CN113373168B - 细菌来源的α-L-鼠李糖苷酶基因、基因表达及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种细菌来源的α‑L‑鼠李糖苷酶基因、基因表达及其应用，筛选出可以将北桑寄生总黄酮中鼠李素‑3‑O‑鼠李糖苷水解为鼠李素的细菌菌株鸟肠球菌（Enterococcus avium），通过对细菌中两种α‑L‑鼠李糖苷酶基因EaRha1和EaRha2进行克隆及原核表达，获得目标α‑L‑鼠李糖苷酶。通过对重组蛋白EaRha1和EaRha2酶学性质的研究，确定了两种蛋白对黄酮类化合物的水解机制，为黄酮类化合物的生物转化提供了理论基础和指导作用。以pNPR为底物，重组蛋白EaRha1最适pH是7，最适温度为50℃，能催化水解含有α‑1,2糖苷键的新橙皮苷和柚皮苷及含有α‑1,6糖苷键的芦丁。以鼠李素‑3‑O‑鼠李糖苷为底物，EaRha2的最适pH是7，最适温度为60℃，能水解鼠李素‑3‑O‑鼠李糖苷和槲皮苷。

Description

细菌来源的α-L-鼠李糖苷酶基因、基因表达及其应用

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体而言，是一种细菌来源的α-L-鼠李糖苷酶基因、基因表达及其应用。

背景技术

α-L-鼠李糖苷酶是一类广泛存在于自然界中、从天然糖苷如类黄酮和萜烯基糖苷中特异性切割末端α-L-鼠李糖的糖苷水解酶，在植物和动物肝脏组织细胞及微生物中均有发现，其微生物来源非常广泛，大多数来源于真菌。早期研究中，国内外学者对真菌中的α-L-鼠李糖苷酶的研究较多，尤其是曲霉属较为普遍，近年来，越来越多的细菌中发现α-L-鼠李糖苷酶的存在。α-L-鼠李糖苷酶是非常具有研究价值的一类酶，不仅可以作用于苷元与糖基之间直接相连的糖苷键，还可以水解糖基和糖基之间连接的糖苷键，糖基和糖基之间糖苷键的裂解作用是能够水解底物中L-鼠李糖和β型糖苷连接的α-1, 2、α-1, 3、α-1, 4、α-1, 6糖苷键。其来源和结构不同，催化特性也不同，具有底物特异性强的特点。α-L-鼠李糖苷酶在食品生产、医药加工和化工等方面具有好的开发前景和应用价值，在食品工业中主要应用在生产食品添加剂和提升饮料品质，如增加香气、饮料脱苦等，在医药上主要用于制备多种药物和药物前体，在化工工业上，可以作为生物催化剂应用到工业生产中。

在蛋白表达研究中，大肠杆菌蛋白表达系统是常用也是经济实惠的蛋白表达系统，具有遗传背景清楚、易于培养和控制、转化操作简单、表达水平高、成本低、周期短等特点，其中，又以pET系统最为常用。目前，已经有多种使用原核表达系统表达α-L-鼠李糖苷酶的研究。史云璐等人通过构建好的BL21(DE3)/pET-28a-HFM-rha78重组蛋白表达系统成功诱导表达了人粪便宏基因组中的α-L-鼠李糖苷酶，对其酶学性质进行研究并测定了该重组α-L-鼠李糖苷酶对芦丁的生物转化研究。Wu, T等人从使用pET-28载体构建重组表达载体，成功从多形拟杆菌中表达出能够水解鼠李糖和鼠李糖之间α-1, 2糖苷键的α-L-鼠李糖苷酶。

自然界中，黄酮类化合物通常是以糖苷的形式存在，是植物的次生代谢产物。黄酮类化合物结构复杂多样，具有多种药理活性。研究发现黄酮类化合物具有抗炎、抗微生物、降血糖、抗氧化、抗辐射、抗癌、抗肿瘤等药理活性。随着对黄酮类化合物构效关系研究的深入，国内外学者发现了越来越多有价值的黄酮类化合物，一些稀有成分通常具有特殊的药理活性。鼠李素是一种天然黄酮类化合物，可抑制分泌型磷脂酶A2的活性，具有抗氧化、抗炎、保护心肌细胞等的活性。近年来国内外出现了较多关于鼠李素的研究，但由于鼠李素价格昂贵，限制了其研究和应用。

发明人前期完成了北桑寄生总黄酮的富集工作，其中鼠李素-3-O-鼠李糖苷含量高达78.51%，可以作为制备鼠李素的原料，利用α-L-鼠李糖苷酶切割鼠李糖制备鼠李素。

