CN106337057A - N-氨甲酰水解酶表达基因及其工程菌的构建 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种N‑氨甲酰水解酶表达基因及其工程菌的构建。该N‑氨甲酰水解酶的制备方法，包括以下步骤：(1)目的菌的筛选；(2)细菌总DNA提取；(3)扩增该细菌总DNA，以获得N‑氨甲酰水解酶基因；(4)连接该N‑氨甲酰水解酶基因的DNA片段与表达载体，从而获得N‑氨甲酰水解酶的重组质粒；(5)将该的N‑氨甲酰水解酶基因的重组质粒转入到表达宿主中，发酵培养。该N‑氨甲酰水解酶基因编码的氨基酸序列在以N‑氨甲酰‑D‑对羟基苯甘氨酸作为底物时表现出较高的酶活性。
Description
技术领域
本发明涉及一种N-氨甲酰水解酶表达基因及其工程菌的构建，尤其涉及一种N-氨甲酰-D-对羟基苯甘氨酸水解酶表达基因及其工程菌的构建。
背景技术
D-氨基酸及其衍生物是医药及食品领域的重要原材料，被广泛地用于合成半合成抗生素、多肽激素、拟除虫菊酯、杀虫剂和甜味剂。其中，D-对羟基苯甘氨酸(D-pHPG)是生产半合成青霉素和半合成头孢菌素的主要侧链，被广泛应用于合成半合成广谱抗生素阿莫西林、头孢羟氨苄、头孢哌酮、头孢罗奇有头孢羟胺唑等。
D-对羟基苯甘氨酸(D-p-HPG)的合成方法有化学拆分和酶法拆分两类。由于化学法存在成本较高，污染严重等问题，因而酶法拆分日益受到重视。酶法拆分的基本原理是利用含有二氢嘧啶酶的微生物细胞定向转化D-对羟基苯海因(D-p-HPH)为D-氨甲酰对羟基苯甘氨酸(D-N-Carbamyl-p-HPG)；再利用含有氨甲酰水解酶的微生物细胞将其水解为D-对羟基苯甘氨酸(D-p-HPG)。在反应条件下，L-对羟基苯海因自发消旋为D-对羟基苯海因，达到D,L-对羟基苯海因的完全转化。
自上世纪八十年代以来，酶法制备D-对羟基苯甘氨酸的研究和应用得到发展，其过程如下：首先利用化学手段合成D，L-对羟基苯海因(D，L-HPH)作为生物酶作用的底物，然后利用生物酶将其转化为D-对羟基苯甘氨酸。一般而言，先由乙醛酸、苯酚、脲缩合得到D，L-对羟基苯乙内酰苯海因(pHPH)，pHPH可被D-海因酶(D-hydantoinase，E.C.3.5.2.2)立体专一性水解开环生成D-N-氨甲酰对羟基苯甘氨酸(D-CpHPG)，在碱性条件或者存在消旋酶的条件下，未被开环的L-型对映体消旋化为D-型从而进一步被转化。通过这种酶促不对称水解反应，可使混消旋的PHPH完全转化为D-HPG。现在，在工业上已有采用固定化的D-海因酶或固定化细胞进行该反应的报道。
酶法生产D-对羟基苯甘氨酸在工业上有重要的应用价值，因此对其生产所用的相关酶的研究和改造有重要意义。D-海因酶可催化5’单替代海因或二氢尿嘧啶的开环，形成氨基甲酰类的中间物，该中间产物可被氨甲酰水解酶降解为D-对羟基苯甘氨基酸，成为半合成内酰胺类抗生素的重要中间体。因而，对海因酶的研究逐渐成为了相关行业的热点研究课题之一。
目前，酶法拆分的主要问题在于所使用的微生物细胞所含氨甲酰水解酶的活力偏低，半衰期过短，导致中间产物水解时间过长，转化率偏低。
发明内容
本发明的主要优势在于提供一种新的N-氨甲酰水解酶基因及其表达的氨基酸序列；
本发明的另一优势在于提供一种新的N-氨甲酰-D-对羟基苯甘氨酸水解酶基因及其表达的氨基酸序列；
本发明的另一优势在于提供一种来源于Streptomyces sp.7-145(保藏编号CGMCC NO.7914)的新的N-氨甲酰水解酶基因；
本发明的另一优势在于提供一种新的氨基酸，其由所述新的N-氨甲酰水解酶基因编码；
本发明的另一优势在于提供一种新的N-氨甲酰水解酶的基因序列；
本发明的另一优势在于提供一种载体DNA序列的新的重组质粒；
本发明的另一优势在于提供一种新的N-氨甲酰水解酶的应用。
