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CN113025572A - 扩增培养基及其在nk细胞培养中的应用 - Google Patents

扩增培养基及其在nk细胞培养中的应用 Download PDF

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CN113025572A
CN113025572A CN202110382323.1A CN202110382323A CN113025572A CN 113025572 A CN113025572 A CN 113025572A CN 202110382323 A CN202110382323 A CN 202110382323A CN 113025572 A CN113025572 A CN 113025572A
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Taidong Zhenjiang Biotechnology Co ltd
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Abstract

本发明涉及细胞培养技术领域，具体而言，涉及一种扩增培养基及其在NK细胞培养中的应用。该培养基包括无血清培养基KBM 581以及添加于其中的添加剂；所述添加剂包括：聚乙烯吡咯烷酮5mg/mL～0mg/mL；黄芪多糖10mg/mL～40mg/mL；IL‑2 50U/mL～500U/mL；IL‑12 10U/mL～100U/mL；IL‑15 10U/mL～80U/mL；以及CD16单抗1μg/mL～6μg/mL。

Description

扩增培养基及其在NK细胞培养中的应用
技术领域
本发明涉及细胞培养技术领域，具体而言，涉及一种扩增培养基及其在NK细胞培养中的应用。
背景技术
免疫治疗在21世纪随着生命科学的发展蓬勃兴起，是现代生物医药的产业中发展最快的领域之一。NK细胞(自然杀伤细胞)是一种重要的免疫细胞，分布于外周血、脾脏、淋巴等组织。NK细胞在体内可以清除感染细胞、肿瘤细胞等异常细胞，切与其他免疫细胞不同，NK细胞不需要依靠免疫系统指令或其他细胞配合，自己即可识别、攻击异常细胞。但自然条件下NK细胞仅占外周血淋巴细胞的5％～15％，含量较低，在免疫治疗的临床使用上需要一种稳定的体外扩增技术，包括特定的培养基以及培养方法。
现有的NK细胞培养基多为基础细胞培养基添加细胞因子后在培养瓶中静置培养，受限于培养瓶培养方式导致细胞扩增数量少，效率低。也有使用生物反应器扩增NK细胞的尝试，但由于对细胞剪切力的应对方法不足，导致NK细胞容易受到搅拌桨叶和气泡破裂产生的细胞剪切力的伤害导致细胞死亡，影响培养效率和培养环境。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明主要解决现有的NK细胞体外扩增效率较低的问题，提供一种扩增培养基，以及使用该培养基有效于生物反应器高效体外扩增NK细胞的方法。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
根据本发明的第一方面，本发明涉及一种扩增培养基，其包括无血清培养基KBM581以及添加于其中的添加剂；
所述添加剂包括：
聚乙烯吡咯烷酮(polyvinyl pyrrolidone，PVP) 5mg/mL～10mg/mL；
黄芪多糖 10mg/mL～40mg/mL；
IL-2 50U/mL～500U/mL；
IL-12 10U/mL～100U/mL；
IL-15 10U/mL～80U/mL；以及
CD16单抗 1μg/mL～6μg/mL。
可选的，如上所述的扩增培养基，所述添加剂包括：
聚乙烯吡咯烷酮 6mg/mL～9mg/mL；