发明内容

本发明的目的是提供细菌来源的α-L-鼠李糖苷酶基因，其基因表达获得的α-L-鼠李糖苷酶及其应用。

根据本发明的一个方面，提供的是细菌来源的α-L-鼠李糖苷酶基因，所述基因为来源于鸟肠球菌（ Enterococcus avium）的α-L-鼠李糖苷酶基因 EaRha1或α-L-鼠李糖苷酶基因 EaRha2， EaRha1核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示， EaRha2核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

根据本发明的另一方面，提供一种α-L-鼠李糖苷酶 EaRha1，由以上所述的α-L-鼠李糖苷酶基因 EaRha1编码获得；和一种α-L-鼠李糖苷酶 EaRha2，由以上所述的α-L-鼠李糖苷酶基因 EaRha2编码获得。

根据本发明的另一方面，提供的是所述的α-L-鼠李糖苷酶 EaRha1在特异性水解含有α-1, 2糖苷键的新橙皮苷或柚皮苷，或含有α-1, 6糖苷键的芦丁中的应用。

进一步地，α-L-鼠李糖苷酶EaRha1的水解转化条件为：pH=7，温度50℃。

根据本发明的另一方面，提供的是所述的α-L-鼠李糖苷酶 EaRha2特异性水解鼠李素-3-O-鼠李糖苷或槲皮苷中的应用。

进一步地，α-L-鼠李糖苷酶 EaRha2将鼠李素-3-O-鼠李糖苷转化为鼠李素。

进一步地，α-L-鼠李糖苷酶EaRha2的水解转化条件为：pH=7，温度60℃。

根据本发明的另一方面，提供一种α-L-鼠李糖苷酶的制备方法，包括：

步骤一，以北桑寄生总黄酮为底物，初步筛选出将北桑寄生总黄酮中鼠李素-3-O-鼠李糖苷转化为鼠李素的细菌菌株，以27F和1492R扩增其16S rDNA序列，测序比对进行菌种鉴定，确定该菌株为鸟肠球菌（ Enterococcus avium）；

步骤二，测定菌株的生长曲线，提取其全基因组DNA，设计特异引物扩增其α-L-鼠李糖苷酶基因的编码区序列，使用pMD18-T载体构建重组克隆质粒，克隆得到α-L-鼠李糖苷酶基因 EaRha1或α-L-鼠李糖苷酶基因 EaRha2；

步骤三，利用pET-28a(+)载体构建重组表达质粒，用IPTG诱导重组蛋白小量表达；

步骤四，诱导重组蛋白大量表达，使用Ni柱纯化重组蛋白，获得重组α-L-鼠李糖苷酶EaRha1和EaRha2。

进一步地，步骤二中，所述特异引物如下：

EaRha1：

F 5′-ATGAGAATTTCAAAAATTTTGATCAATC-3′，

R 5′-TTAAACAAATGAGATTTCCTCCCGTTC-3′；

EaRha2：

F 5′-ATGAAATCAATGAGAGAA-3′，

R 5′-TTAAAATTCTAGTTCAAC-3′。

本发明筛选出可以将北桑寄生总黄酮中鼠李素-3-O-鼠李糖苷水解为鼠李素的细菌菌株，通过克隆、表达其α-L-鼠李糖苷酶编码基因获得目标α-L-鼠李糖苷酶，进一步对目标酶的酶学性质进行研究，为重组α-L-鼠李糖苷酶的应用奠定理论基础。

通过对细菌中两种α-L-鼠李糖苷酶基因 EaRha1和 EaRha2进行克隆及原核表达，通过对重组蛋白EaRha1和EaRha2酶学性质的研究，确定了两种蛋白对黄酮类化合物的水解机制，为黄酮类化合物的生物转化提供了理论基础和指导作用。

以pNPR为底物，重组蛋白EaRha1最适pH是7，最适温度为50℃。重组蛋白EaRha1能催化水解含有α-1, 2糖苷键的新橙皮苷和柚皮苷及含有α-1, 6糖苷键的芦丁。以芦丁为底物，pH是7，最适温度为50℃条件下，在重组蛋白EaRha1的水解作用下，可将芦丁转化为槲皮素-3-O-葡萄糖苷。

以鼠李素-3-O-鼠李糖苷为底物，EaRha2的最适pH是7，最适温度为60℃。重组蛋白EaRha2能水解鼠李素-3-O-鼠李糖苷和槲皮苷。以鼠李素-3-O-鼠李糖苷为底物，pH是7，最适温度为60℃条件下，在重组蛋白EaRha2的水解作用下，可将鼠李素-3-O-鼠李糖苷转化为鼠李素。

