KR102490149B1

KR102490149B1 - 세균 균체의 제조 방법

Info

Publication number: KR102490149B1
Application number: KR1020207010238A
Authority: KR
Inventors: 야스유키 모리시타
Original assignee: 가부시키가이샤 에스디에스 바이오텍크
Priority date: 2017-09-25
Filing date: 2018-09-25
Publication date: 2023-01-18
Anticipated expiration: 2038-09-25
Also published as: WO2019059396A1; CA3076989C; KR20200057018A; US11377632B2; TW201920650A; MX2020003295A; EP3690025A1; EP3690025A4; CN111133098A; TWI757549B; CN111133098B; JP2019058083A; CA3076989A1; US20200277564A1; JP6996680B2; BR112020005845B1; BR112020005845A2; MX390840B; BR112020005845B8

Abstract

본 발명은, 세균의 다단계의 액체 배양 공정에 있어서, 최종단보다 앞의 단에서 항생 물질을 함유하는 액체 배지에서 세균을 배양하고, 최종단에서 항생 물질 농도를 당해 앞의 단보다 저하시켜 배양하는 공정을 포함하는, 세균 균체의 제조 방법을 제공한다. 이로써, 배양 후에 얻어지는 세균에 있어서의 이상형 콜로니를 형성하는 변이 개체의 출현을 억제하면서, 양호한 생산성으로 세균 균체를 제조할 수 있다.

Description

세균 균체의 제조 방법

본 발명은, 세균의 다단계의 액체 배양 중에 발생할 수 있는, 이상형 콜로니를 형성하는 변이 개체의 발생 및 증식을 억제하면서, 양호한 생산성으로 세균 균체를 제조하는 방법에 관한 것이다.

세균은, 효소나 유용 물질의 생산, 발효 식품의 생산, 유기물의 분해, 정장제, 미생물 농약, 미생물 비료 등, 여러 가지의 분야에 이용되고 있다.

어느 분야에서도 균체를 조제하기 위하여 세균의 배양을 실시할 필요가 있는데, 콜로니 형태에 이상을 나타내는 변이 개체가 배양 중에 출현하여, 본래의 성질을 가진 개체와 비교하여 우위로 증식함으로써, 배양 종료 후의 균체에 있어서는 본래의 유용한 성질이 손상된 케이스가 존재한다.

예를 들어, 비특허문헌 1 에 있어서, 바실루스 (Bacillus) 속 세균의 액체 배지에서의 수천 세대의 계대 배양 중에, 콜로니 형태 등에 이상을 나타내는 변이 개체가 출현하여, 본래의 개체에 우선하여 증식함으로써, 완전히 치환되어 버리는 현상이 관찰되고 있다. 이와 같은 현상은, 특정한 배양 환경에 특화하여 불필요한 대사계를 탈락시킨 변이 개체가, 본래의 개체보다 우위로 증식함으로써 발생하는 것으로 추측된다.

비특허문헌 2 에 있어서는, 바실루스·서브틸리스 916 (Bacillus subtilis 916) 주의 바실로마이신 L (Bacillomycin L) 과 수팩틴 (Surfactin) 의 생합성능 결손 변이주가, 야생형주와 다른 콜로니 형태를 나타내는 것이 나타내어져 있다. 바실로마이신 L 및 수팩틴은 일부의 식물 병해에 대해 방제 효과를 나타내는 것이 알려져 있고, 콜로니 형태의 변이와 유용한 성질의 상실이 링크되어 있는 예로 생각된다.

또, 비특허문헌 3 에 있어서는, 바실루스·서브틸리스 G3 (Bacillus subtilis G3) 주의 항균 활성 강화를 위한 육종에 있어서, 친주와 콜로니 형태가 변화한 주에 있어서, 이투린 A (Itulin A) 의 생산량이 증가한 예가 나타내어져 있다.

비특허문헌 4 에 있어서는, 아네우리니바실러스 미굴라너스 ATCC9999 (Aneurinibacillus migulanus (구분류 Bacillus brevis) ATCC9999) 주에 대해, 컬쳐 콜렉션 보관주로부터 6 타입의 콜로니 형태가 검출된 것, 및 그들의 그라미시딘 S (Gramicidin S) 생산성이 상이한 것이 나타내어져 있다.