通过下面的描述，本发明的其它优势和特征将会变得显而易见，并可以通过权利要求书中特别指出的手段和组合得到实现。
为实现本发明的前述以及其它目的和优势，本发明提供一种N-氨甲酰水解酶基因，其中所述水解酶基因的DNA序列为SEQ ID No：1所示的DNA序列，其中所述水解酶基因来源于Streptomyces sp.7-145(保藏编号CGMCC NO.7914)。
优选地，所述水解酶基因编码的氨基酸序列为SEQ ID No：2所示的氨基酸序列。
优选地，所述重组质粒具有SEQ ID No：2所述氨基酸序列的N-氨甲酰水解酶基因和一种载体DNA序列，其中所述N-氨甲酰水解酶基因具有SEQ ID No：1所示的DNA序列。
优选地，所述载体为pET-21(b)、pET30(a)、pET23(b)、pET41(a)、pET-41ah、pe-41aHNT、pET-41am、pGEX-4T-1、pACYCDuet、pCDFduet、pETDuet、pRSFDuet、pPIC9K、pPIC3.5K和pWB980中的一种或两种以上的组合。
优选地，所述载体为pET-28(a)。
根据本发明的另一方面，本发明还提供了一种N-氨甲酰水解酶制备方法，包括以下步骤：
(1)目的菌的筛选；
(2)链霉菌总DNA提取；
(3)扩增所述链霉菌总DNA，以获得N-氨甲酰水解酶基因；
(4)连接所述N-氨甲酰水解酶基因的DNA片段与表达载体，从而获得N-氨甲酰水解酶的重组质粒；
(5)将所述的N-氨甲酰水解酶基因的重组质粒转入到表达宿主中，发酵培养。
优选地，步骤(3)中所述链霉菌总DNA是通过PCR方法从Streptomyces sp.7-145基因组扩增。
优选地，步骤(4)中所述表达载体为pET-21(b)、pET28a、pET30(a)、pET23(b)、pET41(a)、pET-41ah、pe-41aHNT、pET-41am、pGEX-4T-1、pACYCDuet、pCDFduet、pETDuet、pRSFDuet、pPIC9K、pPIC3.5K和pWB980中的一种。
优选地，步骤(5)中所述表达宿主为E.coli BL21、毕赤酵母、枯草芽孢杆菌(WB600)中的一种。
优选地，步骤(2)包括从Streptomyces sp.7-145中提取链霉菌总DNA。
本发明提供的N-氨甲酰水解酶基因编码的氨基酸序列不同于目前已知来源的N-氨甲酰水解酶，其在以N-氨甲酰-D-对羟基苯甘氨酸作为底物时表现出较高的酶活性。
通过对随后的描述和附图的理解，本发明进一步的优势和优势将得以充分体现。
本发明的这些和其它优势、特点和优势，通过下述的详细说明，附图和权利要求得以充分体现。
附图说明
图1是D-对羟基苯甘氨酸的合成示意图。
图2是N-氨甲酰水解酶表达载体PETJ2的构建示意图。
图3A是目的蛋白电泳图。
图3B是目的基因片段电泳图。
图4是利用HPLC检测N-氨甲酰水解酶反应生成产物的曲线图。
生物材料保藏说明
生物材料的分类命名：链霉菌7-145
拉丁文学名：Streptomyces sp.7-145
保藏日期：2013年7月12日
保藏该生物材料样品的保藏单位全称及简称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏(CGMCC)
保藏编号：CGMCC NO.7914
具体实施方式
下述描述被揭露以使本领域技术人员可制造和使用本发明。下述描述中提供的较佳实施例仅作为对本领域技术人员显而易见的示例和修改，其并不构成对本发明范围的限制。下述描述中所定义的一般原理可不背离本发明精神和发明范围地应用于其它实施例、可选替代、修改、等同实施和应用。
依据本发明的一第一优选实施方式的N-氨甲酰水解酶的含有优势基因的表达载体和工程菌的构建如下：
1.实验准备
1.1分离培养基的制备
