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CN113295790A - 一种畜禽肉及其副产品中兽药化合物残留的检测方法 - Google Patents

一种畜禽肉及其副产品中兽药化合物残留的检测方法 Download PDF

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CN113295790A
CN113295790A CN202110555988.8A CN202110555988A CN113295790A CN 113295790 A CN113295790 A CN 113295790A CN 202110555988 A CN202110555988 A CN 202110555988A CN 113295790 A CN113295790 A CN 113295790A
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CN
China
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veterinary drug
mass
ion
drug compound
acetate
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CN202110555988.8A
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吴文林
周燕
万渝平
郭添荣
韩世鹤
高媛
石拓
黄霞
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Chengdu Food And Drug Inspection Institute
Chinese Academy of Inspection and Quarantine CAIQ
Chengdu Institute of Biology of CAS
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Chengdu Food And Drug Inspection Institute
Chinese Academy of Inspection and Quarantine CAIQ
Chengdu Institute of Biology of CAS
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Abstract

本发明属于兽药残留检测领域，具体涉及一种畜禽肉及其副产品中兽药化合物残留的检测方法。本发明的方法包括如下步骤：(1)建立兽药化合物标准品的多维电子身份数据库，包括：(1)将待测样品制备成供试品溶液；(2)采用UHPLC‑Q/Orbitrap对供试品溶液进行检测，得到色谱图和质谱图；(3)根据色谱图和质谱图得到兽药化合物残留的检测结果；其中，步骤(2)中色谱条件为：色谱柱采用C18柱，流动相A为含0.1％甲酸和20mmol/L乙酸铵的水溶液，流动相B为乙腈。本发明提供的技术方案能够对各种动物源食品中的兽药化合物残留进行非靶向的批量、快速、高效的检测。检测的兽药化合物的种类更加全面，更加符合实际应用需求，具有很高的应用价值。

Description

一种畜禽肉及其副产品中兽药化合物残留的检测方法
技术领域
本发明属于兽药残留检测领域，具体涉及一种畜禽肉及其副产品中兽药化合物残留的检测方法。
背景技术
猪牛羊鸡等畜禽肉以及猪肝、鸡肝等畜禽副产品是人类摄取高质量蛋白、脂肪以及必须氨基酸等营养素的主要来源，是人们一日三餐中的主要食品原料之一，随着我国居民生活水平的不断提高，人们对动物源食品消费需求量也日益增长。兽药的特别功效包括疾病防治与生长改良促进等，兽药在保护食品动物生长、提高产业收益、保障动物源食品储存质量等方面起到了至关重要的作用。然而，兽药是一柄“双刃剑”，合理使用可大大缓解人口增长与食物供给之间矛盾，而超量使用则不仅直接影响食品安全，还间接影响生态环境和动物源食品贸易。兽药残留安全问题是动物源食品安全中的主要问题，食品中兽药安全问题已经受到政府部门的高度重视和人民大众的广泛关注。因而兽药残留的检测，是一项非常重要的工作。
但是，畜禽肉及副产品基质复杂，而各类残留兽药含量甚微且极性差别大，因而利用一次检测获得多种兽药残留的信息是很困难的。传统的兽药残留检测方法包括酶联免疫法、液相色谱法、液质联用法等，但多数仅能针对具有同类基本结构的少量兽药进行检测，难以实现对不同化学结构的大批量兽药同时检测。
中国发明专利“CN111060638A-一种动物性食品中207种兽药及添加物的筛查与确证方法”提出了一种利用UHPLC-Q/Orbitrap同时检测207种兽药化合物的方法，然而，其检测的兽药化合物种类仍然不能覆盖部分激素、大环内酯类抗生素以及玉米赤霉醇类化合物等主流的兽药种类，无法满足实际应用的需求。因而，仍然有必要提出其他对兽药化合物的种类覆盖更加全面的检测方法。
发明内容