비특허문헌 5 에 있어서는, 바실루스·서브틸리스 VT30M (Bacillus subtilis VT30M) 주 및 바실루스 리체니포르미스 VT3 (Bacillus licheniformis VT3) 주의 콜로니 형태 변이주가, 야생형과 비교하여 상이한 효소 생산성이나 항생 물질 내성을 나타낸 예가 나타내어져 있다.

Biotechnology progress 2005, 21, 4, 1026-1031 Appl. Microbiol. Biotechnol. 2015, 99, 4, 1897-1910 Zhiwu Bingli Xuebao 2008, 38, 2, 185-191 Appl. Environ. Microbiol. 2007, 73, 20, 6620-6628 Appl. Environ. Microbiol. 1989, 55, 3026-3028

상기와 같이, 세균의 액체 배양에 있어서, 특히, 다단계 배양을 실시하는 경우에 있어서, 콜로니 형태에 이상을 나타내는 변이 개체가 배양 중에 출현하고, 본래의 성질을 가진 개체와 비교하여 우위로 증식함으로써, 배양 종료 후의 균체에 있어서 본래의 유용한 성질이 손상된 케이스가 존재한다는 문제가 있지만, 이와 같은 현상을 억제하기 위한 효과적인 기술은 지금까지 보고가 없었다.

따라서, 본 발명에서는, 세균의 다단계의 액체 배양 공정에 있어서, 배양 후에 얻어지는 세균에 있어서의 콜로니 형태에 이상을 나타내는 변이 개체의 출현을 억제하면서, 양호한 생산성으로 세균 균체를 제조하기 위한 새로운 방법을 제공하는 것을 과제로 한다.

본 발명자는 상기 과제를 해결하기 위해서 예의 검토를 실시한 결과, 세균의 다단계의 액체 배양 공정에 있어서, 최종단보다 앞의 단에서 항생 물질을 함유하는 배지를 사용하여 배양하고, 최종단에서는 항생 물질의 농도를 앞의 단보다 저하시켜 배양함으로써, 배양 종료 후에 얻어지는 세균 집단에 있어서의 콜로니 형태에 이상을 나타내는 변이 개체의 출현을 현저하게 저감시키면서, 양호한 생산성으로 세균 균체를 제조할 수 있는 것을 알아내어, 본 발명을 완성시키기에 이르렀다.

본 발명은 이하와 같다.

[1] 세균의 다단계의 액체 배양 공정에 있어서, 최종단보다 앞의 단에서 항생 물질을 함유하는 액체 배지에서 세균을 배양하고, 최종단에서 항생 물질의 농도를 당해 앞의 단보다 저하시켜 배양하는 공정을 포함하는, 세균 균체의 제조 방법.

[2] 세균이 아포 형성 세균인, [1] 에 기재된 방법.

[3] 아포 형성 세균이 바실루스 (Bacillus) 속 세균인, [2] 에 기재된 방법.

[4] 아포 형성 세균이, 바실루스·서브틸리스 (Bacillus subtilis), 바실루스·아밀로리퀴파시엔스 (Bacillus amyloliquefaciens), 바실루스·푸밀러스 (Bacillus pumilus), 바실루스·심플렉스 (Bacillus simplex), 바실루스 렌투스 (Bacillus lentus), 바실루스 라테로스포러스 (Bacillus laterosporus), 바실루스 알베이 (Bacillus alvei), 바실루스·포필리에 (Bacillus popilliae), 바실루스·리케니포르미스 (Bacillus licheniformis), 바실루스·브레비스 (Bacillus brevis), 바실루스·스테아로서모필러스 (Bacillus stearothermophilus), 바실루스·알칼로필러스 (Bacillus alcalophilus), 바실루스·코아굴란스 (Bacillus coagulans), 바실루스·서쿨란스 (Bacillus circulans), 바실루스·사이아멘시스 (Bacillus siamensis), 바실루스 로터스 (Bacillus lautus), 바실루스 클라우시 (Bacillus clausii), 바실루스·메가테륨 (Bacillus megaterium), 바실루스·투링기엔시스 (Bacillus thuringiensis), 바실루스·세레우스 (Bacillus cereus), 바실루스·퍼머스 (Bacillus firmus), 바실루스·벨레젠시스 (Bacillus velezensis), 바실루스·피치노티 (Bacillus pichinotyi), 바실루스·아시도칼다리우스 (Bacillus acidocaldarius), 바실루스·알칼리콜라 (Bacillus alkalicola), 바실루스·아조토포르만스 (Bacillus azotoformans), 바실루스·안트라시스 (Bacillus anthracis), 바실루스·바디우스 (Bacillus badius), 바실루스·바타비엔시스 (Bacillus bataviensis), 바실루스·시클로헵타니커스 (Bacillus cycloheptanicus), 바실루스·아네우리닐리티커스 (Bacillus aneurinilyticus), 바실루스·미굴라너스 (Bacillus migulanus), 바실루스·아비살리스 (Bacillus abyssalis), 바실루스·에스투아리 (Bacillus aestuarii), 바실루스·폴리믹싸 (Bacillus polymyxa) 및 바실루스·에스피 (Bacillus sp.) 로 이루어지는 군에서 선택되는, [3] 에 기재된 방법.

