CN109310755A - Pd-l1和kdr的双特异性结合蛋白 - Google Patents

Abstract

提供了双特异性结合蛋白，例如与人PD‑L1和人KDR结合的双特异性抗体。所述双特异性结合蛋白可用于治疗以免疫抑制和/或过度血管生成为特征的疾病和病状。

Description

PD-L1和KDR的双特异性结合蛋白

相关申请案的交叉引用

本申请要求2016年2月2日提交的美国临时申请第62/290,350号的优先权。该申请的内容通过引用整体并入本文。

发明领域

本文提供了双特异性结合蛋白，其包含结合人PD-L1的第一结合区和结合人KDR的第二结合区。还提供了制备双特异性结合蛋白的方法和使用双特异性结合蛋白治疗需要减少或抑制免疫抑制或减少或抑制血管生成的疾病或病状的方法。

发明背景

程序性死亡受体1(PD-1)是CD28受体家族的成员，该家族包含CD28、CTLA-4、PD-1、ICOS和BTLA的(Freeman等(2000)J Exp Med 192:1027-34；Latchman等(2001)Nat Immunol2:261-8)。PD-1是免疫病理状态进展期间，活化T细胞和B细胞上主要上调的诱导型免疫抑制受体。PD-1与其配体PD-L1的相互作用导致对TCR和BCR介导的增殖和细胞因子生成的抑制以及通过内源性PD-1介导的基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)的负信号传导诱导抗原特异性T细胞凋亡(Agata等(1996)Int.Immunol.8:765,Unkeless和Jin.(1997)Curr.Opin.Immunol.9:338-343,Okzaki等(2001)PNAS98:13866-71,Dong等(2002)Nat.Med.8:793-800)。PD-L1是细胞表面糖蛋白并且是PD-1的主要配体。在细胞活化后，在淋巴组织和非淋巴外周组织上PD-L1也可诱导。除免疫细胞外，PD-L1在多种受影响的细胞类型，包括癌细胞和基质细胞中上调，并且在疾病恶化过程中在免疫抑制上起积极作用(Iwai等(2002)PNAS 99:12293-7，Ohigashi等(2005)Clin Cancer Res 11:2947-53)。已将PD-L1上调与多种癌症和病毒感染的不良临床结果联系起来(Hofmeyer等(2011)J.BioMed.Biotech.2011:1-9,McDermott和Atkins.(2013)Cancer Med.2:662-73)。在临床前和临床环境中，抗体对PD-1或PD-L1的阻断促进CD8 T细胞浸润、CTL活性和存在的Th1细胞因子IFN-γ增加(Zhou等(2010)J.Immunol.185:5082-92,Nomi等(2007)Clin CancerRes.13:2152-7,Flies等(2011)YaleJ.Bio.Med.48:409-21，Zitvogel和Kroemer.(2012)OncoImmunol.1:1223-25)。已经证实作为免疫调节剂的PD-L1抗体在用作单一疗法或与其它免疫抑制分子的抗体组合时有效。

VEGFR是受体酪氨酸激酶，并且与PDGF和成纤维细胞生长因子(FGF)属于相同的受体家族。KDR(也称为VEGFR2)是结合VEGF同种型A、C、D和E的受体。它在内皮细胞分化和VEGF促有丝分裂、血管生成和渗透性增强效应中起作用。KDR是200kDa糖蛋白，由细胞外结构域中的7个Ig样环、跨膜结构域和由激酶插入物分开的两个细胞内酪氨酸激酶结构域组成。第二和第三Ig样环是VEGF的高亲和力配体结合结构域，而第一和第四Ig样环分别调节配体结合和受体二聚化。与VEGFR1的25pM的Kd相比，VEGF结合KDR的Kd为75-250pM。KDR主要在血管内皮细胞的细胞表面上表达。KDR也存在于造血细胞、血管平滑肌细胞(VSMC)和一些恶性细胞的细胞表面。

血管生成是生长新血管的高度复杂过程，其涉及毛细血管内皮细胞从预先存在的血管增殖和迁移以及组织浸润，细胞组装成管状结构，新形成的管状组件与闭路血管系统连接，以及新形成的毛细血管成熟。

血管生成在正常生理过程，包括胚胎发育、卵泡生长和伤口愈合中很重要。过度血管生成也会导致肿瘤性疾病和非肿瘤性疾病(例如年龄相关性黄斑变性(AMD)、糖尿病性视网膜病和新生血管性青光眼)中的新血管形成。已经证实用雷珠单抗(ranibizumab)靶向血管内皮生长因子(VEGF)的抗血管生成疗法对延迟AMD进展有效。

血管生成在原发性肿瘤的生长和转移中起重要作用，这是因为生长和转移依赖于新血管的形成。没有血管生成所引起的新血管形成时，肿瘤出现坏死、凋亡或不能生长到明显大小。肿瘤血管生成涉及几个过程，包括来自先前存在的血管的内皮细胞活化、增殖、迁移和组织浸润。这些过程通过肿瘤细胞及其周围基质产生血管生成生长因子如VEGF而引发。

KDR已成为抗癌疗法的重要靶标。因为许多肿瘤分泌升高量的VEGF，而KDR分子的数量保持相对恒定，所以靶向KDR增加了抑制VEGF信号传导的可能性，从而抑制肿瘤生长。

发明内容

提供了与人PD-L1和人KDR结合的双特异性结合蛋白。在某些实施方案中，双特异性结合蛋白与PD-L1结合并阻断PD-L1与PD-1的相互作用。通过阻断PD-L1与PD-1的相互作用，此类双特异性结合蛋白可用于减少或抑制免疫抑制。通过阻断VEGF与KDR的相互作用，此类双特异性结合蛋白可用于减少或抑制血管生成。双特异性结合蛋白因为在一种药剂中组合了抑制免疫抑制和血管生成两者的能力而特别有用。

在一个实施方案中，提供了与人PD-L1和人KDR结合的双特异性抗体。双特异性抗体包含与人PD-L1结合的第一抗原结合位点和与人KDR结合的第二抗原结合位点。还提供了编码双特异性抗体的核酸分子以及包含所述核酸的表达载体，其能够在原核或真核宿主细胞中表达所述核酸，从而导致所述双特异性抗体的产生。还提供了包含用于重组产生双特异性抗体的表达载体的宿主细胞。

本文提供了一种双特异性抗体，其包含结合PD-L1的scFv，所述scFv与结合KDR的抗体连接。在一个实施方案中，PD-L1 scFv与结合KDR的IgG的重链恒定结构域的羧基末端连接。在另一个实施方案中，PD-L1 scFv与结合KDR的IgG的轻链恒定结构域的羧基末端连接。在另一个实施方案中，PD-L1 scFv与结合KDR的IgG的重链可变结构域的氨基末端连接。在另一个实施方案中，PD-L1 scFv与结合KDR的IgG的轻链可变结构域的氨基末端连接。

本文提供了一种双特异性抗体，其包含结合KDR的scFv，所述scFv与结合PD-L1的抗体连接。在一个实施方案中，KDR scFv与结合PD-L1的IgG的重链恒定结构域的羧基末端连接。在另一个实施方案中，KDR scFv与结合PD-L1的IgG的轻链恒定结构域的羧基末端连接。在另一个实施方案中，KDR scFv与结合PD-L1的IgG的重链可变结构域的氨基末端连接。在另一个实施方案中，PD-L1 scFv与结合PD-L1的IgG的轻链可变结构域的氨基末端连接。

在一个实施方案中，结合PD-L1的scFv的氨基酸序列为：

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSAYRMFWVRQAPGKGLEWVSSIYPSGGITFYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAIYYCARIKLGTVTTVDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGAYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSSTRVFGTGTKVTVLGQP(SEQ ID NO:1)。CDR加下划线。

在一个实施方案中，结合KDR的scFv的氨基酸序列为：

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSWYVMGWVRQAPGKGLEWVSSIYPSGGATNYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGNYFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQSVLTQPPSVSVSPGQTASITCSGEKLGDEYASWYQQKPGQSPVLVIYQDNKRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADYYCQAW DSSTLLFGGGTKLTVLGQP(SEQ ID NO:2)。CDR加下划线。

在一个实施方案中，结合KDR的scFv的氨基酸序列为：

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSWYVMGWVRQAPGKGLEWVSSIYPQGGATSYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGNYFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPGTLSLSPGEGATLSCRASQSVSSNYFGWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDSAVYYCQ QFDSLPLTFGGGTKVEIK(SEQ ID NO:3)。CDR加下划线。

在一个实施方案中，结合PD-L1的IgG的重链可变结构域的氨基酸序列为：

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSAYRMFWVRQAPGKGLEWVSSIYPSGGITFYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAIYYCARIKLGTVTTVDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:4)。CDR加下划线。

在一个实施方案中，结合PD-L1的IgG的轻链可变结构域的氨基酸序列为：

QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGAYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSSTRVFGTGTKVTVL(SEQ ID NO:5)。CDR加下划线。

在一个实施方案中，结合KDR的IgG的重链可变结构域的氨基酸序列为：

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSWYVMGWVRQAPGKGLEWVSSIYPSGGATNYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGNYFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:6)。CDR加下划线。

在一个实施方案中，结合KDR的IgG的轻链可变结构域的氨基酸序列为：

QSVLTQPPSVSVSPGQTASITCSGEKLGDEYASWYQQKPGQSPVLVIYQDNKRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADYYCQAWDSSTLLFGGGTKLTVL(SEQ ID NO:7)。CDR加下划线。

在一个实施方案中，结合KDR的IgG的重链可变结构域的氨基酸序列为：

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSWYVMGWVRQAPGKGLEWVSSIYPQGGATSYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGNYFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:8)。CDR加下划线。

在一个实施方案中，结合KDR的IgG的轻链可变结构域的氨基酸序列为：

DIQMTQSPGTLSLSPGEGATLSCRASQSVSSNYFGWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDSAVYYCQQFDSLPLTFGGGTKVEIK(SEQ ID NO:9)。CDR加下划线。

在一个实施方案中，所述双特异性抗体包含结合人PD-L1的重链可变结构域，并且具有三个互补决定区(CDR)，其中CDR1的氨基酸序列为GFTFSAYRMF(SEQ ID NO:10)，CDR2的氨基酸序列为SIYPSGGITFYADSVKG(SEQ ID NO:11)，并且CDR3的氨基酸序列为IKLGTVTTVDY(SEQ ID NO:12)。

在一个实施方案中，所述双特异性抗体包含结合人PD-L1的轻链可变结构域，并且具有三个CDR，其中CDR1的氨基酸序列为TGTSSDVGAYNYVS(SEQ ID NO:13)，CDR2的氨基酸序列为DVSNRPS(SEQ ID NO:14)，并且CDR3的氨基酸序列为SSYTSSSTRV(SEQ ID NO:15)。

在一个实施方案中，所述双特异性抗体包含结合人KDR的重链可变结构域并具有三个CDR，其中CDR1的氨基酸序列为GFTFSWYVMG(SEQ ID NO:16)，CDR2的氨基酸序列为SIYPSGGATNYADSVKG(SEQ ID NO:17)，并且CDR3的氨基酸序列为GNYFDY(SEQ ID NO:18)。

在一个实施方案中，所述双特异性抗体包含结合人KDR的轻链可变结构域并具有三个CDR，其中CDR1的氨基酸序列为SGEKLGDEYAS(SEQ ID NO:19)，CDR2的氨基酸序列为QDNKRPS(SEQ ID NO:20)，并且CDR3的氨基酸序列为QAWDSSTLL(SEQ ID NO:21)。

在一个实施方案中，所述双特异性抗体包含结合人KDR的重链可变结构域并具有三个CDR，其中CDR1的氨基酸序列为GFTFSWYVMG(SEQ ID NO:22)，CDR2的氨基酸序列为SIYPQGGATSYADSVK(SEQ ID NO:23)，并且CDR3的氨基酸序列为GNYFDY(SEQ ID NO:24)。

在一个实施方案中，所述双特异性抗体包含结合人KDR的轻链可变结构域并且具有三个CDR，其中CDR1的氨基酸序列为RASQSVSSNYFG(SEQ ID NO:25)，CDR2的氨基酸序列为GASSRAT(SEQ ID NO:26)，并且CDR3的氨基酸序列为QQFDSLPLT(SEQ ID NO:27)。

在一个实施方案中，结合PD-L1的IgG重链的氨基酸序列为：

(SEQ ID NO:28)。CDR加下划线。在一些实例中，LL(粗体)可以突变为其它残基，例如AA。

在一个实施方案中，结合PD-L1的IgG轻链的氨基酸序列为：

QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGAYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSSTRVFGTGTKVTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTKPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTEC(S)(SEQ ID NO:29)。CDR加下划线。

在一个实施方案中，结合KDR的IgG重链的氨基酸序列为：

(SEQID NO:30)。CDR加下划线。在一些实例中，LL(粗体)可以突变为其它残基，例如AA。

在一个实施方案中，结合KDR的IgG轻链的氨基酸序列为：

QSVLTQPPSVSVSPGQTASITCSGEKLGDEYASWYQQKPGQSPVLVIYQDNKRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADYYCQAWDSSTLLFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTKPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTEC(S)(SEQ IDNO:31)。CDR加下划线。

在一个实施方案中，结合KDR的IgG重链的氨基酸序列为：

(SEQID NO:32)。CDR加下划线。在一些实例中，LL(粗体)可以突变为其它残基，例如AA。

在一个实施方案中，结合KDR的IgG轻链的氨基酸序列为：

DIQMTQSPGTLSLSPGEGATLSCRASQSVSSNYFGWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDSAVYYCQQFDSLPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQID NO:33)。CDR加下划线。

在一个实施方案中，结合PD-L1的scFv的氨基酸序列为：

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSWYLMKWVRQAPGKCLEWVSYIGSSGGFTAYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAMYYCAREDDFGAMDVWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQTVSKYFNWFQQKPGEAPKLLIYATSTLQSGVPSRFSGSGYGTEFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYTTPWTFGCGTKVEIK(SEQ ID NO:57)。CDR加下划线。也有加下划线的是由G突变而来的两个半胱氨酸，即“C”。

在一个实施方案中，所述双特异性抗体包含结合人PD-L1的重链可变结构域并且具有三个互补决定区(CDR)，其中CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别为：GFTFSWYLMK、YIGSSGGFTAYADSVKG和EDDFGAMDV(SEQ ID NO:58-60)。

