CN113166258B

CN113166258B - 靶向pd-l1和vegf的重组蛋白

Info

Publication number: CN113166258B
Application number: CN201980079944.3A
Authority: CN
Inventors: 田文志; 李松
Original assignee: Yiming Angke Biomedical Technology Shanghai Co ltd
Current assignee: Yiming Angke Biomedical Technology Shanghai Co ltd
Priority date: 2018-12-03
Filing date: 2019-12-02
Publication date: 2023-06-20
Anticipated expiration: 2039-12-02
Also published as: US20200172623A1; US11407832B2; EP3891182A4; JP2022511804A; CN113166258A; WO2020114355A1; JP7148037B2; US20220340664A1; EP3891182A1

Abstract

本申请提供一种重组蛋白，其包含1)PD‑L1抗体重链和PD‑L1抗体轻链，和2)血管内皮生长因子受体(VEGFR)的胞外Ig样结构域，其中PD‑L1抗体重链和PD‑L1抗体轻链经二硫键连接而结合PD‑L1，VEGFR的胞外Ig样结构域经接头与重链或轻链的N端或C端连接，该重组蛋白能够同时结合PD‑L1、VEGF和Fc受体。还提供一种含有两个上述重组蛋白的重组抗体、编码该重组蛋白的核苷酸、包含该核苷酸的表达载体、制备该重组蛋白的方法、包含该重组蛋白的药物组合物、以及使用重组蛋白来治疗由VEGF和/或PD‑L1过表达造成的疾病。

Description

靶向PD-L1和VEGF的重组蛋白

发明领域

本申请涉及一种重组蛋白/抗体，及其制备和用途，特别是其在肿瘤治疗中的用途。

背景技术

癌细胞已经发展出一些逃避宿主免疫监视的机制。例如，很多肿瘤细胞或癌细胞在其表面表达高水平的PD-L1和PD-L2，这两者均能与T细胞表面的PD-1结合，从而诱导T细胞凋亡。

此外，癌细胞的生长依赖于充分的营养供应。癌细胞自身能够分泌出促进血管生长的因子，例如血管内皮生长因子(VEGF)。抑制VEGF或其受体的活性，将终止对实体瘤的血液供给，从而抑制其生长。

PD-L1和PD-1

PD-L1，又称为程序性死亡配体1或CD274，是一种跨膜蛋白，在一些特定事件例如同种异体组织移植、自免疫疾病和癌症发生中发挥着重要的免疫系统抑制作用。

在一些癌症中，丧失转录因子如STAT3和NF-κB之间的反馈限制可能会导致局部PD-L1表达增加，这可能会限制PD-L1靶向剂全身给药的疗效(Vlahopoulos,SA.Aberrantcontrol of NF-κB in cancer permits transcriptional and phenotypic plasticityto curtail dependence on host tissue:molecular mode.Cancer Biology&Bedicine.2017,14:254–270)。对来自肾细胞癌患者的196份肿瘤样本的分析表明，肿瘤高表达PD-L1与肿瘤侵袭性增加以及死亡风险增加4.5倍相关(Thompson RH,etal.Costimulatory B7-H1 in renal cell carcinoma patients:Indicator of tumoraggressiveness and potential therapeutic target.PNAS.2004,101(49):17174–9)。

PD-1是长约268个氨基酸的细胞表面受体。当与PD-L1或PD-L2结合时，PD-1下调免疫系统，并通过抑制T细胞炎症活性来促进自身耐受性。PD-1对免疫系统的抑制性作用防止自免疫疾病，但也同时抑制免疫系统对癌细胞的杀灭。约1/5-1/4患有非小细胞肺癌、黑色素瘤、或肾细胞癌的病人对一种PD-1抗体，BMS-936558，产生了客观性应答(SuzanneL.Topalian,et al.,Safety,Activity,and Immune Correlates of Anti–PD-1 Antibodyin Cancer,N Engl J Med 2012,366:2443-2454)。

VEGF和VEGFR

VEGF是在组织/伤口修复程序控制中发挥重要作用的多效生长因子，分为VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D和PIGF。在组织愈伤过程中，VEGF同时驱使心血管的形成和免疫的下调(Canic M,et al.The role of vascular endothelial growth factor in woundhealing.J Surg Res.2009,153:347-358；Leung DW,et al.Vascular endothelialgrowth factor is a secreted angiogenic mitogen.Science.1989,246:1306-1309；Voron T,et al.Control of the immune response by pro-angiogenic factors.FrontOncol.2014,4:70)。VEGF的这两个特性对于癌变都是很关键的，因为可以使得生成肿瘤血管，且可以抑制抗癌免疫(Hanahan D,Weinberg RA.Hallmarks of cancer:the nextgeneration.Cell.2011,144:646–674)。具体而言，认为VEGF通过三个主要机制发挥免疫抑制作用：抑制DC成熟、减少T细胞肿瘤浸润、以及增加肿瘤微环境中的抑制性细胞。非正常VEGF表达也促成其他疾病，包括类风湿性关节炎、糖尿病性视网膜病变、湿性老年性黄斑变性、肾小球肥大。安维汀(Avastin)，FDA批准的VEGF单抗药物，通过抑制VEGF生物活性来治疗癌症(结肠癌、肺癌)。另一个靶向VEGF的蛋白药物，阿帕西普(Aflibercept)，在美国和欧洲被批准用于治疗湿性黄斑变性(商品名为Eylea)和转移性结直肠癌(Zaltrap)。

VEGF受体(VEGFR)有三个亚型，VEGFR-1、VEGFR-2和VEGFR-3，均具有由7个免疫球蛋白样结构域构成的胞外部分、一个跨膜区域和胞内部分。VEGFR-2似乎介导几乎所有已知对VEGF的细胞应答，而VEGFR-1阻止VEGF与VEGFR-2结合，调节VEGFR-2信号通路。VEGF-A，对于人类健康而言最危险的类型，与VEGFR-1和VEGFR-2两者均结合。VEGFR拮抗剂最常用于治疗癌症或癌症治疗研究。乐伐替尼(Lenvima)，作为针对VEGFR-1、VEGFR-2和VEGFR-3激酶的多激酶抑制剂，在2015年获批用于分化型甲状腺癌的治疗，2016年获批与依维莫司联合用于晚期肾细胞癌的治疗。

Fc和FcR

可结晶区段(Fc区)是抗体的尾部区，是决定抗体的效应功能(即，抗体如何与特定细胞受体或其他防御蛋白建立关系)的结构域。

Fc受体(FcR)是在某些免疫细胞，包括B淋巴细胞、滤泡树突状细胞、自然杀伤细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、嗜酸粒细胞、嗜碱粒细胞、和肥大细胞等表面上的蛋白。这些细胞有助于免疫系统的保护功能。

Fc区可以与Fc受体和/或补体系统的蛋白相互作用，激活免疫系统。例如，Fc受体与附着于感染细胞或入侵病原体的抗体相结合，激活吞噬细胞或细胞毒性细胞，通过抗体介导的吞噬作用或抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC)来摧毁微生物或感染细胞。

治疗性双特异性或多特异性融合蛋白/抗体

蛋白/抗体疗法显著地增进了我们治疗疾病(包括癌症)的能力，然而临床研究显示，很多患者无法对单特异疗法产生足够的反应。例如，在用PD-L1/PD-1靶向抗体治疗的患者中，仅有一部分显示出持久的反应和/或存活。上述两种VEGF靶向蛋白，安维汀和阿帕西普，在一定程度上抑制癌细胞生长，但是不会消除癌细胞。

为解决上述局限性，已经开发出针对两种以上不同抗原、或同一抗原的不同表位的双特异或多特异重组蛋白。例如，一些双特异性蛋白经遗传改造成同时靶向细胞毒性细胞和待摧毁的肿瘤细胞。这些蛋白能够阻断多种肿瘤细胞生长/存活通路，和/或激活肿瘤细胞杀灭通路，具有更好抑制癌生长的潜能。

然而，双特异性或多特异性蛋白，特别是双特异性或多特异性抗体，在设计上面临巨大的挑战，因为需要考虑大量的可变因素，包括分子的相容性，是否可以连接在一起，以及如果可以物理连接的话，所得蛋白的亲和力、稳定性和药学特性。已经认识到，简单地将两个以上抗体或蛋白连接在一起，通常不会引起协同效应，甚至不产生有利效果。在以下比较例中公开的包含有经接头连接EGFR抗体的SIRPαD1的重组蛋白，被证实在HT-29或NCI-H1975肿瘤模型中，抗肿瘤活性较单独的EGFR抗体或SIRPαD1-Fc更差。

发明内容

经过不懈的努力，当前的发明人成功设计出一种靶向PD-L1和VEGF并能同时结合FcR的重组蛋白和重组抗体。本申请的重组蛋白/抗体相比于单特异性的对应分子(即便它们进行联合使用)具有更好的抗肿瘤活性。

因而，在第一个方面，本申请提供一种重组蛋白，包含：

-PD-L1抗体重链和PD-L1抗体轻链，两者经二硫键连接而结合PD-L1，和

-血管内皮生长因子受体(VEGFR)的胞外Ig样结构域，其经由接头与上述重链或轻链的N端或C端连接，

其中该重组蛋白能够同时结合PD-L1、VEGF和Fc受体。

在一些实施方式中，VEGFR的胞外Ig样结构域经由接头与重链的N端连接。在一些实施方式中，VEGFR的胞外Ig样结构域经由接头与重链的C端连接。在一些实施方式中，VEGFR的胞外Ig样结构域经由接头与轻链的N端连接。