针对现有技术中存在的问题，本发明提供一种畜禽肉及其副产品中兽药化合物残留的检测方法，实现了基于UHPLC-Q/Orbitrap，对种类更加全面地兽药化合物进行检测。
一种畜禽肉及其副产品中兽药化合物残留的检测方法，包括如下步骤：
(1)将待测样品制备成供试品溶液；
(2)采用UHPLC-Q/Orbitrap对供试品溶液进行检测，得到色谱图和质谱图；
(3)根据色谱图和质谱图得到兽药化合物残留的检测结果；
其中，步骤(2)中色谱条件为：色谱柱采用C18柱，流动相A为含0.02-0.1％甲酸和2.5-20mmol/L乙酸铵的水溶液，流动相B为乙腈。
优选的，所述兽药化合物选自雄性激素、雌性激素、孕激素、糖皮质激素、玉米赤霉醇类化合物、β-受体激动剂、磺胺类抗菌素药物、喹诺酮类抗菌素或大环内酯类抗生素中的至少一种。
优选的，所述兽药化合物选自去氢睾酮、表睾酮、氟甲睾酮、甲睾酮、丙酸诺龙、诺龙、丙酸睾酮、群勃龙、美雄酮、苯丙酸诺龙、司坦唑醇、去甲雄烯二酮、雄烯二酮、17α-甲基异睾酮、美雄醇、表雄酮、17β-羟基雄烷-3-酮、美睾酮、达那唑、烯丙孕素、氯地孕酮醋酸酯、左炔诺孕酮、甲羟孕酮醋酸酯、醋酸甲地孕酮、醋酸美仑孕酮、炔诺酮、醋酸炔诺酮、21-α-羟基孕酮、炔诺醇、17-α-羟孕酮、丙酸倍氯米松、倍他米松、醋酸可的松、氢化可的松、甲基泼尼松龙、泼尼松龙、曲安奈德、曲安西龙、可的松、地塞米松、醋酸氢化可的松、倍氯米松、氟米松、布地奈德、醋酸氟轻松、醋酸氟氢可的松、氟米龙、丙酸氯倍他索、醛固酮、泼尼松、雌三醇、雌酮、己二烯雌酚、己烯雌酚、己烷雌酚、雌二醇、辛基酚、4-壬基酚、双酚A、炔雌醇、α-玉米赤霉烯醇、β-玉米赤霉烯醇、玉米赤霉酮、α-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇、克伦特罗、莱克多巴胺、氯丙那林、喷布特罗、奥西那林、福莫特罗、非诺特罗、塞布特罗、班布特罗、沙丁胺醇、特布他林、妥布特罗、西马特罗、马布特罗、磺胺苯吡唑、磺胺苯酰、磺胺吡啶、磺胺醋酰、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺噁唑、磺胺二甲基异噁唑、磺胺二甲基嘧啶、磺胺二甲基异嘧啶、磺胺甲基异噁唑、磺胺甲基嘧啶、磺胺甲氧哒嗪、磺胺间二甲氧嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺喹噁啉、磺胺邻二甲氧嘧啶、磺胺氯吡嗪、磺胺氯哒嗪、磺胺脒、磺胺嘧啶、磺胺噻唑、磺胺甲噻二唑、磺胺、磺胺硝苯、奥比沙星、达氟沙星、恩诺沙星、氟甲喹、氟罗沙星、环丙沙星、洛美沙星、萘啶酸、诺氟沙星、培氟沙星、沙拉沙星、双氟沙星、司帕沙星、依诺沙星、氧氟沙星、红霉素、吉他霉素、林可霉素、泰乐菌素、替米考星、泰万菌素、竹桃霉素、多拉菌素、伊维菌素、罗红霉素中的至少一种。
优选的，步骤(1)中，制备所述供试品溶液的方法为：将所述待测样品匀浆，用含甲酸的乙腈水溶液提取，取上清液，经反相固相萃取，吹干后定容，即得。
优选的，步骤(1)中，所述含甲酸的乙腈水溶液为含有0.2％甲酸体积分数80％的乙腈水溶液；
和/或，所述待测样品与所述含甲酸的乙腈水溶液的用量比例为2g∶10mL；
和/或，所述上清液的分离方法为加入匀质子，2000r/min旋涡振荡30min，9500r/min离心5min，取上清液；
和/或，所述反相固相萃取的固相萃取柱填料为Oasis PRiME HLB；
和/或，所述反相固相萃取的固相萃取柱填料量为3cc 200mg；
和/或，所述反相固相萃取中过固相萃取柱的速度为1滴/s；
和/或，定容后，还对所述供试品溶液进行过滤膜的操作，所述滤膜聚四氟乙烯膜。
优选的，步骤(2)中，所述色谱条件还包括：所述色谱柱为Waters Acquity BEHC18；和/或，色谱柱温度30-40℃；和/或，流速：0.3-0.5mL/min；和/或，进样量5-15μL；
和/或，梯度洗脱程序：
Figure BDA0003076052100000031
和/或，质谱条件为：
加热电喷雾离子源；扫描采集方式：正负离子同时采集，一级全扫描/数据依赖二级扫描；和/或，喷雾电压：3.5kV(+)，-3.0kV(-)；和/或，离子传输管及加热器温度：325℃、450℃；和/或，鞘气及辅助气流速：35arb、10arb；和/或，采集范围：100-1000m/z；和/或，分辨率：Full MS 75000、dd-MS217500；和/或，Stepped(N)CE(20％，40％，60％)；和/或，C-Trap中离子数最大容量：Full MS 3×106、dd-MS22×105；和/或，C-Trap中最大注入时间：Full MS 100ms、dd-MS250ms；
和/或，所述Q/Orbitrap质谱的质量轴调谐校正，所述质量轴调谐校正为：将Calmix校正液注射进入质谱仪器中，调试并观察Calmix校正液特征离子峰，当正、负离子的离子峰均已出峰稳定后，用调谐应用软件进行自动校正。
优选的，还包括建立兽药化合物标准品的多维电子身份数据库的步骤，所述多维电子身份数据库包括：兽药化合物标准品的基本信息、色谱信息和质谱信息；
步骤(3)中，通过将所述色谱图和质谱图与所述多维电子身份数据库中的信息进行对比，得到兽药化合物残留的检测结果。