在一个实施方案中，所述双特异性抗体包含结合人PD-L1的轻链可变结构域并且具有三个互补决定区(CDR)，其中CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别为：RASQTVSKYFNW、ATSTLQS和QQSYTTPWT(SEQ ID NO:61-63)。

在一个实施方案中，结合PD-L1的IgG的重链可变结构域的氨基酸序列为：

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSWYLMKWVRQAPGKGLEWVSYIGSSGGFTAYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAMYYCAREDDFGAMDVWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO:64)。CDR加下划线。

在一个实施方案中，结合PD-L1的IgG的重链的氨基酸序列为：

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSWYLMKWVRQAPGKGLEWVSYIGSSGGFTAYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAMYYCAREDDFGAMDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(SEQ ID NO:66)。CDR加下划线。也加有下划线的是由两个亮氨酸LL突变而来的两个丙氨酸，即“AA”。

在一个实施方案中，结合PD-L1的IgG的轻链可变结构域的氨基酸序列为：

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQTVSKYFNWFQQKPGEAPKLLIYATSTLQSGVPSRFSGSGYGTEFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYTTPWTFGQGTKVEIK(SEQ ID NO:65)。CDR加下划线。

在一个实施方案中，结合PD-L1的IgG的轻链的氨基酸序列为：

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQTVSKYFNWFQQKPGEAPKLLIYATSTLQSGVPSRFSGSGYGTEFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYTTPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ IDNO:67)。CDR加下划线。

本发明还提供了双特异性结合蛋白的缀合物，例如但不限于显像剂、治疗剂或细胞毒性剂。

本发明还提供了包含双特异性结合蛋白和至少一种药学上可接受的载体的组合物。

在一个实施方案中，提供了能够与人PDL1结合并且也能够与人KDR结合的融合蛋白。融合蛋白可包括与人PD-L1结合的部分和与人KDR结合的部分。在一个实施方案中，融合蛋白与人PD-L1结合的部分是抗体或其PD-L1结合片段。在一个实施方案中，融合蛋白与人KDR结合的部分是抗体或其KDR结合片段。在一个实施方案中，融合蛋白与人PD-L1结合的部分是抗体或其PD-L1结合片段，并且融合蛋白与人KDR结合的部分是抗体或其KDR结合片段。

提供了一种抑制受试者中人PD1与人PD-L1相互作用的方法，该方法包括施用有效量的本文公开的双特异性抗体或其片段。还提供了一种抑制人PD-L1介导的免疫抑制的方法，其包括施用有效量的本文公开的双特异性抗体或其片段，或本文公开的融合蛋白。

还提供了一种刺激对表达人PD-L1的细胞或组织的免疫反应的方法，其包括向受试者施用有效量的本文公开的双特异性抗体或其片段，或本文公开的融合蛋白。在某些实施方案中，表达人PD-L1的细胞或组织为赘生性细胞或受感染细胞。

提供了一种中和人KDR或鼠KDR活化的方法，其包括使细胞与有效量的本发明的双特异性抗体或其片段接触。

还提供了一种抑制血管生成的方法，其包括向受试者施用有效量的本发明的双特异性抗体或其片段。

还提供了一种减少肿瘤生长的方法，其包括向受试者施用有效量的本发明的双特异性抗体或其片段。

本文公开了一种治疗受试者的肿瘤性疾病的方法，其包括向受试者施用有效量的如本文所公开的双特异性抗体或其片段，其中所述肿瘤型疾病选自肺癌、结直肠癌肾细胞癌、成胶质细胞瘤、卵巢癌、膀胱癌、胃癌、多发性骨髓瘤、非小细胞肺癌和胰腺癌。

本文提供了以下带编号的本发明的非限制性实施方案：

1.一种双特异性结合蛋白，其包含与人PD-L1结合的第一区和与人KDR结合的第二区。

2.根据实施方案1所述的双特异性结合蛋白，其为双特异性抗体。

3.根据实施方案1所述的双特异性结合蛋白，其为融合蛋白。

4.一种双特异性抗体，其包含IgG、IgA、IgE或IgD和scFv。

5.根据实施方案4所述的双特异性抗体，其包含结合PD-L1的IgG和结合KDR的scFv。

6.根据实施方案4所述的双特异性抗体，其包含结合KDR的IgG和结合PD-L1的scFv。

7.根据实施方案5或6所述的双特异性抗体，其包含结合人PD-L1并且具有三个互补决定区(CDR)的重链可变结构域，其中CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO:10-12或分别为SEQ ID NO:58-60。

8.根据实施方案5或6所述的双特异性抗体，其包含结合人PD-L1并且具有三个CDR的轻链可变结构域，其中CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO:13-15或分别为SEQ ID NO:61-63。

9.根据实施方案5或6所述的双特异性抗体，其包含结合人KDR并且具有三个CDR的重链可变结构域，其中CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO:16-18。

10.根据实施方案5或6所述的双特异性抗体，其包含结合人KDR并且具有三个CDR的轻链可变结构域，其中CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO:19-21。

11.根据实施方案5或6所述的双特异性抗体，其包含结合人KDR并且具有三个CDR的重链可变结构域，其中CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO:22-24。

12.根据实施方案5或6所述的双特异性抗体，其包含结合人KDR并且具有三个CDR的轻链可变结构域，其中CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO:25-27。

13.根据实施方案5或6所述的双特异性抗体，其包含重链和轻链，其中所述重链和轻链包含选自由以下组成的组的重链/轻链对的相应序列：SEQ ID NO:34和31、SEQ ID NO:30和35、SEQ ID NO:36和31、SEQ ID NO:30和37、SEQ ID NO:38和33、SEQ ID NO:32和39、SEQ ID NO:40和33、SEQ ID NO:32和41、SEQ ID NO:42和29、SEQ ID NO:28和43、SEQ IDNO:44和29、SEQ ID NO:28和45、SEQ ID NO:46和29、SEQ ID NO:28和47、SEQ ID NO:48和29、SEQ ID NO:28和49、SEQ ID NO:51和50、SEQ ID NO:52和50、SEQ ID NO:53和50、SEQ IDNO:54和29、SEQ ID NO:55和29及SEQ ID NO:56和29。

14.一种治疗需要减少免疫抑制或减少血管生成的患者的方法，其包括向需要这样减少免疫抑制或血管生成的患者施用实施方案1-3中任一项所述的双特异性结合蛋白或实施方案4-13中任一项所述的双特异性抗体。

15.一种治疗癌症的方法，其包括向有需要的患者施用实施方案1-3中任一项所述的双特异性结合蛋白或实施方案4-13中任一项所述的双特异性抗体。

16.根据实施方案15所述的方法，其中所述癌症选自肺癌、结直肠癌肾细胞癌、成胶质细胞瘤、卵巢癌、膀胱癌、胃癌、多发性骨髓瘤、非小细胞肺癌和胰腺癌。

17.一种分离的核酸分子，其编码实施方案1-3中任一项所述的双特异性结合蛋白，实施方案4-13中任一项所述的双特异性抗体或其多肽链。

18.一种载体，其包含实施方案17所述的核酸分子。

19.一种培养的宿主细胞，其包含实施方案18所述的载体。

20.一种生成多肽的方法，所述方法包括在容许所述核酸分子表达的条件下培养实施方案19所述的宿主细胞。

21.一种实施方案1-3中任一项所述的双特异性结合蛋白或实施方案4-13中任一项所述的双特异性抗体的缀合物，其中所述双特异性结合蛋白或所述双特异性抗体与选自显像剂、治疗剂和细胞毒性剂的药剂缀合。

22.一种药物组合物，其包含

实施方案1-3中任一项所述的双特异性结合蛋白，实施方案4-13中任一项所述的双特异性抗体或实施方案21所述的缀合物，和药学上可接受的载体。

在下面的描述中阐述了本发明一个或多个实施方案的详情。从说明书和权利要求看，本发明的其它特征、目的和优点将显而易见。

附图说明

图1A、1B、1C和1D显示了可以构建包含PD-L1结合区和KDR结合区的双特异性抗体的四种可能方式。在每种情况下，所述双特异性抗体均包含IgG，IgG包含的其中一个结合区与包含其它结合区的scFv共价连接。IgG使用常规双臂抗体绘图显示；scFv为细长椭圆形。图1A描绘了与IgG重链恒定结构域的羧基末端连接的scFv。图1B描绘了与IgG轻链恒定结构域的羧基末端连接的scFv。图1C描绘了与IgG轻链可变结构域的氨基末端连接的scFv。图1D描绘了与IgG重链可变结构域的氨基末端连接的scFv。

图2显示了双特异性抗体的重链和轻链氨基酸序列(SEQ ID NO:34和31)，其中称为D7A8的PD-L1特异性scFv与称为B1A1的KDR特异性IgG抗体的重链恒定结构域的羧基末端连接。

图3显示了双特异性抗体的重链和轻链氨基酸序列(SEQ ID NO:30和35)，其中称为D7A8的PD-L1特异性scFv与称为B1A1的KDR特异性IgG抗体的轻链恒定结构域的羧基末端连接。

图4显示了双特异性抗体的重链和轻链氨基酸序列(SEQ ID NO:36和31)，其中称为D7A8的PD-L1特异性scFv与称为B1A1的KDR特异性IgG抗体的重链可变结构域的氨基末端连接。

图5显示了双特异性抗体的重链和轻链氨基酸序列(SEQ ID NO:30和37)，其中称为D7A8的PD-L1特异性scFv与称为B1A1的KDR特异性IgG抗体的轻链可变结构域的氨基末端连接。

图6显示了双特异性抗体的重链和轻链氨基酸序列(SEQ ID NO:38和33)，其中称为D7A8的PD-L1特异性scFv与称为B1C4A7的KDR特异性IgG抗体的重链恒定结构域的羧基末端连接。

图7显示了双特异性抗体的重链和轻链氨基酸序列(SEQ ID NO:32和39)，其中称为D7A8的PD-L1特异性scFv与称为B1C4A7的KDR特异性IgG抗体的轻链恒定结构域的羧基末端连接。

图8显示了双特异性抗体的重链和轻链氨基酸序列(SEQ ID NO:40和33)，其中称为D7A8的PD-L1特异性scFv与称为B1C4A7的KDR特异性IgG抗体的重链可变结构域的氨基末端连接。

图9显示了双特异性抗体的重链和轻链氨基酸序列(SEQ ID NO:32和41)，其中称为D7A8的PD-L1特异性scFv与称为B1C4A7的KDR特异性IgG抗体的轻链可变结构域的氨基末端连接。

图10显示了双特异性抗体的重链和轻链氨基酸序列(SEQ ID NO:42和29)，其中称为B1A1的KDR特异性scFv与称为D7A8的PD-L1特异性IgG抗体的重链恒定结构域的羧基末端连接。

图11显示了双特异性抗体的重链和轻链氨基酸序列(SEQ ID NO:28和43)，其中称为B1A1的KDR特异性scFv与称为D7A8的KDR特异性IgG抗体的轻链恒定结构域的羧基末端连接。

图12显示了双特异性抗体的重链和轻链氨基酸序列(SEQ ID NO:44和29)，其中称为B1A1的KDR特异性scFv与称为D7A8的KDR特异性IgG抗体的重链可变结构域的氨基末端连接。

图13显示了双特异性抗体的重链和轻链氨基酸序列(SEQ ID NO:28和45)，其中称为B1A1的KDR特异性scFv与称为D7A8的KDR特异性IgG抗体的轻链可变结构域的氨基末端连接。

图14显示了双特异性抗体的重链和轻链氨基酸序列(SEQ ID NO:46和29)，其中称为B1C4A7的KDR特异性scFv与称为D7A8的PD-L1特异性IgG抗体的重链恒定结构域的羧基末端连接。

图15显示了双特异性抗体的重链和轻链氨基酸序列(SEQ ID NO:28和47)，其中称为B1C4A7的KDR特异性scFv与称为D7A8的KDR特异性IgG抗体的轻链恒定结构域的羧基末端连接。

图16显示了双特异性抗体的重链和轻链氨基酸序列(SEQ ID NO:48和29)，其中称为B1C4A7的KDR特异性scFv与称为D7A8的KDR特异性IgG抗体的重链可变结构域的氨基末端连接。

图17显示了双特异性抗体的重链和轻链氨基酸序列(SEQ ID NO:28和49)，其中称为B1C4A7的KDR特异性scFv与称为D7A8的KDR特异性IgG抗体的轻链可变结构域的氨基末端连接。

图18显示了VEGFR2和PDL1的双特异性抗体(BsAb)的结构。抗VEGFR2抗体B1A1(与人、大鼠和猴VEGFR2结合)和B1C4A7(与人、小鼠、大鼠和猴VEGFR2结合)作为常规IgG1使用。抗PDL1抗体D7A8(与小鼠、大鼠和猴PDL1结合)重新格式化为单链可变片段并附于B1A1或B1C4A7的c-端。“LALA形式”是指通过两个丙氨酸(AA)置换两个亮氨酸残基(例如以上SEQID NO:28、30和32中的LL粗体)使其CH2区突变的抗体。