还提供包含本文所述重组蛋白的二聚体。二聚体可以是包含两个上述重组蛋白，例如两个相同重组蛋白，的同型二聚体。

在第二个方面，本申请提供一种重组抗体，包含具有两条重链和两条轻链的PD-L1抗体，其中血管内皮生长因子受体(VEGFR)的胞外Ig样结构域经由接头与各重链的N端或C端连接，或与各轻链的N端或C端连接，其中该重组蛋白能够同时结合PD-L1、VEGF和FcR。该重组抗体可以是第一个方面中所述重组蛋白的同型二聚体。

在一些实施方式中，VEGFR的胞外Ig样结构域经由接头与各重链的N端连接。在一些实施方式中，VEGFR的胞外Ig样结构域经由接头与各重链的C端连接。在一些实施方式中，VEGFR的胞外Ig样结构域经由接头与各轻链的N端连接。

与靶细胞例如癌细胞上的PD-L1结合，可以解除PD-1介导的抑制性信号对T细胞的检查，而与VEGF结合，可以抑制新血管形成，并解除免疫抑制，从而限制靶细胞生长。此外，与免疫细胞例如NK细胞或巨噬细胞上的FcR结合，可以刺激NK细胞或巨噬细胞的靶向细胞杀灭。

在第一和第二方面提及的PD-L1抗体可以是分离的单克隆抗体，例如阿替利珠单抗(Atezolizumab)、阿维鲁单抗(Avelumab)、度伐利尤单抗(Durvalumab)、以及与阿替利珠单抗、阿维鲁单抗或度伐利尤单抗具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％氨基酸同一性的抗体。

PD-L1抗体可以是分离的单克隆抗体，包含两条重链和两条轻链，各条重链具有SEQ ID NO:2或4所示的氨基酸序列，各条轻链具有SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列，这些氨基酸序列可以分别由SEQ ID NO:1、3和5的核酸序列编码。PD-L1抗体的抗原结合(Fab)部分(或互补位)可以与靶细胞例如癌细胞/肿瘤细胞表面的PD-L1结合，阻断PD-L1与T细胞表面PD-1的相互作用，从而解除PD-1介导的抑制信号对T细胞的检查。PD-L1抗体的Fc部分可以与免疫细胞例如NK细胞和巨噬细胞表面上的FcR结合，以激活NK细胞或巨噬细胞对靶细胞的杀灭。

在一些实施方式中，PD-L1抗体的重链可以包含与SEQ ID NO:2具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性的氨基酸序列，其中PD-L1抗体能够与PD-L1结合并阻断PD-L1与T细胞表面上PD-1的相互作用，并且能够与免疫细胞表面的FcR结合，从而激活这些细胞来杀灭靶细胞例如癌细胞。

在一些实施方式中，轻链可以包含与SEQ ID NO:6具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性的氨基酸序列，其中PD-L1抗体能够与PD-L1结合并阻断PD-L1与T细胞表面上PD-1的相互作用，并且能够与免疫细胞表面的FcR结合，从而激活这些细胞来杀灭靶细胞例如癌细胞。

在第一和第二方面描述的VEGFR可以是VEGFR1和/或VEGFR2，且VEGFR的胞外Ig样结构域可以是VEGFR的第二胞外Ig样结构域。在一个实施方式中，VEGFR是VEGFR1，且VEGFR1的胞外Ig样结构域是VEGFR1的第二胞外Ig样结构域(VEGFR1D2)。在另一实施方式中，VEGFR是VEGFR2，且VEGFR2的胞外Ig样结构域是VEGFR2的第二胞外Ig样结构域(VEGFR2D2)。VEGFR的胞外Ig样结构域可以与靶细胞表达的或在靶细胞周围的VEGF结合，靶细胞为例如癌细胞/肿瘤细胞，从而限制靶细胞的生长。

在一个实施方式中，VEGFR1D2具有分别如SEQ ID NO:7和8所示的核酸序列和氨基酸序列。在一个实施方式中，VEGFR1D2可以具有与SEQ ID NO:8具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性的氨基酸序列，其中VEGFR1D2可以与靶细胞如癌细胞/肿瘤细胞表达的、或在靶细胞周围的VEGF结合，从而限制靶细胞的生长。

在上述第一和第二方面提及的接头可以是约5-30氨基酸残基的肽。在一个实施方式中，接头为10-30氨基酸残基的肽。在另一实施方式中，接头是10-15氨基酸残基的肽。在一些实施方式中，接头是-(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)₂-(SEQ ID NO:10)、或-(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)₃-(SEQ ID NO:12)，其可以分别由SEQ ID NO:9和11编码。

VEGFR1D2-接头-PD-L1抗体重链，其中VEGFR1D2与PD-L1抗体重链的N端连接，可以包含SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列，其可以由SEQ ID NO:13的核苷酸编码。在一些实施方式中，VEGFR1D2-接头-PD-L1抗体重链包含与SEQ ID NO:14具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性的氨基酸序列，其中VEGFR1D2-接头-PD-L1抗体重链与PD-L1抗体轻链一起，能够与VEGF、PD-L1以及FcR结合，i)阻断靶细胞上PD-L1与T细胞上PD-1之间的相互作用；ii)阻断VEGF与靶细胞表面VEGFR之间的相互作用；以及iii)激活免疫细胞对靶细胞的灭杀。

PD-L1抗体重链-接头-VEGFR1D2，其中VEGFR1D2与PD-L1抗体重链的C端连接，可以包含SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列，其可以由SEQ ID NO:15的核苷酸编码。在一些实施方式中，PD-L1抗体重链-接头-VEGFR1D2包含与SEQ ID NO:16具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性的氨基酸序列，其中PD-L1抗体重链-接头-VEGFR1D2与PD-L1抗体轻链一起，能够与VEGF、PD-L1以及FcR结合，i)阻断靶细胞上PD-L1与T细胞上PD-1之间的相互作用；ii)阻断VEGF与靶细胞表面VEGFR之间的相互作用；以及iii)激活免疫细胞对靶细胞的灭杀。

VEGFR1D2-接头-PD-L1抗体轻链，其中VEGFR1D2与PD-L1抗体轻链的N端连接，可以包含SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列，其可以由SEQ ID NO:17的核苷酸编码。在一些实施方式中，VEGFR1D2-接头-PD-L1抗体轻链包含与SEQ ID NO:18具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性的氨基酸序列，其中VEGFR1D2-接头-PD-L1抗体轻链与PD-L1抗体重链一起，能够与VEGF、PD-L1以及FcR结合，i)阻断靶细胞上PD-L1与T细胞上PD-1之间的相互作用；ii)阻断VEGF与靶细胞表面VEGFR之间的相互作用；以及iii)激活免疫细胞对靶细胞的灭杀。

在第三个方面，本申请还提供编码本申请重组蛋白/抗体的核酸分子，以及包含该核酸的表达载体、和包含该表达载体的宿主细胞。

在第四个方面，本申请还提供一种使用含上述表达载体的宿主细胞制备重组蛋白/抗体的方法，该方法包括以下步骤，(i)在宿主细胞中表达重组蛋白/抗体，以及(ii)从宿主细胞中分离重组蛋白/抗体。

在第五个方面，本申请提供一种药物组合物，其包含本申请的重组蛋白或重组抗体、以及至少一种药学上可接受的载体。

在第六个方面，本申请提供一种用于治疗由过表达VEGF和/或PD-L1造成的疾病的方法，包括对有需求的患者或受试者施用治疗有效量的本申请药物组合物。

在一个实施方式中，本申请提供重组蛋白或重组抗体在制备用于治疗由过表达VEGF和/或PD-L1引起的疾病的药物组合物中的用途。

在一个实施方式中，本申请的方法用于治疗选自急性髓细胞样白血病(AML)、慢性髓细胞样白血病(CML)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、多发性骨髓瘤(MM)、膀胱癌、卵巢癌、前列腺癌、肺癌、结肠癌、乳腺癌、胰腺癌、肝癌和肾细胞癌中的疾病。在一个实施方式中，本申请提供一种用于治疗老年性黄斑变性(AMD)、糖尿病性视网膜病变、肝纤维化或血管肉瘤的方法。

基于以下的详细描述和实施例，当前公开的其他特征和有利之处将是非常明晰可见的，详细描述和实施例不应当解读为是限制性的。所有在说明书中引用的文献、Genbank登记号、专利和公开专利申请均通过引用的方式并入本文。

附图说明

图1为本申请重组抗体的结构示意图。

图2示出本申请重组抗体的SEC-HPLC图谱。

图3示出本申请重组抗体与VEGF-165的结合活性。

图4示出本申请重组抗体与PD-L1的结合活性。

图5示出本申请重组抗体同时结合VEGF-165和PD-L1的活性。

图6示出IMM2510对Raji-PD-L1的ADCC活性。

图7示出VEGF-165存在下IMM2510对Raji-PD-L1的ADCC活性。

图8示出IMM2505在MC38-hPD-L1异种移植模型中的体内疗效。

具体实施方式

抗体疗法已在多个地区被批准用于多种疾病的治疗，包括癌症等，且显著改善了患者预后(Komeev KV et al.,(2017)TLR-signaling and proinflammatory cytokinesas drivers of tumorigenesis.Cytokine 89:127–135)。一旦与疾病抗原结合，抗体可以引发抗体依赖的细胞介导的细胞毒性，激活补体系统，和/或防止受体与其配体相互作用，所有这些都可能引起细胞死亡。美国FDA批准的抗体药物包括阿仑单抗(Alemtuzumab)、纳武利尤单抗(Nivolumab)、利妥昔单抗(Rituximab)和度伐利尤单抗。