优选的，所述基本信息包括化合物中英文名称、CAS号、化学分子式和理论精确分子质量数；
和/或，所述色谱信息包括保留时间；
和/或，所述质谱信息包括母离子质量数、碎片离子质量数、离子加合方式和质谱响应面积对标准品浓度的标准曲线。
优选的，所述多维电子身份数据库包括一级精确质量数指纹识别数据库和二级HCD碎片离子参考谱图确证库；
所述一级精确质量数指纹识别数据库是将兽药化合物的基本信息、色谱信息和质谱信息在Trace Finder数据采集与处理软件中依次录入形成的指纹识别数据库；
所述二级HCD碎片离子参考谱图确证库是将兽药化合物在高能碰撞池中最优碰撞能量下裂解得到的二级HCD碎片离子质谱图在mzVault谱图管理软件中添加收录形成的谱图确证库，所述最优碰撞能量是在出现3-5个选择离子丰度比最大的碎片离子时，记录的碰撞能量值CE(20％，40％，60％，ev)。
优选的，步骤(3)中，判断某一兽药化合物呈阳性的标准是在5ppm质量窗口范围内进行提取的原始数据满足以下所有条件：
1)母离子质谱峰的保留时间误差范围在±15s内；
2)母离子质量数偏差小于等于5ppm；
3)二级质谱图中碎片离子的匹配个数大于等于2个，且碎片离子质量数偏差小于等于10ppm。
本发明的技术方案具有如下有益效果：
(1)本发明对畜禽肉及其副产品的提取条件、色谱条件及质谱条件进行了优化，使得本发明的检测方法能够一次测试实现对雄性激素、雌性激素、孕激素、糖皮质激素、玉米赤霉醇类化合物、β-受体激动剂、磺胺类抗菌素药物、喹诺酮类抗菌素和大环内酯类抗生素等9类兽药化合物残留的检测。相比于其他现有技术，本发明检测的兽药化合物的种类更加全面，更加符合实际应用需求。
(2)优选方案中，本发明提出一种基于UHPLC-Q/Orbitrap的动物源食品中兽药化合物多维电子身份数据库的构建方法及侦测平台，基于UHPLC-Q/Orbitrap技术在获得色谱和质谱信息的基础上，建立了兽药化合物的多维电子身份数据库，以电子身份取代实物标准品，可实现自动化、多目标、高精度、高效率的非靶向兽药残留侦测。对实现动物源食品中上百种痕量兽药残留的多目标快速锁定与甄别确证具有重要意义。采用本发明的方法，对多种兽药化合物进行批量处理时更加简单高效，对操作人员的知识和经验水平要求较低，有利于本发明技术的广泛应用。
(3)优选方案中，本发明以兽药化合物多维电子身份数据库及侦测平台为基础的高通量侦测方法，取代了以实物标准品参考对照的传统靶向定性分析方法，实现了兽药残留由已知分析物靶向侦测向未知分析物高通量非靶向侦测技术的跨越式发展。不仅缩短了样品分析时间，提高了样品检测效率，还节省了资源，减少了污染，满足了可持续发展与环境友好的要求。
(4)优选方案中，依据目标化合物的保留时间、精确质量数、离子丰度比、碰撞能量、二级HCD碎片离子图等信息，通过检索比对待测兽药化合物采集信息与数据库中的多维电子身份信息，以一级精确质量数指纹识别数据库(MS1)中色质谱指纹信息筛查识别，再配以二级HCD碎片离子参考谱图确证库(MS2)中特征谱图确证，保证了药物精准定性筛查结果的准确性。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1实施例1中牛肉样品中阳性组分提取离子流色谱图。
图2实验例1中128种兽药在Waters Acquity BEH C18上的选择离子色谱图。
图3实验例1中3种典型兽药峰型优化后的离子色谱图
图4实验例1中三种典型“瘦肉精”化合物的二级质谱图。
具体实施方式
实施例及实验例所用仪器、试剂与材料如下：
(1)实验仪器
UHPLC/Q Exactive Plus超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱系统(配有HESI离子源，Trace Finder数据采集与处理软件和mzVault谱图管理软件，美国Thermo Fisher公司)；Milli-Q超纯水系统(美国Millipore公司)；ME203型电子天平(瑞士Mettler Toledo公司)，Waters Acquity BEH C18色谱柱(2.1mm×100mm，1.7μm，美国Waters公司)。
(2)实验试剂
乙腈、甲醇均为质谱级(美国Thermo Scientific公司)；甲酸、乙酸铵均为质谱级(美国Sigma Aldrich公司)；陶瓷均质子(美国Agilent公司)；Oasis HLB、Oasis PRiME HLB固相萃取柱(美国Waters公司)；Captiva EMR Lipid固相萃取柱(美国Agilent公司)；25℃-电阻率为18.2MΩ×cm超纯水(美国Millipore公司)；128种兽药标准品纯度均≥90.0％(德国Dr.Ehrenstorfer GmbH公司、美国Sigma Aldrich公司、美国Cato Research ChemicalsInc公司以及中国食品药品检定研究院、天津阿尔塔科技有限公司)
(3)实验材料
112批次畜禽肉及副产品(猪肉、牛肉、羊肉、鸡肉各24批次，猪肝、鸡肝各8批次)均购自当地超市和农贸市场。
实施例1
一、标准溶液的配制