图19显示了蛋白A纯化后对双特异性抗体的SDS-PAGE分析。

图20显示了UPLC系统中经蛋白A纯化的双特异性抗体的尺寸排阻色谱图(280nm下的紫外线轨迹)。

图21显示了PBS缓冲液中双特异性抗体的DSC扫描结果。

图22显示了在小鼠血清中于37处理5天的双特异性抗体的蛋白质印迹结果。

图23显示了用于测定人和小鼠VEGFR2以及人和小鼠PDL1的EC50的双特异性抗体A7-A8的剂量反应ELISA结果。

图24显示了用于测定双特异性抗体A7-A8对VEGF-VEGFR2和PDL1-PD1的IC50的剂量反应阻断ELISA结果。

图25显示了与细胞表达的人或小鼠VEGFR2和人或小鼠PDL1的结合。

图26显示了通过表面等离子体共振(Biacore)检查到的双特异性抗体A7-A8与受体hVEGFR2和hPDL1的相互作用。

图27显示了在交叉结合ELISA中在固定hVEGFR2表面上和溶液中的复合物的方案。

图28显示通过交叉结合ELISA检查，双特异性抗体A7-A8可与VEGFR2和PDL1同时结合。

图29显示了双特异性抗体A7-A8对VEGFR2及KDR-PAE(hVEGFR2)和EOMA(mVEGFR2)中的下游分子受VEGF刺激的磷酸化的抑制。

图30显示了双特异性抗体A7-A8存在下细胞因子IL2和INFγ的分泌。

图31显示了用于测定人和小鼠VEGFR2以及人和小鼠PDL1的EC50的双特异性抗体A1-A8的剂量反应ELISA结果。

图32显示了用于测定双特异性抗体A1-A8对VEGF-VEGFR2和PDL1-PD1的IC50的剂量反应阻断ELISA结果。

图33显示了与细胞表达的人或小鼠VEGFR2和人或小鼠PDL1的结合。

图34显示了通过表面等离子体共振(Biacore)检查到的双特异性抗体A1-A8与受体hVEGFR2和hPDL1的相互作用。

图35显示通过交叉结合ELISA检查，双特异性抗体A1-A8可与VEGFR2和PDL1同时结合。

图37显示了双特异性抗体A1-A8和A7-A8存在下细胞因子IL2和INFγ的分泌。

图38显示了BsAb(A7-A8)的CT26研究结果。

图39A和39B显示了BsAb(A7-A8)的MC38研究结果。

图40显示了BsAb(B1A1-A11)和BsAb(B1C4A7-A11)变体的SDS-PAGE结果，其中观察到降解条带。

图41显示了BsAb(A11-B1A1)和BsAb(D7A8-B1A1)变体的SDS-PAGE结果，其中在方向改变后未观察到降解条带。

图42显示了与PDL1和VEGFR2的结合。

图43显示阻断配体和受体的相互作用。

图44显示了BsAb(A11-B1A1)、BsAb(A11-B1A1)_30和BsAb(A11-B1A1)_30cc的共同轻链序列(SEQ ID NO:50)和的三个重链序列(SEQ ID NO:51-53)。

图45显示了BsAb(D7A8-B1A1)、BsAb(D7A8-B1A1)_30和BsAb(D7A8-B1A1)_30cc的共同轻链序列(SEQ ID NO:29)和的三个重链序列(SEQ ID NO:54-56)。

具体实施方式

免疫细胞上的PD-1与PD-L1的相互作用抑制免疫细胞的增殖和细胞因子产生。PD-L1在各种组织(包括癌)中也是可诱导的和上调的。PD-1和PD-L1一起在免疫抑制中起作用。本文提供了与人PD-L1结合并阻断其与人PD-1的相互作用的新型双特异性结合蛋白，例如双特异性抗体或此类双特异性抗体的抗原结合片段。

双特异性抗体还与人KDR结合并阻断其与人VEGF的相互作用。在一些实施方案中，所述双特异性抗体阻断配体与KDR结合(例如，VEGF-A、VEGF-C、VEGF-D或VEGF-E中的一种或多种的结合)。在一些实施方案中，所述双特异性抗体中和KDR的活化。所述双特异性抗体可用于治疗肿瘤性疾病，包括例如实体和非实体瘤和过度增生性病症。因此，提供了中和KDR活化的方法，抑制肿瘤生长，包括抑制肿瘤相关血管生成的方法，以及治疗血管生成相关病症的方法。

还提供了含有与PDL1和KDR结合的双特异性抗体或抗体片段的试剂盒。

所述双特异性抗体不受KDR抑制的任何特定机制的限制。一种双特异性抗体所遵循的机制不一定与另一种双特异性抗体所遵循的机制相同。一些可能的机制包括防止VEGF配体与KDR细胞外结合结构域结合和防止受体二聚化或寡聚化。然而，不能排除其它机制。

所述双特异性抗体抑制KDR活化。KDR抑制的一个量度是受体的酪氨酸激酶活性降低。酪氨酸激酶抑制可以使用公知方法测定，例如测量受体的自身磷酸化水平。也可以通过对天然或合成KDR底物和KDR信号转导途径其它组分的磷酸化事件的抑制或调节来观察对KDR的抑制。例如，在ELISA测定中或在蛋白质印迹上可以使用对磷酸酪氨酸有特异性的抗体来检测磷酸化。Panek等，J.Pharmacol.Exp.Thera.,283:1433-44(1997)和Batley等，Life Sci.,62:143-50(1998)描述了对酪氨酸激酶活性的一些测定法。

也可以利用体内测定法。例如，可以通过促有丝分裂测定法，在存在和不存在抑制剂的情况下使用经受体配体刺激的细胞系来观察受体酪氨酸激酶抑制。例如，经VEGF刺激的HUVEC细胞(ATCC)可用于测定KDR抑制。另一种方法涉及使用例如注入小鼠体内的人肿瘤细胞来测试对表达VEGF的肿瘤细胞生长的抑制。参见，例如美国专利第6,365,157号(Rockwell等)。

本文公开的双特异性结合蛋白(例如双特异性抗体)可以通过本领域已知的方法制备。此类方法可涉及使用编码结合蛋白(例如双特异性抗体)或其部分的核酸。可用于制备本文公开的结合蛋白(例如双特异性抗体)的载体包括适于在HEK293细胞中表达蛋白质的瞬时表达载体，例如pBh1(Dyax)或pcDNA^TM3.4载体(Thermo FisherScientific)。适于在哺乳动物细胞中表达蛋白质的稳定表达载体，例如CHO-S(ThermoFisher Scientific)中的pCHO.1或CHO-K(Lonza)中的GS载体。本领域技术人员可参考以下出版物获得制备本文公开的结合蛋白(例如双特异性抗体)或其部分的指导：Lu D和Zhu Z.(2014)；Construction and production of an IgG-like tetravalent bispecificantibody,IgG-single-chain Fv fusion.Human Monoclonal antibodies,methods andprotocols；Humanna press；ISSN 1064-3745；Marvin J.S.,Zhu Z.(2006)Bispecificantibodies for dual-modality cancer therapy:killing two signaling cascadeswith one stone.Curr.Opin.Drug Discov.Devel.9,184-193；Lu,D.、Zhang,H.、Koo,H.等(2005)A fully human recombinant IgG-like bispecific antibody to both theepidermal growth factor receptor and the insulin-like growth factor receptorfor enhanced antitumor activity.J.Biol.Chem.280,19665–19672；Demarest S.J(2011)Emerging antibody combinations in oncology.mAbs 3,338-351；Spiess C.,Zhai Q.,Carter P.(2015)Alternative molecular formats and therapeuticapplications for bispecific antibodies.Molecular Immunology 67,95-106；Croasdale R.等(2012)Development of tetravalent IgG1 dual targeting IGF-1R-EGFR antibodies with potent tumor inhibition.Archives of Biochem.andBiophys.526,206-218。

根据Kabat和Chothia标识系统标识本文阐述的重链和轻链CDR的氨基酸序列。根据Kabat和Chothia共同系统标识前两个重链CDR，其为CDR提供了不同但重叠的位置。对许多重链和轻链的比较显示出许多CDR序列之间的显著相似性。因此，可以预料许多CDR可以在序列间混合和匹配。

本文所述的双特异性结合蛋白或双特异性抗体可具有一个或多个氨基酸取代、缺失、插入和/或添加。在某些实施方案中，所述双特异性抗体或蛋白包含以上公开的重链可变结构域之一和以上提及的轻链可变结构域之一。在某些实施方案中，所述双特异性抗体或其结合片段包含一个或多个以上公开的可变结构域，其氨基酸序列与以上公开的可变结构域序列至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同。为了减弱效应子功能，可以使对应于IgG1的234或235或两者(在CH2结构域中)的位置的亮氨酸突变为丙氨酸(例如上述LALA形式或LALA突变)。另外，可以进行突变以在两个结构域，例如两个可变结构域之间引入一个或多个二硫键，从而改善热稳定性。例如，对应于SEQ IDNO:57的位置44和248的残基可以突变为半胱氨酸以便引入二硫键。

除非另有说明或从上下文中清楚，否则如本文所用的术语“抗体”可包括全抗体及其任何抗原结合片段(即抗原结合部分)或其单链。在一个实施方案中，“抗体”是指包含通过二硫键相互连接的至少两条重(H)链和两条轻(L)链的糖蛋白，或其抗原结合片段。每条重链由重链可变区(本文中缩写为V_H)和重链恒定区组成。在某些天然存在的IgG、IgD和IgA抗体中，重链恒定区由三个结构域即CH1、CH2和CH3组成。在某些天然存在的抗体中，每条轻链由轻链可变区(本文中缩写为V_L)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个结构域即C_L组成。V_H和V_L区可进一步细分为称为互补决定区(CDR)的高变区，散布有保守性更高，称为骨架区(FR)的区域。每个V_H和V_L由三个CDR和四个骨架区(FR)组成，从氨基端到羧基端按以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，所述因子包括免疫系统的各种细胞(例如效应细胞)和经典补体系统的第一组分(Clq)。

如本文中所用，“抗体”在最广的意义上使用，并且具体包括单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)和抗体片段，只要其表现出所需的生物活性。实例包括人抗体、人源化抗体和嵌合抗体。如本文中所用，“抗体片段”可包含完整抗体的一部分，通常包括完整抗体的抗原结合区和/或可变区和/或保持FcR结合能力的抗体Fc区。抗体片段的实例包括线性抗体；单链抗体分子；和由抗体片段形成的多特异性抗体。优选地，抗体片段保留了IgG重链的整个恒定区并且包括IgG轻链。

如本文中所用，术语抗体的“抗原结合部分”或“抗原结合片段”是指抗体的保持特异性结合抗原(例如人PD-L1或KDR)的能力的一个或多个片段。术语抗体的“抗原结合部分/片段”所涵盖的结合片段的实例包括(i)Fab片段-由V_L、V_H、C_L和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab')2片段-包含在铰链区通过二硫键连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由V_H和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体单臂的V_L和V_H结构域组成的Fv片段，和(v)由V_H结构域组成的dAb片段(Ward等(1989)Nature341:544-546)。独立互补决定区(CDR)或通过合成接头连接的两个或更多个独立CDR的组合，如果能够结合抗原，则可以包含抗体的抗原结合结构域。

“人”抗体(HuMAb)是指具有可变区的抗体，其中骨架区和CDR区均源自人种系免疫球蛋白序列。此外，如果抗体含有恒定区，则恒定区也源自人种系免疫球蛋白序列。本发明的人抗体可包括并非人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机或定点诱变引入突变，或通过体内体细胞突变)。然而，如本文中所用，术语“人抗体”并非旨在包括其中源自另一哺乳动物物种(例如小鼠)种系的CDR序列已经移植到人骨架序列上的抗体。术语“人”抗体和“全人”抗体同义使用。

“人源化”抗体是指其中非人抗体(例如小鼠抗体)CDR结构域外的一些、大多数或所有氨基酸被源自人免疫球蛋白的相应氨基酸置换的抗体。在抗体人源化形式的一个实施方案中，CDR结构域外的一些、大多数或所有氨基酸已被来自人免疫球蛋白的氨基酸置换，而一个或多个CDR区内的一些、大多数或所有氨基酸不变。氨基酸的少量添加、缺失、插入、取代或修饰是容许的，只要它们不消除抗体结合特定抗原的能力。“人源化”抗体保持与原抗体类似的抗原特异性。

“嵌合抗体”是指其中可变区源自一个物种而恒定区源自另一物种的抗体，例如其中可变区源自小鼠抗体而恒定区源自人抗体的抗体。“杂合”抗体是指具有不同类型的重链和轻链，例如小鼠(亲本)重链和人源化轻链的抗体，或反之亦然。

“双特异性”是指蛋白质(例如抗体)与PD-L1和KDR结合。“双特异性抗体”是具有两个不同重链/轻链对的人工杂合抗体，其产生两个对不同抗原具有特异性的抗原结合位点。双特异性抗体可以通过多种方法产生，包括蛋白质的融合或Fab'片段的连接。参见，例如Songsivilai和Lachmann(1990)Clin.Exp.Immunol.79:315-321；Kostelny等(1992)J.Immunol.148,1547-1553。

本文描述的双特异性分子可以通过使用本领域已知的其它方法缀合结合特异性组成部分来制备。例如，双特异性分子的每个结合特异性部分可以单独产生，然后彼此缀合。多种偶合剂或交联剂可用于共价缀合。实例包括蛋白A、碳二亚胺、N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰基-硫代乙酸酯(SATA)、5,5’-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)、邻亚苯基二马来酰亚胺(oPDM)、N-琥珀酰亚胺基-3-(2)-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)和磺基琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯(磺基-SMCC)(参见例如，Karpovsky等(1984)J.Exp.Med.160:1686；Liu,MA等(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)82:8648)。其它方法包括Paulus(1985)Behring Ins.Mitt.No.78,118-132；Brennan等(1985)Science 229:81-83)和Glennie等(1987)J.Immunol.139:2367-2375)中描述的那些方法。优选的缀合剂是SATA和磺基-SMCC，两者均可从Pierce Chemical Co.(Rockford,IL)获得。抗体也可以通过两条重链C端铰链区的巯基键合而缀合。在一个特别优选的实施方案中，在缀合之前将铰链区修饰为含有奇数个巯基残基，优选一个。

或者，两个结合部分可以在相同载体中编码，并在相同宿主细胞中表达和组装。本文描述的双特异性分子可以是包含两个单链抗体的单链分子，或具有至少两条抗体链的复合物，或其组合。制备双特异性分子的方法可以在例如美国专利第5,260,203号；美国专利第5,455,030号；美国专利第4,881,175号；美国专利第5,132,405号；美国专利第5,091,513号；美国专利第5,476,786号；美国专利第5,013,653号；美国专利第5,258,498号；和美国专利第5,482,858号中找到。双特异性分子与其特定靶标的结合可以使用本领域公认的方法确认，例如本领域已知的或如本文所描述的酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、FACS分析、生物测定(例如生长抑制)或蛋白质印迹测定。

“抑制受体”意指削弱和/或灭活受体转导信号的能力，例如通过削弱和/或灭活受体的内在激酶活性。

“同一性”是指两个氨基酸或核酸序列共有的相同位置的数量或百分比，其考虑了为最佳比对两个序列而需要引入的空位的数量和每个空位的长度。

术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”在本文中可互换用于描述聚合物中氨基酸残基的排列。除稀有氨基酸和合成氨基酸类似物之外，肽、多肽或蛋白质可以由20种标准的天然存在的氨基酸组成。它们可以是任何氨基酸链，而无论长度或翻译后修饰如何(例如，糖基化或磷酸化)。