然而，临床研究发现，很多患者并不会对单特异疗法产生充分的反应。例如，已批准的PD-L1抗体阿维鲁单抗(BAVENCIO)的总体反应率仅为33％。此外，在多个疗程后，频繁地发生获得性抗体耐性。

因而，需要针对两个以上不同且独特的抗原、或同一抗原的不同表位的双特异性或多特异性抗体。

经过不断的尝试，当前的发明人发明出了新的重组蛋白/抗体，其可以通过三种作用机制抗击疾病，即解除PD-1介导的抑制信号对T细胞的检查或抑制，抑制新血管的形成并解除免疫抑制，从而限制靶细胞生长，以及激活免疫细胞例如NK细胞和巨噬细胞对靶细胞的杀灭。

本申请的重组蛋白包含：1)PD-L1抗体重链和PD-L1抗体轻链，其经二硫键连接而结合PD-L1，和2)血管内皮生长因子受体(VEGFR)的胞外Ig样结构域，其经由接头与上述重链或轻链的N端或C端连接，其中该重组蛋白能够同时结合PD-L1、VEGF和Fc受体。在一些实施方式中，VEGFR的胞外Ig样结构域经由接头与重链的N端连接。在一些实施方式中，VEGFR的胞外Ig样结构域经由接头与重链的C端连接。在一些实施方式中，VEGFR的胞外Ig样结构域经由接头与轻链的N端连接。重链的Fc片段可以经二硫键与另一Fc片段连接。例如，本申请的两个重组蛋白可以通过二硫键连接在一起，形成本申请的重组抗体。

本申请的重组蛋白包含具有两条重链和两条轻链的PD-L1抗体，其中血管内皮生长因子受体(VEGFR)的胞外Ig样结构域经由接头与各重链的N端或C端连接，或与各轻链的N端或C端连接，其中该重组蛋白能够同时结合PD-L1、VEGF和FcR。在一些实施方式中，VEGFR的胞外Ig样结构域经由接头与各重链的N端连接。在一些实施方式中，VEGFR的胞外Ig样结构域经由接头与各重链的C端连接。在一些实施方式中，VEGFR的胞外Ig样结构域经由接头与各轻链的N端连接。

当前申请的发明人惊讶地发现，当Fc片段的C端连接有多肽时，抗体的Fc部保持有FcR结合能力。特别地，在一个未公开的研究中，当前的发明人设计并制备了一个重组抗体，含有一个正常的Ig样抗体和两个VEGFR1D2片段，其中两个VEGFR1D2片段分别与抗体的两个Fc片段连接。重组抗体在ADCC检测中，有效地裂解了靶细胞，活性比正常抗体要稍低，重组抗体的最大裂解％和裂解EC₅₀约为45.0％和68.71ng/ml，正常抗体的最大裂解％和裂解EC₅₀约为58.0％和49.55ng/ml。在之后的体内抗肿瘤测试中，重组抗体显示出了比正常抗体与VEGFR1D2-Fc联用更好的抗肿瘤效果。

包含在本申请重组蛋白/抗体中的三个主要组成部分是血管内皮生长因子受体(VEGFR)的胞外Ig样结构域、接头和PD-L1抗体。本领域技术人员将意识到，对于上述三个组成部分，存在很多种设计选择。优选地，在人疾病治疗中使用人源序列，因为非人动物蛋白或肽的强免疫原性可能会引起过敏反应和其他不良反应。然而，基于不同的应用目的，也可以在本申请中使用其他动物蛋白或肽，如果合适的话，可以进行人源化。

任何PD-L1抗体可以用于本申请重组蛋白或抗体的形成。PD-L1抗体可以是选自阿替利珠单抗、阿维鲁单抗、度伐利尤单抗的分离单克隆抗体。

在一些实施方式中，PD-L1抗体是分离的单克隆抗体，包含两条重链和两条轻链，各重链具有SEQ ID NO:2或4的氨基酸序列，各轻链具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列，这些氨基酸序列可以分别由SEQ ID NO:1、3和5的核酸序列编码。PD-L1抗体的Fab部分(或互补位)可以与靶细胞例如癌细胞/肿瘤细胞表面的PD-L1结合，阻断PD-L1与T细胞表面PD-1的相互作用，从而解除PD-1介导的抑制性信号对T细胞的检查，而PD-L1抗体的Fc部分可以与免疫细胞例如NK细胞和巨噬细胞表面的FcR结合，以刺激NK细胞或巨噬细胞的靶向细胞杀灭。在一些实施方式中，PD-L1抗体的重链可包含与SEQ ID NO:2具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性的氨基酸序列，其中该PD-L1抗体能够与PD-L1结合并阻断PD-L1与T细胞表面PD-1的相互作用，并且能够与免疫细胞表面的FcR结合，从而激活这些免疫细胞对例如癌细胞的靶向杀灭。在一些实施方式中，轻链可以包含与SEQ ID NO:6具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性的氨基酸序列，其中该PD-L1抗体能够与PD-L1结合，阻断PD-L1与T细胞表面PD-1的相互作用，并且能够与免疫细胞表面的FcR结合，从而激活这些免疫细胞对例如癌细胞的靶向杀灭。

能够与VEGF，特别是VEGF-A结合的任何VEGFR(VEGFR1、VEGFR2、和VEGFR3)的任何胞外Ig样结构域，可以选来构建重组蛋白。在一个实施方式中，重组蛋白中的VEGFR是VEGFR1，且VEGFR的胞外Ig样结构域是VEGFR1的第二胞外Ig样结构域(VEGFR1D2)。

在一个实施方式中，VEGFR1D2具有分别如SEQ ID NO:7和8所示的核酸序列和氨基酸序列。在另一实施方式中，VEGFR1D2可以具有与SEQ ID NO:8具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性的氨基酸序列，其中VEGFR1D2可以与靶细胞如癌细胞/肿瘤细胞表达的、或在靶细胞周围的VEGF结合，从而限制靶细胞的生长。

接头主要起到VEGFR的胞外Ig样结构域与PD-L1抗体重链或轻链的N端或C端之间的间隔的作用。接头可以由肽键连接的氨基酸构成，优选肽键连接的5-30个氨基酸，其中氨基酸选自20种天然存在的氨基酸。这些氨基酸中的一个或多个可以糖基化，如本领域技术人员所了解的。在一个实施方式中，5-30个氨基酸可以选自甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸和赖氨酸。在一个实施方式中，接头由大部分没有空间位阻的氨基酸构成，例如甘氨酸和丙氨酸。示例性的接头为多聚甘氨酸(特别是Gly、(Gly)₈)、多聚(Gly-Ala))、以及多聚丙氨酸。以下实施例中示出的示例性合适接头为(Gly-Ser)，例如-(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)₃-和(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)₂-。

接头也可以是非肽类接头。例如，可以使用烷基接头，例如-NH-、-(CH₂)s-C(O)-，其中s＝2-20。这些烷基接头还可以经任何非空间位阻基团例如低级烷基(例如C_1-4)低级酰基、卤素(例如Cl、Br)、CN、NH₂、苯基等进行取代。

同时，本申请提供编码重组蛋白或抗体的多核苷酸分子和表达重组蛋白或抗体的表达载体。载体的例子包括但不限于质粒、病毒载体、酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)、可转化人工染色体(TAC)、哺乳动物人工染色体(MAC)和人工附加染色体(HAEC)。

本申请提供包含上述表达载体的宿主细胞。宿主细胞可以用表达载体进行转化或转染。合适的宿主细胞包括大肠杆菌(Escherichia coli)、酵母和其他真核生物。优选地，使用大肠杆菌、酵母或哺乳动物细胞系(例如COS或CHO)。

另一方面，本申请提供一种药物组合物，其包含本申请的与药学上可接受载体配制在一起的重组蛋白或抗体。组合物可以任选地包含一种或多种其他药学活性成分，例如另一种抗体或药物。本申请的药物组合物也可以与例如另一种免疫刺激剂、抗癌药物、抗病毒剂或疫苗一起在联合疗法中进行施用。

药物组合物可以包含任何数量的赋形剂。可以使用的赋形剂包括载体、表面活性剂、增稠或乳化剂、固体粘合剂、分散或混悬助剂、稳定剂、着色剂、矫味剂、包衣、崩解剂、润滑剂、甜味剂、防腐剂、等渗剂、及其组合。合适赋形剂的选择和使用在Gennaro,ed.,Remington:The Science and Practice of Pharmacy,20th Ed.(Lippincott Williams&Wilkins 2003)中有过教导，其公开内容通过引用的方式并入本文。

药物组合物中的主要媒介物或载体可以本质上是水性或非水性的。例如，合适的媒介物或载体可以是注射用水、生理盐水或人工脑脊液，可以补充有注射中常见的其他材料。例如，媒介物或载体可以是中性缓冲盐溶液或混有血清白蛋白的盐溶液。其他示例性的药物组合物包含Tris缓冲液、或醋酸盐缓冲液，其还可以包含山梨醇或其合适的替代物。在本申请的一个实施方式中，组合物可以通过混合具有所需纯度的所选组分与任意的配制剂(Remington’s Pharmaceutical Sciences，如上)以冻干或水溶液形式制备而用于储存。此外，治疗组合物可以使用合适的赋形剂例如蔗糖配制为冻干剂。

