CN113045567B - 基于蛋白磷酸酶5的磷酸酶募集嵌合体(PHORCs)化合物、其制备方法和医药用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开如式I所示基于蛋白磷酸酶5的磷酸酶募集嵌合体(PHORCs)化合物、其制备方法和医药用途。本发明的化合物可不同程度的去磷酸化胃癌MKN45细胞中的p‑ASK1，可以在体外、体内显著抑制ASK1活性，从而选择性地下调周期相关蛋白，具有细胞增殖抑制作用。其中化合物DDO‑3711的细胞增殖抑制作用明显优于ASK1小分子抑制剂TCASK10组及ASK1小分子抑制剂TCASK10和PP5小分子激活剂P5SA‑1联合给药组，可用于制备胃癌、结肠癌等相关疾病的治疗药物。

Description

基于蛋白磷酸酶5的磷酸酶募集嵌合体(PHORCs)化合物、其制 备方法和医药用途

技术领域

本发明涉及药物化学领域，特别涉及一种招募蛋白磷酸酶5(PP5)靶向细胞凋亡信号调节激酶1(ASK1)去磷酸化的磷酸酶募集嵌合体(PHORCs)化合物、其制备方法和医药用途。

背景技术

蛋白的翻译后修饰过程负责调控人体内多种生理进程，其中包括泛素化、磷酸化、糖基化、酯化等。正因为存在不同的翻译后修饰过程，使得蛋白的活性、定位、稳定性和生理功能等受到严格的调控。许多疾病也伴随着蛋白翻译后修饰功能的异常，因此有目的地干预蛋白的翻译后修饰过程是一种有效的调控手段。近年来研究火热的PROTACs本质上是一种双功能小分子的设计及其在蛋白翻译后修饰过程中的应用：通过不同的分子配体将目标蛋白与E3泛素连接酶相连而实现对特定蛋白的选择性降解。这一技术的最大特点是充分利用体内泛素-蛋白酶体系统实现特异性诱导靶标蛋白降解，解决了诱导蛋白质降解的选择性问题，也有望解决很多传统小分子难以靶向“难成药靶标”的问题。然而，PROTACs也并非适用于所有的研究体系，例如体内很多具有重要基础功能的靶标蛋白不能被降解，或降解后会诱发严重的负反馈效应，限制了PROTACs的应用，需要新的研究策略来攻克此难题。近年来，有科学家把目光放在了蛋白的磷酸化与去磷酸化上，提出了磷酸酶募集嵌合体(Phosphatase Recruiting Chimeras，PHORCs)。

在蛋白的翻译后修饰(PTMs)过程中，磷酸化与去磷酸化过程扮演着重要的角色。其中，蛋白激酶(kinases)负责底物蛋白的磷酸化，蛋白磷酸酶(phosphatases)负责底物蛋白的去磷酸化。磷酸化与去磷酸化过程会诱导蛋白构象的大幅改变，触发信号通路的激动或抑制，进而调控蛋白的各项生理功能。然而，许多致病蛋白的过度磷酸化会导致其功能的异常活跃，加速疾病的进程。PHORCs是一种基于磷酸酶发展而来的新型靶向去磷酸化目标蛋白的技术。PHORCs是一种双功能的分子，可同时与目标蛋白和蛋白磷酸酶结合，通过拉近目标蛋白和蛋白磷酸酶的距离达到促进蛋白磷酸酶去磷酸化目标蛋白的目的。与PROTACs相比，有明显的优势：(1)避免了由蛋白质降解引起的毒性作用，(2)应用范围更加广泛，可以调节许多不可降解蛋白质的活性。因此，利用PHORCs使靶蛋白去磷酸，从而调节靶蛋白的活性是一种潜在的疾病治疗策略，具有较大的临床应用前景。

细胞凋亡信号调节激酶1(ASK1)是一种广泛表达的丝/苏氨酸蛋白激酶，在细胞应激反应中发挥重要的生理作用。ASK1的活性受到多种方式调节，其中自磷酸化Thr838使其自身激活，而PP5去磷酸化Thr838使其活性受到抑制。在1-甲基-1-亚硝基脲(MNU)诱导的胃肿瘤发生模型中，ASK1过表达且活性增高，其通过激活AP-1来增加Cyclin D1的表达、加速细胞周期发挥肿瘤促进作用。因此，针对ASK1开发PHORCs分子，通过促进PP5去磷酸化ASK1来抑制其活性将有效治疗胃癌。