(1)标准储备液：准确称取各标准品2mg，依次用乙腈稀释并定容至1mg/mL的标准储备液，于-18℃避光保存。
(2)混合标准工作液：准确移取标准储备液各100μL于10mL容量瓶中，用乙腈稀释至刻度配制成16个浓度为10μg/mL的混合标准中间液I，分别准确移取混合标准中间液I各100μL，用乙腈定容至10mL，配制成浓度为100ng/mL的混合标准中间溶液II；再准确移取混合标准中间液II0.1、0.5、1、2和5mL，配制成浓度为1、5、10、20和50ng/mL的混合标准工作溶液，于-18℃避光保存。
二、高通量样品前处理方法
畜禽肉及其副产品的样品按照GB/T 30891-2014的要求制样后装入洁净的容器内密封并标识，准确称取2.00g(精确至0.01g)匀浆样品，转移至50mL聚丙烯离心管中，缓慢添加含0.2％甲酸的80％体积分数乙腈水溶液10mL，静置10min后再加入两粒陶瓷均质子，快速剧烈振摇并旋涡振荡30min(2000r/min)使样品充分散开，9500r/min高速离心5min，取上清液待净化。取上清液5mL，经固相萃取柱净化后收集4mL后半段流出液，并准确量取2mL用氮气吹干至1mL，初始流动相定容，过滤膜，待上机测试。取上清液5mL，以1滴/s过6cc 200mg的Oasis PRiME HLB固相萃取柱。收集4mL后半段流出液并准确量取2mL，氮气下吹干，1mL初始流动相定容，过0.22μm聚四氟乙烯滤膜，得到供UHPLC-Q/Orbitrap测试的供试品溶液。
三、一次进样进行UHPLC-Q/Orbitrap仪器分析
仪器分析条件如下：
UHPLC条件：色谱柱：Waters Acquity BEH C18(2.1mm×100mm，1.7μm)；色谱柱温度：40℃。流速：0.5mL/min；流动相A(水相)为含0.1％甲酸的20mmol/L乙酸铵水溶液，流动相B(有机相)为乙腈。梯度洗脱程序：首先将初始流动相A相为98％使极性大的物质先出峰，随后降低乙腈的起始浓度并保持浓度缓慢增加至100％，再将乙腈浓度降至初始浓度水平并平衡保持。梯度洗脱程序设置见表1。进样量：10μL。
表1液相色谱流动相梯度洗脱程序
Figure BDA0003076052100000071
Figure BDA0003076052100000081
Q/Orbitrap高分辨质谱条件：离子源：加热电喷雾离子源；扫描采集方式：正负离子同时采集，一级全扫描/数据依赖二级扫描(Full MS/dd-MS2)(Top N)；喷雾电压：3.5kV(+)，-3.0kV(-)；离子传输管及加热器温度：325℃、450℃；鞘气及辅助气(N2)流速：35arb、10arb；采集范围：100-1000m/z；分辨率：75000(Full MS)、17500(dd-MS2)；Stepped(N)CE(20％，40％，60％)；C-Trap中离子数最大容量(AGC target)：3×106(Full MS)、2×105(dd-MS2)；C-Trap中最大注入时间：100ms(Full MS)、50ms(dd-MS2)。
四、建立128种兽药多维电子身份数据库
多维电子身份数据库作为兽药的电子身份证数据库，可在后期无标准品对照条件对128中兽药进行快速锁定识别与甄别确证。兽药化合物的多维电子身份数据库包括兽药化合物标准品的基本信息、色谱信息和质谱信息。所述基本信息包括化合物中英文名称、CAS号、化学分子式和理论精确分子质量数；所述色谱信息包括保留时间；所述质谱信息包括母离子质量数、碎片离子质量数、离子加合方式和质谱响应面积对标准品浓度的标准曲线。
所述多维电子身份数据库包括一级精确质量数指纹识别数据库(MS1)和二级HCD碎片离子参考谱图确证库(MS2)。所述一级精确质量数指纹识别数据库是将兽药化合物的基本信息、色谱信息和质谱信息在Trace Finder数据采集与处理软件中依次录入形成的指纹识别数据库。所述二级HCD碎片离子参考谱图确证库是将兽药化合物在高能碰撞池中最优碰撞能量下裂解得到的二级HCD碎片离子质谱图在mzVault谱图管理软件中添加收录形成的谱图确证库，所述最优碰撞能量是在出现3-5个选择离子丰度比最大的碎片离子时，记录的碰撞能量值，Stepped(N)CE(20％，40％，60％)。
本实施例按照上述方法建立了128种兽药化合物的多维电子身份数据库，128种兽药化合物的具体信息如下表所示：
表2 UHPLC-Q/Orbitrap 128种兽药化合物信息
Figure BDA0003076052100000091
Figure BDA0003076052100000101
Figure BDA0003076052100000111
Figure BDA0003076052100000121
五、数据处理与分析
在TraceFinder分析软件中，运用建立好的高分辨质谱数据库对UHPLC-Q/Orbitrap采集的样品数据进行检索匹配分析，利用质谱软件的自动去卷积功能，并与化合物数据库(Compound Database)中的保留时间、精确母离子质量数、碎片离子质量数、二级质谱图等相关参数进行对比甄别鉴定。
判断某一兽药化合物呈阳性的标准是在5ppm质量窗口范围内进行提取的原始数据满足以下所有条件：