[5] 항생 물질이, 스트렙토마이신, 린코마이신, 에리트로마이신, 리팜피신, 클로람페니콜, 악티노마이신, 푸시딘산, 리피아마이신, 퓨로마이신, 스펙티노마이신, 테트라시클린 및 티오스트렙톤으로 이루어지는 군에서 선택되는 1 종류 이상인, [1] ∼ [4] 중 어느 하나에 기재된 방법.

[6] 항생 물질이 스트렙토마이신인, [5] 에 기재된 방법.

[7] 상기 최종단보다 앞의 단의 액체 배지에 있어서의 항생 물질의 농도가 0.001 ppm ∼ 10,000 ppm 인, [1] ∼ [6] 중 어느 하나에 기재된 방법.

[8] 상기 최종단보다 앞의 단의 액체 배지에 있어서의 항생 물질의 농도가 1.0 ∼ 90 ppm 인, [1] ∼ [6] 중 어느 하나에 기재된 방법.

[9] 세균의 다단계의 액체 배양 공정에 있어서, 최종단보다 앞의 단에서 항생 물질을 함유하는 액체 배지에서 세균을 배양하고, 최종단에서 항생 물질의 농도를 당해 앞의 단보다 저하시켜 배양하는 공정을 포함하는, 이상형 콜로니를 형성하는 변이 개체의 출현을 저감시킨 세균의 배양 방법.

[10] 세균의 다단계의 액체 배양 공정에 있어서, 최종단보다 앞의 단에서 항생 물질을 함유하는 액체 배지에서 세균을 배양하고, 최종단에서 항생 물질의 농도를 당해 앞의 단보다 저하시켜 배양하는 공정을 포함하는, 세균의 액체 배양 중의 이상형 콜로니를 형성하는 변이 개체의 출현 및 증식을 억제하는 방법.

본 발명에 의하면, 다단계 배양에서 사용하는 배지 중에 항생 물질을 함유시켜 세균을 배양하고, 최종단에서 항생 물질의 양을 저하시켜 세균을 배양함으로써, 세균의 액체 배양 종료시점의 콜로니 형태에 이상을 나타내는 변이 개체의 비율을 저하시키면서, 양호한 생산성으로 세균 균체를 제조할 수 있다. 콜로니 형태에 이상을 나타내는 변이 개체는 바람직한 성질을 상실하고 있을 가능성이 높기 때문에, 이와 같은 변이 개체를 저감시킴으로써, 배양에 의해 얻어진 세균 균체를 효소나 유용 물질의 생산, 발효 식품의 생산, 유기물의 분해, 정장제, 미생물 농약이나 미생물 비료 등의 용도에 바람직한 상태로 사용할 수 있다.

도 1 은, 이상형 콜로니의 형태의 일례를 나타내는 도면이다 (사진). 이상형 콜로니를 ○ 로 나타낸다.

본 발명에 있어서, 세균의 종류는 액체 배양할 수 있고, 고체 배지 상에서 콜로니를 형성하는 것이면 특별히 제한되지 않고, 그램 양성 세균이어도 되고 그램 음성 세균이어도 되지만, 예를 들어, 에세리키아 (Escherichia) 속 세균, 시겔라 (Shigella) 속 세균, 살모네라균 (Salmonella) 속 세균, 클렙시엘라 (Klebsiella) 속 세균, 에르시니아 (Yersinia) 속 세균, 엔테로박터 (Enterobacter) 속 세균, 슈도모나스 (Pseudomonas) 속 세균, 브루셀라 (Brucella) 속 세균, 스테필로코커스 (Staphylococcus) 속 세균, 스트렙토코커스 (Streptococcus) 속 세균, 스트렙토미세스 (Streptomyces) 속 세균, 로도코커스 (Rhodococcus) 속 세균, 아세토박테륨 (Acetobacterium) 속 세균, 메타노박테륨 (Methanobacterium) 속 세균, 엔테로코커스 (Enterococcus) 속 세균, 바실루스 (Bacillus) 속 세균, 클로스트리듐 (Clostridium) 속 세균, 코리네박테륨 (Corynebacterium) 속 세균, 마이코박테륨 (Mycobacterium) 속 세균 등을 들 수 있다.