发明内容

发明目的：本发明目的是提供一种招募蛋白磷酸酶5(PP5)靶向细胞凋亡信号调节激酶1(ASK1)去磷酸化的磷酸酶募集嵌合体(PHORCs)化合物、其制备方法和医药用途。本发明选择了PP5激活剂棕榈酸、HSP90多肽(TSRMEEVD)和P5SA-1等作为与PP5结合的配体，选择ASK1抑制剂TCASK10(IC₅₀＝14nM)等作为与ASK1结合的配体，通过连接链将二者连接得到一系列可不同程度去磷酸化ASK1并抑制其活性的PHORCs化合物。

技术方案：本发明提供的结构式如式I所示的基于蛋白磷酸酶5的磷酸酶募集嵌合体(PHORCs)化合物，其光学异构体，及药学上可接受的盐或溶剂合物，

A-L-P

式I

其中：

A表示ASK1激酶的配体，L表示连接链，P表示蛋白磷酸酶PP5的配体。

进一步地，A为式II-1或者式II-2所示化合物，

进一步地，L为式III所示化合物的结构式为以下任意结构之一或者不存在：

其中，n表示独立的1-11之间任意一个自然数，x表示独立的1-11之间任意一个自然数；

进一步地，P为式IV所示化合物的结构式为以下任意结构之一：

其中，各个y表示独立的1-11之间任意一个自然数；

其中，T表示苏氨酸；

其中，S表示丝氨酸；

其中，R表示精氨酸；

其中，M表示甲硫氨酸；

其中，E表示谷氨酸；

其中，V表示缬氨酸；

其中，D表示天冬氨酸。

进一步地，式I所示化合物的结构式为DDO-3701～DDO-3714、DDO-3709R8任意结构之一：

所述的招募蛋白磷酸酶5靶向细胞凋亡信号调节激酶1去磷酸化的磷酸酶募集嵌合体化合物在制备治疗或预防肿瘤疾病的药物中的用途。

进一步地，所述肿瘤疾病为胃癌、结肠癌、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、肾癌、胰腺癌、肝癌、急性骨髓性白血病或多发性骨髓瘤。

本发明的第二个目的是提供一种招募蛋白磷酸酶5(PP5)靶向细胞凋亡信号调节激酶1(ASK1)去磷酸化的磷酸酶募集嵌合体化合物，包括所述结构式如式I所示化合物，其光学异构体，及药学上可接受的盐或溶剂合物。

有益效果：

本发明提供的磷酸酶募集嵌合体化合物可不同程度的去磷酸化胃癌细胞系MKN45中的p-ASK1，可以在体外、体内显著抑制ASK1活性，从而选择性地下调周期相关蛋白，具有细胞增殖抑制作用。其中化合物DDO-3711的细胞增殖抑制作用明显优于ASK1小分子抑制剂TCASK10组及ASK1小分子抑制剂TCASK10和PP5小分子激活剂P5SA-1联合给药组，可用于制备胃癌、结肠癌等相关疾病的治疗药物。本发明还公开了一种合成该系列磷酸酶募集嵌合体化合物的制备方法。

附图说明

图1：化合物DDO-3711对MKN45细胞中ASK1、p-ASK1蛋白表达的影响；

图2：化合物DDO-3711、ASK1小分子抑制剂TCASK10及ASK1小分子抑制剂TCASK10和PP5小分子激活剂联合用药对MKN45细胞增殖的抑制作用。

具体实施方式

如无其他特殊说明，原料可以从商业途径获得，或者通过本领域已知的方法制备，或根据本文所述方法制备。化合物的结构通过核磁共振(¹H-NMR)和/或质谱(MS)来确定。NMR测定是用VarianINOVA(300MHz)或者Bruker Advance(400MHz)核磁共振仪，测定溶剂为氘代二甲亚砜(DMSO-d6)，TMS为内标。MS的测定用Waters Q-Tof微型质谱仪。柱层析采用青岛海洋化工厂的200-300目硅胶。

实施例1

N-(6-(1H-咪唑-1-基)咪唑并[1，2-a]吡啶-2-基)-4-棕榈酰氨基苯甲酰胺(DDO-3701)的制备。

合成路线：

将化合物1(50mg，0.16mmol)溶于3ml N，N-二甲基甲酰胺中，加入棕榈酸酐(194mg，0.39mmol)，N，N-二异丙基乙胺(61mg，0.46mmol)，氮气保护下，70℃反应5小时；抽滤，浓缩滤液；加入5ml乙酸乙酯打浆，抽滤，用2ml乙酸乙酯淋洗；50℃干燥滤饼，得到20mg淡黄色固体粉末，收率23％。¹H NMR(300MHz，DMSO-d₆)δ10.21(s，1H)，9.54(s，1H)，8.60(s，1H)，7.85(d，J＝9.4Hz，2H)，7.81(d，J＝9.0Hz，2H)，7.63(d，J＝8.6Hz，2H)，7.60(d，J＝9.5Hz，1H)，7.40(s，1H)，5.87(s，2H)，2.38(t，J＝7.3Hz，2H)，1.63(p，J＝7.1Hz，2H)，1.26(s，26H)，0.90-0.84(m，3H).HRMS(ESI)：found557.35957(C₃₃H₄₄N₆O₂[M+H]⁺，requires557.35985).