1)母离子质谱峰的保留时间误差范围在±15s内；
2)母离子质量数偏差小于等于5ppm；
3)二级质谱图中碎片离子的匹配个数大于等于2个，且碎片离子质量数偏差小于等于10ppm。
对于判断为阳性的兽药化合物，可将其质谱响应面积代入多维电子身份数据库中的标准曲线，计算得到其在畜禽肉及其副产品中的含量。
通过上述方法，对112批次(其中猪肉、牛肉、羊肉、鸡肉各24批次，猪肝和鸡肝各8批次)样品进行检测。侦测共检出兽药残留24种，共计检出兽药残留频次71次，涉及样品71批次(猪肉和鸡肉各17批次，牛肉14批次，羊肉11批次)。具体结果见表3。
表3畜禽肉及副产品中兽药残留侦测结果
Figure BDA0003076052100000122
Figure BDA0003076052100000131
对照兽药限量国家标准GB 31650-2019要求，发现128种兽药中大多数虽然超出方法定量限，但都低于国家标准的限量值。其中1批次牛肉中同时检出限用兽药地塞米松和限用兽药林可霉素。问题牛肉样品中阳性化合物的提取图见图1。
实验例1 UHPLC-Q/Orbitrap仪器分析条件的优选
(1)色谱柱及柱温的选择
本发明需要同时实现对128种性质不同兽药的有效分离，需要选取兼容性、柱效较好且耐用的色谱柱及柱温。实验首先对比了Thermo Accucore aQ C18(2.1mm×100mm，2.6μm)、Agilent Eclipse plus C18(3.0mm×150mm，1.8μm)以及Waters Acquity BEH C18(2.1mm×100mm，1.7μm)三种色谱柱对128种化合物的分离效果。部分兽药在ThermoAccucorea Q C18和Agilent Eclipse plus C18色谱柱上均存在不同程度的峰型拖尾和峰型较差的现象。而Waters Acquity BEH C18色谱柱能够较好保留128种激素化合物，峰型无明显拖尾且尖锐对称。
色谱柱温度往往影响着色谱分离效率，实验考察了4种不同柱温(20℃-50℃范围内以5℃递增)下的出峰效果，实验发现：①20℃-25℃区间，随着温度的升高，出峰效果明显大幅增强。②40℃-50℃区间，绝大部分化合物的保留时间和出峰效果变化不再明显。为了节能和省时，故选择40℃作为柱温。128种兽药在Waters Acquity BEH C18上的选择离子色谱图见图2。
(2)流动相体系及流速的选择
流动相体系及流速设置直接影响分析物的保留时间和峰型。实验所涉及到的128种药物能比较容易的溶于乙腈，是中、弱极性的药物。分别选取了4种不同(乙腈-水及其条件下添加不同浓度乙酸铵)流动相组合进行质谱分析，结果显示：乙腈-20mmol/L乙酸铵溶液中添加0.1％甲酸，此时各待测物色谱峰形最好，基质干扰达到最小。因此，最终选择水相为0.1％甲酸-乙酸铵(20mmol/L)水溶液，有机相为乙腈。
同时，实验考察了三种不同流速下对待测物的分离效果。结果表明在三种流速(0.3/0.4/0.5，mL/min)下均能实现对128种兽药的分离，当流速为0.5mL/min时，不仅色谱峰型尖锐，回收率较高，还能有效提高检测效率，符合兽药多残留分析检测的要求。3种典型兽药峰型优化后的离子色谱图见图3。
(3)梯度洗脱程序的选择
本发明拟实现对6种基质中的128种兽药开展多目标同时检测，采用梯度洗脱以实现完好分离。综合考虑峰型、灵敏度、出峰时间等因素，梯度洗脱程序设置见表1。
(4)扫描采集方式的选择
本发明对Full MS、Full MS/dd-MS2以及选择离子扫描(Target-SIM)/dd-MS2三种扫描采集方式进行了考察对比分析，试验结果显示：Full MS模式虽可完成定量检测，但在定性方面仅依靠母离子精确质量数和保留时间作为参考依据，对碎片离子分析的缺失易造成定性不准；Target-SIM/dd-MS2模式是以母离子和碎片离子精确质量数作为定性依据而提高了目标物的定性能力，但其定量水平欠佳。Full MS/dd-MS2则可同时实现对目标兽药的定性(两级离子精确质量数)筛查与定量(一级离子)检测，此条件下128种化合物的精确质量相对偏差均小于1ppm，满足实验需求。故扫描方式为Full MS/dd-MS2。
(5)质谱分辨率的选择
质谱扫描的质量分辨率决定着离子质量数的精确度，通常需要同时兼顾选择性和灵敏度两个因素。本发明将一级和二级质谱的分辨率设置多种数据并进行了对比分析，试验表明，当一级全扫描质量分辨率R＝140000(超高分辨率)时，扫描选择性很强但灵敏度下降，采集到的点数过少；当一级全扫描质量分辨率R＝75000(高分辨率)时，待测物与杂质间实现基线分离的比例最佳且响应值得到提高。故两级质谱扫描分辨率75000/17500。
(6)二级质谱参数的选取