이 중에서는, 바실루스속 세균, 패니바실루스속 세균, 지오바실루스속 세균, 클로스트리듐속, 스포로사르시나속 등의 아포 형성 세균이 보다 바람직하다.

바실루스속 세균으로는 바실루스속으로 분류되는 세균이면 특별히 제한되지 않지만, 예를 들어, 바실루스·서브틸리스 (Bacillus subtilis), 바실루스·아밀로리퀴파시엔스 (Bacillus amyloliquefaciens), 바실루스·푸밀러스 (Bacillus pumilus), 바실루스·심플렉스 (Bacillus simplex), 바실루스 렌투스 (Bacillus lentus), 바실루스 라테로스포러스 (Bacillus laterosporus), 바실루스 알베이 (Bacillus alvei), 바실루스·포필리에 (Bacillus popilliae), 바실루스·리케니포르미스 (Bacillus licheniformis), 바실루스·브레비스 (Bacillus brevis), 바실루스·스테아로서모필러스 (Bacillus stearothermophilus), 바실루스·알칼로필러스 (Bacillus alcalophilus), 바실루스·코아굴란스 (Bacillus coagulans), 바실루스·서쿨란스 (Bacillus circulans), 바실루스·사이아멘시스 (Bacillus siamensis), 바실루스 로터스 (Bacillus lautus), 바실루스 클라우시 (Bacillus clausii), 바실루스·메가테륨 (Bacillus megaterium), 바실루스·투링기엔시스 (Bacillus thuringiensis), 바실루스·세레우스 (Bacillus cereus), 바실루스·퍼머스 (Bacillus firmus), 바실루스·벨레젠시스 (Bacillus velezensis), 바실루스·피치노티 (Bacillus pichinotyi), 바실루스·아시도칼다리우스 (Bacillus acidocaldarius), 바실루스·알칼리콜라 (Bacillus alkalicola), 바실루스·아조토포르만스 (Bacillus azotoformans), 바실루스·안트라시스 (Bacillus anthracis), 바실루스·바디우스 (Bacillus badius), 바실루스·바타비엔시스 (Bacillus bataviensis), 바실루스·시클로헵타니커스 (Bacillus cycloheptanicus), 바실루스·아네우리닐리티커스 (Bacillus aneurinilyticus), 바실루스·미굴라너스 (Bacillus migulanus), 바실루스·아비살리스 (Bacillus abyssalis), 바실루스·에스투아리 (Bacillus aestuarii), 바실루스·폴리믹싸 (Bacillus polymyxa), 또는 바실루스·에스피 (Bacillus sp.) 를 들 수 있다.

패니바실루스속 세균으로는, 파에니바실루스·마세란스 (Paenibacillus macerans), 파에니바실루스·아밀로리티커스 (Paenibacillus amylolyticus), 파에니바실루스·페오리아테 (Paenibacillus peoriate), 파에니바실루스·엘기 (Paenibacillus elgii) 등을 들 수 있다.

지오바실루스속 세균으로는, 지오바실루스·서모글루코시다시어스 (Geobacillus thermoglucosidasius), 지오바실루스·칼독실로실리티커스 (Geobacillus caldoxylosilyticus), 지오바실루스·스테아로서모필러스 (Geobacillus stearothermophilus) 등을 들 수 있다.

클로스트리듐속 세균으로는, 클로스트리듐·부틸리쿰 (Clostridium butyricum), 클로스트리듐·클루이베리 (Clostridium kluyveri), 클로스트리듐·아세토부틸리쿰 (Clostridium acetobutylicum), 클로스트리듐·아미노부틸리쿰 (Clostridium aminobutyricum), 클로스트리듐·베이저린키이 (Clostridium beijerinckii), 클로스트리듐·사카로퍼부틸아세토니쿰 (Clostridium saccharoperbutylacetonicum), 클로스트리듐·서모셀럼 (Clostridium thermocellum), 클로스트리듐·융달리 (Clostridium ljungdahlii), 클로스트리듐·보툴리눔 (Clostridium botulinum) 등을 들 수 있다.