实施例2

N-(6-(1H-咪唑-1-基)咪唑并[1，2-a]吡啶-2-基)-4-(2-(2-(2-(棕榈酰氨基乙氧基)乙氧基)乙酰氨基)苯甲酰胺(DDO-3702)的制备。

合成路线：

(1)N-(6-(1H-咪唑-1-基)咪唑并[1，2-a]吡啶-2-基)-4-(2-(2-(2-(2-棕榈酰氨基乙氧基)乙氧基)乙酰氨基)苯甲酰胺(3)的制备。

将化合物2(500mg，1.25mmol)溶于15ml氯化亚砜中，加入2滴N，N-二甲基甲酰胺，80℃回流3小时；浓缩反应液后加入5mlN，N-二甲基甲酰胺，制成酰氯的N，N-二甲基甲酰胺溶液备用；冰浴下，向化合物1(413mg，1.30mmol)的N，N-二甲基甲酰胺溶液(5ml)中滴加酰氯的N，N-二甲基甲酰胺溶液，室温反应过夜；加入饱和碳酸氢钠固体调节反应液的pH至碱性；浓缩反应液，柱层析纯化(洗脱剂：二氯甲烷/甲醇(v/v)＝40/1)；将得到淡黄色固体粉末溶于6ml二氯甲烷中，加入1.2ml哌啶，室温反应3小时；浓缩反应液，加入10ml乙酸乙酯打浆，抽滤，50℃干燥滤饼；得到淡黄色固体粉末240mg，收率39.36％。¹H NMR(300MHz，DMSO-d₆)δ10.46(s，1H)，9.43(s，1H)，8.16(s，1H)，7.91(d，J＝8.4Hz，2H)，7.84(dd，1H)，7.67(s，1H)，7.64(d，J＝8.2Hz，2H)，7.56(d，J＝9.4Hz，1H)，7.15(s，1H)，5.87(s，2H)，4.23(s，2H)，3.69(q，J＝5.4Hz，4H)，3.25-3.16(m，2H)，2.77-2.69(m，2H)，1.24(s，2H).HRMS(ESI)：found464.2039，486.18571(C₂₃H₂₅N₇O₄[M+H]⁺，[M+Na]⁺requires 464.1968，486.18602).

(2)标题化合物N-(6-(1H-咪唑-1-基)咪唑并[1，2-a]吡啶-2-基)-4-(2-(2-(2-(棕榈酰氨基乙氧基)乙氧基)乙酰氨基)苯甲酰胺(DDO-3702)的制备。

本品由N-(6-(1H-咪唑-1-基)咪唑并[1，2-a]吡啶-2-基)-4-(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙酰氨基)苯甲酰胺(3)制得，制备方法同实施例1，得到20mg淡黄色固体粉末，收率13％。¹H NMR(300MHz，DMSO-d₆)δ10.22(s，lH)，9.48(s，1H)，8.30(s，1H)，7.95(t，J＝5.6Hz，lH)，7.88(d，J＝8.5Hz，2H)，7.83(dd，J＝9.4，2.3Hz，1H)，7.71(s，1H)，7.63(d，J＝8.6Hz，2H)，7.55(d，J＝9.4Hz，1H)，7.22(s，1H)，5.87(s，2H)，4.17(s，2H)，3.69(dd，J＝6.1，3.3Hz，2H)，3.61(dd，J＝6.0，3.4Hz，2H)，3.45(t，J＝5.8Hz，2H)，3.22(q，J＝5.8Hz，2H)，2.06(t，J＝7.4Hz，2H)，1.46(t，J＝7.0Hz，2H)，1.20(s，24H)，0.83(t，3H).HRMS(ESI)：found 702.43342，724.41511(C39H55N7O5[M+H]⁺，[M+Na]⁺requires 702.42647，724.41569).