黄芪多糖 20mg/mL～30mg/mL；
IL-2 150U/mL～400U/mL；
IL-12 30U/mL～80U/mL；
IL-15 20U/mL～70U/mL；以及
CD16单抗 2μg/mL～5μg/mL。
可选的，如上所述的扩增培养基，所述添加剂包括：
聚乙烯吡咯烷酮 7mg/mL～8mg/mL；
黄芪多糖 22mg/mL～28mg/mL；
IL-2 200U/mL～350U/mL；
IL-12 40U/mL～70U/mL；
IL-15 30U/mL～60U/mL；以及
CD16单抗 2μg/mL～5μg/mL。
可选的，如上所述的扩增培养基，所述聚乙烯吡咯烷酮的平均分子量为250000～350000。
本发明的第二方面涉及一种组合产品，包含：
第一预培养培养基、第二预培养培养基、CD16单抗，以及如上任一项所述的扩增培养基；
其中所述第一预培养培养基为所述扩增培养基去除聚乙烯吡咯烷酮和CD16单抗后得到；
其中所述第二预培养培养基为所述扩增培养基去除聚乙烯吡咯烷酮后得到。
本发明的第三方面涉及NK细胞培养方法，包括：
a)将外周血单个核细胞接种于预先包被有CD16单抗的培养瓶中，所用培养基为如上所述的扩增培养基去除CD16单抗后得到，培养至第2～4天；
b)将培养基更换为所述扩增培养基，进行一次多次扩大培养；
c)将培养所得的细胞移入生物反应器中，利用所述扩增培养基进行放大培养。
可选的，如上所述的NK细胞培养方法，在步骤a)中，所述CD16单抗以1μg/mL～6μg/mL浓度的包被液进行包被。
可选的，如上所述的NK细胞培养方法，在步骤a)中，所述外周血单个核细胞的接种量为(1～3)×106个/mL。
可选的，如上所述的NK细胞培养方法，在步骤c)中，细胞移入生物反应器后的培养条件为：
溶氧量43％～47％，搅拌速度40rpm～60rpm。
可选的，如上所述的NK细胞培养方法，步骤c)还包括：
通过添加所述扩增培养基以控制反应器中的细胞密度不超过1×107个/mL。
本发明的有益效果为：
本发明所采用的特定培养基，能防止细胞为生物反应器培养时的剪切力所伤害，提高细胞收率，并且有效提升NK细胞比例。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明一个实施例中流式检测术对细胞表型的检测结果；
A对比例5；B对比例1；C实施例1。
具体实施方式
现将详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
本文中所使用的术语“含有”、“包含”和“包括”是同义词，其是包容性或开放式的，不排除额外的、未被引述的成员、元素或方法步骤。
本发明涉及扩增培养基，其包括无血清培养基KBM 581以及添加于其中的添加剂；
所述添加剂包括：
聚乙烯吡咯烷酮 5mg/mL～10mg/mL；
黄芪多糖 10mg/mL～40mg/mL；
IL-2 50U/mL～500U/mL；
IL-12 10U/mL～100U/mL；
IL-15 10U/mL～80U/mL；以及
CD16单抗 1μg/mL～6μg/mL。
本发明所采用的特定培养基，能防止细胞为生物反应器培养时的剪切力所伤害，提高细胞收率，并且有效提升NK细胞比例。
本发明所提供的扩增培养基可以是固体(例如冻干粉或喷雾干燥粉)或溶液；
当其为溶液时，通常以工作浓度或母液的形式被包装。在本发明中，“工作浓度”用于限定所述扩增培养基在培养NK细胞时主要活性组分的比例，所述扩增培养基中主要活性组分的浓度可以为工作浓度，也可以为能够稀释为该浓度的母液(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90或100倍浓缩的母液)。
在一些实施方式中，所述添加剂包括：
聚乙烯吡咯烷酮 6mg/mL～9mg/mL；
黄芪多糖 20mg/mL～30mg/mL；
IL-2 150U/mL～400U/mL；