스포로사르시나속 세균으로는, 스포로사르시나·파스테우리 (Sporosarcina pasteurii), 스포로사르시나·우레아에 (Sporosarcina ureae), 스포로사르시나·사이크로필라 (Sporosarcina psychrophila), 스포로사르시나·서모톨레란스 (Sporosarcina thermotolerans) 등을 들 수 있다.

본 발명 방법에 있어서 배양되는 세균은, 비유전자 조작 세균이어도 되고, 유전자 조작 세균이어도 되지만, 항생 물질 내성 유전자를 함유하지 않는 세균인 것이 바람직하다.

또, 본 발명 방법에 있어서 배양되는 세균은 야생형이어도 되고 변이형이어도 되지만, 후자의 경우여도, 항생 물질 내성 변이는 갖지 않는 세균인 것이 바람직하다.

본 발명의 세균 균체의 제조 방법 및 세균의 배양 방법은, 세균을, 항생 물질을 함유하는 액체 배지에서 배양하는 공정을 포함한다.

액체 배지는, 배양 대상의 세균의 종류에 따라 적절히 선택할 수 있고, 세균의 배양에 적합한 농도의, 탄소원 및 질소원 등의 배지 성분을 함유한 일반적인 액체 배지를 사용할 수 있다.

예를 들어, 탄소원으로는, 당 (전분, 글루코오스, 락토오스, 글리세롤, 아라비노오스, 리보스, 자일로오스, 갈락토오스, 프룩토오스, 만노오스, 이노시톨, 만니톨, 소르비톨, 글루코사민, N-아세틸글루코사민, 셀로비오스, 말토오스, 수크로오스, 트레할로오스, 자일리톨 등) 혹은 당원 원료, 알코올, 유기산, 유기산염, 알칸 또는 다른 일반적인 탄소원이 예시되고, 질소원으로는, 대두 유래 성분, 효모 유래 성분, 콘 유래 성분, 동식물 단백질 및 그 분해물, 질산암모늄, 황산암모늄, 염화암모늄, 아세트산암모늄 등의 암모늄염, 암모니아, 질산나트륨, 질산칼륨, 글루타민산나트륨, 우레아 등이 예시된다.

탄소원 및 질소원 이외의 배지 성분으로는, 미량 금속염, 아미노산, 비타민 등을 들 수 있고, 필요에 따라 적절히 첨가할 수 있다.

본 발명의 방법에 있어서, 항생 물질로는, 이상형 콜로니 출현율을 비첨가시와 비교하여 저감시킬 수 있는 것이면 특별히 한정되지 않지만, 구체적으로는, 스트렙토마이신, 린코마이신, 에리트로마이신, 리팜피신, 클로람페니콜, 악티노마이신, 푸시딘산, 리피아마이신, 퓨로마이신, 스펙티노마이신, 테트라시클린, 티오스트렙톤이 예시된다. 이 중에서 특히 바람직하게는, 스트렙토마이신이다.

항생 물질은, 세균의 생육을 저해시키지 않는 (아치사량 이하) 농도인 것이 바람직하고, 액체 배지 중의 항생 물질의 농도가 0.001 ppm 이상 10,000 ppm 이하가 되도록 첨가하는 것이 바람직하다.

항생 물질의 농도는, 세균에 대한 증식 저해 농도 이하인 것이 바람직하고, 세균의 종류에 따라 다르기도 하지만, 예를 들어, 1,000 ppm 이하인 것이 바람직하고, 300 ppm 이하인 것이 보다 바람직하고, 90 ppm 이하인 것이 더욱 바람직하다. 한편, 항생 물질의 농도의 하한은 이상형 콜로니의 출현을 억제할 수 있는 농도이면 되는데, 0.01 ppm 이상인 것이 바람직하고, 0.1 ppm 이상인 것이 보다 바람직하고, 1 ppm 이상인 것이 더욱 바람직하다.

항생 물질은, 최종단보다 앞의 단에서 액체 배지에 첨가한다. 항생 물질은, 액체 배지에 배양 개시시부터 함유시켜도 되지만, 배양 도중에 첨가해도 된다. 배양 도중에 첨가하는 경우, 균체가 어느 정도 증식된 단계에서 첨가하는 것이 바람직하고, 예를 들어, 배양 개시부터 1 ∼ 10 시간 동안 첨가하는 것이 바람직하다. 또, 액체 배지 중의 항생 물질의 농도는, 배양 도중에 보충하거나 하여 변화시켜도 된다.

