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CN113015540A - 使用mrna治疗剂治疗癌症的方法和组合物 - Google Patents

使用mrna治疗剂治疗癌症的方法和组合物 Download PDF

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CN113015540A CN201980074987.2A CN201980074987A CN113015540A CN 113015540 A CN113015540 A CN 113015540A CN 201980074987 A CN201980074987 A CN 201980074987A CN 113015540 A CN113015540 A CN 113015540A
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Abstract

本公开的特征在于使用编码OX40L多肽、IL‑12多肽、IL‑15多肽以及它们的组合的一种或多种mRNA来治疗癌症的方法，所述癌症包括实体瘤和播散性癌症，如髓系恶性肿瘤。

Description

使用MRNA治疗剂治疗癌症的方法和组合物
相关申请的交叉引用
本申请要求2018年9月14日提交的美国临时申请序列号62/731,335、2018年11月20日提交的美国临时申请序列号62/770,024和2019年7月31日提交的美国临时申请号62/881,322的权益。上述申请的全部内容以引用方式并入本文。
背景技术
癌症是一种以体内不受控制的细胞分裂和生长为特征的疾病。在美国，大约三分之一的女性和一半的男性在一生中会经历癌症。癌症一般可分为两类，实体瘤和播散性癌症。每种类型都需要不同的考虑来开发有效的治疗方法。
播散性癌症，如髓系恶性肿瘤，代表着一个重要的癌症群体，仅在美国每年就有超过30,000例新确诊病例，5年存活率仅为约20％。大约有60,000至170,000例骨髓增生异常综合征(MDS)，可发展为急性髓系白血病(AML)。播散性癌症(如髓系恶性肿瘤，包括AML)的治疗选择有限，而常规方法如化学疗法和/或免疫调节细胞因子或抗体对AML不是很有效。例如，发现单独的白细胞介素2治疗对AML患者的缓解维持治疗无效(Buyse,M.等人(2000)Blood117:26)。相似地，研究发现，在自体骨髓移植后，利诺胺(linomide)并不比安慰剂有益(Simonsson,B.等人(2011)Bone Marrow Transpl.25:1121)。尽管有多种治疗选择，但复发或难治性AML患者的预后通常较差。
实体瘤的治疗包括手术、化学疗法和/或放射疗法。在手术中，大部分肿瘤甚至是受侵袭的器官都被切除。化学疗法包括使用药物摧毁癌细胞。有些癌症可通过化学疗法治愈，而有些则不能。化疗药物不仅能影响癌细胞，也能影响其他快速分裂的正常细胞，如胃肠道细胞、骨髓细胞、毛囊细胞和生殖系统细胞，这些细胞会产生一些副作用。放射疗法包括使用x射线治疗癌症。有些癌症可通过放射疗法治愈，而有些则不能。目前使用的化学疗法和放射疗法等标准治疗方法带来了许多不希望看到的后果，而遗传疗法和免疫疗法为疾病诊断、治疗和管理提供了更有针对性的方法。因此，需要改进的治疗方法来治疗癌症，包括实体瘤和播散性癌症，例如髓系恶性肿瘤如AML。
发明内容
本公开涉及用于治疗受试者的癌症的方法和组合物。本公开至少部分地基于以下发现：施用编码一种或多种细胞缔合性细胞因子(例如，IL-12和IL-15)和细胞缔合性共刺激分子(例如，OX40L)的mRNA的组合可诱导T细胞激活、NK细胞激活或T细胞激活和NK细胞激活两者，从而在实体瘤和播散性癌症如髓系恶性肿瘤(例如，AML)中产生抗肿瘤功效。还发现通过施用编码两种细胞缔合性细胞因子(例如，IL-12和IL-15)的mRNA与编码共刺激分子(例如，OX40L)的mRNA的组合可增强抗肿瘤功效。mRNA的组合提供各种信号以有效诱导T细胞激活、NK细胞激活，或T细胞激活和NK细胞激活两者。
此外，本公开提供了编码反式呈递IL-15的mRNA。IL-15是一种独特的细胞因子，主要与其高亲和力受体IL-15Rα结合存在。将IL-15/IL-15Rα复合物穿梭至细胞表面，通过β/γC受体复合物刺激对立细胞。因此，不希望受理论束缚，编码IL-15和IL-15Rα的mRNA(一起编码，例如作为编码可操作地连接至IL-15Rα的IL-15的多肽融合体的单个mRNA，或单独编码，例如作为各自编码IL-15和IL-15Rα的两个不同mRNA)导致反式呈递，从而刺激具有β/γC受体复合物的对立细胞。
不希望受理论束缚，相对于相同细胞因子的可溶性或分泌形式，编码一种或多种细胞缔合性细胞因子与共刺激分子的mRNA的组合可提供针对实体瘤和播散性癌症(包括髓系恶性肿瘤)的增强的抗肿瘤功效，因为它们能够形成更强的癌细胞:免疫细胞突触，并且能够提供对它们所相互作用的细胞(例如，T细胞和NK细胞)的增强的、延长的或持续的激活。T细胞激活需要三个信号：由MHC与肽的相互作用提供的信号1；由共刺激分子如OX40L提供的信号2；和由免疫增强分子(包括细胞因子，如IL-12和IL-15)提供的信号3。要建立由T细胞驱动的抗肿瘤免疫，这三个信号都是必需的。但是，肿瘤微环境通常无法提供激活T细胞和增强抗肿瘤免疫应答的必要信号。通过将编码共刺激分子(如人OX40L)的mRNA与编码一种或多种细胞缔合性免疫增强分子的mRNA，例如编码一种或多种提供信号3的细胞缔合性细胞因子(例如，人IL-12、人IL-15/IL-15Rα)的mRNA的组合提供至肿瘤微环境中的T细胞，细胞(例如，白血病细胞或抗原呈递细胞如树突状细胞)表达所述mRNA导致T细胞被激活，从而诱导抗肿瘤免疫应答。此外，通过限制细胞因子和共刺激分子暴露于表达mRNA的细胞，避免全身暴露和潜在的不期望毒性。
关于AML，已知白血病细胞已经降低和/或下调了共刺激分子CD80和CD86的表达(Yaho,S.和Chen,L.,Eur J.Immunol.2013,43(3):576-579；和Hirano N,等人,Leukemia.1996,10:1168-1176)。通过施用编码人OX40L的mRNA，可在不存在强共刺激信号或强共刺激信号被下调的情况下提供强共刺激信号，或者在不存在强共刺激信号的情况下，例如在树突状细胞上，可加强或增强现有的共刺激信号，从而在T细胞与表达编码OX40L的mRNA的白血病细胞和/或树突状细胞之间提供更强的突触，并诱导T细胞产生抗肿瘤免疫应答。如本文所述，尽管将编码共刺激分子的mRNA(例如，编码OX40L的mRNA)的数量减少了1/10，但与不使用共刺激分子的治疗相比，仍有较强的抗肿瘤效应，由此证明了如本文所述的理论。
重要的是，全身施用编码一种或多种细胞缔合性细胞因子(例如，人IL-12、人IL-15/IL-15Rα)的mRNA和编码共刺激分子(例如，人OX40L)的mRNA的组合可在播散性癌症模型中诱导持久的抗癌记忆应答，所述播散性癌症模型以与在AML患者中观察到的方式相似的方式植入造血组织。在该模型中，抗癌免疫应答预防疾病复发和重现。这种效应被认为是首次证明施用mRNA治疗剂可在播散性癌症模型中产生抗癌记忆应答。
本文中还证明了分次给药方案的出乎意料的功效。发现将相同剂量的mRNA分为多个剂量(即，两个以上)，并在同一治疗期间以每周一次的单剂量施用，相对于单剂量，在播散性癌症模型中提供了增强的抗癌功效，包括诱导持久的抗癌记忆应答。不希望受理论束缚，这样的分次给药可在受试者中提供更大或增强的对mRNA编码的多肽的暴露，从而产生增强的抗肿瘤功效，同时具有降低的毒性和更好的耐受性。
如本文所述，生物分布研究表明，包封mRNA的脂质纳米颗粒不仅转染白血病细胞，而且转染多种免疫细胞，包括树突状细胞。这些研究表明，一种或多种编码细胞缔合性细胞因子的mRNA和编码共刺激分子(例如，人OX40L)的mRNA的组合疗法将可用于治疗多种播散性癌症，包括具有大量髓系群体的癌症如AML，以及多发性骨髓瘤和B细胞白血病。
本文所述的组合疗法还被证明在具有各种肿瘤微环境的动物模型中，可有效地在实体瘤中建立抗肿瘤免疫。不受理论束缚，据信在免疫检查点抗性肿瘤模型和免疫抑制性肿瘤模型中观察到的抗肿瘤功效证明了施用一种或多种编码细胞缔合性细胞因子的mRNA和编码共刺激分子(如人OX40L)的mRNA后T、NK、NKT和树突状细胞激活的有效性。如本文所公开，编码一种或多种细胞缔合性细胞因子(例如，人IL-12、人IL-15/IL-15Rα)的mRNA和编码共刺激分子(例如，人OX40L)的mRNA的施用激活并增加了小鼠和非人灵长类动物(NHP)中的先天性和适应性免疫细胞群，并且在NHP中诱导免疫刺激性细胞因子(例如，IFN-γ和CXCL)的表达。如本文所公开，尽管在施用mRNA后DC细胞群被激活并扩增，但在DC功能缺陷的AML动物模型中，功能性DC并非抗肿瘤疗效所必需。施用编码细胞缔合性细胞因子的一种或多种mRNA和编码共刺激分子(如人OX40L)的mRNA所介导的抗肿瘤功效需要CD8+ T细胞、CD4+ T细胞以及IFN-γ，因为在耗尽CD8+ T细胞、CD4+ T细胞或IFN-γ的动物中进行的实验导致疾病负担增加且存活率下降。
此外，发现在实体瘤中肿瘤内施用组合疗法可引起远位效应，表明抗肿瘤免疫应答对于未治疗的远端肿瘤有效。
因此，本文提供了通过提供激活特定免疫细胞的编码细胞缔合性细胞因子的两种或更多种mRNA和编码共刺激分子的mRNA的组合，从而增强针对癌症的免疫应答来治疗癌症(例如，实体瘤和/或播散性癌症)的组合物和方法。已知癌症，包括髓系恶性肿瘤(如AML)可通过多种机制逃避免疫应答。本公开的组合物和方法可用于针对癌症，例如实体瘤和/或播散性癌症(例如，髓系恶性肿瘤如AML)激活先天性免疫，激活适应性免疫和/或激活记忆应答。在一些方面，mRNA是修饰的mRNA。
因此，在一些方面，本公开提供了一种治疗人患者的癌症的方法，所述方法包括向所述患者施用：
(i)编码人OX40L的第一mRNA；和
(ii)编码免疫增强剂的至少一种第二mRNA，其中所述免疫增强剂是激活T细胞、NK细胞或T细胞和NK细胞两者的细胞缔合性细胞因子。
在一些方面，本公开提供了一种治疗人患者的癌症的方法，所述方法包括向所述患者施用：
(i)编码人OX40L的第一mRNA；和
(ii)编码免疫增强剂的至少一种第二mRNA，其中所述免疫增强剂是激活T细胞、NK细胞或T细胞和NK细胞两者的细胞缔合性细胞因子，
其中所述第一mRNA和所述至少一种第二mRNA被包封在相同或不同的脂质纳米颗粒中。
在任一前述或相关方面，所述至少一种第二mRNA是：
(i)编码反式呈递的人IL-15的mRNA；
(ii)编码可操作地连接至包含跨膜结构域的膜结构域的人IL-12多肽的mRNA；或
(iii)编码反式呈递的人IL-15的mRNA和编码可操作地连接至膜结构域的人IL-12多肽的mRNA。
在一些方面，本公开提供了一种治疗有需要的受试者的癌症的方法，所述方法包括施用至少两种选自由以下组成的组的mRNA：
(i)编码人OX40L多肽的mRNA；
(ii)编码可操作地连接至人IL-15Rα多肽的人IL-15多肽的mRNA；
(iii)编码人IL-15多肽的mRNA和编码人IL-15Rα多肽的mRNA；和
(iv)编码可操作地连接至包含跨膜结构域的膜结构域的人IL-12多肽的mRNA。
在任一前述或相关方面，所述癌症是播散性癌症，并且所述第一mRNA和所述至少一种第二mRNA以全身方式施用。在一些方面，所述播散性癌症是血液学癌症。在一些方面，所述播散性癌症是髓系恶性肿瘤。在一些方面，所述髓系恶性肿瘤选自由以下组成的组：骨髓增生异常综合征(MDS)、骨髓增生性疾病(MPD)和急性髓系白血病(AML)。在其他方面，所述癌症是实体瘤，并且其中所述第一mRNA和所述至少一种第二mRNA以肿瘤内方式施用。
在其他方面，本公开提供了一种治疗有需要的受试者的实体瘤的方法，所述方法包括(例如，静脉内)施用至少两种选自由以下组成的组的mRNA：
(i)编码人OX40L多肽的mRNA；
(ii)编码可操作地连接至人IL-15Rα多肽的人IL-15多肽的mRNA；
(iii)编码人IL-15多肽的mRNA和编码人IL-15Rα多肽的mRNA；和
(iv)编码可操作地连接至包含跨膜结构域的膜结构域的人IL-12多肽的mRNA。
在一些方面，本公开提供了一种治疗有需要的受试者的播散性癌症的方法，所述方法包括(例如，全身性地，例如通过静脉内注射)施用至少两种选自由以下组成的组的mRNA：
(i)编码人OX40L多肽的mRNA；
(ii)编码可操作地连接至人IL-15Rα多肽的人IL-15多肽的mRNA；
(iii)编码人IL-15多肽的mRNA和编码IL-15Rα多肽的人mRNA；和
(iv)编码可操作地连接至包含跨膜结构域的膜结构域的人IL-12多肽的mRNA。
在一些方面，本公开提供了一种治疗有需要的受试者的髓系恶性肿瘤的方法，所述方法包括(例如，全身性地，例如通过静脉内注射)施用至少两种选自由以下组成的组的mRNA：
(i)编码人OX40L多肽的mRNA；
(ii)编码可操作地连接至人IL-15Rα多肽的人IL-15多肽的mRNA；
(iii)编码人IL-15多肽的mRNA和编码人IL-15Rα多肽的mRNA；和
(iv)编码可操作地连接至包含跨膜结构域的膜结构域的人IL-12多肽的mRNA。
在任一前述或相关方面，所述至少两种mRNA选自由以下组成的组：
(i)编码人OX40L多肽的mRNA和编码可操作地连接至包含跨膜结构域的膜结构域的人IL-12多肽的mRNA；
(ii)编码人OX40L多肽的mRNA、编码人IL-15多肽的mRNA和编码人IL-15Rα多肽的mRNA；
(iii)编码人OX40L多肽的mRNA和编码可操作性地连接至人IL-15Rα多肽的人IL-15多肽的mRNA；
(iv)编码人IL-15多肽的mRNA、编码人IL-15Rα多肽的mRNA和编码可操作地连接至包含跨膜结构域的膜结构域的人IL-12多肽的mRNA；
(v)编码可操作地连接至人IL-15Rα多肽的人IL-15多肽的mRNA和编码可操作地连接至包含跨膜结构域的膜结构域的人IL-12多肽的mRNA；
(vi)编码人OX40L多肽的mRNA、编码人IL-15多肽的mRNA、编码人IL-15Rα多肽的mRNA和编码可操作地连接至包含跨膜结构域的膜结构域的人IL-12多肽的mRNA；以及
(vii)编码人OX40L多肽的mRNA、编码可操作地连接至人IL-15Rα多肽的人IL-15多肽的mRNA和编码可操作地连接至包含跨膜结构域的膜结构域的人IL-12多肽的mRNA。
在一些方面，本公开提供了一种用于治疗人患者的播散性癌症的方法，所述方法包括向所述患者全身性地施用：
(i)编码人OX40L的第一mRNA；和
(ii)编码免疫增强剂的至少一种第二mRNA，其中所述免疫增强剂是激活T细胞、NK细胞或T细胞和NK细胞两者的细胞缔合性细胞因子，
其中所述第一mRNA和所述第二mRNA被包封在相同或不同的脂质纳米颗粒中。在一些方面，所述方法包括施用编码第二免疫增强剂的第三mRNA，其中所述免疫增强剂是激活T细胞、NK细胞或T细胞和NK细胞两者的细胞缔合性细胞因子。在一些方面，所述第二mRNA编码可操作地连接至包含跨膜结构域的膜结构域的人IL-12多肽，并且所述第三mRNA编码反式呈递的人IL-15。
在其他方面，本公开提供了一种治疗人患者的播散性癌症的方法，所述方法包括向所述患者全身性地施用包含脂质纳米颗粒(LNP)和药学上可接受的载体的药物组合物，其中所述LNP包含：
(i)编码人OX40L的第一mRNA；和
(ii)编码免疫增强剂的至少一种第二mRNA，其中所述免疫增强剂是激活T细胞、NK细胞或T细胞和NK细胞两者的细胞缔合性细胞因子。在一些方面，所述方法包括施用编码第二免疫增强剂的第三mRNA，其中所述免疫增强剂是激活T细胞、NK细胞或T细胞和NK细胞两者的细胞缔合性细胞因子。在一些方面，所述第二mRNA编码可操作地连接至包含跨膜结构域的膜结构域的人IL-12多肽，并且所述第三mRNA编码反式呈递的人IL-15。
在其他方面，本公开提供了一种治疗人患者的播散性癌症的方法，所述方法包括向所述患者施用给药方案，所述给药方案包括：
(i)第一分次剂量的药物组合物，所述药物组合物包含编码人OX40L的第一mRNA和编码免疫增强剂的至少一种第二mRNA，其中所述免疫增强剂是激活T细胞、NK细胞或T细胞和NK细胞两者的细胞缔合性细胞因子，和
(ii)至少一个第二分次剂量的所述药物组合物，
其中相对于相同给药间隔期间相同量的mRNA的单个剂量，所述第一分次剂量和所述第二分次剂量增加了所述患者中对所述mRNA编码的多肽的暴露，从而治疗所述患者的所述播散性癌症。在一些方面，所述第一分次剂量和所述第二分次剂量相对于相同量的mRNA的单个剂量，增强所述治疗的抗肿瘤功效。在一些方面，所述第一分次剂量和所述第二分次剂量强抗肿瘤功效，并且具有降低的毒性和更好的耐受性。在一些方面，所述方法包括施用编码第二免疫增强剂的第三mRNA，其中所述免疫增强剂是激活T细胞、NK细胞或T细胞和NK细胞两者的细胞缔合性细胞因子。在一些方面，所述第二mRNA编码可操作地连接至包含跨膜结构域的膜结构域的人IL-12多肽，并且所述第三mRNA编码反式呈递的人IL-15。
在任一前述或相关方面，所述细胞缔合性细胞因子是可操作地连接至包含跨膜结构域的膜结构域的人IL-12多肽。在其他方面，细胞缔合性细胞因子是反式呈递的人IL-15。在一些方面，反式呈递的人IL-15是可操作地连接至人IL-15Rα多肽的人IL-15多肽。在其他方面，反式呈递的人IL-15由编码人IL-15多肽的第一mRNA和编码人IL-15Rα多肽的第二mRNA编码。
在任一前述或相关方面，所述mRNA被配制在相同的脂质纳米颗粒(LNP)中。在任一前述或相关方面，每种mRNA被配制在相同的LNP中。在其他方面，每种mRNA被配制在单独的LNP中。
在一些方面，本公开的mRNA被配制在相同或不同的LNP中，其中所述LNP包含摩尔比为约20％-60％:5％-25％:25％-55％:0.5％-15％的可电离氨基脂质:磷脂:结构脂质:PEG修饰脂质。在其他方面，所述LNP包含摩尔比为约50％:约10％:约38.5％:约1.5％的可电离脂质:磷脂:甾醇:PEG修饰脂质。在其他方面，所述LNP包含摩尔比为50:38.5:10:1.5的可电离脂质:胆固醇:DSPC:PEG修饰脂质。
在一些方面，本公开的mRNA被配制在相同或不同的LNP中，其中所述LNP包含约30mol％至约60mol％的可电离脂质、约0mol％至约30mol％的非阳离子辅助脂质或磷脂、约18.5mol％至约48.5mol％的甾醇或其他结构脂质，以及约0mol％至约10mol％的PEG脂质。在其他方面，所述LNP包含约50mol％的可电离脂质、约10mol％的非阳离子辅助脂质或磷脂、约38.5mol％的甾醇或其他结构脂质，以及约1.5mol％的PEG脂质。
在任一前述或相关方面，所述可电离脂质选自由以下组成的组：例如，2,2-二亚油基-4-二甲基氨基乙基-[1,3]-二氧戊环(DLin-KC2-DMA)、4-二甲基氨基丁酸二亚油基-甲酯(DLin-MC3-DMA)和9-((4-(二甲基氨基)丁酰基)氧基)十七烷二酸二((Z)-壬-2-烯-1-基)酯(L319)。在一些方面，所述可电离脂质包含化合物X。
在任一前述或相关方面，所述LNP包含摩尔比为约20％-60％:5％-25％:25％-55％:0.5％-15％的化合物X:磷脂:胆固醇:PEG修饰脂质。在一些方面，所述LNP包含摩尔比为约50％:约10％:约38.5％:约1.5％的化合物X:磷脂:胆固醇:PEG修饰脂质。
在任一前述或相关方面，所述PEG修饰脂质是PEG-DMG或化合物P-428。在一些方面，LNP包含摩尔比为50:38.5:10:1.5的化合物X:胆固醇:磷脂:化合物P-428，或化合物X:胆固醇:DSPC:化合物P-428。在其他方面，LNP包含摩尔比为40:38.5:20:1.5的化合物X:胆固醇:磷脂:化合物P-428，或化合物X:胆固醇:DSPC:化合物P-428。
在任一前述或相关方面，所述LNP包含植物甾醇或植物甾醇与胆固醇的组合。在一些方面，所述植物甾醇选自由以下组成的组：β-谷甾醇、豆甾醇、β-谷甾烷醇、菜油甾醇、菜子甾醇以及它们的组合。在一些方面，所述植物甾醇包括(i)谷甾醇或其盐或酯，或(ii)豆甾醇或其盐或酯。在一些方面，所述植物甾醇是β-谷甾醇
Figure BDA0003064795710000121
或其盐或酯。
在其他方面，所述植物甾醇或其盐或酯选自由以下组成的组：β-谷甾醇、β-谷甾烷醇、菜油甾醇、菜子甾醇、化合物S-140、化合物S-151、化合物S-156、化合物S-157、化合物S-159、化合物S-160、化合物S-164、化合物S-165、化合物S-170、化合物S-173、化合物S-175以及它们的组合。
在一些方面，甾醇或其他结构脂质的mol％是18.5％植物甾醇，并且结构脂质的总mol％是38.5％。在其他方面，甾醇或其他结构脂质的mol％是28.5％植物甾醇，并且结构脂质的总mol％是38.5％。
在一些方面，本公开的mRNA被配制在相同或不同的LNP中，其中所述LNP包含摩尔比为50:10:10:28.5:1.5的化合物X:DSPC:胆固醇:β-谷甾醇:PEG-DMG。在一些方面，本公开的mRNA被配制在相同或不同的LNP中，其中所述LNP包含摩尔比为50:10:20:18.5:1.5的化合物X:DSPC:胆固醇:β-谷甾醇:PEG-DMG。在任一前述或相关方面，所述癌症是播散性癌症。在一些方面，所述播散性癌症是血液学癌症。在一些方面，所述播散性癌症是髓系恶性肿瘤。
在任一前述或相关方面，所述髓系恶性肿瘤选自由以下组成的组：骨髓增生异常综合征(MDS)、骨髓增生性疾病(MPD)和急性髓系白血病(AML)。在一些方面，髓系恶性肿瘤是AML。
在任一前述或相关方面，所述癌症是实体瘤。在一些方面，所述实体瘤对检查点抑制剂疗法无应答。在一些方面，所述实体瘤包含免疫抑制性肿瘤微环境。
在任一前述或相关方面，所述至少两种mRNA以肿瘤内方式施用。在一些方面，所述至少两种mRNA以静脉内方式施用。在一些方面，所述mRNA被包封在相同的LNP中，并被配制在适于肿瘤内注射的溶液中。在一些方面，所述mRNA被包封在相同的LNP中，并被配制在适于静脉内注射的溶液中。在其他方面，每种mRNA被包封在一个或多个单独的LNP中，并被配制在适于肿瘤内注射的溶液中。在其他方面，每种mRNA被包封在一个或多个单独的LNP中，并被配制在适于静脉内注射的溶液中。
在任一前述或相关方面，用于治疗癌症(例如，实体瘤或播散性癌症，如髓系恶性肿瘤)的方法还包括施用检查点抑制剂多肽。在一些方面，所述检查点抑制剂多肽抑制PD-1、PD-L1、CTLA-4或它们的组合。在一些方面，所述检查点抑制剂多肽是抗体或编码所述抗体的mRNA。在一些方面，所述抗体是抗CTLA-4抗体或其特异性地结合CTLA-4的抗原结合片段、抗PD-1抗体或其特异性地结合PD-1的抗原结合片段、抗PD-L1抗体或其特异性地结合PD-L1的抗原结合片段，以及它们的组合。在一些方面，所述抗PD-L1抗体是阿特珠单抗、阿维鲁单抗或度伐鲁单抗。在一些方面，所述抗CTLA-4抗体是曲美木单抗或伊匹单抗。在一些方面，所述抗PD-1抗体是纳武单抗或派姆单抗。
在其他方面，本公开提供了一种LNP，所述LNP包含：
(i)编码人OX40L的第一mRNA；和
(ii)编码免疫增强剂的至少一种第二mRNA，其中所述免疫增强剂是激活T细胞、NK细胞或T细胞和NK细胞两者的细胞缔合性细胞因子。
在其他方面，本公开提供了一种LNP，所述LNP包含：
(i)可电离脂质；
(ii)甾醇或其他结构脂质；
(iii)编码人OX40的第一mRNA；
(iv)编码免疫增强剂的至少一种第二mRNA，其中所述免疫增强剂是激活T细胞、NK细胞或T细胞和NK细胞两者的细胞缔合性细胞因子；
(v)任选地，非阳离子辅助脂质或磷脂；和
(vi)任选地，PEG脂质。
在一些方面，本公开提供了一种LNP，所述LNP包含至少两种包封的信使RNA(mRNA)，其中所述至少两种mRNA选自由以下组成的组：
(i)编码人OX40L多肽的mRNA；
(ii)编码可操作地连接至人IL-15Rα多肽的人IL-15多肽的mRNA；
(iii)编码人IL-15多肽的mRNA和编码人IL-15Rα多肽的mRNA；和
(iv)编码可操作地连接至包含跨膜结构域的膜结构域的人IL-12多肽的mRNA。
在一些实施方案中，本公开提供了一种脂质纳米颗粒，其中所述mRNA被共同配制在相同的脂质纳米颗粒中，并且其中所述编码人OX40L、拴系人IL-12和细胞缔合性人IL-15的mRNA以1:1:1的重量(质量)比共同配制。
在一些实施方案中，本公开的mRNA被共同配制在相同的脂质纳米颗粒中，其中所述编码人OX40L、栓系人IL-12和细胞缔合性人IL-15的mRNA以1:1:1的重量(质量)比共同配制，并且其中所述编码细胞缔合性人IL-15的mRNA由编码人IL-15和人IL-15Rα的两种mRNA编码，并且其中所述两种mRNA以1:1的摩尔比共同配制。
在一些方面，所述至少两种mRNA选自由以下组成的组：
(i)编码人OX40L多肽的mRNA和编码可操作地连接至包含跨膜结构域的膜结构域的人IL-12多肽的mRNA；
(ii)编码人OX40L多肽的mRNA、编码人IL-15多肽的mRNA和编码人IL-15Rα多肽的mRNA；
(iii)编码人OX40L多肽的mRNA和编码可操作性地连接至人IL-15Rα多肽的人IL-15多肽的mRNA；
(iv)编码人IL-15多肽的mRNA、编码人IL-15Rα多肽的mRNA和编码可操作地连接至包含跨膜结构域的膜结构域的人IL-12多肽的mRNA；
(v)编码可操作地连接至人IL-15Rα多肽的人IL-15多肽的mRNA和编码可操作地连接至包含跨膜结构域的膜结构域的人IL-12多肽的mRNA；
(vi)编码人OX40L多肽的mRNA、编码人IL-15多肽的mRNA、编码人IL-15Rα多肽的mRNA和编码可操作地连接至包含跨膜结构域的膜结构域的人IL-12多肽的mRNA；以及
(vii)编码人OX40L多肽的mRNA、编码可操作地连接至人IL-15Rα多肽的人IL-15多肽的mRNA和编码可操作地连接至包含跨膜结构域的膜结构域的人IL-12多肽的mRNA。
在一些方面，本公开提供了一种脂质纳米颗粒，所述脂质纳米颗粒包含：编码人OX40L多肽的mRNA、编码人IL-15多肽的mRNA、编码人IL-15Rα多肽的mRNA和编码可操作地连接至包含跨膜结构域的膜结构域的人IL-12多肽的mRNA。
在一些方面，本公开提供了一种组合物，所述组合物包含：包封编码人OX40L多肽的mRNA的第一脂质纳米颗粒；包封编码人IL-15多肽的mRNA的第二脂质纳米颗粒；包封编码人IL-15Rα多肽的mRNA的第三脂质纳米颗粒；和包封编码可操作地连接至包含跨膜结构域的膜结构域的人IL-12多肽的mRNA的第四脂质纳米颗粒。
在一些方面，本公开提供了一种组合物，所述组合物包含：包封编码人OX40L多肽的mRNA的第一脂质纳米颗粒；包封编码可操作地连接至人IL-15Rα多肽的人IL-15多肽的mRNA的第二脂质纳米颗粒；和包封编码可操作地连接至包含跨膜结构域的膜结构域的人IL-12多肽的mRNA的第三脂质纳米颗粒。
在任一前述或相关方面，编码人OX40L多肽的mRNA包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。在一些方面，所述OX40L多肽由包含SEQ ID NO:11所示核苷酸序列的核苷酸序列或与SEQ ID NO:11所示核苷酸序列具有至少80％同一性的核苷酸序列编码。
在任一前述或相关方面，编码可操作地连接至包含跨膜结构域的膜结构域的人IL-12多肽的mRNA包含可操作地连接至IL-12p35亚基(IL-12A)多肽的IL-12p40亚基(IL-12B)多肽。在一些方面，所述IL-12B多肽通过肽接头可操作地连接至所述IL-12A多肽。在一些方面，所述IL-12多肽包含SEQ ID NO:39或SEQ ID NO:40所示的氨基酸序列或与SEQ IDNO:39或SEQ ID NO:40所示的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。在一些方面，所述IL-12多肽由包含SEQ ID NO:46所示核苷酸序列的核苷酸序列或与SEQ ID NO:46所示核苷酸序列具有至少80％同一性的核苷酸序列编码。在一些方面，所述IL-12B多肽位于所述IL-12A多肽的5’末端或所述肽接头的5’末端；或者其中所述IL-12A多肽位于所述IL-12B多肽的5’末端或所述肽接头的5’末端。
在一些方面，所述膜结构域通过肽接头可操作地连接至所述IL-12A多肽。在其他方面，所述膜结构域通过肽接头可操作地连接至所述IL-12B多肽。在一些方面，所述跨膜结构域包含源自I型整合膜蛋白的跨膜结构域。在一些方面，所述跨膜结构域选自由以下组成的组：分化簇8(CD8)跨膜结构域、血小板源性生长因子受体(PDGFR)跨膜结构域和分化簇80(CD80)跨膜结构域。
在一些方面，所述PDGFR-β跨膜结构域包含SEQ ID NO:42所示的氨基酸序列。在一些方面，所述CD8跨膜结构域包含SEQ ID NO:41所示的氨基酸序列。在一些方面，所述CD80跨膜结构域包含SEQ ID NO:43所示的氨基酸序列。
在其他方面，所述膜结构域包含细胞内结构域。在一些方面，所述细胞内结构域与所述跨膜结构域源自相同的多肽。在其他方面，所述细胞内结构域与所述跨膜结构域源自不同的多肽。在一些方面，所述胞内结构域选自由以下组成的组：PDGFR细胞内结构域、截短的PDGFR细胞内结构域，和CD80细胞内结构域。
在一些方面，所述细胞内结构域是包含PDGFR-β细胞内结构域的PDGFR细胞内结构域，所述PDGFR-β细胞内结构域包含SEQ ID NO:48所示的氨基酸序列。在一些方面，所述细胞内结构域是包含在E570或G739处截短的PDGFR-β细胞内结构域的截短PDGFR细胞内结构域。在一些方面，所述在E570处截短的截短PDGFR-β细胞内结构域包含SEQ ID NO:49所示的氨基酸序列。在一些方面，所述在G739处截短的截短PDGFR-β跨膜结构域包含SEQ ID NO:50所示的氨基酸序列。在其他方面，所述细胞内结构域是包含SEQ ID NO:47所示氨基酸序列的CD80细胞内结构域。
在一些方面，可操作地连接至膜结构域的IL-12多肽包括膜结构域，所述膜结构域包含：
(i)PDGFR-β跨膜结构域和PDGFR-β细胞内结构域；
(ii)PDGFR-β跨膜结构域和在E570处截短的截短PDGFR-β细胞内结构域；
(iii)PDGFR-β跨膜结构域和在G739处截短的截短PDGFR-β细胞内结构域；或
(iv)CD80跨膜结构域和CD80细胞内结构域。
在任一前述或相关方面，所述编码人IL-15Rα多肽的mRNA包含sushi结构域。在一些方面，所述IL-15Rα多肽包含sushi结构域、细胞内结构域和跨膜结构域。在一些方面，所述细胞内结构域和所述跨膜结构域源自IL-15Rα。在一些方面，所述细胞内结构域和所述跨膜结构域源自异源多肽。
在一些方面，所述编码人IL-15多肽的mRNA包含SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。在一些方面，所述IL-15多肽由包含SEQ ID NO:122所示核苷酸序列的核苷酸序列或与SEQ ID NO:122所示核苷酸序列具有至少80％同一性的核苷酸序列编码。
在一些方面，所述IL-15Rα多肽包含SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列或与SEQ IDNO:13所示的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。在一些方面，所述IL-15Rα多肽由包含SEQ ID NO:22所示核苷酸序列的核苷酸序列或与SEQ ID NO:22所示核苷酸序列具有至少80％同一性的核苷酸序列编码。
在一些方面，可操作地连接至IL-15Rα多肽的IL-15多肽包含SEQ ID NO:23、27和123中任一个所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:23、27和123中任一个所示的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。在一些方面，可操作地连接至IL-15Rα多肽的IL-15多肽由包含SEQ ID NO:24-26、28-30和124-126中任一个所示的核苷酸序列的核苷酸序列或与SEQ ID NO:24-26、28-30和124-126中任一个所示的核苷酸序列具有至少80％同一性的核苷酸序列编码。
在其他方面，本公开提供了一种LNP，所述LNP包含：
(i)编码人OX40L多肽的mRNA，其中所述人OX40L多肽包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；
(ii)编码人IL-15多肽的mRNA，其中所述人IL-15多肽包含SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列；
(iii)编码人IL-15Rα多肽的mRNA，其中所述人IL-15Rα多肽包含SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列；以及
(iv)编码可操作地连接至包含跨膜结构域的膜结构域的人IL-12多肽的mRNA，其中所述人IL-12多肽包含SEQ ID NO:61所示的氨基酸序列，
其中所述LNP包含摩尔比为约20％-60％:5％-25％:25％-55％:0.5％-15％的可电离氨基脂质:磷脂:结构脂质:PEG修饰脂质。在一些实施方案中，所述编码人OX40L、拴系人IL-12和细胞缔合性人IL-15的mRNA以1:1:1的重量(质量)比共同配制在LNP中。在一些实施方案中，所述编码人OX40L、栓系人IL-12和细胞缔合性人IL-15的mRNA以1:1:1的重量(质量)比共同配制，并且其中所述编码细胞缔合性人IL-15的mRNA由编码人IL-15和人IL-15Rα的两种mRNA编码，并且其中所述两种mRNA以1:1的摩尔比共同配制。
在一些方面，本公开提供了一种LNP，所述LNP包含：
(i)编码人OX40L多肽的mRNA，其中所述mRNA包含SEQ ID NO:11所示的核苷酸序列或与SEQ ID NO:11所示的核苷酸序列具有至少80％同一性的核苷酸序列；
(ii)编码人IL-15多肽的mRNA，其中所述mRNA包含SEQ ID NO:122所示的核苷酸序列或与SEQ ID NO:122所示的核苷酸序列具有至少80％同一性的核苷酸序列；
(iii)编码人IL-15Rα多肽的mRNA，其中所述mRNA包含SEQ ID NO:22所示的核苷酸序列或与SEQ ID NO:22所示的核苷酸序列具有至少80％同一性的核苷酸序列；以及
(iv)编码可操作地连接至包含跨膜结构域的膜结构域的人IL-12多肽的mRNA，其中所述mRNA包含SEQ ID NO:60所示的核苷酸序列或与SEQ ID NO:60所示的核苷酸序列具有至少80％同一性的核苷酸序列，
其中所述LNP包含摩尔比为约20％-60％:5％-25％:25％-55％:0.5％-15％的可电离氨基脂质:磷脂:结构脂质:PEG修饰脂质。在一些实施方案中，编码人OX40L、栓系人IL-12和细胞缔合性人IL-15的mRNA在LNP中以1:1:1的重量(质量)比共同配制。在一些实施方案中，编码人OX40L、栓系人IL-12和细胞缔合性人IL-15的mRNA以1:1:1的重量(质量)比共同配制，并且其中编码细胞缔合性人IL-15的mRNA由编码人IL-15和人IL-15Rα的两种mRNA编码，并且其中所述两种mRNA以1:1的摩尔比共同配制。
在一个实施方案中，所述LNP包含0.1-1:0.1-1:0.1-1重量比(质量比)的OX40L:IL-15+IL-15Ra:IL-12。在一个实施方案中，所述LNP包含1:1:1的重量比(质量比)的编码OX40L:IL-15+IL-15Rα:IL-12的mRNA。在一些方面，所述LNP包含1:1:1重量比(质量比)的编码OX40L:IL-15/IL-15Rα:IL-12的mRNA。在一些方面，编码人OX40L多肽的mRNA的量为LNP中剩余mRNA的量的1/10。
在任一前述或相关方面，所述LNP被配制成用于肿瘤内递送。在其他方面，所述LNP被配制成用于静脉内递送。
在一些方面，所述LNP包含摩尔比为约20％-60％:5％-25％:25％-55％:0.5％-15％的可电离氨基脂质:磷脂:结构脂质:PEG修饰脂质。在一些方面，所述脂质纳米颗粒包含摩尔比为约50％:约10％:约38.5％:约1.5％的可电离脂质:磷脂:甾醇:PEG修饰脂质。在一些方面，所述脂质纳米颗粒包含摩尔比为50:38.5:10:1.5的可电离脂质:胆固醇:DSPC:PEG修饰脂质。在一些方面，所述可电离脂质选自由以下组成的组：例如，2,2-二亚油基-4-二甲基氨基乙基-[1,3]-二氧戊环(DLin-KC2-DMA)、4-二甲基氨基丁酸二亚油基-甲酯(DLin-MC3-DMA)和9-((4-(二甲基氨基)丁酰基)氧基)十七烷二酸二((Z)-壬-2-烯-1-基)酯(L319)。在一些方面，所述可电离脂质包含化合物X。
在一些方面，所述LNP包含摩尔比为约20％-60％:5％-25％:25％-55％:0.5％-15％的化合物X:磷脂:胆固醇:PEG修饰脂质。在一些方面，所述脂质纳米颗粒包含摩尔比为约50％:约10％:约38.5％:约1.5％的化合物X:磷脂:胆固醇:PEG修饰脂质。
在一些方面，所述脂质纳米颗粒中的PEG修饰脂质是PEG-DMG或化合物P-428。在一些方面，所述脂质纳米颗粒包含摩尔比为50:38.5:10:1.5的化合物X:胆固醇:磷脂:化合物P-428，或化合物X:胆固醇:DSPC:化合物P-428。在一些方面，所述脂质纳米颗粒包含摩尔比为40:38.5:20:1.5的化合物X:胆固醇:磷脂:化合物P-428，或化合物X:胆固醇:DSPC:化合物P-428。
在一些方面，所述LNP包含植物甾醇或植物甾醇与胆固醇的组合。在一些方面，所述植物甾醇选自由以下组成的组：β-谷甾醇、豆甾醇、β-谷甾烷醇、菜油甾醇、菜子甾醇以及它们的组合。在一些方面，所述植物甾醇包括(i)谷甾醇或其盐或酯，或(ii)豆甾醇或其盐或酯。在一些方面，所述植物甾醇是β-谷甾醇
Figure BDA0003064795710000221
或其盐或酯。
在其他方面，所述植物甾醇或其盐或酯选自由以下组成的组：β-谷甾醇、β-谷甾烷醇、菜油甾醇、菜子甾醇、化合物S-140、化合物S-151、化合物S-156、化合物S-157、化合物S-159、化合物S-160、化合物S-164、化合物S-165、化合物S-170、化合物S-173、化合物S-175以及它们的组合。
在一些方面，甾醇或其他结构脂质的mol％是18.5％植物甾醇，并且结构脂质的总mol％是38.5％。在其他方面，甾醇或其他结构脂质的mol％是28.5％植物甾醇，并且结构脂质的总mol％是38.5％。
在一些方面，所述LNP包含摩尔比为50:10:10:28.5:1.5的化合物X:DSPC:胆固醇:β-谷甾醇:PEG-DMG。在一些方面，本公开的mRNA被配制在相同或不同的LNP中，其中所述LNP包含摩尔比为50:10:20:18.5:1.5的化合物X:DSPC:胆固醇:β-谷甾醇:PEG-DMG。
在任一前述方面，每种mRNA包含3’非翻译区(UTR)。在一些方面，所述3’UTR包含至少一个微RNA(miR)结合位点。在一些方面，所述至少一个miR结合位点是miR-122结合位点。在另一方面，所述miR-122结合位点是miR-122-3p或miR-122-5p结合位点。在一些方面，所述miR-122-5p结合位点包含SEQ ID NO:83所示的核苷酸序列。在一些方面，所述miR-122-3p结合位点包含SEQ ID NO:74所示的核苷酸序列。在任一前述方面，每种mRNA包含3’UTR，所述3’UTR包含SEQ ID NO:77或SEQ ID NO:121所示的核苷酸序列。
在任一前述方面，每种mRNA包含5’非翻译区(UTR)。在一些方面，所述5’UTR包含SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:133所示的核苷酸序列。
在任一前述方面，每种mRNA包括至少一种化学修饰。在一些方面，所述化学修饰选自由以下组成的组：假尿苷、N1-甲基假尿苷、2-硫代尿苷、4’-硫代尿苷、5-甲基胞嘧啶、2-硫代-1-甲基-1-脱氮-假尿苷、2-硫代-1-甲基-假尿苷、2-硫代-5-氮杂-尿苷、2-硫代-二氢假尿苷、2-硫代-二氢尿苷、2-硫代-假尿苷、4-甲氧基-2-硫代-假尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-硫代-1-甲基-假尿苷、4-硫代-假尿苷、5-氮杂-尿苷、二氢假尿苷、5-甲基尿苷、5-甲基尿苷、5-甲氧基尿苷和2’-O-甲基尿苷。
在任一前述方面，每种mRNA中至少95％的尿苷是N1-甲基假尿苷。在一些方面，每种mRNA中至少99％的尿苷是N1-甲基假尿苷。在一些方面，每种mRNA中100％的尿苷是N1-甲基假尿苷。
在一些方面，本公开提供了用于治疗有需要的受试者的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用本文所述的脂质纳米颗粒。在一些方面，本公开提供了用于治疗有需要的受试者的播散性癌症如髓系恶性肿瘤的方法，所述方法包括向所述受试者施用本文所述的脂质纳米颗粒。在一些方面，本公开提供了用于治疗有需要的受试者的实体瘤的方法，所述方法包括向所述受试者施用本文所述的脂质纳米颗粒。在一些方面，所述方法还包括施用检查点抑制剂多肽或编码检查点抑制剂多肽的mRNA。在一些方面，所述检查点抑制剂多肽抑制PD-1、PD-L1、CTLA-4或它们的组合。在一些方面，所述检查点抑制剂多肽是抗体或编码所述抗体的mRNA。在一些方面，所述抗体是抗CTLA-4抗体或其特异性地结合CTLA-4的抗原结合片段、抗PD-1抗体或其特异性地结合PD-1的抗原结合片段、抗PD-L1抗体或其特异性地结合PD-L1的抗原结合片段，以及它们的组合。在一些方面，所述抗PD-L1抗体是阿特珠单抗、阿维鲁单抗或度伐鲁单抗。在一些方面，所述抗CTLA-4抗体是曲美木单抗或伊匹单抗。在一些方面，所述抗PD-1抗体是纳武单抗或派姆单抗。
在其他方面，本公开提供了如本文所述的脂质纳米颗粒和任选的药学上可接受的载体，其用于治疗个体的癌症或延迟癌症的进展，其中治疗包括施用所述脂质纳米颗粒。在其他方面，本公开提供了如本文所述的脂质纳米颗粒和任选的药学上可接受的载体，其用于治疗个体的播散性癌症如髓系恶性肿瘤或延迟播散性癌症如髓系恶性肿瘤的进展，其中治疗包括施用所述脂质纳米颗粒。在其他方面，本公开提供了如本文所述的脂质纳米颗粒和任选的药学上可接受的载体，其用于治疗个体的实体瘤或延迟实体瘤的进展，其中治疗包括施用所述脂质纳米颗粒。
在一些方面，本公开提供了如本文所述的脂质纳米颗粒和任选的药学上可接受的载体，其用于治疗个体的癌症或延迟癌症的进展，其中治疗包括与包含免疫检查点抑制性多肽和任选的药学上可接受的载体的组合物组合施用所述脂质纳米颗粒。在一些方面，本公开提供了如本文所述的脂质纳米颗粒和任选的药学上可接受的载体，其用于治疗个体的播散性癌症如髓系恶性肿瘤或延迟播散性癌症如髓系恶性肿瘤的进展，其中治疗包括与包含免疫检查点抑制性多肽和任选的药学上可接受的载体的组合物组合施用所述脂质纳米颗粒。在一些方面，本公开提供了如本文所述的脂质纳米颗粒和任选的药学上可接受的载体，其用于治疗个体的实体瘤或延迟实体瘤的进展，其中治疗包括与包含免疫检查点抑制性多肽和任选的药学上可接受的载体的组合物组合施用所述脂质纳米颗粒。
在其他方面，本公开提供了如本文所述的脂质纳米颗粒和任选的药学上可接受的载体在制造用于治疗个体的癌症或延迟癌症的进展的药物中的用途，其中所述药物包含所述脂质纳米颗粒和任选的药学上可接受的载体，并且其中所述治疗包括施用所述药物。在其他方面，本公开提供了如本文所述的脂质纳米颗粒和任选的药学上可接受的载体在制造用于治疗个体的播散性癌症如髓系恶性肿瘤或延迟播散性癌症如髓系恶性肿瘤的进展的药物中的用途，其中所述药物包含所述脂质纳米颗粒和任选的药学上可接受的载体，并且其中所述治疗包括施用所述药物。在其他方面，本公开提供了如本文所述的脂质纳米颗粒和任选的药学上可接受的载体在制造用于治疗个体的实体瘤或延迟实体瘤的进展的药物中的用途，其中所述药物包含所述脂质纳米颗粒和任选的药学上可接受的载体，并且其中所述治疗包括施用所述药物。
在一些方面，本公开提供了如本文所述的脂质纳米颗粒和任选的药学上可接受的载体在制造用于治疗个体的癌症或延迟癌症的进展的药物中的用途，其中所述药物包含所述脂质纳米颗粒和任选的药学上可接受的载体，并且其中所述治疗包括与包含免疫检查点抑制剂多肽或编码所述免疫检查点抑制剂多肽的mRNA和任选的药学上可接受的载体的组合物组合施用所述药物。在一些方面，本公开提供了如本文所述的脂质纳米颗粒和任选的药学上可接受的载体在制造用于治疗个体的播散性癌症如髓系恶性肿瘤或延迟播散性癌症如髓系恶性肿瘤的进展的药物中的用途，其中所述药物包含所述脂质纳米颗粒和任选的药学上可接受的载体，并且其中所述治疗包括与包含免疫检查点抑制剂多肽或编码免疫检查点抑制剂多肽的mRNA和任选的药学上可接受的载体的组合物组合施用所述脂质纳米颗粒。在一些方面，本公开提供了如本文所述的脂质纳米颗粒和任选的药学上可接受的载体在制造用于治疗个体的实体瘤或延迟实体瘤的进展的药物中的用途，其中所述药物包含所述脂质纳米颗粒和任选的药学上可接受的载体，并且其中所述治疗包括与包含免疫检查点抑制剂多肽或编码免疫检查点抑制剂多肽的mRNA和任选的药学上可接受的载体的组合物组合施用所述脂质纳米颗粒。
在其他方面，本公开提供了一种药盒，所述药盒包括：容器，所述容器包括如本文所述的脂质纳米颗粒和任选的药学上可接受的载体；以及包装插入物，所述包装插入物包括用于施用所述脂质纳米颗粒以治疗个体的癌症或延迟癌症的进展的说明书。在一些方面，所述包装插入物还包括用于将所述脂质纳米颗粒与包含免疫检查点抑制剂多肽或编码免疫检查点抑制剂多肽的mRNA和任选的药学上可接受的载体的组合物组合施用以治疗个体的癌症或延迟癌症的进展的说明书。
在其他方面，本公开提供了一种药盒，所述药盒包括：容器，所述容器包括如本文所述的脂质纳米颗粒和任选的药学上可接受的载体；以及包装插入物，所述包装插入物包括用于施用所述脂质纳米颗粒以治疗个体的播散性癌症如髓系恶性肿瘤或延迟播散性癌症如髓系恶性肿瘤的进展的说明书。在一些方面，所述包装插入物还包括用于将脂质纳米颗粒与包含免疫检查点抑制剂多肽和任选的药学上可接受的载体的组合物组合施用以治疗个体的播散性癌症如髓系恶性肿瘤或延迟播散性癌症如髓系恶性肿瘤的进展的说明书。
在其他方面，本公开提供了一种药盒，所述药盒包括：容器，所述容器包括如本文所述的脂质纳米颗粒和任选的药学上可接受的载体；以及包装插入物，所述包装插入物包括用于施用所述脂质纳米颗粒以治疗个体的实体瘤或延迟实体瘤的进展的说明书。在一些方面，所述包装插入物还包括用于将所述脂质纳米颗粒与包含免疫检查点抑制剂多肽和任选的药学上可接受的载体的组合物组合施用以治疗个体的实体瘤或延迟实体瘤的进展的说明书。
在一些方面，本公开提供了一种药盒，所述药盒包括：容器，所述容器包括如本文所述的脂质纳米颗粒和任选的药学上可接受的载体；以及包装插入物，所述包装插入物包括用于单独地或与包含免疫检查点抑制剂多肽和任选的药学上可接受的载体的组合物组合地施用所述药物以治疗个体的癌症或延迟癌症的进展的说明书。在一些方面，本公开提供了一种药盒，所述药盒包括：容器，所述容器包括如本文所述的脂质纳米颗粒和任选的药学上可接受的载体；以及包装插入物，所述包装插入物包括用于单独地或与包含免疫检查点抑制剂多肽和任选的药学上可接受的载体的组合物组合地施用所述药物以治疗个体的播散性癌症(如髓系恶性肿瘤)或延迟播散性癌症(如髓系恶性肿瘤)的进展的说明书。在一些方面，本公开提供了一种药盒，所述药盒包括：容器，所述容器包括如本文所述的脂质纳米颗粒和任选的药学上可接受的载体；以及包装插入物，所述包装插入物包括用于单独地或与包含免疫检查点抑制剂多肽和任选的药学上可接受的载体的组合物组合地施用所述药物以治疗个体的实体瘤或延迟实体瘤的进展的说明书。
在其他方面，本公开提供了用于增强受试者中的免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者施用如本文所述的脂质纳米颗粒或mRNA的组合。
在其他方面，本公开提供了用于增强受试者中的免疫细胞激活的方法，所述方法包括向所述受试者施用如本文所述的脂质纳米颗粒或mRNA的组合。在一些方面，所述免疫细胞激活包括T细胞激活、NK细胞激活或T细胞和NK细胞激活两者。
在其他方面，本公开提供了用于增强受试者中的NK细胞激活的方法，所述方法包括向所述受试者施用如本文所述的脂质纳米颗粒或mRNA的组合。
在任一前述方法中，所述受试者患有髓系恶性肿瘤。在一些方面，所述髓系恶性肿瘤是AML。在任一前述方法中，所述受试者患有实体瘤。
在任一前述方面，所述方法还包括施用如本文所述的检查点抑制剂多肽或编码检查点抑制剂多肽的mRNA。
在任一前述方面，如本文所述的mRNA、药物组合物或LNP具有选自由以下组成的组的一种或多种活性：(a)NK、NKT、CD8+ T、CD4+ T和/或树突状细胞(DC)群增加；(b)NK、NKT、CD8+ T细胞、CD4+ T细胞和/或DC增殖增加；(c)NK、NKT、CD8+ T、CD4+ T和/或树突状细胞激活增加；(d)DC成熟增加；(e)经治疗的受试者的疾病负担减轻减轻；(f)经治疗的受试者的存活率提高；(g)IFNγ或IP10的表达增加；以及(h)(a)-(g)的任何组合。
在任一前述方面，受如本文所述的mRNA、药物组合物或LNP影响的DC群是CD8+cDC1、CD103+cDC1、cDC2或iDC群。
附图说明
图1提供了示出在不存在或存在人血清的情况下含有不同PEG修饰脂质(PEG DMG或化合物428)的脂质纳米颗粒(LNP)的体外AML细胞系(Kasumi-1)转染效率的图。
图2提供了示出在存在人血清的情况下含有不同PEG修饰脂质(PEG DMG或化合物428)的LNP的体外原代AML样品转染效率的图。
图3A至图3C是示出植入了P388D1 AML细胞并用配制在LNP中的编码鼠OX40L(mOX40L)的mRNA(图3A)、配制在LNP中的编码mOX40L和人IL-15(hIL-15)的mRNA(图3B)和配制在LNP中的编码mOX40L、hIL-15和鼠IL-12(mIL-12)的mRNA(图3C)。LNP以肿瘤内方式施用。
图4A至图4D提供了人IL-15/IL-15Rα构建体的示意图。图4A示出了IL-15多肽(左)和包含sushi结构域和跨膜结构域的IL-15Rα多肽(右)，其中IL-15以高亲和力结合至IL-15Rαsushi结构域，从而将IL-15限制于表达IL-15Rα的细胞。图4B示出了拴系IL-15构建体，其中IL-15多肽连接至全长IL-15Rα，从而将IL-15拴系至细胞膜。图4C示出了分泌性IL-15构建体，其中IL-15多肽连接至IL-15Rα的sushi结构域。图4D示出了拴系IL-15构建体，其中IL-15多肽连接至IL-15Ra的sushi结构域，所述sushi结构域连接至异源多肽(例如，CD80)的跨膜结构域和细胞内结构域。
图5A至图5D提供了比较图4A至图4C中描述的人IL-15/IL-15Rα构建体之间的蛋白质表达和T细胞增殖的图。图5A示出了当用Lipofectamine 2000中的编码指示IL-15/IL-15Rα构建体的mRNA转染HeLa细胞时，上清液或裂解物中IL-15的蛋白质表达。图5B示出了当与用Lipofectamine 2000中的编码指示IL-15/IL-15Rα构建体的mRNA转染的HeLa细胞共培养时，T细胞的增殖。图5C示出了当用编码指示IL-15/IL-15Rα构建体的不同mRNA型式转染HeLa细胞时，上清液或裂解物中IL-15的蛋白表达。图5D示出了上清液中脱落蛋白质的百分比(上清液表达/裂解物表达+上清液表达)。
图6A至图6F是示出植入了C1498 AML细胞并用包封编码以下的mRNA的LNP肿瘤内治疗的小鼠的肿瘤体积的图：NST-mOX40L(NST)(图6A)、mOX40L(图6B)、hIL-15/IL-15Rα(图6C)、膜栓系mIL-12(mIL-12TM)(图6D)、mOX40L+hIL-15/IL-15Rα(图6E)或mOX40L+hIL-15/IL-15Rα+mIL-12TM(图6F)。
图7A至图7C是示出用包封编码以下的mRNA的LNP肿瘤内治疗的患有AML肿瘤的小鼠的存活百分比：各种单剂(mOX40L或hIL-15/IL-15Rα或mIL-12TM mRNA)(图7A)、各种mOX40L+hIL-15/IL-15Rα双联体mRNA(图7B)或各种mOX40L+hIL-15/IL-15Rα+mIL-12TM三联体mRNA(图7C)。
图8A至图8B示出了携带播散性AML模型并用配制在包含化合物X和化合物428的单独LNP中的编码小鼠OX40L(即，mOX40L)、细胞缔合性人IL-15(即，hIL-15+hIL-15Rα)和栓系小鼠IL-12(连接至PDGFR跨膜结构域的mIL-12，即mIL-12TM)的mRNA(2mg/kg总mRNA)的组合静脉内治疗的小鼠的疾病负担。图8A示出了生物发光成像(BLI)，图8B示出了如通过流式细胞术测定的血液中GFP+细胞的数量。
图9提供了示出在植入AML细胞后21天，用配制在包含化合物X和化合物428的单独LNP中的编码mOX40L、细胞缔合性hIL-15和栓系mIL-12的mRNA的组合静脉内治疗的小鼠的血液中白血病疾病负担减轻的图。通过流式细胞术测定血液中GFP+细胞的数量(左)，以及CD45+细胞的GFP+％(右)。
图10提供了示出图9中的小鼠，和用配制在包含化合物X和化合物428的单独LNP中的编码mOX40L、细胞缔合性hIL-15和拴系mIL-12的mRNA的组合以不同的给药方案(即，2mg/kg一次(QDx1)；2mg/kg每周一次持续三周(Q7Dx3)；0.67mg/kg每周一次持续三周(Q7Dx3)；0.22mg/kg每周三次持续三周(TIWx3))治疗的小鼠的Kaplan-Meier存活图。