IL-12 30U/mL～80U/mL；
IL-15 20U/mL～70U/mL；以及
CD16单抗 2μg/mL～5μg/mL。
在一些实施方式中，所述添加剂包括：
聚乙烯吡咯烷酮 7mg/mL～8mg/mL；
黄芪多糖 22mg/mL～28mg/mL；
IL-2 200U/mL～350U/mL；
IL-12 40U/mL～70U/mL；
IL-15 30U/mL～60U/mL；以及
CD16单抗 2μg/mL～5μg/mL。
在一些实施方式中，所述添加剂包括：
聚乙烯吡咯烷酮 7mg/mL～8mg/mL；
黄芪多糖 23mg/mL～27mg/mL；
IL-2 250U/mL～300U/mL；
IL-12 50U/mL～60U/mL；
IL-15 40U/mL～50U/mL；以及
CD16单抗 3μg/mL～4μg/mL。
在一些实施方式中，所述聚乙烯吡咯烷酮的平均分子量为250000～350000，也可以选择260000、270000、280000、290000。
根据本发明的再一方面，还涉及组合产品，其包含：
第一预培养培养基、第二预培养培养基、CD16单抗，以及如上所述的扩增培养基；
其中所述第一预培养培养基为所述扩增培养基去除聚乙烯吡咯烷酮和CD16单抗后得到；
其中所述第二预培养培养基为所述扩增培养基去除聚乙烯吡咯烷酮后得到。
组合产品中的各组分可以分别进行包装，优选CD16单抗为冻干粉包装。
根据本发明的再一方面，还涉及NK细胞培养方法，包括：
a)将外周血单个核细胞接种于预先包被有CD16单抗的培养瓶中，所用培养基为如上所述的扩增培养基去除CD16单抗后得到，培养至第2～4天；
b)将培养基更换为所述扩增培养基，进行一次多次扩大培养；
c)将培养所得的细胞移入生物反应器中，利用所述扩增培养基进行放大培养。
在一些实施方式中，在步骤a)中，所述CD16单抗以1μg/mL～6μg/mL浓度的包被液进行包被。也可以为2μg/mL、3μg/mL、4μg/mL、5μg/mL。
在一些实施方式中，在步骤a)中，所述外周血单个核细胞的接种量为(1～3)×106个/mL，也可以为2×106个/mL。
在一些实施方式中，在步骤c)中，细胞移入生物反应器后的培养条件为：
溶氧量43％～47％，搅拌速度40rpm～60rpm。
在一些实施方式中，在步骤c)中，细胞移入生物反应器后的培养条件为：
溶氧量45％～46％，搅拌速度45rpm～55rpm。
在一些实施方式中，在步骤c)中，细胞移入生物反应器后的培养条件为：
溶氧量40％，搅拌速度50rpm。
适用于本发明的生物反应器可以是任何溶剂，例如3L、5L、7L、10L、15L、20L、30L、40L、50L、100L、150L、300L、500L、1000L、3000L。
在一些实施方式中，步骤c)还包括：
通过添加所述扩增培养基以控制反应器中的细胞密度不超过1×107个/mL。
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。
在下述实施例中，所用PVP，黄芪多糖，IL-2，IL-12，IL-15，CD16和KBM581无血清培养基的商品信息为：
聚乙烯吡咯烷酮(PVP)(巴斯夫BASF)
黄芪多糖(上海皓元生物医药科技有限公司，HY-N0937)
IL-2，IL-12，IL-15，CD16(近岸蛋白质科技有限公司)
KBM 581培养基(康宁Corning，88-581-CM)
实施例1
将T25的培养瓶使用1mL磷酸盐缓冲液和3μg CD16单抗在37℃培养箱中包被过夜。
用肝素钠抗凝的采血管采集外周血，用Ficoll淋巴细胞分离液分离外周血中的单个核细胞。
使用磷酸盐缓冲液洗涤三次得到的细胞，使用添加上述黄芪多糖，IL-2，IL-12，IL-15的无血清培养基将细胞密度调整至2×106个/mL，5mL每瓶。