액체 배양 공정은, 계대 배양을 수반하는 2 단계 이상의 배양으로 이루어진다. 2 단계 이상이면 배양 단수는 몇 단이어도 되지만, 바람직하게는 2 ∼ 4 단계의 다단계 배양이어도 된다.

또한, 1 단계째는 1 개의 배양 용기, 2 단계째는 4 개의 배양 용기와 같이 후단이 됨에 따라 배양 용기의 수를 늘려도 된다. 또 1 단계는 1 ℓ, 2 단계째는 10 ℓ 와 같이 후단이 됨에 따라 배양 용기의 용량을 늘려도 된다.

다단계 배양의 배양 시간에 대해, 예를 들어, 2 단계의 배양을 실시하는 경우, 세균을 1 단계째의 배지에 접종하여 10 ∼ 40 시간, 바람직하게는 20 ∼ 30 시간 배양을 실시하고, 1 단계째의 배양에서 얻어진 균체의 일부를 2 단계째의 배지에 접종하고, 15 ∼ 80 시간, 바람직하게는 20 ∼ 50 시간 배양을 실시하는 양태를 들 수 있고, 토탈의 배양 시간으로는 바람직하게는 25 ∼ 120 시간, 보다 바람직하게는 30 ∼ 80 시간이다.

예를 들어, 3 단계의 배양을 실시하는 경우, 세균을 1 단계째의 배지에 접종하여 10 ∼ 40 시간, 바람직하게는 20 ∼ 30 시간 배양을 실시하고, 1 단계째의 배양에서 얻어진 균체의 일부를 2 단계째의 배지에 접종하고, 5 ∼ 40 시간, 바람직하게는 10 ∼ 30 시간 배양을 실시하고, 2 단계째의 배양에서 얻어진 균체의 일부를 3 단계째의 배지에 접종하고, 15 ∼ 80 시간, 바람직하게는 20 ∼ 50 시간 배양을 실시하는 양태를 들 수 있고, 토탈의 배양 시간으로는 바람직하게는 30 ∼ 160 시간, 보다 바람직하게는 35 ∼ 110 시간이다.

예를 들어, 4 단계의 배양을 실시하는 경우, 세균을 1 단계째의 배지에 접종하여 10 ∼ 40 시간, 바람직하게는 20 ∼ 30 시간 배양을 실시하고, 1 단계째의 배양에서 얻어진 균체의 일부를 2 단계째의 배지에 접종하고, 5 ∼ 40 시간, 바람직하게는 10 ∼ 30 시간 배양을 실시하고, 2 단계째의 배양에서 얻어진 균체의 일부를 3 단계째의 배지에 접종하고, 5 ∼ 40 시간, 바람직하게는 10 ∼ 30 시간 배양을 실시하고, 3 단계째의 배양에서 얻어진 균체의 일부를 4 단계째의 배지에 접종하고, 15 ∼ 80 시간, 바람직하게는 20 ∼ 50 시간 배양을 실시하는 양태를 들 수 있고, 토탈의 배양 시간으로는 바람직하게는 35 ∼ 200 시간, 보다 바람직하게는 60 ∼ 140 시간이다.

이와 같이, 액체 배양을 다단계로 실시하는 경우, 그 중의, 최종단을 제외한 적어도 어느 하나의 단계에서 항생 물질을 함유하는 배지를 사용하여 배양을 실시하고, 최종단에서는 항생 물질을 함유시킨 단계보다 낮은 항생 물질 농도에서 배양을 실시하면 된다. 최종단에서 항생 물질 농도를 낮춤으로써, 증식 저해나 아포 형성 저해를 일으키는 요인을 제외하게 되기 때문에, 보다 신속하게 배양 공정을 진행시킬 수 있다. 통상적으로 미생물의 다단계 배양에 의한 생산에서는, 최종단이 가장 큰 규모가 되는 것이 일반적이기 때문에, 최종단에서 항생 물질 농도를 낮추는 것은, 제조 비용의 억제로 연결된다.

예를 들어, 최종단에 있어서의 항생 물질의 농도를, 항생 물질을 함유시킨 단계에 있어서의 항생 물질의 농도의 1/2 이하, 1/5 이하, 1/10 이하, 1/50 이하, 또는 1/100 이하로 할 수 있고, 최종단에 있어서의 항생 물질의 농도를 제로 (검출 한계 이하) 로 해도 된다.