在一些情况下，可以通过选择在对保持以下方面的影响上无显著差异的取代来进行氨基酸取代：(a)取代区域中肽骨架的结构，(b)分子在靶位的电荷或疏水性；或(c)侧链体积。例如，天然存在的残基可以基于侧链性质分组；(1)疏水性氨基酸(正亮氨酸、甲硫氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸)；(2)中性亲水性氨基酸(半胱氨酸、丝氨酸和苏氨酸)；(3)酸性氨基酸(天冬氨酸和谷氨酸)；(4)碱性氨基酸(天冬酰胺、谷氨酰胺、组氨酸、赖氨酸和精氨酸)；(5)影响链取向的氨基酸(甘氨酸和脯氨酸)；和(6)芳香族氨基酸(色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸)。这些组内进行的取代可以视为保守性取代。取代的实例包括但不限于缬氨酸取代丙氨酸，赖氨酸取代精氨酸，谷氨酰胺取代天冬酰胺，谷氨酸取代天冬氨酸，丝氨酸取代半胱氨酸，天冬酰胺取代谷氨酰胺，天冬氨酸取代谷氨酸，脯氨酸取甘氨酸，精氨酸取代组氨酸，亮氨酸取代异亮氨酸，异亮氨酸取代亮氨酸，精氨酸取代赖氨酸，亮氨酸取代甲硫氨酸，亮氨酸取代苯丙氨酸，甘氨酸取代脯氨酸，苏氨酸取代丝氨酸，丝氨酸取代苏氨酸，酪氨酸取代色氨酸，苯丙氨酸取代酪氨酸，和/或亮氨酸取代缬氨酸。

用于测定序列相似性的方法和计算机程序是公开可用的，包括但不限于GCG程序包(Devereux等，Nucleic Acids Research 12:387,1984)、BLASTP、BLASTN、FASTA(Altschul等，J.Mol.Biol.215:403(1990)和ALIGN程序(2.0版)。公知的Smith Waterman算法也可用于测定相似性。BLAST程序从NCBI和其它来源公开可用(BLAST Manual,Altschul等，NCBI NLM NIH,Bethesda,Md.20894；http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/上的BLAST2.0)。在比较序列时，这些方法考虑了各种取代、缺失和其它修饰。保守性取代通常包括以下组的取代：甘氨酸、丙氨酸；缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸；天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺；丝氨酸、苏氨酸；赖氨酸、精氨酸；和苯丙氨酸、酪氨酸。

本文提供的双特异性抗体还包括通过直接突变、亲和力成熟方法、噬菌体展示或链改组改善了结合特征的那些双特异性抗体。可以通过使CDR突变并筛选具有所需特征的抗原结合位点来修饰或改善亲和力和特异性。以多种方式使CDR突变。一种方法是使单个残基或残基组合随机化，使得在其它方面相同的抗原结合位点的群体中，在特定位置发现所有二十种氨基酸。或者，通过易错PCR方法在一系列CDR残基上诱导突变(参见例如，Hawkins等，J.Mol.Biol.,226:889-896(1992))。例如，含有重链和轻链可变区基因的噬菌体展示载体可以在大肠杆菌(E.coli)的突变菌株中增殖(参见例如，Low等，J.Mol.Biol.,250:359-368(1996))。这些诱变方法说明了本领域技术人员已知的许多方法。

为了使免疫原性最小化，优选包含人恒定结构域序列的双特异性抗体。双特异性抗体可以是，可以包含或可以组合任何免疫球蛋白类别，例如IgG、IgM、IgA、IgD或IgE及其亚类的成员。可以选择抗体类别以优化效应子功能(例如，补体依赖性细胞毒性(CDC)和抗体依赖性细胞毒性(ADCC))。

双特异性结合蛋白的某些实施方案涉及使用PD-L1和KDR结合抗体片段。Fv是含完整重链和轻链可变结构域，包括全部六个高变环(CDR)的最小片段。缺乏恒定域，可变结构域非共价缔合。可以使用允许V_H和V_L结构域缔合形成抗原结合位点的接头将重链和轻链连接成单个多肽链(“单链Fv”或“scFv”)。在一个实施方案中，所述接头为(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)₃。由于scFv片段缺乏全抗体的恒定结构域，所以比全抗体小得多。scFv片段也没有正常重链恒定域与其它生物分子的相互作用，这在某些实施方案中可能是不需要的。

含V_H、V_L和任选C_L、C_H1或其它恒定结构域的抗体片段也可用于双特异性结合蛋白中。由木瓜蛋白酶消化产生的抗体单价片段称为Fab并且缺少重链铰链区。由胃蛋白酶消化产生的，称为F(ab')₂的片段保留了重链铰链并且是二价的。此类片段也可以重组产生。许多其它有用的抗原结合抗体片段是本领域已知的，包括但不限于双链抗体、三链抗体、单结构域抗体及其它单价和多价形式。

在一个实施方案中，通过表面等离子体共振测量，双特异性结合蛋白例如双特异性抗体的PD-L1结合区的缔合速率常数(Kon)为至少约10²M^-1s^-1；至少约10³M^-1s^-1；至少约10⁴M^-1s^-1；至少约10⁵M^-1s^-1；或至少约10⁶M^-1s^-1。在一个实施方案中，通过表面等离子体共振测量，PD-L1结合区的缔合速率常数(Kon)介于10²M^-1s^-1和10³M^-1s^-1之间；介于10³M^-1s^-1和10⁴M^-1s^-1之间；介于10⁴M^-1s^-1和10⁵M^-1s^-1之间；或者介于10⁵M^-1s^-1和10⁶M^-1s^-1之间。

在一个实施方案中，通过表面等离子体共振测量，双特异性结合蛋白例如双特异性抗体的KDR结合区的缔合速率常数(Kon)为至少约10²M^-1s^-1；至少约10³M^-1s^-1；至少约10⁴M^-1s^-1；至少约10⁵M^-1s^-1；或至少约10⁶M^-1s^-1。在一个实施方案中，通过表面等离子体共振测量，KDR结合区的缔合速率常数(Kon)介于10²M^-1s^-1和10³M^-1s^-1之间；介于10³M^-1s^-1和10⁴M^-1s^-1之间；介于10⁴M^-1s^-1和10⁵M^-1s^-1之间；或者介于10⁵M^-1s^-1和10⁶M^-1s^-1之间。

在一个实施方案中，通过表面等离子体共振测量，双特异性结合蛋白例如双特异性抗体的PD-L1结合区的解离速率常数(Koff)为至多约10^-3s^-1；至多约10^-4s^-1；至多约10^-5s^-1；或至多约10^-6s^-1。在一个实施方案中，通过表面等离子体共振测量，PD-L1结合区的解离速率常数(Koff)为10^-3s^-1至10^-4s^-1；10^-4s^-1至10^-5s^-1；或10^-5s^-1至10^-6s^-1。

在一个实施方案中，通过表面等离子体共振测量，双特异性结合蛋白例如双特异性抗体的KDR结合区的解离速率常数(Koff)为至多约10^-3s^-1；至多约10^-4s^-1；至多约10^-5s^-1；或至多约10^-6s^-1。在一个实施方案中，通过表面等离子体共振测量，KDR结合区的解离速率常数(Koff)为10^-3s^-1至10^-4s^-1；10^-4s^-1至10^-5s^-1；或10^-5s^-1至10^-6s^-1。

在一个实施方案中，双特异性结合蛋白例如双特异性抗体的PD-L1结合区的解离常数(K_D)为至多约10^-7M；至多约10^-8M；至多约10^-9M；至多约10^-10M；至多约10^-11M；至多约10^-12M；或至多10^-13M。在一个实施方案中，双特异性结合蛋白例如双特异性抗体的PD-L1结合区与其靶标的解离常数(K_D)为10^-7M至10^-8M；10^-8M至10^-9M；10^-9M至10^-10M；10^-10M至10^-11M；10^-11M至10^-12M；或10^-12M至10^-13M。

在一个实施方案中，双特异性结合蛋白例如双特异性抗体的KDR结合区的解离常数(K_D)为至多约10^-7M；至多约10^-8M；至多约10^-9M；至多约10^-10M；至多约10^-11M；至多约10^{- 12}M；或至多10^-13M。在一个实施方案中，双特异性结合蛋白例如双特异性抗体的KDR结合区与其靶标的解离常数(K_D)为10^-7M至10^-8M；10^-8M至10^-9M；10^-9M至10^-10M；10^-10M至10^-11M；10^-11M至10^-12M；或10^-12M至10^-13M。

本文描述的双特异性结合蛋白可以是还包含显像剂、治疗剂或细胞毒性剂的缀合物。在一个实施方案中，显像剂为放射性标记、酶、荧光标记、发光标记、生物发光标记、磁性标记或生物素。在另一个实施方案中，所述放射性标记为：³H、¹⁴C、³⁵S、⁹⁰Y、⁹⁹Tc、¹¹¹In、¹²⁵I、¹³¹I、¹⁷⁷Lu或¹⁵³Sm。再一个实施方案中，所述治疗剂或细胞毒性剂为抗代谢物、烷化剂、抗生素、生长因子、细胞因子(例如免疫刺激细胞因子)、抗血管生成剂、抗有丝分裂剂、蒽环类、毒素或凋亡剂。如以下所讨论的，免疫刺激细胞因子特别重要。

提供了结合人PD-L1以抑制免疫抑制并且还结合人KDR以抑制血管生成的分子。在一个实施方案中，此类分子组合了第一抗体结合人PD-L1的PD-L1结合结构域与第二抗体结合人KDR的KDR结合结构域。

所述分子的PD-L1结合部分可以是抗体的抗原结合结构域，例如重链和轻链可变结构域对。本文提供了合适的抗体重链和轻链可变结构域及包含它们的抗体。双特异性结合蛋白的PD-L1结合部分可以是结合PD-L1并阻断免疫抑制的任何药剂。这些包括抗PD-L1抗体和片段，不限于本文公开的那些抗体，以及源自人PD1的肽和蛋白质(人PD-L1天然配体)。如本文所公开的，PD-L1结合区与结合人KDR的区域连接。

因此，在某些实施方案中，提供了杂合分子，其包含与人PD-L1结合并阻断与人PD1结合的区域，以及与人KDR结合并阻断与人KDR结合的区域。PD-L1和KDR结合区可以通过接头连接为一个多肽。因此，提供了与人KDR结合区连接的人PD-L1结合区。

本发明的另一方面提供了编码上述抗体或其链的核酸分子。核酸可以存在于全细胞、细胞裂解物中或部分纯化或基本上纯的形式中。当通过标准技术，包括碱/SDS处理、CsCl条带化、柱色谱法法、琼脂糖凝胶电泳和本领域公知的其它技术，从其它细胞组分或其它污染物(例如其它细胞核酸或蛋白质)中纯化时，核酸被“分离”或“致使为基本上纯的”。参见，F.Ausubel等编辑(1987)Current Protocols in Molecular Biology,GreenePublishing and Wiley Interscience,New York。本发明的核酸可以是例如DNA或RNA，并且可以含或可以不含内含子序列。在一个优选实施方案中，所述核酸为cDNA分子。

可以使用标准分子生物学技术获得本发明的核酸。对于杂交瘤(例如，由携带人免疫球蛋白基因的转基因小鼠制备的杂交瘤)表达的抗体，可以通过标准PCR扩增或cDNA克隆技术获得编码由杂交瘤产生的抗体的轻链和重链的cDNA。对于由免疫球蛋白基因文库(例如，使用噬菌体展示技术)获得的抗体，可以从该文库中回收编码抗体的核酸。所述核酸和含有所述核酸的载体可用于表达上述抗体或其链。

如本文中所用，术语“载体”意指能够转运与之连接的另一核酸的核酸分子。一种类型的载体为“质粒”，是指其中可以连接附加DNA区段的环状双链DNA环。另一种类型的载体为病毒载体，其中附加DNA区段可以连接到病毒基因组中。某些载体能够在将其引入其中的宿主细胞(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和哺乳动物附加型载体)中自主复制。其它载体(例如，非附加型哺乳动物载体)可以在引入宿主细胞后整合到宿主细胞基因组中，从而连同宿主基因组一起复制。而且，某些载体能够指导与之操作性连接的基因的表达。此类载体在本文中称为“重组表达载体”(或简称为“表达载体”)。一般而言，在重组DNA技术中有实用性的表达载体常常呈质粒形式。在本说明书中，“质粒”和“载体”可互换使用，因为质粒是最常用的载体形式。然而，还包括其它形式的起到相同功能的表达载体，例如病毒载体(例如，复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。

如本文中所用，术语“重组宿主细胞”(或简称“宿主细胞”)意指包含非天然存在于细胞中的核酸的细胞，并且可以是已向其中引入了重组表达载体的细胞。应理解，此类术语不仅意指特定受试者细胞，而且意指此类细胞的后代。因为由于突变或环境影响在下一代中可能出现某些修饰，所以事实上此类后代可能与亲本细胞不同，但仍包括在本文所用的术语“宿主细胞”的范围内。

应理解，在哺乳动物中用于预防或治疗目的时，双特异性结合蛋白通常将以另外包含至少一种药学上可接受的载体的组合物形式施用。合适的药学上可接受的载体包括，例如水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、右旋糖、甘油、蔗糖、聚山梨醇酯、乙醇等中的一种或多种及其组合。药学上可接受的载体还可包含少量辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、防腐剂或缓冲剂，其增强双特异性结合蛋白的保质期或有效性。

在本文描述的方法中，将治疗有效量的双特异性结合蛋白例如双特异性抗体施用给有需要的哺乳动物。如本文中所用，术语“施用”意指通过可以实现所寻求的结果的任何方法将双特异性结合蛋白例如双特异性抗体递送给哺乳动物。施用可以是，例如静脉内或肌肉内施用。虽然双特异性结合蛋白例如双特异性抗体对人类施用特别有用，但是也可以施用给其它哺乳动物。如本文中所用的术语“哺乳动物”旨在包括但不限于人、实验室动物、家养宠物和家畜。“治疗有效量”意指双特异性结合蛋白例如双特异性抗体，当施用给哺乳动物时，有效产生所需疗效的量。

双特异性结合蛋白例如双特异性抗体可用于抑制肿瘤和其它肿瘤性疾病，以及治疗与免疫抑制相关的其它病理状况。可以治疗的肿瘤包括原发性肿瘤、转移性肿瘤和难治性肿瘤。难治性肿瘤包括对于用单独的化学治疗剂、单独的抗体、单独的放射或其组合进行的治疗无反应或有抗性的肿瘤。难治性肿瘤还涵盖似乎通过用此类药剂治疗而被抑制，但在停止治疗后长达五年，有时长达十年或更长时间复发的肿瘤。双特异性结合蛋白例如双特异性抗体可有效治疗血管化肿瘤和未血管化或基本上尚未血管化的肿瘤。