图11提供了示出如通过生物发光成像(BLI)测定的，图9中的小鼠的保护性免疫的图，所述小鼠对不同给药方案的编码mOX40L、细胞缔合性hIL-15和栓系mIL-12的mRNA的组合疗法有完全应答并受到AML细胞再攻击。
图12提供了用AML细胞再攻击的小鼠的Kaplan-Meier存活图，如图11中所述。
图13提供了示出如通过流式细胞术测定的，用AML细胞再攻击的小鼠的血液中GFP+细胞的数量的图，如图11中所述。
图14提供了示出在静脉内施用配制在包含化合物X和化合物428的LNP(LNP1)或包含化合物X/DSPC/胆固醇/β-谷甾醇/PEG-DMG的LNP(LNP2)中的编码mOX40L的mRNA的0.22mg/kg的第三次TIW剂量后24小时，从携带AML细胞的小鼠的外周血、脾脏或骨髓中分离出的指示细胞类型中mOX40L+细胞的百分比的图。
图15提供了示出在第一次静脉内剂量后6小时、24小时、48小时和54小时，接受0.22mg/kg每周三次(TIW)或2mg/kg单剂量的剂量的配制在单独LNP中的编码mOX40L、细胞缔合性hIL-15和栓系mIL-12的mRNA的组合的小鼠中的小鼠IFNγ(左)、内源性小鼠IL-15/15R(中)和小鼠IP-10(右)的血清细胞因子水平的图。
图16提供了示出在第一次和第二次静脉内TIW剂量后6小时和24小时，接受配制在LNP1或LNP2中的编码mOX40L；细胞缔合性hIL-15；栓系mIL-12；mOX40L+细胞缔合性hIL-15；mOX40L+栓系mIL-12；细胞缔合性hIL-15+栓系mIL-12；或mOX40L+细胞缔合性hIL-15+栓系mIL-12的mRNA的小鼠中的小鼠IFNγ(左)和内源性小鼠IL-15/IL-15R(右)的血清细胞因子水平的图。
图17A至图17D提供了示出携带播散性AML模型并用编码以下的mRNA静脉内治疗的小鼠的体重变化百分比的图：mOX40L+细胞缔合性hIL-15(图17A)；mOX40L+栓系mIL-12(图17B)；细胞缔合性hIL-15+栓系mIL-12(图17C)；或mOX40L+细胞缔合性hIL-15+栓系mIL-12(图17D)。mRNA配制在包含化合物X和化合物428的单独LNP中，并以0.22mg/kg每周三次持续三周的剂量施用。
图18A至图18B提供了示出施用单次肿瘤内剂量的编码mOX40L、栓系mIL-12和细胞缔合性hIL-15的mRNA(图18A)以及与免疫检查点抑制剂即抗mCTLA-4抗体的组合(图18B)的携带MC38-R的肿瘤的小鼠的肿瘤体积的图。
图19A至图19D提供了流式细胞术图，示出在第1次剂量后24小时(24h)、第3次剂量后24小时(6d)和第6次剂量后24小时(13d)，施用编码mOX40L、栓系mIL-12和细胞缔合性hIL-15的mRNA或对照mRNA(NST)的小鼠中NK细胞占活CD45+细胞的百分比。提供了外周血(PB)(图19A)、脾脏(SP)(图19B)、骨髓(BM)(图19C)和腹股沟淋巴结(LN)(图19D)中的NK细胞百分比。
图20A至图20D提供了流式细胞术图，示出在第1次剂量后24小时(24h)、第3次剂量后24小时(6d)和第6次剂量后24小时(13d)，施用编码mOX40L、栓系mIL-12和细胞缔合性hIL-15的mRNA或对照mRNA(NST)的小鼠中表达激活标志物CD69的NK细胞的百分比。提供了外周血(PB)(图20A)、脾脏(SP)(图20B)、骨髓(BM)(图20C)和腹股沟淋巴结(LN)(图20D)中的表达CD69的NK细胞的百分比。
图21A至图21D提供了流式细胞术图，示出在第1次剂量后24小时(24h)、第3次剂量后24小时(6d)和第6次剂量后24小时(13d)，施用编码mOX40L、栓系mIL-12和细胞缔合性hIL-15的mRNA或对照mRNA(NST)的小鼠中NKT细胞占活CD45+细胞的百分比。提供了外周血(PB)(图21A)、脾脏(SP)(图21B)、骨髓(BM)(图21C)和腹股沟淋巴结(LN)(图21D)中的NK细胞百分比。
图22A至图22D提供了流式细胞术图，示出在第1次剂量后24小时(24h)、第3次剂量后24小时(6d)和第6次剂量后24小时(13d)，施用编码mOX40L、栓系mIL-12和细胞缔合性hIL-15的mRNA或对照mRNA(NST)的小鼠中表达激活标志物CD69的NKT细胞的百分比。提供了外周血(PB)(图22A)、脾脏(SP)(图22B)、骨髓(BM)(图22C)和腹股沟淋巴结(LN)(图22D)中的表达CD69的NKT细胞的百分比。
图23A至图23D提供了流式细胞术图，示出在第1次剂量后24小时(24h)、第3次剂量后24小时(6d)和第6次剂量后24小时(13d)，施用编码mOX40L、栓系mIL-12和细胞缔合性hIL-15的mRNA或对照mRNA(NST)的小鼠中CD8+ T细胞占活CD45+细胞的百分比。提供了外周血(PB)(图23A)、脾脏(SP)(图23B)、骨髓(BM)(图23C)和腹股沟淋巴结(LN)(图23D)中的CD8+ T细胞百分比。
图24A至图24D提供了流式细胞术图，示出在第1次剂量后24小时(24h)、第3次剂量后24小时(6d)和第6次剂量后24小时(13d)，施用编码mOX40L、栓系mIL-12和细胞缔合性hIL-15的mRNA或对照mRNA(NST)的小鼠中表达激活标志物CD69的CD8+ T细胞的百分比。提供了外周血(PB)(图24A)、脾脏(SP)(图24B)、骨髓(BM)(图24C)和腹股沟淋巴结(LN)(图24D)中的表达CD69的CD8+ T细胞的百分比。
图25A至图25D提供了流式细胞术图，示出在第1次剂量后24小时(24h)、第3次剂量后24小时(6d)和第6次剂量后24小时(13d)，施用编码mOX40L、栓系mIL-12和细胞缔合性hIL-15的mRNA或对照mRNA(NST)的小鼠中CD4+ T细胞占活CD45+细胞的百分比。提供了外周血(PB)(图25A)、脾脏(SP)(图25B)、骨髓(BM)(图25C)和腹股沟淋巴结(LN)(图25D)中的CD4+ T细胞百分比。
图26A至图26D提供了流式细胞术图，示出在第1次剂量后24小时(24h)、第3次剂量后24小时(6d)和第6次剂量后24小时(13d)，施用编码mOX40L、栓系mIL-12和细胞缔合性hIL-15的mRNA或对照mRNA(NST)的小鼠中表达激活标志物CD69的CD4+ T细胞的百分比。提供了外周血(PB)(图26A)、脾脏(SP)(图26B)、骨髓(BM)(图26C)和腹股沟淋巴结(LN)(图26D)中的表达CD69的CD4+ T细胞的百分比。
图27A至图27D提供了流式细胞术图，示出在第1次剂量后24小时(24h)、第3次剂量后24小时(6d)和第6次剂量后24小时(13d)，施用编码mOX40L、栓系mIL-12和细胞缔合性hIL-15的mRNA或对照mRNA(NST)的小鼠中脾脏DC细胞群占活CD45+细胞的百分比。提供了CD8+cDC1细胞数量(图27A)、CD103+cDC1细胞数量(图27B)、cDC2细胞数量(图27C)和iDC细胞数量(图27D)。
图28A至图28D提供了流式细胞术图，示出在第1次剂量后24小时(24h)、第3次剂量后24小时(6d)和第6次剂量后24小时(13d)，施用编码mOX40L、栓系mIL-12和细胞缔合性hIL-15的mRNA或对照mRNA(NST)的小鼠中腹股沟淋巴结DC细胞群占活CD45+细胞的百分比。提供了CD8+cDC1细胞数量(图28A)、CD103+cDC1细胞数量(图28B)、cDC2细胞数量(图28C)和iDC细胞数量(图28D)。
图29A至图29D提供了流式细胞术图，示出在第1次剂量后24小时(24h)、第3次剂量后24小时(6d)和第6次剂量后24小时(13d)，施用编码mOX40L、栓系mIL-12和细胞缔合性hIL-15的mRNA或对照mRNA(NST)的小鼠中成熟标志物CD86在脾脏和腹股沟淋巴结CD8+cDC1和CD103+cDC1细胞群上的表达。提供了脾脏CD8+cDC1细胞(图29A)、脾脏CD103+cDC1细胞(图29B)、腹股沟淋巴结CD8+cDC1细胞(图29C)和腹股沟淋巴结CD103+cDC1细胞(图29D)的CD86 MFI。
图30A至图30D提供了流式细胞术图，示出在第1次剂量后24小时(24h)、第3次剂量后24小时(6d)和第6次剂量后24小时(13d)，施用编码mOX40L、栓系mIL-12和细胞缔合性hIL-15的mRNA或对照mRNA(NST)的小鼠中成熟标志物CD86在脾脏和腹股沟淋巴结cDC2和iDC细胞群上的表达。提供了脾脏cDC2细胞(图30A)、脾脏iDC细胞(图30B)、腹股沟淋巴结cDC2细胞(图30C)和腹股沟淋巴结iDC细胞(图30D)的CD86 MFI。
图31提供了示出携带AML的C57BL/6或Batf3 KO小鼠的存活百分比的图。荷瘤C57BL/6未经治疗，施用对照mRNA(NST)或编码mOX40L、拴系mIL-12和细胞缔合性hIL-15的mRNA。每周三次持续两周(TIWx3)向荷瘤Batf3 KO小鼠施用0.22mg/kg的对照mRNA(NST)或编码mOX40L、栓系mIL-12和细胞缔合性hIL-15的mRNA。
图32提供了示出施用对照mRNA或编码mOX40L、栓系mIL-12和细胞缔合性hIL-15的mRNA，和未治疗的，用同种型mAb治疗的或用抗CD4+mAb治疗的小鼠的存活百分比的图。
图33提供了示出施用对照mRNA或编码mOX40L、栓系mIL-12和细胞缔合性hIL-15的mRNA，和未治疗的，用同种型mAb治疗的或用抗IFNγmAb治疗的小鼠的存活百分比的图。
图34A至图34B提供了流式细胞术图，示出在向荷瘤小鼠施用编码mOX40L、栓系mIL-12和细胞缔合性hIL-15的mRNA或对照mRNA，且进一步不治疗，用同种型mAb治疗或用抗IFNγmAb治疗后，单核细胞上的MHC II表达，显示为单核细胞百分比(图34A)或MFI(图34B)。
图35A至图35B提供了流式细胞术图，示出在向荷瘤小鼠施用编码mOX40L、栓系mIL-12和细胞缔合性hIL-15的mRNA或对照mRNA，且进一步不治疗，用同种型mAb治疗或用抗IFNγmAb治疗后，骨髓细胞上的PD-L1表达，显示为骨髓细胞百分比(图35A)或MFI(图35B)。
图36A至图36B提供了流式细胞术图，示出在向荷瘤小鼠施用编码mOX40L、栓系mIL-12和细胞缔合性hIL-15的mRNA或对照mRNA，且进一步不治疗，用同种型mAb治疗或用抗IFNγmAb治疗后，粒细胞上的PD-L1表达，显示为粒细胞百分比(图36A)或MFI(图36B)。
图37A至图37B提供了流式细胞术图，示出在向荷瘤小鼠施用编码hOX40L、栓系hIL-12和细胞缔合性hIL-15的mRNA或对照mRNA，且进一步不治疗，用同种型mAb治疗或用抗IFNγmAb治疗后，单核细胞上的PD-L1表达，显示为单核细胞百分比(图37A)或MFI(图37B)。
图38A至图38F提供了示出施用配制在LNP中的编码hOX40L、栓系hIL-12和细胞缔合性hIL-15的mRNA后，食蟹猴中IFNγ(图38A至图38C)和IP-10(CXCL10)(图38D至图38F)的表达的图。
图39A至图39C提供了流式细胞图，分别示出施用编码hOX40L、栓系hIL-12和细胞缔合性hIL-15的mRNA或给予Tris/蔗糖对照注射液的食蟹猴的脾脏和骨髓样品中的NK、NKT和CD8+ T细胞数量(占活CD45+细胞的百分比)。
图40A至图40D提供了流式细胞图，分别示出施用hOX40L、栓系hIL-12和细胞缔合性hIL-15或给予Tris/蔗糖对照注射液的食蟹猴的脾脏和骨髓样品中具有激活标志物CD69的CD8+ T细胞、NK、CD4+ T细胞和NKT细胞的百分比。
具体实施方式
一种特别令人兴奋的治疗癌症的方法涉及用刺激免疫应答的物质来预防或治疗疾病，称为免疫疗法。免疫疗法，在本领域中也称为免疫肿瘤学，已经开始通过引入靶向宿主免疫系统而非肿瘤的疗法，革新癌症治疗。这些疗法具有独特的药理学应答特征，因此代表了可治愈许多不同类型的癌症的疗法。肺癌、肾癌、膀胱癌和皮肤癌是免疫肿瘤学治疗在存活率或肿瘤应答方面取得显著功效的癌症之一，其中黑素瘤可能显示出最大的益处。
播散性癌症是严重的健康问题，不能通过常规疗法有效治疗。具体地，已知播散性癌症，包括转移性癌症和通常不形成实体瘤的血液癌症，如髓系恶性肿瘤(例如，AML)，通过多种机制逃避免疫应答，从而阻碍有效免疫应答的发展。例如，已知AML通过上调NK抑制蛋白，通过抑制NK激活配体和/或通过诱导NK细胞无应答来逃避NK细胞裂解。此外，AML中体细胞突变的发生率较低，这导致新抗原谱较低，由此导致AML特异性T细胞应答性较低且抗肿瘤免疫较低(参见例如，Grove和Vassilou(2014)Dis.Models Mech.7:94)。
尽管可通过常规疗法(例如，手术)治疗实体瘤，但是许多癌症对这种疗法无应答或发生复发。此外，肿瘤微环境是复杂的，经常决定治疗的结果。
因此，可用于治疗癌症的方法和组合物，特别是增强针对癌症的免疫应答(例如，NK细胞和/或T细胞的免疫应答)的方法和组合物引起了极大的兴趣。
本文提供了用于治疗癌症(例如，实体瘤或播散性癌症如髓系恶性肿瘤)的组合物，所述组合物包含一种或多种多核苷酸(例如，mRNA，例如修饰的mRNA)，以在有需要的受试者中刺激特定免疫细胞群体。
在一些实施方案中，本公开提供了用于治疗癌症(例如，实体瘤或播散性癌症如髓系恶性肿瘤)的包含至少两种mRNA(例如，修饰的mRNA)的组合物，其中所述至少两种mRNA编码人OX40L多肽、可操作地连接至包含跨膜结构域的膜结构域的人IL-12多肽、人IL-15多肽、人IL-15Rα多肽以及它们的组合。在一些实施方案中，所述组合物包含：
(a)编码人OX40L多肽的mRNA和编码可操作地连接至包含跨膜结构域的膜结构域的人IL-12多肽的mRNA；
(b)编码人OX40L多肽的mRNA、编码人IL-15多肽的mRNA和编码人IL-15Rα多肽的mRNA；
(c)编码人OX40L多肽的mRNA和编码可操作性地连接至人IL-15Rα多肽的人IL-15多肽的mRNA；
(d)编码可操作地连接至包含跨膜结构域的膜结构域的人IL-12多肽的mRNA、编码人IL-15多肽的mRNA和编码人IL-15Rα多肽的mRNA；
(e)编码可操作地连接至包含跨膜结构域的膜结构域的人IL-12多肽的mRNA和编码可操作地连接至人IL-15Rα多肽的人IL-15多肽的mRNA；
(f)编码OX40L多肽的mRNA、编码可操作地连接至包含跨膜结构域的膜结构域的人IL-12多肽的mRNA、编码人IL-15多肽的mRNA和编码人IL-15Rα多肽的mRNA；或
(g)编码人OX40L多肽的mRNA、编码可操作地连接至包含跨膜结构域的膜结构域的人IL-12多肽的mRNA和编码可操作地连接至人IL-15Rα多肽的人IL-15多肽的mRNA。
在一些实施方案中，编码人OX40L、栓系人IL-12和细胞缔合性人IL-15的mRNA在LNP中以1:1:1的重量(质量)比共同配制。在一些实施方案中，编码人OX40L、栓系人IL-12和细胞缔合性人IL-15的mRNA以1:1:1的重量(质量)比共同配制，并且其中编码细胞缔合性人IL-15的mRNA由编码人IL-15和人IL-15Rα的两种mRNA编码，并且其中所述两种mRNA以1:1的摩尔比共同配制。
在一些实施方案中，本公开的mRNA编码人OX40L多肽，其是包含OX40L的细胞质结构域的人OX40L多肽。在一些实施方案中，mRNA编码包含OX40L的跨膜结构域的人OX40L多肽。在一些实施方案中，mRNA编码包含OX40L的细胞外结构域和OX40L的跨膜结构域的人OX40L多肽。在一些实施方案中，mRNA编码包含OX40L的细胞外结构域和OX40L的细胞质结构域的人OX40L多肽。在一些实施方案中，mRNA编码包含OX40L的细胞外结构域、OX40L的跨膜结构域和OX40L的细胞质结构域的人OX40L多肽。
在一些实施方案中，mRNA编码人IL-12多肽，其是人IL-12多肽的膜栓系形式。例如，在一些实施方案中，本公开的mRNA编码可操作地连接至膜结构域的人IL-12多肽，其中所述膜结构域包含跨膜结构域。在一些实施方案中，膜结构域包括跨膜结构域和细胞内结构域。在一些实施方案中，跨膜结构域和细胞内结构域源自相同的多肽。在一些实施方案中，跨膜结构域和细胞内结构域源自不同的多肽。
在一些实施方案中，本公开的mRNA编码人IL-15多肽，其是可溶性人IL-15多肽。在一些实施方案中，本公开的mRNA编码可操作地连接至人IL-15Rα多肽的人IL-15多肽，从而在细胞中表达mRNA后形成IL-15/IL-15Rα的膜栓系形式(例如，复合物)。在一些实施方案中，本公开提供了编码人IL-15多肽的第一mRNA和编码人IL-15Rα多肽的第二mRNA，从而提供由单独的mRNA编码的IL-15/IL-15Rα的膜拴系形式(例如，复合物)。在一些实施方案中，本公开的mRNA编码包含sushi结构域的人IL-15Rα多肽，所述sushi结构域对IL-15具有高亲和力。在一些实施方案中，本公开的mRNA编码包含sushi结构域、跨膜结构域和细胞内结构域的人IL-15Rα。在一些实施方案中，跨膜结构域和细胞内结构域是人IL-15Rα跨膜结构域和细胞内结构域。在一些实施方案中，跨膜结构域和细胞内结构域与IL-15Rα异源。
编码OX40L多肽的mRNA
人OX40L首先由Tanaka等人(Tanaka等人,International Journal of Cancer(1985),36(5):549-55)在感染人T细胞白血病病毒I型(HTLV-I)的人淋巴细胞的表面上鉴定。OX40L是OX40(CD134)的配体。OX40L也被命名为CD252(分化簇252)，肿瘤坏死因子(配体)超家族，成员4，tax转录激活糖蛋白1，TXGP1，或gp34。人OX40L的长度是183个氨基酸并且含有三个结构域：氨基酸1-23的细胞质结构域；氨基酸24-50的跨膜结构域和氨基酸51-183的细胞外结构域。
在一些实施方案中，本分开的组合物或方法包含编码哺乳动物OX40L多肽的mRNA。在一些实施方案中，哺乳动物OX40L多肽是鼠OX40L多肽。在一些实施方案中，哺乳动物OX40L多肽是人OX40L多肽。在一些实施方案中，OX40L多肽包含SEQ ID NO:1-3所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，编码人OX40L多肽的mRNA编码人OX40L多肽，所述人OX40L多肽包含与SEQ ID NO:1-3所示的氨基酸序列或由SEQ ID NO:4-11所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列，其中所述人OX40L多肽能够结合至OX40受体。在一些实施方案中，编码人OX40L多肽的mRNA编码人OX40L多肽，所述人OX40L多肽包含与SEQID NO:1至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列，并且能够结合至OX40受体。在一些实施方案中，编码人OX40L多肽的mRNA编码人OX40L多肽，所述人OX40L多肽基本上由SEQ ID NO:1组成并且能够结合至OX40受体。
在某些实施方案中，编码人OX40L多肽的mRNA编码人OX40L多肽，所述人OX40L多肽包含任选地具有一个或多个保守取代的SEQ ID NO:1-3所示氨基酸序列，其中所述保守取代不会显著影响OX40L多肽与其受体的结合活性，即，所述OX40L多肽在所述取代后结合至OX40受体。在一些实施方案中，编码人OX40L多肽的mRNA编码人OX40L多肽，所述人OX40L多肽包含与SEQ ID NO:1-3所示的任一氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。
在其他实施方案中，编码人OX40L多肽的mRNA包含与SEQ ID NO:4-11所示的任一核酸序列至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％相同的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码人OX40L多肽的mRNA包含开放阅读框，所述开放阅读框包含选自SEQ ID NO:9-11中任一个的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码人OX40L多肽的mRNA包含开放阅读框，所述开放阅读框包含与选自SEQ IDNO:9-11中任一个的核苷酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码人OX40L多肽的mRNA包含开放阅读框，所述开放阅读框包含SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码人OX40L多肽的mRNA包含开放阅读框，所述开放阅读框包含与SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码人OX40L多肽的mRNA包含开放阅读框，所述开放阅读框包含SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码人OX40L多肽的mRNA包含开放阅读框，所述开放阅读框包含与SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码人OX40L多肽的mRNA包含开放阅读框，所述开放阅读框包含SEQ ID NO:11所示的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码人OX40L多肽的mRNA包含开放阅读框，所述开放阅读框包含与SEQ ID NO:11所示的核苷酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％同一性的核苷酸序列。
在一些实施方案中，可用于本文所述的方法和组合物的mRNA包含编码OX40L的细胞外结构域的开放阅读框。在其他实施方案中，mRNA包含编码OX40L的细胞质结构域的开放阅读框。在一些实施方案中，mRNA包含编码OX40L的跨膜结构域的开放阅读框。在某些实施方案中，mRNA包含编码OX40L的细胞外结构域和OX40L的跨膜结构域的开放阅读框。在其他实施方案中，mRNA包含编码OX40L的细胞外结构域和OX40L的细胞质结构域的开放阅读框。在其他实施方案中，mRNA包含编码OX40L的细胞外结构域、OX40L的跨膜结构域和OX40L的细胞质结构域的开放阅读框。
本领域技术人员将理解，除了在SEQ ID NO:1-11中隐含地公开的天然信号序列和前肽序列(在前体中存在且在成熟相应形式中不存在的序列)以及非天然信号肽之外，还可使用其他信号序列。因此，提及根据SEQ ID NO:1-11的OX40L多肽或mRNA涵盖其中本领域中已知的替代信号肽(或编码序列)已连接至所述OX40L多肽(或mRNA)的变体。还应当理解，在整个本申请中提及SEQ ID NO:1-11中公开的序列同样适用，并且涵盖本申请提交时本领域中已知的那些序列的直系同源物和功能变体(例如多态性变体)和同种型。
编码细胞缔合性细胞因子的mRNA
在一些实施方案中，本文所述的方法和组合物利用编码细胞缔合性细胞因子的mRNA。细胞因子是细胞释放的一种小分泌性蛋白，对细胞之间的相互作用和通信有特定作用。为了最大程度地减少可溶性细胞因子的不良/脱靶效应，以及潜在的全身毒性，本公开利用至少一种编码细胞缔合性细胞因子的mRNA。细胞缔合性细胞因子是天然地或经过设计与细胞表面缔合的物质。例如，在一些实施方案中，可溶性/分泌性细胞因子被修饰为包括跨膜结构域，使得可溶性/分泌性细胞因子将附着于细胞表面。在一些实施方案中，通过将细胞因子“锚定”或“栓系”至细胞表面，在施用可溶性细胞因子后一般可观察到全身效应降低。
在一些实施方案中，细胞缔合性细胞因子激活T细胞、NK细胞或T细胞和NK细胞两者。测量T细胞和NK细胞激活的方法是本领域技术人员已知的。例如，可通过例如流式细胞术分析NK细胞或T细胞上的激活标志物(例如，CD25和CD69)的表面表达来测量NK和T细胞激活。
在一些实施方案中，适合作为细胞缔合性细胞因子的细胞因子是IL-12家族成员。在一些实施方案中，IL-12家族成员是选自IL-12、IL-23、IL-12p40亚基、IL-23p19亚基、IL-27、IL-35以及它们的组合的多肽。
在一些实施方案中，适合作为细胞缔合性细胞因子的细胞因子是如本文所述的IL-15。
编码拴系IL-12多肽的mRNA
在一些实施方案中，本文所述的方法和组合物利用编码可操作地连接至包含跨膜结构域的膜结构域的IL-12多肽的mRNA。
白细胞介素12(IL-12)是在先天性免疫和适应性免疫中起重要作用的促炎性细胞因子。Gately,MK等人,Annu Rev Immunol.16:495-521(1998)。IL-12主要作为由两个二硫键连接的p35(IL-12A)和p40(IL-12B)亚基组成的70kDa异源二聚体蛋白发挥作用。由于IL-12蛋白具有激活NK细胞和细胞毒性T细胞两者的能力，自1994年以来，IL-12蛋白就作为一种有前景的抗癌治疗剂进行研究。参见Nastala,C.L.等人,J Immunol 153:1697-1706(1994)。
尽管对IL-12作为治疗剂抱有很高的期望，但早期的临床研究并未取得令人满意的结果。Lasek W.等人,Cancer Immunol Immunother 63:419-435,424(2014)。在大多数患者中，反复施用IL-12导致适应性应答和血液中IL-12诱导的干扰素γ(IFNγ)水平的逐渐下降。同上。此外，虽然认识到IL-12诱导的抗癌活性主要由IFNγ的二次分泌介导，但是通过IL-12同时诱导IFNγ及其他细胞因子(例如，TNF-α)或趋化因子(IP-10或MIG)引起严重的毒性。同上。
为了降低毒性，已经生成了IL-12的膜锚定型式，因为IL-12是天然可溶的。PCT申请号PCT/US2018/033436描述了编码拴系IL-12的mRNA，且其以引用方式整体并入本文。
因此，在一些实施方案中，编码人IL-12多肽的mRNA编码拴系的人IL-12多肽，其中人IL-12可操作地连接至膜结构域。
在一些实施方案中，IL-12多肽是鼠IL-12多肽。在一些实施方案中，IL-12多肽是人IL-12多肽。在一些实施方案中，IL-12多肽包含SEQ ID NO:33、35、39或40所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，IL-12多肽包含单个多肽链，所述单个多肽链包含直接或通过接头融合的IL-12B和IL-12A多肽。在其他实施方案中，IL-12多肽包含两个多肽，第一多肽包含IL-12B，第二多肽包含IL-12A。在一些实施方案中，本公开提供了IL-12A多肽和IL-12B多肽，其中IL-12A和IL-12B多肽在相同链或不同链上。
如本公开中所使用的，术语“IL-12多肽”是指例如，IL-12的IL-12p40亚基(即，IL-12B)、IL-12的IL-12p35亚基(即，IL-12A)，或包含IL-12p40亚基多肽和IL-12p35亚基多肽的融合蛋白，其可操作地连接至包含跨膜结构域的膜结构域。在一些方面，融合蛋白包含选自以下的IL-12B多肽：
(i)全长IL-12B多肽(例如，具有与野生型IL-12B相同或基本相同的长度)；
(ii)全长IL-12B多肽的功能片段(例如，比IL-12B野生型更短的截短的(例如，缺失羧基、氨基末端或内部区域)序列；但仍保留IL-12B功能活性)；
(iii)其变体(例如，其中一个或多个氨基酸已被置换的全长或截短的IL-12B蛋白，例如，相对于野生型IL-12B多肽保留多肽的全部或大部分IL-12B活性的变体(例如像，V33I、V298F或本领域中已知的任何其他天然或人工变体)；或
(iv)融合蛋白，所述融合蛋白包含(i)全长IL-12B野生型、其功能片段或变体和(ii)异源蛋白；
和/或
选自以下的IL-12A多肽：
(i)全长IL-12A多肽(例如，具有与野生型IL-12A相同或基本相同的长度)；
(ii)全长IL-12A多肽的功能片段(例如，比IL-12A野生型更短的截短的(例如，缺失羧基、氨基末端或内部区域)序列；但仍保留IL-12A功能活性)；
(iii)其变体(例如，其中一个或多个氨基酸已被置换的全长或截短的IL-12A蛋白，例如，相对于野生型IL-12A多肽保留多肽的全部或大部分IL-12A活性的变体(如本领域中已知的天然或人工变体)；或
(iv)融合蛋白，所述融合蛋白包含(i)全长IL-12A野生型、其功能片段或变体和(ii)异源蛋白。
在一些实施方案中，编码人IL-12多肽的mRNA编码人IL-12多肽，所述人IL-12多肽包含与SEQ ID NO:33、35、39或40中列出的氨基酸序列或由SEQ ID NO:34、36或46中列出的核苷酸序列编码的氨基酸序列至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列，其中所述人IL-12多肽能够结合至IL-12受体。
在某些实施方案中，由本公开的mRNA编码的IL-12多肽包含任选地具有一个或多个保守取代的SEQ ID NO:33、35、39或40中列出的氨基酸序列，其中所述保守取代不会显著影响IL-12多肽与其受体的结合活性，即，所述IL-12多肽在所述取代后结合至IL-12受体。
在其他实施方案中，编码人IL-12多肽的mRNA包含与SEQ ID NO:34、36或46中列出的核酸序列至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％相同的核苷酸序列。
本领域技术人员将理解，除了在SEQ ID NO:33-40和46中隐含地公开的天然信号序列和前肽序列(在前体中存在且在成熟相应形式中不存在的序列)以及非天然信号肽之外，还可使用其他信号序列。因此，提及根据SEQ ID NO:33-40和46的IL-12多肽或mRNA涵盖其中本领域中已知的替代信号肽(或编码序列)已连接至所述IL-12多肽(或mRNA)的变体。还应当理解，通过本申请提及SEQ ID NO:33-40和46中公开的序列是同等适用的，并且包括本申请时本领域已知的那些序列的直系同源物和功能变体(例如，多态变体)和同种型。被提起。
在一些实施方案中，由本公开的mRNA编码的拴系IL-12多肽包含将IL-12多肽拴系(即，锚定)至细胞膜(例如，跨膜结构域)的膜结构域。在一些实施方案中，拴系IL-12多肽包含跨膜结构域。在一些实施方案中，拴系IL-12多肽包含跨膜结构域和任选的细胞内结构域。在一些实施方案中，拴系IL-12多肽包含跨膜结构域和细胞内结构域。
在一些实施方案中，膜结构域来自整合膜蛋白。
整合膜蛋白可包括例如整合多起源蛋白，所述蛋白含有将蛋白栓系至细胞表面的单程或多程跨膜结构域，包括具有疏水性α螺旋或β桶(即，β折叠)结构的结构域。I型整合膜蛋白的氨基末端(即，N末端)位于细胞外空间，而II型整合膜蛋白的羧基末端(即，C末端)位于细胞外空间。
在一些实施方案中，本公开的拴系IL-12多肽包含来自整合多起源蛋白的跨膜结构域。在一些实施方案中，本公开的拴系IL-12多肽包含来自I型整合膜蛋白的跨膜结构域。在一些实施方案中，拴系IL-12多肽包含来自II型整合膜蛋白的跨膜结构域。
在一些实施方案中，跨膜结构域包含细胞内结构域(即，位于细胞的细胞内空间中的结构域，例如位于细胞的细胞质中的结构域)。在一些实施方案中，细胞内结构域已经从跨膜结构域去除。在一些实施方案中，跨膜结构域包括膜结构域而无细胞内结构域。
整合膜蛋白还可包括例如单起源蛋白，所述单起源蛋白含有不跨越整个细胞膜而是将蛋白栓系至细胞表面的膜结构域。在一些实施方案中，本公开的拴系IL-12多肽包含来自整合单起源蛋白的膜结构域。
在一些实施方案中，膜结构域源自分化簇(CD)蛋白、CD8、CD80、CD4、受体、血小板源性生长因子受体(PDGF-R)、白细胞介素6受体(IL-6R)、转铁蛋白受体、肿瘤坏死因子(TNF)受体、促红细胞生成素(EPO)受体、T细胞受体(TCR)、TCRβ链、Fc受体、FcγRII、FcεRI、干扰素受体、I型干扰素受体、生长因子、干细胞因子(SCF)、TNF-α、B7-1、脱唾液酸糖蛋白、c-erbB-2、ICAM-1、免疫球蛋白、IgG、IgM、病毒糖蛋白、狂犬病病毒糖蛋白、呼吸道合胞病毒糖蛋白G(RSVG)、水泡性口炎病毒糖蛋白(VSVG)、病毒血凝素(HA)、流行性感冒HA、牛痘病毒HA或它们的任何组合。
在一些实施方案中，膜结构域选自由以下组成的组：CD8跨膜结构域、PDGF-R跨膜结构域、CD80跨膜结构域以及它们的任何组合。
跨膜结构域的示例性氨基酸序列如SEQ ID NO:41-43所示。
在一些实施方案中，膜结构域包含T细胞表面糖蛋白CD8α链(也称为CD8A或T淋巴细胞分化抗原T8/Leu-2)的跨膜结构域，例如UniProtKB-P01732的跨膜结构域。在一些实施方案中，编码栓系IL-12的mRNA包含编码CD8跨膜多肽的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码栓系IL-12的mRNA包含编码如SEQ ID NO:41所示的CD8跨膜多肽的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码包含CD8跨膜结构域的拴系IL-12的mRNA包含开放阅读框，所述开放阅读框包含SEQ ID NO:69所示的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码包含CD8跨膜结构域的拴系IL-12的mRNA包含开放阅读框，所述开放阅读框包含与SEQ ID NO:69所示的核苷酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％同一性的核苷酸序列。
在一些实施方案中，膜结构域包含血小板源性生长因子受体β(EC:2.7.10.1)(也称为PDGF-R-β、PDGFR-β、β血小板源性生长因子受体、β型血小板源性生长因子受体、CD140抗原样家族成员B、血小板源性生长因子受体1、PDGFR-1或CD140b)的跨膜结构域，例如UniProtKB-P09619的跨膜结构域。在一些实施方案中，编码栓系IL-12的mRNA包含编码PDGFR-β跨膜多肽的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码栓系IL-12的mRNA包含编码如SEQID NO:42所示的PDGFR-β跨膜多肽的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码包含PDGFR-β跨膜结构域的拴系IL-12的mRNA包含开放阅读框，所述开放阅读框包含SEQ ID NO:62所示的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码包含PDGFR-β跨膜结构域的拴系IL-12的mRNA包含开放阅读框，所述开放阅读框包含与SEQ ID NO:62所示的核苷酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％同一性的核苷酸序列。
在一些实施方案中，膜结构域包含T淋巴细胞激活抗原CD80(也称为激活B7-1抗原、BB1、CTLA-4抗受体B7.1或B7)的跨膜结构域，例如UniProtKB-P33681的跨膜结构域。在一些实施方案中，编码栓系IL-12的mRNA包含编码CD80跨膜多肽的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码栓系IL-12的mRNA包含编码如SEQ ID NO:43所示的CD80跨膜多肽的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码包含CD80跨膜结构域的拴系IL-12的mRNA包含开放阅读框，所述开放阅读框包含SEQ ID NO:70所示的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码包含CD80跨膜结构域的拴系IL-12的mRNA包含开放阅读框，所述开放阅读框包含与SEQ ID NO:70所示的核苷酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％同一性的核苷酸序列。
在一些实施方案中，拴系IL-12多肽中的膜结构域包含与SEQ ID NO:41、SEQ IDNO:42、SEQ ID NO:43或它们的任何组合具有至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约99％或约100％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，膜结构域包括跨膜结构域和细胞内结构域。在一些实施方案中，细胞内结构域是已知在细胞中充当传输信号的任何寡肽或多肽。在一些实施方案中，膜结构域包含细胞内结构域以使拴系IL-12多肽稳定。
在本公开的方法和组合物中有用的细胞内结构域至少包括来自于上文所述的跨膜结构域所在的任何多肽的细胞内结构域。例如，合适的细胞内结构域包括但不限于源自CD80、PDGFR或它们的任何组合的细胞内结构域。
在一些实施方案中，膜结构域包含血小板源性生长因子受体β(EC:2.7.10.1)(也称为PDGF-R-β、PDGFR-β、β血小板源性生长因子受体、β型血小板源性生长因子受体、CD140抗原样家族成员B、血小板源性生长因子受体1、PDGFR-1或CD140b)的细胞内结构域，例如UniProtKB-P09619的细胞内结构域。在一些实施方案中，编码栓系IL-12的mRNA包含编码PDGFR-β细胞内多肽的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码栓系IL-12的mRNA包含编码如SEQ ID NO:48所示的PDGFR-β细胞内多肽的核苷酸序列。
在一些实施方案中，膜结构域包含PDGFR-β的截短的细胞内结构域。在一些实施方案中，与野生型PDGFR-β细胞内结构域相比，PDGFR-β的截短的细胞内结构域使拴系IL-12多肽稳定。在一些实施方案中，编码栓系IL-12的mRNA包含编码截短的PDGFR-β细胞内多肽的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码栓系IL-12的mRNA包含编码如SEQ ID NO:49所示的截短的PDGFR-β细胞内多肽的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码栓系IL-12的mRNA包含编码如SEQ ID NO:50所示的截短的PDGFR-β细胞内多肽的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码包含截短的PDGFR-β细胞内结构域的拴系IL-12的mRNA包含开放阅读框，所述开放阅读框包含SEQ ID NO:63所示的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码包含截短的PDGFR-β细胞内结构域的拴系IL-12的mRNA包含开放阅读框，所述开放阅读框包含与SEQ ID NO:63所示的核苷酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码包含截短的PDGFR-β细胞内结构域的拴系IL-12的mRNA包含开放阅读框，所述开放阅读框包含SEQ ID NO:64所示的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码包含截短的PDGFR-β细胞内结构域的拴系IL-12的mRNA包含开放阅读框，所述开放阅读框包含与SEQ ID NO:64所示的核苷酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％同一性的核苷酸序列。
在其他实施方案中，膜结构域包含T淋巴细胞激活抗原CD80(也称为激活B7-1抗原、BB1、CTLA-4抗受体B7.1或B7)的细胞内结构域，例如UniProtKB-P33681的细胞内结构域。在一些实施方案中，编码栓系IL-12的mRNA包含编码CD80细胞内多肽的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码栓系IL-12的mRNA包含编码如SEQ ID NO:47所示的CD80细胞内多肽的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码包含CD80细胞内结构域的拴系IL-12的mRNA包含开放阅读框，所述开放阅读框包含SEQ ID NO:71所示的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码包含CD80细胞内结构域的拴系IL-12的mRNA包含开放阅读框，所述开放阅读框包含与SEQID NO:71所示的核苷酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％同一性的核苷酸序列。
在一些实施方案中，本文所述的拴系IL-12多肽包含膜结构域，所述膜结构域包含跨膜结构域和源自相同多肽(即，同源)的细胞内结构域。在一些实施方案中，本文所述的拴系IL-12多肽包含膜结构域，所述膜结构域包含CD80跨膜结构域和CD80细胞内结构域。在一些实施方案中，本文所述的拴系IL-12多肽包含膜结构域，所述膜结构域包含PDGFR-β跨膜结构域和PDGFR-β细胞内结构域。在一些实施方案中，本文所述的拴系IL-12多肽包含膜结构域，所述膜结构域包含跨膜结构域和源自不同多肽(即，异源)的细胞内结构域(例如，CD80跨膜结构域和PDGFR-β细胞内结构域；CD8跨膜结构域和CD80胞内结构域；CD8跨膜结构域和PDGFR-β跨膜结构域；或PDGFR-β跨膜结构域和CD80胞内结构域)。
在一些实施方案中，拴系IL-12多肽中的膜结构域(例如，跨膜结构域和任选的细胞内结构域)位于任何IL-12氨基酸序列(即，IL-12A、IL-12B或IL-12A和IL-12B两者的任何氨基酸序列，当在拴系IL-12多肽中同时存在时)的C末端。短语“位于C末端”表示有关于多肽的C末端，在多肽中相对于多肽中的其他序列的位置。在任何IL-12氨基酸序列的“C末端”的膜结构域(例如，跨膜结构域和任选的细胞内结构域)是指该膜结构域比任何IL-12氨基酸序列更接近栓系IL-12多肽的C末端。
在一些实施方案中，拴系IL-12多肽中的膜结构域(例如，跨膜结构域和任选的细胞内结构域)位于IL-12多肽的N末端。在任何IL-12氨基酸序列的“N末端”的膜结构域是指该膜结构域比任何IL-12氨基酸序列更接近栓系IL-12多肽的N末端。
在一些实施方案中，拴系IL-12多肽中的膜结构域(例如，跨膜结构域和任选的细胞内结构域)通过接头连接至IL-12多肽，所述接头在本文中称为“膜结构域接头”或“跨膜结构域接头”(当膜结构域是跨膜结构域时，并且任选地是细胞内结构域时)。本文其他地方公开了接头的非限制性实例。在一些实施方案中，拴系IL-12多肽中的膜结构域直接融合至IL-12多肽。
在一些实施方案中，包含由mRNA编码的人CD8跨膜结构域的拴系人IL-12多肽包含SEQ ID NO:53所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，编码包含人CD8跨膜结构域的拴系人IL-12多肽的mRNA包含开放阅读框，所述开放阅读框包含SEQ ID NO:52所示的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码包含人CD8跨膜结构域的拴系人IL-12多肽的mRNA包含开放阅读框，所述开放阅读框包含与SEQ ID NO:52所示的核苷酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％同一性的核苷酸序列。
在一些实施方案中，包含由mRNA编码的人CD8跨膜结构域的拴系人IL-12多肽包含SEQ ID NO:55所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，编码包含人CD8跨膜结构域的拴系人IL-12多肽的mRNA包含开放阅读框，所述开放阅读框包含SEQ ID NO:54所示的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码包含人CD8跨膜结构域的拴系人IL-12多肽的mRNA包含开放阅读框，所述开放阅读框包含与SEQ ID NO:54所示的核苷酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％同一性的核苷酸序列。
在一些实施方案中，包含由mRNA编码的人CD80跨膜结构域和细胞内结构域的拴系人IL-12多肽包含SEQ ID NO:61所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，编码包含人CD80跨膜结构域和细胞内结构域的拴系人IL-12多肽的mRNA包含开放阅读框，所述开放阅读框包含SEQ ID NO:56-60中任一个所示的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码包含人CD8跨膜结构域的拴系人IL-12多肽的mRNA包含开放阅读框，所述开放阅读框包含与选自SEQ IDNO:56-60中任一个的核苷酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％同一性的核苷酸序列。
编码细胞缔合性IL-15/IL-15Rα的mRNA
IL-15是细胞因子4α螺旋束家族的成员，在发展有效免疫应答中起重要作用。Waldmann,T.A.,Cancer Immunol.Res.3:219-227(2015)。IL-15对NK细胞的正常发育和记忆性CD8+ T细胞的长期维持至关重要。IL-15基因编码162个氨基酸的前蛋白，其信号肽长度为48个氨基酸，成熟蛋白长度为114个氨基酸。Bamford,R.N.,等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:2897-2902(1996)。另见例如智人IL-15转录物变体3mRNA序列的GenBank登录号NM_000585和相应IL-15同种型1前原蛋白的NP_000576。
IL-15与白细胞介素2(IL2)具有某些结构相似性。像IL-2一样，IL-15通过IL-2受体β链(CD122)和共同的γ链(CD132)传导信号。但是，与IL-2不同的是，IL-15自身不能有效结合CD122和CD132。IL-15必须首先结合至IL-15α受体亚基(IL-15Rα)。IL-15Rα基因编码267个氨基酸的前蛋白，其信号肽长度为30个氨基酸，成熟蛋白长度为237个氨基酸。参见，例如，智人IL-15Rα转录物变体1mRNA的GenBank登录号NM_002189和智人IL-15Rα同种型1前体氨基酸序列的NP_002180。
人IL-15Rα主要为跨膜蛋白，可与如活化树突状细胞和单核细胞等细胞表面上的IL-15结合。Waldmann,T.A.,Cancer Immunol.Res.3:219-227(2015)。IL-15/IL-15Rα的膜结合复合物然后将IL-15反式呈递至CD122和CD132亚基。因此，IL-15Rα是IL-15活性的必要组成部分，因此IL-15是天然的细胞缔合性细胞因子。
因此，在一些实施方案中，本公开提供了编码人IL-15多肽的mRNA和编码人IL-15Rα多肽的mRNA。在一些实施方案中，本公开提供了编码可操作地连接至人IL-15Rα多肽的人IL-15多肽的mRNA。
在一些实施方案中，IL-15多肽和/或IL-15Rα多肽是相对于野生型IL-15和/或IL-15Rα序列包含取代，和插入和/或添加，缺失和/或共价修饰的变体、肽或多肽。如本文所提及，术语“IL-15多肽”是指成熟的IL-15多肽(即，没有其信号肽和前肽)。在一个实施方案中，IL-15多肽包括信号肽和/或前肽。
如本文所用，术语“IL-15Rα多肽”至少包含全长人IL-15Rα多肽的Sushi结构域和铰链区。在一些实施方案中，全长人IL-15Rα多肽的sushi结构域包含SEQ ID NO:129所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，IL-15Rα多肽包含全长人IL-15Rα多肽的细胞外结构域。在一些实施方案中，全长人IL-15Rα多肽的细胞外结构域包含SEQ ID NO:130所示的氨基酸序列。在其他实施方案中，IL-15Rα多肽包含全长人IL-15Rα多肽的跨膜区和/或细胞内结构域。在一些实施方案中，全长人IL-15Rα多肽的跨膜区和/或细胞内结构域包含SEQ ID NO:131所示的氨基酸序列。在其他实施方案中，IL-15Rα多肽包含异源多肽的跨膜区和/或细胞内结构域。例如，本文所述的任何跨膜结构域和/或细胞内结构域都可用作IL-15Rα多肽的异源跨膜结构域和/或细胞内结构域。
在一些实施方案中，可将序列标签或氨基酸添加到由本发明的多核苷酸编码的序列中(例如，在N末端或C末端)，例如，用于定位。在一些实施方案中，可任选地删除位于本发明多肽的羧基、氨基末端或内部区域的氨基酸残基。
在一些方面，本公开提供了编码人IL-15多肽的mRNA。在其他方面，本公开提供了编码人IL-15Rα多肽的mRNA。在一些实施方案中，本公开的mRNA编码包含人IL-15多肽和含Sushi结构域的人IL-15Rα多肽的融合蛋白，所述多肽可操作地连接。在其他实施方案中，mRNA编码两条多肽链，第一条链包含人IL-15多肽，第二条链包含人IL-15Rα多肽。
在一些实施方案中，IL-15多肽选自：
(i)具有或不具有信号肽的成熟人IL-15多肽(例如，具有与野生型人IL-15相同或基本相同的长度)；
(ii)人IL-15多肽的功能片段(例如，比IL-15野生型更短的截短的(例如，缺失羧基、氨基末端或内部区域)序列；但仍保留IL-15活性)；
(iii)其变体(例如，其中一个或多个氨基酸已被置换的全长、成熟或截短的IL-15蛋白，例如，相对于野生型IL-15多肽保留多肽的全部或大部分IL-15活性的变体；和
(iv)融合蛋白，所述融合蛋白包含(a)具有或不具有信号肽的成熟人IL-15野生型、其功能片段或变体和(b)异源蛋白；和/或
在一些实施方案中，IL-15Rα多肽选自：
(i)全长人IL-15Rα多肽(例如，具有与野生型人IL-15Rα相同或基本相同的长度)；
(ii)全长人IL-15Rα多肽的功能片段(例如，比IL-15Rα野生型更短的截短的(例如，缺失羧基、氨基末端或内部区域)序列；但仍保留IL-15Rα活性)；
(iii)其变体(例如，其中一个或多个氨基酸已被置换的全长或截短的IL-15Rα蛋白，例如，相对于野生型IL-15Rα多肽保留多肽的全部或大部分IL-15Rα活性的变体(如本领域中已知的天然或人工变体)；和
(iv)融合蛋白，所述融合蛋白包含(a)全长人IL-15Rα野生型、其功能片段或变体和(b)异源蛋白。
在某些实施方案中，mRNA编码哺乳动物IL-15和/或IL-15Rα多肽，如非人(例如，灵长类动物)IL-15和/或IL-15Rα多肽，其功能片段或变体。
在一些实施方案中，人IL-15多肽包含与SEQ ID NO:15和17中列出的氨基酸序列或由SEQ ID NO:16、19、20和122中列出的核苷酸序列编码的氨基酸序列至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列，其中所述人IL-15多肽能够结合至人IL-15受体。
在某些实施方案中，由本公开的mRNA编码的人IL-15多肽包含任选地具有一个或多个保守取代的SEQ ID NO:15和17中列出的氨基酸序列，其中所述保守取代不会显著影响IL-15多肽与其受体的结合活性，即，所述IL-15多肽在所述取代后结合至IL-15受体。
在其他实施方案中，编码人IL-15多肽的mRNA包含与SEQ ID NO:16、19、20和122中列出的核酸序列至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％相同的核苷酸序列。
在一些实施方案中，人IL-15Rα多肽包含与SEQ ID NO:13中列出的氨基酸序列或由SEQ ID NO:14、21和22中列出的核苷酸序列编码的氨基酸序列至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列，其中所述人IL-15Rα多肽能够结合至人IL-15多肽。
在某些实施方案中，由本公开的mRNA编码的人IL-15Rα多肽包含任选地具有一个或多个保守取代的SEQ ID NO:14、21和22中列出的氨基酸序列，其中所述保守取代不会显著影响IL-15Rα多肽与其配体的结合活性，即，所述IL-15Rα多肽在所述取代后结合至IL-15。
在其他实施方案中，编码人IL-15Rα多肽的mRNA包含与SEQ ID NO:14、21和22中列出的核酸序列至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％相同的核苷酸序列。
在一些实施方案中，mRNA编码人IL-15/IL-15Rα融合多肽，所述融合多肽包含与SEQ ID NO:13中列出的氨基酸序列或由SEQ ID NO:14、21和22中列出的核苷酸序列编码的氨基酸序列至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列。
在某些实施方案中，由本公开的mRNA编码的IL-15/IL-15Rα融合多肽包含任选地具有一个或多个保守取代的SEQ ID NO:23、27和123中列出的氨基酸序列，其中所述保守取代不会显著影响IL-15多肽与其受体的结合活性。