예를 들어, 후술하는 실시예 1 과 같이, 배양을 3 단계에서 실시하고, 1 단계째와 2 단계째는 항생 물질을 첨가하고, 3 단계째는 항생 물질을 첨가하지 않고, 2 단계째의 배양액을 1 ％ 계대 배양함으로써 항생 물질 농도를 2 단계째의 100 분의 1 로 저하시키는 배양 방법으로 할 수도 있다.

또, 항생 물질의 농도를 단계마다 서서히 줄일 수도 있고, 그 경우, 최종단에 있어서의 항생 물질의 농도는, 최대 농도의 1/2 이하, 1/5 이하, 1/10 이하, 1/50 이하, 또는 1/100 이하로 할 수 있다.

또한, 항생 물질을 함유하는 배지를 사용하여 배양하는 기간은 토탈로 10 시간 이상인 것이 바람직하다.

배양 온도는 세균의 종류에 따라 적절히 선택할 수 있지만, 예를 들어, 10 ℃ ∼ 50 ℃, 바람직하게는 15 ℃ ∼ 50 ℃, 보다 바람직하게는 15 ℃ ∼ 40 ℃ 이다.

그 밖의, 산소 농도, pH 등의 각종 조건에 대해서는, 통상적인 세균의 액체 배양에 사용되는 조건이면 되는데, 예를 들어, 호기 조건 (예를 들어, 산소 농도 15 ∼ 50 ％) 에서, 교반하면서 배양하는 조건이 예시된다. 배지의 pH 는 6.5 ∼ 8.5 가 바람직하고, 7.0 ∼ 8.0 이 보다 바람직하다.

이상형 콜로니가 출현할지의 여부는, 항생 물질을 사용한 액체 배양 후에, 얻어진 균체의 일부를 채취하고, 그것을 콜로니끼리가 접착되지 않고, 콜로니 형태를 식별할 수 있을 정도의 농도로 희석하고, 한천 배지 등의 고체 배지 상에 도포하여 배양하고, 출현하는 콜로니의 형태를 관찰함으로써 확인할 수 있다.

이상형 콜로니란, 야생형의 세균의 콜로니 형태와는 상이한 형태를 나타내는 콜로니를 의미한다. 예를 들어, 표 3 에 나타내는 바와 같이, 정상형 콜로니의 형태가 거의 원형이고, 측면이 렌즈상이고, 표면이 평활 또는 뮤코이드상인 데 반하여, 이상형 콜로니는, 형태가 불규칙하고, 측면이 편평하고, 표면이 조면 (粗面) 인 경우를 들 수 있다. 형태면의 이상, 측면의 이상, 표면의 이상 중, 1 개 이상에 해당하면 이상형 콜로니라고 할 수 있다. 도 1 은 이상형 콜로니의 형태의 일례를 나타내고, 동그라미로 둘러싸여져 있는 것이 이상형 콜로니이다.

실시예

이하, 실시예를 들어 본 발명을 구체적으로 설명하는데, 본 발명은 이하의 실시예에 한정되는 것이 아니다.

(실시예 1)

500 ㎖ 삼각 플라스크 (배플 부착) 를 사용하여, 표 1 에 기재된 배지 성분을 함유하는 액체 배지를 각각 100 ㎖ 씩 제조하고, 오토클레이브 멸균을 실시하였다. 또한 메일라드 반응을 피하기 위하여, 글루코오스는 별도 멸균 후, 무균적으로 혼합하였다.

표 2 에 기재된 바와 같이, 시험구를 설정하였다. 각 시험구의 조건에 따라, 필터 멸균한 스트렙토마이신 수용액을, 무균적으로 배지에 첨가하였다.

보통 한천 배지 상에 생육시킨 바실루스·서브틸리스 ITB105 주 (NITE BP-01727) 의 콜로니로부터 1 백금이를 취하여 식균한 후, 30 ℃, 150 rpm 에서 진탕 배양을 실시하였다 (1 단째). 18 시간 후에, 각각 1 ㎖ 를 분취하여 새로운 배지에 계대 배양하고, 동일하게 진탕 배양을 실시하였다 (2 단째). 또한 24 시간 후에, 각각 1 ㎖ 를 분취하여 새로운 배지에 계대 배양하고, 동일하게 진탕 배양을 실시하였다 (3 단째). 3 단째의 배양액에 대해, 30 시간 후에 샘플링을 실시하였다.