所述黄芪多糖在培养基中浓度为25mg/mL，IL-2在培养基中浓度为270U/mL，IL-12在培养基中浓度为55U/mL，IL-15在培养基中浓度为45U/mL。
Day 3后使用添加黄芪多糖，IL-2，IL-12，IL-15，CD16的KBM 581无血清培养基将体系扩大至20mL。
所述黄芪多糖在培养基中浓度为25mg/mL，IL-2在培养基中浓度为270U/mL，IL-12在培养基中浓度为55U/mL，IL-15在培养基中浓度为45U/mL，CD16在培养基中浓度3μg/mL。
继续培养并根据细胞生长情况分瓶，待细胞总体系体积达到400mL时，转入2L生物反应器，使用添加PVP，黄芪多糖，IL-2，IL-12，IL-15，CD16的KBM 581无血清培养基。
所述生物反应器的条件参数为37℃，5％CO2，溶氧量45％，搅拌速度50rpm，所述PVP的添加量为7mg/mL，黄芪多糖在培养基中浓度为25mg/mL，IL-2在培养基中浓度为270U/mL，IL-12在培养基中浓度为55U/mL，IL-15在培养基中浓度为45U/mL，CD16在培养基中浓度3μg/mL。
在生物反应器中继续培养14天，并依据细胞生长情况添加培养基，使反应器中细胞密度不超过1×107个/mL。
实施例2
将T25的培养瓶使用1mL磷酸盐缓冲液和6μg CD16单抗在37℃培养箱中包被过夜。
用肝素钠抗凝的采血管采集外周血，用Ficoll淋巴细胞分离液分离外周血中的单个核细胞。
使用磷酸盐缓冲液洗涤三次得到的细胞，使用添加上述黄芪多糖，IL-2，IL-12，IL-15的无血清培养基将细胞密度调整至2×106个/mL，5mL每瓶。
所述黄芪多糖在培养基中浓度为15mg/mL，IL-2在培养基中浓度为400U/mL，IL-12在培养基中浓度为20U/mL，IL-15在培养基中浓度为80U/mL。
Day 3后使用添加黄芪多糖，IL-2，IL-12，IL-15，CD16的KBM 581无血清培养基将体系扩大至20mL。
所述黄芪多糖在培养基中浓度为15mg/mL，IL-2在培养基中浓度为400U/mL，IL-12在培养基中浓度为20U/mL，IL-15在培养基中浓度为80U/mL CD16在培养基中浓度6μg/mL。
继续培养并根据细胞生长情况分瓶，待细胞总体系体积达到400mL时，转入2L生物反应器，使用添加PVP，黄芪多糖，IL-2，IL-12，IL-15，CD16的KBM 581无血清培养基。
所述生物反应器的条件参数为37℃，5％CO2，溶氧量45％，搅拌速度50rpm，所述PVP的添加量为10mg/mL，黄芪多糖在培养基中浓度为15mg/mL，IL-2在培养基中浓度为400U/mL，IL-12在培养基中浓度为20U/mL，IL-15在培养基中浓度为80U/mL，CD16在培养基中浓度6μg/mL。
在生物反应器中继续培养14天，并依据细胞生长情况添加培养基，使反应器中细胞密度不超过1×107个/mL。
实施例3
将T25的培养瓶使用1mL磷酸盐缓冲液和2μg CD16单抗在37℃培养箱中包被过夜。
用肝素钠抗凝的采血管采集外周血，用Ficoll淋巴细胞分离液分离外周血中的单个核细胞。
使用磷酸盐缓冲液洗涤三次得到的细胞，使用添加上述黄芪多糖，IL-2，IL-12，IL-15的无血清培养基将细胞密度调整至2×106个/mL，5mL每瓶。
所述黄芪多糖在培养基中浓度为35mg/mL，IL-2在培养基中浓度为100U/mL，IL-12在培养基中浓度为90U/mL，IL-15在培养基中浓度为20U/mL。
Day 3后使用添加黄芪多糖，IL-2，IL-12，IL-15，CD16的KBM 581无血清培养基将体系扩大至20mL。
所述黄芪多糖在培养基中浓度为35mg/mL，IL-2在培养基中浓度为100U/mL，IL-12在培养基中浓度为90U/mL，IL-15在培养基中浓度为20U/mL，CD16在培养基中浓度2μg/mL。