在全扫描的基础上罗列目标物，不同阀值条件下测试发现，二级质谱自动触发时强度阀值＝50000。此外，发现部分物质存在二级质谱采集点数较少的情况，尤其是个别同分异构体物质仅能采集到二个以内的二级质谱，造成此类现象的原因可能与动态排除(Dynamic exclusion)参数设置范围不佳或开启顶点激发(Apex trigger)等因素有关。首先，确认了半峰宽为Dynamic exclusion的最佳时间，深度优化后可得到时间分别为6s、3s，考虑到需要兼顾128种兽药的不同峰宽窄，最终确定Dynamic exclusion＝3s。其次，采用20％、40％、60％三种不同归一化碰撞能(Stepped(N)CE)对化合物进行碎裂，得到一张碎片离子信息丰富的加合图。再次，在开启顶点激发条件下，发现存在个别化合物难以在顶点处激发二级，这可能是由于待测化合物数量众多且各物质间存在明显的峰宽差异造成的，故不启用顶点激发功能，采集前三强(TopN＝3)时可获得满意二级质谱图。在选择的二级质谱条件下三种典型“瘦肉精”化合物的二级质谱图见图4。
实验例2样品前处理方法的优选
畜禽肉及副产品中存在多种基质干扰杂质，这些干扰物质不仅会污染色谱柱，还可能会产生严重的基质抑制，最终影响待测药物测定的灵敏度和准确度。本实验例分别从提取、净化和针式滤膜选择等板块来优化通过式反相固相萃取样品前处理技术。
(1)提取溶剂、提取溶剂体积及提取次数的选择
提取试剂能够将兽药从样品基质中提取出来，而不同提取剂效果差异明显。兽药常用提取剂有乙酸乙酯、乙腈、乙腈水溶液等，本实验例考察了乙酸乙酯、乙睛、80％乙腈水溶液、90％乙腈水溶液、0.2％甲酸-80％乙腈水溶液、1.0％甲酸-80％乙腈水溶液等6种提取剂对128种兽药的提取效果。
结果显示：乙腈水溶液提取效率明显高于乙酸乙酯和纯乙腈，90％体积分数的乙腈水溶液提取效果率低于80％体积分数的乙腈水溶液，适量甲酸的加入，可有效增加兽药的稳定性并高水平沉淀了样品中的蛋白质并实现了对目标物的提取，而0.2％甲酸提取效率高于1.0％甲酸。故0.2％甲酸-80％乙腈水溶液相较于其他5种提取溶剂有更好的提取效率。
为尽可能地使目标物完全提取，需要确定适量的提取溶剂体积。本实验例以80％乙腈水溶液(含0.2％甲酸)作为提取溶剂，分别考察提取溶剂体积为5、10和15mL三种是提取溶剂体积对待测药物提取效果的影响。结果显示，在三种不同提取溶剂体积下，样品中兽药提取效果的高低排名为：10mL＞15mL＞5mL。当提取溶剂为10mL时，目标化合物己基本实现提取完全，提取效果最好。
畜禽肉及副产品多为固体基质，与提取溶液不混溶。本实验例以在选取提取溶剂的基础上分3次提取，评价提取次数对兽药提取效果的影响。结果显示，样品在提取1次、提取2次和提取3次情况下，样品中药物的提取效果无显著性差异，可能是因为在0.2％甲酸-80％乙腈水溶液下1次提取已实现对药物的完全提取。从工作效率和实验成本等方面综合考虑，选择1次提取。
(2)样品均质离心提取条件的优化
兽药残留检测过程中，通过均质和离心作用，可以使样品充分混合均匀后组分分散，并达到良好的一致性。本实施例在上述实验条件下3种均质离心条件(A.均质子+旋涡振荡2000r/min*30min+离心9500r/min*5min；B.均质子+旋涡振荡2000r/min*30min+6000r/min*10min；C.旋涡振荡2000r/min*30min+9500r/min*5min)对样品的混匀与分散效果，结果显示，样品的分散式和提取效果：A＞B＞C。
(3)固相萃取柱及填料量的选择
畜禽肉及副产品，尤其是动物肝脏样品基质复杂，样品经提取后仍需净化。本实施例考察C18、Oasis HLB、Oasis PRiME HLB和Captiva EMR Lipid四种萃取柱对兽药的分离净化效果。当采用C18时，128种兽药的平均回收率最低，说明传统C18吸附剂难以同时兼顾所有兽药性质，Oasis PRIME HLB的净化效果均明显优于Oasis HLB和Captiva EMR Lipid，表明Oasis PRIME HLB能够更好地对样品中的磷脂和蛋白质等杂质进行吸附。
本实验例同步考察了Oasis PRiME HLB不同填料用量(1cc 30mg/3cc 60mg/3cc150mg/6cc 200mg/6cc 500mg)对目标物的吸附净化效果。结果显示，当填料由1cc 30mg增加到3cc 200mg时，萃取效率迅速提高；当填料量为6cc 200mg和6cc 500mg时，两者对畜禽肉中药物的吸附净化效果相当，但前者对畜禽副产品基质的吸附效果均最好。
(4)针式滤膜的选择
针式滤膜主要起到过滤上机测试液中颗粒物质的作用，样品经提取、净化步骤后，待测试液中仍然悬浮着少量絮状物。本实施例考察了0.22μm聚四氟乙烯(A)、0.22μm尼龙滤膜(B)和0.22μm聚醚砜(C)三种滤膜对兽药的净化效果。结果显示，样品溶液经过三种不同材料的针式滤膜过滤后，均有大量化合物检出，三种滤膜过滤效果依次为：0.22μm聚四氟乙烯＞0.22μm尼龙滤膜>0.22μm聚醚砜。
实验例3方法学考察与验证
(1)基质效应评价
相较于三重四级杆等低分辨质谱，UHPLC-Q/Orbitrap高分辨质谱在抗干扰能力方面优势明显，但仍未根本解决基质效应问题。本研究涉及的样品品种多且基质复杂，故须进行基质效应评价。内标法降低基质效应影响效果最好，但本研究涉及的药物种类过多，内标昂贵且难得，因此本实施例采用响应面法作为考察方法。将128种兽药标准品分别通过猪肉、牛肉等6类基质以及甲醇制备为标准溶液，通过甲醇纯溶剂和基质溶液中同一物质的标准曲线斜率之比，对化合物的基质效应状况进行评价。结果显示，6类基质均存在基质效应，尤其是猪肉、牛肉基质的基质效应更为明显。样品存在基质效应，会在一定程度上影响部分化合物的定量测定，前期可通过样品前处理和仪器条件优化来有效降低基质效应，同时在定量环节通过基质匹配标准曲线来消除或减弱基质效应的影响。