实施例3

N-(6-(1H-咪唑-1-基)咪唑并[1，2-a]吡啶-2-基)-4-(6-棕榈酰氨基己酰胺基)苯甲酰胺(DDO-3703)的制备。

合成路线：

(1)叔丁基(6-((4-((6-(1H-咪唑-1-基)咪唑并[1，2-a]吡啶-2-基)氨基甲酰基)苯基)氨基)-6-氧己基)氨基甲酸酯(4)的制备。

将叔丁氧羰酰基6-氨基己酸(727mg，3.14mmol)、N，N’-羰基二咪唑(510mg，3.14mmol)溶于6ml无水N，N-二甲基甲酰胺中，冰浴下，搅拌30分钟；滴加化合物1(1g，3.14mmol)的N，N-二甲基甲酰胺溶液，室温反应4小时；反应液浓缩后柱层析纯化(洗脱剂：乙酸乙酯)；得黄色固体粉末100mg，收率6％。¹H NMR(300MHz，DMSO-d₆)δ10.24(s，1H)，9.45(s，1H)，8.16(s，1H)，7.81(d，J＝8.4Hz，2H)，7.70(s，1H)，7.64(d，J＝8.5Hz，4H)，7.56(d，J＝9.4Hz，1H)，7.16(s，1H)，6.84(s，1H)，5.87(s，2H)，2.94(q，J＝7.1，6.7Hz，2H)，2.38(t，J＝7.2Hz，2H)，1.63(t，J＝7.2Hz，2H)，1.40(s，12H)，1.25(s，2H).HRMS(ESI)：found532.26784(C₂₈H₃₃N₇O₄[M+H]⁺，requires 532.26668).

(2)标题化合物N-(6-(1H-咪唑-1-基)咪唑并[1，2-a]吡啶-2-基)-4-(6-棕榈酰氨基己酰胺基)苯甲酰胺(DDO-3703)的制备。

将化合物4(40mg，0.075mmol)溶于5ml乙酸乙酯中，加入1ml浓盐酸，室温搅拌3小时；浓缩反应液，将得到的固体溶于5mlN，N-二甲基甲酰胺中，加入棕榈酸酐(89mg，0.180mmol)和N，N-二异丙基乙胺(0.5m1)，氮气保护下，70℃反应5小时；浓缩反应液后，柱层析纯化(洗脱剂：二氯甲烷/甲醇(v/v)＝10/1+1％三乙胺)；得淡黄色固体粉末20mg，收率40％。¹H NMR(300MHz，DMSO-d₆)δ10.34(s，1H)，9.44(s，1H)，8.16(s，1H)，7.98(s，2H)，7.83(s，1H)，7.81(s，2H)，7.62(d，J＝7.1Hz，2H)，7.16(s，1H)，5.86(s，2H)，3.11-3.04(m，2H)，2.92(s，2H)，2.76(s，2H)，2.38(s，2H)，2.05(t，3H)，1.63(s，2H)，1.42(t，4H)，1.24(s，22H)，0.87(s，2H).HRMS(ESI)：found 670.44348，692.42485(C₃₉H₅₅N₇O₅[M+H]⁺，[M+Na]⁺，requires 670.43588，692.42586).

实施例4

N1-(6-(1H-咪唑-1-基)咪唑并[1，2-a]吡啶-2-基)-N⁴-(6-(4-((5-(3，4-二甲氧基苯基)-1，2，4-噁二唑-3-基)甲基)苯甲酰胺基)己基)对苯二甲酰胺(DDO-3711)的制备。

(1)N¹-(6-(1H-咪唑-1-基)咪唑并[1，2-a]吡啶-2-基)-N⁴-(6-氨基己基)对苯二甲酰胺(6)的制备。

将化合物5(600mg，1.56mmol)、1-羟基苯并三唑(63mg，0.466mmol)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(328mg，1.711mmol)溶于10mlN，N-二甲基甲酰胺中，氮气保护；冰浴下，滴加N1-Fmoc-1，6-二氨基己烷(606mg，1.616mmol)的N，N-二甲基甲酰胺(5ml)溶液，滴加完毕，升温至室温，反应5小时；抽滤，除去不溶物；向滤液中加500ml水，搅拌析晶1小时，抽滤，水淋洗，50℃干燥；将得到棕色固体粉末溶于7mlN，N-二甲基甲酰胺中，加入0.7ml哌啶，室温搅拌过夜；抽滤，用少量N，N-二甲基甲酰胺淋洗，50℃干燥滤饼；得到棕黄色固体粉末350mg，收率50.5％。¹H NMR(300MHz，DMSO-d₆)δ11.87(s，1H)，9.85(s，1H)，9.50(s，1H)，8.81(t，J＝5.6Hz，1H)，8.51(s，1H)，8.33(s，1H)，8.22(d，J＝8.2Hz，2H)，8.04(d，J＝8.4Hz，3H)，7.95(s，1H)，7.89(s，1H)，5.34(s，2H)，3.35-3.25(m，2H)，2.80-2.74(m，2H)，1.62-1.54(m，4H)，1.38-1.34(m，4H).HRMS(ESI)：found 446.22951(C₂₄H₂₇N₇O₂[M+H]⁺，requires 446.22990).