可以治疗的实体瘤的实例包括乳腺癌、肺癌、结直肠癌、胰腺癌、神经胶质瘤和淋巴瘤。此类肿瘤的一些实例包括表皮样瘤、鳞状肿瘤，如头颈部肿瘤、结直肠肿瘤、前列腺肿瘤、乳腺肿瘤、肺部肿瘤(包括小细胞和非小细胞肺肿瘤)、胰腺肿瘤、甲状腺肿瘤、卵巢肿瘤和肝脏肿瘤。其它实例包括卡波西氏肉瘤(Kaposi's sarcoma)、CNS赘生物、神经母细胞瘤、毛细血管成血管细胞瘤、脑膜瘤和脑转移瘤、黑素瘤、胃肠癌和肾癌及肉瘤、横纹肌肉瘤、成胶质细胞瘤(优选多形性成胶质细胞瘤)和平滑肌肉瘤。双特异性结合蛋白例如双特异性抗体对其有效的血管化皮肤癌的实例包括可以通过抑制恶性角化细胞如人恶性角化细胞的生长来治疗的鳞状细胞癌、基底细胞癌和皮肤癌。

非实体肿瘤的实例包括对细胞因子无反应的白血病、多发性骨髓瘤和淋巴瘤。白血病的一些实例包括急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、红细胞性白血病或单核细胞性白血病。淋巴瘤的一些实例包括霍奇金(Hodgkin's)和非霍奇金(non-Hodgkin's)淋巴瘤。

双特异性结合蛋白例如双特异性抗体也用于治疗病毒感染。T细胞上的PD-1表达与HIV和HCV感染患者中的病毒载量相关联，并且PD-1表达已被鉴定为病毒特异性CD8⁺T细胞耗竭的标志。例如，PD-1⁺CD8⁺T细胞显示出受损的效应功能和PD-1相关的T细胞耗竭，这可以通过阻断PD-1/PD-L1相互作用而恢复。这导致病毒特异性CD8⁺T细胞介导的免疫性恢复，表明使用拮抗性抗体中断PD-1信号传导恢复了T细胞效应子功能。基于PD-1/PD-L1阻断的免疫疗法不仅导致肿瘤抗原的T细胞耐受性破坏，而且还提供了重新激活病毒特异性效应T细胞和根除慢性病毒感染中的病原体的策略。因此，本发明的抗体和杂合蛋白可用于治疗慢性病毒感染，包括但不限于HCV和HIV，及淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)。

双特异性结合蛋白例如双特异性抗体可以有利地与第二药剂一起施用给有需要的患者。例如，在一些实施方案中，将双特异性结合蛋白例如双特异性抗体与抗肿瘤剂一起施用给受试者。在一些实施方案中，将双特异性结合蛋白例如双特异性抗体与血管生成抑制剂一起施用给受试者。在一些实施方案中，将双特异性结合蛋白例如双特异性抗体与抗炎剂或免疫抑制剂一起施用。

抗肿瘤剂包括细胞毒性化学治疗剂、靶向小分子和生物分子，以及辐射。化学治疗剂的非限制性实例包括顺铂(cisplatin)、达卡巴嗪(dacarbazine)(DTIC)、放线菌素D(dactinomycin)、伊立替康(irinotecan)、二氯甲基二乙胺(氮芥)、链佐星(streptozocin)、环磷酰胺、卡莫司汀(carmustine)(BCNU)、洛莫司汀(lomustine)(CCNU)、多柔比星(doxorubicin)(阿霉素(adriamycin))、柔红霉素(daunorubicin)、丙卡巴肼(procarbazine)、丝裂霉素(mitomycin)、阿糖胞苷(cytarabine)、依托泊苷(etoposide)、甲氨蝶呤(methotrexate)、5-氟尿嘧啶、长春碱(vinblastine)、长春新碱(vincristine)、博来霉素(bleomycin)、紫杉醇(paclitaxel)(他克唑，taxol)、多西他赛(docetaxel)(泰索帝，taxotere)、阿地白介素(aldesleukin)、天冬酰胺酶、白消安(busulfan)、卡铂(carboplatin)、克拉屈滨(cladribine)、达卡巴嗪、氟尿苷(floxuridine)、氟达拉滨(fludarabine)、羟基脲、异环磷酰胺、干扰素α、亮丙瑞林(leuprolide)、甲地孕酮(megestrol)、美法仑(melphalan)、巯基嘌呤、普卡霉素(plicamycin)、米托坦(mitotane)、培门冬酶(pegaspargase)、喷司他丁(pentostatin)、哌泊溴烷(pipobroman)、普卡霉素(plicamycin)、链佐星、他莫昔芬(tamoxifen)、替尼泊苷(teniposide)、睾内酯(testolactone)、硫鸟嘌呤、塞替派(thiotepa)、尿嘧啶氮芥、长春瑞滨(vinorelbine)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、他克唑及其组合。

靶向小分子和生物分子包括但不限于信号转导途径组分的抑制剂，例如酪氨酸激酶调节剂和受体酪氨酸激酶抑制剂，以及与肿瘤特异性抗原结合的药剂。肿瘤发生所涉及的生长因子受体的非限制性实例为血小板源生长因子(PDGFR)、胰岛素样生长因子(IGFR)、神经生长因子(NGFR)和成纤维细胞生长因子(FGFR)的受体，及表皮生长因子受体家族的受体，包括EGFR(erbB1)、HER2(erbB2)、erbB3和erbB4。

EGFR拮抗剂包括与EGFR或EGFR配体结合，并抑制配体结合和/或受体活化的抗体。例如，该药剂可以阻断受体二聚体与其它EGFR家族成员的异二聚体形成。EGFR的配体包括例如EGF、TGF-α双调节蛋白、结合肝素的EGF(HB-EGF)和β调节蛋白(betaregullulin)。EGFR拮抗剂可以外部结合EGFR胞外部分，这可以抑制或不抑制配体的结合，或内部结合酪氨酸激酶结构域。EGFR拮抗剂还包括例如通过抑制EGFR信号转导途径的组分的功能，抑制EGFR依赖性信号转导的药剂。结合EGFR的EGFR拮抗剂的实例包括但不限于生物分子例如对EGFR有特异性的抗体(及其功能等效物)，和小分子例如直接作用于EGFR的细胞质结构域的合成激酶抑制剂。

小分子和生物抑制剂包括表皮生长因子受体(EGFR)抑制剂，包括吉非替尼(gefitinib)、埃罗替尼(erlotinib)和西妥昔单抗(cetuximab)，HER2抑制剂(例如曲妥珠单抗(trastuzumab)、妥珠单抗-美坦新(trastuzumabemtansine)(曲妥单抗-DM1；T-DM1)和帕妥珠单抗(pertuzumab))、抗VEGF抗体和片段(例如贝伐单抗(bevacizumab))、抑制CD20的抗体(例如利妥昔单抗(rituximab)、替伊莫单抗(ibritumomab))、抗VEGFR抗体(例如雷莫芦单抗(ramucirumab)(IMC-1121B)、IMC-1C11和CDP791)、抗PDGFR抗体和伊马替尼(imatinib)。小分子激酶抑制剂可以对特定酪氨酸激酶具有特异性，或者是两种或更多种激酶的抑制剂。例如，化合物N-(3,4-二氯-2-氟苯基)-7-({[(3aR，6aS)-2-甲基八氢环戊[c]吡咯-5-基]甲基}氧基)-6-(甲氧基)喹唑啉-4-胺(也称为XL647、EXEL-7647和KD-019)是几种受体酪氨酸激酶(RTK)，包括EGFR、EphB4、KDR(VEGFR)、Flt4(VEGFR3)和ErbB2的体外抑制剂，也是导致肿瘤对某些TKI无反应的途径中所涉及的SRC激酶的抑制剂。在本发明的一个实施方案中，对有需要的受试者的治疗包括施用式I的rho-激酶抑制剂和施用KD-019。

达沙替尼(Dasatinib)(BMS-354825；Bristol-Myers Squibb,New York)是另一种口服生物可利用的ATP位点竞争性Src抑制剂。达沙替尼还靶向Bcr-Abl(FDA批准用于慢性骨髓性白血病(CML)或费城染色体阳性(Ph+)急性淋巴细胞性白血病(ALL)患者)以及c-Kit、PDGFR、c-FMS、EphA2和SFK。另外两种Src和Bcr-Abl的口服酪氨酸激酶抑制剂是博舒替尼(bosutinib)(SKI-606)和塞卡替尼(saracatinib)(AZD0530)。

在一个实施方案中，双特异性结合蛋白例如双特异性抗体与抗病毒剂组合用于治疗慢性病毒感染。例如，对于HCV，可以使用以下药剂。HCV蛋白酶抑制剂包括但不限于波西普韦(boceprevir)、特拉匹韦(telaprevir)(VX-950)、ITMN-191、SCH-900518、TMC-435、BI-201335、MK-7009、VX-500、VX-813、BMS790052、BMS650032和VBY376。HCV非结构蛋白4B(NS4B)抑制剂包括但不限于克立咪唑(clemizole)和其它NS4B-RNA结合抑制剂，包括但不限于苯并咪唑RBI(B-RBI)和吲唑RBI(I-RBI)。HCV非结构蛋白5A(NS5A)抑制剂包括但不限于BMS-790052、A-689、A-831、EDP239、GS5885和PP1461。HCV聚合酶(NS5B)抑制剂包括但不限于核苷类似物(例如伐洛他滨(valopicitabine)、R1479、R1626、R7128)、核苷酸类似物(例如IDX184、PSI-7851、PSI-7977和非核苷类似物(例如非利布韦(filibuvir)、HCV-796、VCH-759、VCH-916、ANA598、VCH-222(VX-222)、BI-207127、MK-3281、ABT-072、ABT-333、GS9190、BMS791325)。此外，可以使用利巴韦林(ribavirin)或利巴韦林类似物如他立韦林(Taribavirin)(韦拉米啶(viramidine)；ICN3142)、咪唑立宾(Mizoribine)、美泊地布(Merimepodib)(VX-497)、霉酚酸酯(Mycophenolatemofetil)和霉酚酸(Mycophenolate)。

当本发明的双特异性抗体与第二药剂一起施用时，第一和第二药剂可以依次或同时施用。每种药剂可以单剂量或多剂量施用，并且该剂量可以按任何时间表施用，包括但不限于每日两次、每日一次、每周一次、每两周一次和每月一次。

本发明还包括双特异性抗体的辅助施用。辅助施用意指除了已经施用以治疗疾病或疾病症状的第一药剂外，还向患者施用第二药剂。在一些实施方案中，辅助施用包括向患者施用第二药剂，其中第一药剂的施用未治疗或未充分治疗所述疾病或疾病症状。在其它实施方案中，辅助施用包括将第二药剂施用给通过施用第一药剂有效治疗疾病的患者。

在某些实施方案中，向受试者施用一个剂量的双特异性结合蛋白例如双特异性抗体，每天一次、每隔一天一次、每几天一次、每三天一次、每周一次、每周两次、每周三次或每两周一次。在其它实施方案中，向受试者施用两个、三个或四个剂量的双特异性结合蛋白例如双特异性抗体，每天一次、每几天一次、每三天一次、每周一次或每两周一次。在一些实施方案中，施用一个剂量的双特异性结合蛋白例如双特异性抗体2天、3天、5天、7天、14天或21天。在某些实施方案中，施用一个剂量的双特异性结合蛋白例如双特异性抗体1个月、1.5个月、2个月、2.5个月、3个月、4个月、5个月、6个月或更长时间。

施用方法包括但不限于肠胃外、皮内、玻璃体内、肌肉内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜外、口服、舌下、鼻内、脑内、阴道内、透皮、透粘膜、直肠、通过吸入或局部，特别是耳、鼻、眼或皮肤施用。施用模式由从业者自行决定。在大多数情况下，施用将导致双特异性结合蛋白例如双特异性抗体释放到血流中。对于眼病的治疗，优选在玻璃体内施用双特异性结合蛋白例如双特异性抗体。

在特定实施方案中，可能需要局部施用双特异性结合蛋白例如双特异性抗体。这可以通过以下方式实现，例如但不限于通过局部输注，局部施加，通过注射，借助于导管或借助于植入物，所述植入物为多孔、无孔或者凝胶状材料，包括膜，如硅橡胶膜或纤维。在此类情况下，施用可以选择性地靶向局部组织，双特异性结合蛋白例如双特异性抗体基本上不会释放到血流中。

也可以采用肺部施用，例如通过使用吸入器或雾化器，和用雾化剂配制，或通过在碳氟化合物或合成肺表面活性剂中灌注。在某些实施方案中，用传统粘合剂和媒介物如甘油三酯将双特异性结合蛋白例如双特异性抗体配制成栓剂。

在另一个实施方案中，双特异性结合蛋白例如双特异性抗体在囊泡中，特别是在脂质体中递送(参见Langer,1990,Science 249:1527-1533；Treat等，在Liposomes in theTherapy of Infectious Disease and Bacterial infection中，Lopez-Berestein和Fidler(编辑)，Liss,New York，第353-365页(1989)；Lopez Berestein，同上，第317-327页；一般来说同上)。

在另一个实施方案中，双特异性结合蛋白例如双特异性抗体在控释系统中递送(参见，例如Goodson，在Medical Applications of Controlled Release中，同上，第2卷，第115-138页(1984))。可以使用在Langer,1990,Science 249:1527-1533的综述中讨论的控释系统的实例。在一个实施方案中，可以使用泵(参见Langer，同上；Sefton,1987,CRCCrit.Ref.Biomed.Eng.14:201；Buchwald等，1980,Surgery 88:507；Saudek等，1989,N.Engl.J.Med.321:574)。在另一个实施方案中，可以使用聚合物材料(参见MedicalApplications of Controlled Release,Langer和Wise(编辑),CRC Pres.,Boca Raton,Florida(1974)；Controlled Drug Bioavailability,Drug Product Design andPerformance,Smolen和Ball(编辑),Wiley,New York(1984)；Ranger和Peppas,1983,J.Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.23:61；还请参见Levy等，1985,Science 228:190；During等，1989,Ann.Neurol.25:351；Howard等，1989,J.Neurosurg.71:105)。