在其他实施方案中，编码IL-15/IL-15Rα融合多肽的mRNA包含与SEQ ID No:24-26、28-30和124-126中列出的核酸序列至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％相同的核苷酸序列。
细胞因子和共刺激分子的组合物
在一些实施方案中，本公开提供了包含至少两种本文所述的mRNA的组合物(例如，脂质纳米颗粒)。在一些实施方案中，本公开提供了包含两种本文所述的mRNA的组合物(例如，脂质纳米颗粒)。在一些实施方案中，本公开提供了包含三种本文所述的mRNA的组合物(例如，脂质纳米颗粒)。在一些实施方案中，本公开提供了包含四种本文所述的mRNA的组合物(例如，脂质纳米颗粒)。
在一些实施方案中，所述组合物包含(i)编码人OX40L多肽的mRNA；和(ii)编码拴系人IL-12多肽的mRNA。在一些实施方案中，所述组合物包含(i)编码人OX40L多肽的mRNA，其中所述人OX40L多肽包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；和(ii)编码栓系人IL-12多肽的mRNA，其中所述人栓系IL-12多肽包含选自由SEQ ID NO 53、55、61和66组成的组的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述组合物包含(i)编码人OX40L多肽的mRNA，其中所述人OX40L多肽包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；和(ii)编码栓系人IL-12多肽的mRNA，其中所述人IL-12多肽包含SEQ ID NO61所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述组合物包含(i)编码人OX40L多肽的mRNA，其中所述mRNA包含开放阅读框，所述开放阅读框包含选自由SEQ ID NO:4、6和9-11组成的组的核苷酸序列；和(ii)编码拴系人IL-12多肽的mRNA，其中所述mRNA包含开放阅读框，所述开放阅读框包含选自由SEQ ID NO:52、54、56-60和67组成的组的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述组合物包含(i)编码人OX40L多肽的mRNA，其中所述mRNA包含开放阅读框，所述开放阅读框包含与选自由SEQ ID NO:4、6和9-11组成的组的核苷酸序列具有至少80％、85％、90％、95％或99％同一性的核苷酸序列；和(ii)编码拴系人IL-12多肽的mRNA，其中所述mRNA包含开放阅读框，所述开放阅读框包含选自由SEQID NO:52、54、56-60和67组成的组的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述组合物包含(i)编码人OX40L多肽的mRNA，其中所述mRNA包含开放阅读框，所述开放阅读框包含SEQ ID NO:11所示的核苷酸序列；和(ii)编码栓系人IL-12多肽的mRNA，其中所述mRNA包含开放阅读框，所述开放阅读框包含SEQ ID NO:60所示的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述组合物包含(i)编码人OX40L多肽的mRNA，其中所述mRNA包含开放阅读框，所述开放阅读框包含与SEQ ID NO:11所示的核苷酸序列具有至少80％、85％、90％、95％或99％同一性的核苷酸序列；和(ii)编码栓系人IL-12多肽的mRNA，其中所述mRNA包含开放阅读框，所述开放阅读框包含与SEQ ID NO:60所示的核苷酸序列具有至少80％、85％、90％、95％或99％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本公开提供了如本文所述的编码人OX40L多肽的mRNA和编码拴系人IL-12多肽的mRNA的组合，其中所述两种mRNA被包封在相同或不同的脂质纳米颗粒中。在一些实施方案中，所述两种mRNA包封在相同的脂质纳米颗粒中。在一些实施方案中，所述两种mRNA包封在两个不同的脂质纳米颗粒中。
在一些实施方案中，所述组合物包含(i)编码人OX40L多肽的mRNA；(ii)编码人IL-15多肽的mRNA；和(iii)编码人IL-15Rα多肽的mRNA。在一些实施方案中，所述组合物包含(i)编码人OX40L多肽的mRNA，其中所述人OX40L多肽包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；(ii)编码人IL-15多肽的mRNA，其中所述人IL-15多肽包含选自由SEQ ID NO:15和17组成的组的氨基酸序列；和(iii)编码人IL-15Rα多肽的mRNA，其中所述人IL-15Rα多肽包含SEQ IDNO:13所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述组合物包含(i)编码人OX40L多肽的mRNA，其中所述人OX40L多肽包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；(ii)编码人IL-15多肽的mRNA，其中所述人IL-15多肽包含如SEQ ID NO:17所示的氨基酸；和(iii)编码人IL-15Rα多肽的mRNA，其中所述人IL-15Rα多肽包含SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述组合物包含(i)编码人OX40L多肽的mRNA，其中所述mRNA包含开放阅读框，所述开放阅读框包含选自由SEQ ID NO:4、6和9-11组成的组的核苷酸序列；(ii)编码人IL-15多肽的mRNA，其中所述mRNA包含开放阅读框，所述开放阅读框包含选自由SEQ ID NO:16、19、20和122组成的组的核苷酸序列；和(iii)编码人IL-15Rα多肽的mRNA，其中所述mRNA包含开放阅读框，所述开放阅读框包含选自由SEQ ID NO:14、21和22组成的组的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述组合物包含(i)编码人OX40L多肽的mRNA，其中所述mRNA包含开放阅读框，所述开放阅读框包含与选自由SEQ ID NO:4、6和9-11组成的组的核苷酸序列具有至少80％、85％、90％、95％或99％同一性的核苷酸序列；(ii)编码人IL-15多肽的mRNA，其中所述mRNA包含开放阅读框，所述开放阅读框包含与选自由SEQ ID NO:16、19、20和122组成的组的核苷酸序列具有至少80％、85％、90％、95％或99％同一性的核苷酸序列；和(iii)编码人IL-15Rα多肽的mRNA，其中所述mRNA包含开放阅读框，所述开放阅读框包含与选自由SEQ IDNO:14、21和22组成的组的核苷酸序列具有至少80％、85％、90％、95％或99％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述组合物包含(i)编码人OX40L多肽的mRNA，其中所述mRNA包含开放阅读框，所述开放阅读框包含SEQ ID NO:11所示的核苷酸序列；(ii)编码人IL-15多肽的mRNA，其中所述mRNA包含开放阅读框，所述开放阅读框包含SEQ ID NO:122所示的核苷酸序列；和(iii)编码人IL-15Rα多肽的mRNA，其中所述mRNA包含开放阅读框，所述开放阅读框包含SEQ ID NO:22所示的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述组合物包含(i)编码人OX40L多肽的mRNA，其中所述mRNA包含开放阅读框，所述开放阅读框包含与SEQ ID NO:11所示的核苷酸序列具有至少80％、85％、90％、95％或99％同一性的核苷酸序列；(ii)编码人IL-15多肽的mRNA，其中所述mRNA包含开放阅读框，所述开放阅读框包含与SEQ ID NO:122所示的核苷酸序列具有至少80％、85％、90％、95％或99％同一性的核苷酸序列；和(iii)编码人IL-15Rα多肽的mRNA，其中所述mRNA包含开放阅读框，所述开放阅读框包含与SEQ IDNO:22组成的组的核苷酸序列具有至少80％、85％、90％、95％或99％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本公开提供了如本文所述的编码人OX40L多肽的mRNA、编码人IL-15多肽的mRNA和编码人IL-15Rα多肽的mRNA的组合，其中所述三种mRNA被包封在相同或不同的脂质纳米颗粒中。在一些实施方案中，所述三种mRNA包封在相同的脂质纳米颗粒中。在一些实施方案中，所述三种mRNA包封在三个不同的脂质纳米颗粒中。
在一些实施方案中，所述组合物包含(i)编码人OX40L多肽的mRNA；和(ii)编码可操作性地连接至人IL-15Rα多肽的人IL-15多肽的mRNA。在一些实施方案中，所述组合物包含(i)编码人OX40L多肽的mRNA，其中所述人OX40L多肽包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；和(ii)编码包含选自由SEQ ID NO:18、23、27和123组成的组的氨基酸序列的可操作地连接至人IL-15Rα多肽的人IL-15多肽的mRNA。在一些实施方案中，所述组合物包含(i)编码人OX40L多肽的mRNA，其中所述mRNA包含开放阅读框，所述开放阅读框包含选自由SEQ IDNO:4、6和9-11组成的组的核苷酸序列；和(ii)编码可操作地连接至人IL-15Rα多肽的人IL-15多肽的mRNA，其中所述mRNA包含开放阅读框，所述开放阅读框包含选自由SEQ ID NO:24-26、28-30和124-126组成的组的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述组合物包含(i)编码人OX40L多肽的mRNA，其中所述mRNA包含开放阅读框，所述开放阅读框包含与选自由SEQ IDNO:4、6和9-11组成的组的核苷酸序列具有至少80％、85％、90％、95％或99％同一性的核苷酸序列；和(ii)编码可操作地连接至人IL-15Rα多肽的人IL-15多肽的mRNA，其中所述mRNA包含开放阅读框，所述开放阅读框包含与选自由SEQ ID NO:24-26、28-30和124-126组成的组的核苷酸序列具有至少80％、85％、90％、95％或99％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述组合物包含(i)编码人OX40L多肽的mRNA，其中所述mRNA包含开放阅读框，所述开放阅读框包含SEQ ID NO:11所示的核苷酸序列；和(ii)编码可操作地连接至人IL-15Rα多肽的人IL-15多肽的mRNA，其中所述mRNA包含开放阅读框，所述开放阅读框包含选自由SEQ ID NO:24-26、28-30和124-126组成的组的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述组合物包含(i)编码人OX40L多肽的mRNA，其中所述mRNA包含开放阅读框，所述开放阅读框包含与SEQ ID NO:11所示的核苷酸序列具有至少80％、85％、90％、95％或99％同一性的核苷酸序列；和(ii)编码可操作地连接至人IL-15Rα多肽的人IL-15多肽的mRNA，其中所述mRNA包含开放阅读框，所述开放阅读框包含与选自由SEQ ID NO:24-26、28-30和124-126组成的组的核苷酸序列具有至少80％、85％、90％、95％或99％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本公开提供了如本文所述的编码人OX40L多肽的mRNA和编码可操作地连接至人IL-15Rα多肽的人IL-15多肽的mRNA的组合，其中所述两种mRNA被包封在相同或不同的脂质纳米颗粒中。在一些实施方案中，所述两种mRNA包封在相同的脂质纳米颗粒中。在一些实施方案中，所述两种mRNA包封在两个不同的脂质纳米颗粒中。
在一些实施方案中，所述组合物包含(i)编码栓系人IL-12多肽的mRNA；(ii)编码人IL-15多肽的mRNA；和(iii)编码人IL-15Rα多肽的mRNA。在一些实施方案中，所述组合物包含(i)编码栓系人IL-12多肽的mRNA，其中所述人IL-12多肽包含选自由SEQ ID NO:53、55、61和66组成的组的氨基酸序列；(ii)编码人IL-15多肽的mRNA，其中所述人IL-15多肽包含选自由SEQ ID NO:15和17组成的组的氨基酸序列；和(iii)编码人IL-15Rα多肽的mRNA，其中所述人IL-15Rα多肽包含SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述组合物包含(i)编码栓系人IL-12多肽的mRNA，其中所述人IL-12多肽包含SEQ ID NO:61所示的氨基酸序列；(ii)编码人IL-15多肽的mRNA，其中所述人IL-15多肽包含如SEQ ID NO:17所示的氨基酸；和(iii)编码人IL-15Rα多肽的mRNA，其中所述人IL-15Rα多肽包含SEQ IDNO:13所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述组合物包含(i)编码栓系人IL-12多肽的mRNA，其中所述mRNA包含开放阅读框，所述开放阅读框包含选自由SEQ ID NO:52、54、56-60和67组成的组的核苷酸序列；(ii)编码人IL-15多肽的mRNA，其中所述mRNA包含开放阅读框，所述开放阅读框包含选自由SEQ ID NO:16、19、20和122组成的组的核苷酸序列；和(iii)编码人IL-15Rα多肽的mRNA，其中所述mRNA包含开放阅读框，所述开放阅读框包含选自由SEQ ID NO:14、21和22组成的组的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述组合物包含(i)编码栓系人IL-12多肽的mRNA，其中所述mRNA包含开放阅读框，所述开放阅读框包含与选自由SEQ ID NO:52、54、56-60和67组成的组的核苷酸序列具有至少80％、85％、90％、95％或99％同一性的核苷酸序列；(ii)编码人IL-15多肽的mRNA，其中所述mRNA包含开放阅读框，所述开放阅读框包含与选自由SEQ ID NO:16、19、20和122组成的组的核苷酸序列具有至少80％、85％、90％、95％或99％同一性的核苷酸序列；和(iii)编码人IL-15Rα多肽的mRNA，其中所述mRNA包含开放阅读框，所述开放阅读框包含与选自由SEQ ID NO:14、21和22组成的组的核苷酸序列具有至少80％、85％、90％、95％或99％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述组合物包含(i)编码栓系人IL-12多肽的mRNA，其中所述mRNA包含开放阅读框，所述开放阅读框包含SEQ ID NO:60所示的核苷酸序列；(ii)编码人IL-15多肽的mRNA，其中所述mRNA包含开放阅读框，所述开放阅读框包含SEQ ID NO:122所示的核苷酸序列；和(iii)编码人IL-15Rα多肽的mRNA，其中所述mRNA包含开放阅读框，所述开放阅读框包含SEQ ID NO:22所示的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述组合物包含(i)编码栓系人IL-12多肽的mRNA，其中所述mRNA包含开放阅读框，所述开放阅读框包含与SEQ ID NO:60所示的核苷酸序列具有至少80％、85％、90％、95％或99％同一性的核苷酸序列；(ii)编码人IL-15多肽的mRNA，其中所述mRNA包含开放阅读框，所述开放阅读框包含与SEQ ID NO:122所示的核苷酸序列具有至少80％、85％、90％、95％或99％同一性的核苷酸序列；和(iii)编码人IL-15Rα多肽的mRNA，其中所述mRNA包含开放阅读框，所述开放阅读框包含与SEQ IDNO:22组成的组的核苷酸序列具有至少80％、85％、90％、95％或99％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本公开提供了如本文所述的编码栓系人IL-12多肽的mRNA、编码人IL-15多肽的mRNA和编码人IL-15Rα多肽的mRNA的组合，其中所述三种mRNA被包封在相同或不同的脂质纳米颗粒中。在一些实施方案中，所述三种mRNA包封在相同的脂质纳米颗粒中。在一些实施方案中，所述三种mRNA包封在三个不同的脂质纳米颗粒中。
在一些实施方案中，所述组合物包含(i)编码栓系人IL-12多肽的mRNA；和(ii)编码可操作性地连接至人IL-15Rα多肽的人IL-15多肽的mRNA。在一些实施方案中，所述组合物包含(i)编码栓系人IL-12多肽的mRNA，其中所述人IL-12多肽包含选自由SEQ ID NO:53、55、61和66组成的组的氨基酸序列；和(ii)编码包含选自由SEQ ID NO:18、23、27和123组成的组的氨基酸序列的可操作地连接至人IL-15Rα多肽的人IL-15多肽的mRNA。在一些实施方案中，所述组合物包含(i)编码栓系人IL-12多肽的mRNA，其中所述栓系人IL-12多肽包含SEQ ID NO:61所示的氨基酸序列；和(ii)编码包含选自由SEQ ID NO:18、23、27和123组成的组的氨基酸序列的可操作地连接至人IL-15Rα多肽的人IL-15多肽的mRNA。在一些实施方案中，所述组合物包含(i)编码栓系人IL-12多肽的mRNA，其中所述mRNA包含开放阅读框，所述开放阅读框包含选自由SEQ ID NO:52、54、56-60和67组成的组的核苷酸序列；和(ii)编码可操作地连接至人IL-15Rα多肽的人IL-15多肽的mRNA，其中所述mRNA包含开放阅读框，所述开放阅读框包含选自由SEQ ID NO:24-26、28-30和124-126组成的组的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述组合物包含(i)编码栓系人IL-12多肽的mRNA，其中所述mRNA包含开放阅读框，所述开放阅读框包含与选自由SEQ ID NO:52、54、56-60和67组成的组的核苷酸序列具有至少80％、85％、90％、95％或99％同一性的核苷酸序列；和(ii)编码可操作地连接至人IL-15Rα多肽的人IL-15多肽的mRNA，其中所述mRNA包含开放阅读框，所述开放阅读框包含与选自由SEQ ID NO:24-26、28-30和124-126组成的组的核苷酸序列具有至少80％、85％、90％、95％或99％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述组合物包含(i)编码栓系人IL-12多肽的mRNA，其中所述mRNA包含开放阅读框，所述开放阅读框包含SEQ ID NO:60所示的核苷酸序列；和(ii)编码可操作地连接至人IL-15Rα多肽的人IL-15多肽的mRNA，其中所述mRNA包含开放阅读框，所述开放阅读框包含选自由SEQ ID NO:24-26、28-30和124-126组成的组的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述组合物包含(i)编码栓系人IL-12多肽的mRNA，其中所述mRNA包含开放阅读框，所述开放阅读框包含与SEQ ID NO:60所示的核苷酸序列具有至少80％、85％、90％、95％或99％同一性的核苷酸序列；和(ii)编码可操作地连接至人IL-15Rα多肽的人IL-15多肽的mRNA，其中所述mRNA包含开放阅读框，所述开放阅读框包含与选自由SEQ ID NO:24-26、28-30和124-126组成的组的核苷酸序列具有至少80％、85％、90％、95％或99％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本公开提供了如本文所述的编码栓系人IL-12多肽的mRNA和编码可操作地连接至人IL-15Rα多肽的人IL-15多肽的mRNA的组合，其中所述两种mRNA被包封在相同或不同的脂质纳米颗粒中。在一些实施方案中，所述两种mRNA包封在相同的脂质纳米颗粒中。在一些实施方案中，所述两种mRNA包封在两个不同的脂质纳米颗粒中。
在一些实施方案中，所述组合物包含(i)编码人OX40L多肽的mRNA；(ii)编码栓系人IL-12多肽的mRNA；(iii)编码人IL-15多肽的mRNA；和(iv)编码人IL-15Rα多肽的mRNA。在一些实施方案中，所述组合物包含(i)编码人OX40L多肽的mRNA，其中所述人OX40L多肽包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；(ii)编码栓系人IL-12多肽的mRNA，其中所述人IL-12多肽包含选自由SEQ ID NO:53、55、61和66组成的组的氨基酸序列；(iii)编码人IL-15多肽的mRNA，其中所述人IL-15多肽包含选自由SEQ ID NO:15和17组成的组的氨基酸序列；和(iv)编码人IL-15Rα多肽的mRNA，其中所述人IL-15Rα多肽包含SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述组合物包含(i)编码人OX40L多肽的mRNA，其中所述人OX40L多肽包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；(ii)编码栓系人IL-12多肽的mRNA，其中所述人IL-12多肽包含SEQ ID NO:61所示的氨基酸序列；(iii)编码人IL-15多肽的mRNA，其中所述人IL-15多肽包含SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列；和(iv)编码人IL-15Rα多肽的mRNA，其中所述人IL-15Rα多肽包含SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述组合物包含(i)编码人OX40L多肽的mRNA，其中所述mRNA包含开放阅读框，所述开放阅读框包含选自由SEQ ID NO:4、6和9-11组成的组的核苷酸序列；(ii)编码栓系人IL-12多肽的mRNA，其中所述mRNA包含开放阅读框，所述开放阅读框包含选自由SEQ ID NO:52、54、56-60和67组成的组的核苷酸序列；(iii)编码人IL-15多肽的mRNA，其中所述mRNA包含开放阅读框，所述开放阅读框包含选自由SEQ ID NO:16、19、20和122组成的组的核苷酸序列；和(iv)编码人IL-15Rα多肽的mRNA，其中所述mRNA包含开放阅读框，所述开放阅读框包含选自由SEQ IDNO:14、21和22组成的组的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述组合物包含(i)编码人OX40L多肽的mRNA，其中所述mRNA包含开放阅读框，所述开放阅读框包含与选自由SEQ IDNO:4、6和9-11组成的组的核苷酸序列具有至少80％、85％、90％、95％或99％同一性的核苷酸序列；(ii)编码栓系人IL-12多肽的mRNA，其中所述mRNA包含开放阅读框，所述开放阅读框包含与选自由SEQ ID NO:52、54、56-60和67组成的组的核苷酸序列具有至少80％、85％、90％、95％或99％同一性的核苷酸序列；(iii)编码人IL-15多肽的mRNA，其中所述mRNA包含开放阅读框，所述开放阅读框包含与选自由SEQ ID NO:16、19、20和122组成的组的核苷酸序列具有至少80％、85％、90％、95％或99％同一性的核苷酸序列；和(iv)编码人IL-15Rα多肽的mRNA，其中所述mRNA包含开放阅读框，所述开放阅读框包含与选自由SEQ ID NO:14、21和22组成的组的核苷酸序列具有至少80％、85％、90％、95％或99％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述组合物包含(i)编码人OX40L多肽的mRNA，其中所述mRNA包含开放阅读框，所述开放阅读框包含SEQ ID NO:11所示的核苷酸序列；(ii)编码栓系人IL-12多肽的mRNA，其中所述mRNA包含开放阅读框，所述开放阅读框包含SEQ ID NO:60所示的核苷酸序列；(iii)编码人IL-15多肽的mRNA，其中所述mRNA包含开放阅读框，所述开放阅读框包含SEQ ID NO:122所示的核苷酸序列；和(iv)编码人IL-15Rα多肽的mRNA，其中所述mRNA包含开放阅读框，所述开放阅读框包含SEQ ID NO:22所示的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述组合物包含(i)编码人OX40L多肽的mRNA，其中所述mRNA包含开放阅读框，所述开放阅读框包含与SEQ ID NO:11所示的核苷酸序列具有至少80％、85％、90％、95％或99％同一性的核苷酸序列；(ii)编码栓系人IL-12多肽的mRNA，其中所述mRNA包含开放阅读框，所述开放阅读框包含与SEQ ID NO:60所示的核苷酸序列具有至少80％、85％、90％、95％或99％同一性的核苷酸序列；(iii)编码人IL-15多肽的mRNA，其中所述mRNA包含开放阅读框，所述开放阅读框包含与SEQ ID NO:122所示的核苷酸序列具有至少80％、85％、90％、95％或99％同一性的核苷酸序列；和(iv)编码人IL-15Rα多肽的mRNA，其中所述mRNA包含开放阅读框，所述开放阅读框包含与SEQ ID NO:22所示的选自由SEQ ID NO:24-26、28-30和124-126组成的组的核苷酸序列具有至少80％、85％、90％、95％或99％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本公开提供了如本文所述的编码人OX40L多肽的mRNA、编码栓系人IL-12多肽的mRNA、编码人IL-15多肽的mRNA和编码人IL-15Rα多肽的mRNA的组合，其中所述四种mRNA被包封在相同或不同的脂质纳米颗粒中。在一些实施方案中，所述四种mRNA包封在相同的脂质纳米颗粒中。在一些实施方案中，所述四种mRNA包封在三个不同的脂质纳米颗粒中。
在一些实施方案中，所述组合物包含(i)编码人OX40L多肽的mRNA；(ii)编码栓系人IL-12多肽的mRNA；和(iii)编码可操作地连接至人IL-15Rα多肽的人IL-15多肽的mRNA。在一些实施方案中，所述组合物包含(i)编码人OX40L多肽的mRNA，其中所述人OX40L多肽包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；(ii)编码栓系人IL-12多肽的mRNA，其中所述人IL-12多肽包含选自由SEQ ID NO:53、55、61和66组成的组的氨基酸序列；和(iii)编码包含选自由SEQ ID NO:18、23、27和123组成的组的氨基酸序列的可操作地连接至人IL-15Rα多肽的人IL-15多肽的mRNA。在一些实施方案中，所述组合物包含(i)编码人OX40L多肽的mRNA，其中所述人OX40L多肽包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；(ii)编码栓系人IL-12多肽的mRNA，其中所述人IL-12多肽包含SEQ ID NO:61所示的氨基酸序列；和(iii)编码包含选自由SEQID NO:18、23、27和123组成的组的氨基酸序列的可操作地连接至人IL-15Rα多肽的人IL-15多肽的mRNA。在一些实施方案中，所述组合物包含(i)编码人OX40L多肽的mRNA，其中所述mRNA包含开放阅读框，所述开放阅读框包含选自由SEQ ID NO:4、6和9-11组成的组的核苷酸序列；(ii)编码栓系人IL-12多肽的mRNA，其中所述mRNA包含开放阅读框，所述开放阅读框包含选自由SEQ ID NO:52、54、56-60和67组成的组的核苷酸序列；和(iii)编码可操作地连接至人IL-15Rα多肽的人IL-15多肽的mRNA，其中所述mRNA包含开放阅读框，所述开放阅读框包含选自由SEQ ID NO:24-26、28-30和124-126组成的组的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述组合物包含(i)编码人OX40L多肽的mRNA，其中所述mRNA包含开放阅读框，所述开放阅读框包含与选自由SEQ ID NO:4、6和9-11组成的组的核苷酸序列具有至少80％、85％、90％、95％或99％同一性的核苷酸序列；(ii)编码栓系人IL-12多肽的mRNA，其中所述mRNA包含开放阅读框，所述开放阅读框包含与选自由SEQ ID NO:52、54、56-60和67组成的组的核苷酸序列具有至少80％、85％、90％、95％或99％同一性的核苷酸序列；和(iii)编码可操作地连接至人IL-15Rα多肽的人IL-15多肽的mRNA，其中所述mRNA包含开放阅读框，所述开放阅读框包含与选自由SEQ ID NO:24-26、28-30和124-126组成的组的核苷酸序列具有至少80％、85％、90％、95％或99％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述组合物包含(i)编码人OX40L多肽的mRNA，其中所述mRNA包含开放阅读框，所述开放阅读框包含SEQ IDNO:11所示的核苷酸序列；(ii)编码栓系人IL-12多肽的mRNA，其中所述mRNA包含开放阅读框，所述开放阅读框包含SEQ ID NO:60所示的核苷酸序列；和(iii)编码可操作地连接至人IL-15Rα多肽的人IL-15多肽的mRNA，其中所述mRNA包含开放阅读框，所述开放阅读框包含选自由SEQ ID NO:24-26、28-30和124-126组成的组的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述组合物包含(i)编码人OX40L多肽的mRNA，其中所述mRNA包含开放阅读框，所述开放阅读框包含与SEQ ID NO:11所示的核苷酸序列具有至少80％、85％、90％、95％或99％同一性的核苷酸序列；(ii)编码栓系人IL-12多肽的mRNA，其中所述mRNA包含开放阅读框，所述开放阅读框包含与SEQ ID NO:60所示的核苷酸序列具有至少80％、85％、90％、95％或99％同一性的核苷酸序列；和(iii)编码可操作地连接至人IL-15Rα多肽的人IL-15多肽的mRNA，其中所述mRNA包含开放阅读框，所述开放阅读框包含与选自由SEQ ID NO:24-26、28-30和124-126组成的组的核苷酸序列具有至少80％、85％、90％、95％或99％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本公开提供了如本文所述的编码人OX40L多肽的mRNA、编码栓系人IL-12多肽的mRNA和编码可操作地连接至人IL-15Rα多肽的人IL-15多肽的组合，其中所述三种mRNA被包封在相同或不同的脂质纳米颗粒中。在一些实施方案中，所述三种mRNA包封在相同的脂质纳米颗粒中。在一些实施方案中，所述三种mRNA包封在两个不同的脂质纳米颗粒中。
mRNA构建体组分
mRNA可以是天然或非天然存在的mRNA。如下所述，mRNA可包含一个或多个修饰的核碱基、核苷或核苷酸，在这种情况下，它可被称为“修饰的mRNA”或“mmRNA”。如本文所述，“核苷”定义为含有糖分子(例如，戊糖或核糖)或其衍生物与有机碱基(例如，嘌呤或嘧啶)或其衍生物(在本文中也称为“核碱基”)组合的化合物。如本文所述，“核苷酸”定义为包括磷酸基团的核苷。
mRNA可包括5'非翻译区(5'-UTR)、3'非翻译区(3'-UTR)和/或编码区(例如，开放阅读框)。SEQ ID NO:75中显示了用于构建体中的示例性5’UTR。SEQ ID NO:76中显示了用于构建体中的另一示例性5’UTR。SEQ ID NO:133中显示了用于构建体中的另一示例性5’UTR。SEQ ID NO:12中显示了用于构建体中的另一示例性5’UTR。SEQ ID NO:77中显示了用于构建体中的示例性3’UTR。SEQ ID NO:78中显示了用于构建体中的包含miR-122和miR-142.3p结合位点的示例性3’UTR。mRNA可包括任何合适数量的碱基对，包括数十(例如，10、20、30、40、50、60、70、80、90或100)、数百(例如，200、300、400、500、600、700、800或900)或数千(例如，1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10,000)个碱基对。任意数量(例如，全部、部分或无)的核碱基、核苷或核苷酸可以是取代的、修饰的或以其他方式非天然存在的规范物质的类似物。在某些实施方案中，所有特定核碱基类型均可以是修饰的。
在一些实施方案中，如本文所述的mRNA可包括5'帽结构、链终止核苷酸、任选地Kozak序列(也称为Kozak共有序列)、茎环、聚A序列和/或聚腺苷酸化信号。
5'帽结构或帽物质是包括通过接头连接的两个核苷部分的化合物，并且可选自天然存在的帽、非天然存在的帽或帽类似物，或抗反向帽类似物(anti-reverse cap analog，ARCA)。帽物质可包括一个或多个修饰的核苷和/或接头部分。例如，天然mRNA帽可包括鸟嘌呤(G)核苷酸和在7位甲基化的鸟嘌呤核苷酸，它们在5'位通过三磷酸连键连接，例如m7G(5’)ppp(5’)G，通常写为m7GpppG。帽物质还可以是抗反向帽类似物。可能的帽物质的非限制性列表包括m7GpppG、m7Gpppm7G、m73′dGpppG、m2 7,O3′GpppG、m2 7,O3′GppppG、m2 7,O2′Gp pppG、m7Gpppm7G、m73′dGpppG、m2 7,O3′GpppG、m2 7,O3′GppppG和m2 7,O2′GppppG。
mRNA可替代地或另外地包括链终止核苷。例如，链终止核苷可包括在其糖基的2'和/或3'位脱氧的那些核苷。此类物质可包括3’-脱氧腺苷(虫草素(cordycepin))、3’-脱氧尿苷、3’-脱氧胞嘧啶、3’-脱氧鸟苷、3’-脱氧胸腺嘧啶，以及2’,3’-二脱氧核苷，如2’,3’-二脱氧腺苷、2’,3’-二脱氧尿苷、2’,3’-二脱氧胞嘧啶、2’,3’-二脱氧鸟苷和2’,3’-二脱氧胸腺嘧啶。在一些实施方案中，如例如国际专利公布号WO 2013/103659中所述，将链终止核苷酸并入mRNA中的例如3’末端可使mRNA稳定化。
mRNA可替代地或另外地包括茎环，如组蛋白茎环。茎环可包括2、3、4、5、6、7、8或更多个核苷酸碱基对。例如，茎环可包括4、5、6、7或8个核苷酸碱基对。茎环可位于mRNA的任何区域。例如，茎环可位于非翻译区(5’非翻译区或3’非翻译区)、编码区或聚A序列或尾之中、之前或之后。在一些实施方案中，茎环可影响mRNA的一种或多种功能，如翻译起始、翻译效率和/或转录终止。
mRNA可替代地或另外地包括聚A序列和/或聚腺苷酸化信号。聚A序列可全部或大部分由腺嘌呤核苷酸或其类似物或衍生物组成。聚A序列可以是位于mRNA的3’非翻译区附近的尾。在一些实施方案中，聚A序列可影响mRNA的核输出、翻译和/或稳定性。
mRNA可替代地或另外地包括微RNA结合位点。
在一些实施方案中，mRNA是双顺反子mRNA，其包含第一编码区和第二编码区，具有包含允许第一编码区与第二编码区之间的内部翻译起始的内部核糖体进入位点(IRES)序列的间插序列，或者具有编码自切割肽(如2A肽)的间插序列。IRES序列和2A肽通常用于增强同一载体中多种蛋白质的表达。多种IRES序列在本领域中是已知的且可获得的，并且是可使用的，包括例如脑心肌炎病毒IRES。
在一个实施方案中，本公开的多核苷酸可包括编码自切割肽的序列。自切割肽可以是但不限于2A肽。多种2A肽在本领域中是已知的且可获得的，并且是可使用的，包括例如口蹄疫病毒(FMDV)2A肽、马甲型鼻炎病毒2A肽、明脉扁刺蛾病毒(Thosea asigna)病毒2A肽和猪捷申病毒1型2A肽。2A肽可被几种病毒利用通过核糖体跳过从一个转录物生成两个蛋白质，这样正常的肽键在2A肽序列处受损，导致一个翻译事件产生两个不连续的蛋白质。作为非限制性实例，2A肽可具有蛋白质序列：GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP(SEQ ID NO:79)，其片段或变体。在一个实施方案中，2A肽在最后一个甘氨酸和最后一个脯氨酸之间切割。作为另一非限制性实例，本公开的多核苷酸可包括编码具有蛋白质序列GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP(SEQ ID NO:79)、其片段或变体的2A肽的多核苷酸序列。编码2A肽的多核苷酸序列的一个实例是：GGAAGCGGAGCTACTAACTTCAGCCTGCTGAAGCAGGCTGGAGACGTGGAGGAGAACCCTGGACCT(SEQID NO:80)。在一个说明性性实施方案中，2A肽由以下序列编码：5’-TCCGGACTCAGATCCGGGGATCTCAAAATTGTCGCTCCTGTCAAACAAACTCTTAACTTTGATTTACTCAAACTGGCTGGGGATGTAGAAAGCAATCCAGGTCCACTC-3’(SEQ ID NO:81)。2A肽的多核苷酸序列可通过本文所述和/或本领域已知的方法进行修饰或密码子优化。
在一个实施方案中，此序列可用于分离两个或更多个目标多肽的编码区。作为非限制性实例，编码F2A肽的序列可在第一编码区A和第二编码区B之间(A-F2Apep-B)。F2A肽的存在导致F2A肽序列末端的甘氨酸和脯氨酸之间的一个长蛋白被切割(NPGP被切割产生NPG和P)，从而产生单独的蛋白A(连接F2A肽的21个氨基酸，以NPG结尾)和单独的蛋白B(连接F2A肽的1个氨基酸P)。同样，对于其他2A肽(P2A、T2A和E2A)，长蛋白中该肽的存在导致2A肽序列末端的甘氨酸和脯氨酸之间发生切割(NPGP被切割产生NPG和P)。蛋白A和蛋白B可以是相同或不同的目标肽或多肽。在特定实施方案中，蛋白A是诱导免疫原性细胞死亡的多肽，而蛋白B是刺激炎症和/或免疫应答和/或调节免疫应答性的另一种多肽(如下文进一步描述)。
在一些实施方案中，本文所述的mRNA构建体包含接头。在一些实施方案中，接头是肽接头，包括一个氨基酸至约200个氨基酸。在一些实施方案中，接头包含至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个、至少25个、至少26个、至少27个、至少28个、至少29个、至少30个、至少31个、至少32个、至少33个、至少34个、至少35个、至少36个、至少37个、至少38个、至少39个或至少40个氨基酸。
在一些实施方案中，接头可以是GS(Gly/Ser)接头，例如包含(GnS)m，其中n是1至20的整数且m是1至20的整数。在一些实施方案中，GS接头可包含(GGGGS)o(SEQ ID NO:86)，其中o是1至5的整数。在一些实施方案中，GS接头可包含GGSGGGGSGG(SEQ ID NO:87)、GGSGGGGG(SEQ ID NO:88)或GSGSGSGS(SEQ ID NO:89)。在一个特定实施方案中，接头是G6S(GGGGGGS)(SEQ ID NO:90)。
在一些实施方案中，接头可以是富含Gly的接头，例如包含(Gly)p，其中p是1至40的整数。在一些实施方案中，富含Gly的接头可包含GGGGG(SEQ ID NO:91)、GGGGGG(SEQ IDNO:92)、GGGGGGG(SEQ ID NO:93)或GGGGGGGG(SEQ ID NO:94)。
在一些实施方案中，接头可包含(EAAAK)q(SEQ ID NO:95)，其中q是1至5的整数。在一个实施方案中，接头可包含(EAAAK)3，即EAAAKEAAAKEAAAK(SEQ ID NO:96)。
其他示例性接头包括但不限于GGGGSLVPRGSGGGGS(SEQ ID NO:97)、GSGSGS(SEQID NO:98)、GGGGSLVPRGSGGGG(SEQ ID NO:99)、GGSGGHMGSGG(SEQ ID NO:100)、GGSGGSGGSGG(SEQ ID NO:101)、GGSGG(SEQ ID NO:102)、GSGSGSGS(SEQ ID NO:103)、GGGSEGGGSEGGGSEGGG(SEQ ID NO:104)、AAGAATAA(SEQ ID NO:105)、GGSSG(SEQ ID NO:106)、GSGGGTGGGSG(SEQ ID NO:107)、GSGSGSGSGGSG(SEQ ID NO:108)、GSGGSGSGGSGGSG(SEQ ID NO:109)和GSGGSGGSGGSGGS(SEQ ID NO:110)。
可构建编码本文所公开的接头的核苷酸以融合本文所公开的多核苷酸的一个或多个ORF。
修饰的mRNA
在一些实施方案中，本公开的mRNA包含一个或多个修饰的核碱基、核苷或核苷酸(称为“修饰的mRNA”或“mmRNA”)。在一些实施方案中，与参考未修饰的mRNA相比，修饰的mRNA可具有有用的特性，包括稳定性增强、细胞内保留、翻译增强和/或缺乏引入了mRNA的细胞的先天性免疫应答的实质性诱导。因此，使用修饰的mRNA可提高蛋白质生产的效率，实现核酸在细胞内的保留并且具有降低的免疫原性。
在一些实施方案中，mRNA包括一个或多个(例如，1、2、3或4个)不同的修饰的核碱基、核苷或核苷酸。在一些实施方案中，mRNA包括一个或多个(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100或更多个)不同的修饰核碱基、核苷或核苷酸。在一些实施方案中，相对于相应的未修饰mRNA，修饰的mRNA在引入了mRNA的细胞中的降解降低。
在一些实施方案中，修饰的核碱基是修饰的尿嘧啶。具有修饰的尿嘧啶的示例性核碱基和核苷包括假尿苷(ψ)、吡啶-4-酮核糖核苷、5-氮杂-尿苷、6-氮杂-尿苷、2-硫代-5-氮杂-尿苷、2-硫代-尿苷(s2U)、4-硫代-尿苷(s4U)、4-硫代-假尿苷、2-硫代-假尿苷、5-羟基-尿苷(ho5U)、5-氨基烯丙基-尿苷、5-卤代-尿苷(例如，5-碘-尿苷或5-溴-尿苷)、3-甲基-尿苷(m3U)、5-甲氧基-尿苷(mo5U)、尿苷5-氧乙酸(cmo5U)、尿苷5-氧乙酸甲酯(mcmo5U)、5-羧甲基-尿苷(cm5U)、1-羧甲基-假尿苷、5-羧羟甲基-尿苷(chm5U)、5-羧羟甲基-尿苷甲酯(mchm5U)、5-甲氧基羰基甲基-尿苷(mcm5U)、5-甲氧基羰基甲基-2-硫代-尿苷(mcm5s2U)、5-氨基甲基-2-硫代-尿苷(nm5s2U)、5-甲基氨基甲基-尿苷(mnm5U)、5-甲基氨基甲基-2-硫代-尿苷(mnm5s2U)、5-甲基氨基甲基-2-硒代-尿苷(mnm5se2U)、5-氨基甲酰基甲基-尿苷(ncm5U)、5-羧甲基氨基甲基-尿苷(cmnm5U)、5-羧甲基氨基甲基-2-硫代-尿苷(cmnm5s2U)、5-丙炔基-尿苷、1-丙炔基-假尿苷、5-牛磺酸甲基-尿苷(τm5U)、1-牛磺酸甲基-假尿苷、5-牛磺酸甲基-2-硫代-尿苷(τm5s2U)、1-牛磺酸甲基-4-硫代-假尿苷、5-甲基-尿苷(m5U，即，具有核碱基脱氧胸腺嘧啶)、1-甲基-假尿苷(m1ψ)、5-甲基-2-硫代-尿苷(m5s2U)、1-甲基-4-硫代-假尿苷(m1s4ψ)、4-硫代-1-甲基-假尿苷、3-甲基-假尿苷(m3ψ)、2-硫代-1-甲基-假尿苷、1-甲基-1-脱氮-假尿苷、2-硫代-1-甲基-1-脱氮-假尿苷、二氢尿苷(D)、二氢假尿苷、5,6-二氢尿苷、5-甲基-二氢尿苷(m5D)、2-硫代-二氢尿苷、2-硫代-二氢假尿苷、2-甲氧基-尿苷、2-甲氧基-4-硫代-尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-甲氧基-2-硫代-假尿苷、N1-甲基-假尿苷、3-(3-氨基-3-羧丙基)尿苷(acp3U)、1-甲基-3-(3-氨基-3-羧丙基)假尿苷(acp3ψ)、5-(异戊烯基氨基甲基)尿苷(inm5U)、5-(异戊烯基氨基甲基)-2-硫代-尿苷(inm5s2U)、α-硫代-尿苷、2’-O-甲基-尿苷(Um)、5,2’-O-二甲基-尿苷(m5Um)、2’-O-甲基-假尿苷(ψm)、2-硫代-2’-O-甲基-尿苷(s2Um)、5-甲氧基羰基甲基-2’-O-甲基-尿苷(mcm5Um)、5-氨基甲酰基甲基-2’-O-甲基-尿苷(ncm5Um)、5-羧甲基氨基甲基-2’-O-甲基-尿苷(cmnm5Um)、3,2’-O-二甲基-尿苷(m3Um)和5-(异戊烯基氨基甲基)-2’-O-甲基-尿苷(inm5Um)、1-硫代-尿苷、脱氧胸苷、2’-F-阿糖-尿苷、2’-F-尿苷、2’-OH-阿糖-尿苷、5-(2-羰基甲氧基乙烯基)尿苷和5-[3-(1-E-丙烯基氨基)]尿苷。
在一些实施方案中，修饰的核碱基是修饰的胞嘧啶。具有修饰的胞嘧啶的示例性核碱基和核苷包括5-氮杂-胞苷、6-氮杂-胞苷、假异胞苷、3-甲基-胞苷(m3C)、N4-乙酰基-胞苷(ac4C)、5-甲酰基-胞苷(f5C)、N4-甲基-胞苷(m4C)、5-甲基-胞苷(m5C)、5-卤代-胞苷(例如，5-碘-胞苷)、5-羟基甲基-胞苷(hm5C)、1-甲基-假异胞苷、吡咯并-胞苷、吡咯并-假异胞苷、2-硫代-胞苷(s2C)、2-硫代-5-甲基-胞苷、4-硫代-假异胞苷、4-硫代-1-甲基-假异胞苷、4-硫代-1-甲基-1-脱氮-假异胞苷、1-甲基-1-脱氮-假异胞苷、折布拉林(zebularine)、5-氮杂-折布拉林、5-甲基-折布拉林、5-氮杂-2-硫代-折布拉林、2-硫代-折布拉林、2-甲氧基-胞苷、2-甲氧基-5-甲基-胞苷、4-甲氧基-假异胞苷、4-甲氧基-1-甲基-假异胞苷、赖西丁(lysidine)(k2C)、α-硫代-胞苷、2’-O-甲基-胞苷(Cm)、5,2’-O-二甲基-胞苷(m5Cm)、N4-乙酰基-2’-O-甲基-胞苷(ac4Cm)、N4,2’-O-二甲基-胞苷(m4Cm)、5-甲酰基-2’-O-甲基-胞苷(f5Cm)、N4,N4,2’-O-三甲基-胞苷(m4 2Cm)、1-硫代-胞苷、2’-F-阿糖-胞苷、2’-F-胞苷和2’-OH-阿糖-胞苷。
在一些实施方案中，修饰的核碱基是修饰的腺嘌呤。具有修饰的腺嘌呤的示例性核碱基和核苷包括α-硫代-腺苷、2-氨基-嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、2-氨基-6-卤代-嘌呤(例如，2-氨基-6-氯-嘌呤)、6-卤代-嘌呤(例如，6-氯-嘌呤)、2-氨基-6-甲基-嘌呤、8-叠氮基-腺苷、7-脱氮-腺嘌呤、7-脱氮-8-氮杂-腺嘌呤、7-脱氮-2-氨基-嘌呤、7-脱氮-8-氮杂-2-氨基-嘌呤、7-脱氮-2,6-二氨基嘌呤、7-脱氮-8-氮杂-2,6-二氨基嘌呤、1-甲基-腺苷(m1A)、2-甲基-腺嘌呤(m2A)、N6-甲基-腺苷(m6A)、2-甲基硫代-N6-甲基-腺苷(ms2m6A)、N6-异戊烯基-腺苷(i6A)、2-甲基硫代-N6-异戊烯基-腺苷(ms2i6A)、N6-(顺式-羟基异戊烯基)腺苷(io6A)、2-甲基硫代-N6-(顺式-羟基异戊烯基)腺苷(ms2io6A)、N6-甘氨酰基氨基甲酰基-腺苷(g6A)、N6-苏氨酰基氨基甲酰基-腺苷(t6A)、N6-甲基-N6-苏氨酰基氨基甲酰基-腺苷(m6t6A)、2-甲基硫代-N6-苏氨酰基氨基甲酰基-腺苷(ms2g6A)、N6,N6-二甲基-腺苷(m6 2A)、N6-羟基正缬氨酰氨基甲酰基-腺苷(hn6A)、2-甲基硫代-N6-羟基正缬氨酰氨基甲酰基-腺苷(ms2hn6A)、N6-乙酰基-腺苷(ac6A)、7-甲基-腺嘌呤、2-甲基硫代-腺嘌呤、2-甲氧基-腺嘌呤、α-硫代-腺苷、2’-O-甲基-腺苷(Am)、N6,2’-O-二甲基-腺苷(m6Am)、N6,N6,2’-O-三甲基-腺苷(m6 2Am)、1,2’-O-二甲基-腺苷(m1Am)、2’-O-核糖基腺苷(磷酸)(Ar(p))、2-氨基-N6-甲基-嘌呤、1-硫代-腺苷、8-叠氮基-腺苷、2’-F-阿糖-腺苷、2’-F-腺苷、2’-OH-阿糖-腺苷和N6-(19-氨基-五氧杂十九基(pentaoxanonadecyl))-腺苷。
在一些实施方案中，修饰的核碱基是修饰的鸟嘌呤。具有修饰的鸟嘌呤的示例性核碱基和核苷包括-硫代α-尿苷、肌苷(I)、1-甲基-肌苷(m1I)、怀俄苷(imG)、怀俄苷(mimG)、4-去甲基-怀俄苷(imG-14)、异怀俄苷(imG2)、怀丁苷(yW)、过氧怀丁苷(o2yW)、羟基怀丁苷(OhyW)、未修饰的羟基怀丁苷(OhyW*)、7-脱氮-尿苷、辫苷(Q)、环氧辫苷(oQ)、半乳糖基-辫苷(galQ)、甘露糖基-辫苷(manQ)、7-氰基-7-脱氮-尿苷(preQ0)、7-氨基甲基-7-脱氮-尿苷(preQ1)、古嘌苷(G+)、7-脱氮-8-氮杂-尿苷、6-硫代-尿苷、6-硫代-7-脱氮-尿苷、6-硫代-7-脱氮-8-氮杂-尿苷、7-甲基-尿苷(m7G)、6-硫代-7-甲基-尿苷、7-甲基-肌苷、6-甲氧基-尿苷、1-甲基-尿苷(m1G)、N2-甲基-尿苷(m2G)、N2,N2-二甲基-尿苷(m2 2G)、N2,7-二甲基-尿苷(m2,7G)、N2,N2,7-二甲基-尿苷(m2,2,7G)、8-氧代-尿苷、7-甲基-8-氧代-尿苷、1-甲基-6-硫代-尿苷、N2-甲基-6-硫代-尿苷、N2,N2-二甲基-6-硫代-尿苷、α-硫代-尿苷、2’-O-甲基-尿苷(Gm)、N2-甲基-2’-O-甲基-尿苷(m2Gm)、N2,N2-二甲基-2’-O-甲基-尿苷(m2 2Gm)、1-甲基-2’-O-甲基-尿苷(m1Gm)、N2,7-二甲基-2’-O-甲基-尿苷(m2,7Gm)、2’-O-甲基-肌苷(Im)、1,2’-O-二甲基-肌苷(m1Im)、2’-O-核糖基尿苷(磷酸)(Gr(p))、1-硫代-尿苷、O6-甲基-尿苷、2’-F-阿糖-尿苷和2’-F-尿苷。
在一些实施方案中，本公开的mRNA包括前述修饰核碱基中的一个或多个的组合(例如，前述修饰核碱基中的2个、3个或4个的组合)。
在一些实施方案中，所述修饰的核碱基是假尿苷(ψ)、N1-甲基假尿苷(m1ψ)、2-硫代尿苷、4’-硫代尿苷、5-甲基胞嘧啶、2-硫代-1-甲基-1-脱氮-假尿苷、2-硫代-1-甲基-假尿苷、2-硫代-5-氮杂-尿苷、2-硫代-二氢假尿苷、2-硫代-二氢尿苷、2-硫代-假尿苷、4-甲氧基-2-硫代-假尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-硫代-1-甲基-假尿苷、4-硫代-假尿苷、5-氮杂-尿苷、二氢假尿苷、5-甲氧基尿苷或2’-O-甲基尿苷。
在一些实施方案中，本公开的mRNA包括前述修饰核碱基中的一个或多个的组合(例如，前述修饰核碱基中的2个、3个或4个的组合)。
在一些实施方案中，修饰的核碱基是修饰的胞嘧啶。具有修饰的胞嘧啶的示例性核碱基和核苷包括N4-乙酰基-胞苷(ac4C)、5-甲基-胞苷(m5C)、5-卤代-胞苷(例如，5-碘-胞苷)、5-羟基甲基-胞苷(hm5C)、1-甲基-假异胞苷、2-硫代-胞苷(s2C)、2-硫代-5-甲基-胞苷。在一些实施方案中，本公开的mRNA包括前述修饰核碱基中的一个或多个的组合(例如，前述修饰核碱基中的2个、3个或4个的组合)。
在一些实施方案中，修饰的核碱基是修饰的腺嘌呤。具有修饰的腺嘌呤的示例性核碱基和核苷包括7-脱氮-腺嘌呤、1-甲基-腺苷(m1A)、2-甲基-腺嘌呤(m2A)、N6-甲基-腺苷(m6A)。在一些实施方案中，本公开的mRNA包括前述修饰核碱基中的一个或多个的组合(例如，前述修饰核碱基中的2个、3个或4个的组合)。
在一些实施方案中，修饰的核碱基是修饰的鸟嘌呤。具有修饰的鸟嘌呤的示例性核碱基和核苷包括肌苷(I)、1-甲基-肌苷(m1I)、怀俄苷(imG)、甲基怀俄苷(mimG)、7-脱氮-尿苷、7-氰基-7-脱氮-尿苷(preQ0)、7-氨基甲基-7-脱氮-尿苷(preQ1)、7-甲基-尿苷(m7G)、1-甲基-尿苷(m1G)、8-氧代-尿苷、7-甲基-8-氧代-尿苷。在一些实施方案中，本公开的mRNA包括前述修饰核碱基中的一个或多个的组合(例如，前述修饰核碱基中的2个、3个或4个的组合)。
在一些实施方案中，修饰的核碱基是1-甲基-假尿苷(m1ψ)、5-甲氧基-尿苷(mo5U)、5-甲基-胞苷(m5C)、假尿苷(ψ)、α-硫代-尿苷或α-硫代-腺苷。在一些实施方案中，本公开的mRNA包括前述修饰核碱基中的一个或多个的组合(例如，前述修饰核碱基中的2个、3个或4个的组合)。
在一些实施方案中，mRNA包含假尿苷(ψ)。在一些实施方案中，mRNA包含假尿苷(ψ)和5-甲基-胞苷(m5C)。在一些实施方案中，mRNA包含1-甲基-假尿苷(m1ψ)。在一些实施方案中，mRNA包含1-甲基-假尿苷(m1ψ)和5-甲基-胞苷(m5C)。在一些实施方案中，mRNA包含2-硫代尿苷(s2U)。在一些实施方案中，mRNA包含2-硫代尿苷和5-甲基-胞苷(m5C)。在一些实施方案中，mRNA包含5-甲氧基-尿苷(mo5U)。在一些实施方案中，mRNA包含5-甲氧基-尿苷(mo5U)和5-甲基-胞苷(m5C)。在一些实施方案中，mRNA包含2’-O-甲基尿苷。在一些实施方案中，mRNA包含2’-O-甲基尿苷和5-甲基-胞苷(m5C)。在一些实施方案中，mRNA包含N6-甲基-腺苷(m6A)。在一些实施方案中，mRNA包含N6-甲基-腺苷(m6A)和5-甲基-胞苷(m5C)。