(2)标题化合物N1-(6-(1H-咪唑-1-基)咪唑并[1，2-a]吡啶-2-基)-N⁴-(6-(4-((5-(3，4-二甲氧基苯基)-1，2，4-噁二唑-3-基)甲基)苯甲酰胺基)己基)对苯二甲酰胺(DDO-3711)的制备。

将化合物7(33mg，0.097mmol)、1-羟基苯并三唑(4mg，0.0296mmol)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(33mg，0.172mmol)溶于3mlN，N-二甲基甲酰胺中；氮气保护，冰浴下，滴加化合物6(50mg，0.112mmol)的N，N-二甲基甲酰胺溶液(10ml)，滴加完毕，升温至室温，反应5小时；向反应液中加水50ml，搅拌析晶1小时，抽滤；柱层析纯化滤饼(洗脱剂：二氯甲烷/甲醇(v/v)＝10/1)；得到类白色固体粉末12mg，收率16％。¹HNMR(300MHz，DMSO-d₆)δ11.48(s，1H)，9.12(s，1H)，8.66(d，J＝5.5Hz，1H)，8.46(t，J＝5.7Hz，1H)，8.40(s，1H)，8.25(s，1H)，8.18(d，J＝8.2Hz，2H)，7.98(d，J＝8.4Hz，2H)，7.84(d，J＝8.2Hz，2H)，7.75(s，1H)，7.71(dd，J＝8.4，2.1Hz，1H)，7.66(s，1H)，7.54(d，J＝2.0Hz，1H)，7.45(d，J＝8.1Hz，2H)，7.20(s，1H)，4.24(s，2H)，3.88(s，3H)，3.87(s，3H)，3.33-3.26(m，2H)，1.61-1.52(m，4H)，1.41-1.35(m，4H)，1.25(s，4H).HRMS(ESI)：found 768.32444(C42H41N9O6[M+H]⁺requires768.32526).

实施例5

合成路线：

(1)(9H-芴-9-基)甲基(6-((6-(4-((6-(1H-咪唑-1-基)咪唑并[1，2-a]吡啶-2-基)氨甲酰基)苯甲酰胺基)己基)氨基)-6-氧代己基)氨基甲酸酯(8a)的制备。

将Fomc-6-氨基己酸(20mg，0.057mmol)、1H-苯并三唑-1-基氧三吡咯烷基六氟磷酸盐(68mg，0.131mmol)和N，N-二异丙基乙胺(0.1m1)溶于3ml无水N，N-二甲基甲酰胺，氮气保护；冰浴，滴加化合物6(80mg，0.180mmol)的N，N-二甲基甲酰胺溶液(20m1)，滴加完毕，升温至室温，反应5小时；向反应液中加入水300ml和乙酸乙酯100ml萃取，取有机层，无水硫酸钠干燥后浓缩，柱层析纯化(洗脱剂：二氯甲烷/甲醇＝20/1+1％三乙胺)；得到类白色固体粉末20mg，收率35％。¹H NMR(300MHz，DMSO-d₆)δ11.49(s，1H)，9.12(s，1H)，8.67(s，1H)，8.40(s，1H)，8.23(s，1H)，8.19(d，J＝8.0Hz，2H)，7.99(d，J＝8.0Hz，3H)，7.91(d，J＝7.6Hz，2H)，7.74(s，1H)，7.64(d，J＝5.3Hz，2H)，7.49-7.28(m，4H)，7.19(s，1H)，3.30(d，J＝6.5Hz，2H)，3.09-3.01(m，4H)，2.92(s，1H)，2.86(q，J＝7.4Hz，2H)，2.76(s，1H)，2.07(q，J＝6.8Hz，2H)，1.77-1.72(m，1H)，1.57-1.49(m，4H)，1.47-1.37(m，2H)，1.35-1.30(m，4H)，1.29-1.21(m，2H).HRMS(ESI)：found 781.38063(C₄₅H₄₈N₈O₅[M+H]⁺，requires 781.37477).

(2)N1-(6-(1H-咪唑-1-基)咪唑并[1，2-a]吡啶-2-基)-N⁴-(6-(4-((5-(3，4-二甲氧基苯基)-1，2，4-噁二唑-3-基)甲基)苯甲酰胺基)己酰胺基)己基)对苯二甲酰胺(DDO-3712)的制备。

将化合物8a(20mg，0.0256mmol)溶于10ml乙酸乙酯中，加入1ml浓盐酸，室温反应3小时；浓缩反应液，加3ml乙酸乙酯打浆，抽滤；将得到的脱去保护基的氨基化合物直接投下一步。