附图说明

图1为菌种初步筛选结果，（a）：空白组+北桑寄生总黄酮，（b）：XB+北桑寄生总黄酮。

图2左：pET-28a(+)/ EaRha1重组质粒转入 E. coli.DH5 α感受态细胞；右：pET-28a(+)/ EaRha2重组质粒转入 E. coli.DH5 α感受态细胞；M1：DL 5000 Marker。

图3左：重组质粒提取结果；右：PCR验证后的结果。M1：DL 5000 Marker；1和1′：pET-28a(+)/ EaRha1重组质粒提取和PCR验证结果；2和2′：pET-28a(+)/ EaRha2重组质粒提取和PCR验证结果。

图4左：pET-28a(+)/ EaRha1重组质粒转入 E.coliBL21(DE3)感受态细胞；右：pET-28a(+)/ EaRha2重组质粒转入 E.coliBL21(DE3)感受态细胞；M1：DL 5000 Marker。

图5左：EaRha1合并组分SDS-PAGE分析；右：EaRha2合并组分SDS-PAGE分析。M′：10kDa-190 kDa 蛋白Marker；总1：EaRha1未纯化；总2：EaRha2未纯化。

图6左：EaRha1最适pH的测定结果；右：EaRha2最适pH的测定结果。

图7左：EaRha1最适温度的测定结果；右：EaRha2最适温度的测定结果。

具体实施方式

一，α-L-鼠李糖苷酶菌种的筛选及鉴定

利用α-L-鼠李糖苷酶可以从黄酮类化合物和萜烯基糖苷中特异性切割末端α-L-鼠李糖的特性，以北桑寄生总黄酮为底物，筛选出可以产α-L-鼠李糖苷酶的细菌菌株XB。使用HPLC再次验证后，发现该菌株能将北桑寄生总黄酮中的鼠李素-3-O-鼠李糖苷稳定转化为鼠李素，经分子生物学鉴定确定该菌株为鸟肠球菌（ Enterococcus avium）。

产α-L-鼠李糖苷酶菌种XB对北桑寄生总黄酮的水解

菌种的筛选

将菌种活化后培养三天，将菌液与北桑寄生总黄酮的培养基溶液于无菌环境下按体积比1: 1混匀，置于与细菌相同环境下培养，收集10 d的转化样品，经大孔吸附树脂富集后，甲醇定容，HPLC检测。将北桑寄生总黄酮溶液与空白培养基按体积比1:1混匀，置于与样品相同环境下培养，作为对照。

北桑寄生总黄酮与菌种的混合液为样品组，北桑寄生总黄酮与空白培养基的混合液为对照组，反应10 d后进行HPLC检测。北桑寄生总黄酮中主要物质鼠李素-3-O-鼠李糖苷的出峰时间为72.75 min，经生物转化后的产物鼠李素的出峰时间为82.41 min，编号为XB的菌种能将北桑寄生总黄酮中的鼠李素-3-O-鼠李糖苷稳定转化为其对应的苷元鼠李素，推测菌种XB中可能含有α-L-鼠李糖苷酶基因（如图1所示）。

菌种的鉴定

菌种筛选后，采用冻融法提取细菌基因组DNA。按照下列PCR体系和反应条件对细菌16S rDNA进行扩增，所用引物为细菌通用引物27F（AGAGTTTGATCMTGGCTCAG）和1492R（T8ACGGYTACCTTGTTACGACT）。反应体系见表1。

表1PCR反应体系

成分	使用量
		Taq PCR Master Mix	10 μL
细菌DNA	1 μL
		上游引物	0.8 μL
下游引物	0.8 μL
		<![CDATA[ddH<sub>2</sub>O]]>	7.4 μL
total	20 μL

PCR扩增条件：

选择条带清晰的剩余PCR产物进行16S rDNA测序，于NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）网站比对分析测序结果，找出同源性较高的菌株，分别使用MEGA5.0中的Clustal W程序和neighbor-joining方法进行碱基序列比对和系统发育树构建，菌株XB和 Enterococcus avium strain菌株亲缘性最近，鉴定该菌种为鸟肠球菌，拉丁文名为 Enterococcus avium。