继续培养并根据细胞生长情况分瓶，待细胞总体系体积达到400mL时，转入2L生物反应器，使用添加PVP，黄芪多糖，IL-2，IL-12，IL-15，CD16的KBM 581无血清培养基。
所述生物反应器的条件参数为37℃，5％CO2，溶氧量45％，搅拌速度50rpm，所述PVP的添加量为5mg/mL，所述黄芪多糖在培养基中浓度为35mg/mL，IL-2在培养基中浓度为100U/mL，IL-12在培养基中浓度为90U/mL，IL-15在培养基中浓度为20U/mL，CD16在培养基中浓度2μg/mL。
在生物反应器中继续培养14天，并依据细胞生长情况添加培养基，使反应器中细胞密度不超过1×107个/mL。
对比例1
按照实施例1方法收集单个核细胞，使用添加黄芪多糖，IL-2，IL-12，IL-15的KBM581无血清培养基调整细胞浓度至1×106个/mL，5mL每瓶。
所述黄芪多糖在培养基中浓度为25mg/mL，IL-2在培养基中浓度为270U/mL，IL-12在培养基中浓度为55U/mL，IL-15在培养基中浓度为45U/mL。
Day 3后使用添加黄芪多糖，IL-2，IL-12，IL-15，CD16的KBM 581无血清培养基将体系扩大至20mL。
所述黄芪多糖在培养基中浓度为25mg/mL，IL-2在培养基中浓度为270U/mL，IL-12在培养基中浓度为55U/mL，IL-15在培养基中浓度为45U/mL，CD16在培养基中浓度3μg/mL。
继续培养并根据细胞生长情况分瓶，待细胞总体系体积达到400mL时，转入2L生物反应器，使用添加黄芪多糖，IL-2，IL-12，IL-15，CD16的KBM 581无血清培养基。
所述生物反应器的条件参数为37℃，5％CO2，溶氧量45％，搅拌速度50rpm，所述黄芪多糖在培养基中浓度为25mg/mL，IL-2在培养基中浓度为270U/mL，IL-12在培养基中浓度为55U/mL，IL-15在培养基中浓度为45U/mL，CD16在培养基中浓度3μg/mL。
在生物反应器中继续培养14天，并依据细胞生长情况添加培养基，使反应器中细胞密度不超过1×107个/mL。
对比例2
按照实施例1方法收集单个核细胞，使用添加IL-2，IL-12，IL-15的KBM 581无血清培养基调整细胞浓度至1×106个/mL，5mL每瓶。
所述IL-2在培养基中浓度为270U/mL，IL-12在培养基中浓度为55U/mL，IL-15在培养基中浓度为45U/mL。
Day 3后使用添加IL-2，IL-12，IL-15，CD16的KBM 581无血清培养基将体系扩大至20mL。
所述IL-2在培养基中浓度为270U/mL，IL-12在培养基中浓度为55U/mL，IL-15在培养基中浓度为45U/mL，CD16在培养基中浓度3μg/mL。
继续培养并根据细胞生长情况分瓶，待细胞总体系体积达到400mL时，转入2L生物反应器，使用添加PPV，IL-2，IL-12，IL-15，CD16的KBM 581无血清培养基。
所述生物反应器的条件参数为37℃，5％CO2，溶氧量45％，搅拌速度50rpm，所述PVP的添加量为7mg/mL，IL-2在培养基中浓度为270U/mL，IL-12在培养基中浓度为55U/mL，IL-15在培养基中浓度为45U/mL，CD16在培养基中浓度3μg/mL。
在生物反应器中继续培养14天，并依据细胞生长情况添加培养基，使反应器中细胞密度不超过1×107个/mL。
对比例3
按照实施例1方法收集单个核细胞，使用添加黄芪多糖，IL-2，IL-12，IL-15的KBM581无血清培养基调整细胞浓度至1×106个/mL，5mL每瓶。
所述黄芪多糖在培养基中浓度为5mg/mL，IL-2在培养基中浓度为270U/mL，IL-12在培养基中浓度为55U/mL，IL-15在培养基中浓度为45U/mL。
Day 3后使用添加黄芪多糖，IL-2，IL-12，IL-15，CD16的KBM 581无血清培养基将体系扩大至20mL。