优选地，药物组合物适用于静脉、肌内、皮下、非肠道、脊柱、或表皮给药(例如，通过注射或推注)。取决于给药途径的不同，活性分子可以包裹在材料中以保护其免受酸或酶以及可能使其失活的其他自然条件的作用。本文所用的术语“非肠道给药”是指除通常通过注射进行的肠道和局部给药外的给药模式，包括而不限于，静脉、肌内、动脉内、膜内、囊内、眶内、心脏内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬脑膜、和胸骨内注射和输注。或者，本申请的抗体可以通过非注射途径给药，例如局部的、表皮的或粘膜的给药模式，例如，鼻内、经口、阴道、直肠、舌下、或局部给药。

药物组合物可以是无菌水溶液或混悬液的形式。它们也可以配制成微乳剂、脂质体、或其他适用于高浓度药物的有序结构。

可以与载体材料结合来制备单剂型的活性成分的量各异，取决于待治疗的受试者和特定的给药途径，且通常是产生疗效的组合物的量。通常而言，以百分比计，该量为约0.01％-约99％的活性成分，优选为约0.1％-约70％，最优选为约1％-约30％的活性成分，与药学上可接受的载体组合在一起。

给药方案可以调整以达成最优的所需反应(例如，治疗反应)。例如，随着时间的推进施用多个分剂量，或者根据治疗情况的危急程度而成比例地减少或增加剂量。特别有利的是，以剂量单位配制非肠道组合物，以方便给药且有利于剂量的均一性。本文所用的剂量单位型是指适用于待治疗受试者的单次给药的物理上分离的单元；各单元包含事先计算出的与药物载体一起产生所需的疗效的活性化合物的量。或者，重组蛋白可以以持续释放剂型进行给药，在这种情况下，给药的频率降低。

对于重组蛋白的给药，剂量范围为约0.0001-100mg/kg受体体重，更通常地为0.01-10mg/kg。例如，剂量可以为0.3mg/kg体重、1mg/kg体重、3mg/kg体重、5mg/kg体重、或10mg/kg体重，或在1-10mg/kg的范围内。示例性的治疗方案为，每周两次、每周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次、每月一次、每三个月一次、或每三至六个月一次给药。本发明重组蛋白的优选给药方案包括腹膜内给药，3mg/kg体重或6mg/kg体重，使用如下的一种给药时间表：(i)每四周给药六次，之后每三月给药一次；(ii)每三周给药一次；(iii)3mg/kg体重给药一次，之后为1mg/kg体重，每三周一次；(vi)6mg/kg体重，每周一次。在一些方法中，调整剂量以达到约1-1000μg/ml的血浆抗体浓度，在一些方法中为约25-300μg/ml。

“治疗有效量”的本申请重组蛋白优选地引起疾病症状严重程度的降低、无疾病症状时期的频率和持续时间的上升、或防止由疾病引起的损伤或无能。例如，对于荷肿瘤受试者的治疗，“治疗有效量”是指，相对于未治疗的受试者，优选地，肿瘤生长抑制至少约40％，更优选抑制至少约60％，更优选抑制至少约80％，更优选抑制至少约99％。治疗有效量的本申请融合蛋白可以在受试者(通常为人，或者可以为另一种哺乳动物)中减小肿瘤体积、或者减轻症状。

药物组合物可以是受控的缓释制剂，包括植入体、透皮贴剂、和微囊化递送系统。可以使用可生物降解的生物相容性多聚物，例如乙烯-醋酸乙烯共聚物、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原蛋白、聚原酸酯、和聚乳酸。参见，例如Sustained and Controlled Release DrugDelivery Systems,J.R.Robinson,ed.,Marcel Dekker,Inc.,New York,1978。

药物组合物可以通过以下医疗装置进行施用，例如(1)无针皮下注射装置(例如，美国专利5,399,163、5,383,851、5,312,335、5,064,413、4,941,880、4,790,824、和4,596,556)；(2)微输注泵(美国专利4,487,603)；(3)透皮装置(美国专利4,486,194)；(4)输注装置(美国专利4,447,233和4,447,224)；和(5)渗透装置(美国专利4,439,196和4,475,196)，以上公开内容通过引用的方式并入本文。

在某些实施方式中，本申请的重组蛋白可以配制成保证合适的体内分布。例如，为保证本申请的治疗性蛋白跨过血脑屏障，可以将蛋白配制在脂质体中，还可以额外地包含靶向基团以加强对特定细胞或器官的选择性传输。参见，例如，美国专利4,522,811、5,374,548、5,416,016、和5,399,331。

本发明还涉及体内基因疗法，其中将编码本发明重组蛋白的核酸分子或其衍生物直接引入受试者中。例如，将编码本申请重组蛋白的核酸序列经由带有或不带有合适递送载体例如腺相关病毒载体的核酸构建体经局部注射而引入目标细胞。其他可供选择的病毒载体包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、单纯疱疹病毒、和乳头状瘤病毒载体。病毒载体的体内物理转移可以通过所需核酸构建体或包含所需核酸序列的其他合适递送载体的局部注射、脂质体介导的转移、直接注射(裸露的DNA)、或微粒轰击(基因枪)而实现。

本申请的组合物可以单独使用，或者与其他用于增强其疗效或降低潜在副作用的治疗剂联合使用。

本申请的另一目的是提供一种用于制备上述重组蛋白或重组抗体以及包含该重组蛋白或重组抗体的药物组合物的方法。在一个实施方式中，制备方法包括以下步骤：(1)提供编码重组蛋白的多核苷酸分子；(2)构建包含(1)的多核苷酸分子的表达载体；(3)用(2)中的表达载体转染或转化合适的宿主细胞并培养这些宿主细胞以表达蛋白；以及(4)纯化蛋白或抗体。制备可以由普通技术人员以熟知的技术进行。

本申请的另一目标是提供使用本申请的药物组合物来治疗疾病的方法，包括向有该需求的患者或受试者施用有效量的上述药物组合物。

在一个实施方式中，药物组合物用于治疗过表达VEGF和/或PD-L1的肿瘤或癌症，包括但不限于急性髓细胞样白血病(AML)、慢性髓细胞样白血病(CML)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、多发性骨髓瘤(MM)、膀胱癌、卵巢癌、前列腺癌、肺癌、结肠癌、乳腺癌、胰腺癌、肝癌和肾癌。

在一个实施方式中，本申请提供一种用于治疗与VEGF过表达相关的疾病的方法，包括但不限于老年性黄斑变性(AMD)、糖尿病性视网膜病变、肝纤维化和血管肉瘤。

本申请将参照以下非限制性实施例进行进一步说明。

实施例

在以下的描述中，IMM25是指靶向PD-L1的单克隆PD-L1抗体。该抗体具有两条重链和两条轻链，各重链具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列，各轻链具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列。

IMM2510是指一种重组抗体，包含两个VEGFR1D2，各VEGFR1D2经GS-接头与PD-L1抗体的各重链的N端连接。VEGFR1D2-接头-PD-L1重链由SEQ ID NO:13的核酸序列编码，并具有SEQ ID NO:14的氨基酸序列。PD-L1抗体的轻链具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列。

IMM25011是指一种重组抗体，包含两个VEGFR1D2，各VEGFR1D2经GS-接头与PD-L1抗体的各重链的C端连接。PD-L1重链-接头-VEGFR1D2由SEQ ID NO:15的核酸序列编码，并具有SEQ ID NO:16的氨基酸序列。PD-L1抗体的轻链具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列。

IMM25031是指一种重组抗体，包含两个VEGFR1D2，各VEGFR1D2经GS-接头与PD-L1抗体的各轻链的N端连接。VEGFR1D2-接头-PD-L1轻链由SEQ ID NO:17的核酸序列编码，并具有SEQ ID NO:18的氨基酸序列。PD-L1抗体的重链具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列。

VEGFR1-Fc是一种重组蛋白，包含两个与抗体Fc部分相连的VEGFR1D2。各个VEGFR1D2-Fc片段具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列，其可以由SEQ ID NO:21的核酸序列编码。

这四个重组抗体的基本结构示于图1。

实施例1.表达IMM25、IMM25011、IMM25031和IMM2510的载体的构建

1.1 IMM25

人工设计IMM2505的全长编码序列。具体地，将编码小鼠IgG1重链信号肽的57个核苷酸(SEQ ID NO:19)加到PD-L1抗体重链编码序列(SEQ ID NO:1)的5’端，并将Kozak序列(SEQ ID NO:20)加到信号肽序列的5’端。最后，在所得序列的5’和3’端分别加入HindIII和NheI限制性酶切位点。对于轻链，使用同一信号肽序列和Kozac序列，但是在所得序列的5’和3’端分别加入HindIII和XbaI限制性酶切位点。两个所得的序列通过金斯瑞合成(ID#:C0015BJ110-1(重链)；C0015BJ110-2(轻链))，并分别亚克隆到pMac-H和pMac-L载体中。

1.2 IMM2510

人工设计IMM2510的全长编码序列。具体地，对于重链，将VEGFR1的第二胞外结构域(VEGFR1D2)的编码序列(SEQ ID NO:7)通过GS-接头(SEQ ID NO:11)与PD-L1抗体重链编码序列(SEQ ID NO:3)的5’端连接。将编码小鼠IgG1重链信号肽的57个核苷酸(SEQ ID NO:19)加到VEGFR1D2编码序列的5’端，并将Kozak序列(SEQ ID NO:20)加到信号肽序列的5’端。最后，在所得序列的5’和3’端分别加入HindIII和NheI限制性酶切位点。将所得序列通过金斯瑞合成(ID#:C9143DA150-1)，并亚克隆到pMac-H载体中。IMM2510轻链的表达载体与IMM25的相同。