二，α-L-鼠李糖苷酶基因的克隆

本实验通过从鸟肠球菌全基因组数据中查找α-L-鼠李糖苷酶基因，设计引物后进行扩增和克隆，利于目的片段的长期保存，为后续蛋白表达提供基础。

1.实验材料

1.1菌种和质粒

菌种： Enterococcus aviumXB（鸟肠球菌 XB）由本实验室分离保存，并保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏号为CGMCC No 21305，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2020年12月7日。 E. coli.DH5 α感受态细胞（Code No. 9057）购于宝日医生物技术（北京）有限公司。

质粒：pMD18-T质粒（Code No. 6011）购于宝日医生物技术（北京）有限公司，含有抗氨苄霉素基因。

1.2培养基的配制

LB液体培养基：酵母提取物0.5%，蛋白胨1%，氯化钠1%，pH为7。121℃高压灭菌20min备用。

LB固体培养基：在液体培养基中加琼脂含量为1.5%，121℃高压灭菌20 min后降温至60℃左右，于无菌环境下倒入培养皿中，每个培养皿15-20 mL，凝固后备用。

LB/Amp溶液/固体培养基：配制方法同LB固体培养基，Amp浓度为100 μg/mL。

2.实验方法和结果

2.1菌种的活化

平板涂布法。培养条件：培养条件为黑暗有氧，温度为30℃。

2.2鸟肠球菌的生长曲线

取活化好的菌液按照1: 10的比例接种于500 mL培养基中，黑暗，30℃，180 r/min振荡培养，分别于0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24 h测量OD600值，以空白LB培养基溶液做为对照。重复三组。由鸟肠球菌的生长曲线可知，鸟肠球菌的迟缓期为0-2 h，指数生长期为2-10 h，稳定期为10-16 h，16 h后开始进入衰亡期。

2.3鸟肠球菌基因组DNA的提取

采用TaKaRa公司细菌基因组DNA提取试剂盒（Code No. 9763）提取鸟肠球菌的基因组DNA。提取得到的基因组DNA可通过琼脂糖凝胶电泳检测（电泳条件：电压140 V，电泳约30 min）并用微量核酸蛋白检测仪测定浓度。

2.4 引物设计

通过NCBI网站查找到鸟肠球菌基因组数据，从Enterococcus avium strain 352基因组数据中找到1条α-L-鼠李糖苷酶基因序列（QCQ 11839.1）和1条与α-L-鼠李糖苷酶有相同结构域的拼接序列（QCQ 11255.1），分别将这两条基因命名为EaRha1和EaRha2。根据Primer 5软件分别设计两对引物扩增α-L-鼠李糖苷酶基因编码区。特异性引物序列如下：

EaRha1：

F 5′-ATGAGAATTTCAAAAATTTTGATCAATC-3′

R 5′-TTAAACAAATGAGATTTCCTCCCGTTC-3′

EaRha2：

F 5′-ATGAAATCAATGAGAGAA-3′

R 5′-TTAAAATTCTAGTTCAAC-3′。

2.5 目的基因的扩增

2.5.1 目的基因的扩增

按照表2反应体系及反应条件扩增鸟肠球菌中α-L-鼠李糖苷酶基因片段。

表2目的基因PCR反应体系

成分	使用量
		Prime STAR HS DNA Polymerase	0.5 μL
目的DNA量	5.0 μL
		<![CDATA[5× Prime STAR Buffer（Mg<sup>2+</sup>plus）]]>	10.0 μL
dNTP Mixture	4.0 μL
		-F/-F	1.5 μL
-R/-R	1.5 μL
		<![CDATA[ddH<sub>2</sub>O]]>	27.5μL
total	50 μL

PCR扩增条件（三步法）：

2.5.2 目的基因的纯化

根据上海生工生物DNA柱式凝胶回收试剂盒回收目的条带，保存于-20℃或进行下一步实验。

2.6 目的基因的克隆

2.6.1 目的基因与pMD18-T载体的连接

将上述回收的目的基因片段使用Taq PCR Master Mix（上海生工生物）于72℃下保温30 min，在PCR产物的3′末端附加A碱基，然后与pMD18-T载体连接，16℃过夜连接。

2.6.2 重组克隆载体的转化

按照TaKaRa公司说明书将克隆载体转化到E. coli. DH5 α感受态细胞中，进行菌液PCR和测序验证。所用引物由上海生工生物合成，为通用引物M13-47F（序列：5′-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3′）和M13-48R（序列：5′-AGCGGATAACAATTTCACACAGGA-3′）。

2.6.3 重组菌株的筛选和鉴定

对测序得到的结果在UniProt（https://www.uniprot.org/blast/）上进行比对，分别使用MEGA 5.0[32]中的Clustal W程序和neighbor-joining方法进行氨基酸序列比对和系统发育树构建。

