CN112986433A

CN112986433A - 检测人血清样本中类固醇含量的方法

Info

Publication number: CN112986433A
Application number: CN202110198064.7A
Authority: CN
Inventors: 刘鹏云; 杨青青; 马金飞; 孔子青; 王美华
Original assignee: Hangzhou Calibra Diagnostics Co ltd
Current assignee: Hangzhou Calibra Diagnostics Co ltd
Priority date: 2021-02-22
Filing date: 2021-02-22
Publication date: 2021-06-18

Abstract

本发明涉及一种检测血清样本中类固醇含量的方法，其包括如下步骤：(1)样本采集：采集静脉血，待血样凝固后，离心得到待测血清样本；(2)蛋白沉降：待测血清样本与含有内标的所述蛋白沉降剂充分混合，涡旋后离心，得到待检测液；(3)采用高效液相色谱串联质谱系统对待检测液进行检测。本发明提供一种前处理简单、快速，检测效率高且成本低的液质联用检测方法，可以同时检测人血清样本中11种类固醇的含量。

Description

检测人血清样本中类固醇含量的方法

技术领域

本发明涉及检测技术领域，主要涉及一种检测人血清样本中类固醇含量的方法。

背景技术

类固醇激素又称甾体激素，是一类四环脂肪烃化合物。人体内源性类固醇激素主要包括肾上腺皮质激素、雌激素、雄激素和孕激素四大类。这些激素在各种酶的作用下相互转化，通过调节各种组织细胞的代谢活动来影响人体的生理活动。激素浓度水平的异常变化与某些疾病的发病机制密切相关，目前临床上已经将类固醇激素水平作为较多疾病的诊断指标，包括先天性类固醇代谢紊乱(如先天性肾上腺增生、先天性发育障碍和先天性盐稳态失调等)和获得性类固醇代谢紊乱(如库欣综合征、艾迪生病、高雄激素血症及精神状态疾病)等。

目前在临床上应用最多的激素检测方法是化学免疫法，近年来气质联用法和液质联用法也在逐渐得到重视和应用。化学免疫法是利用免疫学抗原抗体反应的灵敏性来对待测物进行间接检测。该技术虽然可以自动化操作，检测成本低，但是存在以下弊端：1)由于不同类固醇激素的结构非常相似，通常只是羰基和羟基位置和数量的变化，抗体的特异性不足以进行区分，会导致检测结果的准确性差；2)免疫法的灵敏度相对较差，对于临床的应用有很大的局限性，比如检测女性样本的雄激素水平；3)基质效应强，且不能用内标法进行校正；4)可检测的线性范围有限；5)不同厂家的试剂盒的检测结果以及参考区间差别大；6)一次只能检测一种类固醇激素，效率低。气质联用法是将气相色谱仪与质谱仪联合起来使用的仪器，其特异性和灵敏度较好，但是也存在以下弊端：1)前处理一般都需要复杂的衍生化过程，前处理时间长，且缺乏同时适用于多种类固醇激素的衍生化试剂；2)样本分析时间长，气质联用仪对于单个样本的分析时间一般大于30min，检测通量低。液质联用法是将液相色谱仪与质谱仪联合起来的检测技术，样本中的分析物在液相系统进行分离，然后进入质谱系统，质谱的质量分析器将离子碎片按质量数分开，经检测器得到质谱信号。因此液质联用仪是对待测物直接进行检测，特异性强，并且可以一次检测多种类固醇激素。同时，引入同位素内标进行校准，兼具色谱和质谱的双重分离效果，可以大大降低基质效应，检测准确度高。