1.3 IMM25011

人工设计IMM25011的全长编码序列。具体地，对于重链，将PD-L1抗体重链编码序列(SEQ ID NO:3)通过GS-接头(SEQ ID NO:9)与VEGFR1的第二胞外结构域(VEGFR1D2)的编码序列(SEQ ID NO:7)的3’端连接，并在所得序列的5’和3’端分别加入NheI和SalI限制性酶切位点。将所得序列通过金斯瑞合成(ID#:C8379CJ170-1)，并亚克隆到IMM25重链表达载体中。IMM25011轻链的表达载体与IMM25的相同。

1.4 IMM25031

人工设计IMM25031的全长编码序列。具体地，对于轻链，将VEGFR1的第二胞外结构域(VEGFR1D2)的编码序列(SEQ ID NO:7)通过GS-接头(SEQ ID NO:11)与PD-L1抗体轻链编码序列(SEQ ID NO:5)的5’端连接。将编码小鼠IgG1重链信号肽的57个核苷酸(SEQ ID NO:19)加到VEGFR1D2编码序列的5’端，并将Kozak序列(SEQ ID NO:20)加到信号肽序列的5’端。最后，在所得序列的5’和3’端分别加入HindIII和XbaI限制性酶切位点。将所得序列通过金斯瑞合成(ID#:C4608CE150-1)，并亚克隆到pMac-L载体中。IMM25031重链的表达载体与IMM25的相同。

实施例2.重组抗体的制备和质量分析

为制备重组蛋白，将表达载体使用聚醚酰亚胺(PEI)(polysciences,Cat#24765-1)转染到Free Style^TMCHO-S细胞(Thermo Fisher Scientific，Cat#R80007)中，形成转染子。细胞培养约7-10天，之后收集细胞培养上清液，以通过亲和色谱进行蛋白纯化。重组蛋白的纯度通过SEC-HPLC来分析。

图2中的SEC-HPLC图谱显示出本申请三种重组抗体之间的较大差异。IMM2510具有最高纯度(90.67％)，之后为IMM25011(85.58％)和IMM25031(71.97％)。IMM25011具有最高的聚体百分比(15.42％)，而IMM25031有更多的降解(27.11％)。

实施例3.重组抗体与VEGF-165结合

对于VEGF结合，在包被缓冲液(产品编码：1001329288 C3041-100CAP，Sigma-Aldrich Co.)中配制重组人VEGF-165(Cat#11066-HNAH，Sino Biologicals)，并转移到ELISA板上，50ng/孔，将板置于4℃冰箱过夜。之后，用含有0.05％吐温20的PBS(PBS-T)洗板3遍，之后添加梯度稀释的重组抗体和对照抗体(安维汀)，将板于室温孵育1小时，并用PBS-T再洗5遍。向板加入HRP-兔抗人IgG Fc(Cat#:309-036-008，Jackson ImmunoResearchLab)，且板于室温孵育1小时。用PBS-T洗板5次后，向板加入底物，并在用1N H₂SO₄停止显色后在酶标仪中读数。

如图3所示，本申请的三种重组抗体与VEGF-165具有相似的结合活性，但是相对地比安维汀低2-4倍。

实施例4.重组抗体与PD-L1结合

对于PD-L1结合的分析，将100μl 1×10⁶/ml CHO-PD-L1(ImmuneOnco,Cat#YMAK-C006)与100μl梯度稀释的重组抗体以及对照抗体(阿替利珠单抗和赫赛汀)4℃孵育40分钟。在用冷PBS洗涤后，细胞与FITC-偶联的抗人IgG-Fc抗体(Sigma，Cat#F9512)孵育。之后，细胞洗涤2遍，并进行FACS分析。

结果如图4所示，IMM25011具有与阿替利珠单抗相同的结合活性(阿替利珠单抗的EC₅₀＝0.22nM，IMM25011的EC₅₀＝0.23nM)，这与基于其结构的判断一致，而IMM25031(EC₅₀＝0.96nM)和IMM2510(0.85nM)具有相似的结合活性，相对地比阿替利珠单抗低4倍。

实施例5.重组抗体同时结合VEGF-165和PD-L1

对于重组抗体同时结合两个靶点的活性分析，将100μl 1×10⁶/ml CHO-PD-L1(ImmuneOnco,Cat#YMAK-C006)与100μl梯度稀释的IMM2510 4℃孵育45分钟。细胞用冷PBS洗2遍，之后与100μl 40nM生物素偶联的VEGF-165(Cat#11066-HNAH，Sino Biologicals)4℃孵育45分钟。在洗涤2遍后，细胞用FITC偶联的链霉亲和素(BD Pharmingen，Cat#554060，Lot#6169673)4℃染色45分钟。在洗涤后，细胞进行FACS分析。

如图5所示，随着IMM2510浓度的增加，观察到剂量依赖式的荧光信号增加，表明同时结合了两个靶点。IMM2510的结合亲和性(EC₅₀＝0.63nM)与在PD-L1单靶点结合测试中观察到的相似(EC₅₀＝0.85nM)。

实施例6.重组抗体诱导抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC)

作为靶细胞的CFSE标记Raji-PD-L1细胞(ImmuneOnco，Cat#YMAK-C007)，6×10⁵/ml，50μl，与100μl 6×10⁵/ml作为效应细胞的稳定表达FcγRIIIa的NK92MI细胞(ATCC，Cat#CRL-2408)以1：2比率混合，且混合的细胞在5％CO₂下与50μl连续稀释的IMM2510或IMM25于37℃培养4小时。之后向细胞培养液中加入碘化丙啶(PI)(Sigma，Cat#P4170)，浓度5μg/ml，细胞培养液经FACS分析PI信号。

为确认ADCC活性不会被VEGF结合影响，连同IMM2510或对照抗体一起，向细胞培养液中分别加入低浓度(25ng/ml)或高浓度(250ng/ml)的VEGF-165蛋白(Cat#11066-HNAH，Sino Biologicals)，按照上述程序分析ADCC。

基于以下公式计算由ADCC造成的细胞裂解百分比：％裂解(或％ADCC)＝(％IMM2510或IMM25处理的PI阳性细胞-％阴性对照蛋白处理的PI阳性细胞)/(100-％阴性对照蛋白处理的PI阳性细胞)*100。

如图6所示，与IMM25相比，IMM2510的ADCC活性降低了6倍(EC₅₀＝0.85nM vs.IMM25的EC₅₀＝0.22nM)，可能是相对较低的PD-L1结合亲和力引起的。在检测中加入VEGF-165时，IMM2510的ADCC活性不受影响，如图7所示，进一步表明其是同时分别结合两个靶点的。

实施例7.IMM2510具有较好的抗肿瘤效果

使用B-hPD-1人源化小鼠(BIOCYTOGEN)评估体内效力。在无血清培养基中配制稳定表达人PD-L1的小鼠结肠癌细胞(MC-38)(MC38-PD-L1，BIOCYTOGEN)，并注射至6-8周龄的B-hPD-1人源化小鼠右胁腹。当肿瘤体积达到100-200mm³时，小鼠随机分成5组，每组6只小鼠。小鼠分别经PBS、IMM25(5.0mg/kg)、VEGFR1-Fc(2.0mg/kg)、IMM2510(6.0mg/kg)、以及IMM25(5.0mg/kg)与VEGFR1-Fc(2.0mg/kg)的组合处理。处理经腹膜注射进行，一周两次，持续4周。测量肿瘤体积和体重，一周两次。

肿瘤体积(V)计算为(长×宽²)/2。肿瘤生长抑制率(TGI)用以下公式计算：肿瘤生长抑制率＝(1-给药组肿瘤体积变化/对照组肿瘤体积变化)×100％。

结果以均值±S.E.M表示。通过Dunnett’s多重比较进行两组之间的比较，其中认定P<0.05为显著。

表1.IMM2510和其他药剂的抗肿瘤效果

肿瘤体积和TGI在表1和图8中示出。数据显示，与PBS(均值＝2934.0mm³)相比，单药物处理小鼠的肿瘤体积生长较慢(第28天的平均肿瘤体积：IMM25＝2168.0mm³，VEGFR1-Fc＝2088.0mm³)，而用两种单药物的组合处理的小鼠的肿瘤体积生长比起单药物处理小鼠明显更慢(均值＝1552.0mm³)。重组抗体IMM2510以更强的效力抑制肿瘤生长(均值＝706.0mm³)，甚至显著地好于组合处理。

比较例1.IMM0404在HT-29或NCI-H1975异种移植模型中的抗肿瘤活性

本实施例中的IMM0404是一种重组抗体，包含两个SIRPαD1，各个经由GS-接头与EGFR抗体Eribitux各重链的N端连接。SIRPαD1-GS-接头-EGFR重链具有SEQ ID NO:23的氨基酸序列。EGFR抗体的轻链具有SEQ ID NO:24的氨基酸序列。

SIRPαD1-Fc是由连接Fc片段的SIRPαD1构成的融合蛋白，在WO2016169261中有过描述。融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示。

HT-29异种移植模型

在含有10％FBS的McCoy 5A培养基中于37℃、5％CO₂培养HT-29人结肠癌细胞。收集对数期细胞，并混悬在1×PBS中。以1:1的体积比，向混悬液中加入基质胶，并混合，每ml混合物包含3×10⁷细胞。