三.重组α-L-鼠李糖苷酶的表达

本实验构建了重组表达载体并将重组表达载体转入 E.coliBL21(DE3)感受态细胞，筛选出重组蛋白表达菌株pET-28a(+)/ EaRha1和pET-28a(+)/ EaRha2。

在蛋白表达研究中，大肠杆菌蛋白表达系统是常用蛋白表达系统，该表达系统具有遗传背景清楚、易于培养和控制、转化操作简单、表达水平高、成本低、周期短等特点，以pET系统最为常用。本实验使用pET-28a(+)表达质粒构建重组表达载体，小量诱导表达后，通过SDS-PAGE分析研究确定了两种重组α-L-鼠李糖苷酶的最佳诱导条件。

1.实验材料

1.1菌种和质粒

菌种：E.coli BL21(DE3)感受态细胞（目录号：CD601）购于北京全式金生物技术有限公司。

质粒：pET-28a(+)质粒（货号：P3110）购于北京索莱宝科技有限公司，含有抗卡那霉素基因。

1.2培养基的配制

LB/Kan溶液/固体培养基：配制方法同LB固体培养基，Kan浓度为100 μg/mL。

2.实验方法和结果

2.1 引物设计

在第二部分“2.4”中设计的特异性引物序列5′-端设计合适的酶切位点，带酶切位点的特异性引物序列如下：

EaRha1：

F1 5′-CTAGCTAGCATGAGAATTTCAAAAAT-3′

R1 5′-CCGCTCGAGTTAAACAAATGAGATTT-3′

EaRha2：

F1 5′-CGCGGATCCATGAAATCAATGAGAGAA-3′

R1 5′-TAAGAATGCGGCCGCTTAAAATTCTAGTTCAA-3′

2.2 表达载体的构建

2.2.1 目的基因的双酶切及纯化

将第二部分“2.5.1”中目的基因片段用带酶切位点的引物进行PCR扩增，根据上海生工生物DNA柱式凝胶回收试剂盒回收目的条带，使用 NheI/ XhoI和 BamH I/ NotI限制性快切酶进行双酶切，37℃酶切30 min。酶切后的目的基因片段产物使用柱式DNA胶回收试剂盒回收并于-20℃保存，进行下一步实验。

2.2.2 表达质粒pET-28a(+)的双酶切及纯化

将表达质粒pET-28a(+)按照第二部分“2.6.2”转化到 E. coli.DH5 α感受态细胞，使用柱式质粒DNA小量抽提试剂盒（上海生工生物有限公司）提取质粒，并使用 NheI/ XhoI和 BamH I/ NotI限制性快切酶对表达质粒进行双酶切，于37℃酶切30 min。酶切后的产物使用柱式DNA胶回收试剂盒（上海生工生物有限公司）回收并于-20℃保存，进行下一步实验。

2.2.3 目的基因和表达载体的连接

将得到的目的基因片段和质粒DNA片段使用T4连接酶（TaKaRa公司）于16℃进行过夜连接。

2.2.4 重组表达载体的转化

将连接产物转化至 E. coli.DH5 α感受态细胞中，其中抗生素换为Kan霉素，进行菌液PCR和测序验证。引物为通用引物对T7-F（序列：5′-TAATACGACTCACTATAGGG-3′）和T7-R（序列：5′-TGCTAGTTATTGCTCAGCGG-3′）。

2.2.5 重组表达菌株的筛选

将测序结果与目的基因序列进行比对，将序列完全相同的菌液样品活化涂板，挑取单克隆后扩大培养，提取质粒，回收后进行PCR验证，将条带一致的重组质粒转化到 E.  coliBL21(DE3)表达感受态细胞（北京全式金生物技术有限公司）中，于含Kan的LB固体培养基上进行阳性克隆筛选，使用通用引物对T7进行重组子验证，保存菌液。

将双酶切后的目的基因和pET-28a(+)质粒经T4连接酶连接后，转入 E. coli.DH5α感受态细胞，结果见图2，目的条带清晰，片段大小一致，初步验证重组表达载体构建成功。将条带清晰的目的条带对应菌液测序比对后，测序结果与预期一致，表明重组表达载体构建成功。重新活化重组菌株 E. coli.DH5 α，提取重组质粒并回收纯化，将回收的重组质粒进行PCR验证，结果见图3，回收的重组质粒条带单一且片段大小一致，将回收纯化的重组质粒转入 E.coliBL21(DE3)感受态细胞，结果见图4，结果表明，重组表达菌株构建成功。