1号分离培养基的制备：将75ml 0.4M HCl溶2g几丁质，5℃下搅拌12h，用2M氢氧化钠调pH至5.0，而后加去离子水至200ml，灭菌备用，得到A；B，K2HPO42.0g，KCl 0.5g，KH2PO41.0g，CaCl20.1g，MgSO40.7g，Yeast extract 0.5g，NaCl 0.5g，海水盐30g，去离子水1L。自然pH：200ml加琼脂4g；在200mlB中加入30ml A溶液加放线菌酮100μg/ml,萘啶酸50μg/ml。
2号分离培养基组成为：甘露醇0.5g，蛋白胨0.1g，放线菌酮100mg，萘啶酸0.05g，海水盐30g，去离子水1L；自然pH：200ml加琼脂4g；在200ml B中加入30ml A溶液加放线菌酮100μg/ml,萘啶酸50μg/ml。
3号分离培养基为：放线菌酮0.3g，Glucose 1.0g，Glycerol 1.0g，K2HPO40.3g，MgSO40.2g，NaCl0.3g，放线菌酮100mg，萘啶酮酸50mg，Agar 20g，海水盐30g，去离子水1L，自然pH。
4号分离培养基为：CaSO40.8g，Ca(NO3)20.33g，MgSO40.7g，K2SO40.025g，KH2PO40.005g，NaHCO30.2g，FeCl30.001g，Gucose 0.01g，Yeast extract 0.005g，放线菌酮100mg，萘啶酮酸50mg，Agar 20g，海水盐30g，去离子水1L，自然pH；
5号分离培养基为：Casein 1g，Soluble starch 1g，K2HPO40.2g，MgSO42g，放线菌酮100mg，萘啶酮酸50mg，Agar 20g，海水盐30g，去离子水1L，自然pH；
1.2海泥样品的预处理
海泥样品被置于室温风干3周后，得到风干海泥样品。每0.5g所述风干海泥样品被溶于4ml无菌水中，55℃加热6min，1000rpm/min离心10min,取上清用于分离海洋来源的放线菌。
2.菌种分离、纯化和保藏
2.1菌种的分离
分别吸取200μl所述上清，稀释涂布于1～5号分离培养基，28℃培养7～14d后备用。
2.2挑菌、纯化、保藏
从菌种分离平板上挑取单菌落在选择培养基上划线，28℃培养7d，之后从菌种选择培养基上挑取单菌落在ISP2培养基平板上划线，28℃培养7d，重复该步骤3-5次，对菌株进行纯化重复该步骤3-5次，对菌株进行纯化。刮取所得纯培养物的孢子用30％甘油作保护剂冻存于-80℃冰箱作长期保藏。
所述选择培养基为：酵母提取物4g，麦芽提取物10g，葡萄糖4g，琼脂20g，N-氨甲酰基-D-对羟基苯甘氨酸20g，去离子水1L，pH7.2-7.4。
所述ISP2培养基为：酵母提取物4g，麦芽提取物10g，葡萄糖4g，琼脂20g，去离子水1L，pH7.2-7.4。
2.3链霉菌总DNA的提取
用无菌竹签从固体培养基上挑取少许菌苔并尽量压碎，加入1ml洗涤液，振荡均匀，8000rpm/min离心5min，弃上清。加入200μl裂解液，混匀，于800w微波炉中处理3次，每次15s(开盖微波，防止外噗)，以EP管中样品温热为宜。加入400μl抽提液混匀，加入等体积Tris饱和酚/氯仿溶液，颠倒50次左右进行蛋白抽提，8000rpm/min离心10min(酚氯仿抽提两次)。而后于上清中加入等体积异丙醇沉淀30min，70％乙醇洗涤沉淀一次，室温下风干后溶于20μl TE溶液中。
3.引物设计
DC-SF1：TBGTCTTYCCCGAACTSVCG
DC-SR1：GTTCTGRTADGMBCCKGCCTG
DC-QF1：ATGGCTCGTCAGATGATATTCGC
DC-QR1：CAGAGTTCCGCGATCAGACCATAG
16s rRNA-17f：GSGGSGSSGCSGGSTTCAT SGG