在某些实施方案中，本公开的mRNA被均一修饰(即，完全修饰，在整个序列中修饰)以获得特定修饰。在一些实施方案中，本公开的mRNA被修饰，其中至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的指定核苷酸或核碱基被修饰。例如，mRNA可用5-甲基-胞苷(m5C)均一修饰，这意味着mRNA序列中的所有胞嘧啶残基都被5-甲基-胞苷(m5C)置换。相似地，可通过用修饰的残基(如以上阐述的那些)置换针对序列中存在的任何类型的核苷残基来均一地修饰本公开的mRNA。在一些实施方案中，本公开的mRNA可用1-甲基假尿苷(m1ψ)均一修饰，这意味着mRNA序列中的所有尿苷残基都被1-甲基假尿苷(m1ψ)置换。在一些实施方案中，至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的尿苷是1-甲基假尿苷(m1ψ)。
在一些实施方案中，本公开的mRNA可在编码区(例如，编码多肽的开放阅读框)中被修饰。在其他实施方案中，mRNA可在除编码区之外的区域中被修饰。例如，在一些实施方案中，提供了5’-UTR和/或3’-UTR，其中任一者或两者可独立地包含一个或多个不同的核苷修饰。在此类实施方案中，核苷修饰也可存在于编码区中。
可存在于本公开的mmRNA中的核苷修饰及其组合的实例包括但不限于在PCT专利申请公布：WO2012045075、WO2014081507、WO2014093924、WO2014164253和WO2014159813中描述的那些。
本公开的mmRNA可包括对糖、核碱基和/或核苷间连键的修饰的组合。这些组合可包括本文所述的任何一个或多个修饰。
在某些实施方案中，修饰的核苷可部分或完全取代本公开的mRNA的天然核苷酸。作为非限制性实例，天然核苷酸尿苷可被本文所述的修饰的核苷取代。在另一个非限制性实例中，天然核苷尿苷可部分地(例如，约0.1％、1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99.9％的天然尿苷)被本文所公开的至少一个修饰的核苷取代。
本公开的mRNA或其区域可经密码子优化。密码子优化方法在本领域中是已知的，并且可用于多种目的：匹配宿主生物体中的密码子频率以确保适当折叠；偏重GC含量以增加mRNA稳定性或减少二级结构；使可损害基因构建或表达的串联重复密码子或碱基延伸减到最少；定制转录和翻译控制区；插入或移除蛋白质移行序列；在所编码蛋白质中移除/添加翻译后修饰位点(例如，糖基化位点)；添加、移除或改组蛋白质结构域；插入或缺失限制性位点；修饰核糖体结合位点和mRNA降解位点；调整翻译速率以使蛋白质的各种结构域适当折叠；或减少或消除多核苷酸内的问题二级结构。密码子优化工具、算法和服务在本领域中是已知的；非限制性实例包括来自GeneArt(Life Technologies)的服务、DNA2.0(MenloPark CA)和/或专有方法。在一个实施方案中，使用优化算法来优化mRNA序列，例如，以优化在哺乳动物细胞中的表达或增强mRNA的稳定性。
在某些实施方案中，本公开包括与本文所述的任何多核苷酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的多核苷酸。
本公开的mRNA可通过本领域可用的方式产生，包括但不限于体外转录(IVT)和合成方法。可利用酶促(IVT)、固相、液相、组合合成方法、小区域合成和连接方法。在一个实施方案中，使用IVT酶促合成方法制备mRNA。通过IVT制备多核苷酸的方法在本领域中是已知的，并且描述于国际申请PCT/US2013/30062中，所述申请的内容以引用方式整体并入本文。因此，本公开还包括可用于体外转录本文所述的mRNA的多核苷酸，例如DNA、构建体和载体。
可在合成期间或合成后将非天然的修饰核碱基引入多核苷酸，例如mRNA中。在某些实施方案中，修饰可在核苷间键、嘌呤或嘧啶碱基或糖上。在特定实施方案中，修饰可被引入多核苷酸链的末端或多核苷酸链中的其他任何地方；通过化学合成或通过聚合酶。修饰的核酸及其合成的实例在PCT申请号PCT/US2012/058519中公开。修饰的多核苷酸的合成还描述于Verma和Eckstein,Annual Review of Biochemistry,第76卷,99-134(1998)中。
酶促或化学连接方法可用于将核苷酸或其部分与不同的功能部分缀合，所述功能部分如有靶向剂或递送剂、荧光标记、液体、纳米颗粒等。Goodchild,BioconjugateChemistry,第1(3)卷,165-187(1990)中综述了多核苷酸和修饰多核苷酸的缀合物。
非翻译区(UTR)
可通过由各种顺式作用核酸结构提供的多种机制来控制和调节包含编码多肽的开放阅读框的多核苷酸的翻译。例如，形成发夹或其他高阶(例如，假结)分子内mRNA二级结构的天然存在的顺式作用RNA元件可为多核苷酸提供翻译调控活性，其中RNA元件影响或调节多核苷酸翻译的起始，尤其是当RNA元件位于5’UTR中靠近5’帽结构的位置时(Pelletierhe和Sonenberg(1985)Cell 40(3):515-526；Kozak(1986)Proc Natl Acad Sci83:2850-2854)。
非翻译区(UTR)是多核苷酸的起始密码子(5’UTR)之前和终止密码子(3’UTR)之后未翻译的核酸区段。在一些实施方案中，本发明的包含编码肽的开放阅读框(ORF)的多核苷酸(例如，核糖核酸(RNA)，例如信使RNA(mRNA))还包含UTR(例如，5’UTR或其功能片段、3’UTR或其功能片段，或它们的组合)。
顺式作用RNA元件还可影响翻译延伸，参与许多移码事件(Namy等人,(2004)MolCell 13(2):157-168)。内部核糖体进入序列(IRES)代表另一种类型的顺式作用RNA元件，它们通常位于5’UTR中，但据报道也发现存在于天然存在的mRNA的编码区内(Holcik等人(2000)Trends Genet 16(10):469-473)。在细胞mRNA中，IRES经常与5’帽结构共存，并提供具有在帽依赖性翻译受到损害的条件下进行翻译的功能能力的mRNA(Gebauer等人,(2012)Cold Spring Harb Perspect Biol 4(7):a012245)。另一种天然存在的顺式作用RNA元件包括上游开放阅读框(uORF)。天然存在的uORF在众多mRNA的5’UTR内单数或多数地存在并影响下游主要ORF的翻译，通常是产生负面影响(酵母中的GCN4 mRNA和哺乳动物的ATF4mRNA明显除外，其中uORF用于在eIF2磷酸化增加的条件下促进下游主要ORF的翻译(Hinnebusch(2005)Annu Rev Microbiol 59:407-450))。由包含多核苷酸(例如，mRNA)的组分、结构、元件、基序和/或特定序列提供的另外的示例性翻译调控活性包括但不限于mRNA稳定或去稳定(Baker和Parker(2004)Curr Opin Cell Biol16(3):293-299)、翻译激活(Villalba等人,(2011)Curr Opin Genet Dev21(4):452-457)和翻译阻遏(Blumer等人,(2002)Mech Dev 110(1-2):97-112)。研究表明，天然存在的顺式作用RNA元件在用于通过整合到异源多核苷酸中而修饰异源多核苷酸时可赋予其各别的功能(Goldberg-Cohen等人,(2002)J Biol Chem 277(16):13635-13640)。
功能RNA元件
在一些实施方案中，本公开提供了包含修饰(例如，RNA元件)的多核苷酸，其中所述修饰提供了期望的翻译调控活性。此类修饰描述于PCT申请号PCT/US2018/033519中，所述申请以引用方式整体并入本文。
在一些实施方案中，本公开提供了包含5’非翻译区(UTR)、起始密码子、编码多肽的全开放阅读框、3’UTR和至少一种修饰的多核苷酸，其中所述至少一种修饰提供期望的翻译调控活性，例如，促进和/或增强mRNA翻译的翻译保真度的修饰。在一些实施方案中，期望的翻译调控活性是顺式作用的调控活性。在一些实施方案中，期望的翻译调控活性是43S预起始复合物(PIC)或核糖体在起始密码子处或附近的停留时间的增加。在一些实施方案中，期望的翻译调控活性是起始密码子处或来自起始密码子的多肽合成的起始的增加。在一些实施方案中，期望的翻译调控活性是从全开放阅读框翻译的多肽的量的增加。在一些实施方案中，期望的翻译调控活性是由PIC或核糖体解码的起始密码子的保真度的增加。在一些实施方案中，期望的翻译调控活性是PIC或核糖体的漏扫描的抑制或减少。在一些实施方案中，期望的翻译调控活性是PIC或核糖体解码起始密码子的速率的降低。在一些实施方案中，期望的翻译调控活性是在mRNA内除起始密码子之外的任何密码子处多肽合成的起始的抑制或减少。在一些实施方案中，期望的翻译调控活性是从mRNA内除全开放阅读框之外的任何开放阅读框翻译的多肽的量的抑制或减少。在一些实施方案中，期望的翻译调控活性是异常翻译产物的产生的抑制或减少。在一些实施方案中，期望的翻译调控活性是前述一种或多种翻译调控活性的组合。
因此，本公开提供了包含RNA元件的多核苷酸(例如mRNA)，所述RNA元件包含提供如本文所述的期望的翻译调控活性的序列和/或一个或多个RNA二级结构。在一些方面，mRNA包含RNA元件，所述RNA元件包含促进和/或增强mRNA翻译的翻译保真度的序列和/或一个或多个RNA二级结构。在一些方面，mRNA包含RNA元件，所述RNA元件包含提供期望的翻译调控活性，如抑制和/或减少漏扫描的序列和/或一个或多个RNA二级结构。在一些方面，本公开提供了包含RNA元件的mRNA，所述RNA元件包含抑制和/或减少漏扫描从而促进mRNA的翻译保真度的序列和/或一个或多个RNA二级结构。
在一些实施方案中，RNA元件包含天然和/或修饰的核苷酸。在一些实施方案中，RNA元件包含提供如本文所述的期望的翻译调控活性的连接核苷酸序列或其衍生物或类似物。在一些实施方案中，RNA元件包含形成或折叠成稳定的RNA二级结构的连接核苷酸序列或其衍生物或类似物，其中所述RNA二级结构提供如本文所述的期望的翻译调控活性。RNA元件可基于以下来鉴别和/或表征：元件的一级序列(例如，富含GC的元件)；元件形成的RNA二级结构(例如，茎环)；元件在RNA分子中的位置(例如，位于mRNA的5’UTR内)，元件的生物功能和/或活性(例如，“翻译增强子”)，以及它们的任何组合。
在一些实施方案中，本公开提供了具有一种或多种结构修饰的mRNA，所述一种或多种结构抑制漏扫描和/或促进mRNA翻译的翻译保真度，其中至少一种结构修饰是富含GC的RNA元件。在一些实施方案中，本公开提供了包含至少一种修饰的mRNA，其中所述至少一种修饰是包含连接核苷酸序列或其衍生物或类似物的富含GC的RNA元件，所述富含GC的RNA元件在mRNA的5’UTR中的Kozak共有序列之前。在一个实施方案中，富含GC的RNA元件位于mRNA的5’UTR中的Kozak共有序列上游约30、约25、约20、约15、约10、约5、约4、约3、约2或约1个核苷酸。在另一个实施方案中，富含GC的RNA元件位于Kozak共有序列上游15-30、15-20、15-25、10-15或5-10个核苷酸。在另一个实施方案中，富含GC的RNA元件紧邻mRNA的5’UTR中的Kozak共有序列。
在一些实施方案中，本公开提供了富含GC的RNA元件，所述富含GC的RNA元件包含以任何顺序连接的3-30、5-25、10-20、15-20、约20、约15、约12、约10、约7、约6或约3个核苷酸的序列、其衍生物或类似物，其中序列组成为70％-80％胞嘧啶、60％-70％胞嘧啶、50％-60％胞嘧啶、40％-50％胞嘧啶、30％-40％胞嘧啶碱基。在一些实施方案中，本公开提供了富含GC的RNA元件，所述RNA元件包含以任何顺序连接的3-30、5-25、10-20、15-20、约20、约15、约12、约10、约7、约6或约3个核苷酸的序列、其衍生物或类似物，其中序列组成为约80％胞嘧啶、约70％胞嘧啶、约60％胞嘧啶、约50％胞嘧啶、约40％胞嘧啶或约30％胞嘧啶。
在一些实施方案中，本公开提供了富含GC的RNA元件，所述RNA元件包含以任何顺序连接的20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4或3个核苷酸的序列或其衍生物或类似物，其中序列组成为70％-80％胞嘧啶、60％-70％胞嘧啶、50％-60％胞嘧啶、40％-50％胞嘧啶或30％-40％胞嘧啶。在一些实施方案中，本公开提供了富含GC的RNA元件，所述RNA元件包含以任何顺序连接的20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4或3个核苷酸的序列或其衍生物或类似物，其中序列组成为约80％胞嘧啶、约70％胞嘧啶、约60％胞嘧啶、约50％胞嘧啶、约40％胞嘧啶或约30％胞嘧啶。
在一些实施方案中，本公开提供了包含至少一种修饰的mRNA，其中所述至少一种修饰是在mRNA的5’UTR中的Kozak共有序列之前的包含连接核苷酸序列或其衍生物或类似物的富含GC的RNA元件，其中所述富含GC的RNA元件位于mRNA的5’UTR中的Kozak共有序列上游约30、约25、约20、约15、约10、约5、约4、约3、约2或约1个核苷酸，并且其中所述富含GC的RNA元件包含以任何顺序连接的3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个核苷酸的序列或其衍生物或类似物，其中序列组成为>50％胞嘧啶。在一些实施方案中，序列组成为>55％胞嘧啶、>60％胞嘧啶、>65％胞嘧啶、>70％胞嘧啶、>75％胞嘧啶、>80％胞嘧啶、>85％胞嘧啶或>90％胞嘧啶。
在一些实施方案中，本公开提供了包含至少一种修饰的mRNA，其中所述至少一种修饰是在mRNA的5’UTR中的Kozak共有序列之前的包含连接核苷酸序列或其衍生物或类似物的富含GC的RNA元件，其中所述富含GC的RNA元件位于mRNA的5’UTR中的Kozak共有序列上游约30、约25、约20、约15、约10、约5、约4、约3、约2或约1个核苷酸，并且其中所述富含GC的RNA元件包含约3-30、5-25、10-20、15-20或约20、约15、约12、约10、约6或约3个核苷酸的序列或其衍生物或类似物，其中所述序列包含重复的GC基序，其中所述重复的GC基序是[CCG]n，其中n＝1至10，n＝2至8，n＝3至6，或n＝4至5。在一些实施方案中，所述序列包含重复的GC基序[CCG]n，其中n＝1、2、3、4或5。在一些实施方案中，所述序列包含重复的GC基序[CCG]n，其中n＝1、2或3。在一些实施方案中，所述序列包含重复的GC基序[CCG]n，其中n＝1。在一些实施方案中，所述序列包含重复的GC基序[CCG]n，其中n＝2。在一些实施方案中，所述序列包含重复的GC基序[CCG]n，其中n＝3。在一些实施方案中，所述序列包含重复的GC基序[CCG]n，其中n＝4(SEQ ID NO:111)。在一些实施方案中，所述序列包含重复的GC基序[CCG]n，其中n＝5(SEQ ID NO:112)。
在一些实施方案中，富含GC的RNA元件位于mRNA的5’UTR中的Kozak共有序列上游约30、约25、约20、约15、约10、约5、约4、约3、约2或约1个核苷酸。在另一个实施方案中，富含GC的RNA元件位于Kozak共有序列上游约15-30、15-20、15-25、10-15或5-10个核苷酸。在另一个实施方案中，富含GC的RNA元件紧邻mRNA的5’UTR中的Kozak共有序列。
在一些实施方案中，本公开提供了包含至少一种修饰的修饰mRNA，其中所述至少一种修饰是在mRNA的5’UTR中的Kozak共有序列之前的包含连接核苷酸序列或其衍生物或类似物的富含GC的RNA元件，其中所述富含GC的RNA元件包含本文所提供的任何序列。在一些实施方案中，富含GC的RNA元件位于mRNA的5’UTR中的Kozak共有序列上游约30、约25、约20、约15、约10、约5、约4、约3、约2或约1个核苷酸。在一些实施方案中，富含GC的RNA元件位于Kozak共有序列上游约15-30、15-20、15-25、10-15或5-10个核苷酸。在一些实施方案中，富含GC的RNA元件紧邻mRNA的5’UTR中的Kozak共有序列。
在一些实施方案中，本公开提供了包含至少一种修饰的mRNA，其中所述至少一种修饰是包含SEQ ID NO:113所示序列或其衍生物或类似物的富含GC的RNA元件，所述富含GC的RNA元件在mRNA的5’UTR中的Kozak共有序列之前。在一些实施方案中，富含GC的元件包含紧邻mRNA的5’UTR中的Kozak共有序列且在其上游的SEQ ID NO:113所示序列。在一些实施方案中，富含GC的元件包含位于mRNA的5’UTR中的Kozak共有序列上游1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个碱基的SEQ ID NO:113所示序列。在其他实施方案中，富含GC的元件包含位于mRNA的5’UTR中的Kozak共有序列上游1-3、3-5、5-7、7-9、9-12或12-15个碱基的SEQ ID NO:113所示序列。
在一些实施方案中，本公开提供了包含至少一种修饰的mRNA，其中所述至少一种修饰是包含SEQ ID NO:114所示序列或其衍生物或类似物的富含GC的RNA元件，所述富含GC的RNA元件在mRNA的5’UTR中的Kozak共有序列之前。在一些实施方案中，富含GC的元件包含紧邻mRNA的5’UTR中的Kozak共有序列且在其上游的SEQ ID NO:114所示序列。在一些实施方案中，富含GC的元件包含位于mRNA的5’UTR中的Kozak共有序列上游1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个碱基的SEQ ID NO:114所示序列。在其他实施方案中，富含GC的元件包含位于mRNA的5’UTR中的Kozak共有序列上游1-3、3-5、5-7、7-9、9-12或12-15个碱基的SEQ ID NO:114所示序列。
在一些实施方案中，本公开提供了包含至少一种修饰的mRNA，其中所述至少一种修饰是包含SEQ ID NO:115所示序列或其衍生物或类似物的富含GC的RNA元件，所述富含GC的RNA元件在mRNA的5’UTR中的Kozak共有序列之前。在一些实施方案中，富含GC的元件包含紧邻mRNA的5’UTR中的Kozak共有序列且在其上游的SEQ ID NO:115所示序列。在一些实施方案中，富含GC的元件包含位于mRNA的5’UTR中的Kozak共有序列上游1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个碱基的SEQ ID NO:115所示序列。在其他实施方案中，富含GC的元件包含位于mRNA的5’UTR中的Kozak共有序列上游1-3、3-5、5-7、7-9、9-12或12-15个碱基的SEQ ID NO:115所示序列。
在一些实施方案中，本公开提供了包含至少一种修饰的mRNA，其中所述至少一种修饰是包含SEQ ID NO:113所示序列或其衍生物或类似物的富含GC的RNA元件，所述富含GC的RNA元件在mRNA的5’UTR中的Kozak共有序列之前，其中所述5’UTR包含SEQ ID NO:116所示的序列。
在一些实施方案中，富含GC的元件包含紧邻本文所述5’UTR中的Kozak共有序列且在其上游的SEQ ID NO:113所示序列。在一些实施方案中，富含GC的元件包含位于mRNA的5’UTR中的Kozak共有序列上游1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个碱基的SEQ ID NO:113所示序列，其中所述5’UTR包含SEQ ID NO:116所示的序列。
在其他实施方案中，富含GC的元件包含位于mRNA的5’UTR中的Kozak共有序列上游1-3、3-5、5-7、7-9、9-12或12-15个碱基的SEQ ID NO:113所示序列，其中所述5’UTR包含SEQID NO:116所示的序列。
在一些实施方案中，5’UTR包含SEQ ID NO:117所示的序列。
在一些实施方案中，5’UTR包含SEQ ID NO:118所示的序列。
在一些实施方案中，本公开提供了包含至少一种修饰的mRNA，其中所述至少一种修饰是富含GC的RNA元件，所述富含GC的RNA元件包含稳定的RNA二级结构，所述二级结构包含以形成发夹或茎环的顺序连接的核苷酸序列或其衍生物或类似物。在一个实施方案中，稳定的RNA二级结构在Kozak共有序列上游。在另一个实施方案中，稳定的RNA二级结构位于Kozak共有序列上游约30、约25、约20、约15、约10或约5个核苷酸。在另一个实施方案中，稳定的RNA二级结构位于Kozak共有序列上游约20、约15、约10或约5个核苷酸。在另一个实施方案中，稳定的RNA二级结构位于Kozak共有序列上游约5、约4、约3、约2、约1个核苷酸。在另一个实施方案中，稳定的RNA二级结构位于Kozak共有序列上游约15-30、约15-20、约15-25、约10-15或约5-10个核苷酸。在另一个实施方案中，稳定的RNA二级结构位于Kozak共有序列上游12-15个核苷酸。在另一个实施方案中，稳定的RNA二级结构具有约-30kcal/mol、约-20至-30kcal/mol、约-20kcal/mol、约-10至-20kcal/mol、约-10kcal/mol、约-5至-10kcal/mol的ΔG。
在另一个实施方案中，所述修饰可操作地连接至编码多肽的开放阅读框，并且其中所述修饰和所述开放阅读框是异源的。
在另一个实施方案中，富含GC的RNA元件的序列仅由鸟嘌呤(G)和胞嘧啶(C)核碱基组成。
提供如本文所述的期望的翻译调控活性的RNA元件可使用已知的技术如核糖体谱分析来鉴定和表征。核糖体谱分析是一种允许确定与mRNA结合的PIC和/或核糖体的位置的技术(参见例如，Ingolia等人,(2009)Science 324(5924):218-23，以引用方式并入本文)。该技术是基于通过PIC和/或核糖体保护mRNA的区域或区段免受核酸酶消化。保护导致产生30bp的RNA片段，称为“足迹”。RNA足迹的序列和频率可通过本领域已知的方法(例如，RNA-seq)来分析。足迹大致位于核糖体的A位点中央。如果PIC或核糖体位于沿mRNA的特定位置或位点，则在这些位置产生的足迹将相对常见。研究表明，在PIC和/或核糖体表现出减少的加工性的位置会产生更多的足迹，而在PIC和/或核糖体表现出增加的加工性的位置会产生较少的足迹(Gardin等人,(2014)eLife 3:e03735)。在一些实施方案中，通过核糖体谱分析确定PIC或核糖体在沿包含本文所述的任何一种或多种RNA元件的多核苷酸的离散位置或位点处的停留时间或占据时间。
UTR与多核苷酸中的编码区可以是同源或异源的。在一些实施方案中，UTR与编码多肽的ORF同源。在一些实施方案中，UTR与编码多肽的ORF异源。在一些实施方案中，多核苷酸包含两个或更多个5’UTR或其功能片段，它们各自具有相同或不同的核苷酸序列。在一些实施方案中，多核苷酸包含两个或更多个3’UTR或其功能片段，它们各自具有相同或不同的核苷酸序列。
在一些实施方案中，5’UTR或其功能片段、3’UTR或其功能片段或它们的任何组合是序列优化的。
在一些实施方案中，5'UTR或其功能片段，3'UTR或其功能片段或它们的任何组合包含至少一个化学修饰的核碱基，例如，N1-甲基假尿嘧啶或5-甲氧基尿嘧啶。
UTR可具有提供调控作用的特征，例如稳定性、定位和/或翻译效率的增加或降低。可将包含UTR的多核苷酸施用至细胞、组织或生物体，并且可使用常规方法测量一种或多种调控特征。在一些实施方案中，5’UTR或3’UTR的功能片段分别包含全长5’或3’UTR的一种或多种调控特征。
天然5’UTR携带在翻译起始中起作用的特征。它们拥有像Kozak序列的签名序列，所述Kozak序列通常已知在核糖体起始许多基因的翻译的过程中有所涉及。Kozak序列具有共有CCR(A/G)CCAUGG(SEQ ID NO:135)，其中R是起始密码子(AUG)上游三个碱基的嘌呤(腺嘌呤或鸟嘌呤)，其后是另一个“G”。还已知5’UTR形成在延伸因子结合中所涉及的二级结构。
通过工程化通常在特定靶器官的丰富表达的基因中发现的特征，可增强多核苷酸的稳定性和蛋白质产生。例如，引入肝表达的mRNA(如白蛋白、血清淀粉样蛋白A、载脂蛋白A/B/E、转铁蛋白、甲胎蛋白、促红细胞生成素或因子VIII)的5’UTR可增强肝细胞系或肝脏中多核苷酸的表达。同样，使用来自其他组织特异性mRNA的5’UTR来改进该组织中的表达对于以下各项来说是可能的：肌肉(例如，MyoD、肌球蛋白、肌红蛋白、肌细胞生成素(Myogenin)、力蛋白(Herculin))、内皮细胞(例如，Tie-1、CD36)、骨髓细胞(例如，C/EBP、AML1、G-CSF、GM-CSF、CD11b、MSR、Fr-1、i-NOS)、白细胞(例如，CD45、CD18)、脂肪组织(例如，CD36、GLUT4、ACRP30、脂联素)以及肺上皮细胞(例如，SP-A/B/C/D)。
在一些实施方案中，UTR选自其蛋白质共享共同功能、结构、特征或特性的转录物的家族。例如，所编码的多肽可属于在特定细胞、组织中或在发育期间的特定时间表达的蛋白质家族(即，共享至少一种功能、结构、特征、定位、起源或表达模式)。来自任何所述基因或mRNA的UTR可交换相同或不同蛋白质家族的任何其他UTR以便形成新的多核苷酸。
在一些实施方案中，5’UTR和3’UTR可以是异源的。在一些实施方案中，5’UTR可源自与3’UTR不同的物种。在一些实施方案中，3’UTR可源自与5’UTR不同的物种。
共同拥有的国际专利申请号PCT/US2014/021522(公布号WO/2014/164253，以引用方式整体并入本文)提供了可作为ORF的侧翼区用于本发明的多核苷酸中的示例性UTR的列表。
本申请的示例性UTR包括但不限于源自以下的核酸序列的一个或多个5’UTR和/或3’UTR：球蛋白，如α-球蛋白或β-球蛋白(例如，非洲爪蟾、小鼠、兔或人球蛋白)；强Kozak翻译起始信号；CYBA(例如，人细胞色素b-245α多肽)；白蛋白(例如，人白蛋白7)；HSD17B4(羟基类固醇(17-β)脱氢酶)；病毒(例如，烟草蚀纹病毒(TEV)、委内瑞拉马脑炎病毒(VEEV)、登革热病毒、巨细胞病毒(CMV)(例如CMV立即早期1(IE1))、肝炎病毒(例如，乙型肝炎病毒)、辛德毕斯病毒或PAV大麦黄矮病毒)；热休克蛋白(例如，hsp70)；翻译起始因子(例如，elF4G)；葡萄糖转运蛋白(例如，hGLUT1(人葡萄糖转运蛋白1))；肌动蛋白(例如，人α或β肌动蛋白)；GAPDH；微管蛋白；组蛋白；柠檬酸循环酶；拓扑异构酶(例如，缺乏5’TOP基序的TOP基因的5’UTR(寡嘧啶束))；核糖体蛋白大32(L32)；核糖体蛋白(例如，人或小鼠核糖体蛋白，例如像rps9)；ATP合酶(例如，ATP5A1或线粒体H+-ATP合酶的β亚基)；生长激素e(例如，牛(bGH)或人(hGH))；延伸因子(例如，延伸因子1α1(EEF1A1))；锰超氧化物歧化酶(MnSOD)；肌细胞增强因子2A(MEF2A)；β-F1-ATP酶、肌酸激酶、肌红蛋白、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)；胶原(例如，I型胶原、α2(Col1A2)、I型胶原、α1(Col1A1)、VI型胶原、α2(Col6A2)、VI型胶原、α1(Col6A1))；核糖体结合蛋白(例如，核糖体结合蛋白I(RPNI))；低密度脂蛋白受体相关蛋白(例如，LRP1)；心肌营养素样细胞因子(例如，Nnt1)；钙网蛋白(Calr)；原胶原-赖氨酸、2-氧代戊二酸5-双加氧酶1(Plod1)；和核连蛋白(例如，Nucb1)。
在一些实施方案中，5’UTR选自由以下组成的组：β球蛋白5’UTR；含有强Kozak翻译起始信号的5’UTR；细胞色素b-245α多肽(CYBA)5’UTR；羟基类固醇(17-β)脱氢酶(HSD17B4)5’UTR；烟草蚀纹病毒(TEV)5’UTR；委内瑞拉马脑炎病毒(TEEV)5’UTR；编码非结构蛋白的风疹病毒(RV)RNA的5’近端开放阅读框；登革热病毒(DEN)5’UTR；热休克蛋白70(Hsp70)5’UTR；eIF4G 5’UTR；GLUT1 5’UTR；其功能片段以及它们的任何组合。
在一些实施方案中，3’UTR选自由以下组成的组：β球蛋白3’UTR；CYBA 3’UTR；白蛋白3’UTR；生长激素(GH)3’UTR；VEEV 3’UTR；乙型肝炎病毒(HBV)3’UTR；α-球蛋白3’UTR；DEN3’UTR；PAV大麦黄矮病毒(BYDV-PAV)3’UTR；延伸因子1α1(EEF1A1)3’UTR；锰超氧化物歧化酶(MnSOD)3’UTR；线粒体H(+)-ATP合酶(β-mRNA)3’UTR的β亚基；GLUT1 3’UTR；MEF2A 3’UTR；β-F1-ATP酶3’UTR；其功能片段以及它们的组合。
可将源自任何基因或mRNA的野生型UTR并入本发明的多核苷酸中。在一些实施方案中，可相对于野生型或天然UTR改变UTR以产生变体UTR，例如，通过改变所述UTR相对于ORF的取向或位置；或通过包含额外的核苷酸、核苷酸的缺失、核苷酸的交换或转位。在一些实施方案中，可利用5’UTR或3’UTR的变体，例如野生型UTR的突变体，或其中将一个或多个核苷酸添加至UTR的末端或从UTR的末端移除的变体。
另外，可将一种或多种合成UTR与一种或多种非合成UTR组合使用。参见，例如，Mandal和Rossi,Nat.Protoc.2013 8(3):568-82，其内容以引用方式整体并入本文。
UTR或其部分可置于与它们所选自的转录物中相同的取向或可在取向或位置上有所改变。因此，5’UTR和/或3’UTR可反转、缩短、延长、与一个或多个其他5’UTR或3’UTR组合。
在一些实施方案中，多核苷酸包含多个UTR，例如双重、三重或四重5’UTR或3’UTR。例如，双重UTR包含同一UTR的串联或基本上串联的两个拷贝。例如，可使用双β球蛋白3’UTR(参见US2010/0129877，其内容以引用方式整体并入本文)。
在某些实施方案中，本发明的多核苷酸包含选自本文所公开的任何UTR的5’UTR和/或3’UTR。在一些实施方案中，5’UTR包含：
5’UTR-001(上游UTR)(GGGAAAUAAGAGAGAAAAGAAGAGUAAGAAGAAAUAUAAGAGCCACC)(SEQ ID NO.:76)；
5’UTR-002(上游UTR)(GGGAGAUCAGAGAGAAAAGAAGAGUAAGAAGAAAUAUAAGAGCCACC)(SEQ ID NO.:136)；
5’UTR-003(上游UTR)(参见WO2016/100812)；
5’UTR-004(上游UTR)(GGGAGACAAGCUUGGCAUUCCGGUACUGUUGGUAAAGCCACC)(SEQ IDNO.:137)；
5’UTR-006(上游UTR)(参见WO2016/100812)；
5’UTR-008(上游UTR)(GGGAAUUAACAGAGAAAAGAAGAGUAAGAAGAAAUAUAAGAGCCACC)(SEQ ID NO.:138)；
5’UTR-009(上游UTR)(GGGAAAUUAGACAGAAAAGAAGAGUAAGAAGAAAUAUAAGAGCCACC)(SEQ ID NO.:139)；
5’UTR-010，上游(GGGAAAUAAGAGAGUAAAGAACAGUAAGAAGAAAUAUAAGAGCCACC)(SEQID NO.:140)；
5’UTR-011(上游UTR)(GGGAAAAAAGAGAGAAAAGAAGACUAAGAAGAAAUAUAAGAGCCACC)(SEQ ID NO.:141)；
5’UTR-012(上游UTR)(GGGAAAUAAGAGAGAAAAGAAGAGUAAGAAGAUAUAUAAGAGCCACC)(SEQ ID NO.:142)；
5’UTR-013(上游UTR)(GGGAAAUAAGAGACAAAACAAGAGUAAGAAGAAAUAUAAGAGCCACC)(SEQ ID NO.:143)；
5’UTR-014(上游UTR)(GGGAAAUUAGAGAGUAAAGAACAGUAAGUAGAAUUAAAAGAGCCACC)(SEQ ID NO.:144)；
5’UTR-015(上游UTR)(GGGAAAUAAGAGAGAAUAGAAGAGUAAGAAGAAAUAUAAGAGCCACC)(SEQ ID NO.:145)；
5’UTR-016(上游UTR)(GGGAAAUAAGAGAGAAAAGAAGAGUAAGAAGAAAAUUAAGAGCCACC)(SEQ ID NO.:146)；
5’UTR-017(上游UTR)；或(GGGAAAUAAGAGAGAAAAGAAGAGUAAGAAGAAAUUUAAGAGCCACC)(SEQ ID NO.:147)；
5’UTR-018(上游UTR)5’UTR
(UCAAGCUUUUGGACCCUCGUACAGAAGCUAAUACGACUCACUAUAGGGAAAUAAGAGAGAAAAGAAGAGUAAGAAGAAAUAUAAGAGCCACC)(SEQ ID NO.:75)。
在某些实施方案中，本发明的5’UTR和/或3’UTR序列包含与选自由包含SEQ IDNO:75-76、116-118、132-134或136-147中任一个的5’UTR序列组成的组的序列和/或包含SEQ ID NO:4、77-78或121中任一个的3’UTR序列或它们的任何组合至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的核苷酸序列。
在某些实施方案中，本发明的5’UTR和/或3’UTR序列包含与选自由包含SEQ IDNO:75、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:116、SEQ ID NO:117、SEQ ID NO:118、SEQ ID NO:132或SEQ ID NO:134中任一个的5’UTR序列组成的组的序列和/或包含SEQ ID NO:77、SEQ IDNO:78或SEQ ID NO:121中任一个的3’UTR序列或它们的任何组合至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的核苷酸序列。
在一些实施方案中，5’UTR包含SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:116、SEQID NO:117、SEQ ID NO:118、SEQ ID NO:132或SEQ ID NO:134所示的核苷酸序列。在一些实施方案中，3’UTR包含SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:78或SEQ ID NO:121所示的核苷酸序列。在一些实施方案中，5’UTR包含SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:116、SEQ ID NO:117、SEQ ID NO:118、SEQ ID NO:132或SEQ ID NO:134所示的核苷酸序列，并且3’UTR包含SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:78或SEQ ID NO:121所示的核苷酸序列。
本发明的多核苷酸可包含特征的组合。例如，ORF的侧翼可以为包含强Kozak翻译起始信号的5’UTR和/或包含用于模板化添加聚A尾的oligo(dT)序列的3’UTR。5’UTR可包含来自相同和/或不同UTR的第一多核苷酸片段和第二多核苷酸片段(参见例如US2010/0293625，其以引用方式整体并入本文)。
其他非UTR序列可用作本发明的多核苷酸内的区或亚区。例如，内含子或内含子序列的部分可并入本发明的多核苷酸中。并入内含子序列可增加蛋白质产生以及多核苷酸表达水平。在一些实施方案中，本发明的多核苷酸代替UTR或除UTR之外还包含内部核糖体进入位点(IRES)(参见例如Yakubov等人,Biochem.Biophys.Res.Commun.2010 394(1):189-193，其内容以引用方式整体并入本文)。在一些实施方案中，多核苷酸包含IRES而不是5’UTR序列。在一些实施方案中，多核苷酸包含ORF和病毒衣壳序列。在一些实施方案中，多核苷酸包含合成5’UTR与非合成3’UTR的组合。
在一些实施方案中，UTR还可包括至少一种翻译增强子多核苷酸、翻译增强子元件或翻译增强子元件(统称为“TEE”，其是指增加由多核苷酸产生的多肽或蛋白质的量的多核苷酸序列)。作为非限制性实例，TEE可位于转录启动子与起始密码子之间。在一些实施方案中，5’UTR包含TEE。
在一方面，TEE是UTR中的保守元件，其可促进核酸的翻译活性，如但不限于帽依赖性或帽非依赖性翻译。
微RNA(miRNA)结合位点
本公开的mRNA可包括调控元件，例如，微RNA(miRNA)结合位点、转录因子结合位点、结构化mRNA序列和/或基序、经工程化以充当内源核酸结合分子的假受体的人工结合位点，以及它们的组合。在一些实施方案中，包括此类调控元件的mRNA被称为包括“感应序列(sensor sequence)”。感应序列的非限制性实例描述于美国公布2014/0200261中，其内容以引用方式整体并入本文。
在一些实施方案中，本公开的mRNA包含编码目标多肽的开放阅读框(ORF)，并且还包含一个或多个miRNA结合位点。基于天然存在的miRNA的组织特异性和/或细胞类型特异性表达，包含或并入一个或多个miRNA结合位点可调控本公开的多核苷酸，进而调控由其编码的多肽。
miRNA，例如，天然存在的miRNA，是19-25个核苷酸长的非编码RNA，其结合至mRNA并通过降低多核苷酸的稳定性或通过抑制多核苷酸的翻译来下调基因表达。miRNA序列包含“种子”区域，即成熟miRNA的2-8位区域中的序列。miRNA种子可包含成熟miRNA的2-8或2-7位。在一些实施方案中，miRNA种子可包含7个核苷酸(例如，成熟miRNA的核苷酸2-8)，其中相应miRNA结合位点中的种子互补位点侧翼为与miRNA位置1相对的腺苷(A)。在一些实施方案中，miRNA种子可包含6个核苷酸(例如，成熟miRNA的核苷酸2-7)，其中相应miRNA结合位点中的种子互补位点侧翼为miRNA位置1相对的腺苷(A)。参见，例如，Grimson A,Farh KK,Johnston WK,Garrett-Engele P,Lim LP,Bartel DP；Mol Cell.2007年7月6日；27(1):91-105。可以进行靶细胞或组织的miRNA谱分析以确定细胞或组织中miRNA的存在或不存在。在一些实施方案中，本公开的mRNA包含一个或多个微RNA结合位点、微RNA靶序列、微RNA互补序列或微RNA种子互补序列。此类序列可对应于任何已知的微RNA(如美国公布US2005/0261218和美国公布US2005/0059005中教导的那些，其各自的内容以引用方式整体并入本文)，例如与之具有互补性。
如本文所用，术语“微RNA(miRNA或miR)结合位点”是指mRNA内的序列，包括5’UTR和/或3’UTR中的序列，其与miRNA的全部或一个区域具有足够的互补性以与miRNA相互作用、缔合或结合。在一些实施方案中，本公开的mRNA包含编码目标多肽的ORF，并且还包含一个或多个miRNA结合位点。在示例性实施方案中，mRNA的5’UTR和/或3’UTR包含一个或多个miRNA结合位点。
与miRNA具有足够互补性的miRNA结合位点是指足以促进miRNA介导的mRNA调节(例如，miRNA介导的mRNA翻译阻遏或降解)的互补程度。在本公开的示例性方面，与miRNA具有足够互补性的miRNA结合位点是指足以促进miRNA介导的mRNA降解的互补程度，例如，miRNA指导的RNA诱导沉默复合物(RISC)介导的mRNA切割。miRNA结合位点可以与例如19-25个核苷酸的miRNA序列、19-23个核苷酸的miRNA序列或22个核苷酸的miRNA序列具有互补性。miRNA结合位点可以仅与miRNA的一部分互补，例如与少于天然存在的miRNA序列全长的1、2、3或4个核苷酸的部分互补。当期望的调节是mRNA降解时，优选的是完全或完整互补性(例如，天然存在的miRNA的长度上全部或显著部分的完全互补性或完整互补性)。
在一些实施方案中，miRNA结合位点包括与miRNA种子序列具有互补性(例如，部分或完整互补性)的序列。在一些实施方案中，miRNA结合位点包括与miRNA种子序列具有完整互补性的序列。在一些实施方案中，miRNA结合位点包括与miRNA序列具有互补性(例如，部分或完整互补性)的序列。在一些实施方案中，miRNA结合位点包括与miRNA序列具有完整互补性的序列。在一些实施方案中，miRNA结合位点与miRNA序列具有完整互补性，但是对于1、2或3个核苷酸取代、末端添加和/或截短没有。
在一些实施方案中，miRNA结合位点与相应的miRNA的长度相同。在其他实施方案中，miRNA结合位点在5’末端、3’末端或两者比相应miRNA短一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、十一个或十二个核苷酸。在其他实施方案中，微RNA结合位点在5’末端、3’末端或在两者比相应的微RNA短两个核苷酸。比相应的miRNA短的miRNA结合位点仍然能够使并入一个或多个miRNA结合位点的mRNA降解或阻止mRNA翻译。
在一些实施方案中，miRNA结合位点结合相应的成熟miRNA，所述成熟miRNA是含有Dicer的活性RISC的部分。在另一个实施方案中，miRNA结合位点与RISC中相应的miRNA的结合使含有miRNA结合位点的mRNA降解或阻止mRNA被翻译。在一些实施方案中，miRNA结合位点与miRNA具有足够的互补性，使得包含miRNA的RISC复合物切割包含miRNA结合位点的多核苷酸。在其他实施方案中，miRNA结合位点具有不完全的互补性，使得包含miRNA的RISC复合物诱导包含miRNA结合位点的多核苷酸的不稳定性。在另一个实施方案中，miRNA结合位点具有不完全的互补性，使得包含miRNA的RISC复合物阻遏包含miRNA结合位点的多核苷酸的转录。
在一些实施方案中，miRNA结合位点与相应miRNA具有一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、十一个或十二个错配。
在一些实施方案中，miRNA结合位点具有分别与相应miRNA的至少约十个、至少约十一个、至少约十二个、至少约十三个、至少约十四个、至少约十五个、至少约十六个、至少约十七个、至少约十八个、至少约十九个、至少约二十个或至少约二十一个连续核苷酸互补的至少约十个、至少约十一个、至少约十二个、至少约十三个、至少约十四个、至少约十五个、至少约十六个、至少约十七个、至少约十八个、至少约十九个、至少约二十个或至少约二十一个连续核苷酸。
通过将一个或多个miRNA结合位点工程设计到本公开的mRNA中，所述mRNA可被靶向于降解或降低翻译，条件是所述的miRNA是可得的。这可减少mRNA递送时的脱靶效应。例如，如果本公开的mRNA不打算递送至某组织或细胞但最终到达那里，则如果一个或多个miRNA结合位点工程化到mRNA的5’UTR和/或3’UTR中，组织或细胞中丰富的miRNA可以抑制目的基因的表达。
相反，miRNA结合位点可以从它们天然存在于其中的mRNA序列中除去，以增加特定组织中的蛋白质表达。例如，可以从mRNA中除去特定miRNA的结合位点，以改善含有该miRNA的组织或细胞中的蛋白质表达。
在一个实施方案中，本公开的mRNA可包括5’UTR和/或3’UTR中的至少一个miRNA结合位点，以将细胞毒性或细胞保护性mRNA治疗剂导向特定细胞，例如但不限于正常和/或癌性细胞。在另一个实施方案中，本公开的多核苷酸可包括5’UTR和/或3’UTR中的两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个miRNA结合位点，以将细胞毒性或细胞保护性mRNA治疗剂导向特定细胞，例如但不限于正常和/或癌性细胞。
可通过引入或除去一个或多个miRNA结合位点，例如一个或多个不同的miRNA结合位点，来实现多种组织中表达的调节。是否除去或插入miRNA结合位点的决定可以基于miRNA表达模式和/或其在发育和/或疾病中的组织和/或细胞中的分布来做出。已经报道了miRNA、miRNA结合位点及其表达模式和在生物学中的作用的鉴定(例如，Bonauer等人,CurrDrug Targets 2010 11:943-949；Anand和Cheresh Curr Opin Hematol 2011 18:171-176；Contreras和Rao Leuke mia 2012 26:404-413(2011年12月20日.doi:10.1038/leu.2011.356)；Bartel Cell 2009 136:215-233；Landgraf等人,Cell,2007 129:1401-1414；Gentner和Naldini,Tissue Antigens.2012 80:393-403及其中的所有参考文献；所述文献各自以引用方式整体并入本文)。
miRNA和miRNA结合位点可对应于任何已知序列，包括美国公布号2014/0200261、2005/0261218和2005/0059005中描述的非限制性实例，所述公布各自以引用方式整体并入本文。
已知miRNA调节mRNA从而调节蛋白质表达的组织的实例包括但不限于肝脏(miR-122)、肌肉(miR-133、miR-206、miR-208)、内皮细胞(miR-17-92、miR-126)、骨髓细胞(miR-142-3p、miR-142-5p、miR-16、miR-21、miR-223、miR-24、miR-27)、脂肪组织(let-7、miR-30c)、心脏(miR-1d、miR-149)、肾脏(miR-192、miR-194、miR-204)和肺上皮细胞(let-7、miR-133、miR-126)。
具体地，已知miRNA在免疫细胞(也称为造血细胞)，如抗原呈递细胞(APC)(例如、树突状细胞和巨噬细胞)、巨噬细胞、单核细胞、B淋巴细胞、T淋巴细胞、粒细胞、自然杀伤细胞等中差异表达。免疫细胞特异性miRNA参与免疫原性、自身免疫、对感染的免疫应答、炎症以及基因疗法和组织/器官移植后的有害免疫应答。免疫细胞特异性miRNA还调节造血细胞(免疫细胞)的发育、增殖、分化和凋亡的许多方面。例如，miR-142和miR-146仅在免疫细胞中表达，在髓系树突状细胞中尤其丰富。已经证明，通过向多核苷酸的3’UTR添加miR-142结合位点，可以切断对多核苷酸的免疫应答，使组织和细胞中的基因转移更加稳定。miR-142有效降解抗原呈递细胞中的外源多核苷酸并阻抑转导细胞的细胞毒性消除(例如，AnnoniA等人,blood,2009,114,5152-5161；Brown BD,等人,Nat med.2006,12(5),585-591；BrownBD,等人,blood,2007,110(13):4144-4152，所述文献各自以引用方式整体并入本文)。
抗原介导的免疫应答可指由外来抗原触发的免疫应答，外来抗原在进入生物体时被抗原呈递细胞加工并展示在抗原呈递细胞的表面上。T细胞可识别呈递的抗原，并诱导表达该抗原的细胞的细胞毒性消除。
将miR-142结合位点引入本公开的mRNA的5’UTR和/或3’UTR可通过miR-142介导的降解选择性地阻抑抗原呈递细胞中的基因表达，限制抗原呈递细胞(例如，树突状细胞)中的抗原呈递，并由此阻止mRNA递送后抗原介导的免疫应答。然后，mRNA在靶组织或细胞中稳定表达，而不触发细胞毒性消除。
在一个实施方案中，可将已知在免疫细胞，特别是抗原呈递细胞中表达的miRNA的结合位点工程化到本公开的mRNA中，以通过miRNA介导的RNA降解抑制抗原呈递细胞中多核苷酸的表达，减轻抗原介导的免疫应答。在不表达免疫细胞特异性miRNA的非免疫细胞中维持mRNA的表达。例如，在一些实施方案中，为了阻止针对肝脏特异性蛋白的免疫原性反应，可除去任何miR-122结合位点并且可将miR-142(和/或mirR-146)结合位点工程化到本公开的mRNA的5’UTR和/或3’UTR中。
为了进一步驱动APC和巨噬细胞中的选择性降解和阻抑，本公开的mRNA可在5’UTR和/或3’UTR中包含单独的或与miR-142和/或miR-146结合位点结合的另外的负调控元件。作为非限制性实例，另外的负调控元件是组成型衰变元件(CDE)。
免疫特异性miRNA包括但不限于hsa-let-7a-2-3p、hsa-let-7a-3p、hsa-7a-5p、hsa-let-7c、hsa-let-7e-3p、hsa-let-7e-5p、hsa-let-7g-3p、hsa-let-7g-5p、hsa-let-7i-3p、hsa-let-7i-5p、miR-10a-3p、miR-10a-5p、miR-1184、hsa-let-7f-1--3p、hsa-let-7f-2--5p、hsa-let-7f-5p、miR-125b-1-3p、miR-125b-2-3p、miR-125b-5p、miR-1279、miR-130a-3p、miR-130a-5p、miR-132-3p、miR-132-5p、miR-142-3p、miR-142-5p、miR-143-3p、miR-143-5p、miR-146a-3p、miR-146a-5p、miR-146b-3p、miR-146b-5p、miR-147a、miR-147b、miR-148a-5p、miR-148a-3p、miR-150-3p、miR-150-5p、miR-151b、miR-155-3p、miR-155-5p、miR-15a-3p、miR-15a-5p、miR-15b-5p、miR-15b-3p、miR-16-1-3p、miR-16-2-3p、miR-16-5p、miR-17-5p、miR-181a-3p、miR-181a-5p、miR-181a-2-3p、miR-182-3p、miR-182-5p、miR-197-3p、miR-197-5p、miR-21-5p、miR-21-3p、miR-214-3p、miR-214-5p、miR-223-3p、miR-223-5p、miR-221-3p、miR-221-5p、miR-23b-3p、miR-23b-5p、miR-24-1-5p,miR-24-2-5p、miR-24-3p、miR-26a-1-3p、miR-26a-2-3p、miR-26a-5p、miR-26b-3p、miR-26b-5p、miR-27a-3p、miR-27a-5p、miR-27b-3p,miR-27b-5p、miR-28-3p、miR-28-5p、miR-2909、miR-29a-3p、miR-29a-5p、miR-29b-1-5p、miR-29b-2-5p、miR-29c-3p、miR-29c-5p,、miR-30e-3p、miR-30e-5p、miR-331-5p、miR-339-3p、miR-339-5p、miR-345-3p、miR-345-5p、miR-346、miR-34a-3p、miR-34a-5p、、miR-363-3p、miR-363-5p、miR-372、miR-377-3p、miR-377-5p、miR-493-3p、miR-493-5p、miR-542、miR-548b-5p、miR548c-5p、miR-548i、miR-548j、miR-548n、miR-574-3p、miR-598、miR-718、miR-935、miR-99a-3p、miR-99a-5p、miR-99b-3p和miR-99b-5p。此外，可通过微阵列杂交和显微切片机分析在免疫细胞中鉴定新的miRNA(例如，JimaDD等人,Blood,2010,116:e118-e127；Vaz C等人,BMC Genomics,2010,11,288，其各自的内容以引用方式整体并入本文)。
在一些实施方案中，本公开的mRNA包含miRNA结合位点，其中所述miRNA结合位点包含一个或多个选自72-74和82-83的核苷酸序列，包括任何一个或多个miRNA结合位点序列的一个或多个拷贝。在一些实施方案中，本公开的mRNA还包含至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个选自SEQ ID NO:72-74和82-83的相同或不同的miRNA结合位点，包括它们的任何组合。
在一些实施方案中，本公开的mRNA包含至少一个miR-122结合位点、至少两个miR-122结合位点、至少三个miR-122结合位点、至少四个miR-122结合位点或至少五个miR-122个结合位点。在一方面，miRNA结合位点结合miR-122或与miR-122互补。在另一方面，miRNA结合位点结合至miR-122-3p或miR-122-5p。在一个特定方面，miRNA结合位点包含与SEQ IDNO:74至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％相同的核苷酸序列，其中所述miRNA结合位点结合至miR-122。在另一个特定方面，miRNA结合位点包含与SEQ ID NO:83至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％相同的核苷酸序列，其中所述miRNA结合位点结合至miR-122。
在一些实施方案中，miRNA结合位点插入本公开的mRNA中在多核苷酸的任何位置(例如，5’UTR和/或3’UTR)。在一些实施方案中，5’UTR包含miRNA结合位点。在一些实施方案中，3’UTR包含miRNA结合位点。在一些实施方案中，5’UTR和3’UTR包含miRNA结合位点。mRNA中的插入位点可以是mRNA中的任何位置，只要mRNA中miRNA结合位点的插入在不存在相应miRNA的情况下不干扰功能多肽的翻译；并且在miRNA存在下，miRNA结合位点在mRNA中的插入以及miRNA结合位点与相应miRNA的结合能够降解mRNA或阻止mRNA的翻译。