公开号为CN111721854A的中国专利申请公开了一种同时检测血清中11项类固醇激素的方法。该方法的前处理过程主要是利用释放剂A和蒸馏水活化固相萃取板，然后将标曲样本、质控样本、待测样本经过固相萃取板，使待测物吸附在固相萃取板的填料上，用15％的甲醇淋洗后，用乙腈进行洗脱，在洗脱液中加入5％的甲醇混匀后进入液质联用仪进行分析。得到样本中皮质素、皮质醇、11-脱氧皮质醇、皮质酮、脱氢表雄酮、雄烯二酮、睾酮、17-羟孕烯醇酮、17-羟孕酮、孕酮、脱氢表雄酮硫酸酯的含量。上述技术前处理利用固相萃取的原理，其中用到的固相萃取板使用前需要经过两步活化，且洗脱前还需要进行淋洗，前处理步骤极其复杂，对技术人员的要求相对较高；固相萃取板的价格昂贵，导致该方法的检测成本比较高；前处理耗时较长，相应的会影响报告周期。

申请号为2019103397025的专利申请了一种同时检测血清中13种甾体激素的方法。该方法的前处理过程主要是将标准溶液与内标溶液混合后，加入甲基叔丁基醚。震荡离心后，取上清用氮气吹干，然后用50％的甲醇溶液复溶后进入液质联用仪进行分析。得到样本中孕烯醇酮、孕酮、17α-羟孕烯醇酮、17α-羟孕酮、11α-羟孕酮、皮质酮、氢化可的松、可的松、11-脱氧皮质醇、11-脱氧皮质酮、21-脱氧皮质醇、醛固酮和雌酮的含量。上述技术利用液液萃取的原理，前处理需要将上层有机溶液取出并吹干，步骤比较复杂，且该步骤会大大限制相关技术的自动化，不利于大批量样本的处理。此外，上述技术中11-脱氧皮质醇的保留时间是2.41min，皮质酮的保留时间是2.45min，两者未完全实现基线分离，但由于两者是同分异构体，容易出现串扰现象，导致检测结果准确性差。上述技术中17α-羟孕酮的低浓度质控的精密度RSD(％)为15.48，11-脱氧皮质酮的中浓度质控的精密度RSD(％)为16.27，精密度相对较差，不满足中国医学会检验医学分会、卫生计生委临床检验中心发布的《临床色谱-质谱临床应用建议》指南与共识中建议的评估标准(小于15％)。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足，本发明提供一种前处理简单、快速，检测效率高且成本低的液质联用检测方法，同时检测人血清样本中11种类固醇的含量。为了实现本发明的目的，本发明提供以下技术方案：

本发明一方面涉及一种检测血清样本中类固醇含量的方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)样本采集：采集静脉血，待血样凝固后，离心得到待测血清样本；

(2)蛋白沉降：待测血清样本与含有内标的所述蛋白沉降剂充分混合，涡旋后离心，得到待检测液；

(3)采用高效液相色谱串联质谱系统对待检测液进行检测；

所述蛋白沉降剂以甲醇为溶剂，其中包括硫酸锌和类固醇的同位素内标。本发明所述的检测方法前处理步骤简单，将蛋白沉降的有效成分和降低基质效应的内标成分配制到一起，一步操作即可达到蛋白沉降和内标校正的目的；只需将样本与蛋白沉降试剂混匀后离心，去上清即可进行检测，无需进行复杂的固相萃取过程或者不易批量处理的液液萃取过程。

在本发明的一个优选实施方式中，所述蛋白沉降剂中硫酸锌的终浓度为1-10mg/mL，所述蛋白沉降剂与待测血清样本的体积比为1：1～3：1。本发明的蛋白沉降剂中含有硫酸锌和甲醇，使用少量体积的蛋白沉降剂即可达到沉降蛋白的目的。

在本发明的一个优选实施方式中，所述类固醇选自孕酮、睾酮、17ɑ-羟孕酮、脱氢表雄酮、雄烯二酮、皮质醇、11-脱氧皮质醇、硫酸脱氢表雄酮、脱氧皮质酮、可的松和皮质酮中的1种、2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种、11种。本发明的一个优势在于本发明可以同时检测血清中11种类固醇激素的方法。