所述黄芪多糖在培养基中浓度为5mg/mL，IL-2在培养基中浓度为270U/mL，IL-12在培养基中浓度为55U/mL，IL-15在培养基中浓度为45U/mL，CD16在培养基中浓度3μg/mL。
继续培养并根据细胞生长情况分瓶，待细胞总体系体积达到400mL时，转入2L生物反应器，使用添加PVP，黄芪多糖，IL-2，IL-12，IL-15，CD16的KBM 581无血清培养基。
所述生物反应器的条件参数为37℃，5％CO2，溶氧量45％，搅拌速度50rpm，所述PVP在培养基中浓度为3mg/mL，黄芪多糖在培养基中浓度为5mg/mL，IL-2在培养基中浓度为270U/mL，IL-12在培养基中浓度为55U/mL，IL-15在培养基中浓度为45U/mL，CD16在培养基中浓度3μg/mL。
在生物反应器中继续培养14天，并依据细胞生长情况添加培养基，使反应器中细胞密度不超过1×107个/mL。
对比例4
按照实施例1方法收集单个核细胞，使用添加黄芪多糖，IL-2，IL-12，IL-15的KBM581无血清培养基调整细胞浓度至1×106个/mL，5mL每瓶。
所述黄芪多糖在培养基中浓度为60mg/mL，IL-2在培养基中浓度为270U/mL，IL-12在培养基中浓度为55U/mL，IL-15在培养基中浓度为45U/mL。
Day 3后使用添加黄芪多糖，IL-2，IL-12，IL-15，CD16的KBM 581无血清培养基将体系扩大至20mL。
所述黄芪多糖在培养基中浓度为60mg/mL，IL-2在培养基中浓度为270U/mL，IL-12在培养基中浓度为55U/mL，IL-15在培养基中浓度为45U/mL，CD16在培养基中浓度3μg/mL。
继续培养并根据细胞生长情况分瓶，待细胞总体系体积达到400mL时，转入2L生物反应器，使用添加PVP，黄芪多糖，IL-2，IL-12，IL-15，CD16的KBM 581无血清培养基。
所述生物反应器的条件参数为37℃，5％CO2，溶氧量45％，搅拌速度50rpm，所述PVP在培养基中浓度为20mg/mL，黄芪多糖在培养基中浓度为60mg/mL，IL-2在培养基中浓度为270U/mL，IL-12在培养基中浓度为55U/mL，IL-15在培养基中浓度为45U/mL，CD16在培养基中浓度3μg/mL。
在生物反应器中继续培养14天，并依据细胞生长情况添加培养基，使反应器中细胞密度不超过1×107个/mL。
对比例5
按照实施例1方法收集单个核细胞，使用添加黄芪多糖，IL-2，IL-12，IL-15的KBM581无血清培养基调整细胞浓度至1×106个/mL，5mL每瓶。
所述黄芪多糖在培养基中浓度为25mg/mL，IL-2在培养基中浓度为270U/mL，IL-12在培养基中浓度为55U/mL，IL-15在培养基中浓度为45U/mL。
Day 3后使用添加黄芪多糖，IL-2，IL-12，IL-15，CD16的KBM 581无血清培养基将体系扩大至20mL。
所述黄芪多糖在培养基中浓度为25mg/mL，IL-2在培养基中浓度为270U/mL，IL-12在培养基中浓度为55U/mL，IL-15在培养基中浓度为45U/mL，CD16在培养基中浓度3μg/mL。
继续培养并根据细胞生长情况分瓶，待细胞总体系体积达到400mL时，继续培养14天，使用添加PVP，黄芪多糖，IL-2，IL-12，IL-15，CD16的KBM 581无血清培养基。
所述PVP的添加量为7mg/mL，黄芪多糖在培养基中浓度为25mg/mL，IL-2在培养基中浓度为270U/mL，IL-12在培养基中浓度为55U/mL，IL-15在培养基中浓度为45U/mL，CD16在培养基中浓度3μg/mL。
依据细胞生长情况分瓶，使每瓶中细胞密度不超过1×107个/mL。
表1细胞数对比
Figure BDA0003013441240000131
本实验在探讨一种NK细胞培养基和培养方法.