16s rRNA-1492r：GGGWRCTGGYRSGGSCCGTAGTTG
4.目的基因筛选
以微波法提取的链霉菌总DNA作为模板，使用引物DC-SF1和DC-SR1进行PCR扩增。扩增体系：2×PCR mix 10μl,dd H2O 8μl,模板DNA 1μl(约50ng-200ng),上、下游引物各0.5μl(浓度为20μM)。PCR反应条件为：96℃，2min预变性；96℃，1min变性,50℃，30s退火,72℃延伸40s(30个循环)；最后72℃延伸5min,4℃下保存。
5.目的蛋白表达基因扩增
以微波法提取的链霉菌总DNA作为模板，使用引物DC-QF1和DC-QR1进行PCR扩增。扩增体系：2×PCR mix 10μl,dd H2O8μl,模板DNA 1μl(约50ng-200ng),上、下游引物各0.5μl(浓度为20μM)。PCR反应条件为：96℃，2min预变性；96℃，1min变性,50℃，30s退火,72℃延伸60s(30个循环)；最后72℃延伸5min,4℃下保存。
6. 16S rRNA扩增及分析
以微波法提取的链霉菌总DNA作为模板，使用16S rRNA基因扩增所使用的兼并引物16S rRNA-17f和16S rRNA-1492r进行基因扩增。20μl PCR反应体系：2×PCR mix 10μl,dd H2O 8μl,模板DNA 1μl(约50ng-200ng),上、下游引物各0.5μl(浓度为20μM)。PCR反应条件为：96℃，2min预变性；96℃，1min变性,50℃，30s退火,72℃延伸90s(30个循环)；最后72℃延伸5min,4℃下保存。
将所得16S rDNA序列使用EzTaxon server 2.1进行序列比对，然后用生物信息学软件Mega 5.0构建系统发育树。
7.表达基因序列分析
通过pubmed中的Blast进行序列分析，结果显示从链霉菌Streptomyces sp.7-145中分离的目的蛋白表达基因与Ralstonia pickettii来源的基因序列(登录号为AF320814)同源性最高，为97％。
8.含N-氨甲酰水解酶的质粒构建
PCR扩增结束后，先使用1％的琼脂糖凝胶进行电泳，电压为120伏，割胶后，用胶回收试剂盒(北京康为世纪生物科技有限公司)回收900bp左右的目的DNA片段，接着用BamHI和HindIII进行双酶切，将所获得的DNA片段和载体pET-28a连接(宝生物工程有限公司)，之后将链接产物转化入大肠杆菌DH5a感受态细胞(北京全式金生物技术有限公司)，在含卡那霉素抗生素的LB平板上筛选。
值得一提的是，依据本发明的该第一优选实施方式，所述载体为pET-28a，但这仅是对本发明的示例而非限制。依据本发明的其它优选实施方式，所述载体也可以为其它载体，如pET-21(b)、pET30(a)、pET23(b)、pET41(a)、pET-41ah、pe-41aHNT、pET-41am、pGEX-4T-1、pACYCDuet、pCDFduet、pETDuet、pRSFDuet、pPIC9K、pPIC3.5K、pWB980等；
重组子用限制性内切酶BamHI和HindIII进行双酶切验证。酶切产物在此进行电压为120伏的琼脂糖凝胶电泳，验证片段大小分别为900bp左右的片段和5300bp左右的载体。
图3A是目的蛋白电泳图。
图3B是目的基因片段电泳图。
值得一提的是，所述N-氨甲酰水解酶基因的DNA序列如SEQ ID No：1所示。所述N-氨甲酰水解酶基因编码的氨基酸序列如SEQ ID No：2所示。
9.表达N-氨甲酰水解酶的基因工程菌株构建
用质粒提取试剂盒(北京康为世纪生物科技有限公司)提取重组子质粒，然后按常规方法转化入表达宿主E.coli BL21(北京全式金生物技术有限公司)，即获得N-氨甲酰水解酶基因的大肠杆菌工程菌。值得一提的是，依据本发明的该第一优选实施方式，所述表达宿主为E.coli BL21，但这仅是对本发明的示例而非限制。依据本发明的其它优选实施方式，所述表达宿主也可以为其它表达宿主，如毕赤酵母、枯草芽孢杆菌(WB600)等；