将化合物7(7mg，0.0205mmol)、1-羟基苯并三唑(0.8mg，0.00592mmol)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(4.3mg，0.0224mmol)和4ml N，N-二甲基甲酰胺溶解，氮气保护；冰浴，滴加上述脱去保护基的氨基化合物的N，N-二甲基甲酰胺溶液(4ml)，滴加完毕，升温至室温，反应5小时；向反应液中加30ml水和10ml乙酸乙酯萃取，取有机层，无水硫酸钠干燥后浓缩，柱层析纯化(洗脱剂：二氯甲烷/甲醇(v/v)＝15/1+1％三乙胺)；得到类白色固体粉末12mg，收率52％。¹H NMR(300MHz，DMSO-d₆)δ11.47(s，1H)，9.11(s，1H)，8.64(t，J＝5.4Hz，1H)，8.44(t，J＝4.8Hz，1H)，8.39(s，1H)，8.23(s，1H)，8.18(d，J＝8.3Hz，2H)，7.98(d，J＝8.0Hz，2H)，7.83(d，J＝8.0Hz，2H)，7.73(s，1H)，7.65(s，1H)，7.63(d，J＝2.0Hz，1H)，7.54(d，J＝2.0Hz，1H)，7.44(d，J＝8.2Hz，2H)，7.19(s，1H)，4.23(s，2H)，3.88(s，3H)，3.87(s，3H)，2.04(m，4H)，1.80(s，1H)，1.80(s，2H)，1.61-1.45(m，8H)，1.27-1.25(m，10H).HRMS(ESI)：found 881.40954(C₄₈H₅₂N₁₀O₇[M+H]⁺，requires 881.40932).

(3)(9H-芴-9-基)甲基(8-((6-(4-((6-(1H-咪唑-1-基)咪唑并[1，2-a]吡啶-2-基)氨甲酰基)苯甲酰胺基)己基)氨基)-8-氧代辛基)氨基甲酸酯(8b)的制备。

本品由8-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)辛酸(28.53mg，0.0748mmol)和化合物6(100mg，0.225mmol)制得，制备方法同实施例5(1)，得到类白色固体粉末63mg，收率7l％。¹H NMR(500MHz，DMSO-d₆)δ9.11(s，1H)，8.63(s，1H)，8.40(s，1H)，8.22(s，1H)，8.18(d，J＝7.9Hz，2H)，7.99(d，J＝8.1Hz，2H)，7.89(dd，J＝21.7，7.5Hz，4H)，7.72(s，1H)，7.64(q，J＝9.6Hz，2H)，7.44(t，J＝7.4Hz，2H)，7.37(t，J＝7.4Hz，2H)，7.19(s，1H)，6.30(s，2H)，3.31(q，J＝6.8Hz，4H)，3.06(q，J＝6.6Hz，2H)，2.76(s，1H)，2.10-2.04(m，2H)，1.60-1.47(m，6H)，1.47-1.38(m，4H)，1.37-1.29(m，6H)，1.29-1.20(m，4H).HRMS(ESI)：found809.41286，831.39534(C₄₇H₅₂N₈O_s[M+H]⁺，[M+Na]⁺requires 809.40619，831.39529).

(4)N¹-(6-(1H-咪唑-1-基)咪唑并[1，2-a]吡啶-2-基)-N⁴-(6-(8-(4-((5-(3，4-二甲氧基苯基)-1，2，4-噁二唑-3-基)甲基)苯甲酰胺基)辛酰胺基)己基)对苯二甲酰胺(DDO-3713)的制备。

本品由化合物8b(55mg，0.068mmol)和化合物7(18mg，0.053mmol)制备得，制备方法同实施例5(2)，得到60mg类白色固体粉末，收率97％。

(5)(9H-芴-9-基)甲基(11-((6-(4-((6-(1H-咪唑-1-基)咪唑并[1，2-a]吡啶-2-基)氨甲酰基)苯甲酰胺基)己基)氨基)-11-氧代癸基)氨基甲酸酯(8c)的制备。

本品由11-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)十一酸(33.76mg，0.0798mmol)和化合物6(100mg，0.225mmol)制得，制备方法同实施例5(1)，得到类白色固体粉末63mg，收率71％。得到50mg类白色固体粉末，收率53％。¹H NMR(500MHz，DMSO-d₆)δ11.43(s，1H)，9.11(s，1H)，8.61(t，J＝5.5Hz，1H)，8.40(s，1H)，8.29(s，1H)，8.18(d，J＝8.1Hz，2H)，7.99(d，J＝8.2Hz，2H)，7.90(d，J＝7.4Hz，2H)，7.70(d，J＝7.9Hz，2H)，7.65(dd，2H)，7.43(t，J＝7.4Hz，2H)，7.34(t，J＝7.4Hz，2H)，7.23(s，1H)，5.33(s，1H)，3.14-3.08(m，4H)，3.07-3.03(m，2H)，2.98(q，J＝6.4Hz，2H)，2.05(t，J＝7.3Hz，2H)，1.56(t，J＝6.7Hz，2H)，1.53-1.46(m，2H)，1.45-1.38(m，4H)，1.36-1.30(m，4H)，1.25(s，12H).HRMS(ESI)：found，(C₅₀H₅₈N₈O₅[M+H]⁺，[M+Na]⁺requires).