提供上述施用时间表仅仅是为了说明的目的，不应视为限制。本领域的普通技术人员将容易理解哪些剂量和给药时间表是合适的。

应理解和预计到，本领域技术人员可以对本文公开的原理进行变化，并且其意图是此类修改包括在本公开的范围内。

在整个申请中，引用了各种出版物。这些出版物通过引用整体并入本申请中，以更全面地描述本公开所属领域的现状。以下实施例进一步说明了本公开，但不应解释为以任何方式限制本公开的范围。

美国临时专利申请序列号61/710,420；62/061,097；61/927,907以及国际专利申请号PCT/US2013/063754；PCT/US2015/011657；和PCT/US2015/054569通过引用整体并入本文。

实施例

实施例1针对VEGFR2和PDL1的双特异性抗体的表达和物理表征

该实施例描述了HEK293中针对VEGFR2和PDL1的双特异性抗体的瞬时表达，并通过蛋白A纯化；聚集度分析(通过SEC-UPLC)、血清稳定性试验和热稳定性试验(通过使用DSC测量Tm)。

介绍

通过直接从DyaxFab310噬菌粒文库淘选固定的VEGFR2，分离抗体λR3B1(针对VEGFR2)。通过将轻链库与λR3B1的重链配对，构建轻链改组文库。在对人和鼠VEGFR2进行筛选后，分离出可与人和鼠VEGFR2两者结合的B1C4。通过软突变方法对其轻链CDR3和重链CDR1和CDR2进行进一步修饰，其中仅10％的残基突变为另19种氨基酸(不包括半胱氨酸)。通过在非常严格的条件下筛选软突变文库来鉴定B1C4A7，即一种亲和力更高且更稳定的抗体。

还通过对来自Dyax Fab 310噬菌粒文库的PDL1进行淘选来鉴定抗PDL1抗体tccR3D7和tccR3A11。从tccR3D7_HCDR1文库中分离出具有较高亲和力和较低氧化敏感性的抗体D7A8，其中位于tccR3D7重链CDR1中的三个甲硫氨酸氨基酸随机突变。

为了构建BsAb，首先使抗PDL1抗体D7A8(或A11)重新格式化为VH-(SG₄)₅-VL方向的单链可变片段(scFv)；然后使scFv附于通过接头连接的常规抗体B1A1或B1C4A7(针对VEGFR2)的c-端(图1)。为了削弱效应子功能，使B1A1或B1C4A7位置234和235(IgG1-CH2结构域)中的亮氨酸突变为丙氨酸。

将双特异性抗体(A1-A8)和(A7-A8)的基因插入哺乳动物表达载体pBh1中，并在HEK293细胞系中瞬时表达。收获上清液并负载到蛋白A柱中以纯化双特异性抗体。

通过使用SDS-PAGE、SEC-UPLC和DSC来分析双特异性抗体(A1-A8)和(A7-A8)的纯度和稳定性。蛋白质印迹后，通过在小鼠血清中孵育BsAb来检查这两种双特异性抗体的血清稳定性。

材料和方法

待表达和试验的单特异性和双特异性抗体

表达和纯化

用于表达、纯化和SDS-PAGE的材料

用于表达、纯化和SDS-PAGE的材料列于下表中。

用于表达、纯化和SDS-PAGE的方法

根据制造商说明，通过使用Polyjet转染试剂将携带双特异性抗体的哺乳动物表达载体转染至游离型HEK293细胞中。收获6天培养物并将过滤的上清液负载到与AKTAxpress蛋白质纯化系统连接的亲和柱蛋白A上。将纯化的抗体缓冲液更换为PBS并过滤。通过在Nanodrop光度计中测量280nm的吸光度并通过使用理论系数计算获得抗体浓度。

在还原和非还原条件下，通过添加含或不含还原剂的负载染料制备抗体样品。将样品管在100下加热10分钟，将还原和非还原样品连同分子量标准品一起负载到4–12％NOVEX bis-tris凝胶上。凝胶在200v恒定电压下电泳约50分钟。然后用蛋白质染料为凝胶染色并在QH2O中脱色，直至观察到蛋白质条带。(图19)示出了凝胶图片

UPLC和DSC

用于UPLC和DSC的材料

用于UPLC和DSC的方法

用于UPLC的方法

根据制造商说明对机器进行编程。首先将样品负载到UPLC小体积样品瓶中，负载10μg样品并注入BEH200SEC柱中。在pH＝7.4的PBS缓冲液中以0.4ml/分钟的流速分离抗体10分钟，并在280nM波长下通过TDA检测从柱上洗脱的抗体。对每个样品进行至少两次注射。用Waters提供的软件Empower 3分析每个峰的面积百分比。

用于DSC的方法

将浓度为1mg/ml的样品负载到96深孔板中，然后使用Nano DSC进行DSC分析。进行几次缓冲液(PBS)注射以获得足够的样品空白。在样品电泳之前实施15分钟的预扫描以确保准确的起始温度。通过从25至100监测，实现60/小时的温度斜升。在分析之前从每种抗体中减去仅为缓冲液样品的热谱图，并且在去卷积之后使用NanoDSC软件计算Tm。

小鼠血清中的稳定性

用于小鼠血清稳定性测定的材料

用于小鼠血清稳定性测定的方法

将各200ng的双特异性抗体或单特异性抗体添加到90％小鼠血清中，并在37下孵育5天。将小鼠血清中经热处理的抗体在还原条件下负载到4-12％Bis-Tris蛋白质凝胶中并进行电泳。根据制造商说明将分离的蛋白质转移到PVDF膜上。用3％PBS乳液封闭后，将膜与1/2000的HRP-抗人IgG(H+L)抗体一起孵育。用PBST洗涤三次后，首先使膜与ECL反应。在ImageQuant LAS4000中在不同曝光时间点拍摄图片以获得高质量图像。

结果

表达和纯化

将携带双特异性抗体的哺乳动物表达载体转染至游离型HEK293细胞。通过蛋白A纯化双特异性抗体，并将缓冲液更换为PBS。通过Nanodrop光度计在280nm下测量并通过使用理论系数计算抗体浓度。结果示于下表中。

结果表明，双特异性抗体A1-A8和A7-A8可以在HEK-293细胞中瞬时表达。在蛋白A纯化和缓冲液交换后第6天收获的1L上清液中回收超过10mg的BsAb(A1-A8)和BsAb(A7-A8)。

SDS-PAGE分析

在还原或非还原条件下将各5μg的抗体负载到4-12％NuPAGE凝胶中。用蛋白质染料染色并用H₂O脱色后拍摄凝胶图片。结果示于图19中。结果表明通过SDS-PAGE估计，两种BsAb的纯度均超过95％。

SEC-UPLC分析

SEC-UPLC分析使用以下方法进行：柱：ACQUITY UPLC BEH200SEC，1.7μm，4.6x150mm；UPLC系统：带TDA检测器的waters ACQUITY UPLC；洗脱剂：PBS，pH＝7.4；流速：0.4mL/分钟；注射液：10μg；波长：280nm；每条曲线列出了主峰的百分比。对每个样品进行两次注射。UPLC系统中经蛋白A纯化的双特异性抗体的尺寸排阻色谱图(280nm下的紫外线轨迹)的结果示于图20中。表中汇总了峰面积相对于保留时间的百分比。表中还列出了两次测量的平均峰面积。

发现通过SEC-HPLC分析对于BsAb(A1-A8)和BsAb(A7-A8)分别检测到低于2％和1％的聚集度。还发现，如果浓度较高，则BsAb(A7-A8)的聚集度增加，但仍然低于3％。

通过DSC测量Tm

图21和下表中显示了在PBS缓冲液中对双特异性抗体的DSC扫描结果。

表：来自DSC扫描的双特异性抗体的解链温度

结果表明，通过DSC扫描测量的BsAb(A7-A8)-LALA的Tm1约为约60，低于亲本抗体B1C4A7和D7A8-LALA的最低Tm1(两者均为约69)。BsAb(A7-A8)的最低Tm1由scFvD7A8产生，正如报道的那样scFv抗体片段不如IgG稳定。scFv的进一步工程化，例如在D7A8的重链和轻链可变结构域之间使用更长的接头，或在两个结构域之间添加二硫键，可以提高其热稳定性。

血清稳定性

图22中显示了在小鼠血清中于37处理5天的双特异性抗体的蛋白质印迹结果。如图所示，在还原条件下在37下处理BsAb(A1-A8)-LALA和BsAb(A7-A8)-LALA5天后，没有观察到短的重链和轻链条带。因此，结果表明BsAb(A1-A8)-LALA和BsAb(A7-A8)-LALA两者在37下于小鼠血清中稳定长达5天。

实施例2双特异性抗体(A7-A8)的体外表征

该实施例描述了双特异性抗体A7-A8的体外表征以及与其亲本抗体B1C4A7(针对VEGFR2)和dsD7A8-LALA(针对PDL1)的效力比较。

介绍

前一实施例报道称，通过在HEK293中瞬时表达获得并通过蛋白A纯化的纯双特异性抗体A7-A8，通过SEC-UPLC分析检测到低于1％的较高分子量聚集。BsAb(A7-A8)在37小鼠血清中也稳定长达5天。

单独与其亲本抗体B1C4A7(针对VEGFR2)和dsD7A8-LALA(针对PDL1)一起，研究了可以与人和小鼠物种交叉反应的双特异性抗体A7-A8与可溶性和细胞表达的VEGFR2和PDL1(人和小鼠物种)的结合能力，抑制配体(VEGF和PDL1)与各自受体(VEGFR2和PD1)的结合，阻断VEGFR2/下游分子磷酸化和刺激细胞因子IL2和INFγ分泌。

材料和方法

待试验抗体

剂量反应结合ELISA

用于剂量反应结合ELISA的材料

用于剂量反应结合ELISA的方法

按1μg/ml将抗原VEGFR2-Fc(人和小鼠)和PDL1-Fc(人和小鼠)涂到Immulon 2HB平板上，在4下过夜。用3％PBSM封闭平板。将连续稀释的双特异性和单特异性抗体添加到封闭的平板中，并在室温下孵育约1小时。洗涤平板后，添加HRP缀合的抗人IgG Fab特异性(HRP抗hFab)抗体(在3％PBSM中1/5000稀释)。再次洗涤平板，然后添加TMB反应缓冲液以显色。用1N H₂SO₄终止反应后，用酶标仪在OD450下读板。

剂量反应竞争ELISA

用于剂量反应竞争ELISA的材料

用于剂量反应竞争ELISA的方法

根据制造商的说明书，用生物素标记人和小鼠PDL1-Fc。

按1μg/ml将配体VEGF(人和小鼠)和PDL1(人和小鼠)涂到Immulon2HB平板上，在4下过夜。用3％PBSM封闭平板。将连续稀释的抗体与人或小鼠VEGFR2(终浓度为0.5μg/ml)或与生物素标记的人和小鼠PDL1在PBSM封闭的96孔圆底板中混合，并在室温下孵育1小时。将抗体-受体混合物分别转移到封闭的涂有配体的平板上，并在室温下再孵育1小时。洗涤平板后，分别添加HRP-抗人IgGFc特异性抗体(对于VEGF-VEGFR2)或链霉亲和素-HRP(对于PD1-PDL1)(在3％PBSM中1/5000稀释)。再次洗涤平板，然后添加TMB反应缓冲液以显色。用1NH₂SO₄终止反应后，用酶标仪在OD450下读板。

通过Biacore进行动力学分析

Biacore材料

名称	公司	型号/产品目录号
			Biacore	GE	T200
BiaEvaluation软件V1	GE	T200
			重组人VEGFR2	R&Dsystems	357-KD-050
S系列CM5芯片	GE	BR1005-30
			HBSEP	GE	BR1006-69

Biacore方法

表面准备

在Biacore T200仪器(GE Healthcare)中使用表面等离子体共振(SPR)评价结合亲和力。使CM5芯片在10μl/ml的电泳缓冲液HBSEP(电泳缓冲液)中平衡。用1:1 NHS/EDC注射液激活CM5芯片的两个流动室5分钟。用5μg/ml稀释于pH5的10mM乙酸钠缓冲液中的hVEGFR2固定第二流动室，以达到40-100RU的固定化蛋白质。随后注射5分钟的乙醇胺来封闭表面。

样品电泳

在HBSEP电泳缓冲液中以30μl/分钟进行电泳。将样品在电泳缓冲液中连续稀释，浓度范围为1.5-100nM。将样品注射到两个流动室上，缔合时间为3分钟而解离时间为10分钟。每次结合循环后注射30秒的20mMHCL进行再生。获得每个浓度的传感图，并使用Bia-evaluation软件，减去空白流动室，将导出曲线拟合为1:1 Langmuir结合模型。

交叉结合ELISA

用于交叉结合ELISA的材料

用于交叉结合ELISA的方法

根据制造商的说明书，用来自Thermo-Fisher的生物素标记试剂盒标记人PDL1-Fc。

按1μg/ml将人VEGFR2涂到Immulon 2HB平板上，在4下过夜。用3％PBSM封闭平板。将1nM双特异性抗体或单特异性抗体与生物素标记的hPDL1在PBSM封闭的圆形96孔板中混合，并在室温下孵育1小时。将混合物转移至PBSM封闭的涂有hVEGFR2的平板上，并在室温下再孵育1小时。洗涤平板后，添加HRP-链霉亲和素(在3％PBSM中1/5000稀释)。再次洗涤平板，并添加TMB反应缓冲液以显色。用1NH₂SO₄终止反应后，用酶标仪在OD450下读板。

细胞结合测定

用于细胞结合的材料

用于细胞结合的方法

PAE-KDR细胞(在含谷氨酰胺，补充有10％热失活FBS的DMEM中)、EOMA细胞(在含谷氨酰胺，补充有10％热失活FBS的DMEM中)、MDA-MB-231细胞(在含谷氨酰胺，补充有10％热失活FBS的RPMI1640中)和B16-F10细胞(在含谷氨酰胺，补充有10％热失活FBS的RPMI1640中)生长直至90％的汇合。收获细胞，首先洗涤，然后按5×10⁵个细胞/ml重新悬浮于冰冷FACS缓冲液(PBS，1％BSA)中。将100μl细胞悬浮液添加到96孔圆底微量滴定板的每个孔中并离心(1200rpm，5分钟)。将连续稀释的双特异性抗体和单特异性抗体添加到细胞中，并与细胞在4下孵育1小时。通过在200μl冰冷FACS缓冲液中1500rpm离心5分钟来洗涤细胞3次。将细胞重新悬浮于100μl的PE-抗人抗体中(1/100)，并在4下在黑暗中孵育至少30分钟。将细胞洗涤3次，重新悬浮于200μlPBS中并且读取荧光值。