(2)方法的线性范围、检出限以及定量限
基于UHPLC-Q/Orbitrap技术，具有优异的定性能力，但仍无法绝对避免基质效应的干扰。因此，本实验例选用基质匹配标准溶液建立标准曲线，以期消除或减弱基质效应。以猪肉样品为例，采用猪肉空白提取液配制128种化合物的标准工作液，优化条件后上机分析测定。以化合物峰面积(Y)及其所对应浓度(X)绘制标准曲线并计算线性回归方程及其相关系数(r)，分别以(S/N＝3)和(S/N＝10)计算LOD和LOQ。结果显示，当质量浓度处于0.5-2000ng/mL这一区间范围内时，猪肉中128种兽药化合物的基质匹配标准曲线可显示出良好的线性关系，r均大于0.995。LOD、LOQ依次为0.1-20μg/kg、0.2-100μg/kg，均满足实验需求。猪肉中128种兽药的线性关系、检出限、定量限见表4。
表4猪肉中128种兽药的线性关系、检出限、定量限
Figure BDA0003076052100000181
Figure BDA0003076052100000191
Figure BDA0003076052100000201
(3)回收率与精密度
本实例分别在猪肉、牛肉、羊肉、鸡肉、猪肝、鸡肝的空白样品中添加128种兽药化合物的标准溶液配制成阳性样品，按照已建立的前处理方法和仪器分析方法，在1倍LOQ、5倍LOQ和10倍LOQ下各重复测定6次，求解得到回收率及RSD。结果显示，添加水平在1倍LOQ-10倍LOQ时，方法回收率范围在68.7％-117.1％之间，相对标准偏差(RSD)在0.9％-9.7％之间。其中，猪肉回收率介于68.7％-112.5％，RSD介于0.9％-9.7％；牛肉回收率介于70.7％-108.9％，RSD介于1.6％-9.6％；羊肉回收率介于73.7％-103.6％，RSD介于2.1％-8.8％；鸡肉回收率介于69.3％-106.5％，RSD介于1.2％-9.1％；猪肝回收率介于71.7％-117.1％，RSD介于1.8％-9.3％；鸡肝回收率介于72.1％-97.8％，RSD介于3.6％-7.8％，实例表明准确性和精密度均能满足实验需求。128种兽药在畜禽肉及副产品中回收率与精密度间见表5。
Figure BDA0003076052100000221
Figure BDA0003076052100000231
Figure BDA0003076052100000241
Figure BDA0003076052100000251
通过上述实施例和实验例可见，本发明提供的技术方案实现了对雄性激素、雌性激素、孕激素、糖皮质激素、玉米赤霉醇类化合物、β-受体激动剂、磺胺类抗菌素药物、喹诺酮类抗菌素和大环内酯类抗生素等9类兽药化合物残留的检测。相比于其他现有技术，本发明检测的兽药化合物的种类更加全面，更加符合实际应用需求，具有很高的应用价值。

Claims (10)

1.一种畜禽肉及其副产品中兽药化合物残留的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将待测样品制备成供试品溶液；
(2)采用UHPLC-Q/Orbitrap对供试品溶液进行检测，得到色谱图和质谱图；
(3)根据色谱图和质谱图得到兽药化合物残留的检测结果；
其中，步骤(2)中色谱条件为：色谱柱采用C18柱，流动相A为含0.02-0.1％甲酸和2.5-20mmol/L乙酸铵的水溶液，流动相B为乙腈。
2.按照权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述兽药化合物选自雄性激素、雌性激素、孕激素、糖皮质激素、玉米赤霉醇类化合物、β-受体激动剂、磺胺类抗菌素药物、喹诺酮类抗菌素或大环内酯类抗生素中的至少一种。
3.按照权利要求2所述的检测方法，其特征在于：所述兽药化合物选自去氢睾酮、表睾酮、氟甲睾酮、甲睾酮、丙酸诺龙、诺龙、丙酸睾酮、群勃龙、美雄酮、苯丙酸诺龙、司坦唑醇、去甲雄烯二酮、雄烯二酮、17α-甲基异睾酮、美雄醇、表雄酮、17β-羟基雄烷-3-酮、美睾酮、达那唑、烯丙孕素、氯地孕酮醋酸酯、左炔诺孕酮、甲羟孕酮醋酸酯、醋酸甲地孕酮、醋酸美仑孕酮、炔诺酮、醋酸炔诺酮、21-α-羟基孕酮、炔诺醇、17-α-羟孕酮、丙酸倍氯米松、倍他米松、醋酸可的松、氢化可的松、甲基泼尼松龙、泼尼松龙、曲安奈德、曲安西龙、可的松、地塞米松、醋酸氢化可的松、倍氯米松、氟米松、布地奈德、醋酸氟轻松、醋酸氟氢可的松、氟米龙、丙酸氯倍他索、醛固酮、泼尼松、雌三醇、雌酮、己二烯雌酚、己烯雌酚、己烷雌酚、雌二醇、辛基酚、4-壬基酚、双酚A、炔雌醇、α-玉米赤霉烯醇、β-玉米赤霉烯醇、玉米赤霉酮、α-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇、克伦特罗、莱克多巴胺、氯丙那林、喷布特罗、奥西那林、福莫特罗、非诺特罗、塞布特罗、班布特罗、沙丁胺醇、特布他林、妥布特罗、西马特罗、马布特罗、磺胺苯