2.3 重组α-L-鼠李糖苷酶的诱导表达

通过SDS-PAGE分析可知EaRha1分子量大小约为130 kDa，EaRha2分子量大小约为110 kDa。通过对重组蛋白诱导温度、可溶性和与琼脂糖珠的结合能力的综合研究，确定了重组蛋白最佳诱导温度：诱导时间为12 h，诱导液IPTG浓度为0.5 mM时，EaRha1最适诱导温度为30℃，EaRha2最适诱导温度为25℃。

四．重组α-L-鼠李糖苷酶的纯化及酶学性质

α-L-鼠李糖苷酶具有特异性切割黄酮苷类化合物末端鼠李糖的能力，将黄酮苷类化合物转化为相对应的苷元，增强其药理活性。本实验通过对两个重组蛋白酶学性质的研究，确定了蛋白反应的最佳条件，并在最佳条件下测定了重组蛋白对多种黄酮苷类物质的水解特性，确定了酶的催化位点。

1.实验材料

1.1 菌种：同第三部分“1.1”。

1.2培养基的配制：同第三部分“1.2”。

1.3 缓冲溶液的配制

1）超声缓冲液：Tris-HCl缓冲液（1 M，pH8.0）50 mL+ NaCl 29.22 g+无水甘油150mL+咪唑0.68 g，定容至1 L。高温高压灭菌后，于4℃保存备用。

2）配制浓度为50 mM、100 mM、150 mM、200 mM、250 mM、300 mM的不同浓度咪唑的缓冲溶液，超纯水定容至1 L，使用1 M NaOH溶液调节pH至8.0，用0.22 μm滤膜过滤除菌，备用。

2.实验方法和结果

2.1 重组α-L-鼠李糖苷酶的制备和纯化

2.1.1 重组α-L-鼠李糖苷酶的制备

将转化成功的pET-28a(+)/ EaRha1和pET-28a(+)/ EaRha2菌株平板活化后，按照1:100的比例接种种子液到100 mL含卡那霉素的LB培养基中，37℃，180 r/min过夜培养12 h后，再按照1: 100的比例转接到200 mL含卡那霉素的LB培养基中，37℃，180 r/min培养至OD₆₀₀为0.6左右，加入终浓度为0.5 mmol/L的IPTG溶液，将pET-28a(+)/ EaRha1菌株于30℃，pET-28a(+)/ EaRha2菌株于25℃ 180 r/min诱导12 h，于4℃，3500 g离心20 min，收集菌体于液氮速冷后保存于-80℃。

分别将保存的pET-28a(+)/ EaRha1，pET-28a(+)/ EaRha2菌体于冰上解冻，加入三倍体积的超声缓冲液重悬，加入终浓度为1 mmol/L PMSF和1 mg/mL溶菌酶，颠倒混匀，室温孵育20 min，于冰盐水浴中超声破碎，破碎条件为：4℃，工作时间10 s，间歇时间20 s。超声破碎至无黏性的流体，加入终浓度为0.1 mg/mL的DNase Ⅰ和1 mmol/L的MgCl₂，转移至小量离心管中，4℃，最高转速（14000 r/min）离心30 min，体积比1: 1加甘油保存上清液。

2.1.2 重组α-L-鼠李糖苷酶的纯化

根据北京索莱宝生物科技有限公司的Ni-琼脂糖凝胶6FF（His标签纯化树脂）说明书进行纯化操作，使用浓度为50 mM、100 mM、150 mM、200 mM、250 mM、300 mM的梯度浓度咪唑溶液进行洗脱，将吸光度接近的组分合并，每个合并组分进行SDS-PAGE分析，将目的条带按照体积比1: 1加无水甘油于-20℃保存。

将重组菌株在最适条件下诱导12 h，超声破碎后，得到EaRha1和EaRha2粗酶液，经不同浓度咪唑缓冲液洗脱并合并组分，SDS-PAGE分析见图5，由图可知，EaRha1和EaRha2均在咪唑浓度为100 mM时被洗脱，目标条带单一、清晰，可用于下一步实验。

2.1.3 蛋白标准曲线的绘制及蛋白浓度的测定

使用改良型Bradford法蛋白浓度测定试剂盒（上海生工生物有限公司）中“分光光度计法一”进行蛋白标准曲线的绘制及目的蛋白浓度的测定。

2.2 重组α-L-鼠李糖苷酶的酶学性质

2.2.1 对硝基苯酚和鼠李素-3-O-鼠李糖苷标准曲线的测定

使用对硝基苯基-α-L-鼠李吡喃糖苷（pNPR）作为底物来测定EaRha1的活性，以其产物对硝基苯酚于碱性条件下在波长405 nm时的吸光度的增加量测定EaRha1活性。预实验中发现EaRha2与对硝基苯基-α-L-鼠李吡喃糖苷不反应，改用鼠李素-3-O-鼠李糖苷作为底物测定EaRha2的活性，使用HPLC法以鼠李素生成量的峰面积测定EaRha2活性。