在本发明的一个优选实施方式中，所述蛋白沉降剂中所包含的同位素内标选自孕酮-13C3、睾酮-d3、17ɑ-羟孕酮-d8、脱氢表雄酮-d6、皮质醇-d4、皮质酮-d8、11-脱氧皮质醇-d5、雄烯二酮-13C3、硫酸脱氢表雄酮-d6和可的松-d8。本发明的蛋白沉降剂中加入同位素内标，同位素内标与对应的待测物有相似的色谱性质以及离子化效率，定量过程采用待测物响应与内标物响应的比值，与标准曲线的浓度形成一个线性方程，以此可以计算待测样本中对应的分析物的浓度。

在本发明的一个优选实施方式中，所述液相色谱的色谱条件为：

流动相A：含铵盐的水相

流动相B：含铵盐的有机相

色谱柱：C18色谱柱

流动相梯度参数为：

本发明通过采用上述优选的色谱条件，可以有效实现包括同分异构体11-脱氧皮质醇和皮质酮在内的类固醇的色谱分离，检测特异性好；质控样本的加标回收率均在85％-115％之间，变异系数(CV％)均小于15％，检测结果的准确度高，重现性好。

在本发明的一个优选实施方式中，所述质谱的质谱条件为：

离子源：大气压化学电离源

模式：正离子模式。本发明的离子源采用大气压化学电离源，基质效应相对较小。

在本发明的另一个优选实施方式中，所述检测方法还包括标准曲线配制：用4％的牛血清蛋白溶液将孕酮、睾酮、17ɑ-羟孕酮、脱氢表雄酮、雄烯二酮、皮质醇、11-脱氧皮质醇、硫酸脱氢表雄酮、脱氧皮质酮、可的松和皮质酮的标准品配置成不同浓度的标准曲线。

对于本发明的检测方法而言，其可以是诊断目的的，也可以是非诊断目的的。

在本发明的另一方面，还涉及一种用于检测血清样本中类固醇的蛋白沉降剂，所述蛋白沉降剂以甲醇为溶剂，其中包括硫酸锌和类固醇的同位素内标。

与现有技术相比，本发明至少具有以下优点中的一个或者多个甚至是全部：

1)所需样本量少，100uL样本即可检测11种类固醇激素；

2)所需蛋白沉降试剂的体积较少，检测灵敏度高；

3)将蛋白沉降的有效成分和降低基质效应的内标成分配制到一起，一步操作即可达到蛋白沉降和内标校正的目的；

4)前处理过程只需要一步蛋白沉降即可得到待测溶液，无需进行复杂的固相萃取过程或者不易批量处理的液液萃取过程；

5)前处理操作简单，易于实现高通量处理，且对技术人员的要求相对较低。

6)基质效应低，检测结果准确，采用基质效应低的大气压化学电离源作为质谱检测离子源，更大程度的减少基质效应，临床样本的检测结果更准确；

7)可同时进行11种激素的检测，且同分异构体能够进行液相分离，结果的准确度高。

本发明的有益效果在于，针对固相萃取前处理繁杂，液液萃取前处理不易于自动化和大批量处理的缺点，该技术中前处理过程将蛋白沉降剂与内标配置到一起，血清样本只需经过一步简单的蛋白沉降即可取上清溶液进行检测，操作简单；为避免前处理过程中因加入蛋白沉降试剂引起的多倍稀释，我们采用在蛋白沉降剂中加入硫酸锌，达到用与样本体积的蛋白沉降剂即可达到沉降蛋白的目的；对于血清样本基质复杂，易产生基质效应的缺点，该技术通过选择基质效应较小的大气压化学电离源作为检测用的离子源来降低基质效应，该技术检测结果的准确度和灵敏度较高，满足临床检测的需求。