40只小鼠于右胁腹皮下注射HT-29细胞，每只小鼠3×10⁶细胞。当肿瘤体积达到100-200mm³时，将这些动物随机分成5组，每组8只小鼠。小鼠分别腹膜注射PBS、SIRPαD1-Fc(1.2mg/kg)、Erbitux(2.0mg/kg)、IMM0404(2.7mg/kg)、和SIRPαD1-Fc+Erbitux(1.2mg/kg+2.0mg/kg)，一周一次，持续4周。总共进行4次处理。第一次给药那天定为第0天。测量肿瘤体积和体重，一周两次。

肿瘤体积(V)计算为(长×宽²)/2。肿瘤生长抑制率(TGI)用以下公式计算：肿瘤生长抑制率＝(1-给药组肿瘤体积变化/对照组肿瘤体积变化)×100％。使用student测试来计算组间差异。

表2.IMM0404和其他抗体的抗肿瘤效果

从表2可以看出，在该异种移植模型中，IMM0404没有显示出比其他蛋白更好的抗肿瘤活性。

NCI-H1975异种移植模型

在含有10％FBS的RPMI-1640培养基(GIBCO，US)中于37℃、5％CO₂培养NCI-H1975非小细胞肺癌细胞。收集对数期细胞，并混悬在1×PBS中，每ml 1×10⁷细胞。

40只SCID小鼠于右胁腹皮下注射NCI-H1975细胞，每只小鼠1×10⁶细胞。当肿瘤体积达到100-200mm³时，将这些动物随机分成5组，每组8只小鼠。小鼠分别腹膜注射PBS、SIRPαD1-Fc(2.7mg/kg)、Erbitux(5.0mg/kg)、IMM0404(6.0mg/kg)、和SIRPαD1-Fc+Erbitux(2.7mg/kg+5.0mg/kg)，一周一次，持续3周。总共进行3次处理。第一次给药那天定为第0天。测量肿瘤体积和体重，一周两次。

表3.IMM0404和其他抗体的抗肿瘤效果

从表3可以看出，IMM0404的抗肿瘤活性比SIRPαD1-Fc好，但是比Eribitux以及SIRPαD1-Fc+Eribitux差。

尽管本发明已经在以上连同一个或多个实施方式进行了描述，应当理解的是，本发明不限于那些实施方式，且说明意在涵盖可能包括在所附权利要求的宗旨和范围内的所有可变方式、修改方式和等同方式。所有在本文中引用的文献通过引用的方式进一步全部并入本文。

本申请的一些重要氨基酸序列列于以下。

序列表

<110> 宜明昂科生物医药技术（上海）有限公司

<120> 靶向PD-1和VEGF的重组蛋白

<130> 55525 00021

<150> US 62/774,849

<151> 2018-12-03

<160> 25

<170> PatentIn版本3.5

<210> 1

<211> 1347

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PD-L1抗体重链的核苷酸序列

<400> 1

gaggtgcagc tggtcgagtc tggcggcggc ctcgttcaac caggcgggag cctgcggctc 60

agctgcgccg catctggatt caccttttct gattcttgga tccactgggt tcgccaggcc 120

cctggaaagg gactggagtg ggttgcctgg atctccccat atggtggctc gacttattat 180

gccgactctg tgaaaggacg gtttactatc tccgcggaca ctagcaaaaa taccgcatac 240

ctgcagatga actctctccg cgctgaagat acagctgtgt actactgcgc aagacgtcac 300

tggcccggcg gattcgacta ttgggggcag ggcactctgg tcaccgtgtc ctccgctagc 360

accaagggcc catcggtctt ccccctggca ccctcctcca agagcacctc tgggggcaca 420

gcggccctgg gctgcctggt caaggactac ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac 480

tcaggcgccc tgaccagcgg cgtgcacacc ttcccggctg tcctacagtc ctcaggactc 540

tactccctca gcagcgtggt gaccgtgccc tccagcagct tgggcaccca gacctacatc 600

tgcaacgtga atcacaagcc cagcaacacc aaggtggaca agagagttga gcccaaatct 660

tgtgacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc ccagcacctg aactcctggg gggaccgtca 720

gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga tctcccggac ccctgaggtc 780

acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccctgagg tcaagttcaa ctggtatgtg 840

gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta caacgccacg 900

taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaagact ggctgaatgg caaggagtac 960

aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca gcccccatcg ccgcaaccat ctccaaagcc 1020

aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc catcccggga ggagatgacc 1080

aagaaccaag tcagcctgac ctgcctggtc aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg 1140

gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac 1200

tccgacggct ccttcttcct ctattccaag ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag 1260

gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag 1320

agcctctccc tgtctccggg caaatga 1347

<210> 2

<211> 448

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PD-L1抗体重链的氨基酸序列

<400> 2

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser

20 25 30

Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro

115 120 125

Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly

130 135 140

Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn

145 150 155 160

Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln

165 170 175

Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser

180 185 190

Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser

195 200 205

Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr

210 215 220

His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser

225 230 235 240

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg

245 250 255

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro

260 265 270

Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

275 280 285

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ala Thr Tyr Arg Val Val

290 295 300

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

305 310 315 320

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Ala Ala Thr

325 330 335

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

340 345 350

Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys

355 360 365

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

370 375 380

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp

385 390 395 400

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser

405 410 415

Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala

420 425 430

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440 445

<210> 3

<211> 1344

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PD-L1抗体重链的核苷酸序列

<400> 3

gaggtgcagc tggtcgagtc tggcggcggc ctcgttcaac caggcgggag cctgcggctc 60

agctgcgccg catctggatt caccttttct gattcttgga tccactgggt tcgccaggcc 120

cctggaaagg gactggagtg ggttgcctgg atctccccat atggtggctc gacttattat 180

gccgactctg tgaaaggacg gtttactatc tccgcggaca ctagcaaaaa taccgcatac 240

ctgcagatga actctctccg cgctgaagat acagctgtgt actactgcgc aagacgtcac 300

tggcccggcg gattcgacta ttgggggcag ggcactctgg tcaccgtgtc ctccgctagc 360

accaagggcc catcggtctt ccccctggca ccctcctcca agagcacctc tgggggcaca 420

gcggccctgg gctgcctggt caaggactac ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac 480

tcaggcgccc tgaccagcgg cgtgcacacc ttcccggctg tcctacagtc ctcaggactc 540

tactccctca gcagcgtggt gaccgtgccc tccagcagct tgggcaccca gacctacatc 600

tgcaacgtga atcacaagcc cagcaacacc aaggtggaca agagagttga gcccaaatct 660

tgtgacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc ccagcacctg aactcctggg gggaccgtca 720

gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga tctcccggac ccctgaggtc 780

acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccctgagg tcaagttcaa ctggtatgtg 840

gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta caacgccacg 900

taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaagact ggctgaatgg caaggagtac 960

aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca gcccccatcg ccgcaaccat ctccaaagcc 1020

aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc catcccggga ggagatgacc 1080

aagaaccaag tcagcctgac ctgcctggtc aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg 1140

gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac 1200

tccgacggct ccttcttcct ctattccaag ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag 1260

gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag 1320

agcctctccc tgtctccggg ctga 1344

<210> 4

<211> 447

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PD-L1抗体重链的氨基酸序列

<400> 4

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser

20 25 30

Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro

115 120 125

Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly

130 135 140

Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn

145 150 155 160

Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln

165 170 175

Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser

180 185 190

Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser

195 200 205

Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr

210 215 220

His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser

225 230 235 240

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg

245 250 255

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro

260 265 270

Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

275 280 285

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ala Thr Tyr Arg Val Val

290 295 300

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

305 310 315 320

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Ala Ala Thr

325 330 335

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

340 345 350

Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys

355 360 365

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

370 375 380

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp

385 390 395 400

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser

405 410 415

Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala

420 425 430

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

435 440 445

<210> 5

<211> 645

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PD-L1抗体轻链的核苷酸序列

<400> 5

gatattcaaa tgacacaaag cccttcttcc ctgagcgctt ctgtgggcga ccgcgttaca 60

atcacatgca gggcaagcca ggatgtcagc actgctgtcg cttggtacca gcagaaacca 120

ggcaaggcac ctaagctcct gatctactcc gcctccttcc tgtattccgg agtcccctcc 180

cgcttttccg gctccgggtc tgggaccgat ttcaccctga ccatcagctc cctccagcct 240

gaagattttg ccacctatta ttgtcagcag tacctctatc acccagcgac ctttgggcag 300

gggacaaaag tggagatcaa gcgaactgtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 360

tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 420

cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480

gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540

ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600

ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gttag 645

<210> 6

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PD-L1抗体轻链的氨基酸序列

<400> 6

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Leu Tyr His Pro Ala

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 7

<211> 300

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> VEGFR1D2的核苷酸序列

<400> 7

agtgatacag gtagaccttt cgtagagatg tacagtgaaa tccccgaaat tatacacatg 60

actgaaggaa gggagctcgt cattccctgc cgggttacgt cacctaacat cactgttact 120

ttaaaaaagt ttccacttga cactttgatc cctgatggaa aacgcataat ctgggacagt 180

agaaagggct tcatcatatc agctgcaacg tacaaagaaa tagggcttct gacctgtgaa 240

gcaacagtca atgggcattt gtataagaca aactatctca cacatcgaca aaccaataca 300

<210> 8

<211> 100

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VEGFR1D2的氨基酸序列

<400> 8

Ser Asp Thr Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu

1 5 10 15

Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val

20 25 30

Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr

35 40 45

Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe

50 55 60

Ile Ile Ser Ala Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu

65 70 75 80

Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg

85 90 95

Gln Thr Asn Thr

100

<210> 9

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 接头的核苷酸序列

<400> 9

ggcggcggtg ggagcggcgg cggtgggagc 30

<210> 10

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 接头的氨基酸序列

<400> 10

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10

<210> 11

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 接头的核苷酸序列

<400> 11

ggcggcggtg ggagcggcgg cggtgggagc ggcggcgggg gctcg 45

<210> 12

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 接头的氨基酸序列

<400> 12

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

<210> 13

<211> 1689

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> IMM2510重链的核苷酸序列

<400> 13

agtgatacag gtagaccttt cgtagagatg tacagtgaaa tccccgaaat tatacacatg 60

actgaaggaa gggagctcgt cattccctgc cgggttacgt cacctaacat cactgttact 120

ttaaaaaagt ttccacttga cactttgatc cctgatggaa aacgcataat ctgggacagt 180

agaaagggct tcatcatatc agctgcaacg tacaaagaaa tagggcttct gacctgtgaa 240

gcaacagtca atgggcattt gtataagaca aactatctca cacatcgaca aaccaataca 300

ggcggcggtg ggagcggcgg cggtgggagc ggcggcgggg gctcggaggt gcagctggtc 360

gagtctggcg gcggcctcgt tcaaccaggc gggagcctgc ggctcagctg cgccgcatct 420

ggattcacct tttctgattc ttggatccac tgggttcgcc aggcccctgg aaagggactg 480

gagtgggttg cctggatctc cccatatggt ggctcgactt attatgccga ctctgtgaaa 540

ggacggttta ctatctccgc ggacactagc aaaaataccg catacctgca gatgaactct 600

ctccgcgctg aagatacagc tgtgtactac tgcgcaagac gtcactggcc cggcggattc 660

gactattggg ggcagggcac tctggtcacc gtgtcctccg ctagcaccaa gggcccatcg 720

gtcttccccc tggcaccctc ctccaagagc acctctgggg gcacagcggc cctgggctgc 780

ctggtcaagg actacttccc cgaaccggtg acggtgtcgt ggaactcagg cgccctgacc 840

agcggcgtgc acaccttccc ggctgtccta cagtcctcag gactctactc cctcagcagc 900

gtggtgaccg tgccctccag cagcttgggc acccagacct acatctgcaa cgtgaatcac 960

aagcccagca acaccaaggt ggacaagaga gttgagccca aatcttgtga caaaactcac 1020

acatgcccac cgtgcccagc acctgaactc ctggggggac cgtcagtctt cctcttcccc 1080

ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg 1140

gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag ttcaactggt atgtggacgg cgtggaggtg 1200

cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag cagtacaacg ccacgtaccg tgtggtcagc 1260

gtcctcaccg tcctgcacca agactggctg aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc 1320

aacaaagccc tcccagcccc catcgccgca accatctcca aagccaaagg gcagccccga 1380

gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgggaggaga tgaccaagaa ccaagtcagc 1440

ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat 1500

gggcagccgg agaacaacta caagaccacg cctcccgtgc tggactccga cggctccttc 1560

ttcctctatt ccaagctcac cgtggacaag agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca 1620

tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc agaagagcct ctccctgtct 1680

ccgggctga 1689

<210> 14

<211> 562

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> IMM2510重链的氨基酸序列

<400> 14

Ser Asp Thr Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu

1 5 10 15

Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val

20 25 30

Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr

35 40 45

Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe

50 55 60

Ile Ile Ser Ala Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu

65 70 75 80

Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg

85 90 95

Gln Thr Asn Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

100 105 110

Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln

115 120 125

Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe

130 135 140

Ser Asp Ser Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu

145 150 155 160

Glu Trp Val Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala

165 170 175

Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn

180 185 190

Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val

195 200 205

Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly

210 215 220

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

225 230 235 240

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala

245 250 255

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

260 265 270

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

275 280 285

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

290 295 300

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His

305 310 315 320

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys

325 330 335

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly

340 345 350

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

355 360 365

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

370 375 380

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

385 390 395 400

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ala Thr Tyr

405 410 415

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

420 425 430

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

435 440 445

Ala Ala Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

450 455 460

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser

465 470 475 480

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

485 490 495

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

500 505 510

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

515 520 525

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

530 535 540

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

545 550 555 560

Pro Gly

<210> 15

<211> 1674

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> IMM25011重链的核苷酸序列

<400> 15

gaggtgcagc tggtcgagtc tggcggcggc ctcgttcaac caggcgggag cctgcggctc 60

agctgcgccg catctggatt caccttttct gattcttgga tccactgggt tcgccaggcc 120

cctggaaagg gactggagtg ggttgcctgg atctccccat atggtggctc gacttattat 180

gccgactctg tgaaaggacg gtttactatc tccgcggaca ctagcaaaaa taccgcatac 240

ctgcagatga actctctccg cgctgaagat acagctgtgt actactgcgc aagacgtcac 300

tggcccggcg gattcgacta ttgggggcag ggcactctgg tcaccgtgtc ctccgctagc 360

accaagggcc catcggtctt ccccctggca ccctcctcca agagcacctc tgggggcaca 420

gcggccctgg gctgcctggt caaggactac ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac 480

tcaggcgccc tgaccagcgg cgtgcacacc ttcccggctg tcctacagtc ctcaggactc 540

tactccctca gcagcgtggt gaccgtgccc tccagcagct tgggcaccca gacctacatc 600

tgcaacgtga atcacaagcc cagcaacacc aaggtggaca agagagttga gcccaaatct 660

tgtgacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc ccagcacctg aactcctggg gggaccgtca 720

gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga tctcccggac ccctgaggtc 780

acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccctgagg tcaagttcaa ctggtatgtg 840

gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta caactccacg 900

taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaagact ggctgaatgg caaggagtac 960

aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc 1020

aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc catcccggga ggagatgacc 1080

aagaaccaag tcagcctgac ctgcctggtc aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg 1140

gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac 1200

tccgacggct ccttcttcct ctattccaag ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag 1260

gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag 1320

agcctctccc tgtctccggg cggcggcggt gggagcggcg gcggtgggag cagtgataca 1380

ggtagacctt tcgtagagat gtacagtgaa atccccgaaa ttatacacat gactgaagga 1440

agggagctcg tcattccctg ccgggttacg tcacctaaca tcactgttac tttaaaaaag 1500

tttccacttg acactttgat ccctgatgga aaacgcataa tctgggacag tagaaagggc 1560

ttcatcatat cagctgcaac gtacaaagaa atagggcttc tgacctgtga agcaacagtc 1620

aatgggcatt tgtataagac aaactatctc acacatcgac aaaccaatac atga 1674

<210> 16

<211> 557

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> IMM25011重链的氨基酸序列

<400> 16

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser

20 25 30

Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro

115 120 125

Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly

130 135 140

Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn

145 150 155 160

Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln

165 170 175

Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser

180 185 190

Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser

195 200 205

Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr

210 215 220

His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser

225 230 235 240

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg

245 250 255

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro

260 265 270

Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

275 280 285

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val

290 295 300

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

305 310 315 320

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr

325 330 335

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

340 345 350

Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys

355 360 365

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

370 375 380

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp

385 390 395 400

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser

405 410 415

Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala

420 425 430

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Gly

435 440 445

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Asp Thr Gly Arg Pro Phe

450 455 460

Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu Ile Ile His Met Thr Glu Gly

465 470 475 480

Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val

485 490 495

Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg

500 505 510

Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe Ile Ile Ser Ala Ala Thr Tyr

515 520 525

Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu Ala Thr Val Asn Gly His Leu