通过对比实施例1～4，可得出添加并且在本方法要求的浓度范围内添加PVP、黄芪多糖对于NK细胞的扩增有明显的正面效果。对比实施例5说明按照本方法使用生物反应器对NK细胞培养有明显提升效果。
表2细胞表型对比
Figure BDA0003013441240000132
1.通过效果实施例方法培养的NK细胞，初始细胞数为5*106，最终收获细胞1.03*109可以增殖201倍以上，加大初始培养量，可以满足临床使用细胞数量。
2.通过效果实施例方法培养的NK细胞，流式检测结果(图1、表2)，CD3-CD56+NK细胞比例为94.62％，CD4+CD25+Treg细胞比例为1.23％，NK细胞比例正常，免疫抑制细胞比例很低，可以满足临床使用标准。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.扩增培养基，其特征在于，包括无血清培养基KBM 581以及添加于其中的添加剂；
所述添加剂包括：
聚乙烯吡咯烷酮 5mg/mL～10mg/mL；
黄芪多糖 10mg/mL～40mg/mL；
IL-2 50U/mL～500U/mL；
IL-12 10U/mL～100U/mL；
IL-15 10U/mL～80U/mL；以及
CD16单抗 1μg/mL～6μg/mL。
2.根据权利要求1所述的扩增培养基，其特征在于，所述添加剂包括：
聚乙烯吡咯烷酮 6mg/mL～9mg/mL；
黄芪多糖 20mg/mL～30mg/mL；
IL-2 150U/mL～400U/mL；
IL-12 30U/mL～80U/mL；
IL-15 20U/mL～70U/mL；以及
CD16单抗 2μg/mL～5μg/mL。
3.根据权利要求2所述的扩增培养基，其特征在于，所述添加剂包括：
聚乙烯吡咯烷酮 7mg/mL～8mg/mL；
黄芪多糖 22mg/mL～28mg/mL；
IL-2 200U/mL～350U/mL；
IL-12 40U/mL～70U/mL；
IL-15 30U/mL～60U/mL；以及
CD16单抗 2μg/mL～5μg/mL。
4.根据权利要求1～3任一项所述的扩增培养基，其特征在于，所述聚乙烯吡咯烷酮的平均分子量为250000～350000。
5.组合产品，其特征在于，包含：
第一预培养培养基、第二预培养培养基、CD16单抗，以及权利要求1～4任一项所述的扩增培养基；
其中所述第一预培养培养基为所述扩增培养基去除聚乙烯吡咯烷酮和CD16单抗后得到；
其中所述第二预培养培养基为所述扩增培养基去除聚乙烯吡咯烷酮后得到。
6.NK细胞培养方法，其特征在于，包括：
a)将外周血单个核细胞接种于预先包被有CD16单抗的培养瓶中，所用培养基为权利要求5中所述的第一预培养培养基，培养至第2～4天；
b)将培养基更换为所用培养基为权利要求5中所述的第二预培养培养基，，进行一次多次扩大培养；
c)将培养所得的细胞移入生物反应器中，利用权利要求1～4任一项所述的扩增培养基进行放大培养。
7.根据权利要求6所述的NK细胞培养方法，其特征在于，在步骤a)中，所述CD16单抗以1μg/mL～6μg/mL浓度的包被液进行包被。
8.根据权利要求6所述的培养方法，其特征在于，在步骤a)中，所述外周血单个核细胞的接种量为(1～3)×106个/mL。
9.根据权利要求6所述的培养方法，其特征在于，在步骤c)中，细胞移入生物反应器后的培养条件为：
溶氧量43％～47％，搅拌速度40rpm～60rpm。
10.根据权利要求6所述的培养方法，其特征在于，步骤c)还包括：
通过添加所述扩增培养基以控制反应器中的细胞密度不超过1×107个/mL。
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