附图说明

图1：孕酮(上图)及孕酮同位素内标(下图)离子提取谱图；

图2：睾酮(上图)及睾酮同位素内标(下图)离子提取谱图；

图3：17羟孕酮(上图)及17羟孕酮同位素内标(下图)离子提取谱图；

图4：脱氢表雄酮(上图)及脱氢表雄酮同位素内标(下图)离子提取谱图；

图5：雄烯二酮(上图)及雄烯二酮同位素内标(下图)离子提取谱图；

图6：皮质醇(上图)及皮质醇同位素内标(下图)离子提取谱图；

图7：11脱氧皮质醇(上图)及11脱氧皮质醇同位素内标(下图)离子提取谱图；

图8：硫酸脱氢表熊酮(上图)及硫酸脱氢表熊酮内标(下图)离子提取谱图；

图9：脱氧皮质酮(上图)及17羟孕酮同位素内标(下图)离子提取谱图；

图10：可的松(上图)及可的松同位素内标(下图)离子提取谱图；

图11：皮质酮(上图)及其同位素内标(下图)离子提取谱图。

具体实施方式：

下面结合实例对本发明作进一步说明，以下实施例用来解释说明本发明，而不是对本发明进行限制，在本发明的精神和权利要求的保护范围内，对本发明做出的任何修改和改变，都落入本发明的保护范围。

实施例1：

(1)标准曲线的配置：用甲醇溶液溶解准确称量的孕酮、睾酮、17ɑ-羟孕酮、脱氢表雄酮、雄烯二酮、皮质醇、11-脱氧皮质醇、硫酸脱氢表雄酮、脱氧皮质酮、可的松和皮质酮的标准品得到对应的标准品储备液，然后用4％的BSA溶液将上述储备液稀释成下图浓度的标准曲线。

蛋白沉降剂的配置：用含硫酸锌的甲醇溶液溶解孕酮-¹³C3、睾酮-d3、17α-羟孕酮-d8、脱氢表雄酮-d6、皮质醇-d4、皮质酮-d8、11-脱氧皮质醇-d5、雄烯二酮-¹³C3、硫酸脱氢表雄酮-d6和可的松-d8得到蛋白沉降剂溶液。其中各类固醇激素同位素内标的含量见下表。

内标	蛋白沉降剂浓度(ng/mL)
		孕酮-<sup>13</sup>C3	15
睾酮-d3	5
		17α-羟孕酮-d8	3
皮质醇-d4	60
		11-脱氧皮质醇-d5	5
皮质酮-d8	75
		脱氢表雄酮-d6	150
硫酸脱氢表雄酮-d6	800
		雄烯二酮-<sup>13</sup>C3	5
可的松-d8	60

加标质控样本的配置：取若干低值人群的血清样本混合均匀后用于制作血清低值质控品，向低值质控样本中分别准确添加中浓度和高浓度的标准品储备液得到中值质控和高值质控。

样本的处理：分别取100μL的标准曲线溶液和待测质控样本加入到1.2mL的96孔板中，低值质控样本、中值质控样本、高值质控样本各做6个平行试验，然后向每个孔中加入100-300μL的蛋白沉降剂，充分涡旋后离心。取100uL上清待测。

上机检测

高效液相色谱条件为：

流动相A：含铵盐的水相

流动相B：含铵盐的有机相

色谱柱：C18色谱柱

流动相梯度参数为：

质谱条件为：

离子源：大气压化学电离源

模式：正离子模式

质谱检测参数：

数据处理

数据采用Sciex Analyst软件采集，MultiQuant软件处理。以分析物峰面积与内标峰面积比对标准曲线中的分析物的理论浓度进行线性最小二乘法回归计算，所得回归方程计算样品中分析物的实测浓度。样品中分析物的实测浓度由以下回归方程计算：

y＝ax+b

其中y＝分析物与内标的峰面积比

b＝截距

a斜率

x＝分析物的浓度

检测结果如下：

由上述案例结果分析，本发明能够同时检测11种类固醇激素，其中包括孕酮、睾酮、17ɑ-羟孕酮、脱氢表雄酮、雄烯二酮、皮质醇、11-脱氧皮质醇、硫酸脱氢表雄酮、脱氧皮质酮、可的松和皮质酮。该方法的样本前处理简单，只需加入蛋白沉降剂后涡旋离心即可；目标分析物中同分异构体11-脱氧皮质醇和皮质酮的保留时间分别为4.93min和4.81min，完全进行了色谱分离，检测特异性好；质控样本的加标回收率均在85％-115％之间，变异系数(CV％)均小于15％，检测结果的准确度高，重现性好。因此，本发明提供了一种同时检测11种类固醇激素含量的方法，前处理简单，检测成本低，检测通量大，检测结果的重现性好，准确度高。