在一些实施方案中，将miRNA结合位点插入包含ORF的本公开mRNA中ORF的终止密码子下游的至少约30个核苷酸中。在一些实施方案中，将miRNA结合位点插入本公开mRNA中ORF的终止密码子下游的至少约10个核苷酸、至少约15个核苷酸、至少约20个核苷酸、至少约25个核苷酸、至少约30个核苷酸、至少约35个核苷酸、至少约40个核苷酸、至少约45个核苷酸、至少约50个核苷酸、至少约55个核苷酸、至少约60个核苷酸、至少约65个核苷酸、至少约70个核苷酸、至少约75个核苷酸、至少约80个核苷酸、至少约85个核苷酸、至少约90个核苷酸、至少约95个核苷酸或至少约100个核苷酸中。在一些实施方案中，将miRNA结合位点插入本公开mRNA中ORF的终止密码子下游的约10个核苷酸至约100个核苷酸、约20个核苷酸至约90个核苷酸、约30个核苷酸至约80个核苷酸、约40个核苷酸至约70个核苷酸、约50个核苷酸至约60个核苷酸、约45个核苷酸至约65个核苷酸中。
miRNA基因调控可受miRNA周围序列的影响，例如但不限于周围序列的种类，序列的类型(例如，异源、同源、外源、内源或人工)，周围序列中的调控元件和/或周围序列中的结构元件。miRNA可受5’UTR和/或3’UTR的影响。作为非限制性实例，与相同序列类型的人3’UTR相比，非人3’UTR可以增加miRNA序列对目标多肽表达的调控效应。
在一个实施方案中，5’UTR的其他调控元件和/或结构元件可影响miRNA介导的基因调控。调控元件和/或结构元件的一个实例是5’UTR中的结构化IRES(内部核糖体进入位点)，其对于结合翻译延伸因子以启动蛋白质翻译是必需的。EIF4A2与5’UTR中该二级结构化元件的结合对于miRNA介导的基因表达是必需的(Meijer HA等人,Science,2013,340,82-85，以引用方式整体并入本文)。本公开的mRNA还可包括该结构化的5’UTR，以增强微RNA介导的基因调控。
可将至少一个miRNA结合位点工程化到本公开的mRNA的3’UTR中。在这种情况下，可将至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个、至少十个或更多个miRNA结合位点工程化到本公开的mRNA的3’UTR中。例如，可将1至10个、1至9个、1至8个、1至7个、1至6个、1至5个、1至4个、1至3个、2个或1个miRNA结合位点工程化到本公开的mRNA的3’UTR中。在一个实施方案中，并入本公开的mRNA中的miRNA结合位点可以是相同的或可以是不同的miRNA位点。并入本公开的mRNA中的不同miRNA结合位点的组合可包括其中并入任何不同miRNA位点的多于一个拷贝的组合。在另一个实施方案中，并入本公开的mRNA中的miRNA结合位点可靶向身体内相同或不同的组织。作为非限制性实例，通过在本公开的mRNA的3’UTR中引入组织特异性、细胞类型特异性或疾病特异性miRNA结合位点，可以降低在特定细胞类型(例如，肝细胞、骨髓细胞、内皮细胞、癌细胞等)中的表达程度。
在一个实施方案中，miRNA结合位点可在本公开的mRNA中3’UTR的5’末端附近、3’UTR的5’末端和3’末端之间的大约半途和/或3’UTR的3’末端附近工程化。作为非限制性实例，miRNA结合位点可在3’UTR的5’末端附近和在3’UTR的5’末端和3’末端之间的大约半途处工程化。作为另一个非限制性实例，miRNA结合位点可在3’UTR的3’末端附近和在3’UTR的5’末端和3’末端之间的大约半途处工程化。作为另一个非限制性实例，miRNA结合位点可在3’UTR的5’末端附近和3’UTR的3’末端附近工程化。
在另一个实施方案中，3’UTR可包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个miRNA结合位点。miRNA结合位点可以与miRNA、miRNA种子序列和/或种子序列侧翼的miRNA序列互补。
基于不同组织、细胞类型或生物条件中miRNA的表达模式，本公开的mRNA可以工程化为在特定组织、细胞类型或生物条件中更靶向地表达。通过引入组织特异性miRNA结合位点，本公开的mRNA可以被设计用于在组织或细胞中或在生物学条件的背景中的最佳蛋白质表达。
在一些实施方案中，本公开的mRNA可包含至少一种miRNA以抑制编码的多肽在目标组织或细胞中的表达。作为非限制性实例，本公开的mRNA可包括至少一个miR-122结合位点，以抑制编码目标多肽在肝脏中的表达。作为另一个非限制性实例，本公开的mRNA可包括至少一个miR-142-3p结合位点，miR-142-3p种子序列，不含种子的miR-142-3p结合位点，miR-142-5p结合位点，miR-142-5p种子序列，没有种子的miR-142-5p结合位点，miR-146结合位点，miR-146种子序列和/或没有种子序列的miR-146结合位点。
在一些实施方案中，本公开的mRNA可包含3’UTR中的至少一个miRNA结合位点，以选择性降解免疫细胞中的mRNA治疗剂从而克制由治疗性递送引起的不想要的免疫原性应答。作为非限制性实例，miRNA结合位点可使本公开的mRNA在抗原呈递细胞中更不稳定。这些miRNA的非限制性实例包括mir-142-5p、mir-142-3p、mir-146a-5p和mir-146-3p。
在一个实施方案中，本公开的mRNA在mRNA的区域中包含至少一个可与RNA结合蛋白相互作用的miRNA序列。
在一些实施方案中，本公开的mRNA(例如，RNA，例如mRNA)包含(i)序列优化的核苷酸序列(例如，ORF)，和(ii)miRNA结合位点(例如，结合至miR-142的miRNA结合位点)。
在一些实施方案中，本公开的mRNA包含编码本文所公开的多肽的尿嘧啶修饰序列和本文所公开的miRNA结合位点，例如，结合至miR-142的miRNA结合位点。在一些实施方案中，编码多肽的尿嘧啶修饰序列包含包含至少一个化学修饰的核碱基，例如5-甲氧基尿嘧啶。在一些实施方案中，编码本公开的多肽的尿嘧啶修饰序列中至少95％的核碱基类型(例如，尿嘧啶)是修饰的核碱基。在一些实施方案中，编码多肽的尿嘧啶修饰序列中至少95％的尿嘧啶是5-甲氧基尿苷。在一些实施方案中，包含编码本文所公开的多肽的核苷酸序列和miRNA结合位点的mRNA用递送剂(例如，具有式(I)的化合物，例如化合物X)配制。
脂质纳米颗粒
本公开提供具有有利特性的药物组合物。本文所述的脂质组合物可有利地用于脂质纳米颗粒组合物中，以将治疗剂和/或预防剂(例如，mRNA)递送至哺乳动物细胞或器官。例如，本文所述的脂质具有很少免疫原性或没有免疫原性。例如，与参考脂质(例如，MC3、KC2或DLinDMA)相比，本文所公开的脂质化合物具有较低的免疫原性。例如，包含本文所公开的脂质和治疗剂或预防剂(例如，mRNA)的配制物与包含参考脂质(例如，MC3、KC2或DLinDMA)和相同治疗剂或预防剂的相应制剂相比具有增加的治疗指数。
在某些实施方案中，本发明提供了药物组合物，所述药物组合物包含：
(a)包含编码多肽的核苷酸序列的mRNA；和
(b)递送剂。
在某些实施方案中，本发明提供了药物组合物，所述药物组合物包含：
(i)编码人OX40L多肽的mRNA和编码可操作地连接至包含跨膜结构域的膜结构域的人IL-12多肽的mRNA；
(ii)编码人OX40L多肽的mRNA、编码人IL-15多肽的mRNA和编码人IL-15Rα多肽的mRNA；
(iii)编码人OX40L多肽的mRNA和编码可操作性地连接至人IL-15Rα多肽的人IL-15多肽的mRNA；
(iv)编码可操作地连接至包含跨膜结构域的膜结构域的人IL-12多肽的mRNA、编码人IL-15多肽的mRNA和编码人IL-15Rα多肽的mRNA；
(v)编码可操作地连接至包含跨膜结构域的膜结构域的人IL-12多肽的mRNA和编码可操作地连接至人IL-15Rα多肽的人IL-15多肽的mRNA；
(vi)编码人OX40L多肽的mRNA、编码人IL-12多肽的mRNA、编码人IL-15多肽的mRNA和编码人IL-15Rα多肽的mRNA；或
(vii)编码人OX40L多肽的mRNA、编码可操作地连接至包含跨膜结构域的膜结构域的人IL-12多肽的mRNA和编码可操作地连接至人IL-15Rα多肽的人IL-15多肽的mRNA，
以及递送剂。
在一些实施方案中，本发明提供了药物组合物，所述药物组合物包含：
(i)第一递送剂和编码人OX40L多肽的mRNA；
(ii)第二递送剂和编码人IL-15多肽的mRNA；
(iii)第三递送剂和编码人IL-15Rα多肽的mRNA；以及
(iv)第四递送剂和编码可操作地连接至包含跨膜结构域的膜结构域的人IL-12多肽的mRNA。
在一些实施方案中，本发明提供了药物组合物，所述药物组合物包含：
(i)第一递送剂和编码人OX40L多肽的mRNA；
(ii)第二递送剂和编码可操作性地连接至人IL-15Rα多肽的人IL-15多肽的mRNA；以及
(iii)第三递送剂和编码可操作地连接至包含跨膜结构域的膜结构域的人IL-12多肽的mRNA。
LNP的脂质含量
在一些实施方案中，LNP包含(i)可电离脂质；(ii)固醇或其他结构脂质；(iii)非阳离子辅助脂质或磷脂；(iv)PEG脂质。这些类别的脂质在下面更详细地阐述。
(i)可电离脂质
本公开的脂质纳米颗粒包括一种或多种可电离脂质。在某些实施方案中，本公开的可电离脂质包含中心胺部分和至少一个可生物降解的基团。本文所述的可电离脂质可有利地用于本公开的脂质纳米颗粒中，用于将核酸分子递送至哺乳动物细胞或器官。下述可电离脂质的结构包括前缀I，以将它们与本发明的其他脂质区分开。
在本发明的第一方面，本文所述的化合物为式(II)：
Figure BDA0003064795710001101
或其N-氧化物，或其盐或异构体，其中：
R1选自由以下组成的组：C5-30烷基、C5-20烯基、-R*YR”、-YR”和-R”M’R’；
R2和R3独立地选自由以下组成的组：H、C1-14烷基、C2-14烯基、-R*YR”、-YR”和-R*OR”，或者R2和R3与它们所连接的原子一起形成杂环或碳环；
R4选自由以下组成的组：氢、C3-6碳环、-(CH2)nQ、-(CH2)nCHQR、-(CH2)oC(R10)2(CH2)n-oQ、-CHQR、-CQ(R)2和未取代的C1-6烷基，其中Q选自碳环、杂环、-OR、-O(CH2)nN(R)2、-C(O)OR、-OC(O)R、-CX3、-CX2H、-CXH2、-CN、-N(R)2、-C(O)N(R)2、-N(R)C(O)R、-N(R)S(O)2R、-N(R)C(O)N(R)2、-N(R)C(S)N(R)2、-N(R)R8、-N(R)S(O)2R8、-O(CH2)nOR、-N(R)C(＝NR9)N(R)2、-N(R)C(＝CHR9)N(R)2、-OC(O)N(R)2、-N(R)C(O)OR、-N(OR)C(O)R、-N(OR)S(O)2R、-N(OR)C(O)OR、-N(OR)C(O)N(R)2、-N(OR)C(S)N(R)2、-N(OR)C(＝NR9)N(R)2、-N(OR)C(＝CHR9)N(R)2、-C(＝NR9)N(R)2、-C(＝NR9)R、-C(O)N(R)OR和–C(R)N(R)2C(O)OR，每个o独立地选自1、2、3和4，并且每个n独立地选自1、2、3、4和5；
每个R5独立地选自由以下组成的组：OH、C1-3烷基、C2-3烯基和H；
每个R6独立地选自由以下组成的组：OH、C1-3烷基、C2-3烯基和H；
M和M’独立地选自-C(O)O-、-OC(O)-、-OC(O)-M”-C(O)O-、-C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(S)S-、-SC(S)-、-CH(OH)-、-P(O)(OR’)O-、-S(O)2-、-S-S-、芳基和杂芳基，其中M”是键、C1-13烷基或C2-13烯基；
R7选自由以下组成的组：C1-3烷基、C2-3烯基和H；
R8选自由以下组成的组：C3-6碳环和杂环；
R9选自由以下组成的组：H、CN、NO2、C1-6烷基、-OR、-S(O)2R、-S(O)2N(R)2、C2-6烯基、C3-6碳环和杂环；
R10选自由以下组成的组：H、OH、C1-3烷基和C2-3烯基；
每个R独立地选自由以下组成的组：C1-3烷基、C2-3烯基、(CH2)qOR*和H，
并且每个q独立地选自1、2和3；
每个R’独立地选自由以下组成的组：C1-18烷基、C2-18烯基、-R*YR”、-YR”和H；
每个R”独立地选自由以下组成的组：C3-15烷基和C3-15烯基；
每个R*独立地选自由以下组成的组：C1-12烷基和C2-12烯基；
每个Y独立地是C3-6碳环；
每个X独立地选自由以下组成的组：F、Cl、Br和I；并且
m选自5、6、7、8、9、10、11、12和13；并且其中当R4是-(CH2)nQ、-(CH2)nCHQR、-CHQR或-CQ(R)2时，那么(i)当n是1、2、3、4或5时，Q不是-N(R)2；或者(ii)当n是1或2时，Q不是5、6或7元杂环烷基。
本公开的另一方面涉及式(III)的化合物：
Figure BDA0003064795710001121
或其N-氧化物，
或其盐或异构体，其中
或其盐或异构体，其中
R1选自由以下组成的组：C5-30烷基、C5-20烯基、-R*YR”、-YR”和-R”M’R’；
R2和R3独立地选自由以下组成的组：H、C1-14烷基、C2-14烯基、-R*YR”、-YR”和-R*OR”，或者R2和R3与它们所连接的原子一起形成杂环或碳环；
R4选自由以下组成的组：氢、C3-6碳环、-(CH2)nQ、-(CH2)nCHQR、-(CH2)oC(R10)2(CH2)n-oQ、-CHQR、-CQ(R)2和未取代的C1-6烷基，其中Q选自碳环、杂环、-OR、-O(CH2)nN(R)2、-C(O)OR、-OC(O)R、-CX3、-CX2H、-CXH2、-CN、-N(R)2、-C(O)N(R)2、-N(R)C(O)R、-N(R)S(O)2R、-N(R)C(O)N(R)2、-N(R)C(S)N(R)2、N(R)R8、-N(R)S(O)2R8、-O(CH2)nOR、-N(R)C(＝NR9)N(R)2、-N(R)C(＝CHR9)N(R)2、-OC(O)N(R)2、-N(R)C(O)OR、-N(OR)C(O)R、-N(OR)S(O)2R、-N(OR)C(O)OR、-N(OR)C(O)N(R)2、-N(OR)C(S)N(R)2、-N(OR)C(＝NR9)N(R)2、-N(OR)C(＝CHR9)N(R)2、-C(＝NR9)N(R)2、-C(＝NR9)R、-C(O)N(R)OR和-C(R)N(R)2C(O)OR，每个o独立地选自1、2、3和4，并且每个n独立地选自1、2、3、4和5；
Rx选自由以下组成的组：C1-6烷基、C2-6烯基、-(CH2)vOH和-(CH2)vN(R)2，
其中v选自1、2、3、4、5和6；
每个R5独立地选自由以下组成的组：OH、C1-3烷基、C2-3烯基和H；
每个R6独立地选自由以下组成的组：OH、C1-3烷基、C2-3烯基和H；
M和M’独立地选自-C(O)O-、-OC(O)-、-OC(O)-M”-C(O)O-、-C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(S)S-、-SC(S)-、-CH(OH)-、-P(O)(OR’)O-、-S(O)2-、-S-S-、芳基和杂芳基，其中M”是键、C1-13烷基或C2-13烯基；
R7选自由以下组成的组：C1-3烷基、C2-3烯基和H；
R8选自由以下组成的组：C3-6碳环和杂环；
R9选自由以下组成的组：H、CN、NO2、C1-6烷基、-OR、-S(O)2R、-S(O)2N(R)2、C2-6烯基、C3-6碳环和杂环；
R10选自由以下组成的组：H、OH、C1-3烷基和C2-3烯基；
每个R独立地选自由以下组成的组：C1-3烷基、C2-3烯基、(CH2)qOR*和H，
并且每个q独立地选自1、2和3；
每个R’独立地选自由以下组成的组：C1-18烷基、C2-18烯基、-R*YR”、-YR”和H；
每个R”独立地选自由以下组成的组：C3-15烷基和C3-15烯基；
每个R*独立地选自由以下组成的组：C1-12烷基和C2-12烯基；
每个Y独立地是C3-6碳环；
每个X独立地选自由以下组成的组：F、Cl、Br和I；并且
m选自5、6、7、8、9、10、11、12和13。
在某些实施方案中，式(I)的化合物的子集包括式(IA)的那些：
Figure BDA0003064795710001151
或其N-氧化物，或其盐或异构体，其中l选自1、2、3、4和5；m选自5、6、7、8和9；M1是键或M’；R4是氢、未取代的C1-3烷基、-(CH2)oC(R10)2(CH2)n-oQ或-(CH2)nQ，其中Q是OH、-NHC(S)N(R)2、-NHC(O)N(R)2、-N(R)C(O)R、-N(R)S(O)2R、-N(R)R8、-NHC(＝NR9)N(R)2、-NHC(＝CHR9)N(R)2、-OC(O)N(R)2、-N(R)C(O)OR、
杂芳基或杂环烷基；M和M’独立地选自-C(O)O-、-OC(O)-、-OC(O)-M”-C(O)O-、-C(O)N(R’)-、-P(O)(OR’)O-、-S-S-、芳基和杂芳基；并且R2和R3独立地选自由以下组成的组：H、C1-14烷基和C2-14烯基。例如，m是5、7或9。例如，Q是OH、-NHC(S)N(R)2或-NHC(O)N(R)2。例如，Q是-N(R)C(O)R或-N(R)S(O)2R。
在某些实施方案中，式(I)的化合物的子集包括式(IB)的那些：
Figure BDA0003064795710001152
或其N-氧化物，或其盐或异构体，其中所有变量均如本文所定义。例如，m选自5、6、7、8和9；M和M’独立地选自-C(O)O-、-OC(O)-、-OC(O)-M”-C(O)O-、-C(O)N(R’)-、-P(O)(OR’)O-、-S-S-、芳基和杂芳基；并且R2和R3独立地选自由以下组成的组：H、C1-14烷基和C2-14烯基。例如，m是5、7或9。在某些实施方案中，式(I)的化合物的子集包括式(II)的那些：
Figure BDA0003064795710001153
或其N-氧化物，或其盐或异构体，其中l选自1、2、3、4和5；M1是键或M’；R4是氢、未取代的C1-3烷基、-(CH2)oC(R10)2(CH2)n-oQ或-(CH2)nQ，其中n是2、3或4；并且Q是OH、-NHC(S)N(R)2、-NHC(O)N(R)2、-N(R)C(O)R、-N(R)S(O)2R、-N(R)R8、-NHC(＝NR9)N(R)2、-NHC(＝CHR9)N(R)2、-OC(O)N(R)2、-N(R)C(O)OR、
杂芳基或杂环烷基；M和M’独立地选自-C(O)O-、-OC(O)-、-OC(O)-M”-C(O)O-、-C(O)N(R’)-、-P(O)(OR’)O-、-S-S-、芳基和杂芳基；并且R2和R3独立地选自由以下组成的组：H、C1-14烷基和C2-14烯基。
本公开的另一方面涉及式(I VI)的化合物：
Figure BDA0003064795710001161
或其N-氧化物，
或其盐或异构体，其中
R1选自由以下组成的组：C5-30烷基、C5-20烯基、-R*YR”、-YR”和-R”M’R’；
R2和R3独立地选自由以下组成的组：H、C1-14烷基、C2-14烯基、-R*YR”、-YR”和-R*OR”，或者R2和R3与它们所连接的原子一起形成杂环或碳环；
每个R5独立地选自由以下组成的组：OH、C1-3烷基、C2-3烯基和H；
每个R6独立地选自由以下组成的组：OH、C1-3烷基、C2-3烯基和H；
M和M’独立地选自-C(O)O-、-OC(O)-、-OC(O)-M”-C(O)O-、-C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(S)S-、-SC(S)-、-CH(OH)-、-P(O)(OR’)O-、-S(O)2-、-S-S-、芳基和杂芳基，其中M”是键、C1-13烷基或C2-13烯基；
R7选自由以下组成的组：C1-3烷基、C2-3烯基和H；
每个R独立地选自由以下组成的组：H、C1-3烷基和C2-3烯基；
RN是H或C1-3烷基；
每个R’独立地选自由以下组成的组：C1-18烷基、C2-18烯基、-R*YR”、-YR”和H；
每个R”独立地选自由以下组成的组：C3-15烷基和C3-15烯基；
每个R*独立地选自由以下组成的组：C1-12烷基和C2-12烯基；
每个Y独立地是C3-6碳环；
每个X独立地选自由以下组成的组：F、Cl、Br和I；
Xa和Xb各自独立地是O或S；
R10选自由以下组成的组：H、卤基、-OH、R、-N(R)2、-CN、-N3、-C(O)OH、-C(O)OR、-OC(O)R、-OR、-SR、-S(O)R、-S(O)OR、-S(O)2OR、-NO2、-S(O)2N(R)2、-N(R)S(O)2R、-NH(CH2)t1N(R)2、-NH(CH2)p1O(CH2)q1N(R)2、-NH(CH2)s1OR、-N((CH2)s1OR)2、碳环、杂环、芳基和杂芳基；
m选自5、6、7、8、9、10、11、12和13；
n选自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10；
r是0或1；
t1选自1、2、3、4和5；
p1选自1、2、3、4和5；
q1选自1、2、3、4和5；并且
s1选自1、2、3、4和5。
在一个实施方案中，式(VI)的化合物的子集包括式(VI-a)的那些：
Figure BDA0003064795710001181
或其N-氧化物，
或其盐或异构体，其中
R1a和R1b独立地选自由以下组成的组：C1-14烷基和C2-14烯基；并且
R2和R3独立地选自由以下组成的组：C1-14烷基、C2-14烯基、-R*YR”、-YR”和-R*OR”，或者R2和R3与它们所连接的原子一起形成杂环或碳环。
在另一个实施方案中，式(VI)的化合物的子集包括式(VII)的那些：
Figure BDA0003064795710001182
或其N-氧化物，或其盐或异构体，其中
l选自1、2、3、4和5；
M1是键或M’；并且
R2和R3独立地选自由以下组成的组：H、C1-14烷基和C2-14烯基。
在另一个实施方案中，式(I VI)的化合物的子集包括式(I VIII)的那些：
Figure BDA0003064795710001191
或其N-氧化物，或其盐或异构体，其中
l选自1、2、3、4和5；
M1是键或M’；并且
Ra’和Rb’独立地选自由以下组成的组：C1-14烷基和C2-14烯基；并且
R2和R3独立地选自由以下组成的组：C1-14烷基和C2-14烯基。
当适用时，式(I I)、(I IA)、(I VI)、(I VI-a)、(I VII)或(I VIII)中任一个的化合物包括一个或多个以下特征。
在一些实施方案中，M1是M’。
在一些实施方案中，M和M’独立地是-C(O)O-或-OC(O)-。
在一些实施方案中，M和M’中的至少一个是-C(O)O-或-OC(O)-。
在某些实施方案中，M和M’中的至少一个是-OC(O)-。
在某些实施方案中，M是-OC(O)-并且M’是-C(O)O-。在一些实施方案中，M是-C(O)O-并且M’是-OC(O)-。在某些实施方案中，M和M’各自是-OC(O)-。在一些实施方案中，M和M’各自是-C(O)O-。
在某些实施方案中，M和M’中的至少一个是-OC(O)-M”-C(O)O-。
在一些实施方案中，M和M’独立地是-S-S-。
在一些实施方案中，M和M’中的至少一个是-S-S。
在一些实施方案中，M和M’中的一个是-C(O)O-或-OC(O)-，并且另一个是-S-S-。例如，M是-C(O)O-或-OC(O)-且M’是-S-S-，或者M’是-C(O)O-或-OC(O)-且M是-S-S-。
在一些实施方案中，M和M’中的一个是-OC(O)-M”-C(O)O-，其中M”是键、C1-13烷基或C2-13烯基。在其他实施方案中，M”是C1-6烷基或C2-6烯基。在某些实施方案中，M”是C1-4烷基或C2-4烯基。例如，在一些实施方案中，M”是C1烷基。例如，在一些实施方案中，M”是C2烷基。例如，在一些实施方案中，M”是C3烷基。例如，在一些实施方案中，M”是C4烷基。例如，在一些实施方案中，M”是C2烯基。例如，在一些实施方案中，M”是C3烯基。例如，在一些实施方案中，M”是C4烯基。
在一些实施方案中，l是1、3或5。
在一些实施方案中，R4是氢。
在一些实施方案中，R4不是氢。
在一些实施方案中，R4是未取代的甲基或-(CH2)nQ，其中Q是OH、-NHC(S)N(R)2、-NHC(O)N(R)2、-N(R)C(O)R或-N(R)S(O)2R。
在一些实施方案中，Q是OH。
在一些实施方案中，Q是-NHC(S)N(R)2。
在一些实施方案中，Q是-NHC(O)N(R)2。
在一些实施方案中，Q是-N(R)C(O)R。
在一些实施方案中，Q是-N(R)S(O)2R。
在一些实施方案中，Q是-O(CH2)nN(R)2。
在一些实施方案中，Q是-O(CH2)nOR。
在一些实施方案中，Q是-N(R)R8。
在一些实施方案中，Q是-NHC(＝NR9)N(R)2。
在一些实施方案中，Q是-NHC(＝CHR9)N(R)2。
在一些实施方案中，Q是-OC(O)N(R)2。
在一些实施方案中，Q是-N(R)C(O)OR。
在一些实施方案中，n是2。
在一些实施方案中，n是3。
在一些实施方案中，n是4。
在一些实施方案中，M1不存在。
在一些实施方案中，至少一个R5是羟基。例如，一个R5是羟基。
在一些实施方案中，至少一个R6是羟基。例如，一个R6是羟基。
在一些实施方案中，R5和R6中的一个是羟基。例如，一个R5是羟基并且每个R6均是氢。例如，一个R6是羟基并且每个R5均是氢。
在一些实施方案中，Rx是C1-6烷基。在一些实施方案中，Rx是C1-3烷基。例如，Rx是甲基。例如，Rx是乙基。例如，Rx是丙基。
在一些实施方案中，Rx是-(CH2)vOH，并且v是1、2或3。例如，Rx是甲酰氧基。例如，Rx是乙酰氧基。例如，Rx是丙酰氧基。
在一些实施方案中，Rx是-(CH2)vN(R)2，v是1、2或3并且每个R是H或甲基。例如，Rx是甲氨基、甲基甲氨基或二甲基甲氨基。例如，Rx是氨基甲基、甲基氨基甲基或二甲基氨基甲基。例如，Rx是氨基乙基、甲基氨基乙基或二甲基氨基乙基。例如，Rx是氨基丙基、甲基氨基丙基或二甲基氨基丙基。
在一些实施方案中，R’是C1-18烷基、C2-18烯基、-R*YR”或-YR”。
在一些实施方案中，R2和R3独立地是C3-14烷基或C3-14烯基。
在一些实施方案中，R1b是C1-14烷基。在一些实施方案中，R1b是C2-14烷基。在一些实施方案中，R1b是C3-14烷基。在一些实施方案中，R1b是C1-8烷基。在一些实施方案中，R1b是C1-5烷基。在一些实施方案中，R1b是C1-3烷基。在一些实施方案中，R1b选自C1烷基、C2烷基、C3烷基、C4烷基和C5烷基。例如，在一些实施方案中，R1b是C1烷基。例如，在一些实施方案中，R1b是C2烷基。例如，在一些实施方案中，R1b是C3烷基。例如，在一些实施方案中，R1b是C4烷基。例如，在一些实施方案中，R1b是C5烷基。
在一些实施方案中，R1与-(CHR5R6)m-M-CR2R3R7不同。
在一些实施方案中，-CHR1aR1b-与-(CHR5R6)m-M-CR2R3R7不同。
在一些实施方案中，R7是H。在一些实施方案中，R7选自C1-3烷基。例如，在一些实施方案中，R7是C1烷基。例如，在一些实施方案中，R7是C2烷基。例如，在一些实施方案中，R7是C3烷基。在一些实施方案中，R7选自C4烷基、C4烯基、C5烷基、C5烯基、C6烷基、C6烯基、C7烷基、C7烯基、C9烷基、C9烯基、C11烷基、C11烯基、C17烷基、C17烯基、C18烷基和C18烯基。
在一些实施方案中，Rb’是C1-14烷基。在一些实施方案中，Rb’是C2-14烷基。在一些实施方案中，Rb’是C3-14烷基。在一些实施方案中，Rb’是C1-8烷基。在一些实施方案中，Rb’是C1-5烷基。在一些实施方案中，Rb’是C1-3烷基。在一些实施方案中，Rb’选自C1烷基、C2烷基、C3烷基、C4烷基和C5烷基。例如，在一些实施方案中，Rb’是C1烷基。例如，在一些实施方案中，Rb’是C2烷基。例如，在一些实施方案中，Rb’是C3烷基。例如，在一些实施方案中，Rb’是C4烷基。
在一个实施方案中，式(I)的化合物为式(IIa)：
Figure BDA0003064795710001231
或其N-氧化物，或其盐或异构体，其中R4如本文所述。
在另一个实施方案中，式(I)的化合物为式(IIb)：
Figure BDA0003064795710001232
或其N-氧化物，或其盐或异构体，其中R4如本文所述。
在另一个实施方案中，式(I)的化合物为式(IIc)或(IIe)：
Figure BDA0003064795710001241
或其N-氧化物，或其盐或异构体，其中R4如本文所述。
在另一个实施方案中，式(I I)的化合物为式(I IIf)：
Figure BDA0003064795710001242
或其N-氧化物，或其盐或异构体，
其中M是-C(O)O-或-OC(O)-，M”是C1-6烷基或C2-6烯基，R2和R3独立地选自由以下组成的组：C5-14烷基和C5-14烯基，并且n选自2、3和4。
在另一个实施方案中，式(I I)的化合物为式(IId)：
Figure BDA0003064795710001243
或其N-氧化物，或其盐或异构体，其中n是2、3或4；并且m、R’、R”以及R2至R6如本文所述。例如，R2和R3各自可独立地选自由以下组成的组：C5-14烷基和C5-14烯基。
在另一个实施方案中，式(I)的化合物为式(IIg)：
Figure BDA0003064795710001251
或其N-氧化物，或其盐或异构体，其中l选自1、2、3、4和5；m选自5、6、7、8和9；M1是键或M’；M和M’独立地选自-C(O)O-、-OC(O)-、-OC(O)-M”-C(O)O-、-C(O)N(R’)-、-P(O)(OR’)O-、-S-S-、芳基和杂芳基；并且R2和R3独立地选自由以下组成的组：H、C1-14烷基和C2-14烯基。例如，M”是C1-6烷基(例如，C1-4烷基)或C2-6烯基(例如，C2-4烯基)。例如，R2和R3独立地选自由以下组成的组：C5-14烷基和C5-14烯基。
在另一个实施方案中，式(I VI)的化合物的子集包括式(I VIIa)的那些：
Figure BDA0003064795710001252
或其N-氧化物，或其盐或异构体。
在另一个实施方案中，式(I VI)的化合物的子集包括式(I VIIIa)的那些：
Figure BDA0003064795710001253
或其N-氧化物，或其盐或异构体。
在另一个实施方案中，式(I VI)的化合物的子集包括式(I VIIIb)的那些：
Figure BDA0003064795710001261
或其N-氧化物，或其盐或异构体。
在另一个实施方案中，式(I VI)的化合物的子集包括式(I VIIb-1)的那些：
Figure BDA0003064795710001262
或其N-氧化物，或其盐或异构体。
在另一个实施方案中，式(I VI)的化合物的子集包括式(I VIIb-2)的那些：
Figure BDA0003064795710001263
或其N-氧化物，或其盐或异构体。
在另一个实施方案中，式(I VI)的化合物的子集包括式(I VIIb-3)的那些：
Figure BDA0003064795710001271
或其N-氧化物，或其盐或异构体。在另一个实施方案中，式(VI)的化合物的子集包括式(VIIc)的那些：
Figure BDA0003064795710001272
在另一个实施方案中，式(I VI)的化合物的子集包括式(VIId)的那些：
Figure BDA0003064795710001273
或其N-氧化物，或其盐或异构体。
在另一个实施方案中，式(I VI)的化合物的子集包括式(I VIIIc)的那些：
Figure BDA0003064795710001274
在另一个实施方案中，式(I VI)的化合物的子集包括式(I VIIId)的那些：
Figure BDA0003064795710001281
或其N-氧化物，或其盐或异构体。
当适用时，式(I I)、(I IA)、(I IB)、(I II)、(I IIa)、(I IIb)、(I IIc)、(IIId)、(I IIe)、(I IIf)、(I IIg)、I(III)、(I VI)、(I VI-a)、(I VII)、(I VIII)、(IVIIa)、(I VIIIa)、(I VIIIb)、(I VIIb-1)、(I VIIb-2)、(I VIIb-3)、(I VIIc)、(I VIId)、(I VIIIc)或(I VIIId)中任一个的化合物包括一个或多个以下特征。
在一些实施方案中，R4选自由以下组成的组：C3-6碳环、-(CH2)nQ、-(CH2)nCHQR、-(CH2)oC(R10)2(CH2)n-oQ、-CHQR和-CQ(R)2，其中Q选自C3-6碳环、具有一个或多个选自N、O、S和P的杂原子的5至14元芳族或非芳族杂环、-OR、-O(CH2)nN(R)2、-C(O)OR、-OC(O)R、-CX3、-CX2H、-CXH2、-CN、-N(R)2、-N(R)S(O)2R8、-C(O)N(R)2、-N(R)C(O)R、-N(R)S(O)2R、-N(R)C(O)N(R)2、-N(R)C(S)N(R)2和-C(R)N(R)2C(O)OR，每个o独立地选自1、2、3和4，并且每个n独立地选自1、2、3、4和5。
在另一个实施方案中，R4选自由以下组成的组：C3-6碳环、-(CH2)nQ、-(CH2)nCHQR、-(CH2)oC(R10)2(CH2)n-oQ、-CHQR和-CQ(R)2，其中Q选自C3-6碳环、具有一个或多个选自N、O和S的杂原子的5至14元杂芳基、-OR、-O(CH2)nN(R)2、-C(O)OR、-OC(O)R、-CX3、-CX2H、-CXH2、-CN、-C(O)N(R)2、-N(R)S(O)2R8、-N(R)C(O)R、-N(R)S(O)2R、-N(R)C(O)N(R)2、-N(R)C(S)N(R)2、-C(R)N(R)2C(O)OR和具有一个或多个选自N、O和S的杂原子的5至14元杂环烷基，所述基团被一个或多个选自氧代基(＝O)、OH、氨基和C1-3烷基的取代基取代，每个o独立地选自1、2、3和4，并且每个n独立地选自1、2、3、4和5。
在另一个实施方案中，R4选自由以下组成的组：C3-6碳环、-(CH2)nQ、-(CH2)nCHQR、-(CH2)oC(R10)2(CH2)n-oQ、-CHQR和-CQ(R)2，其中Q选自C3-6碳环、具有一个或多个选自N、O和S的杂原子的5至14元杂环、-OR、-O(CH2)nN(R)2、-C(O)OR、-OC(O)R、-CX3、-CX2H、-CXH2、-CN、-C(O)N(R)2、-N(R)S(O)2R8、-N(R)C(O)R、-N(R)S(O)2R、-N(R)C(O)N(R)2、-N(R)C(S)N(R)2、-C(R)N(R)2C(O)OR，每个o独立地选自1、2、3和4，并且每个n独立地选自1、2、3、4和5；并且当Q是5至14元杂环且(i)R4是-(CH2)nQ，其中n是1或2，或者(ii)R4是-(CH2)nCHQR，其中n是1，或者(iii)R4是-CHQR和-CQ(R)2，那么Q是5至14元杂芳基或8至14元杂环烷基。
在另一个实施方案中，R4选自由以下组成的组：C3-6碳环、-(CH2)nQ、-(CH2)nCHQR、-(CH2)oC(R10)2(CH2)n-oQ、-CHQR和-CQ(R)2，其中Q选自C3-6碳环、具有一个或多个选自N、O和S的杂原子的5至14元杂芳基、-OR、-O(CH2)nN(R)2、-C(O)OR、-OC(O)R、-CX3、-CX2H、-CXH2、-CN、-C(O)N(R)2、-N(R)S(O)2R8、-N(R)C(O)R、-N(R)S(O)2R、-N(R)C(O)N(R)2、-N(R)C(S)N(R)2、-C(R)N(R)2C(O)OR，每个o独立地选自1、2、3和4，并且每个n独立地选自1、2、3、4和5。
在另一个实施方案中，R4是-(CH2)nQ，其中Q是-N(R)S(O)2R8并且n选自1、2、3、4和5。在另一个实施方案中，R4是-(CH2)nQ，其中Q是-N(R)S(O)2R8，其中R8是C3-6碳环如C3-6环烷基，并且n选自1、2、3、4和5。例如，R4是-(CH2)3NHS(O)2R8并且R8是环丙基。
在另一个实施方案中，R4是-(CH2)oC(R10)2(CH2)n-oQ，其中Q是-N(R)C(O)R，n选自1、2、3、4和5，并且o选自1、2、3和4。在另一个实施方案中，R4是-(CH2)oC(R10)2(CH2)n-oQ，其中Q是-N(R)C(O)R，其中R是C1-C3烷基并且n选自1、2、3、4和5，并且o选自1、2、3和4。在另一个实施方案中，R4是-(CH2)oC(R10)2(CH2)n-oQ，其中Q是-N(R)C(O)R，其中R是C1-C3烷基，n是3，并且o是1。在一些实施方案中，R10是H、OH、C1-3烷基或C2-3烯基。例如，R4是3-乙酰氨基-2,2-二甲基丙基。
在一些实施方案中，一个R10是H，一个R10是C1-3烷基或C2-3烯基。在另一个实施方案中，每个R10是C1-3烷基或C2-3烯基。在另一个实施方案中，每个R10是C1-3烷基(例如，甲基、乙基或丙基)。例如，一个R10是甲基，一个R10是乙基或丙基。例如，一个R10是乙基，一个R10是甲基或丙基。例如，一个R10是丙基，一个R10是甲基或乙基。例如，每个R10是甲基。例如，每个R10是乙基。例如，每个R10是丙基。
在一些实施方案中，一个R10是H，一个R10是OH。在另一个实施方案中，每个R10是OH。
在另一个实施方案中，R4是未取代的C1-4烷基，例如未取代的甲基。
在另一个实施方案中，R4是氢。
在某些实施方案中，本公开提供了具有式(I)的化合物，其中R4是-(CH2)nQ或-(CH2)nCHQR，其中Q是-N(R)2，并且n选自3、4和5。
在某些实施方案中，本公开提供了具有式(I)的化合物，其中R4选自由以下组成的组：-(CH2)nQ、-(CH2)nCHQR、-CHQR和-CQ(R)2，其中Q是-N(R)2，并且n选自1、2、3、4和5。
在某些实施方案中，本公开提供了具有式(I)的化合物，其中R2和R3独立地选自由以下组成的组：C2-14烷基、C2-14烯基、-R*YR”、-YR”和-R*OR”，或者R2和R3与它们所连接的原子一起形成杂环或碳环，并且R4是-(CH2)nQ或-(CH2)nCHQR，其中Q是-N(R)2，并且n选自3、4和5。
在某些实施方案中，R2和R3独立地选自由以下组成的组：C2-14烷基、C2-14烯基、-R*YR”、-YR”和-R*OR”，或者R2和R3与它们所连接的原子一起形成杂环或碳环。在一些实施方案中，R2和R3独立地选自由以下组成的组：C2-14烷基和C2-14烯基。在一些实施方案中，R2和R3独立地选自由以下组成的组：-R*YR”、-YR”和-R*OR”。在一些实施方案中，R2和R3与它们所连接的原子一起形成杂环或碳环。
在一些实施方案中，R1选自由以下组成的组：C5-20烷基和C5-20烯基。在一些实施方案中，R1是被羟基取代的C5-20烷基。
在其他实施方案中，R1选自由以下组成的组：-R*YR”、-YR”和-R”M’R’。
在某些实施方案中，R1选自-R*YR”和-YR”。在一些实施方案中，Y是环丙基。在一些实施方案中，R*是C8烷基或C8烯基。在某些实施方案中，R”是C3-12烷基。例如，R”可以是C3烷基。例如，R”可以是C4-8烷基(例如，C4、C5、C6、C7或C8烷基)。
在一些实施方案中，R是(CH2)qOR*，q选自1、2和3，并且R*是被一个或多个选自由氨基、C1-C6烷基氨基和C1-C6二烷基氨基组成的组的取代基取代的C1-12烷基。例如，R是(CH2)qOR*，q选自1、2和3，并且R*是被C1-C6二烷基氨基取代的C1-12烷基。例如，R是(CH2)qOR*，q选自1、2和3，并且R*是被C1-C6二烷基氨基取代的C1-3烷基。例如，R是(CH2)qOR*，q选自1、2和3，并且R*是被二甲基氨基(例如，二甲基氨基乙基)取代的C1-3烷基。
在一些实施方案中，R1是C5-20烷基。在一些实施方案中，R1是C6烷基。在一些实施方案中，R1是C8烷基。在其他实施方案中，R1是C9烷基。在某些实施方案中，R1是C14烷基。在其他实施方案中，R1是C18烷基。
在一些实施方案中，R1是C21-30烷基。在一些实施方案中，R1是C26烷基。在一些实施方案中，R1是C28烷基。在某些实施方案中，R1是
Figure BDA0003064795710001321
在一些实施方案中，R1是C5-20烯基。在某些实施方案中，R1是C18烯基。在一些实施方案中，R1是亚油基。
在某些实施方案中，R1是支链的(例如，癸-2-基、十一烷-3-基、十二烷-4-基、十三烷-5-基、十四烷-6-基、2-甲基十一烷-3-基、2-甲基癸-2-基、3-甲基十一烷-3-基、4-甲基十二烷-4-基或十七烷-9-基)。
在某些实施方案中，R1是
Figure BDA0003064795710001322
在某些实施方案中，R1是未取代的C5-20烷基或C5-20烯基。在某些实施方案中，R'是取代的C5-20烷基或C5-20烯基(例如，被C3-6碳环如1-环丙基壬基取代，或被OH或烷氧基取代)。例如，R1是
Figure BDA0003064795710001323
在其他实施方案中，R1是-R”M’R’。在某些实施方案中，M’是-OC(O)-M”-C(O)O-。例如，R1是
Figure BDA0003064795710001324
其中x1是1与13之间的整数(例如，选自3、4、5和6)，x2是1与13之间的整数(例如，选自1、2和3)，并且x3是2与14之间的整数(例如，选自4、5和6)。例如，x1选自3、4、5和6，x2选自1、2和3，并且x3选自4、5和6。
在其他实施方案中，R1与-(CHR5R6)m-M-CR2R3R7不同。
在一些实施方案中，R’选自-R*YR”和-YR”。在一些实施方案中，Y是C3-8环烷基。在一些实施方案中，Y是C6-10芳基。在一些实施方案中，Y是环丙基。在一些实施方案中，Y是环己基。在某些实施方案中，R*是C1烷基。
在一些实施方案中，R”选自由以下组成的组：C3-12烷基和C3-12烯基。在一些实施方案中，R”是C8烷基。在一些实施方案中，邻近Y的R”是C1烷基。在一些实施方案中，邻近Y的R”是C4-9烷基(例如，C4、C5、C6、C7或C8或C9烷基)。
在一些实施方案中，R”是取代的C3-12(例如，被例如羟基取代的C3-12烷基)。例如，R”是
Figure BDA0003064795710001331
在一些实施方案中，R’选自C4烷基和C4烯基。在某些实施方案中，R’选自C5烷基和C5烯基。在一些实施方案中，R’选自C6烷基和C6烯基。在一些实施方案中，R’选自C7烷基和C7烯基。在一些实施方案中，R’选自C9烷基和C9烯基。
在一些实施方案中，R’选自C4烷基、C4烯基、C5烷基、C5烯基、C6烷基、C6烯基、C7烷基、C7烯基、C9烷基、C9烯基、C11烷基、C11烯基、C17烷基、C17烯基、C18烷基和C18烯基，所述基团各自是直链或支链的。
在一些实施方案中，R’是直链的。在一些实施方案中，R’是支链的。
在一些实施方案中，R’是
Figure BDA0003064795710001332
在一些实施方案中，R’是
Figure BDA0003064795710001333
并且M’是-OC(O)-。在其他实施方案中，R’是
Figure BDA0003064795710001334
Figure BDA0003064795710001335
并且M’是-C(O)O-。
在其他实施方案中，R’选自C11烷基和C11烯基。在其他实施方案中，R’选自C12烷基、C12烯基、C13烷基、C13烯基、C14烷基、C14烯基、C15烷基、C15烯基、C16烷基、C16烯基、C17烷基、C17烯基、C18烷基和C18烯基。在某些实施方案中，R’是直链的C4-18烷基或C4-18烯基。在某些实施方案中，R’是支链的(例如，癸-2-基、十一烷-3-基、十二烷-4-基、十三烷-5-基、十四烷-6-基、2-甲基十一烷-3-基、2-甲基癸-2-基、3-甲基十一烷-3-基、4-甲基十二烷-4-基或十七烷-9-基)。在某些实施方案中，R’是
Figure BDA0003064795710001341
在某些实施方案中，R’是未取代的C1-18烷基。在某些实施方案中，R’是取代的C1-18烷基(例如，被例如烷氧基如甲氧基，或C3-6碳环如1-环丙基壬基，或C(O)O-烷基或OC(O)-烷基如C(O)OCH3或OC(O)CH3取代的C1-15烷基)。例如，R’是
Figure BDA0003064795710001342
Figure BDA0003064795710001343
在某些实施方案中，R’是支链的C1-18烷基。例如，R’是
Figure BDA0003064795710001344
在一些实施方案中，R”选自由以下组成的组：C3-15烷基和C3-15烯基。在一些实施方案中，R”是C3烷基、C4烷基、C5烷基、C6烷基、C7烷基或C8烷基。在一些实施方案中，R”是C9烷基、C10烷基、C11烷基、C12烷基、C13烷基、C14烷基或C15烷基。
在一些实施方案中，M’是-C(O)O-。在一些实施方案中，M’是-OC(O)-。在一些实施方案中，M’是-OC(O)-M”-C(O)O-。
在一些实施方案中，M’是-C(O)O-、-OC(O)-或-OC(O)-M”-C(O)O-。在一些其中M’是-OC(O)-M”-C(O)O-的实施方案中，M”是C1-4烷基或C2-4烯基。
在其他实施方案中，M’是芳基或杂芳基。例如，M’可选自由以下组成的组：苯基、噁唑和噻唑。
在一些实施方案中，M是-C(O)O-。在一些实施方案中，M是-OC(O)-。在一些实施方案中，M是-C(O)N(R’)-。在一些实施方案中，M是-P(O)(OR’)O-。在一些实施方案中，M是-OC(O)-M”-C(O)O-。
在一些实施方案中，M是-C(O)。在一些实施方案中，M是-OC(O)-并且M’是-C(O)O-。在一些实施方案中，M是-C(O)O-并且M’是-OC(O)-。在一些实施方案中，M和M’各自是-OC(O)-。在一些实施方案中，M和M’各自是-C(O)O-。
在其他实施方案中，M是芳基或杂芳基。例如，M可选自由以下组成的组：苯基、噁唑和噻唑。
在一些实施方案中，M与M’相同。在其他实施方案中，M与M’不同。
在一些实施方案中，M”是键。在一些实施方案中，M”是C1-13烷基或C2-13烯基。在一些实施方案中，M”是C1-6烷基或C2-6烯基。在某些实施方案中，M”是直链烷基或烯基。在某些实施方案中，M”是支链的，例如，-CH(CH3)CH2-。
在一些实施方案中，每个R5是H。在一些实施方案中，每个R6是H。在某些实施方案中，每个R5和每个R6是H。
在一些实施方案中，R7是H。在其他实施方案中，R7是C1-3烷基(例如，甲基、乙基、丙基或异丙基)。
在一些实施方案中，R2和R3独立地是C5-14烷基或C5-14烯基。
在一些实施方案中，R2和R3是相同的。在一些实施方案中，R2和R3是C8烷基。在某些实施方案中，R2和R3是C2烷基。在其他实施方案中，R2和R3是C3烷基。在一些实施方案中，R2和R3是C4烷基。在某些实施方案中，R2和R3是C5烷基。在其他实施方案中，R2和R3是C6烷基。在一些实施方案中，R2和R3是C7烷基。
在其他实施方案中，R2和R3是不同的。在某些实施方案中，R2是C8烷基。在一些实施方案中，R3是C1-7(例如，C1、C2、C3、C4、C5、C6或C7烷基)或C9烷基。
在一些实施方案中，R3是C1烷基。在一些实施方案中，R3是C2烷基。在一些实施方案中，R3是C3烷基。在一些实施方案中，R3是C4烷基。在一些实施方案中，R3是C5烷基。在一些实施方案中，R3是C6烷基。在一些实施方案中，R3是C7烷基。在一些实施方案中，R3是C9烷基。
在一些实施方案中，R7和R3是H。
在某些实施方案中，R2是H。
在一些实施方案中，m是5、6、7、8或9。在一些实施方案中，m是5、7或9。例如，在一些实施方案中，m是5。例如，在一些实施方案中，m是7。例如，在一些实施方案中，m是9。
在一些实施方案中，R4选自-(CH2)nQ和-(CH2)nCHQR。
在一些实施方案中，Q选自由以下组成的组：-OR、-OH、-O(CH2)nN(R)2、-OC(O)R、-CX3、-CN、-N(R)C(O)R、-N(H)C(O)R、-N(R)S(O)2R、
-N(H)S(O)2R、-N(R)C(O)N(R)2、-N(H)C(O)N(R)2、-N(H)C(O)N(H)(R)、-N(R)C(S)N(R)2、
-N(H)C(S)N(R)2、-N(H)C(S)N(H)(R)、-C(R)N(R)2C(O)OR、-N(R)S(O)2R8、碳环和杂环。
在某些实施方案中，Q是-N(R)R8、-N(R)S(O)2R8、-O(CH2)nOR、-N(R)C(＝NR9)N(R)2、-N(R)C(＝CHR9)N(R)2、-OC(O)N(R)2或-N(R)C(O)OR。
在某些实施方案中，Q是-N(OR)C(O)R、-N(OR)S(O)2R、-N(OR)C(O)OR、-N(OR)C(O)N(R)2、-N(OR)C(S)N(R)2、-N(OR)C(＝NR9)N(R)2或-N(OR)C(＝CHR9)N(R)2。
在某些实施方案中，Q是硫脲或其电子等排体，例如，
Figure BDA0003064795710001371
或-NHC(＝NR9)N(R)2。
在某些实施方案中，Q是-C(＝NR9)N(R)2。例如，当Q是-C(＝NR9)N(R)2，时，n是4或5。例如，R9是-S(O)2N(R)2。
在某些实施方案中，Q是-C(＝NR9)R或-C(O)N(R)OR，例如，-CH(＝N-OCH3)、-C(O)NH-OH、-C(O)NH-OCH3、-C(O)N(CH3)-OH或-C(O)N(CH3)-OCH3。
在某些实施方案中，Q是-OH。
在某些实施方案中，Q是取代或未取代的5至10元杂芳基，例如Q是三唑、咪唑、嘧啶、嘌呤、2-氨基-1,9-二氢-6H-嘌呤-6-酮-9-基(或鸟嘌呤-9-基)、腺嘌呤-9-基、胞嘧啶-1-基或尿嘧啶-1-基，其各自任选地被一个或多个选自烷基、OH、烷氧基、-烷基-OH、-烷基-O-烷基的取代基取代，并且所述取代基可进一步被取代。在某些实施方案中，Q是取代的5至14元杂环烷基，例如被一个或多个选自氧代基(＝O)、OH、氨基、单烷基氨基或二烷基氨基和C1-3烷基的取代基取代。例如，Q是4-甲基哌嗪基、4-(4-甲氧基苯甲基)哌嗪基、异吲哚啉-2-基-1,3-二酮、吡咯烷-1-基-2,5-二酮或咪唑烷-3-基-2,4-二酮。
在某些实施方案中，Q是-NHR8，其中R8是任选地被一个或多个选自以下的取代基取代的C3-6环烷基：氧代基(＝O)、氨基(NH2)、单烷基氨基或二烷基氨基、C1-3烷基和卤基。例如，R8是环丁烯基，例如3-(二甲基氨基)-环丁-3-烯-4-基-1,2-二酮。在另外的实施方案中，R8是任选地被一个或多个选自以下的取代基取代的C3-6环烷基：氧代基(＝O)、硫代基(＝S)、氨基(NH2)、单烷基氨基或二烷基氨基、C1-3烷基、杂环烷基和卤基，其中所述单烷基氨基或二烷基氨基、C1-3烷基和杂环烷基进一步被取代。例如，R8是被氧代基、氨基和烷基氨基中的一个或多个取代的环丁烯基，其中所述烷基氨基进一步被例如以下一个或多个取代：C1-3烷氧基、氨基、单烷基氨基或二烷基氨基和卤基。例如，R8是3-(((二甲基氨基)乙基)氨基)环丁-3-烯基-1,2-二酮。例如，R8是被氧代基和烷基氨基中的一个或多个取代的环丁烯基。例如，R8是3-(乙基氨基)环丁-3-烯-1,2-二酮。例如，R8是被氧代基、硫代基和烷基氨基中的一个或多个取代的环丁烯基。例如，R8是3-(乙基氨基)-4-硫氧代环丁-2-烯-1-酮或2-(乙基氨基)-4-硫氧代环丁-2-烯-1-酮。例如，R8是被硫代基和烷基氨基中的一个或多个取代的环丁烯基。例如，R8是3-(乙基氨基)环丁-3-烯-1,2-二硫酮。例如，R8是被氧代基和二烷基氨基中的一个或多个取代的环丁烯基。例如，R8是3-(二乙基氨基)环丁-3-烯-1,2-二酮。例如，R8是被氧代基、硫代基和二烷基氨基中的一个或多个取代的环丁烯基。例如，R8是2-(二乙基氨基)-4-硫氧代环丁-2-烯-1-酮或3-(二乙基氨基)-4-硫氧代环丁-2-烯-1-酮。例如，R8是被硫代基和二烷基氨基中的一个或多个取代的环丁烯基。例如，R8是3-(二乙基氨基)环丁-3-烯-1,2-二硫酮。例如，R8是被氧代基和烷基氨基或二烷基氨基中的一个或多个取代的环丁烯基，其中烷基氨基或二烷基氨基进一步被例如一个或多个烷氧基取代。例如，R8是3-(双(2-甲氧基乙基)氨基)环丁-3-烯-1,2-二酮。例如，R8是被氧代基和杂环烷基中的一个或多个取代的环丁烯基。例如，R8是被氧代基和哌啶基、哌嗪基或吗啉基中的一个或多个取代的环丁烯基。例如，R8是被氧代基和杂环烷基中的一个或多个取代的环丁烯基，其中杂环烷基进一步被例如一个或多个C1-3烷基取代。例如，R8是被氧代基和杂环烷基中的一个或多个取代的环丁烯基，其中杂环烷基(例如，哌啶基、哌嗪基或吗啉基)进一步被甲基取代。
在某些实施方案中，Q是-NHR8，其中R8是任选地被一个或多个选自以下的取代基取代的杂芳基：氨基(NH2)、单烷基氨基或二烷基氨基、C1-3烷基和卤基。例如，R8是噻唑或咪唑。
在某些实施方案中，Q是-NHC(＝NR9)N(R)2，其中R9是CN、C1-6烷基、NO2、-S(O)2N(R)2、-OR、-S(O)2R或H。例如，Q是-NHC(＝NR9)N(CH3)2、-NHC(＝NR9)NHCH3、-NHC(＝NR9)NH2。在一些实施方案中，Q是-NHC(＝NR9)N(R)2，其中R9是CN，并且R是被单烷基氨基或二烷基氨基取代的C1-3烷基，例如R是((二甲基氨基)乙基)氨基。在一些实施方案中，Q是-NHC(＝NR9)N(R)2，其中R9是C1-6烷基、NO2、-S(O)2N(R)2、-OR、-S(O)2R或H，并且R是被单烷基氨基或二烷基氨基取代的C1-3烷基，例如R是((二甲基氨基)乙基)氨基。