2.2.2 最适pH的测定

由图6可知，EaRha1的最适pH为7，在pH 4-8时，能检测到60%以上酶活，在pH 9和pH10时，酶活不到10%。EaRha2的最适pH为7，在pH 6-10时，能检测到50%以上酶活。

2.2.3 最适温度的测定

由图7可知，EaRha1和EaRha2的最适温度分别为50℃和60℃。在温度为40℃-60℃时，EaRha1和EaRha2均能检测到60%以上酶活，在温度为70℃时，EaRha2仍能检测到50%以上酶活。

2.2.4 底物特异性的测定

EaRha1和EaRha2重组蛋白对鼠李素-3-O-鼠李糖苷、橙皮苷、新橙皮苷和柚皮苷的水解作用结果见表3。

表3EaRha1和EaRha2底物特异性分析

底物	作用位点	EaRha1	EaRha2
				鼠李素-3-O-鼠李糖苷	苷元与糖基之间直接相连	–	+
槲皮苷	苷元与糖基之间直接相连	–	+
				杨梅苷	苷元与糖基之间直接相连	–	–
橙皮苷	α-1, 6	–	–
				芦丁	α-1, 6	+	–
新橙皮苷	α-1, 2	+	–
				柚皮苷	α-1, 2	+	–
朝藿定C	α-1, 2	–	–
				人参皂苷-Rg2	α-1, 2	–	–

注：“–”表示不能水解，“+”表示可以水解。

本部分实验对重组α-L-鼠李糖苷酶EaRha1和EaRha2使用Ni柱进行纯化，并对酶学性质进行分析：EaRha1的最适pH是7，最适温度为50℃，在40℃以下能保持较高酶活，EaRha1重组蛋白能催化水解含有α-1, 2糖苷键的新橙皮苷和柚皮苷及含有α-1, 6糖苷键的芦丁，不能水解含有α-1, 6糖苷键的橙皮苷和含有α-1, 2糖苷键的朝藿定C和人参皂苷-Rg2以及苷元与糖基之间直接相连的鼠李素-3-O-鼠李糖苷、杨梅苷和槲皮苷。

EaRha2的最适pH是7，最适温度为60℃，在45℃以下能保持较高酶活， EaRha2只能水解苷元与糖基之间直接相连的鼠李素-3-O-鼠李糖苷和槲皮苷，不能催化水解杨梅苷和含有α-1, 2糖苷键的新橙皮苷、柚皮苷、朝藿定C和人参皂苷-Rg2以及含有α-1, 6糖苷键的橙皮苷和芦丁。

                         序列表

<110>  山西医科大学

<120>  细菌来源的α-L-鼠李糖苷酶基因、基因表达及其应用

<160>  2

<170>  SIPOSequenceListing 1.0

<210>  1

<211>  2826

<212>  DNA

<213>  人工序列(Artificial Sequence)