磷酸化测定

用于磷酸化测定的材料

用于磷酸化测定的溶液

1.裂解缓冲液：50mM Tris(pH 7.5)、150mM NaCl、1％Triton x100、1mM EDTA、蛋白酶抑制剂混合物(1:500)：磷酸酶抑制剂混合物2(1:200)和磷酸酶抑制剂混合物3(1:200)

2.剥离缓冲液：100mM 2-巯基乙醇、2％十二烷基硫酸钠和62.5mM Tris-HCl pH6.7

3.负载缓冲液：4ml 100％甘油、2.4ml pH6.8的1M Tris/HCl、0.8g SDS、4mg溴酚蓝、0.5ml2-巯基乙醇和3.1ml ddH₂O。

用于磷酸化测定的方法

将1ml 10％FBS/DMEM中的PAE/KDR(0.4x10⁶个)细胞或1.5ml 10％FBS DMEM培养基中的EOMA(1x10⁶个)细胞添加到12孔板中，在37、5％CO₂孵育4小时直至细胞贴附。去除培养基并添加无血清DMEM以使细胞饥饿过夜。第二天，将连续稀释的抗体添加到细胞中，首先在37、5％CO₂下孵育20分钟，然后向细胞中添加VEGF(对于PAE/KDR和EOMA而言最终浓度分别为30ng/ml和50ng/ml；将细胞混合物在37、5％CO₂下再孵育10分钟。用无血清培养基洗涤细胞一次。然后，添加100μl裂解缓冲液并将细胞从培养皿中移至1.5ml埃彭道夫管(Eppendorf tubes)中并在冰上孵育约2小时。将经过处理的样品(lazed sample)在4下10,000rpm离心10分钟并收集上清液。通过Bio-Rad蛋白质测定试剂盒测量蛋白质浓度。然后，将30μg蛋白质与8μl负载缓冲液混合并煮沸5分钟。将混合物负载到4-12％NUPAGE凝胶上，凝胶电泳以分离蛋白质。将蛋白质和标记物一起转移到PVDF膜上过夜。第二天，用3％PBS乳液封闭膜，然后将抗磷酸-VEGFR2(1/1000)或抗磷酸-MAPK添加到膜上。将膜在4下孵育过夜。将膜用0.1％T-PBS洗涤两次后，添加1:1500的抗兔抗体缀合的HRP，并在室温下与膜一起孵育1小时。将膜用PBST洗涤三次，之后添加ECL并用ImageQuant LAS4000拍照(对于磷酸-蛋白质而言)。

通过将膜与剥离缓冲液一起在50下孵育45分钟来剥除先前添加的二次抗体。将膜用PBST洗涤两次，然后与兔抗KDR抗体或抗MAPK抗体(在10ml 3％PBSM中1:400稀释)一起孵育。将膜与兔抗体在4下孵育过夜。将膜再次洗涤，并将HRP-抗兔抗体(1:1500稀释)添加到膜上。在室温下孵育1小时后，将膜洗涤三次，之后添加ECL并在ImageQuant LA4000中拍摄发光照片(对于总蛋白质而言)。

细胞因子分泌测定

用于磷酸化测定的材料

用于磷酸化测定的方法

使用Histopaque-1077按照制造商的说明书从LeukoPak(含有高浓度血细胞，包括单核细胞、淋巴细胞、血小板、血浆以及红细胞的富集白细胞除去法)中分离PBMC。PBMC按每孔2x10⁴个细胞在含有IMDM(补充有2mM谷氨酰胺、25mM HEPES、3.024g/L碳酸氢钠)和10％FBS的96孔板中培养，并且在连续稀释的双特异性抗体或其亲本抗体存在下用0.01μg/mLSEB激活5至7天。在第6天或第7天，收集上清液用于使用人IFN-γ和人IL-2 QuantikineELISA试剂盒根据制造商的说明测量IL-2和IFNγ。

结果

与人和小鼠VEGFR2和PDL1的剂量反应结合

将连续稀释的BsAb(A7-A8)-LALA，单独与其亲本单特异性抗体B1C4A7(针对VEGFR2)和dsD7A8-LALA(针对PDL1)一起分别添加到涂有hVEGFR2或mVEGFR2，或hPDL1和mPDL1的96孔板中并在室温下孵育1小时。之后将板与HRP缀合的抗人IgG Fab特异性抗体(山羊)一起孵育。洗涤平板，添加过氧化物酶底物并读取A450nm。数据点是两次重复测定的平均值±标准偏差(S.D.)。通过使用来自GraphPad Prism的称为“log(激动剂)vs.反应--变斜率(四参数)”的程序计算针对不同抗原的EC50，并列在每个图的顶部。结果示于图23中。

结果表明BsAb(A7-A8)-LALA可以与重组人VEGFR2、小鼠VEGFR2、人PDL1和小鼠PDL1强烈结合。EC50分别针对hVEGFR2为0.128nM，针对mVEGFR2为0.598Nm，针对hPDL1为0.079nM及针对mPDL1为0.137nM；B1C4A7针对hVEGFR2和mVEGFR2的相关EC50分别为0.107nM和0.466nM；dsD7A8针对hPDL1和mPDL1，分别为0.121nM和0.172nM。

用于测定IC50的剂量反应测定

为了阻断VEGF-VEGFR2相互作用，将连续稀释的BsAb(A7-A8)-LALA，单独与其亲本单特异性抗体B1C4A7(针对VEGFR2)和dsD7A8-LALA(针对PDL1)一起用固定量的任一种人或小鼠VEGFR2-Fc(最终为0.5μg/ml)在室温下于溶液中孵育1小时，之后将混合物转移到涂有人VEGF或小鼠VEGF的96孔板中并且再孵育1小时。通过用HRP-抗人IgGFc特异性抗体孵育平板来量化与固定h/mVEGF结合的h/mVEGFR2的量。

为了阻断PD1-PDL1相互作用，将连续稀释的BsAb(A7-A8)-LALA，单独与其亲本单特异性抗体B1C4A7(针对VEGFR2)和dsD7A8-LALA(针对PDL1)一起用固定量的经生物素标记的人或小鼠PDL1-Fc(最终为0.5μg/ml)在室温下于溶液中孵育1小时，之后将混合物转移到涂有人PDL1或小鼠PDL1的96孔板中并且再孵育1小时。通过用HRP-链霉亲和素孵育平板来量化与固定h/mPD1结合的h/mPDL的量。

结果示于图24中。数据点是两次重复测定的平均值±标准偏差(S.D.)。通过使用来自GraphPad Prism的称为“log(抑制剂)vs.反应--变斜率(四参数)”的程序计算针对不同相互作用的IC50，并列在每个图的顶部。

结果表明BsAb(A7-A8)也可以强烈阻断配体VEGF或PDL1与其各自的受体VEGFR2和PD1结合。hVEGF-hVEGFR2相互作用的IC50，对于BsAb(A7-A8)-LALA为1.29nM，而对于B1C4A7为1.72nM。mVEGF-mVEGFR2相互作用的IC50，对于BsAb(A7-A8)-LALA为0.801nM，而对于B1C4A7为0.973nM。hPDL1-hPD1相互作用的IC50，对于BsAb(A7-A8)-LALA为2.51nM，而对于dsD7A8-LALA为3.04nM。mPDL1-mPD1相互作用的IC50，对于BsAb(A7-A8)-LALA为5.59nM，而对于dsD7A8-LALA为2.80nM。

与细胞表达的VEGFR2和PDL1的结合

首先将连续稀释的BsAb(A7-A8)-LALA，单独与其亲本抗体B1C4A7(针对VEGFR2)和dsD7A8(针对PDL1)一起添加到以下细胞系中：KDR-PAE(hVEGFR2)、EOMA(mVEGFR2)、MDA-MB-231(hPDL1)和B16-F10(mPDL1)，然后在4下孵育1小时。之后，将细胞与PE标记的抗人IgGFc特异性抗体一起孵育。洗涤细胞并读取荧光值。计算细胞表面抗原上抗体的荧光强度，并绘制相对于抗体浓度的图表。结果示于图25中。通过使用来自GraphPad Prism的称为“log(激动剂)vs.反应--变斜率(四参数)”的程序计算针对不同抗原的EC50，并列在每个图的顶部。

结果表明BsAb(A7-A8)-LALA也可以与细胞表达的人VEGFR2、小鼠VEGFR2、人PDL1和小鼠PDL1结合。BsAb(A7-A8)-LALA对于KDR/PAE、MDA-MB-231和B16-F10的EC50值分别为0.533nM、0.223nM和0.122nM；B1C4A7对于KDR/PAE的相关EC50为0.522nM，dsD7A8对于MDA-MB-231和B16-F10的值分别为0.159nM和0.042nM。BsAb(A7-A8)-LALA对于EOMA表达的mVEGFR2的EC50的测定受到与EOMA表达的PDL1的结合干扰(图25)。

双特异性抗体A7-A8及其亲本抗体B1C4A7和dsD7A8-LALA的EC50和IC50列于下表中。BsAb(A7-A8)-LALA与其相关亲本抗体B1A1或dsD7A8-LALA之间非常接近的EC50和IC50表明BsAb(A7-A8)-LALA与B1A1或dsD7A8-LALA一样有效。

表：BsAb(A7-A8)的EC50(对于结合而言)和IC50(对于阻断而言)

*:测量受到与EOMA表达的PDL1的结合干扰

动力学分析

使用标准胺偶联化学法将hVEGFR-Fc或hPDL1-Fc在pH5下固定到S系列CM5传感器芯片上。使用1X HBSEP作为电泳缓冲液，以1.5至100nM范围的浓度按30μl/分钟将抗体注射到固定化表面上。接触时间(缔合阶段)为3分钟。解离时间为6-10分钟。在每个结合循环后，以30ul/分钟的流速注射20mM HCL 30秒，进行再生。获得每个浓度的传感图，并使用Biaevaluation软件将导出曲线拟合为1:1 Langmuir结合模型。结果示于图26中。缔合速率(ka)、解离速率(kd)和计算的KD列在每个图的顶部。

这种通过Biacore进行的动力学分析显示，BsAb(A1-A8)-LALA与VEGFR2或PDL1快速缔合而与VEGFR2或PDL1缓慢解离。与VEGFR2和PDL1非常缓慢的解离速率超出了机器测量范围。BsAb(A7-A8)对于hVEGFR2和hPDL1的KD值分别为约47pM和1.2pM，与B1C4A7的52pM和dsD7A8-LALA的7.7pM相当。

与两个靶标的交叉结合ELISA

使用图27中所示的方案1进行交叉结合ELISA。如图所示，可以在固定化hVEGFR2表面上发现复合物2和3，但是用链霉亲和素-HRP仅可以检测到复合物3。可以在溶液中发现的复合物1在处理过程中将被洗掉。

将连续稀释的BsAb(A7-A8)-LALA，单独与其亲本单特异性抗体B1C4A7(针对VEGFR2)和dsD7A8-LALA(针对PDL1)一起用固定量的经生物素标记的人PDL1-Fc(最终为0.5μg/ml)在室温下于溶液中孵育1小时，之后将混合物转移到涂有hVEGFR2的96孔板中并且再孵育小时。结合的BsAb/生物素-PDL1复合物可以通过HRP-链霉亲和素检测(如方案1中所示)。结果示于图28中。数据点是六次测定的平均值±标准偏差(S.D.)。

如图所示，通过交叉结合ELISA检查，双特异性抗体A7-A8可与VEGFR2和PDL1同时结合。该结果表明双特异性抗体的构象在与第一靶标结合后不变；因此，第一靶标结合的双特异性抗体可以结合第二靶标。

磷酸化测定

将血清饥饿细胞与不同量的抗体在室温下孵育30分钟，接着用30ng/ml的hVEGF(对于KDR-PAE而言)或50ng/ml的mVEGF(对于EOMA而言)再刺激15分钟。裂解细胞并测量蛋白质浓度。用SDS PAGE分解30μg蛋白质，并使用针对受体和MAPK的抗磷酸酪氨酸抗体进行免疫印迹分析。使用增强的化学发光检测信号。结果示于图29中。

通过测试其阻断人VEGFR2或小鼠VEGFR2和下游分子MAPK磷酸化的能力来检查BsAb(A7-A8)-LALA的效力。图29显示，在100或10nM的BsAb(A7-A8)-LALA和B1C4A7的存在下，人VEGFR2、mVEGFR2和MAPK的磷蛋白条带要弱得多。用BsAb(A7-A8)和B1C4A7处理的条带密度差异很小，无法用眼睛区分。

细胞因子分泌测定

将连续稀释的BsAb(A7-A8)-LALA，单独与其亲本抗体B1C4A7(针对VEGFR2)和dsD7A8(针对PDL1)一起添加到用0.01μg/mLSEB活化的PBMC(来自供体BG)中。第6天，收集上清液，通过使用Duoset试剂盒按照制造商说明测量IL-2和IFNγ。结果示于图30中。数据点是三次测定的平均值±标准偏差(S.D.)并通过下式计算：

(样品读数-未刺激的读数)/(SEB刺激的读数-未刺激的读数)*100

结果表明，在BsAb(A7-A8)-LALA和dsD7A8的存在下，经SEB刺激时PBMC中细胞因子IL2和INFγ的分泌远高于抗VEGFR2抗体B1C4A7(图30)。用BsAb(A7-A8)-LALA和dsD7A8处理没有差异。

总之，上述结果证明BsAb(A7-A8)-LALA保持其亲本抗体B1C4A7(针对VEGFR2)和dsD7A8-LALA(针对PDL1)的效力。

实施例3双特异性抗体(A1-A8)的体外表征

该实施例描述了双特异性抗体A1-A8的体外表征以及与其亲本抗体B1A1(针对VEGFR2)和dsD7A8-LALA(针对PDL1)的效力比较。

正如前面实施例中所报道的，通过在HEK293中瞬时表达获得并通过蛋白A纯化的纯双特异性抗体A1-A8，通过SEC-UPLC分析检测到低于1％的较高分子量聚集。在37下孵育长达5天后，BsAb(A1-A8)在小鼠血清中也非常稳定。