在某些实施方案中，Q是-NHC(＝CHR9)N(R)2，其中R9是NO2、CN、C1-6烷基、-S(O)2N(R)2、-OR、-S(O)2R或H。例如，Q是-NHC(＝CHR9)N(CH3)2、-NHC(＝CHR9)NHCH3或-NHC(＝CHR9)NH2。
在某些实施方案中，Q是-OC(O)N(R)2、-N(R)C(O)OR、-N(OR)C(O)OR，如-OC(O)NHCH3、-N(OH)C(O)OCH3、-N(OH)C(O)CH3、-N(OCH3)C(O)OCH3、-N(OCH3)C(O)CH3、-N(OH)S(O)2CH3或-NHC(O)OCH3。
在某些实施方案中，Q是-N(R)C(O)R，其中R是任选地被C1-3烷氧基或S(O)zC1-3烷基取代的烷基，其中z是0、1或2。
在某些实施方案中，Q是未取代或取代的C6-10芳基(如苯基)或C3-6环烷基。
在一些实施方案中，n是1。在其他实施方案中，n是2。在另外的实施方案中，n是3。在某些其他实施方案中，n是4。例如，R4可以是-(CH2)2OH。例如，R4可以是-(CH2)3OH。例如，R4可以是-(CH2)4OH。例如，R4可以是苯甲基。例如，R4可以是4-甲氧基苯甲基。
在一些实施方案中，R4是C3-6碳环。在一些实施方案中，R4是C3-6环烷基。例如，R4可以是任选地被例如OH、卤基、C1-6烷基等取代的环己基。例如，R4可以是2-羟基环己基。
在一些实施方案中，R是H。
在一些实施方案中，R是被单烷基氨基或二烷基氨基取代的C1-3烷基，例如R是((二甲基氨基)乙基)氨基。
在一些实施方案中，R是被一个或多个选自由C1-3烷氧基、氨基和C1-C3二烷基氨基组成的组的取代基取代的C1-6烷基。
在一些实施方案中，R是未取代的C1-3烷基或未取代的C2-3烯基。例如，R4可以是-CH2CH(OH)CH3、-CH(CH3)CH2OH或-CH2CH(OH)CH2CH3。
在一些实施方案中，R是未取代的C1-3烷基，例如CH2OH。例如，R4可以是-CH2CH(OH)CH2OH、-(CH2)3NHC(O)CH2OH、-(CH2)3NHC(O)CH2OBn、-(CH2)2O(CH2)2OH、-(CH2)3NHCH2OCH3、-(CH2)3NHCH2OCH2CH3、CH2SCH3、CH2S(O)CH3、CH2S(O)2CH3或-CH(CH2OH)2。
在一些实施方案中，R4选自以下基团中的任一个：
Figure BDA0003064795710001411
Figure BDA0003064795710001421
Figure BDA0003064795710001431
Figure BDA0003064795710001441
Figure BDA0003064795710001451
Figure BDA0003064795710001461
在一些实施方案中，
Figure BDA0003064795710001471
选自以下基团中的任一个：
Figure BDA0003064795710001472
Figure BDA0003064795710001481
Figure BDA0003064795710001491
Figure BDA0003064795710001501
Figure BDA0003064795710001511
Figure BDA0003064795710001521
Figure BDA0003064795710001531
Figure BDA0003064795710001541
Figure BDA0003064795710001551
在一些实施方案中，R4选自以下基团中的任一个：
Figure BDA0003064795710001561
Figure BDA0003064795710001571
在一些实施方案中，
Figure BDA0003064795710001572
选自以下基团中的任一个：
Figure BDA0003064795710001573
在一些实施方案中，式(III)的化合物还包含阴离子。如本文所述，和阴离子可以是能够与胺反应形成铵盐的任何阴离子。实例包括但不限于氯离子、溴离子、碘离子、氟离子、乙酸根、甲酸根、三氟乙酸根、二氟乙酸根、三氯乙酸根和磷酸根。
在一些实施方案中，本文所述各式中任一个的化合物适于制备供肌肉内施用的纳米颗粒组合物。
在一些实施方案中，R2和R3与它们所连接的原子一起形成杂环或碳环。在一些实施方案中，R2和R3与它们所连接的原子一起形成具有一个或多个选自N、O、S和P的杂原子的5至14元芳族或非芳族杂环。在一些实施方案中，R2和R3与它们所连接的原子一起形成任选取代的芳族或非芳族C3-20碳环(例如，C3-18碳环、C3-15碳环、C3-12碳环或C3-10碳环)。在一些实施方案中，R2和R3与它们所连接的原子一起形成C3-6碳环。在其他实施方案中，R2和R3与它们所连接的原子一起形成C6碳环，如环己基或苯基。在某些实施方案中，所述杂环或C3-6碳环被一个或多个烷基取代(例如在同一环原子处或者在相邻或不相邻的环原子处)。例如，R2和R3与它们所连接的原子一起可形成带有一个或多个C5烷基取代的环己基或苯基。在某些实施方案中，由R2和R3形成的杂环或C3-6碳环被碳环基团取代。例如，R2和R3与它们所连接的原子一起可形成环己基或苯基，该基团被环己基取代。在一些实施方案中，R2和R3与它们所连接的原子一起形成C7-15碳环，如环庚基、环十五烷基或萘基。
在一些实施方案中，R4选自-(CH2)nQ和-(CH2)nCHQR。在一些实施方案中，Q选自由以下组成的组：-OR、-OH、-O(CH2)nN(R)2、-OC(O)R、-CX3、-CN、-N(R)C(O)R、-N(H)C(O)R、-N(R)S(O)2R、-N(H)S(O)2R、-N(R)C(O)N(R)2、-N(H)C(O)N(R)2、-N(R)S(O)2R8、-N(H)C(O)N(H)(R)、-N(R)C(S)N(R)2、-N(H)C(S)N(R)2、-N(H)C(S)N(H)(R)和杂环。在其他实施方案中，Q选自由以下组成的组：咪唑、嘧啶和嘌呤。
在一些实施方案中，R2和R3与它们所连接的原子一起形成杂环或碳环。在一些实施方案中，R2和R3与它们所连接的原子一起形成C3-6碳环。在一些实施方案中，R2和R3与它们所连接的原子一起形成C6碳环。在一些实施方案中，R2和R3与它们所连接的原子一起形成苯基。在一些实施方案中，R2和R3与它们所连接的原子一起形成环己基。在一些实施方案中，R2和R3与它们所连接的原子一起形成杂环。在某些实施方案中，所述杂环或C3-6碳环被一个或多个烷基取代(例如在同一环原子处或者在相邻或不相邻的环原子处)。例如，R2和R3与它们所连接的原子一起可形成带有一个或多个C5烷基取代的苯基。
在一些实施方案中，R5和R6中至少一个在存在时是C1-3烷基，例如甲基。在一些实施方案中，邻近M的R5和R6中的一个是C1-3烷基，例如甲基，并且另一个是H。在一些实施方案中，邻近M的R5和R6中的一个是C1-3烷基，例如甲基，并且另一个是H，并且M是-OC(O)-或-C(O)O-。
在一些实施方案中，R5和R6中至多一个在存在时是C1-3烷基，例如甲基。在一些实施方案中，邻近M的R5和R6中的一个是C1-3烷基，例如甲基，并且另一个是H。在一些实施方案中，邻近M的R5和R6中的一个是C1-3烷基，例如甲基，并且另一个是H，并且M是-OC(O)-或-C(O)O-。
在一些实施方案中，R5和R6中至少一个在存在时是甲基。
当适用时，式(VI)、(VI-a)、(VII)、(VIIa)、(VIIb)、(VIIc)、(VIId)、(VIII)、(VIIIa)、(VIIIb)、(VIIIc)或(VIIId)中任一个的化合物包括一个或多个以下特征。
在一些实施方案中，r是0。在一些实施方案中，r是1。
在一些实施方案中，n是2、3或4。在一些实施方案中，n是2。在一些实施方案中，n是4。在一些实施方案中，n不是3。
在一些实施方案中，RN是H。在一些实施方案中，RN是C1-3烷基。例如，在一些实施方案中，RN是C1烷基。例如，在一些实施方案中，RN是C2烷基。例如，在一些实施方案中，RN是C2烷基。
在一些实施方案中，Xa是O。在一些实施方案中，Xa是S。在一些实施方案中，Xb是O。在一些实施方案中，Xb是S。
在一些实施方案中，R10选自由以下组成的组：N(R)2、-NH(CH2)t1N(R)2、-NH(CH2)p1O(CH2)q1N(R)2、-NH(CH2)s1OR、-N((CH2)s1OR)2和杂环。
在一些实施方案中，R10选自由以下组成的组：-NH(CH2)t1N(R)2、-NH(CH2)p1O(CH2)q1N(R)2、-NH(CH2)s1OR、-N((CH2)s1OR)2和杂环。
在一些其中R10是-NH(CH2)oN(R)2的实施方案中，o是2、3或4。
在一些其中-NH(CH2)p1O(CH2)q1N(R)2的实施方案中，p1是2。在一些其中-NH(CH2)p1O(CH2)q1N(R)2的实施方案中，q1是2。
在一些其中R10是-N((CH2)s1OR)2的实施方案中，s1是2。
在一些其中R10是-NH(CH2)oN(R)2、-NH(CH2)pO(CH2)qN(R)2、-NH(CH2)sOR或-N((CH2)sOR)2的实施方案中，R是H或C1-C3烷基。例如，在一些实施方案中，R是C1烷基。例如，在一些实施方案中，R是C2烷基。例如，在一些实施方案中，R是H。例如，在一些实施方案中，R是H并且一个R是C1-C3烷基。例如，在一些实施方案中，R是H并且一个R是C1烷基。例如，在一些实施方案中，R是H并且一个R是C2烷基。在一些其中R10是-NH(CH2)t1N(R)2、-NH(CH2)p1O(CH2)q1N(R)2、-NH(CH2)s1OR或-N((CH2)s1OR)2的实施方案中，每个R是C2-C4烷基。
例如，在一些实施方案中，一个R是H并且一个R是C2-C4烷基。在一些实施方案中，R10是杂环。例如，在一些实施方案中，R10是吗啉基。例如，在一些实施方案中，R10是甲基哌嗪基。
在一些实施方案中，R5和R6在每次出现时是H。
在一些实施方案中，式(I)的化合物选自由以下组成的组：
Figure BDA0003064795710001611
Figure BDA0003064795710001621
Figure BDA0003064795710001631
在另外的实施方案中，式(I I)的化合物选自由以下组成的组：
Figure BDA0003064795710001632
在一些实施方案中，式(I I)或式(I IV)的化合物选自由以下组成的组：
Figure BDA0003064795710001633
Figure BDA0003064795710001641
Figure BDA0003064795710001651
Figure BDA0003064795710001661
Figure BDA0003064795710001671
Figure BDA0003064795710001681
Figure BDA0003064795710001691
Figure BDA0003064795710001701
Figure BDA0003064795710001711
Figure BDA0003064795710001721
Figure BDA0003064795710001731
在一些实施方案中，本公开的脂质包含化合物I-340A：
Figure BDA0003064795710001732
根据式(I I)、(I IA)、I(IB)、I(II)、(I IIa)、(I IIb)、(I IIc)、(I IId)、(IIIe)、(I IIf)、(I IIg)、(I III)、(I VI)、(I VI-a)、(I VII)、(I VIII)、(I VIIa)、(IVIIIa)、(I VIIIb)、(I VIIb-1)、(I VIIb-2)、(I VIIb-3)、(I VIIc)、(I VIId)、(I VIIIc)或(I VIIId)的脂质的中心胺部分可在生理pH下质子化。因此，脂质可在生理pH下带正电荷或部分正电荷。这些脂质可称为阳离子性或可电离(氨基)脂质。脂质还可以是两性离子性的，即，同时带正电荷和负电荷的中性分子。
在一些方面，本公开的可电离脂质可以是式I(I IX)的化合物中的一种或多种，
Figure BDA0003064795710001741
或其盐或异构体，其中
W是
Figure BDA0003064795710001742
环A是或
Figure BDA0003064795710001743
t是1或2；
A1和A2各自独立地选自CH或N；
Z是CH2或不存在，其中当Z是CH2时，虚线(1)和(2)各自表示单键；而当Z不存在时，虚线(1)和(2)均不存在；
R1、R2、R3、R4和R5独立地选自由以下组成的组：C5-20烷基、C5-20烯基、-R”MR’、-R*YR”、-YR”和-R*OR”；
RX1和RX2各自独立地是H或C1-3烷基；
每个M独立地选自由以下组成的组：-C(O)O-、-OC(O)-、-OC(O)O-、-C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(S)S-、-SC(S)-、-CH(OH)-、-P(O)(OR’)O-、-S(O)2-、-C(O)S-、-SC(O)-、芳基和杂芳基；
M*是C1-C6烷基，
W1和W2各自独立地选自由以下组成的组：-O-和-N(R6)-；
每个R6独立地选自由以下组成的组：H和C1-5烷基；
X1、X2和X3独立地选自由以下组成的组：键、-CH2-、-(CH2)2-、-CHR-、-CHY-、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-(CH2)n-C(O)-、-C(O)-(CH2)n-、-(CH2)n-C(O)O-、-OC(O)-(CH2)n-、-(CH2)n-OC(O)-、-C(O)O-(CH2)n-、-CH(OH)-、-C(S)-和-CH(SH)-；
每个Y独立地是C3-6碳环；
每个R*独立地选自由以下组成的组：C1-12烷基和C2-12烯基；
每个R独立地选自由以下组成的组：C1-3烷基和C3-6碳环；
每个R’独立地选自由以下组成的组：C1-12烷基、C2-12烯基和H；
每个R”独立地选自由以下组成的组：C3-12烷基、C3-12烯基和-R*MR’；并且
n是1-6的整数；
其中当环A是
Figure BDA0003064795710001751
时，那么
i)X1、X2和X3中的至少一个不是-CH2-；和/或
ii)R1、R2、R3、R4和R5中的至少一个是-R”MR’。
在一些实施方案中，所述化合物为式(I IXa1)-(I IXa8)中的任一个：
Figure BDA0003064795710001761
Figure BDA0003064795710001771
在一些实施方案中，可电离脂质是美国申请号62/271,146、62/338,474、62/413,345和62/519,826以及PCT申请号PCT/US2016/068300中描述的化合物中的一种或多种。
在一些实施方案中，可电离脂质选自美国申请号62/519,826中描述的化合物1-156。
在一些实施方案中，可电离脂质选自美国申请号62/519,826中描述的化合物1-16、42-66、68-76和78-156。
在一些实施方案中，可电离脂质是
Figure BDA0003064795710001772
(化合物I-356(在本文中也称为化合物M)，或其盐。
在一些实施方案中，可电离脂质是
Figure BDA0003064795710001773
[化合物I-N]，或其盐。
在一些实施方案中，可电离脂质是
Figure BDA0003064795710001781
[化合物I-O]，或其盐。
在一些实施方案中，可电离脂质是
Figure BDA0003064795710001782
[化合物I-P]，或其盐。
在一些实施方案中，可电离脂质是
Figure BDA0003064795710001783
[化合物I-Q]，或其盐。
根据本文各式中任一个的脂质，例如具有式中(I I)、(I IA)、(IIB)、(II)、(IIa)、(IIb)、(IIc)、(IId)、(IIe)、(IIf)、(IIg)、(III)、(VI)、(VI-a)、(VII)、(VIII)、(VIIa)、(VIIIa)、(VIIIb)、(VIIb-1)、(VIIb-2)、(VIIb-3)、(VIIc)、(VIId)、(VIIIc)、(VIIId)、(IX)、(IXa1)、(IXa2)、(IXa3)、(IXa4)、(IXa5)、(IXa6)、(IXa7)或(IXa8)中任一个的化合物(为清楚起见，每一个都以字母I开头)的中心胺部分可在生理pH下质子化。因此，脂质可在生理pH下带正电荷或部分正电荷。这些脂质可称为阳离子性或可电离(氨基)脂质。脂质还可以是两性离子性的，即，同时带正电荷和负电荷的中性分子。
在一些实施方案中，本发明的可电离氨基脂质，例如具有式(I)、(IA)、(IB)、(II)、(IIa)、(IIb)、(IIc)、(IId)、(IIe)、(IIf)、(IIg)、(III)、(VI)、(VI-a)、(VII)、(VIII)、(VIIa)、(VIIIa)、(VIIIb)、(VIIb-1)、(VIIb-2)、(VIIb-3)、(VIIc)、(VIId)、(VIIIc)、(VIIId)、(IX)、(IXa1)、(IXa2)、(IXa3)、(IXa4)、(IXa5)、(IXa6)、(IXa7)或(IXa8)中任一个的化合物(为清楚起见，每一个都以字母I开头)在脂质组合物中的量的范围为约1mol％至99mol％。
在一个实施方案中，本发明的可电离氨基脂质，例如具有式(I)、(IA)、(IB)、(II)、(IIa)、(IIb)、(IIc)、(IId)、(IIe)、(IIf)、(IIg)、(III)、(VI)、(VI-a)、(VII)、(VIII)、(VIIa)、(VIIIa)、(VIIIb)、(VIIb-1)、(VIIb-2)、(VIIb-3)、(VIIc)、(VIId)、(VIIIc)、(VIIId)、(IX)、(IXa1)、(IXa2)、(IXa3)、(IXa4)、(IXa5)、(IXa6)、(IXa7)或(IXa8)中任一个的化合物(为清楚起见，每一个都以字母I开头)在脂质组合物中的量为至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99mol％。
在一个实施方案中，本发明的可电离氨基脂质，例如具有式(I)、(IA)、(IB)、(II)、(IIa)、(IIb)、(IIc)、(IId)、(IIe)、(IIf)、(IIg)、(III)、(VI)、(VI-a)、(VII)、(VIII)、(VIIa)、(VIIIa)、(VIIIb)、(VIIb-1)、(VIIb-2)、(VIIb-3)、(VIIc)、(VIId)、(VIIIc)、(VIIId)、(IX)、(IXa1)、(IXa2)、(IXa3)、(IXa4)、(IXa5)、(IXa6)、(IXa7)或(IXa8)中任一个的化合物(为清楚起见，每一个都以字母I开头)在脂质组合物中的量的范围为约30mol％至约70mol％、约35mol％至约65mol％、约40mol％至约60mol％和约45mol％至约55mol％。
在一个具体实施方案中，本发明的可电离氨基脂质，例如具有式(I)、(IA)、(IB)、(II)、(IIa)、(IIb)、(IIc)、(IId)、(IIe)、(IIf)、(IIg)、(III)、(VI)、(VI-a)、(VII)、(VIII)、(VIIa)、(VIIIa)、(VIIIb)、(VIIb-1)、(VIIb-2)、(VIIb-3)、(VIIc)、(VIId)、(VIIIc)、(VIIId)、(IX)、(IXa1)、(IXa2)、(IXa3)、(IXa4)、(IXa5)、(IXa6)、(IXa7)或(IXa8)中任一个的化合物(为清楚起见，每一个都以字母I开头)在脂质组合物中的量为约45mol％。
在一个具体实施方案中，本发明的可电离氨基脂质，例如具有式(I)、(IA)、(IB)、(II)、(IIa)、(IIb)、(IIc)、(IId)、(IIe)、(IIf)、(IIg)、(III)、(VI)、(VI-a)、(VII)、(VIII)、(VIIa)、(VIIIa)、(VIIIb)、(VIIb-1)、(VIIb-2)、(VIIb-3)、(VIIc)、(VIId)、(VIIIc)、(VIIId)、(IX)、(IXa1)、(IXa2)、(IXa3)、(IXa4)、(IXa5)、(IXa6)、(IXa7)或(IXa8)中任一个的化合物(为清楚起见，每一个都以字母I开头)在脂质组合物中的量为约40mol％。
在一个具体实施方案中，本发明的可电离氨基脂质，例如具有式(I)、(IA)、(IB)、(II)、(IIa)、(IIb)、(IIc)、(IId)、(IIe)、(IIf)、(IIg)、(III)、(VI)、(VI-a)、(VII)、(VIII)、(VIIa)、(VIIIa)、(VIIIb)、(VIIb-1)、(VIIb-2)、(VIIb-3)、(VIIc)、(VIId)、(VIIIc)、(VIIId)、(IX)、(IXa1)、(IXa2)、(IXa3)、(IXa4)、(IXa5)、(IXa6)、(IXa7)或(IXa8)中任一个的化合物(为清楚起见，每一个都以字母I开头)在脂质组合物中的量为约50mol％。
除本文所公开的可电离氨基脂质，例如具有式(I)、(IA)、(IB)、(II)、(IIa)、(IIb)、(IIc)、(IId)、(IIe)、(IIf)、(IIg)、(III)、(VI)、(VI-a)、(VII)、(VIII)、(VIIa)、(VIIIa)、(VIIIb)、(VIIb-1)、(VIIb-2)、(VIIb-3)、(VIIc)、(VIId)、(VIIIc)、(VIIId)、(IX)、(IXa1)、(IXa2)、(IXa3)、(IXa4)、(IXa5)、(IXa6)、(IXa7)或(IXa8)中任一个的化合物(为清楚起见，每一个都以字母I开头)外，本文所公开的基于脂质的组合物(例如，脂质纳米颗粒)可包含另外的组分，如胆固醇和/或胆固醇类似物、非阳离子辅助脂质、结构脂质、PEG-脂质以及它们的任何组合。
本发明的另外的可电离脂质可选自由以下组成的非限制性组：3-(双十二烷基氨基)-N1,N1,4-三-十二烷基-1-哌嗪乙胺(KL10)、N1-[2-(双十二烷基氨基)乙基]-N1,N4,N4-三-十二烷基-1,4-哌嗪二乙胺(KL22)、14,25-双十三烷基-15,18,21,24-四氮杂-三十八烷(KL25)、1,2-二亚油基氧基-N,N-二甲基氨基丙烷(DLin-DMA)、2,2-二亚油基-4-二甲基氨基甲基-[1,3]-二氧杂环戊烷(DLin-K-DMA)、4-(二甲基氨基)丁酸三十七碳-6,9,28,31-四烯-19-基酯(DLin-MC3-DMA)、2,2-二亚油基-4-(2-二甲基氨基乙基)-[1,3]-二氧杂环戊烷(DLin-KC2-DMA)、1,2-二油氧基-N,N-二甲基氨基丙烷(DODMA)、(13Z,165Z)-N,N-二甲基-3-壬基二十二碳-13-16-二烯-1-胺(L608)、2-({8-[(3β)-胆固-5-烯-3-基氧基]辛基}氧基)-N,N-二甲基-3-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]丙-1-胺(Octyl-CLinDMA)、(2R)-2-({8-[(3β)-胆固-5-烯-3-基氧基]辛基}氧基)-N,N-二甲基-3-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]丙-1-胺(Octyl-CLinDMA(2R))以及(2S)-2-({8-[(3β)-胆固-5-烯-3-基氧基]辛基}氧基)-N,N-二甲基-3-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]丙-1-胺(Octyl-CLinDMA(2S))。除这些之外，可电离氨基脂质还可以是包括环胺基的脂质。
本发明的可电离脂质也可以是国际公布号WO 2017/075531 A1中公开的化合物，所述专利以引用方式整体并入本文。例如，可电离氨基脂质包括但不限于：
Figure BDA0003064795710001811
Figure BDA0003064795710001821
以及它们的任何组合。
本发明的可电离脂质也可以是国际公布号WO 2015/199952 A1中公开的化合物，所述专利以引用方式整体并入本文。例如，可电离氨基脂质包括但不限于：
Figure BDA0003064795710001822
Figure BDA0003064795710001831
Figure BDA0003064795710001841
以及它们的任何组合。
在任一前述或相关方面，本公开的LNP的可电离脂质包括例如具有式(I)、(IA)、(IB)、(II)、(IIa)、(IIb)、(IIc)、(IId)、(IIe)、(IIf)、(IIg)、(III)、(VI)、(VI-a)、(VII)、(VIII)、(VIIa)、(VIIIa)、(VIIIb)、(VIIb-1)、(VIIb-2)、(VIIb-3)、(VIIc)、(VIId)、(VIIIc)、(VIIId)、(IX)、(IXa1)、(IXa2)、(IXa3)、(IXa4)、(IXa5)、(IXa6)、(IXa7)或(IXa8)中任一个的化合物(为清楚起见，每一个都以字母I开头)所包括的化合物。
在任一前述或相关方面，本公开的LNP的可电离脂质包括包含化合物编号I1-356中任一者的化合物。
在任一前述或相关方面，本公开的LNP的可电离脂质包括选自由以下组成的组的至少一种化合物：化合物编号I18(也称为化合物X或化合物II)、I 25(也称为化合物Y)、I48、I 50、I 109、I 111、I 113、I 181、I 182、I 244、I 292、I 301、I 321、I 322、I 326、I328、I 330、I 331和I 332。在另一个实施方案中，本公开的LNP的可电离脂质包括选自由以下组成的组的化合物：化合物编号I 18(也称为化合物X或化合物II)、I 25(也称为化合物Y)、I 48、I 50、I 109、I 111、I 181、I 182、I 292、I 301、I 321、I 326、I 328和I 330。在另一个实施方案中，本公开的LNP的可电离脂质包括选自由以下组成的组的化合物：化合物编号I 182、I 301、I 321和I 326。
在任一前述或相关方面，本发明化合物(例如，包含化合物编号1-356中任一者的化合物)的合成遵循2018年9月19日提交的美国临时专利申请号62/733,315中的合成描述。
代表性的合成路线：
化合物I-182：8-((3-((2-(甲基氨基)-3,4-二氧代环丁-1-烯-1-基)氨基)丙基)(8-(壬氧基)-8-氧代辛基)氨基)辛酸十七烷-9-基酯
3-甲氧基-4-(甲基氨基)环丁-3-烯-1,2-二酮
Figure BDA0003064795710001851
向3,4-二甲氧基-3-环丁烯-1,2-二酮(1g，7mmol)在100mL乙醚中的溶液中加入2M甲胺的THF(3.8mL，7.6mmol)溶液，几乎立即形成沉淀(ppt.)。将混合物在室温下搅拌24小时，然后过滤，将过滤固体用二乙醚洗涤并风干。将过滤固体溶解在热的EtOAc中，过滤，允许滤液冷却至室温，然后冷却至0℃，得到沉淀。通过过滤分离此物，用冷的EtOAc洗涤，风干，然后真空干燥，得到呈白色固体的3-甲氧基-4-(甲基氨基)环丁-3-烯-1,2-二酮(0.70g，5mmol，73％)。1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ:ppm 8.50(br.d,1H,J＝69Hz)；4.27(s,3H)；3.02(sdd,3H,J＝42Hz,4.5Hz)。
8-((3-((2-(甲基氨基)-3,4-二氧代环丁-1-烯-1-基)氨基)丙基)(8-(壬氧基)-8-氧代辛基)氨基)辛酸十七烷-9-基酯
Figure BDA0003064795710001861
向8-((3-氨基丙基)(8-(壬氧基)-8-氧代辛基)氨基)辛酸十七烷-9-基酯(200mg，0.28mmol)在10mL乙醇中的溶液中加入3-甲氧基-4-(甲基氨基)环丁-3-烯-1,2-二酮(39mg，0.28mmol)，将所得无色溶液在室温下搅拌20小时，之后经LC/MS确定无起始胺残留。将该溶液真空浓缩并将残余物通过硅胶色谱法(0-100％(1％NH4OH，20％MeOH在二氯甲烷中的混合物)的二氯甲烷溶液)纯化，得到呈胶状白色固体的8-((3-((2-(甲基氨基)-3,4-二氧代环丁-1-烯-1-基)氨基)丙基)(8-(壬氧基)-8-氧代辛基)氨基)辛酸十七烷-9-基酯(138mg，0.17mmol，60％)。UPLC/ELSD:RT＝3.Min。MS(ES):m/z(MH+)833.4，C51H95N3O6。1H NMR(300MHz,CDCl3)δ:ppm 7.86(br.s.,1H)；4.86(quint.,1H,J＝6Hz)；4.05(t,2H,J＝6Hz)；3.92(d,2H,J＝3Hz)；3.20(s,6H)；2.63(br.s,2H)；2.42(br.s,3H)；2.28(m,4H)；1.74(br.s,2H)；1.61(m,8H)；1.50(m,5H)；1.41(m,3H)；1.25(br.m,47H)；0.88(t,9H,J＝7.5Hz)。
化合物I-301：8-((3-((2-(甲基氨基)-3,4-二氧代环丁-1-烯-1-基)氨基)丙基)(8-氧代-8-(十一烷-3-基氧基)辛基)氨基)辛酸十七烷-9-基酯
Figure BDA0003064795710001862
以同化合物182类似的方式制备化合物I-301，不同之处在于使用8-((3-氨基丙基)(8-氧代-8-(十一烷-3-基氧基)辛基)氨基)辛酸十七烷-9-基酯(500mg，0.66mmol)代替8-((3-氨基丙基)(8-(壬氧基)-8-氧代辛基)氨基)辛酸十七烷-9-基酯。在水性处理之后，将残余物通过硅胶色谱法(0-50％(1％NH4OH，20％MeOH在二氯甲烷中的混合物)的二氯甲烷溶液)纯化，得到白色蜡状固体的8-((3-((2-(甲基氨基)-3,4-二氧代环丁-1-烯-1-基)氨基)丙基)(8-氧代-8-(十一烷-3-基氧基)辛基)氨基)辛酸十七烷-9-基酯(180mg，32％)。HPLC/UV(254nm):RT＝6.77min。MS(CI):m/z(MH+)860.7，C52H97N3O6。1H NMR(300MHz,CDCl3):δppm 4.86-4.79(m,2H)；3.66(bs,2H)；3.25(d,3H,J＝4.9Hz)；2.56-2.52(m,2H)；2.42-2.37(m,4H)；2.28(dd,4H,J＝2.7Hz,7.4Hz)；1.78-1.68(m,3H)；1.64-1.50(m,16H)；1.48-1.38(m,6H)；1.32-1.18(m,43H)；0.88-0.84(m,12H)。
(ii)胆固醇/结构脂质
在一些实施方案中，本文所述的LNP包含一种或多种结构脂质。如本文所用，术语“结构脂质”是指甾醇以及含有甾醇部分的脂质。在脂质纳米颗粒中并入结构脂质可帮助减轻颗粒中其他脂质的聚集。结构脂质可包括但不限于胆固醇、粪甾醇、麦角甾醇、菜子甾醇、番茄次碱、番茄碱、熊果酸、α-生育酚以及它们的混合物。在某些实施方案中，结构脂质是胆固醇。在某些实施方案中，结构脂质包括胆固醇和皮质类固醇(例如像，泼尼松龙、地塞米松、泼尼松和氢化可的松)，或它们的组合。
在一些实施方案中，结构脂质是甾醇。如本文所定义，“甾醇”是由类固醇组成的类固醇的亚组。在某些实施方案中，结构脂质是类固醇。在某些实施方案中，结构脂质是胆固醇。在某些实施方案中，结构脂质是胆固醇的类似物。在某些实施方案中，结构脂质是α-生育酚。此类脂质的实例包括但不限于以下：
Figure BDA0003064795710001881
本文所述的LNP包含一种或多种结构脂质。
如本文所用，术语“结构脂质”是指甾醇以及含有甾醇部分的脂质。在脂质纳米颗粒中并入结构脂质可帮助减轻颗粒中其他脂质的聚集。在某些实施方案中，结构脂质包括胆固醇和皮质类固醇(例如像，泼尼松龙、地塞米松、泼尼松和氢化可的松)，或它们的组合。
在一些实施方案中，结构脂质是甾醇。如本文所定义，“甾醇”是由类固醇组成的类固醇的亚组。结构脂质可包括但不限于甾醇(例如，植物甾醇或动物甾醇)。
在某些实施方案中，结构脂质是类固醇。例如，甾醇可包括但不限于胆固醇、β-谷甾醇、粪甾醇、麦角甾醇、谷甾醇、菜油甾醇、豆甾醇、菜子甾醇、麦角甾醇、番茄次碱、番茄碱、熊果酸、α-生育酚，或本文表1至表16中化合物S1-148中的任一者。
在某些实施方案中，结构脂质是胆固醇。在某些实施方案中，结构脂质是胆固醇的类似物。
在某些实施方案中，结构脂质是α-生育酚。
在一方面，本发明的结构脂质的特征在于具有式SI结构的化合物：
Figure BDA0003064795710001891
其中
R1a是H、任选取代的C1-C6烷基、任选取代的C2-C6烯基或任选取代的C2-C6炔基；
X是O或S；
R1b是H、任选取代的C1-C6烷基或
Figure BDA0003064795710001892
Rb1、Rb2和Rb3各自独立地是任选取代的C1-C6烷基或任选取代的C6-C10芳基；
R2是H或ORA，其中RA是H或任选取代的C1-C6烷基；
R3是H或
Figure BDA0003064795710001893
每个
Figure BDA0003064795710001906
独立地表示单键或双键；
W是CR4a或CR4aR4b，其中如果W与相邻碳原子之间存在双键，则W是CR4a；并且如果W与相邻碳之间存在单键，则W是CR4aR4b；
R4a和R4b各自独立地是H、卤基或任选取代的C1-C6烷基；
R5a和R5b各自独立地是H或ORA，或者R5a和R5b与它们所连接的原子一起组合形成
Figure BDA0003064795710001901
L1a不存在，或是
Figure BDA0003064795710001902
L1b不存在，或是
Figure BDA0003064795710001903
m是1、2或3；
L1c不存在，或是
Figure BDA0003064795710001904
并且
R6是任选取代的C3-C10环烷基、任选取代的C3-C10环烯基、任选取代的C6-C10芳基、任选取代的C2-C9杂环基或任选取代的C2-C9杂芳基，
或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，所述化合物具有式SIa的结构：
Figure BDA0003064795710001905
或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，所述化合物具有式SIb的结构：
Figure BDA0003064795710001911
或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，所述化合物具有式SIc的结构：
Figure BDA0003064795710001912
或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，所述化合物具有式SId的结构：
Figure BDA0003064795710001913
或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，L1a不存在。在一些实施方案中，L1a是
Figure BDA0003064795710001914
在一些实施方案中，L1a是
Figure BDA0003064795710001915
在一些实施方案中，L1b不存在。在一些实施方案中，L1b是
Figure BDA0003064795710001921
在一些实施方案中，L1b是
Figure BDA0003064795710001922
在一些实施方案中，m是1或2。在一些实施方案中，m是1。在一些实施方案中，m是2。
在一些实施方案中，L1c不存在。在一些实施方案中，L1c是
Figure BDA0003064795710001923
在一些实施方案中，L1c是
Figure BDA0003064795710001924
在一些实施方案中，R6是任选取代的C6-C10芳基。
在一些实施方案中，R6是
Figure BDA0003064795710001925
其中
n1是0、1、2、3、4或5；并且
每个R7独立地是卤基或任选取代的C1-C6烷基。
在一些实施方案中，每个R7独立地是
Figure BDA0003064795710001926
Figure BDA0003064795710001927
在一些实施方案中，n1是0、1或2。在一些实施方案中，n是0。在一些实施方案中，n1是1。在一些实施方案中，n1是2。
在一些实施方案中，R6是任选取代的C3-C10环烷基。
在一些实施方案中，R6是任选取代的C3-C10单环烷基。
在一些实施方案中，R6是
Figure BDA0003064795710001931
Figure BDA0003064795710001932
其中
n2是0、1、2、3、4或5；
n3是0、1、2、3、4、5、6或7；
n4是0、1、2、3、4、5、6、7、8或9；
n5是0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11；
n6是0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13；并且
每个R8独立地是卤基或任选取代的C1-C6烷基。
在一些实施方案中，每个R8独立地是
Figure BDA0003064795710001933
Figure BDA0003064795710001934
在一些实施方案中，R6是任选取代的C3-C10杂环基。
在一些实施方案中，R6是
Figure BDA0003064795710001941
在一些实施方案中，R6是任选取代的C3-C10环烯基。
在一些实施方案中，R6是
Figure BDA0003064795710001942
Figure BDA0003064795710001943
其中
n7是0、1、2、3、4、5、6或7；
n8是0、1、2、3、4、5、6、7、8或9；
n9是0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11；并且
每个R9独立地是卤基或任选取代的C1-C6烷基。
在一些实施方案中，R6是
Figure BDA0003064795710001944
Figure BDA0003064795710001945
在一些实施方案中，每个R9独立地是
Figure BDA0003064795710001946
Figure BDA0003064795710001947
在一些实施方案中，R6是任选取代的C2-C9杂环基。
在一些实施方案中，R6是
Figure BDA0003064795710001951
Figure BDA0003064795710001952
其中
n10是0、1、2、3、4或5；
n11是0、1、2、3、4或5；
n12是0、1、2、3、4、5、6或7；
n13是0、1、2、3、4、5、6、7、8或9；
每个R10独立地是卤基或任选取代的C1-C6烷基；并且
Y1和Y2各自独立地是O、S、NRB或CR11aR11b，
其中RB是H或任选取代的C1-C6烷基；
R11a和R11b各自独立地是H、卤基或任选取代的C1-C6烷基；并且
如果Y2是CR11aR11b，则Y1是O、S或NRB。
在一些实施方案中，Y1是O。
在一些实施方案中，Y2是O。在一些实施方案中，Y2是CR11aR11b。
在一些实施方案中，每个R10独立地是
Figure BDA0003064795710001953
Figure BDA0003064795710001961
在一些实施方案中，R6是任选取代的C2-C9杂芳基。
在一些实施方案中，R6是
Figure BDA0003064795710001962
其中
Y3是NRC、O或S
n14是0、1、2、3或4；
RC是H或任选取代的C1-C6烷基；并且
每个R12独立地是卤基或任选取代的C1-C6烷基。
在一些实施方案中，R6是
Figure BDA0003064795710001963
在一些实施方案中，R6是
Figure BDA0003064795710001964
在一方面，本发明的结构脂质的特征在于具有式SII结构的化合物：
Figure BDA0003064795710001971
其中
R1a是H、任选取代的C1-C6烷基、任选取代的C2-C6烯基或任选取代的C2-C6炔基；
X是O或S；
R1b是H或任选取代的C1-C6烷基；
R2是H或ORA，其中RA是H或任选取代的C1-C6烷基；
R3是H或
Figure BDA0003064795710001972
Figure BDA0003064795710001973
表示单键或双键；
W是CR4a或CR4aR4b，其中如果W与相邻碳原子之间存在双键，则W是CR4a；并且如果W与相邻碳之间存在单键，则W是CR4aR4b；
R4a和R4b各自独立地是H、卤基或任选取代的C1-C6烷基；
R5a和R5b各自独立地是H或ORA，或者R5a和R5b与它们所连接的原子一起组合形成
Figure BDA0003064795710001974
L1是任选取代的C1-C6亚烷基；并且
R13a、R13b和R13c各自独立地是任选取代的C1-C6烷基或任选取代的C6-C10芳基；
或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，所述化合物具有式SIIa的结构：
Figure BDA0003064795710001981
或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，所述化合物具有式SIIb的结构：
Figure BDA0003064795710001982
或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，L1是
Figure BDA0003064795710001983
Figure BDA0003064795710001984
在一些实施方案中，R13a、R13b和R13c各自独立地是
Figure BDA0003064795710001985
Figure BDA0003064795710001991
在一方面，本发明的结构脂质的特征在于具有式SIII结构的化合物：
Figure BDA0003064795710001992
其中
R1a是H、任选取代的C1-C6烷基、任选取代的C2-C6烯基或任选取代的C2-C6炔基；
X是O或S；
R1b是H或任选取代的C1-C6烷基；
R2是H或ORA，其中RA是H或任选取代的C1-C6烷基；
R3是H或
Figure BDA0003064795710001993
每个
Figure BDA0003064795710001994
独立地表示单键或双键；
W是CR4a或CR4aR4b，其中如果W与相邻碳原子之间存在双键，则W是CR4a；并且如果W与相邻碳之间存在单键，则W是CR4aR4b；
R4a和R4b各自独立地是H、卤基、羟基、任选取代的C1-C6烷基、-OS(O)2R4c，其中R4c是任选取代的C1-C6烷基或任选取代的C6-C10芳基；
R5a和R5b各自独立地是H或ORA，或者R5a和R5b与它们所连接的原子一起组合形成
Figure BDA0003064795710002001
R14是H或C1-C6烷基；并且
R15是
Figure BDA0003064795710002002
其中
R16是H或任选取代的C1-C6烷基；
R17b是H、OR17c、任选取代的C6-C10芳基或任选取代的C1-C6烷基；
R17c是H或任选取代的C1-C6烷基；
o1是0、1、2、3、4、5、6、7或8；
p1是0、1或2；
p2是0、1或2；
Z是CH2 O、S或NRD，其中RD是H或任选取代的C1-C6烷基；并且
每个R18独立地是卤基或任选取代的C1-C6烷基，
或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，所述化合物具有式SIIIa的结构：
Figure BDA0003064795710002011
或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，所述化合物具有式SIIIb的结构：
Figure BDA0003064795710002012
或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，R14是H、
Figure BDA0003064795710002013
Figure BDA0003064795710002014
Figure BDA0003064795710002021
在一些实施方案中，R14是
Figure BDA0003064795710002022
在一些实施方案中，R15是
Figure BDA0003064795710002023
在一些实施方案中，R15是
Figure BDA0003064795710002024
在一些实施方案中，R16是H。在一些实施方案中，R16是
Figure BDA0003064795710002025
Figure BDA0003064795710002026
在一些实施方案中，R17a是H。在一些实施方案中，R17a是任选取代的C1-C6烷基。
在一些实施方案中，R17b是H。在一些实施方案中，R17b是任选取代的C1-C6烷基。在一些实施方案中，R17b是OR17c。
在一些实施方案中，R17c是H、
Figure BDA0003064795710002027
在一些实施方案中，R17c是H。在一些实施方案中，R17c是
Figure BDA0003064795710002028
在一些实施方案中，R15是
Figure BDA0003064795710002029
在一些实施方案中，每个R18独立地是
Figure BDA0003064795710002031
Figure BDA0003064795710002032
在一些实施方案中，Z是CH2。在一些实施方案中，Z是O。在一些实施方案中，Z是NRD。
在一些实施方案中，o1是0、1、2、3、4、5或6。
在一些实施方案中，o1是0。在一些实施方案中，o1是1。在一些实施方案中，o1是2。在一些实施方案中，o1是3。在一些实施方案中，o1是4。在一些实施方案中，o1是5。在一些实施方案中，o1是6。
在一些实施方案中，p1是0或1。在一些实施方案中，p1是0。在一些实施方案中，p1是1。
在一些实施方案中，p2是0或1。在一些实施方案中，p2是0。在一些实施方案中，p2是1。
在一方面，本发明的结构脂质的特征在于具有式SIV结构的化合物：
Figure BDA0003064795710002041
其中
R1a是H、任选取代的C1-C6烷基、任选取代的C2-C6烯基或任选取代的C2-C6炔基；
X是O或S；
R1b是H或任选取代的C1-C6烷基；
R2是H或ORA，其中RA是H或任选取代的C1-C6烷基；
R3是H或
Figure BDA0003064795710002042
Figure BDA0003064795710002043
表示单键或双键；
W是CR4a或CR4aR4b，其中如果W与相邻碳原子之间存在双键，则W是CR4a；并且如果W与相邻碳之间存在单键，则W是CR4aR4b；
R4a和R4b各自独立地是H、卤基或任选取代的C1-C6烷基；
R5a和R5b各自独立地是H或ORA，或者R5a和R5b与它们所连接的原子一起组合形成
Figure BDA0003064795710002044
s是0或1；
R19是H或C1-C6烷基；
R20是C1-C6烷基；
R21是H或C1-C6烷基；
或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，所述化合物具有式SIVa的结构：
Figure BDA0003064795710002051
或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，所述化合物具有式SIVb的结构：
Figure BDA0003064795710002052
或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，R19是H、
Figure BDA0003064795710002053
Figure BDA0003064795710002061
在一些实施方案中，R19是
Figure BDA0003064795710002062
在一些实施方案中，R20是
Figure BDA0003064795710002063
Figure BDA0003064795710002064
在一些实施方案中，R21是H、
Figure BDA0003064795710002065
Figure BDA0003064795710002066
在一方面，本发明的结构脂质的特征在于具有式SV结构的化合物：
Figure BDA0003064795710002071
其中
R1a是H、任选取代的C1-C6烷基、任选取代的C2-C6烯基或任选取代的C2-C6炔基；
X是O或S；
R1b是H或任选取代的C1-C6烷基；
R2是H或ORA，其中RA是H或任选取代的C1-C6烷基；
R3是H或
Figure BDA0003064795710002072
Figure BDA0003064795710002073
表示单键或双键；
W是CR4a或CR4aR4b，其中如果W与相邻碳原子之间存在双键，则W是CR4a；并且如果W与相邻碳之间存在单键，则W是CR4aR4b；
R4a和R4b各自独立地是H、卤基或任选取代的C1-C6烷基；
R5a和R5b各自独立地是H或ORA，或者R5a和R5b与它们所连接的原子一起组合形成
Figure BDA0003064795710002074
R22是H或C1-C6烷基；并且
R23是卤基、羟基、任选取代的C1-C6烷基或任选取代的C1-C6杂烷基，
或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，所述化合物具有式SVa的结构：
Figure BDA0003064795710002081
或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，所述化合物具有式SVb的结构：
Figure BDA0003064795710002082
或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，R22是H、
Figure BDA0003064795710002083
Figure BDA0003064795710002084
Figure BDA0003064795710002091
在一些实施方案中，R22是
Figure BDA0003064795710002092
在一些实施方案中，R23是
Figure BDA0003064795710002093
Figure BDA0003064795710002094
在一方面，本发明的结构脂质的特征在于具有式SVI结构的化合物：
Figure BDA0003064795710002095
其中
R1a是H、任选取代的C1-C6烷基、任选取代的C2-C6烯基或任选取代的C2-C6炔基；
X是O或S；
R1b是H或任选取代的C1-C6烷基；
R2是H或ORA，其中RA是H或任选取代的C1-C6烷基；
R3是H或
Figure BDA0003064795710002101
Figure BDA0003064795710002102
表示单键或双键；
W是CR4a或CR4aR4b，其中如果W与相邻碳原子之间存在双键，则W是CR4a；并且如果W与相邻碳之间存在单键，则W是CR4aR4b；
R4a和R4b各自独立地是H、卤基或任选取代的C1-C6烷基；
R5a和R5b各自独立地是H或ORA，或者R5a和R5b与它们所连接的原子一起组合形成
Figure BDA0003064795710002103
R24是H或C1-C6烷基；并且
R25a和R25b各自是C1-C6烷基，
或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，所述化合物具有式SVIa的结构：
Figure BDA0003064795710002104
或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，所述化合物具有式SVIb的结构：
Figure BDA0003064795710002111
或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，R24是H、
Figure BDA0003064795710002112
Figure BDA0003064795710002113
在一些实施方案中，R24是
Figure BDA0003064795710002114
在一些实施方案中，R25a和R25b各自独立地是
Figure BDA0003064795710002115
Figure BDA0003064795710002116
Figure BDA0003064795710002121
在一方面，本发明的结构脂质的特征在于具有式SVII结构的化合物：
Figure BDA0003064795710002122
其中
R1a是H、任选取代的C1-C6烷基、任选取代的C2-C6烯基、任选取代的C2-C6炔基或
Figure BDA0003064795710002123
其中R1c、R1d和R1e各自独立地是任选取代的C1-C6烷基或任选取代的C6-C10芳基；
X是O或S；