(6)N¹-(6-(1H-咪唑-1-基)咪唑并[1，2-a]吡啶-2-基)-N⁴-(6-(8-(4-((5-(3，4-二甲氧基苯基)-1，2，4-噁二唑-3-基)甲基)苯甲酰胺基)辛酰胺基)己基)对苯二甲酰胺(DDO-3713)的制备。

本品由化合物8c(25mg，0.0299mmol)和化合物7(11.23mg，0.033mmol)制备得，制备方法同实施例5(2)，得到60mg类白色固体粉末，收率97％。得到类白色固体粉末30mg，收率83％。¹H NMR(300MHz，DMSO-d₆)δ11.48(s，1H)，9.11(s，1H)，8.65(s，1H)，8.45(s，1H)，8.40(s，1H)，8.23(s，1H)，8.18(d，J＝7.9Hz，2H)，7.99(d，J＝4.5Hz，4H)，7.83(d，J＝7.8Hz，2H)，7.64(d，J＝5.7Hz，2H)，7.54(s，1H)，7.44(d，J＝7.8Hz，2H)，7.20(s，1H)，4.23(s，1H)，3.88(s，6H)，3.31-3.23(m，4H)，3.04(s，2H)，2.92(s，2H)，2.76(s，2H)，2.07(t，J＝7.5Hz，2H)，1.62-1.46(m，8H)，1.45-1.35(m，4H)，1.36-1.27(m，8H)，1.26(s，4H).MS(ESI)：found 951.48，973.(C₅₃H₆₂N₁₀O₇[M+H]⁺，[M+Na]⁺requires 950.49，973.47).

实施例6

多肽类PHORCs(DDO-3704～10、DDO-3709R8)的制备

使用标准的Fmoc方法在0.55mmol规模的Rink Amide-MBHA树脂上制备线性肽。偶联反应由Fmoc-氨基酸砌块、DIC、HOBt在DMF中进行，反应50分钟。用20％哌啶的DMF溶液进行Fmoc脱保护步骤15分钟。使用TFA/H2O/EDT/Tis(95∶1∶2∶2，v/v/v/v)裂解肽树脂，20～25℃搅拌反应2小时。将裂解液滤出，采用5倍浓缩液体积量的冰乙醚将其沉淀，滤出沉淀物并于室温减压干燥，得粗品。将粗品研细，准备纯化水，在搅拌下缓慢加入研细粗品，同时滴加乙腈水溶液，待粗品加完并溶解完全后，用0.45μm的微孔滤膜过滤；粗品纯化采用岛津半制备并用5cm，10um，C-18柱填料，在常温下用合适梯度进行分离纯化，收集目标产物，分析检测，将合格主峰减压冷冻干燥，得到粉末状目标多肽。纯度＞95％。通过基质辅助激光解吸附电离/飞行时间(MALDI-TOF)质谱仪确认合成肽的分子量。

实施例7

磷酸酶酶活实验(pNPP法)

表1化合物对PP5酶活激活活性和ASK1酶活抑制活性结果

说明：化合物的结构见具体实施例。

如表1所示，实施例化合物对PP5均表现出激活活性。化合物浓度在30μM下，对PP5的激活活性范围在215％～538％，与阳性对照化合物TD8和PP5SA-1基本保持在一个水平。表明本专利实施例化合物保留了较强的PP5酶活激活活性。

其中，pNPP方法测试PP5酶活活性的操作方法如下：

首先配置含有100mM Tris，50mM NaC1，0.5mM MnCl2(pH＝8.0)的缓冲溶液50mL，用该缓冲溶液溶解待测化合物(DMSO含量小于10％)，PP5蛋白以及pNPP底物。使用96孔透明板，设置三个复孔，每孔加入50μLPP5蛋白溶液(15μM)，50μL化合物溶液(600μM)，最后加入50μL底物溶液(1mg/ml)；阴性对照孔中加入50μLPP5蛋白溶液，50μL抑制剂阳性药LB100溶液，50μL底物溶液；空白孔中加入50μLPP5蛋白溶液，50μL缓冲溶液，50μL底物溶液。将96孔板室温(25℃)孵育30min，使用酶标仪于波长405nm处扫描收集数据，结果使用GraphPad软件分析。

实施例8

ASK1酶活实验(ATP法)