10.高效液相色谱检测活性
将表达后的酶与底物混合，在pH为7.0的体系中反应30min，用高效液相色谱(安捷伦有限公司)检测产物生成，所得HPLC检测图如图4所示。
本领域技术人员会明白附图中所示的和以上所描述的本发明实施例仅是对本发明的示例而不是限制。
由此可以看到本发明优势可被充分有效完成。用于解释本发明功能和结构原理的该实施例已被充分说明和描述，且本发明不受基于这些实施例原理基础上的改变的限制。因此，本发明包括涵盖在附属权利要求书要求范围和精神之内的所有修改。
Claims (10)
1.一种N-氨甲酰水解酶基因，其特征在于，所述水解酶基因的DNA序列为SEQ ID No：1所示的DNA序列，其中所述水解酶基因来源于链霉菌(Streptomyces sp.)7-145。
2.根据权利要求1所述的水解酶基因，其特征在于，所述水解酶基因编码的氨基酸序列为SEQ IDNo：2所示的氨基酸序列。
3.一种重组质粒，其特征在于，所述重组质粒具有SEQ ID No：2所述氨基酸序列的N-氨甲酰水解酶基因和一种载体DNA序列，其中所述N-氨甲酰水解酶基因具有SEQ ID No：1所示的DNA序列。
4.根据权利要求3所述的重组质粒，其特征在于，所述载体选自由载体pET-21(b)、pET30(a)、pET23(b)、pET41(a)、pET-41ah、pe-41aHNT、pET-41am、pGEX-4T-1、pACYCDuet、pCDFduet、pETDuet、pRSFDuet、pPIC9K、pPIC3.5K和pWB980组成的载体组。
5.根据权利要求4所述的重组质粒，其特征在于，所述载体为pET-28(a)。
6.一种N-氨甲酰水解酶制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)目的菌的筛选；
(2)链霉菌总DNA提取；
(3)扩增所述链霉菌总DNA，以获得N-氨甲酰水解酶基因；
(4)连接所述N-氨甲酰水解酶基因的DNA片段与表达载体，从而获得N-氨甲酰水解酶的重组质粒；
(5)将所述的N-氨甲酰水解酶基因的重组质粒转入到表达宿主中，发酵培养。
7.根据权利要求6所述的N-氨甲酰水解酶制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述链霉菌总DNA是通过PCR方法从Streptomyces sp.7-145基因组扩增。
8.根据权利要求7所述的N-氨甲酰水解酶制备方法，其特征在于，步骤(4)中所述表达载体为pET-21(b)、pET28a、pET30(a)、pET23(b)、pET41(a)、pET-41ah、pe-41aHNT、pET-41am、pGEX-4T-1、pACYCDuet、pCDFduet、pETDuet、pRSFDuet、pPIC9K、pPIC3.5K和pWB980中的一种。
9.根据权利要求8所述的N-氨甲酰水解酶制备方法，其特征在于，步骤(5)中所述表达宿主为E.coliBL21、毕赤酵母、枯草芽孢杆菌(WB600)中的一种。
10.根据权利要求6所述的N-氨甲酰水解酶制备方法，其特征在于，所述表达载体选自由载体pET-21(b)、pET30(a)、pET23(b)、pET41(a)、pET-41ah、pe-41aHNT、pET-41am、pGEX-4T-1、pACYCDuet、pCDFduet、pETDuet、pRSFDuet、pPIC9K、pPIC3.5K和pWB980组成的载体组。
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