530 535 540

Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg Gln Thr Asn Thr

545 550 555

<210> 17

<211> 990

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> IMM25031轻链的核苷酸序列

<400> 17

agtgatacag gtagaccttt cgtagagatg tacagtgaaa tccccgaaat tatacacatg 60

actgaaggaa gggagctcgt cattccctgc cgggttacgt cacctaacat cactgttact 120

ttaaaaaagt ttccacttga cactttgatc cctgatggaa aacgcataat ctgggacagt 180

agaaagggct tcatcatatc agctgcaacg tacaaagaaa tagggcttct gacctgtgaa 240

gcaacagtca atgggcattt gtataagaca aactatctca cacatcgaca aaccaataca 300

ggcggcggtg ggagcggcgg cggtgggagc ggcggcgggg gctcggatat tcaaatgaca 360

caaagccctt cttccctgag cgcttctgtg ggcgaccgcg ttacaatcac atgcagggca 420

agccaggatg tcagcactgc tgtcgcttgg taccagcaga aaccaggcaa ggcacctaag 480

ctcctgatct actccgcctc cttcctgtat tccggagtcc cctcccgctt ttccggctcc 540

gggtctggga ccgatttcac cctgaccatc agctccctcc agcctgaaga ttttgccacc 600

tattattgtc agcagtacct ctatcaccca gcgacctttg ggcaggggac aaaagtggag 660

atcaagcgaa ctgtggctgc accatctgtc ttcatcttcc cgccatctga tgagcagttg 720

aaatctggaa ctgcctctgt tgtgtgcctg ctgaataact tctatcccag agaggccaaa 780

gtacagtgga aggtggataa cgccctccaa tcgggtaact cccaggagag tgtcacagag 840

caggacagca aggacagcac ctacagcctc agcagcaccc tgacgctgag caaagcagac 900

tacgagaaac acaaagtcta cgcctgcgaa gtcacccatc agggcctgag ctcgcccgtc 960

acaaagagct tcaacagggg agagtgttag 990

<210> 18

<211> 329

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> IMM25031轻链的氨基酸序列

<400> 18

Ser Asp Thr Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu

1 5 10 15

Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val

20 25 30

Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr

35 40 45

Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe

50 55 60

Ile Ile Ser Ala Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu

65 70 75 80

Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg

85 90 95

Gln Thr Asn Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

100 105 110

Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala

115 120 125

Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val

130 135 140

Ser Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys

145 150 155 160

Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg

165 170 175

Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser

180 185 190

Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Leu Tyr

195 200 205

His Pro Ala Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr

210 215 220

Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu

225 230 235 240

Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro

245 250 255

Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly

260 265 270

Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr

275 280 285

Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His

290 295 300

Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val

305 310 315 320

Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

325

<210> 19

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 小鼠IgG1重链信号肽的核苷酸序列

<400> 19

atgggatggt catgtatcat cctttttctg gtagcaactg caactggagt acattca 57

<210> 20

<211> 9

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Kozak序列

<400> 20

gccgccacc 9

<210> 21

<211> 1005

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> VEGFR1-Fc的核苷酸序列

<400> 21

agtgatacag gtagaccttt cgtagagatg tacagtgaaa tccccgaaat tatacacatg 60

actgaaggaa gggagctcgt cattccctgc cgggttacgt cacctaacat cactgttact 120

ttaaaaaagt ttccacttga cactttgatc cctgatggaa aacgcataat ctgggacagt 180

agaaagggct tcatcatatc agctgcaacg tacaaagaaa tagggcttct gacctgtgaa 240

gcaacagtca atgggcattt gtataagaca aactatctca cacatcgaca aaccaataca 300

gaattcgagc ccaaatcttg tgacaaaact cacacatgcc caccgtgccc agcacctgaa 360

ctcctggggg gaccgtcagt cttcctcttc cccccaaaac ccaaggacac cctcatgatc 420

tcccggaccc ctgaggtcac atgcgtggtg gtggacgtga gccacgaaga ccctgaggtc 480

aagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag gtgcataatg ccaagacaaa gccgcgggag 540

gagcagtaca acagcacgta ccgtgtggtc agcgtcctca ccgtcctgca ccaggactgg 600

ctgaatggca aggagtacaa gtgcaaggtc tccaacaaag ccctcccagc ccccatcgag 660

aaaaccatct ccaaagccaa agggcagccc cgagaaccac aggtgtacac cctgccccca 720

tcccgggatg agctgaccaa gaaccaggtc agcctgacct gcctggtcaa aggcttctat 780

cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc 840

acgcctcccg tgctggactc cgacggctcc ttcttcctct acagcaagct caccgtggac 900

aagagcaggt ggcagcaggg gaacgtcttc tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac 960

aaccactaca cgcagaagag cctctccctg tctccgggta aatga 1005

<210> 22

<211> 334

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VEGFR1-Fc的氨基酸序列

<400> 22

Ser Asp Thr Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu

1 5 10 15

Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val

20 25 30

Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr

35 40 45

Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe

50 55 60

Ile Ile Ser Ala Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu

65 70 75 80

Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg

85 90 95

Gln Thr Asn Thr Glu Phe Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr

100 105 110

Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe

115 120 125

Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro

130 135 140

Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val

145 150 155 160

Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr

165 170 175

Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val

180 185 190

Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys

195 200 205

Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser

210 215 220

Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro

225 230 235 240

Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val

245 250 255

Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly

260 265 270

Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp

275 280 285

Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp

290 295 300

Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His

305 310 315 320

Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325 330

<210> 23

<211> 582

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> SIRPαD1-接头-EGFR抗体重链

<400> 23

Glu Glu Glu Leu Gln Val Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Ser Val Ala

1 5 10 15

Ala Gly Glu Ser Ala Ile Leu His Cys Thr Val Thr Ser Leu Ile Pro

20 25 30

Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Ala Arg Glu Leu

35 40 45

Ile Tyr Asn Gln Lys Glu Gly His Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser

50 55 60

Glu Ser Thr Lys Arg Glu Asn Met Asp Phe Ser Ile Ser Ile Ser Ala

65 70 75 80

Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys Phe Arg Lys

85 90 95

Gly Ser Pro Asp Thr Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu Ser

100 105 110

Val Arg Ala Lys Pro Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

115 120 125

Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu

130 135 140

Val Gln Pro Ser Gln Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe

145 150 155 160

Ser Leu Thr Asn Tyr Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys

165 170 175

Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr

180 185 190

Asn Thr Pro Phe Thr Ser Arg Leu Ser Ile Asn Lys Asp Asn Ser Lys

195 200 205

Ser Gln Val Phe Phe Lys Met Asn Ser Leu Gln Ser Gln Asp Thr Ala

210 215 220

Ile Tyr Tyr Cys Ala Arg Ala Leu Thr Tyr Tyr Asp Tyr Glu Phe Ala

225 230 235 240

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys

245 250 255

Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly

260 265 270

Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro

275 280 285

Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr

290 295 300

Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val

305 310 315 320

Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn

325 330 335

Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro

340 345 350

Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu

355 360 365

Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp

370 375 380

Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp

385 390 395 400

Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly

405 410 415

Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn

420 425 430

Ala Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp

435 440 445

Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro

450 455 460

Ala Pro Ile Ala Ala Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu

465 470 475 480

Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn

485 490 495

Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile

500 505 510

Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr

515 520 525

Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys

530 535 540

Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys

545 550 555 560

Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu

565 570 575

Ser Leu Ser Pro Gly Lys

580

<210> 24

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> EGFR抗体的轻链

<400> 24

Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Val Ile Leu Ser Val Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn

20 25 30

Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Ser

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn Asn Trp Pro Thr

85 90 95

Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 25

<211> 366

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> SIRPαD1-Fc

<400> 25

Glu Glu Glu Leu Gln Val Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Ser Val Ala

1 5 10 15

Ala Gly Glu Ser Ala Ile Leu His Cys Thr Val Thr Ser Leu Ile Pro

20 25 30

Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Ala Arg Glu Leu

35 40 45

Ile Tyr Asn Gln Lys Glu Gly His Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser

50 55 60

Glu Ser Thr Lys Arg Glu Asn Met Asp Phe Ser Ile Ser Ile Ser Ala

65 70 75 80

Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys Phe Arg Lys

85 90 95

Gly Ser Pro Asp Thr Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu Ser

100 105 110

Val Arg Ala Lys Pro Ser Ala Pro Val Val Ser Gly Pro Ala Ala Arg

115 120 125

Ala Thr Pro Gln His Glu Phe Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His

130 135 140

Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val

145 150 155 160

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

165 170 175

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu

180 185 190

Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

195 200 205

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

210 215 220

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

225 230 235 240

Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile

245 250 255

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

260 265 270

Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu

275 280 285

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

290 295 300

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

305 310 315 320

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

325 330 335

Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

340 345 350

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

355 360 365

Claims

1.一种重组蛋白，包含：

-PD-L1抗体，其包含两条重链和两条轻链，所述重链的氨基酸序列如SEQ ID NO：2或4所示，所述轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示，以及

-血管内皮生长因子受体(VEGFR)的胞外Ig样结构域，其为VEGFR1的第二胞外Ig样结构域(VEGFR1D2)，其氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示，

其中所述VEGFR的胞外Ig样结构域经接头与所述PD-L1抗体的重链或轻链的N端、或重链的C端连接，

其中该重组蛋白能够同时与PD-L1、VEGF和Fc受体结合。

2.根据权利要求1所述的重组蛋白，其中所述VEGFR的胞外Ig样结构域经接头与所述PD-L1抗体的重链的N端连接。

3.根据权利要求2所述的重组蛋白，其中VEGFR胞外Ig样结构域-接头-PD-L1抗体重链包含SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列。

4.根据权利要求1所述的重组蛋白，其中所述VEGFR的胞外Ig样结构域经接头与所述PD-L1抗体的重链的C端连接。

5.根据权利要求4所述的重组蛋白，其中PD-L1抗体重链-接头-VEGFR胞外Ig样结构域包含SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列。

6.根据权利要求1所述的重组蛋白，其中所述VEGFR的胞外Ig样结构域经接头与所述PD-L1抗体的轻链的N端连接。

7.根据权利要求6所述的重组蛋白，其中VEGFR胞外Ig样结构域-接头-PD-L1抗体轻链包含SEQ ID NO：18所示的氨基酸序列。

8.一种多核苷酸，其编码权利要求1-7中任一项所述的重组蛋白。

9.一种表达载体，其包含权利要求8所述的多核苷酸。

10.一种宿主细胞，其包含权利要求9所述的表达载体。

11.一种药物组合物，其包含权利要求1-7中任一项所述的重组蛋白、权利要求8所述的多核苷酸、权利要求9所述的表达载体、或权利要求10所述的宿主细胞，以及至少一种药学上可接受的载体。

12.权利要求11所述的药物组合物在制备一种用于治疗由VEGF或PD-L1过表达、或VEGF与PD-L1过表达引起的疾病的药物中的用途，其中所述疾病选自癌症、老年性黄斑变性(AMD)、糖尿病性视网膜病变、肝纤维化和血管肉瘤。

13.根据权利要求12所述的用途，其中所述癌症选自急性髓细胞样白血病(AML)、慢性髓细胞样白血病(CML)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、多发性骨髓瘤(MM)、膀胱癌、卵巢癌、前列腺癌、肺癌、结肠癌、乳腺癌、胰腺癌、肝癌、和肾细胞癌。