如表1所示，测试结果表明实施例化合物DDO-3701～DDO-3703对ASK1酶活无抑制活性，实施例化合物DDO-3704～DDO-3710、DDO-3713对ASK1酶活微摩尔级别的抑制活性，DDO-3709R8、DDO-3711、DDO-3712和DDO-3714表现出对ASK1酶活纳摩尔级别的抑制活性。其中，DDO-3709R8和DDO-3711表现出最佳的ASK1酶活抑制活性。

其中，ATP方法测试ASK1酶活抑制活性的操作方法如下：

①配制1×Kinase buffer；②将测试化合物配置为20μM后，2倍稀释，10个浓度，3个复孔进行测试(测试过程使用384孔板)。③用1×Kinase buffer配制2倍终浓度的激酶溶液，配制ATP和底物的混合物溶液后开始反应。④加入ADP-Glo reagent，1000rpm离心30秒后振荡室温孵育120分钟；加入Kinase Detection Reagent，1000rpm离心30秒后振荡混匀室温孵育30分钟。⑤使用Envision酶标仪读取发光值RLU。

实施例9

Western blots测试PhoRCs分子对底物蛋白的去磷酸化活性

本发明实施例化合物对ASK1的去磷酸化作用如下：

如图1所示，测试结果表明DDO-3711以浓度依赖的方式去磷酸化ASK1。

其中，Western blots测试的操作方法如下：

Western-Blots实验参照标准实验流程。具体实验过程包括细胞给药、细胞裂解、总蛋白收集、制备聚丙烯酰胺凝胶、SDS-PAGE分析、一抗孵育、二抗孵育及结果扫描。实验中、测试ASK1和p-ASK1的表达量。

实施例10

MTT法测试PHORCs分子对胃癌细胞系MKN45及PP5敲除的MKN45细胞的细胞增殖抑制活性

如图2所示，PHORC分子DDO-3711的细胞增殖抑制活性优于ASK1小分子抑制剂TCASK10组及ASK1小分子抑制剂TCASK10和PP5激活剂P5SA-1联合用药组。此外，DDO-3711对MKN45细胞的抗增殖活性明显优于PP5敲除的MKN45细胞的抗增殖活性，表明DDO-3711靶向PP5作用。综上，测试结果表明实施例化合物靶向PP5作用且具有显著的抗肿瘤细胞增殖活性，并优于ASK1小分子抑制剂组和ASK1小分子抑制剂和PP5激活剂联合给药组。

其中，MTT法测试的操作方法如下：

取对数生长期细胞于96孔板中培养24h，每孔体积100μL(每孔细胞总量在1000-1200个肿瘤细胞)。24h后给药组加入含有不同浓度的化合物，化合物用相应的培养基稀释，每组设置5个浓度，3个复孔。对照组加入与实验组相同体积的培养基。随后置于细胞培养箱中培养，72h后弃去培养液，每孔加入200μL0.2％的MTT溶液。37℃孵箱孵育4h后弃去上清液，每孔加入150μL的DMSO溶液，轻度振荡后酶标仪读数(参考波长450nm、检测波长570nm条件下测定光密度值(OD值))。以培养基处理的肿瘤细胞为对照组，用以下公式计算化合物对肿瘤细胞的抑制率，并计算IC₅₀。

Claims (4)

1.一种结构式如式I所示的基于蛋白磷酸酶5的磷酸酶募集嵌合体化合物，其特征在于：

A-L-P

式I

其中：

A表示ASK1激酶的配体，L表示连接链，P表示蛋白磷酸酶PP5的配体；

A为式II-1或者式II-2所示结构式，

L为式III所示结构式，为以下任意结构之一，或者不存在：

其中：

n表示独立的1-11之间任意一个自然数；

x表示独立的1-11之间任意一个自然数，

P为式IV所示结构式，为以下任意结构之一：

其中，各个y表示独立的1-11之间任意一个自然数；

其中，T表示苏氨酸；

其中，S表示丝氨酸；

其中，R表示精氨酸；

其中，M表示甲硫氨酸；

其中，E表示谷氨酸；

其中，V表示缬氨酸；

其中，D表示天冬氨酸。

2.根据权利要求1所述的结构式如式I所示的基于蛋白磷酸酶5的磷酸酶募集嵌合体化合物，其特征在于：式I所示化合物的结构式为DDO-3701～DDO-3714、DDO-37-09R8任意结构之一：

3.权利要求1所述的结构式如式I所示的基于蛋白磷酸酶5的磷酸酶募集嵌合体化合物在制备治疗或预防肿瘤疾病的药物中的用途。

4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于：所述肿瘤疾病为胃癌、结肠癌、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、肾癌、胰腺癌、肝癌、急性骨髓性白血病或多发性骨髓瘤。

Images