吡唑、磺胺苯酰、磺胺吡啶、磺胺醋酰、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺噁唑、磺胺二甲基异噁唑、磺胺二甲基嘧啶、磺胺二甲基异嘧啶、磺胺甲基异噁唑、磺胺甲基嘧啶、磺胺甲氧哒嗪、磺胺间二甲氧嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺喹噁啉、磺胺邻二甲氧嘧啶、磺胺氯吡嗪、磺胺氯哒嗪、磺胺脒、磺胺嘧啶、磺胺噻唑、磺胺甲噻二唑、磺胺、磺胺硝苯、奥比沙星、达氟沙星、恩诺沙星、氟甲喹、氟罗沙星、环丙沙星、洛美沙星、萘啶酸、诺氟沙星、培氟沙星、沙拉沙星、双氟沙星、司帕沙星、依诺沙星、氧氟沙星、红霉素、吉他霉素、林可霉素、泰乐菌素、替米考星、泰万菌素、竹桃霉素、多拉菌素、伊维菌素、罗红霉素中的至少一种。
4.按照权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤(1)中，制备所述供试品溶液的方法为：将所述待测样品匀浆，用含甲酸的乙腈水溶液提取，取上清液，经反相固相萃取，吹干后定容，即得。
5.按照权利要求4所述的检测方法，其特征在于：步骤(1)中，所述含甲酸的乙腈水溶液为含有0.2％甲酸体积分数80％的乙腈水溶液；
和/或，所述待测样品与所述含甲酸的乙腈水溶液的用量比例为2g:10mL；
和/或，所述上清液的分离方法为加入匀质子，2000r/min旋涡振荡30min，9500r/min离心5min，取上清液；
和/或，所述反相固相萃取的固相萃取柱填料为Oasis PRiME HLB；
和/或，所述反相固相萃取的固相萃取柱填料量为3cc 200mg；
和/或，所述反相固相萃取中过固相萃取柱的速度为1滴/s；
和/或，定容后，还对所述供试品溶液进行过滤膜的操作，所述滤膜聚四氟乙烯膜。
6.按照权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤(2)中，所述色谱条件还包括：所述色谱柱为Waters Acquity BEH C18；和/或，色谱柱温度30-40℃；和/或，流速：0.3-0.5mL/min；和/或，进样量5-15μL；
和/或，梯度洗脱程序：
Figure FDA0003076052090000021
Figure FDA0003076052090000031
和/或，质谱条件为：
加热电喷雾离子源；扫描采集方式：正负离子同时采集，一级全扫描/数据依赖二级扫描；和/或，喷雾电压：3.5kV(+)，-3.0kV(-)；和/或，离子传输管及加热器温度：325℃、450℃；和/或，鞘气及辅助气流速：35arb、10arb；和/或，采集范围：100-1000m/z；和/或，分辨率：Full MS 75000、dd-MS2 17500；和/或，Stepped(N)CE(20％，40％，60％)；和/或，C-Trap中离子数最大容量：Full MS 3×106、dd-MS2 2×105；和/或，C-Trap中最大注入时间：FullMS 100ms、dd-MS2 50ms；
和/或，所述Q/Orbitrap质谱的质量轴调谐校正，所述质量轴调谐校正为：将Calmix校正液注射进入质谱仪器中，调试并观察Calmix校正液特征离子峰，当正、负离子的离子峰均已出峰稳定后，用调谐应用软件进行自动校正。
7.按照权利要求1所述的检测方法，其特征在于：还包括建立兽药化合物标准品的多维电子身份数据库的步骤，所述多维电子身份数据库包括：兽药化合物标准品的基本信息、色谱信息和质谱信息；
步骤(3)中，通过将所述色谱图和质谱图与所述多维电子身份数据库中的信息进行对比，得到兽药化合物残留的检测结果。
8.按照权利要求7所述的检测方法，其特征在于：所述基本信息包括化合物中英文名称、CAS号、化学分子式和理论精确分子质量数；
和/或，所述色谱信息包括保留时间；
和/或，所述质谱信息包括母离子质量数、碎片离子质量数、离子加合方式和质谱响应面积对标准品浓度的标准曲线。
9.按照权利要求7或8所述的检测方法，其特征在于：所述多维电子身份数据库包括一级精确质量数指纹识别数据库和二级HCD碎片离子参考谱图确证库；
所述一级精确质量数指纹识别数据库是将兽药化合物的基本信息、色谱信息和质谱信息在Trace Finder数据采集与处理软件中依次录入形成的指纹识别数据库；
所述二级HCD碎片离子参考谱图确证库是将兽药化合物在高能碰撞池中最优碰撞能量下裂解得到的二级HCD碎片离子质谱图在mzVault谱图管理软件中添加收录形成的谱图确证库，所述最优碰撞能量是在出现3-5个选择离子丰度比最大的碎片离子时，记录的碰撞能量值CE(20％，40％，60％，ev)。
10.按照权利要求8所述的检测方法，其特征在于：步骤(3)中，判断某一兽药化合物呈阳性的标准是在5ppm质量窗口范围内进行提取的原始数据满足以下所有条件：
1)母离子质谱峰的保留时间误差范围在±15s内；
2)母离子质量数偏差小于等于5ppm；
3)二级质谱图中碎片离子的匹配个数大于等于2个，且碎片离子质量数偏差小于等于10ppm。
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