얻어진 배양액에 대해, 멸균수로 1 × 10⁷ 배로 희석하고, 100 ㎕ 를 보통 한천 배지에 도포하여 37 ℃ 에서 하룻밤 배양하였다. 콜로니의 출현수를 계측하고, CFU 를 산출하였다. 또 출현한 콜로니에 대해, 표 3 의 기준에 따라 친주의 콜로니 형태와 분명하게 상이한 것을 이상형 콜로니로서 출현수의 계측을 실시하고, 전체에서 차지하는 비율을 산출하였다. 그 결과를 표 4 에 나타낸다. 그 결과, 3 단계 배양에 있어서, 전혀 항생 물질을 첨가하지 않은 경우에는 이상 콜로니가 약 5 ％ 출현했지만, 1 단째 및 2 단째에 스트렙토마이신을 첨가하고, 3 단째는 첨가하지 않고 배양한 경우에는 이상형 콜로니의 출현이 보이지 않았다. 또, 1 단째, 2 단째, 3 단째의 모두에 있어서 스트렙토마이신을 첨가한 경우에는, 이상형 콜로니는 출현하지 않기는 했지만, 콜로니의 출현수 및 정상형 콜로니의 출현수가 낮고, 시험구 번호 2 ∼ 6 과 비교하여, 세균 균체의 생산성이 낮아졌다.

Claims

바실루스 (Bacillus) 속 세균의 다단계의 액체 배양 공정에 있어서, 최종단보다 앞의 단에서 항생 물질을 함유하는 액체 배지에서 세균을 배양하고, 최종단에서 항생 물질 농도를 당해 앞의 단보다 저하시켜 배양하는 공정을 포함하는, 바실루스 (Bacillus) 속 세균 균체의 제조 방법으로서, 상기 항생 물질이, 스트렙토마이신, 린코마이신 및 클로람페니콜로 이루어지는 군에서 선택되는 1 종류 이상이고, 상기 최종단보다 앞의 단의 액체 배지에 있어서의 항생 물질의 농도가 1.0 ∼ 90 ppm 이며, 최종단에 있어서의 항생 물질의 농도를, 항생 물질의 최대 농도의 1/10 이하로 하고, 바실루스 (Bacillus) 속 세균이, 바실루스·서브틸리스 (Bacillus subtilis) 인, 바실루스 (Bacillus) 속 세균 균체의 제조 방법.
바실루스 (Bacillus) 속 세균의 다단계의 액체 배양 공정에 있어서, 최종단보다 앞의 단에서 항생 물질을 함유하는 액체 배지에서 바실루스 (Bacillus) 속 세균을 배양하고, 최종단에서 항생 물질 농도를 당해 앞의 단보다 저하시켜 배양하는 공정을 포함하고, 상기 항생 물질이, 스트렙토마이신, 린코마이신 및 클로람페니콜로 이루어지는 군에서 선택되는 1 종류 이상이고, 상기 최종단보다 앞의 단의 액체 배지에 있어서의 항생 물질의 농도가 1.0 ∼ 90 ppm 이며, 최종단에 있어서의 항생 물질의 농도를, 항생 물질의 최대 농도의 1/10 이하로 하고, 바실루스 (Bacillus) 속 세균이, 바실루스·서브틸리스 (Bacillus subtilis) 인, 이상형 콜로니를 형성하는 변이 개체의 출현을 저감시킨 바실루스 (Bacillus) 속 세균의 배양 방법.
바실루스 (Bacillus) 속 세균의 다단계의 액체 배양 공정에 있어서, 최종단보다 앞의 단에서 항생 물질을 함유하는 액체 배지에서 바실루스 (Bacillus) 속 세균을 배양하고, 최종단에서 항생 물질 농도를 당해 앞의 단보다 저하시켜 배양하는 공정을 포함하고, 상기 항생 물질이, 스트렙토마이신, 린코마이신 및 클로람페니콜로 이루어지는 군에서 선택되는 1 종류 이상이고, 상기 최종단보다 앞의 단의 액체 배지에 있어서의 항생 물질의 농도가 1.0 ∼ 90 ppm 이며, 최종단에 있어서의 항생 물질의 농도를, 항생 물질의 최대 농도의 1/10 이하로 하고, 바실루스 (Bacillus) 속 세균이, 바실루스·서브틸리스 (Bacillus subtilis) 인, 바실루스 (Bacillus) 속 세균의 액체 배양 중의 이상형 콜로니를 형성하는 변이 개체의 출현 및 증식을 억제하는 방법.
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