单独与其亲本抗体B1A1(针对VEGFR2)和dsD7A8-LALA(针对PDL1)一起，研究了可以与人和小鼠物种交叉反应的双特异性抗体A1-A8与可溶性和细胞表达的VEGFR2和PDL1的结合，抑制配体(VEGF和PDL1)，与受体(VEGFR2和PD1)结合，阻断VEGFR2/下游分子磷酸化和刺激细胞因子IL2和INFγ分泌的能力。

材料和方法

除了使用以下抗体，包括双特异性抗体A1-A8外，此处的材料和方法与上述实施例2中描述的那些相同。

结果

与人和小鼠VEGFR2和PDL1的剂量反应结合

以上述相同方式测定对人和小鼠VEGFR2和PDL1的剂量反应。结果示于图31中。

结果表明BsAb(A1-A8)-LALA可以与重组人VEGFR2、人PDL1和小鼠PDL1强烈结合。EC50分别针对hVEGFR2为0.128nM，针对hPDL1为0.088nM且针对mPDL1为0.160nM；B1A1对于hVEGFR2的相关EC50为0.127nM，dsD7A8对于hPDL1和mPDL1分别为0.121nM和0.172nM。

用于测定IC50的剂量反应测定

以上述方式进行测定。结果示于图32中。数据点是两次重复测定的平均值±标准偏差(S.D.)。通过使用来自GraphPad Prism的称为“log(抑制剂)vs.反应--变斜率(四参数)”的程序计算针对不同相互作用的IC50，并列在每个图的顶部。

结果表明BsAb(A1-A8)可以强烈阻断配体VEGF或PDL1与其各自的受体VEGFR2和PD1结合。hVEGF-hVEGFR2相互作用的IC50，对于BsAb(A1-A8)-LALA为1.19nM，而对于B1A1为1.60nM。hPDL1-hPD1相互作用的IC50，对于BsAb(A1-A8)-LALA为2.51nM，而对于dsD7A8-LALA为3.04nM。mPDL1-mPD1相互作用的IC50，对于BsAb(A1-A8)-LALA为3.20nM，而对于dsD7A8-LALA为2.80nM。

与细胞表达的VEGFR2和PDL1的结合

以上述方式进行结合测定。结果示于图33中。

结果表明BsAb(A1-A8)-LALA也可以与细胞表达的人VEGFR2、人PDL1和小鼠PDL1结合。BsAb(A1-A8)-LALA对于KDR/PAE、MDA-MB-231和B16-F10的EC50值分别为0.779nM、0.402nM和0.113nM；B1A1对于KDR/PAE的相关EC50为0.177nM，dsD7A8对于MDA-MB-231和B16-F10分别为0.159nM和0.042nM。(图33)。

双特异性抗体A1-A8及其亲本抗体B1A1和dsD7A8-LALA的EC50和IC50列于下表中。BsAb(A1-A8)-LALA与其相关亲本抗体B1A1或dsD7A8-LALA之间非常接近的EC50和IC50表明BsAb(A1-A8)-LALA与B1A1或dsD7A8-LALA一样有效。

表：BsAb(A1-A8)的EC50(对于结合而言)和IC50(对于阻断而言)

*:EOMA表达mVEGFR2和mPDL1两者

动力学分析

以上述方式进行动力学测定。结果示于图34中。缔合速率(ka)、解离速率(kd)和计算的KD列在每个图的顶部。

通过Biacore进行的动力学分析(图34)显示，BsAb(A1-A8)-LALA与VEGFR2或PDL1快速缔合并长时间停留在VEGFR2或PDL1上。与VEGFR2和PDL1结合非常缓慢的解离速率超出了机器测量范围。BsAb(A1-A8)对于hVEGFR2和hPDL1的KD值分别为约200pM和3.2pM，与B1A1的164pM和dsD7A8-LALA的7.7pM相当。

与两个靶标的交叉结合ELISA

以上述方式进行结合测定。结果示于图35中。数据点是六次测定的平均值±标准偏差(S.D.)。

如图所示，通过交叉结合ELISA检查，双特异性抗体A18可与VEGFR2和PDL1同时结合(图36)。该结果表明双特异性抗体的构象在与第一靶标结合后不变；因此，第一靶标结合的双特异性抗体可以结合第二靶标。

磷酸化测定

以上述方式进行测定。结果示于图36中。

通过测试其阻断人VEGFR2和下游分子MAPK磷酸化的能力来检查BsAb(A1-A8)-LALA的效力。图36显示，在1.5μg/ml(7.5nM)的BsAb(A1-A8)-LALA和BsAb(A7-A8)-LALA存在下，VEGFR2和MAPK两者的磷蛋白条带比没有抗体处理的条带弱得多。该实验中，亲本抗体的浓度为1.5μg/ml(10nM)；因此，在该实验中使用比双特异性抗体更多的单特异性抗体。

细胞因子分泌测定

以上述方式进行细胞因子分泌测定。将连续稀释的BsAb(A1-A8)-LALA和BsAb(A7-A8)添加到用0.01μg/mLSEB活化的PBMC(来自供体BG)中。第6天，收集上清液，通过使用Duoset试剂盒按照制造商的说明测量IL-2和IFNγ。数据点是两次重复测定的平均值±标准偏差(S.D.)。结果示于图37中。

结果表明，在BsAb(A1-A8)-LALA和BsAb(A7-A8)-LALA的存在下，经SEB刺激时PBMC中细胞因子IL2和INFγ的分泌高于对照抗体B1A1和B1C4A7(图37)。

总之，上述结果证明BsAb(A1-A8)-LALA保持其亲本抗体B1A1(针对VEGFR2)和dsD7A8-LALA(针对PDL1)的效力。

实施例4抗肿瘤作用I

在该实施例中，检查上述BsAb(A1-A8)对CT26鼠结肠癌细胞的作用。

更具体地，在小鼠的右下腹侧皮下注射0.1mL于无血清RPMI-1640培养基中的CT26鼠结肠癌细胞(0.3x10⁶个细胞/只小鼠)，用于肿瘤发展。当肿瘤平均大小达到约75-125mm³时，根据肿瘤大小将小鼠随机分配为5个实验组。每组由13只小鼠组成。如下表所示，用抗体处理小鼠。用PBS将每个剂量调节至200μl，并通过腹膜内注射给小鼠，每周两次，持续长达三周。每周两次测量体重和肿瘤体积。结果示于下表。

结果表明B1C4A7、D7A8、其组合和BsAb(A7-A8)使肿瘤体积减小。发现在这种CT26模型中，两种抗体(B1C4A7和D7A8)的组合和BsAb(A7-A8)在减小肿瘤体积方面比两种单独的抗体更有效。因为所有抗体均为全人抗体，所以处理超过2周，发展出免疫原性。因此，报告了处理后长达3周的结果。结果还表明，在任何处理组中均未发现体重显著降低(数据未示出)。

实施例5抗肿瘤作用II

在该实施例中，检查上述BsAb(A1-A8)对MC38鼠结肠癌细胞的作用。

每只小鼠在右下腹侧皮下接种MC38鼠结肠癌细胞(1×10⁶个细胞/只小鼠)，用于肿瘤发展。当肿瘤平均大小达到约90mm³时，根据肿瘤大小将小鼠随机分配为9个实验组。每组由13只小鼠组成。如图39A和39B所示，用抗体处理小鼠。用PBS将每个剂量调节至200μl，并通过腹膜内注射给动物，每周两次，持续长达三周。每周两次测量体重和肿瘤体积。结果示于图39A和39B中。

如图所示，针对VEGFR2的抗体B1C4A7仅显示出中等效力。相比之下，抗PDL1抗体D7A8、BsAb(A7-A8)以及B1C4A7和D7A8的组合完全抑制肿瘤生长，并且在三组之间未观察到显著差异。由于所有抗体均为全人抗体，所以处理超过2周，发展出免疫原性。报告了治疗后长达3周的结果。另外，对于所有小鼠而言在三周内未观察到显著体重减轻(数据未示出)。所有抗体均以常规IgG1形式(图39A)和LALA形式(图39B)构建，其中CH2中的亮氨酸234和235突变为丙氨酸以削弱效应子功能。在这两种形式之间没有观察到显著差异。

实施例6其它双特异性抗体的体外表征

在该实施例中，产生并检查了如图1A所描绘的双特异性抗体的其它实例(即重链-C端融合)。为此，使用抗PDL1抗体A11或D7A8和抗VEGFR2抗体B1A1或B1C4A7产生针对VEGFR2和PDL1的双特异性抗体的不同取向。这些双特异性抗体、相关组分和结合特异性列于下表中。在双特异性抗体中，使用以下两种接头：

15GS：GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：68)

30GS：GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：69)。

另外，向scFv中引入突变以在两个可变结构域之间添加二硫键。还向CH2结构域中引入突变以削弱效应子功能(LALA形式IgG)，其中CH2中的LL残基(例如SEQ ID NO:28、30和32中的粗体)变为AA。

通过SDS-PAGE和SEC-UPLC以上述方式分析这些双特异性抗体的纯度和稳定性。结果示于图40和41中。

如图40所示，观察到BsAb(B1A1-A11)和BsAb(B1C4A7-A11)变体的一些降解条带。

相比之下，在BsAb(A11-B1A1)和BsAb(D7A8-B1A1)变体(图41)中取向改变后未观察到降解条带。

SEC-UPLC结果表明，当添加了二硫键时，双特异性抗体更稳定。例如，对于BsAb(A11-B1A1)_30cc而言，单体占95.5％以上，而对于A11IgG、BsAb(A11-B1A1)和BsAb(A11-B1A1)_30而言，单体分别占97.8％、94.3％和93.8％以上。类似地，在BsAb(D7A8-B1A1)变体中，对于BsAb(D7A8-B1A1)_30cc，单体占97.3％以上，而对于D7A8IgG，BsAb(D7A8-B1A1)和BsAb(D7A8-B1A1)_30，单体占分别超过99％，86.6％和90.2％。

以上述相同方式分析这些双特异性抗体与PDL1和VEGR2的结合。结果示于图42中。发现这些针对PDL1和VEGR2的双特异性抗体与亲本抗体一样有效。

还以上述方式检查了阻断配体和受体的相互作用。结果示于图43中。发现这些双特异性抗体与亲本抗体一样有效。

以上述方式进行Biacore分析。结果示于下表。

Claims (22)

1.一种双特异性结合蛋白，其包含与人PD-L1结合的第一区和与人KDR结合的第二区。

2.如权利要求1所述的双特异性结合蛋白，其为双特异性抗体。

3.如权利要求1所述的双特异性结合蛋白，其为融合蛋白。

4.一种双特异性抗体，其包含IgG、IgA、IgE或IgD和scFv。

5.如权利要求4所述的双特异性抗体，其包含结合PD-L1的IgG和结合KDR的scFv。

6.如权利要求4所述的双特异性抗体，其包含结合KDR的IgG和结合PD-L1的scFv。

7.如权利要求5或6所述的双特异性抗体，其包含结合人PD-L1并且具有三个互补决定区(CDR)的重链可变结构域，其中CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO:10-12或分别为SEQ ID NO:58-60。

8.如权利要求5或6所述的双特异性抗体，其包含结合人PD-L1并且具有三个CDR的轻链可变结构域，其中CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO:13-15或分别为SEQ IDNO:61-63。

9.如权利要求5或6所述的双特异性抗体，其包含结合人KDR并且具有三个CDR的重链可变结构域，其中CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO:16-18。

10.如权利要求5或6所述的双特异性抗体，其包含结合人KDR并且具有三个CDR的轻链可变结构域，其中CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO:19-21。

11.如权利要求5或6所述的双特异性抗体，其包含结合人KDR并且具有三个CDR的重链可变结构域，其中CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO:22-24。

12.如权利要求5或6所述的双特异性抗体，其包含结合人KDR并且具有三个CDR的轻链可变结构域，其中CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO:25-27。

13.如权利要求5或6所述的双特异性抗体，其包含重链和轻链，其中所述重链和所述轻链包含选自由以下组成的组的重链/轻链对的相应序列：SEQ ID NO:34和31、SEQ ID NO:30和35、SEQ ID NO:36和31、SEQ ID NO:30和37、SEQ ID NO:38和33、SEQ ID NO:32和39、SEQID NO:40和33、SEQ ID NO:32和41、SEQ ID NO:42和29、SEQ ID NO:28和43、SEQ ID NO:44和29、SEQ ID NO:28和45、SEQ ID NO:46和29、SEQ ID NO:28和47、SEQ ID NO:48和29、SEQID NO:28和49、SEQ ID NO:51和50、SEQ ID NO:52和50、SEQ ID NO:53和50、SEQ ID NO:54和29、SEQ ID NO:55和29及SEQ ID NO:56和29。

14.一种治疗需要减少免疫抑制或减少血管生成的患者的方法，所述方法包括向需要这样减少免疫抑制或血管生成的患者施用权利要求1-3中任一项所述的双特异性结合蛋白或权利要求4-13中任一项所述的双特异性抗体。

15.一种治疗癌症的方法，其包括向有需要的患者施用权利要求1-3中任一项所述的双特异性结合蛋白或权利要求4-13中任一项所述的双特异性抗体。

16.如权利要求15所述的方法，其中所述癌症选自肺癌、结直肠癌肾细胞癌、成胶质细胞瘤、卵巢癌、膀胱癌、胃癌、多发性骨髓瘤、非小细胞肺癌和胰腺癌。

17.一种分离的核酸分子，其编码权利要求1-3中任一项所述的双特异性结合蛋白、权利要求4-13中任一项所述的双特异性抗体或其多肽链。

18.一种载体，其包含权利要求17所述的核酸分子。

19.一种培养的宿主细胞，其包含权利要求18所述的载体。

20.一种生成多肽的方法，所述方法包括在容许所述核酸分子表达的条件下培养权利要求19所述的宿主细胞。

21.一种权利要求1-3中任一项所述的双特异性结合蛋白或权利要求4-13中任一项所述的双特异性抗体的缀合物，其中所述双特异性结合蛋白或所述双特异性抗体与选自显像剂、治疗剂和细胞毒性剂的药剂缀合。

22.一种药物组合物，其包含

权利要求1-3中任一项所述的双特异性结合蛋白、权利要求4-13中任一项所述的双特异性抗体、或权利要求21所述的缀合物，和

药学上可接受的载体。