R1b是H或任选取代的C1-C6烷基；
R2是H或ORA，其中RA是H或任选取代的C1-C6烷基；
R3是H或
Figure BDA0003064795710002124
Figure BDA0003064795710002125
表示单键或双键；
W是CR4a或CR4aR4b，其中如果W与相邻碳原子之间存在双键，则W是CR4a；并且如果W与相邻碳之间存在单键，则W是CR4aR4b；
R4a和R4b各自独立地是H、卤基或任选取代的C1-C6烷基；
R5a和R5b各自独立地是H或ORA，或者R5a和R5b与它们所连接的原子一起组合形成
Figure BDA0003064795710002131
q是0或1；
R26a和R26b各自独立地是H或任选取代的C1-C6烷基，或者R26a和R26b与它们所连接的原子一起组合形成
Figure BDA0003064795710002132
其中R26c和R26各自独立地是H或任选取代的C1-C6烷基；并且
R27a和R27b各自是H、羟基或任选取代的C1-C6烷基，
或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，所述化合物具有式SVIIa的结构：
Figure BDA0003064795710002133
或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，所述化合物具有式SVIIb的结构：
Figure BDA0003064795710002141
或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，R26a和R26b独立地是H、
Figure BDA0003064795710002142
Figure BDA0003064795710002143
在一些实施方案中，R26a和R26b与它们所连接的原子一起组合形成
Figure BDA0003064795710002144
在一些实施方案中，R26a和R26b与它们所连接的原子一起组合形成
Figure BDA0003064795710002145
在一些实施方案中，R26a和R26b与它们所连接的原子一起组合形成
Figure BDA0003064795710002146
在一些实施方案中，其中R26c和R26各自独立地是
Figure BDA0003064795710002147
Figure BDA0003064795710002151
在一些实施方案中，R27a和R27b各自是H、羟基或任选取代的C1-C3烷基。
在一些实施方案中，R27a和R27b各自独立地是H、羟基、
Figure BDA0003064795710002152
Figure BDA0003064795710002153
在一方面，本发明的结构脂质的特征在于具有式SVIII结构的化合物：
Figure BDA0003064795710002154
其中
R1a是H、任选取代的C1-C6烷基、任选取代的C2-C6烯基或任选取代的C2-C6炔基；
X是O或S；
R1b是H或任选取代的C1-C6烷基；
R2是H或ORA，其中RA是H或任选取代的C1-C6烷基；
R3是H或
Figure BDA0003064795710002161
Figure BDA0003064795710002162
表示单键或双键；
W是CR4a或CR4aR4b，其中如果W与相邻碳原子之间存在双键，则W是CR4a；并且如果W与相邻碳之间存在单键，则W是CR4aR4b；
R4a和R4b各自独立地是H、卤基或任选取代的C1-C6烷基；
R5a和R5b各自独立地是H或ORA，或者R5a和R5b与它们所连接的原子一起组合形成
Figure BDA0003064795710002163
R28是H或任选取代的C1-C6烷基；
r是1、2或3；
每个R29独立地是H或任选取代的C1-C6烷基；并且
R30a、R30b和R30c各自是C1-C6烷基，
或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，所述化合物具有式SVIIIa的结构：
Figure BDA0003064795710002164
Figure BDA0003064795710002171
或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，所述化合物具有式SVIIIb的结构：
Figure BDA0003064795710002172
或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，R28是H、
Figure BDA0003064795710002173
Figure BDA0003064795710002174
在一些实施方案中，R28是
Figure BDA0003064795710002175
在一些实施方案中，R30a、R30b和R30c各自独立地是
Figure BDA0003064795710002176
Figure BDA0003064795710002177
Figure BDA0003064795710002181
在一些实施方案中，r是1。在一些实施方案中，r是2。在一些实施方案中，r是3。
在一些实施方案中，每个R29独立地是H、
Figure BDA0003064795710002182
Figure BDA0003064795710002183
在一些实施方案中，每个R29独立地是H或
Figure BDA0003064795710002184
在一方面，本发明的结构脂质的特征在于具有式SIX结构的化合物：
Figure BDA0003064795710002185
其中
R1a是H、任选取代的C1-C6烷基、任选取代的C2-C6烯基或任选取代的C2-C6炔基；
X是O或S；
R1b是H或任选取代的C1-C6烷基；
R2是H或ORA，其中RA是H或任选取代的C1-C6烷基；
R3是H或
Figure BDA0003064795710002191
Figure BDA0003064795710002192
表示单键或双键；
W是CR4a或CR4aR4b，其中如果W与相邻碳原子之间存在双键，则W是CR4a；并且如果W与相邻碳之间存在单键，则W是CR4aR4b；
R4a和R4b各自独立地是H、卤基或任选取代的C1-C6烷基；
R5a和R5b各自独立地是H或ORA，或者R5a和R5b与它们所连接的原子一起组合形成
Figure BDA0003064795710002193
R31是H或C1-C6烷基；并且
R32a和R32b各自是C1-C6烷基，
或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，所述化合物具有式SIXa的结构：
Figure BDA0003064795710002194
Figure BDA0003064795710002201
或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，所述化合物具有式SIXb的结构：
Figure BDA0003064795710002202
或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，R31是H、
Figure BDA0003064795710002203
Figure BDA0003064795710002204
在一些实施方案中，R31是
Figure BDA0003064795710002205
在一些实施方案中，R32a和R32b各自独立地是
Figure BDA0003064795710002206
Figure BDA0003064795710002207
Figure BDA0003064795710002211
在一方面，本发明的结构脂质的特征在于具有式SX结构的化合物：
Figure BDA0003064795710002212
其中
R1a是H、任选取代的C1-C6烷基、任选取代的C2-C6烯基或任选取代的C2-C6炔基；
X是O或S；
R2是H或ORA，其中RA是H或任选取代的C1-C6烷基；
R3是H或
Figure BDA0003064795710002213
Figure BDA0003064795710002214
表示单键或双键；
W是CR4a或CR4aR4b，其中如果W与相邻碳原子之间存在双键，则W是CR4a；并且如果W与相邻碳之间存在单键，则W是CR4aR4b；
R4a和R4b各自独立地是H、卤基或任选取代的C1-C6烷基；
R5a和R5b各自独立地是H或ORA，或者R5a和R5b与它们所连接的原子一起组合形成
Figure BDA0003064795710002221
R33a是任选取代的C1-C6烷基或
Figure BDA0003064795710002222
其中R35是任选取代的C1-C6烷基或任选取代的C6-C10芳基；
R33b是H或任选取代的C1-C6烷基；或者
R35和R33b与它们所连接的原子一起形成任选取代的C3-C9杂环基；并且
R34是任选取代的C1-C6烷基或任选取代的C1-C6杂烷基，
或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，所述化合物具有式SXa的结构：
Figure BDA0003064795710002223
或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，所述化合物具有式SXb的结构：
Figure BDA0003064795710002224
Figure BDA0003064795710002231
或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，R33a是
Figure BDA0003064795710002232
在一些实施方案中，R35是
Figure BDA0003064795710002233
在一些实施方案中，R35是
Figure BDA0003064795710002234
其中
t是0、1、2、3、4或5；并且
每个R36独立地是卤基、羟基、任选取代的C1-C6烷基或任选取代的C1-C6杂烷基。
在一些实施方案中，R34是
Figure BDA0003064795710002235
其中u是0、1、2、3或4。
在一些实施方案中，u是3或4。
在一方面，本发明的结构脂质的特征在于具有式SXI结构的化合物：
Figure BDA0003064795710002236
其中
R1a是H、任选取代的C1-C6烷基、任选取代的C2-C6烯基或任选取代的C2-C6炔基；
X是O或S；
R2是H或ORA，其中RA是H或任选取代的C1-C6烷基；
R3是H或
Figure BDA0003064795710002241
Figure BDA0003064795710002242
表示单键或双键；
W是CR4a或CR4aR4b，其中如果W与相邻碳原子之间存在双键，则W是CR4a；并且如果W与相邻碳之间存在单键，则W是CR4aR4b；
R4a和R4b各自独立地是H、卤基或任选取代的C1-C6烷基；
R5a和R5b各自独立地是H或ORA，或者R5a和R5b与它们所连接的原子一起组合形成
Figure BDA0003064795710002243
并且
R37a和R37b各自独立地是任选取代的C1-C6烷基、任选取代的C1-C6杂烷基、卤基或羟基，
或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，所述化合物具有式SXIa的结构：
Figure BDA0003064795710002244
Figure BDA0003064795710002251
或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，所述化合物具有式SXIb的结构：
Figure BDA0003064795710002252
或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，R37a是羟基。
在一些实施方案中，R37b是
Figure BDA0003064795710002253
Figure BDA0003064795710002254
在一方面，本发明的结构脂质的特征在于具有式SXII结构的化合物：
Figure BDA0003064795710002255
Figure BDA0003064795710002261
其中
R1a是H、任选取代的C1-C6烷基、任选取代的C2-C6烯基或任选取代的C2-C6炔基；
X是O或S；
R2是H或ORA，其中RA是H或任选取代的C1-C6烷基；
R3是H或
Figure BDA0003064795710002262
Figure BDA0003064795710002263
表示单键或双键；
W是CR4a或CR4aR4b，其中如果W与相邻碳原子之间存在双键，则W是CR4a；并且如果W与相邻碳之间存在单键，则W是CR4aR4b；
R4a和R4b各自独立地是H、卤基或任选取代的C1-C6烷基；
R5a和R5b各自独立地是H或ORA，或者R5a和R5b与它们所连接的原子一起组合形成
Figure BDA0003064795710002264
并且
Q是O、S或NRE，其中RE是H或任选取代的C1-C6烷基；并且
R38是任选取代的C1-C6烷基；
或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，所述化合物具有式SXIIa的结构：
Figure BDA0003064795710002271
或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，所述化合物具有式SXIIb的结构：
Figure BDA0003064795710002272
或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，Q是NRE。
在一些实施方案中，RE是H或
Figure BDA0003064795710002273
在一些实施方案中，RE是H。在一些实施方案中，RE是
Figure BDA0003064795710002274
在一些实施方案中，R38是
Figure BDA0003064795710002275
其中u是0、1、2、3或4。
在一些实施方案中，X是O。
在一些实施方案中，R1a是H或任选取代的C1-C6烷基。
在一些实施方案中，R1a是H。
在一些实施方案中，R1b是H或任选取代的C1-C6烷基。
在一些实施方案中，R1b是H。
在一些实施方案中，R2是H。
在一些实施方案中，R4a是H。
在一些实施方案中，R4b是H。
在一些实施方案中，
Figure BDA0003064795710002281
表示双键。
在一些实施方案中，R3是H。在一些实施方案中，R3是
Figure BDA0003064795710002282
在一些实施方案中，R5a是H。
在一些实施方案中，R5b是H。
在一方面，本发明的特征在于具有表1中的化合物S-1-42、S-150、S-154、S-162-165、S-169-172和S-184中任一者的结构的化合物，或其任何药学上可接受的盐。如本文所用，“CMPD”是指“化合物”。
表1.式SI的化合物
Figure BDA0003064795710002283
Figure BDA0003064795710002291
Figure BDA0003064795710002301
Figure BDA0003064795710002311
Figure BDA0003064795710002321
在一方面，本发明的特征在于具有表2中的化合物S-43-50和S-175-178中任一者的结构的化合物，或其任何药学上可接受的盐。
表2.式SII的化合物
Figure BDA0003064795710002322
Figure BDA0003064795710002331
在一方面，本发明的特征在于具有表3中的化合物S-51-67、S-149和S-153中任一者的结构的化合物，或其任何药学上可接受的盐。
表3.式SIII的化合物
Figure BDA0003064795710002332
Figure BDA0003064795710002341
在一方面，本发明的特征在于具有表4中的化合物S-68-73中任一者的结构的化合物，或其任何药学上可接受的盐。
表4.式SIV的化合物
Figure BDA0003064795710002351
在一方面，本发明的特征在于具有表5中的化合物S-74-78中任一者的结构的化合物，或其任何药学上可接受的盐。
表5.式SV的化合物
Figure BDA0003064795710002352
Figure BDA0003064795710002361
在一方面，本发明的特征在于具有表6中的化合物S-79或S-80中任一者的结构的化合物，或其任何药学上可接受的盐。
表6.式SVI的化合物
Figure BDA0003064795710002362
在一方面，本发明的特征在于具有表7中的化合物S-81-87、S-152和S-157中任一者的结构的化合物，或其任何药学上可接受的盐。
表7.式S-VII的化合物
Figure BDA0003064795710002363
Figure BDA0003064795710002371
在一方面，本发明的特征在于具有表8中的化合物S-88-97中任一者的结构的化合物，或其任何药学上可接受的盐。
表8.式SVIII的化合物
Figure BDA0003064795710002372
Figure BDA0003064795710002381
在一方面，本发明的特征在于具有表9中的化合物S-98-105和S-180-182中任一者的结构的化合物，或其任何药学上可接受的盐。
表9.式SIX的化合物
Figure BDA0003064795710002382
Figure BDA0003064795710002391
在一方面，本发明的特征在于具有表10中的化合物S-106的结构的化合物，或其任何药学上可接受的盐。
表10.式SX的化合物
Figure BDA0003064795710002392
在一方面，本发明的特征在于具有表11中的化合物S-107或S-108的结构的化合物，或其任何药学上可接受的盐。
表11.式SXI的化合物
Figure BDA0003064795710002393
在一方面，本发明的特征在于具有表12中的化合物S-109的结构的化合物，或其任何药学上可接受的盐。
表12.式SXII的化合物
Figure BDA0003064795710002401
在一方面，本发明的特征在于具有表13中的化合物S-110-130、S-155、S-156、S-158、S-160、S-161、S-166-168、S-173、S-174和S-179中任一者的结构的化合物，或其任何药学上可接受的盐。
表13.本发明的化合物
Figure BDA0003064795710002402
Figure BDA0003064795710002411
Figure BDA0003064795710002421
在一方面，本发明的特征在于具有表14中的化合物S-131-133中任一者的结构的化合物，或其任何药学上可接受的盐。
表14.本发明的化合物
Figure BDA0003064795710002422
Figure BDA0003064795710002431
在一方面，本发明的特征在于具有表15中的化合物S-134-148、S-151和S-159中任一者的结构的化合物，或其任何药学上可接受的盐。
表15.本发明的化合物
Figure BDA0003064795710002432
Figure BDA0003064795710002441
本发明的脂质纳米颗粒的一种或多种结构脂质可以是结构脂质的组合物(例如，两种或更多种结构脂质的混合物，三种或更多种结构脂质的混合物，四种或更多种结构脂质的混合物，或五种或多种结构脂质的混合物)。结构脂质的组合物可包括但不限于甾醇(例如，甾醇可包括但不限于胆固醇、β-谷甾醇、粪甾醇、麦角甾醇、谷甾醇、菜油甾醇、豆甾醇、菜子甾醇、麦角甾醇、番茄次碱、番茄碱、熊果酸、α-生育酚，或表15中化合物134-148、151和159中的任一者)的任何组合。例如，本发明的脂质纳米颗粒的一种或多种结构脂质可以是表16中的组合物183。
表16.结构脂质组合物
Figure BDA0003064795710002442
Figure BDA0003064795710002451
组合物S-183是化合物S-141、S-140、S-143和S-148的混合物。在一些实施方案中，组合物S-183包含约35％至约45％的化合物S-141、约20％至约30％的化合物S-140、约20％至约30％的化合物S-143和约5％至约15％的化合物S-148。在一些实施方案中，组合物183包含约40％的化合物S-141、约25％的化合物S-140、约25％的化合物S-143和约10％的化合物S-148。
在一些实施方案中，结构脂质是植物甾醇。在一些实施方案中，所述植物甾醇是单独的或组合的谷甾醇、豆甾醇、菜油甾醇、谷甾烷醇、菜油甾烷醇、菜子甾醇、岩藻甾醇、β-谷甾醇、豆甾烷醇、β-谷甾烷醇、麦角甾醇、羽扇豆醇、环阿屯醇、Δ5-燕麦甾醇、Δ7-燕麦甾醇或Δ7-豆甾醇，包括其类似物、盐或酯。在一些实施方案中，本公开的LNP的植物甾醇组分是单一植物甾醇。在一些实施方案中，本公开的LNP的植物甾醇组分是不同植物甾醇(例如，2、3、4、5或6种不同植物甾醇)的混合物。在一些实施方案中，本公开的LNP的植物甾醇组分是一种或多种植物甾醇和一种或多种动物甾醇的混合物，如植物甾醇(例如，谷甾醇，如β-谷甾醇)和胆固醇的混合物。
化合物的比例
本发明的脂质纳米颗粒可包含如本文所述的结构组分。脂质纳米颗粒的结构组分可以是化合物S-1-148中的任一者，本发明的一种或多种结构化合物的混合物和/或化合物S-1-148中的任一者与胆固醇和/或植物甾醇的组合。
例如，脂质纳米颗粒的结构组分可以是本发明的一种或多种结构化合物(例如，化合物S-1-148中任一者)与胆固醇的混合物。脂质纳米颗粒中存在的结构化合物相对于胆固醇的mol％可为0-99mol％。脂质纳米颗粒中存在的结构化合物相对于胆固醇的mol％可为约10mol％、20mol％、30mol％、40mol％、50mol％、60mol％、70mol％、80mol％或90mol％。
在一方面，本发明的特征在于一种包含两种或更多种甾醇的组合物，其中所述两种或更多种甾醇包括β-谷甾醇、谷甾烷醇、菜油甾醇、豆甾醇和菜子甾醇中的至少两种。所述组合物可另外包含胆固醇。在一个实施方案中，β-谷甾醇占组合物中非胆固醇甾醇的约35％-99％，例如，约40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或更高。
在另一方面，本发明的特征在于一种包含两种或更多种甾醇的组合物，其中所述两种或更多种甾醇包括β-谷甾醇和菜油甾醇，其中β-谷甾醇占组合物中甾醇的95％-99.9％，并且菜油甾醇占组合物中甾醇的0.1％-5％。
在一些实施方案中，所述组合物还包含谷甾烷醇。在一些实施方案中，β-谷甾醇占组合物中甾醇的95％-99.9％，菜油甾醇占0.05％-4.95％，并且谷甾烷醇占0.05％-4.95％。
在另一方面，本发明的特征在于一种包含两种或更多种甾醇的组合物，其中所述两种或更多种甾醇包括β-谷甾醇和谷甾烷醇，其中β-谷甾醇占组合物中甾醇的95％-99.9％，并且谷甾烷醇占组合物中甾醇的0.1％-5％。
在一些实施方案中，所述组合物还包含菜油甾醇。在一些实施方案中，β-谷甾醇占组合物中甾醇的95％-99.9％，菜油甾醇占0.05％-4.95％，并且谷甾烷醇占0.05％-4.95％。
在一些实施方案中，所述组合物还包含菜油甾醇。在一些实施方案中，β-谷甾醇占组合物中甾醇的75％-80％，菜油甾醇占5％-10％，并且谷甾烷醇占10％-15％。
在一些实施方案中，所述组合物还包含另外的甾醇。在一些实施方案中，β-谷甾醇占组合物中甾醇的35％-45％，豆甾醇占20％-30％，菜油甾醇占20％-30％，并且菜子甾醇占1％-5％。
在另一方面，本发明的特征在于一种包含多种脂质纳米颗粒的组合物，其中所述多种脂质纳米颗粒包含可电离脂质和两种或更多种甾醇，其中所述两种或更多种甾醇包括β-谷甾醇和菜油甾醇，并且β-谷甾醇占组合物中甾醇的95％-99.9％，并且菜油甾醇占组合物中甾醇的0.1％-5％。
在一些实施方案中，所述两种或更多种甾醇还包括谷甾烷醇。在一些实施方案中，β-谷甾醇占组合物中甾醇的95％-99.9％，菜油甾醇占0.05％-4.95％，并且谷甾烷醇占0.05％-4.95％。
在另一方面，本发明的特征在于一种包含多种脂质纳米颗粒的组合物，其中所述多种脂质纳米颗粒包含可电离脂质和两种或更多种甾醇，其中所述两种或更多种甾醇包括β-谷甾醇和谷甾烷醇，并且β-谷甾醇占组合物中甾醇的95％-99.9％，并且谷甾烷醇占组合物中甾醇的0.1％-5％。
在一些实施方案中，两种或更多种固醇还包括菜油甾醇。在一些实施方案中，β-谷甾醇占组合物中甾醇的95％-99.9％，菜油甾醇占0.05％-4.95％，并且谷甾烷醇占0.05％-4.95％。
(iii)非阳离子辅助脂质/磷脂
在一些实施方案中，本文所述的基于脂质的组合物(例如，LNP)包含一种或多种非阳离子辅助脂质。在一些实施方案中，所述非阳离子辅助脂质是磷脂。在一些实施方案中，所述非阳离子辅助脂质是磷脂替代物或替换物。
如本文所用，术语“非阳离子辅助脂质”是指包含至少一个长度为至少8个碳的脂肪酸链和至少一个极性头基部分的脂质。在一个实施方案中，辅助脂质不是磷脂酰胆碱(PC)。在一个实施方案中，非阳离子辅助脂质是磷脂或磷脂替代物。在一些实施方案中，磷脂或磷脂替代物可以是，例如，一种或多种饱和或(多)不饱和磷脂，或磷脂替代物，或它们的组合。一般来讲，磷脂包含磷脂部分和一个或多个脂肪酸部分。
磷脂部分可选自，例如，由磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、磷脂酰丝氨酸、磷脂酸、2-溶血磷脂酰胆碱和鞘磷脂组成的非限制性组。
脂肪酸部分可选自，例如，由月桂酸、肉豆蔻酸、肉豆蔻脑酸、棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、α-亚麻酸、芥酸、植酸、花生酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸、山嵛酸、二十二碳五烯酸和二十二碳六烯酸组成的非限制性组。
磷脂包括但不限于甘油磷脂类如磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油和磷脂酸。磷脂还包括磷酸鞘脂类，如鞘磷脂。
在一些实施方案中，非阳离子辅助脂质是DSPC类似物、DSPC替代物、油酸或油酸类似物。
在一些实施方案中，非阳离子辅助脂质是非磷脂酰胆碱(PC)两性离子脂质、DSPC类似物、油酸、油酸类似物或1,2-二硬脂酰基-i77-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)替代物。
磷脂
本文所公开的药物组合物的脂质组合物可包含一种或多种非阳离子辅助脂质。在一些实施方案中，非阳离子辅助脂质是磷脂，例如，一种或多种饱和或(多)不饱和磷脂或它们的组合。一般来讲，磷脂包含磷脂部分和一个或多个脂肪酸部分。如本文所用，“磷脂”是包括磷酸酯部分和一个或多个碳链如不饱和脂肪酸链的脂质。磷脂可包括一个或多个(例如，双键或三键)(例如，一处或多处不饱和)。磷脂或其类似物或衍生物可包括胆碱。磷脂或其类似物或衍生物可不包括胆碱。特定的磷脂可促进与膜的融合。例如，阳离子磷脂可与膜(例如，细胞膜或细胞内膜)的一种或多种带负电的磷脂相互作用。磷脂与膜融合可使含脂质的组合物中的一种或多种成分穿过膜，由此允许例如将所述一种或多种成分递送至细胞。
磷脂部分可选自，例如，由磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、磷脂酰丝氨酸、磷脂酸、2-溶血磷脂酰胆碱和鞘磷脂组成的非限制性组。
脂肪酸部分可选自，例如，由月桂酸、肉豆蔻酸、肉豆蔻脑酸、棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、α-亚麻酸、芥酸、植酸、花生酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸、山嵛酸、二十二碳五烯酸和二十二碳六烯酸组成的非限制性组。
特定的磷脂可促进与膜的融合。例如，阳离子磷脂可与膜(例如，细胞膜或细胞内膜)的一种或多种带负电的磷脂相互作用。磷脂与膜融合可使含脂质的组合物(例如，LNP)中的一种或多种成分(例如，治疗剂)穿过膜，由此允许例如将所述一种或多种成分递送至靶组织。
本公开的脂质纳米颗粒的脂质组分可包括一种或多种磷脂如一种或多种(多)不饱和脂质。磷脂可组装成一个或多个脂质双层。一般来讲，磷脂可包括磷脂部分和一个或多个脂肪酸部分。例如，磷脂可以是根据式(H III)的脂质：
Figure BDA0003064795710002501
其中Rp代表磷脂部分，并且R1和R2代表可相同或不同的具有或不具有不饱和度的脂肪酸部分。磷脂部分可选自由磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、磷脂酰丝氨酸、磷脂酸、2-溶血磷脂酰胆碱和鞘磷脂组成的非限制性组。脂肪酸部分可选自由月桂酸、肉豆蔻酸、肉豆蔻脑酸、棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、α-亚麻酸、芥酸、植酸、花生酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸、山嵛酸、二十二碳五烯酸和二十二碳六烯酸组成的非限制性组。还考虑了非天然物质，包括具有修饰和取代(包括支化、氧化、环化和炔烃)的天然物质。例如，磷脂可用一种或多种炔烃(例如，其中一个或多个双键被三键置换的烯基)官能化或交联。在适当的反应条件下，炔基在暴露于叠氮化物时可经历铜催化的环加成反应。此类反应可用于官能化LNP的脂质双层以促进膜渗透或细胞识别或者将LNP与有用组分(如靶向或成像部分(例如染料))缀合。每种可能性代表本发明的一个单独的实施方案。
可用于本文所述的组合物和方法中的磷脂可选自由以下组成的非限制性组：1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、1,2-二亚油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DLPC)、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-磷酸胆碱(DMPC)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)、1,2-双十一烷酰基-sn-甘油-磷酸胆碱(DUPC)、1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(POPC)、1,2-二-O-十八碳烯基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(18:0Diether PC)、1-油酰基-2-胆固醇基半琥珀酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(OChemsPC)、1-十六烷基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(C16 Lyso PC)、1,2-二亚麻酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(18:3(cis)PC)、1,2-二花生四烯酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DAPC)、1,2-双二十二碳六烯酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(22:6(cis)PC)1,2-二植烷酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(4ME 16.0Pe)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DSPE)、1,2-二亚油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(PE(18:2/18:2)、1,2-二亚麻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(PE 18:3(9Z，12Z，15Z)、1,2-二花生四烯酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DAPE 18:3(9Z，12Z，15Z)、1,2-双二十二碳六烯酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(22:6(顺式)PE)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸-rac-(1-甘油)钠盐(DOPG)和鞘磷脂。每种可能性代表本发明的一个单独的实施方案。
在一些实施方案中，LNP包括DSPC。在某些实施方案中，LNP包括DOPE。在一些实施方案中，LNP包括DMPE。在一些实施方案中，LNP包括DSPC和DOPE两者。
在一个实施方案中，用于LNP中的非阳离子辅助脂质选自由以下组成的组：DSPC、DMPE和DOPC或它们的组合。
磷脂包括但不限于甘油磷脂类如磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油和磷脂酸。磷脂还包括磷酸鞘脂类，如鞘磷脂。
磷脂的实例包括但不限于以下：
Figure BDA0003064795710002511
Figure BDA0003064795710002521
Figure BDA0003064795710002531
Figure BDA0003064795710002541
Figure BDA0003064795710002551
在某些实施方案中，可用于或潜在可用于本发明的磷脂是DSPC(1,2-双十八酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱)的类似物或变体。在某些实施方案中，可用于或潜在可用于本发明的磷脂是式(H IX)的化合物：
Figure BDA0003064795710002552
或其盐，其中：
每个R1独立地是任选取代的烷基；或者任选地两个R1与居间原子连接在一起以形成任选取代的单环碳环基或任选取代的单环杂环基；或者任选地三个R1与居间原子连接在一起以形成任选取代的双环碳环基或任选取代的双环杂环基；或者
n是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
m是0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
A具有式：
Figure BDA0003064795710002561
L2的每个实例独立地是键或任选取代的C1-6亚烷基，其中所述任选取代的C1-6亚烷基的一个亚甲基单元任选地被-O-、-N(RN)-、-S-、-C(O)-、-C(O)N(RN)-、-NRNC(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-OC(O)O-、-OC(O)N(RN)-、-NRNC(O)O-或-NRNC(O)N(RN)-置换；
R2的每个实例独立地是任选取代的C1-30烷基、任选取代的C1-30烯基或任选取代的C1-30炔基；任选地其中R2的一个或多个亚甲基单元独立地被任选取代的亚碳环基、任选取代的亚杂环基、任选取代的亚芳基、任选取代的亚杂芳基、-N(RN)-、-O-、-S-、-C(O)-、-C(O)N(RN)-、-NRNC(O)-、-NRNC(O)N(RN)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-OC(O)O-、-OC(O)N(RN)-、-NRNC(O)O-、-C(O)S-、-SC(O)-、-C(＝NRN)-、-C(＝NRN)N(RN)-、-NRNC(＝NRN)-、-NRNC(＝NRN)N(RN)-、-C(S)-、-C(S)N(RN)-、-NRNC(S)-、-NRNC(S)N(RN)-、-S(O)-、-OS(O)-、-S(O)O-、-OS(O)O-、-OS(O)2-、-S(O)2O-、-OS(O)2O-、-N(RN)S(O)-、-S(O)N(RN)-、-N(RN)S(O)N(RN)-、-OS(O)N(RN)-、-N(RN)S(O)O-、-S(O)2-、-N(RN)S(O)2-、-S(O)2N(RN)-、-N(RN)S(O)2N(RN)-、-OS(O)2N(RN)-或-N(RN)S(O)2O-置换；
RN的每个实例独立地是氢、任选取代的烷基或氮保护基；
B环是任选取代的碳环基、任选取代的杂环基、任选取代的芳基或任选取代的杂芳基；并且
p是1或2；
前提条件是所述化合物不具有下式：
Figure BDA0003064795710002571
其中R2的每个实例独立地是未取代的烷基、未取代的烯基或未取代的炔基。
i)磷脂头部修饰
在某些实施方案中，可用于或潜在可用于本发明的磷脂包括修饰的磷脂头部(例如，修饰的胆碱基团)。在某些实施方案中，具有修饰的头部的磷脂是具有修饰的季胺的DSPC或其类似物。例如，在式(IX)的实施方案中，R1中的至少一个不是甲基。在某些实施方案中，R1中的至少一个不是氢或甲基。在某些实施方案中，式(IX)的化合物为下式之一：
Figure BDA0003064795710002572
或其盐，其中：
每个t独立地是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
每个u独立地是0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；并且
每个v独立地是1、2或3。
在某些实施方案中，式(H IX)的化合物为下式之一：
Figure BDA0003064795710002581
或其盐。
在某些实施方案中，式(H IX)的化合物为以下之一：
Figure BDA0003064795710002582
Figure BDA0003064795710002591
或其盐。
在一个实施方案中，LNP包含化合物H-409作为非阳离子辅助脂质。
(ii)磷脂尾部修饰
在某些实施方案中，可用于或潜在可用于本发明的磷脂包括修饰的尾部。在某些实施方案中，可用于或潜在可用于本发明的磷脂是具有修饰的尾部的DSPC(1,2-双十八酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱)或其类似物。如本文所述，“修饰的尾部”可以是具有较短或较长脂肪链，引入分支的脂肪链，引入具有取代基的脂肪链，其中一个或多个亚甲基被环状或杂原子基团置换的脂肪链或它们的任何组合的尾部。例如，在某些实施方案中，(H IX)的化合物为式(H Ix-a)或其盐，其中R2的至少一个实例是R2的每个实例是任选取代的C1-30烷基，其中R2的一个或多个亚甲基单元独立地被任选取代的亚碳环基、任选取代的亚杂环基、任选取代的亚芳基、任选取代的亚杂芳基、-N(RN)-、-O-、-S-、-C(O)-、-C(O)N(RN)-、-NRNC(O)-、-NRNC(O)N(RN)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-OC(O)O-、-OC(O)N(RN)-、-NRNC(O)O-、-C(O)S-、-SC(O)-、-C(＝NRN)-、-C(＝NRN)N(RN)-、-NRNC(＝NRN)-、-NRNC(＝NRN)N(RN)-、-C(S)-、-C(S)N(RN)-、-NRNC(S)-、-NRNC(S)N(RN)-、-S(O)-、-OS(O)-、-S(O)O-、-OS(O)O-、-OS(O)2-、-S(O)2O-、-OS(O)2O-、-N(RN)S(O)-、-S(O)N(RN)-、-N(RN)S(O)N(RN)-、-OS(O)N(RN)-、-N(RN)S(O)O-、-S(O)2-、-N(RN)S(O)2-、-S(O)2N(RN)-、-N(RN)S(O)2N(RN)-、-OS(O)2N(RN)-或-N(RN)S(O)2O-置换。
在某些实施方案中，式(H IX)的化合物为式(H IX-c)：
Figure BDA0003064795710002601
或其盐，其中：
每个x独立地是0与30之间(包括端值在内)的整数；并且
每个实例是G，其独立地选自由以下组成的组：任选取代的亚碳环基、任选取代的亚杂环基、任选取代的亚芳基、任选取代的亚杂芳基、-N(RN)-、-O-、-S-、-C(O)-、-C(O)N(RN)-、-NRNC(O)-、-NRNC(O)N(RN)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-OC(O)O-、-OC(O)N(RN)-、-NRNC(O)O-、-C(O)S-、-SC(O)-、-C(＝NRN)-、-C(＝NRN)N(RN)-、-NRNC(＝NRN)-、-NRNC(＝NRN)N(RN)-、-C(S)-、-C(S)N(RN)-、-NRNC(S)-、-NRNC(S)N(RN)-、-S(O)-、-OS(O)-、-S(O)O-、-OS(O)O-、-OS(O)2-、-S(O)2O-、-OS(O)2O-、-N(RN)S(O)-、-S(O)N(RN)-、-N(RN)S(O)N(RN)-、-OS(O)N(RN)-、-N(RN)S(O)O-、-S(O)2-、-N(RN)S(O)2-、-S(O)2N(RN)-、-N(RN)S(O)2N(RN)-、-OS(O)2N(RN)-或-N(RN)S(O)2O-置换。每种可能性代表本发明的一个单独的实施方案。
在某些实施方案中，式(H IX-c)的化合物为式(H IX-c-1)：
Figure BDA0003064795710002611
或其盐，其中：
v的每个实例独立地是1、2或3。
在某些实施方案中，式(H IX-c)的化合物为式(H IX-c-2)：
Figure BDA0003064795710002612
或其盐。
在某些实施方案中，式(IX-c)的化合物为下式：
Figure BDA0003064795710002621
或其盐。
在某些实施方案中，式(H IX-c)的化合物为以下：
Figure BDA0003064795710002622
或其盐。
在某些实施方案中，式(H IX-c)的化合物为式(H IX-c-3)：
Figure BDA0003064795710002623
或其盐。
在某些实施方案中，式(H IX-c)的化合物为下式：
Figure BDA0003064795710002624
或其盐。
在某些实施方案中，式(H IX-c)的化合物为以下：
Figure BDA0003064795710002631
或其盐。
在某些实施方案中，可用于或潜在可用于本发明的磷脂包括修饰的磷脂胆碱部分，其中将季胺连接至磷酰基的烷基链不是亚乙基(例如，n不是2)。因此，在某些实施方案中，可用于或潜在可用于本发明的磷脂是式(H IX)的化合物，其中n是1、3、4、5、6、7、8、9或10。例如，在某些实施方案中，式(H IX)的化合物为下式之一：
Figure BDA0003064795710002632
或其盐。
在某些实施方案中，式(H IX)的化合物为以下之一：
Figure BDA0003064795710002633
Figure BDA0003064795710002641
Figure BDA0003064795710002651
或其盐。
在某些实施方案中，使用替代脂质代替本发明的磷脂。此类替代脂质的非限制性实例包括以下：
Figure BDA0003064795710002652
Figure BDA0003064795710002661
磷脂尾部修饰
在某些实施方案中，可用于本发明的磷脂包括修饰的尾部。在某些实施方案中，可用于本发明的磷脂是具有修饰的尾部的DSPC或其类似物。如本文所述，“修饰的尾部”可以是具有较短或较长脂肪链，引入分支的脂肪链，引入具有取代基的脂肪链，其中一个或多个亚甲基被环状或杂原子基团置换的脂肪链或它们的任何组合的尾部。例如，在某些实施方案中，(H I)的化合物为式(H I-a)或其盐，其中R2的至少一个实例是R2的每个实例是任选取代的C1-30烷基，其中R2的一个或多个亚甲基单元独立地被任选取代的亚碳环基、任选取代的亚杂环基、任选取代的亚芳基、任选取代的亚杂芳基、-N(RN)-、-O-、-S-、-C(O)-、-C(O)N(RN)-、-NRNC(O)-、-NRNC(O)N(RN)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-OC(O)O-、-OC(O)N(RN)-、-NRNC(O)O-、-C(O)S-、-SC(O)-、-C(＝NRN)-、-C(＝NRN)N(RN)-、-NRNC(＝NRN)-、-NRNC(＝NRN)N(RN)-、-C(S)-、-C(S)N(RN)-、-NRNC(S)-、-NRNC(S)N(RN)-、-S(O)-、-OS(O)-、-S(O)O-、-OS(O)O-、-OS(O)2-、-S(O)2O-、-OS(O)2O-、-N(RN)S(O)-、-S(O)N(RN)-、-N(RN)S(O)N(RN)-、-OS(O)N(RN)-、-N(RN)S(O)O-、-S(O)2-、-N(RN)S(O)2-、-S(O)2N(RN)-、-N(RN)S(O)2N(RN)-、-OS(O)2N(RN)-或-N(RN)S(O)2O-置换。
在某些实施方案中，式(H I-a)的化合物为式(H I-c)：
Figure BDA0003064795710002671
或其盐，其中：
每个x独立地是0与30之间(包括端值在内)的整数；并且
每个实例是G，其独立地选自由以下组成的组：任选取代的亚碳环基、任选取代的亚杂环基、任选取代的亚芳基、任选取代的亚杂芳基、-N(RN)-、-O-、-S-、-C(O)-、-C(O)N(RN)-、-NRNC(O)-、-NRNC(O)N(RN)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-OC(O)O-、-OC(O)N(RN)-、-NRNC(O)O-、-C(O)S-、-SC(O)-、-C(＝NRN)-、-C(＝NRN)N(RN)-、-NRNC(＝NRN)-、-NRNC(＝NRN)N(RN)-、-C(S)-、-C(S)N(RN)-、-NRNC(S)-、-NRNC(S)N(RN)-、-S(O)-、-OS(O)-、-S(O)O-、-OS(O)O-、-OS(O)2-、-S(O)2O-、-OS(O)2O-、-N(RN)S(O)-、-S(O)N(RN)-、-N(RN)S(O)N(RN)-、-OS(O)N(RN)-、-N(RN)S(O)O-、-S(O)2-、-N(RN)S(O)2-、-S(O)2N(RN)-、-N(RN)S(O)2N(RN)-、-OS(O)2N(RN)-或-N(RN)S(O)2O-。每种可能性代表本发明的一个单独的实施方案。
在某些实施方案中，式(H I-c)的化合物为式(H I-c-1)：
Figure BDA0003064795710002681
或其盐，其中：
v的每个实例独立地是1、2或3。
在某些实施方案中，式(H I-c)的化合物为式(H I-c-2)：
Figure BDA0003064795710002682
或其盐。
在某些实施方案中，式(I-c)的化合物为下式：
Figure BDA0003064795710002683
或其盐。
在某些实施方案中，式(H I-c)的化合物为以下：
Figure BDA0003064795710002691
或其盐。
在某些实施方案中，式(H I-c)的化合物为式(H I-c-3)：
Figure BDA0003064795710002692
或其盐。
在某些实施方案中，式(H I-c)的化合物为下式：
Figure BDA0003064795710002693
或其盐。
在某些实施方案中，式(H I-c)的化合物为以下：
Figure BDA0003064795710002694
或其盐。
磷酸胆碱接头修饰
在某些实施方案中，可用于本发明的磷脂包括修饰的磷脂胆碱部分，其中将季胺连接至磷酰基的烷基链不是亚乙基(例如，n不是2)。因此，在某些实施方案中，可用于本发明的磷脂是式(H I)的化合物，其中n是1、3、4、5、6、7、8、9或10。例如，在某些实施方案中，式(H I)的化合物为下式之一：
Figure BDA0003064795710002701
或其盐。
在某些实施方案中，式(H I)的化合物为以下之一：
Figure BDA0003064795710002702
Figure BDA0003064795710002711
Figure BDA0003064795710002721
或其盐。
如以下实施例所示，制备许多具有除DSPC以外的磷脂的LNP制剂，并测试其活性。
磷脂替代物或替换物
在一些实施方案中，基于脂质的组合物(例如，脂质纳米颗粒)包含代替磷脂的油酸或油酸类似物。在一些实施方案中，油酸类似物包含修饰的油酸尾部、修饰的羧酸部分或两者。在一些实施方案中，油酸类似物是其中油酸的羧酸部分被不同的基团置换的化合物。
在一些实施方案中，基于脂质的组合物(例如，脂质纳米颗粒)包含代替磷脂的不同的两性离子基团。
示例性的磷脂替代物和/或替换物提供于公布的PCT申请WO2017/099823中，其以引用方式并入本文。
示例性的磷脂替代物和/或替换物提供于公布的PCT申请WO2017/099823中，其以引用方式并入本文。
(iv)PEG脂质
PEG脂质的非限制性实例包括PEG修饰的磷脂酰乙醇胺和磷脂酸、PEG-神经酰胺缀合物(例如，PEG-CerC14或PEG-CerC20)、PEG修饰的二烷基胺和PEG修饰的1,2-二酰氧基丙-3-胺。此类脂质也称为PEG化脂质。例如，PEG脂质可是PEG-c-DOMG、PEG-DMG、PEG-DLPE、PEG-DMPE、PEG-DPPC或PEG-DSPE脂质。
在一些实施方案中，PEG脂质包括但不限于1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油甲氧基聚乙二醇(PEG-DMG)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-[氨基(聚乙二醇)](PEG-DSPE)、PEG-二甾醇基甘油(PEG-DSG)、PEG-二棕榈油基、PEG-二油基、PEG-二硬脂基、PEG-二酰基甘油酰胺(PEG-DAG)、PEG-二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺(PEG-DPPE)或PEG-1,2-二肉豆蔻酰基氧基丙基-3-胺(PEG-c-DMA)。
在一个实施方案中，PEG脂质选自由以下组成的组：PEG修饰的磷脂酰乙醇胺、PEG修饰的磷脂酸、PEG修饰的神经酰胺、PEG修饰的二烷基胺、PEG修饰的二酰基甘油、PEG修饰的二烷基甘油以及它们的混合物。
在一些实施方案中，PEG脂质的脂质部分包括长度为约C14至约C22、优选约C14至约C16的那些。在一些实施方案中，PEG部分(如，mPEG-NH2)具有约1000、2000、5000、10,000、15,000或20,000道尔顿的大小。在一个实施方案中，PEG脂质是PEG2k-DMG。
在一个实施方案中，本文所述的脂质纳米颗粒可包含PEG脂质，其是非扩散性PEG。非扩散性PEG的非限制性实例包括PEG-DSG和PEG-DSPE。
PEG脂质在本领域中是已知的，如美国专利号8158601和国际公布号WO 2015/130584 A2中描述的那些，所述专利以引用方式整体并入本文。
一般来讲，本文所述的各式的其他一些脂质组分(例如，PEG脂质)可如2016年12月10日提交的标题为“Compositions and Methods for Delivery of Therapeutic Agents”的国际专利申请号PCT/US2016/000129中所述进行合成，所述专利以引用方式整体并入本文。
脂质纳米颗粒组合物的脂质组分可包括一种或多种包含聚乙二醇的分子，如PEG或PEG修饰的脂质。此类物质可替代地称为PEG化脂质。PEG脂质是用聚乙二醇修饰的脂质。PEG脂质可选自包括以下的非限制性组：PEG修饰的磷脂酰乙醇胺、PEG修饰的磷脂酸、PEG修饰的神经酰胺、PEG修饰的二烷基胺、PEG修饰的二酰基甘油、PEG修饰的二烷基甘油以及它们的混合物。例如，PEG脂质可是PEG-c-DOMG、PEG-DMG、PEG-DLPE、PEG-DMPE、PEG-DPPC或PEG-DSPE脂质。
在一些实施方案中，PEG修饰的脂质是PEG DMG的修饰形式。PEG-DMG具有以下结构：
Figure BDA0003064795710002741
在一个实施方案中，可用于本发明的PEG脂质可以是国际公布号WO2012099755中描述的PEG化脂质，所述公布的内容以引用方式整体并入本文。本文所述的任何这些示例性PEG脂质均可被修饰以在PEG链上包含羟基。在某些实施方案中，PEG脂质是PEG-OH脂质。如本文一般所定义，“PEG-OH脂质”(在本文中也称为“羟基-PEG化脂质”)是在脂质上具有一个或多个羟基(-OH)的PEG化脂质。在某些实施方案中，PEG-OH脂质在PEG链上包括一个或多个羟基。在某些实施方案中，PEG-OH或羟基-PEG化脂质在PEG链的末端包含-OH基团。每种可能性代表本发明的一个单独的实施方案。
在一些实施方案中，PEG脂质是式(PI)的化合物：
Figure BDA0003064795710002742
或其盐或异构体，其中：
r是1与100之间的整数；