<400>  1

atgagaattt caaaaatttt gatcaatcat atgacagaac ctattggctt tcagttagat  60

gatctgcgaa ttgagtttac agtggaagca gaacaattca cagaaataac gaagcaatta 120

accatctgga cagataatta tgaagccccc gtttaccaaa gcaagcagga accatttgaa 180

actaactatt ttgatgttcc gttgacactg attccacgta ctcgttacca cgtagaaatt 240

gcgattcgag acaccaatca tgaacttctt accaaagaaa gcttttttga aactggtaaa 300

atggatgaac ctttccaagc agattggatt gctcatccag ataaagctat tcaaaataca 360

ctttttcaaa aaaagatcag cgtgaagtcc caagtagcaa aagcgcgttt atacgctact 420

ggattgggga tttatgaagc atatattaat ggtgaaaaag ttggtgatga gtatttaacg 480

ccaggggtta cggcatacga tcaatggatc caagtccaaa cctacgatgt cacagcagcc 540

ttccaaaaag cagcggatca tgagctgctc ttcactactg gtgacggctg gtataaagga 600

actttaggct tcgatggcgg aatgaaaaac atttacggcg accagcaatg tgtcattgga 660

gaattccacg tgacgtatga agatggtcaa acagagatca tttccactga tagctcatgg 720

gtaacaacca gcggaaaagt aactaaatca gagatttatt atggagaaga cttgaatgat 780

acattaaccc cttccgattg gcagtccgtg atcttactag atcagaataa ggcactactt 840

caagaccgat tgagtctgcc gataaaaatt atggaacgat tgcctattca agaaatcctt 900

gaaactccgg caggtgaaca ggtccttgat tttggtcaaa atcagactgg ttggatggaa 960

ttttacaacc gcgaacccaa aggcacaaaa cttgtttttc aaatgggaga aatcctacag 1020

gagggtaact tttatcgcga aaatttacgt gaagcaagag cctcttttgt ctatatttct 1080

gacggtgaag aaaaatgggt tcgcccccat ttcactttct acggctatcg ttatgtaaaa 1140

gtcgaaggaa acactcaagc actgagaaaa gaagattatc aagcggcggt cctttattct 1200

gaaatggcaa ccacaggcga aatcaaaacc actaattcaa aggttaatcg gctttttcaa 1260

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gacgaacgac ttggctggac aggcgatgct gaagtctttt ctaaaacagc tgctttaaat 1380

atgaacgttt ttccattctt taaaaaatat ggaaaagaca tcgctatcga gcaacaattg 1440

catgatggta tggttccaat gtatgctcct gcaatgggga attctgatgg cggtgctgcg 1500

gtttggggcg atgcagcaac gatcatccca tggaacatgt atcagattta tggtgattca 1560

gcgattttac gtcaaaacta cacagcaatg aaggattggg tagcatggat tcaaaaaaac 1620

agtaagagca gtgatttatg gactggaacc tttcaatttg gcgattggct cgctcttgat 1680

ggagaaaatc ccgcgttacc aactggaaaa actgaagaag attttattgc ctctgtctac 1740

tactattatt ctaatgacat cattgctaaa acagctgaaa ttttgaattt tgctaacgat 1800

gcaacttatt atcgtgaaca agctcaacgg atcaaagagg ctattgttaa ggaatatatt 1860

actgcaaatg gccgtttagc aattgatact cagacggctt atgcaatcgc gctatatttt 1920

gaattggttc ctcaatcaca acgttcgcga gtcgctaagg atttagtaac ccgcttgaaa 1980

aaggacaatg accatcttaa aaccggattt gtcggtactc ccttcatctg tcaggtttta 2040

tctaattatg gctatcataa actagccacg aaaattttcc ttttagaaga ttttccaagc 2100

tggctctatg cagtaaatct tggcgcaaca actgtctggg aacgctggaa ctctgttctt 2160

cctgatggtt ccatgaaccc agaaggaatg aattcattaa atcattatag ctttggtgca 2220

attatggaat gggcctatag ctatcttcta ggaattaaac cagctcaccc tggctatcag 2280

gaaatcaact tttcgccgct atttgattat cgcttaaaac aagttaatgg acatttcgat 2340

acaccatacg gaactttcgc tgtaagttat caaatcgaag cggacagcga gcacaccatt 2400

aagctcaact tgactgtgcc ttttggaacg accgtacatg tcgatttacc acgaggagaa 2460

aatggtccgg taacagtcaa caatcaggaa aaaaataacg gtcgcttctc acttacctgc 2520

ggcacctatg aaatcgccta tgttcccagc gaaaattacg tagaacacta taatagcgaa 2580

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cctgtgttag attttttcag agcagatcca gcagccatta agggcggttt aggaactatg 2700

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gtttaa                                                           2826

<210>  2

<211>  2640

<212>  DNA

<213>  人工序列(Artificial Sequence)

<400>  2

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ggaaatcctc tcacaggaga ataccctttg gagaagcaat cacttgctga aacgattgag 2520

ctggagatcg ttgttggtag tacattgaat aattatctaa acaagtctcc gttggccgct 2580

tattatggag agtatcaacc gcagaactat ggaattgaag atgttgaact agaattttaa 2640

Claims (3)

1.一种α-L-鼠李糖苷酶EaRha2在特异性水解鼠李素-3-O-鼠李糖苷或槲皮苷中的应用，所述α-L-鼠李糖苷酶EaRha2由α-L-鼠李糖苷酶基因EaRha2编码获得，α-L-鼠李糖苷酶基因EaRha2的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：α-L-鼠李糖苷酶EaRha2将鼠李素-3-O-鼠李糖苷水解转化为鼠李素。

3.根据权利要求2所述的应用，α-L-鼠李糖苷酶EaRha2的水解转化条件为：pH=7，温度60℃。

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