各分析物准确度和精密度的验证结果如下所示：

孕酮的精密度和准确度

睾酮的精密度和准确度

17ɑ-羟孕酮的精密度和准确度

脱氢表雄酮的精密度和准确度

雄烯二酮的精密度和准确度

皮质醇的精密度和准确度

11-脱氧皮质醇的精密度和准确度

硫酸脱氢表雄酮的精密度和准确度

脱氧皮质酮的精密度和准确度

可的松的精密度和准确度

皮质酮的精密度和准确度

其中11种类固醇激素及其内标的谱图如图1-图11所示，其中上图为样本谱图，下图为同位素内标的谱图。上述验证结果表明，本发明的技术方案可以同时检测血清样本中的11中类固醇激素，包括孕酮、睾酮、17ɑ-羟孕酮、脱氢表雄酮、雄烯二酮、皮质醇、11-脱氧皮质醇、硫酸脱氢表雄酮、脱氧皮质酮、可的松和皮质酮。该方法的样本前处理简单，只需加入蛋白沉降剂后涡旋离心即可；同分异构体11-脱氧皮质醇和皮质酮的保留时间分别为4.93min和4.81min，可以实现色谱分离；各分析物的变异系数(CV％)在4.12％～13.85％，均符合批间精密度(CV％)＜15％；加标样本中各分析物的回收率在87％-112％之间，均符合回收率＜15％。

以上描述了本发明优选实施方式，然其并非用以限定本发明。本领域技术人员对在此公开的实施方案可进行并不偏离本发明范畴和精神的改进和变化。

Claims

1.一种检测血清样本中类固醇含量的方法，其特征在于包括如下步骤：

(3)采用高效液相色谱串联质谱系统对待检测液进行检测；

所述蛋白沉降剂以甲醇为溶剂，其中包括硫酸锌和类固醇的同位素内标。

2.根据权利要求1所述的方法，所述蛋白沉降剂中硫酸锌的浓度为1-10mg/mL，所述蛋白沉降剂与待测血清样本的体积比为1：1～1：3。

3.根据权利要求1所述的方法，所述类固醇选自孕酮、睾酮、17ɑ-羟孕酮、脱氢表雄酮、雄烯二酮、皮质醇、11-脱氧皮质醇、硫酸脱氢表雄酮、脱氧皮质酮、可的松和皮质酮中的1种、2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种、11种。

4.根据权利要求3所述的方法，所述蛋白沉降剂中所包含的同位素内标选自孕酮-¹³C3、睾酮-d3、17ɑ-羟孕酮-d8、脱氢表雄酮-d6、皮质醇-d4、皮质酮-d8、11-脱氧皮质醇-d5、雄烯二酮-¹³C3、硫酸脱氢表雄酮-d6和可的松-d8。

5.根据权利要求1所述的方法，所述液相色谱的色谱条件为：

流动相A：含铵盐的水相

流动相B：含铵盐的有机相

色谱柱：C18色谱柱

流动相梯度参数为：

6.根据权利要求1所述的方法，所述质谱的质谱条件为：

离子源：大气压化学电离源

模式：正离子模式。

7.根据权利要求1所述的方法，所述检测方法还包括标准曲线配制：用4％的牛血清蛋白溶液将孕酮、睾酮、17ɑ-羟孕酮、脱氢表雄酮、雄烯二酮、皮质醇、11-脱氧皮质醇、硫酸脱氢表雄酮、脱氧皮质酮、可的松和皮质酮的标准品配置成不同浓度的标准曲线。

8.一种用于检测血清样本中类固醇的蛋白沉降剂，所述蛋白沉降剂以甲醇为溶剂，其中包括硫酸锌和类固醇的同位素内标。