R5PEG是C10-40烷基、C10-40烯基或C10-40炔基；并且任选地R5PEG的一个或多个亚甲基独立地被C3-10亚碳环基、4至10元亚杂环基、C6-10亚芳基、4至10元亚杂芳基、-N(RN)-、-O-、-S-、-C(O)-、-C(O)N(RN)-、-NRNC(O)-、-NRNC(O)N(RN)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-OC(O)O-、-OC(O)N(RN)-、-NRNC(O)O-、-C(O)S-、-SC(O)-、-C(＝NRN)-、-C(＝NRN)N(RN)-、-NRNC(＝NRN)-、-NRNC(＝NRN)N(RN)-、-C(S)-、-C(S)N(RN)-、-NRNC(S)-、-NRNC(S)N(RN)-、-S(O)-、-OS(O)-、-S(O)O-、-OS(O)O-、-OS(O)2-、-S(O)2O-、-OS(O)2O-、-N(RN)S(O)-、-S(O)N(RN)-、-N(RN)S(O)N(RN)-、-OS(O)N(RN)-、-N(RN)S(O)O-、-S(O)2-、-N(RN)S(O)2-、-S(O)2N(RN)-、-N(RN)S(O)2N(RN)-、-OS(O)2N(RN)-或-N(RN)S(O)2O-置换；并且
RN的每个实例独立地是氢、C1-6烷基或氮保护基。
例如，R5PEG是C17烷基。例如，PEG脂质是式(PI-a)的化合物：
Figure BDA0003064795710002751
或其盐或异构体，其中r是1与100之间的整数。
例如，PEG脂质是下式的化合物：
Figure BDA0003064795710002752
(PEG 1；
也称为化合物428或以下化合物I)，
或其盐或异构体。
PEG脂质可以是式(PII)的化合物：
Figure BDA0003064795710002753
或其盐或异构体，其中：
s是1与100之间的整数；
R”是氢、C1-10烷基或氧保护基；
R7PEG是C10-40烷基、C10-40烯基或C10-40炔基；并且任选地R5PEG的一个或多个亚甲基独立地被C3-10亚碳环基、4至10元亚杂环基、C6-10亚芳基、4至10元亚杂芳基、-N(RN)-、-O-、-S-、-C(O)-、-C(O)N(RN)-、-NRNC(O)-、-NRNC(O)N(RN)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-OC(O)O-、-OC(O)N(RN)-、-NRNC(O)O-、-C(O)S-、-SC(O)-、-C(＝NRN)-、-C(＝NRN)N(RN)-、-NRNC(＝NRN)-、-NRNC(＝NRN)N(RN)-、-C(S)-、-C(S)N(RN)-、-NRNC(S)-、-NRNC(S)N(RN)-、-S(O)-、-OS(O)-、-S(O)O-、-OS(O)O-、-OS(O)2-、-S(O)2O-、-OS(O)2O-、-N(RN)S(O)-、-S(O)N(RN)-、-N(RN)S(O)N(RN)-、-OS(O)N(RN)-、-N(RN)S(O)O-、-S(O)2-、-N(RN)S(O)2-、-S(O)2N(RN)-、-N(RN)S(O)2N(RN)-、-OS(O)2N(RN)-或-N(RN)S(O)2O-置换；并且
RN的每个实例独立地是氢、C1-6烷基或氮保护基。
在一些实施方案中，R7PEG是C10-60烷基，并且R7PEG的一个或多个亚甲基被-C(O)-置换。例如，R7PEG是C31烷基，并且R7PEG的两个亚甲基被-C(O)-置换。
在一些实施方案中，R”是甲基。
在一些实施方案中，PEG脂质是式(PII-a)的化合物：
Figure BDA0003064795710002761
或其盐或异构体，其中s是1与100之间的整数。
例如，PEG脂质是下式的化合物：
Figure BDA0003064795710002771
或其盐或异构体。
在某些实施方案中，可用于本发明的PEG脂质是式(PIII)的化合物。本文提供了式(PIII)的化合物：
Figure BDA0003064795710002772
或其盐，其中：
R3是-ORO；
RO是氢、任选取代的烷基或氧保护基；
r是1与100之间的整数(包括端值在内)；
L1是任选取代的C1-10亚烷基，其中所述任选取代的C1-10亚烷基的至少一个亚甲基独立地被任选取代的亚碳环基、任选取代的亚杂环基、任选取代的亚芳基、任选取代的亚杂芳基、O、N(RN)、S、C(O)、C(O)N(RN)、NRNC(O)、C(O)O、OC(O)、OC(O)O、OC(O)N(RN)、NRNC(O)O或NRNC(O)N(RN)置换；
D是通过点击化学获得的部分或在生理条件下可切割的部分；
m是0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
A具有式：
Figure BDA0003064795710002773
L2的每个实例独立地是键或任选取代的C1-6亚烷基，其中所述任选取代的C1-6亚烷基的一个亚甲基单元任选地被O、N(RN)、S、C(O)、C(O)N(RN)、NRNC(O)、C(O)O、OC(O)、OC(O)O、OC(O)N(RN)、NRNC(O)O或NRNC(O)N(RN)置换；
R2的每个实例独立地是任选取代的C1-30烷基、任选取代的C1-30烯基或任选取代的C1-30炔基；任选地其中R2的一个或多个亚甲基单元独立地被任选取代的亚碳环基、任选取代的亚杂环基、任选取代的亚芳基、任选取代的亚杂芳基、N(RN)、O、S、C(O)、C(O)N(RN)、NRNC(O)、NRNC(O)N(RN)、C(O)O、OC(O)、OC(O)O、OC(O)N(RN)、NRNC(O)O、C(O)S、SC(O)、C(＝NRN)、C(＝NRN)N(RN)、NRNC(＝NRN)、NRNC(＝NRN)N(RN)、C(S)、C(S)N(RN)、NRNC(S)、NRNC(S)N(RN)、S(O)、OS(O)、S(O)O、OS(O)O、OS(O)2、S(O)2O、OS(O)2O、N(RN)S(O)、S(O)N(RN)、N(RN)S(O)N(RN)、OS(O)N(RN)、N(RN)S(O)O、S(O)2、N(RN)S(O)2、S(O)2N(RN)、N(RN)S(O)2N(RN)、OS(O)2N(RN)或N(RN)S(O)2O置换；
RN的每个实例独立地是氢、任选取代的烷基或氮保护基；
B环是任选取代的碳环基、任选取代的杂环基、任选取代的芳基或任选取代的杂芳基；并且
p是1或2。
在某些实施方案中，式(PIII)的化合物是PEG-OH脂质(即，R3是-ORO，且RO是氢)。在某些实施方案中，式(PIII)的化合物为式(PIII-OH)：
Figure BDA0003064795710002781
或其盐。
在某些实施方案中，D是通过点击化学获得的部分(例如，三唑)。
在某些实施方案中，式(PIII)的化合物为式(PIII-a-1)或(PIII-a-2)：
Figure BDA0003064795710002791
或其盐。
在某些实施方案中，式(PIII)的化合物为下式之一：
Figure BDA0003064795710002792
或其盐，其中
s是0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。
在某些实施方案中，式(PIII)的化合物为下式之一：
Figure BDA0003064795710002793
或其盐。
在某些实施方案中，式(PIII)的化合物为下式之一：
Figure BDA0003064795710002801
或其盐。
在某些实施方案中，式(PIII)的化合物为下式之一：
Figure BDA0003064795710002802
Figure BDA0003064795710002811
或其盐。
在某些实施方案中，D是在生理条件下可切割的部分(例如，酯、酰胺、碳酸酯、氨基甲酸酯、尿素)。在某些实施方案中，式(PIII)的化合物为式(PIII-b-1)或(PIII-b-2)：
Figure BDA0003064795710002812
或其盐。
在某些实施方案中，式(PIII)的化合物为式(PIII-b-1-OH)或(PIII-b-2-OH)：
Figure BDA0003064795710002813
或其盐。
在某些实施方案中，式(PIII)的化合物为下式之一：
Figure BDA0003064795710002821
或其盐。
在某些实施方案中，式(PIII)的化合物为下式之一：
Figure BDA0003064795710002822
或其盐。
在某些实施方案中，式(PIII)的化合物为下式之一：
Figure BDA0003064795710002823
Figure BDA0003064795710002831
或其盐。
在某些实施方案中，式(PIII)的化合物为下式之一：
Figure BDA0003064795710002832
或其盐。
在某些实施方案中，可用于本发明的PEG脂质是PEG化的脂肪酸。在某些实施方案中，可用于本发明的PEG脂质是式(PIV)的化合物。本文提供了式(PIV)的化合物：
Figure BDA0003064795710002833
或其盐，其中：
R3是-ORO；
RO是氢、任选取代的烷基或氧保护基；
r是1与100之间的整数(包括端值在内)；
R5是任选取代的C10-40烷基、任选取代的C10-40烯基或任选取代的C10-40炔基；并且任选地R5的一个或多个亚甲基单元独立地被任选取代的亚碳环基、任选取代的亚杂环基、任选取代的亚芳基、任选取代的亚杂芳基、N(RN)、O、S、C(O)、C(O)N(RN)、NRNC(O)、NRNC(O)N(RN)、C(O)O、OC(O)、OC(O)O、OC(O)N(RN)、NRNC(O)O、C(O)S、SC(O)、C(＝NRN)、C(＝NRN)N(RN)、NRNC(＝NRN)、NRNC(＝NRN)N(RN)、C(S)、C(S)N(RN)、NRNC(S)、NRNC(S)N(RN)、S(O)、OS(O)、S(O)O、OS(O)O、OS(O)2、S(O)2O、OS(O)2O、N(RN)S(O)、S(O)N(RN)、N(RN)S(O)N(RN)、OS(O)N(RN)、N(RN)S(O)O、S(O)2、N(RN)S(O)2、S(O)2N(RN)、N(RN)S(O)2N(RN)、OS(O)2N(RN)或N(RN)S(O)2O置换；并且
RN的每个实例独立地是氢、任选取代的烷基或氮保护基。
在某些实施方案中，式(PIV)的化合物为式(PIV-OH)：
Figure BDA0003064795710002841
或其盐。在一些实施方案中，r是40-50。在一些实施方案中，r是45。
在某些实施方案中，式(PIV)的化合物为下式之一：
Figure BDA0003064795710002842
Figure BDA0003064795710002851
或其盐。在一些实施方案中，r是40-50。在一些实施方案中，r是45。
在其他实施方案中，式(PIV)的化合物为：
Figure BDA0003064795710002852
或其盐。
在一个实施方案中，式(PIV)的化合物为
Figure BDA0003064795710002853
在一方面，本文提供了包含式(PV)的PEG脂质的脂质纳米颗粒(LNP)：
Figure BDA0003064795710002854
或其药学上可接受的盐；其中：
L1是键、任选取代的C1-3亚烷基、任选取代的C1-3亚杂烷基、任选取代的C2-3亚烯基、任选取代的C2-3亚炔基；
R1是任选取代的C5-30烷基、任选取代的C5-30烯基或任选取代的C5-30炔基；
RO是氢、任选取代的烷基、任选取代的酰基或氧保护基；并且
r是2至100的整数，包括端值在内。
在某些实施方案中，式(PV)的PEG脂质为下式：
Figure BDA0003064795710002861
或其药学上可接受的盐；其中：
Y1是键、-CR2-、-O-、-NRN-或-S-；
R的每个实例独立地是氢、卤素或任选取代的烷基；并且
RN是氢、任选取代的烷基、任选取代的酰基或氮保护基。
在某些实施方案中，式(PV)的PEG脂质为下式之一：
Figure BDA0003064795710002862
Figure BDA0003064795710002871
或其药学上可接受的盐，其中：
R的每个实例独立地是氢、卤素或任选取代的烷基。
在某些实施方案中，式(PV)的PEG脂质为下式之一：
Figure BDA0003064795710002872
Figure BDA0003064795710002881
或其药学上可接受的盐；其中：
s是5-25的整数，包括端值在内。
在某些实施方案中，式(PV)的PEG脂质为下式之一：
Figure BDA0003064795710002882
Figure BDA0003064795710002891
或其药学上可接受的盐。
在某些实施方案中，式(PV)的PEG脂质选自由以下组成的组：
Figure BDA0003064795710002892
Figure BDA0003064795710002901
Figure BDA0003064795710002902
以及
Figure BDA0003064795710002903
及其药学上可接受的盐。
在另一方面，本文提供了包含式(PVI)的PEG脂质的脂质纳米颗粒(LNP)：
Figure BDA0003064795710002911
或其药学上可接受的盐；其中：
RO是氢、任选取代的烷基、任选取代的酰基或氧保护基；
r是2至100的整数，包括端值在内；并且
m是5-15的整数(包括端值在内)，或19-30的整数(包括端值在内)。
在某些实施方案中，式(PVI)的PEG脂质为下式之一：
Figure BDA0003064795710002912
或其药学上可接受的盐。
在某些实施方案中，式(PVI)的PEG脂质为下式之一：
Figure BDA0003064795710002921
或其药学上可接受的盐。
在另一方面，本文提供了包含式(PVII)的PEG脂质的脂质纳米颗粒(LNP)：
Figure BDA0003064795710002922
或其药学上可接受的盐，其中：
Y2是-O-、-NRN-或-S-
R1的每个实例独立地是任选取代的C5-30烷基、任选取代的C5-30烯基或任选取代的C5-30炔基；
RO是氢、任选取代的烷基、任选取代的酰基或氧保护基；
RN是氢、任选取代的烷基、任选取代的酰基或氮保护基；并且
r是2至100的整数，包括端值在内。
在某些实施方案中，式(PVII)的PEG脂质为下式之一：
Figure BDA0003064795710002931
或其药学上可接受的盐。
在某些实施方案中，式(PVII)的PEG脂质为下式之一：
Figure BDA0003064795710002932
或其药学上可接受的盐；其中：
s的每个实例独立地是5-25的整数，包括端值在内。
在某些实施方案中，式(PVII)的PEG脂质为下式之一：
Figure BDA0003064795710002933
或其药学上可接受的盐。
在某些实施方案中，式(PVII)的PEG脂质选自由以下组成的组：
Figure BDA0003064795710002941
Figure BDA0003064795710002942
以及
Figure BDA0003064795710002943
及其药学上可接受的盐。
在另一方面，本文提供了包含式(PVIII)的PEG脂质的脂质纳米颗粒(LNP)：
Figure BDA0003064795710002944
或其药学上可接受的盐，其中：
L1是键、任选取代的C1-3亚烷基、任选取代的C1-3亚杂烷基、任选取代的C2-3亚烯基、任选取代的C2-3亚炔基；
R1的每个实例独立地是任选取代的C5-30烷基、任选取代的C3-30烯基或任选取代的C5-30炔基；
RO是氢、任选取代的烷基、任选取代的酰基或氧保护基；
r是2至100的整数，包括端值在内；
前提条件是当L1是-CH2CH2-或-CH2CH2CH2-时，RO不是甲基。
在某些实施方案中，当L1是任选取代的C2或C3亚烷基时，RO不是任选取代的烷基。在某些实施方案中，当L1是任选取代的C2或C3亚烷基时，RO是氢。在某些实施方案中，当L1是-CH2CH2-或-CH2CH2CH2-时，RO不是任选取代的烷基。在某些实施方案中，当L1是-CH2CH2-或-CH2CH2CH2-时，RO是氢。
在某些实施方案中，式(PVIII)的PEG脂质为下式：
Figure BDA0003064795710002951
或其药学上可接受的盐，其中：
Y1是键、-CR2-、-O-、-NRN-或-S-；
R的每个实例独立地是氢、卤素或任选取代的烷基；
RN是氢、任选取代的烷基、任选取代的酰基或氮保护基；
前提条件是当Y1是键或-CH2-时，RO不是甲基。
在某些实施方案中，当L1是-CR2-时，RO不是任选取代的烷基。在某些实施方案中，当L1是-CR2-时，RO是氢。在某些实施方案中，当L1是-CH2-时，RO不是任选取代的烷基。在某些实施方案中，当L1是-CH2-时，RO是氢。
在某些实施方案中，式(PVIII)的PEG脂质为下式之一：
Figure BDA0003064795710002961
Figure BDA0003064795710002971
或其药学上可接受的盐，其中：
R的每个实例独立地是氢、卤素或任选取代的烷基。
在某些实施方案中，式(PVIII)的PEG脂质为下式之一：
Figure BDA0003064795710002972
Figure BDA0003064795710002981
或其药学上可接受的盐；其中：
R的每个实例独立地是氢、卤素或任选取代的烷基；并且
每个s独立地是5-25的整数，包括端值在内。
在某些实施方案中，式(PVIII)的PEG脂质为下式之一：
Figure BDA0003064795710002982
Figure BDA0003064795710002991
或其药学上可接受的盐。
在某些实施方案中，式(PVIII)的PEG脂质选自由以下组成的组：
Figure BDA0003064795710002992
Figure BDA0003064795710003001
Figure BDA0003064795710003011
及其药学上可接受的盐。
在任一前述或相关方面，本发明的PEG脂质的特征在于其中r是40-50。
在某些实施方案中，与现有的包含PEG脂质的LNP制剂相比，本文所提供的LNP表现出增加的PEG脱落。如本文所用，“PEG脱落”是指PEG基团从PEG脂质裂解。在许多情况下，PEG基团从PEG脂质裂解通过血清驱动的酯酶裂解或水解发生。在某些实施方案中，已经对本文所提供的PEG脂质进行过设计以控制PEG脱落的速率。在某些实施方案中，本文所提供的LNP在人血清中约6小时后，表现出大于5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或98％的PEG脱落。在某些实施方案中，本文所提供的LNP在人血清中约6小时后，表现出大于50％的PEG脱落。在某些实施方案中，本文所提供的LNP在人血清中约6小时后表现出大于60％的PEG脱落。在某些实施方案中，本文所提供的LNP在人血清中约6小时后表现出大于70％的PEG脱落。在某些实施方案中，所述LNP在人血清中约6小时后表现出大于80％的PEG脱落。在某些实施方案中，所述LNP在人血清中约6小时后表现出大于90％的PEG脱落。在某些实施方案中，本文所提供的LNP在人血清中约6小时后表现出大于90％的PEG脱落。
在其他实施方案中，本文所提供的LNP在人血清中约6小时后，表现出小于5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或98％的PEG脱落。在某些实施方案中，本文所提供的LNP在人血清中约6小时后，表现出小于60％的PEG脱落。在某些实施方案中，本文所提供的LNP在人血清中约6小时后表现出小于70％的PEG脱落。在某些实施方案中，本文所提供的LNP在人血清中约6小时后表现出小于80％的PEG脱落。
除本文所提供的PEG脂质之外，LNP还可包含一种或多种另外的脂质组分。在某些实施方案中，相对于其他脂质，PEG脂质以0.15％-15％的摩尔比存在于LNP中。在某些实施方案中，相对于其他脂质，PEG脂质以0.15％-5％的摩尔比存在。在某些实施方案中，相对于其他脂质，PEG脂质以1％-5％的摩尔比存在。在某些实施方案中，相对于其他脂质，PEG脂质以0.15％-2％的摩尔比存在。在某些实施方案中，相对于其他脂质，PEG脂质以1％-2％的摩尔比存在。在某些实施方案中，相对于其他脂质，PEG脂质以约1％、1.1％、1.2％、1.3％、1.4％、1.5％、1.6％、1.7％、1.8％、1.9％或2％的摩尔比存在。在某些实施方案中，相对于其他脂质，PEG脂质以约1.5％的摩尔比存在。
在一个实施方案中，本文所公开的药物组合物的脂质组合物中的PEG脂质的量的范围为约0.1mol％至约5mol％、约0.5mol％至约5mol％、约1mol％至约5mol％、约1.5mol％至约5mol％、约2mol％至约5mol％、约0.1mol％至约4mol％、约0.5mol％至约4mol％、约1mol％至约4mol％、约1.5mol％至约4mol％、约2mol％至约4mol％、约0.1mol％至约3mol％、约0.5mol％至约3mol％、约1mol％至约3mol％、约1.5mol％至约3mol％、约2mol％至约3mol％、约0.1mol％至约2mol％、约0.5mol％至约2mol％、约1mol％至约2mol％、约1.5mol％至约2mol％、约0.1mol％至约1.5mol％、约0.5mol％至约1.5mol％或约1mol％至约1.5mol％。
在一个实施方案中，本文所公开的脂质组合物中的PEG脂质的量为约2mol％。在一个实施方案中，本文所公开的脂质组合物中的PEG脂质的量为约1.5mol％。
在一个实施方案中，本文所公开的脂质组合物中的PEG脂质的量为至少约0.1mol％、0.2mol％、0.3mol％、0.4mol％、0.5mol％、0.6mol％、0.7mol％、0.8mol％、0.9mol％、1mol％、1.1mol％、1.2mol％、1.3mol％、1.4mol％、1.5mol％、1.6mol％、1.7mol％、1.8mol％、1.9mol％、2mol％、2.1mol％、2.2mol％、2.3mol％、2.4mol％、2.5mol％、2.6mol％、2.7mol％、2.8mol％、2.9mol％、3mol％、3.1mol％、3.2mol％、3.3mol％、3.4mol％、3.5mol％、3.6mol％、3.7mol％、3.8mol％、3.9mol％、4mol％、4.1mol％、4.2mol％、4.3mol％、4.4mol％、4.5mol％、4.6mol％、4.7mol％、4.8mol％、4.9mol％或5mol％。
示例性合成：
化合物：HO-PEG2000-酯-C18
Figure BDA0003064795710003031
向装有碳载钯(10wt％，74mg，0.070mmol)的充氮烧瓶中加入苯甲基-PEG2000-酯-C18(822mg，0.35mmol)和MeOH(20mL)。将该烧瓶抽空并回填H2三次，并允许在RT和1atm H2下搅拌12小时。将混合物通过硅藻土过滤，用DCM冲洗，并将滤液真空浓缩，得到期望的产物(692mg，88％)。使用所述方法，n＝40-50。在一个实施方案中，所得多分散性混合物的n由平均值45表示。
例如，r的值可基于PEG脂质内PEG部分的分子量来确定。例如，分子量2,000(例如，PEG2000)对应于约45的n值。对于给定的组成，n的值可表示在本领域可接受的范围内的值的分布，因为通常发现聚合物是不同聚合物链长的分布。例如，了解此类聚合物组合物的多分散性的本领域技术人员将理解，n值45(例如，在结构式中)可表示在实际的含PEG的组合物(例如，DMG PEG200 peg脂质组合物)中40-50之间的值的分布。
在一些方面，本文所公开的药物组合物的LNP不包含PEG脂质。
在一个实施方案中，本公开的LNP包含PEG脂质。在一个实施方案中，PEG脂质不是PEG DMG。在一些方面，PEG脂质选自由以下组成的组：PEG修饰的磷脂酰乙醇胺、PEG修饰的磷脂酸、PEG修饰的神经酰胺、PEG修饰的二烷基胺、PEG修饰的二酰基甘油、PEG修饰的二烷基甘油以及它们的混合物。在一些方面，PEG脂质选自由以下组成的组：PEG-c-DOMG、PEG-DMG、PEG-DLPE、PEG-DMPE、PEG-DPPC和PEG-DSPE脂质。在其他方面，PEG-脂质是PEG-DMG。
在一个实施方案中，本公开的LNP包含PEG脂质，所述PEG脂质如果是分支的，则其链长大于约14或大于约10。
在一个实施方案中，PEG脂质是选自化合物编号P415、P416、P417、P 419、P 420、P423、P 424、P 428、P L1、P L2、P L16、P L17、P L18、P L19、P L22和P L23中任一者组成的组的化合物。在一个实施方案中，PEG脂质是选自化合物编号P415、P417、P 420、P 423、P424、P 428、P L1、P L2、P L16、P L17、P L18、P L19、P L22和P L23中任一者组成的组的化合物。
在一个实施方案中，PEG脂质选自由以下组成的组：Cmpd 428、PL16、PL17、PL 18、PL19、PL 1和PL 2。
示例性LNP脂质
在任一前述或相关方面，本公开的LNP的可电离脂质(表示是I)包括例如具有式(II)、(I IA)、(I IB)、(I II)、(I IIa)、(I IIb)、(I IIc)、(I IId)、(I IIe)、(I IIf)、(IIIg)、(I III)、(I VI)、(I VI-a)、(I VII)、(I VIII)、(I VIIa)、(I VIIIa)、(I VIIIb)、(IVIIb-1)、(I VIIb-2)、(I VIIb-3)、(I VIIc)、(I VIId)、(I VIIIc)、(I VIIId)、(I IX)、(IIXa1)、(I IXa2)、(I IXa3)、(I IXa4)、(I IXa5)、(I IXa6)、(I IXa7)或(I IXa8)中任一个的任何化合物和/或化合物X、Y、I 48、I 50、I 109、I 111、I 113、I 181、I 182、I 244、I292、I 301、I 321、I 322、I 326、I 328、I 330、I 331、I 332或I M中任一者中所包括的化合物。
在任一前述或相关方面，本公开的LNP的可电离脂质包括本文所述的化合物，如化合物X、化合物Y、化合物I-321、化合物I-292、化合物I-326、化合物I-182、化合物I-301、化合物I-48、化合物I-50、化合物I-328、化合物I-330、化合物I-109、化合物I-111或化合物I-181。
在任一前述或相关方面，本公开的LNP的可电离脂质包括选自由以下组成的组的至少一种化合物：化合物编号I18(也称为化合物X)、I 25(也称为化合物Y)、I 48、I 50、I109、I 111、I 113、I 181、I 182、I 244、I 292、I 301、I 309、I 317、I 321、I 322、I 326、I328、I 330、I 331、I 332、I 347、I 348、I 349、I 350、I 351和I 352。在另一个实施方案中，本公开的LNP的可电离脂质包括选自由以下组成的组的化合物：化合物编号I18(也称为化合物X)、I 25(也称为化合物Y)、I 48、I 50、I 109、I 111、I 181、I 182、I 292、I 301、I321、I 326、I 328和I 330。在另一个实施方案中，本公开的LNP的可电离脂质包括选自由以下组成的组的化合物：化合物编号I 182、I 301、I 321和I 326。
在一个实施方案中，可采用可电离脂质的共混物。
在一个实施方案中，LNP包含甾醇。在另一个实施方案中，LNP包含天然存在的甾醇。在另一个实施方案中，LNP包含修饰的甾醇。在一个实施方案中，LNP包含一种或多种植物甾醇。在一个实施方案中，LNP包含植物甾醇/胆固醇共混物。
术语“植物甾醇”是指基于植物的甾醇和甾烷醇的组，所述植物甾醇和甾烷醇是植物甾体，包括其盐或酯。
术语“甾醇”是指类固醇(steroid)(也称为类固醇(steroid alcohol))的亚组。甾醇通常分为两类：(1)植物甾醇(plant sterol)，也称为“植物甾醇(phytosterol)”，以及(2)动物甾醇(animal sterol)，也称为“动物甾醇(zoosterol)”，如胆固醇。术语“甾烷醇”是指在甾醇环结构中没有双键的饱和甾醇的类别。
在一些实施方案中，所述植物甾醇是单独的或组合的谷甾醇、豆甾醇、菜油甾醇、谷甾烷醇、菜油甾烷醇、菜子甾醇、岩藻甾醇、β-谷甾醇、豆甾烷醇、β-谷甾烷醇、麦角甾醇、羽扇豆醇、环阿屯醇、Δ5-燕麦甾醇、Δ7-燕麦甾醇或Δ7-豆甾醇，包括其类似物、盐或酯。在一些实施方案中，本公开的LNP的植物甾醇组分是单一植物甾醇。在一些实施方案中，本公开的LNP的植物甾醇组分是不同植物甾醇(例如，2、3、4、5或6种不同植物甾醇)的混合物。在一些实施方案中，本公开的LNP的植物甾醇组分是一种或多种植物甾醇和一种或多种动物甾醇的混合物，如植物甾醇(例如，谷甾醇，如β-谷甾醇)和胆固醇的混合物。
在一些实施方案中，谷甾醇是β-谷甾醇。
在一些实施方案中，谷甾醇具有下式：
Figure BDA0003064795710003061
包括其类似物、盐或酯。
在一些实施方案中，谷甾醇是豆甾醇。
在一些实施方案中，豆甾醇具有下式：
Figure BDA0003064795710003071
包括其类似物、盐或酯。
在一些实施方案中，谷甾醇是菜油甾醇。
在一些实施方案中，菜油甾醇具有下式：
Figure BDA0003064795710003072
包括其类似物、盐或酯。
在一些实施方案中，谷甾醇是谷甾烷醇。
在一些实施方案中，谷甾烷醇具有下式：
Figure BDA0003064795710003081
包括其类似物、盐或酯。
在一些实施方案中，谷甾醇是菜油甾烷醇。
在一些实施方案中，菜油甾烷醇具有下式：
Figure BDA0003064795710003082
包括其类似物、盐或酯。
在一些实施方案中，谷甾醇是菜子甾醇。
在一些实施方案中，菜子甾醇具有下式：
Figure BDA0003064795710003091
包括其类似物、盐或酯。
在一些实施方案中，谷甾醇是岩藻甾醇。
在一些实施方案中，岩藻甾醇具有下式：
Figure BDA0003064795710003092
包括其类似物、盐或酯。
在一些实施方案中，植物甾醇(例如，β-谷甾醇)具有大于70％的纯度。在一些实施方案中，植物甾醇(例如，β-谷甾醇)具有大于80％的纯度。在一些实施方案中，植物甾醇(例如，β-谷甾醇)具有大于90％的纯度。在一些实施方案中，植物甾醇(例如，β-谷甾醇)具有大于95％的纯度。在一些实施方案中，植物甾醇(例如，β-谷甾醇)具有大于97％、98％或99％的纯度。
在一个实施方案中，LNP包含多于一种类型的结构脂质。
例如，在一个实施方案中，LNP包括植物甾醇。在一个实施方案中，植物甾醇是LNP中存在的唯一结构脂质。在另一个实施方案中，LNP包含结构脂质的共混物。
在一个实施方案中，本文所公开的药物组合物的脂质组合物中的植物甾醇和结构脂质(例如，β-谷甾醇和胆固醇)的组合量的范围为约20mol％至约60mol％、约25mol％至约55mol％、约30mol％至约50mol％或约35mol％至约45mol％。
在一个实施方案中，本文所公开的脂质组合物中的植物甾醇和结构脂质(例如，β-谷甾醇和胆固醇)的组合量的范围为约25mol％至约30mol％、约30mol％至约35mol％或约35mol％至约40mol％。
在一个实施方案中，本文所公开的脂质组合物中的植物甾醇和结构脂质(例如，β-谷甾醇和胆固醇)的量为约24mol％、约29mol％、约34mol％或约39mol％。
在一些实施方案中，本文所公开的脂质组合物中的植物甾醇和结构脂质(例如，β-谷甾醇和胆固醇)的组合量为至少约20mol％、21mol％、22mol％、23mol％、24mol％、25mol％、26mol％、27mol％、28mol％、29mol％、30mol％、31mol％、32mol％、33mol％、34mol％、35mol％、36mol％、37mol％、38mol％、39mol％、40mol％、41mol％、42mol％、43mol％、44mol％、45mol％、46mol％、47mol％、48mol％、49mol％、50mol％、51mol％、52mol％、53mol％、54mol％、55mol％、56mol％、57mol％、58mol％、59mol％或60mol％。
在一些实施方案中，脂质纳米颗粒包含一种或多种植物甾醇(例如，β-谷甾醇)和一种或多种结构脂质(例如，胆固醇)。在一些实施方案中，结构脂质的mol％为脂质纳米颗粒中存在的植物甾醇的mol％的约1％至50％。在一些实施方案中，结构脂质的mol％为基于脂质的组合物(例如，LNP)中存在的植物甾醇的mol％的约10％至40％。在一些实施方案中，结构脂质的mol％为基于脂质的组合物(例如，LNP)中存在的植物甾醇的mol％的约20％至30％。在一些实施方案中，结构脂质的mol％为基于脂质的组合物(例如，脂质纳米颗粒)中存在的植物甾醇的mol％的约30％。
在一些实施方案中，脂质纳米颗粒包含15mol％至40mol％的植物甾醇(例如，β-谷甾醇)。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒包含约15mol％、16mol％、17mol％、18mol％、19mol％、20mol％、21mol％、22mol％、23mol％、24mol％、25mol％、26mol％、27mol％、28mol％、29mol％、30mol％、31mol％、32mol％、33mol％、34mol％、35mol％、36mol％、37mol％、38mol％、30mol％或40mol％的植物甾醇(例如，β-谷甾醇)和0mol％、1mol％、2mol％、3mol％、4mol％、5mol％、6mol％、7mol％、8mol％、9mol％、10mol％、11mol％、12mol％、13mol％、14mol％、15mol％、16mol％、17mol％、18mol％、19mol％、20mol％、21mol％、22mol％、23mol％、24mol％或25mol％的结构脂质(例如，胆固醇)。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒包含大于20mol％的植物甾醇(例如，β-谷甾醇)和小于20mol％的结构脂质(例如，胆固醇)，使得植物甾醇和结构脂质的总mol％在30mol％与40mol％之间。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒包含分别为约20mol％、约21mol％、约22mol％、约23mol％、约24mol％、约25mol％、约26mol％、约27mol％、约28mol％、约29mol％、约30mol％、约31mol％、约32mol％、约33mol％、约34mol％、约35mol％、约37mol％、约38mol％、约39mol％或约40mol％的植物甾醇(例如，β-谷甾醇)；和约19mol％、约18mol％、约17mol％、约16mol％、约15mol％、约14mol％、约13mol％、约12mol％、约11mol％、约10mol％、约9mol％、约8mol％、约7mol％、约6mol％、约5mol％、约4mol％、约3mol％、约2mol％、约1mol％或约0mol％的结构脂质(例如，胆固醇)。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒包含约28mol％的植物甾醇(例如，β-谷甾醇)和约10mol％的结构脂质(例如，胆固醇)。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒包含38.5％的总摩尔％的植物甾醇和结构脂质(例如，胆固醇)。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒包含28.5mol％的植物甾醇(例如，β-谷甾醇)和10mol％的结构脂质(例如，胆固醇)。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒包含18.5mol％的植物甾醇(例如，β-谷甾醇)和20mol％的结构脂质(例如，胆固醇)。
在某些实施方案中，LNP包含50％的可电离脂质、10％的辅助脂质(例如，磷脂)、38.5％的结构脂质和1.5％的PEG脂质。在某些实施方案中，LNP包含50％的可电离脂质、10％的辅助脂质(例如，磷脂)、38％的结构脂质和2％的PEG脂质。在某些实施方案中，LNP包含50％的可电离脂质、20％的辅助脂质(例如，磷脂)、28.5％的结构脂质和1.5％的PEG脂质。在某些实施方案中，LNP包含50％的可电离脂质、20％的辅助脂质(例如，磷脂)、28％的结构脂质和2％的PEG脂质。在某些实施方案中，LNP包含40％的可电离脂质、30％的辅助脂质(例如，磷脂)、28.5％的结构脂质和1.5％的PEG脂质。在某些实施方案中，LNP包含40％的可电离脂质、30％的辅助脂质(例如，磷脂)、28％的结构脂质和2％的PEG脂质。在某些实施方案中，LNP包含45％的可电离脂质、20％的辅助脂质(例如，磷脂)、33.5％的结构脂质和1.5％的PEG脂质。在某些实施方案中，LNP包含45％的可电离脂质、20％的辅助脂质(例如，磷脂)、33％的结构脂质和2％的PEG脂质。
在一方面，LNP包含植物甾醇，并且LNP不包含另外的结构脂质。因此，LNP的结构脂质(甾醇)组分由植物甾醇组成。在另一方面，LNP包含植物甾醇和另外的结构脂质。因此，LNP的甾醇组分包含植物甾醇和一种或多种另外的甾醇或结构脂质。
在任一前述或相关方面，本公开的LNP的结构脂质(例如，甾醇，如植物甾醇或植物甾醇/胆固醇共混物)包含本文所述的化合物，如胆固醇、β-谷甾醇(在本文中也称为Cmpd S141)、菜油甾醇(在本文中也称为Cmpd S 143)、β-谷甾烷醇(在本文中也称为Cmpd S 144)、菜子甾醇或豆甾醇，或它们的组合或共混物。在另一个实施方案中，本公开的LNP的结构脂质(例如，甾醇，如植物甾醇或植物甾醇/胆固醇共混物)包括选自胆固醇、β-谷甾醇、菜油甾醇、β-谷甾烷醇、菜子甾醇、豆甾醇、β-谷甾醇-d7、化合物S-30、化合物S-31、化合物S-32或它们的组合或共混物的化合物。在另一个实施方案中，本公开的LNP的结构脂质(例如，甾醇，如植物甾醇或植物甾醇/胆固醇共混物)包含本文所述的化合物，如胆固醇、β-谷甾醇(在本文中也称为Cmpd S 141)、菜油甾醇(在本文中也称为Cmpd S 143)、β-谷甾烷醇(在本文中也称为Cmpd S 144)、化合物S-140，化合物S-144、菜子甾醇(在本文中也称为Cmpd S148)或组合物S-183(约40％化合物S-141、约25％化合物S-140、约25％化合物S-143和约10％菜子甾醇)。在一些实施方案中，本公开的LNP的结构脂质包含本文所述的化合物，如化合物S-159、化合物S-160、化合物S-164、化合物S-165、化合物S-167、化合物S-170、化合物S-173或化合物S-175。
在一个实施方案中，LNP包含非阳离子辅助脂质，例如磷脂。在任一前述或相关方面，本公开的LNP的非阳离子辅助脂质(例如，磷脂)包含本文所述的化合物，如DSPC、DMPE、DOPC或H-409。在一个实施方案中，非阳离子辅助脂质(例如，磷脂)是DSPC。在其他实施方案中，本公开的LNP的非阳离子辅助脂质(例如，磷脂)包含本文所述的化合物，如DSPC、DMPE、DOPC、DPPC、PMPC、H-409、H-418、H-420、H-421或H-422。
在任一前述或相关方面，本公开的LNP的PEG脂质包含本文所述的化合物，所述化合物可选自由以下组成的组：PEG修饰的磷脂酰乙醇胺、PEG修饰的磷脂酸、PEG修饰的神经酰胺、PEG修饰的二烷基胺、PEG修饰的二酰基甘油、PEG修饰的二烷基甘油以及它们的混合物。在另一个实施方案中，PEG脂质选自由以下组成的组：化合物编号P415、P416、P417、P419、P 420、P 423、P 424、P 428、P L5、P L1、P L2、P L16、P L17、P L18、P L19、P L22、PL23、DMG、DPG和DSG。在另一个实施方案中，PEG脂质选自由以下组成的组：Cmpd 428、PL16、PL17、PL 18、PL19、P L5、PL 1和PL 2。
在其他实施方案中，本公开提供了脂质纳米颗粒，所述脂质纳米颗粒包含化合物X(作为可电离脂质)、DSPC(作为磷脂)、胆固醇或胆固醇/β-谷甾醇共混物(作为结构脂质)和化合物428(作为PEG脂质)。在这些含化合物X的组合物的各个实施方案中，可电离脂质:磷脂:结构脂质:PEG脂质的比例可例如为：(i)50:10:38:2；(ii)50:20:28:2；(iii)40:20:38:2；(iv)40:30:28:2；对于结构脂质组分，在一个实施方案中，结构脂质完全是38％或28％的胆固醇。在另一个实施方案中，结构脂质是总百分比为38％或28％的胆固醇/β-谷甾醇，其中所述共混物可包含例如：(i)20％的胆固醇和18％的β-谷甾醇；(ii)10％的胆固醇和18％的β-谷甾醇或(iii)10％的胆固醇和28％的β-谷甾醇。在另一个实施方案中，结构脂质是总百分比为38.5％的胆固醇/β-谷甾醇，其中所述共混物可包含例如：(i)20％的胆固醇和18.5％的β-谷甾醇；或(ii)10％的胆固醇和28.5％的β-谷甾醇。
在其他实施方案中，本公开提供了脂质纳米颗粒，所述脂质纳米颗粒包含以下任一者：化合物X、Y、I-321、I-292、I-326、I-182、I-301、I-48、I-50、I-328、I-330、I-109、I-111或I-181(作为可电离脂质)；DSPC(作为磷脂)；胆固醇、胆固醇/β-谷甾醇共混物、β-谷甾醇/β-谷甾烷醇共混物、β-谷甾醇/菜油甾醇共混物、β-谷甾醇/β-谷甾烷醇/菜油甾醇共混物、胆固醇/菜油甾醇共混物、胆固醇/β-谷甾烷醇共混物、胆固醇/β-谷甾烷醇/菜油甾醇共混物或胆固醇/β-谷甾醇/β-谷甾烷醇/菜油甾醇共混物(作为结构脂质)；和化合物428(作为PEG脂质)。在这些组合物的各个实施方案中，可电离脂质:磷脂:结构脂质:PEG脂质的比例可例如为：(i)50:10:38:2；(ii)50:20:28:2；(iii)40:20:38:2；(iv)40:30:28:2；(v)40:18.5:40:1.5；或(vi)45:20:33.5:1.5。在一个实施方案中，对于结构脂质组分，LNP可包含例如40％的结构脂质，结构脂质由以下组成：(i)10％的胆固醇和30％的β-谷甾醇；(ii)10％的胆固醇和30％的菜油甾醇；(iii)10％的胆固醇和30％的β-谷甾烷醇；(iv)10％的胆固醇、20％的β-谷甾醇和10％的菜油甾醇；(v)10％的胆固醇、20％的β-谷甾醇和10％的β-谷甾烷醇；(vi)10％的胆固醇、10％的β-谷甾醇和20％的菜油甾醇；(vii)10％的胆固醇、10％的β-谷甾醇和20％的菜油甾醇；(viii)10％的胆固醇、20％的菜油甾醇和10％的β-谷甾烷醇；(ix)10％的胆固醇、10％的菜油甾醇和20％的β-谷甾烷醇；或(x)10％的胆固醇、10％的β-谷甾醇、10％的菜油甾醇和10％的β-谷甾烷醇。在另一个实施方案中，对于结构脂质组分，LNP可包含例如33.5％的结构脂质，结构脂质由以下组成：(i)33.5％的胆固醇；(ii)18.5％的胆固醇、15％的β-谷甾醇；(iii)18.5％的胆固醇、15％的菜油甾醇；或(iv)18.5％的胆固醇、15％的菜油甾醇。
在其他实施方案中，本公开提供了包含菜油甾醇、β-谷甾烷醇或豆甾醇(作为结构脂质)的脂质纳米颗粒。LNP的其他组分可选自本文所公开的那些，例如，化合物X、化合物I-109、化合物I-111、化合物I-181、化合物I-182或化合物I-244(作为可电离脂质)；DSPC(作为磷脂)；和化合物428(作为PEG脂质)。
示例性的其他LNP组分
表面活性剂
在某些实施方案中，本发明的脂质纳米颗粒任选地包含一种或多种表面活性剂。
在某些实施方案中，表面活性剂是两亲聚合物。如本文所用，两亲“聚合物”是包含低聚物或聚合物的两亲化合物。例如，两亲聚合物可包含低聚物片段，如两个或更多个PEG单体单元。例如，本文所述的两亲聚合物可以是PS 20。
例如，两亲聚合物是嵌段共聚物。
例如，两亲聚合物是冻干保护剂。
例如，两亲聚合物在约30℃和大气压下在水中具有小于2x10-4M的临界胶束浓度(CMC)。
例如，两亲聚合物在约30℃和大气压下在水中具有范围介于约0.1x10-4M与约1.3x10-4M之间的临界胶束浓度(CMC)。
例如，在配制物中，例如在冷冻或冻干之前，两亲聚合物的浓度的范围介于其CMC至约30倍CMC之间(例如，多至约25倍、约20倍、约15倍、约10倍、约5倍或约3倍其CMC)。
例如，两亲聚合物选自泊洛沙姆(poloxamer，
Figure BDA0003064795710003162
)、泊洛沙胺(poloxamine，
Figure BDA0003064795710003163
)、聚氧乙二醇脱水山梨糖醇烷基酯(聚山梨醇酯)和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。
例如，两亲聚合物是泊洛沙姆。例如，两亲聚合物具有以下结构：
Figure BDA0003064795710003161
其中a是10与150之间的整数，并且b是20与60之间的整数。例如，a为约12且b为约20，或者a为约80且b为约27，或者a为约64且b为约37，或者a为约141且b为约44，或者a为约101且b为约56。
例如，两亲聚合物是P124、P188、P237、P338或P407。
例如，两亲聚合物是P188(例如，泊洛沙姆188，CAS编号9003-11-6，也称为Kolliphor P188)。
例如，两亲聚合物是泊洛沙胺，例如，tetronic 304或tetronic904。
例如，两亲聚合物是聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，如分子量为3kDa、10kDa或29kDa的PVP。
例如，两亲聚合物是聚山梨醇酯，如PS 20。
在某些实施方案中，表面活性剂是非离子表面活性剂。
在一些实施方案中，脂质纳米颗粒包含表面活性剂。在一些实施方案中，表面活性剂是两亲聚合物。在一些实施方案中，表面活性剂是非离子表面活性剂。
例如，非离子表面活性剂选自由以下组成的组：聚乙二醇醚(Brij)、泊洛沙姆、聚山梨醇酯、脱水山梨糖醇及其衍生物。
例如，聚乙二醇醚是式(VIII)的化合物：
Figure BDA0003064795710003171
或其盐或异构体，其中：
t是1与100之间的整数；
R1BRIJ独立地是C10-40烷基、C10-40烯基或C10-40炔基；并且任选地R5PEG的一个或多个亚甲基独立地被C3-10亚碳环基、4至10元亚杂环基、C6-10亚芳基、4至10元亚杂芳基、-N(RN)-、-O-、-S-、-C(O)-、-C(O)N(RN)-、-NRNC(O)-、-NRNC(O)N(RN)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-OC(O)O-、-OC(O)N(RN)-、-NRNC(O)O-、-C(O)S-、-SC(O)-、-C(＝NRN)-、-C(＝NRN)N(RN)-、-NRNC(＝NRN)-、-NRNC(＝NRN)N(RN)-、-C(S)-、-C(S)N(RN)-、-NRNC(S)-、-NRNC(S)N(RN)-、-S(O)-、-OS(O)-、-S(O)O-、-OS(O)O-、-OS(O)2-、-S(O)2O-、-OS(O)2O-、-N(RN)S(O)-、-S(O)N(RN)-、-N(RN)S(O)N(RN)-、-OS(O)N(RN)-、-N(RN)S(O)O-、-S(O)2-、-N(RN)S(O)2-、-S(O)2N(RN)-、-N(RN)S(O)2N(RN)-、-OS(O)2N(RN)-或-N(RN)S(O)2O-置换；并且
RN的每个实例独立地是氢、C1-6烷基或氮保护基。
在一些实施方案中，R1BRIJ是C18烷基。例如，聚乙二醇醚是式(VIII-a)的化合物：
Figure BDA0003064795710003181
或其盐或异构体。
在一些实施方案中，R1BRIJ是C18烯基。例如，聚乙二醇醚是式(VIII-b)的化合物：
Figure BDA0003064795710003182
或其盐或异构体。
在一些实施方案中，泊洛沙姆选自由以下组成的组：泊洛沙姆101、泊洛沙姆105、泊洛沙姆108、泊洛沙姆122、泊洛沙姆123、泊洛沙姆124、泊洛沙姆181、泊洛沙姆182、泊洛沙姆183、泊洛沙姆184、泊洛沙姆185、泊洛沙姆188、泊洛沙姆212、泊洛沙姆215、泊洛沙姆217、泊洛沙姆231、泊洛沙姆234、泊洛沙姆235、泊洛沙姆237、泊洛沙姆238、泊洛沙姆282、泊洛沙姆284、泊洛沙姆288、泊洛沙姆331、泊洛沙姆333、泊洛沙姆334、泊洛沙姆335、泊洛沙姆338、泊洛沙姆401、泊洛沙姆402、泊洛沙姆403和泊洛沙姆407。
在一些实施方案中，聚山梨醇酯是
Figure BDA0003064795710003183
Figure BDA0003064795710003191
在一些实施方案中，脱水山梨糖醇的衍生物是
Figure BDA0003064795710003192
Figure BDA0003064795710003193
在一些实施方案中，脂质纳米颗粒中非离子表面活性剂的浓度范围为约0.00001％w/v至约1％w/v，例如约0.00005％w/v至约0.5％w/v或约0.0001％w/v至约0.1％w/v。
在一些实施方案中，脂质纳米颗粒中非离子表面活性剂的浓度范围为约0.000001wt％至约1wt％，例如约0.000002wt％至约0.8wt％或约0.000005wt％至约0.5wt％。
在一些实施方案中，脂质纳米颗粒中PEG脂质的浓度为约0.01mol％至约50mol％，例如约0.05mol％至约20mol％、约0.07mol％至约10mol％、约0.1mol％至约8mol％、约0.2mol％至约5mol％或约0.25mol％至约3mol％。
佐剂
在一些实施方案中，本发明的LNP任选地包含一种或多种佐剂，例如吡喃葡萄糖基脂质佐剂(GLA)、CpG寡聚脱氧核糖核苷酸(例如，A类或B类)、聚(I:C)、氢氧化铝和Pam3CSK4。
其他组分
本发明的LNP除前述部分所述的那些之外，还可任选地包含一种或多种组分。例如，脂质纳米颗粒可包括一种或多种疏水性小分子，如维生素(例如，维生素A或维生素E)或甾醇。
脂质纳米颗粒还可包含一种或多种渗透性增强剂分子、碳水化合物、聚合物、表面改变剂或其他组分。渗透性增强剂分子可以是例如美国专利申请公布号2005/0222064所描述的分子。碳水化合物可包括单糖(例如，葡萄糖)和多糖(例如，糖原及其衍生物和类似物)。
聚合物可以被包括在脂质纳米颗粒中和/或用于包封或部分包封脂质纳米颗粒。聚合物可以是可生物降解的和/或生物相容的。聚合物可选自但不限于聚胺、聚醚、聚酰胺、聚酯、聚氨基甲酸酯、聚脲、聚碳酸酯、聚苯乙烯、聚酰亚胺、聚砜、聚氨基甲酸乙酯、聚乙炔、聚乙烯、聚乙烯亚胺、聚异氰酸酯、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯腈和聚芳酯。例如，聚合物可包括聚(己内酯)(PCL)、乙烯乙酸乙烯酯聚合物(EVA)、聚(乳酸)(PLA)、聚(L-乳酸)(PLLA)、聚(乙醇酸)(PGA)、聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)、聚(L-乳酸-共-乙醇酸)(PLLGA)、聚(D,L-丙交酯)(PDLA)、聚(L-丙交酯)(PLLA)、聚(D,L-丙交酯-共-己内酯)、聚(D,L-丙交酯-共-己内酯-共-乙交酯)、聚(D,L-丙交酯-共-PEO-共-D,L-丙交酯)、聚(D,L-丙交酯-共-PPO-共-D,L-丙交酯)、聚氰基丙烯酸烷酯、聚氨酯、聚L-赖氨酸(PLL)、甲基丙烯酸羟基丙酯(HPMA)、聚乙二醇、聚L-谷氨酸、聚(羟基酸)、聚酐、聚原酸酯、聚(酯酰胺)、聚酰胺、聚(酯醚)、聚碳酸酯、聚烯烃(如聚乙烯和聚丙烯)、聚烷二醇(如聚(乙二醇)(PEG))、聚氧化烯(PEO)、聚对苯二甲酸烷二酯(如聚(对苯二甲酸乙二酯))、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯醚、聚乙烯基酯(如聚(乙酸乙烯酯))、聚乙烯基卤化物(如聚(乙烯基氯)(PVC))、聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)、聚硅氧烷、聚苯乙烯(PS)、聚氨酯、衍生化纤维素(如烷基纤维素、羟基烷基纤维素、纤维素醚、纤维素酯、硝基纤维素、羟丙基纤维素、羧甲基纤维素)、丙烯酸聚合物(如聚((甲基)丙烯酸甲酯)(PMMA)、聚((甲基)丙烯酸乙酯)、聚((甲基)丙烯酸丁酯)、聚((甲基)丙烯酸异丁酯)、聚((甲基)丙烯酸己酯)、聚((甲基)丙烯酸异癸酯)、聚((甲基)丙烯酸月桂酯)、聚((甲基)丙烯酸苯酯)、聚(丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸异丙酯)、聚(丙烯酸异丁酯)、聚(丙烯酸十八烷酯)以及其共聚物和混合物)、聚二噁烷酮及其共聚物、聚羟基烷酸酯、聚富马酸丙二酯、聚甲醛、泊洛沙姆、泊洛沙胺、聚(原酸)酯、聚(丁酸)、聚(戊酸)、聚(丙交酯-共-己内酯)、三亚甲基碳酸酯、聚(N-丙烯酰基吗啉)(PAcM)、聚(2-甲基-2-噁唑啉)(PMOX)、聚(2-乙基-2-噁唑啉)(PEOZ)以及聚甘油。
表面改变剂可包括但不限于阴离子蛋白质(例如，牛血清白蛋白)、表面活性剂(例如，阳离子表面活性剂，如二甲基双十八烷基-溴化铵)、糖或糖衍生物(例如，环糊精)、核酸、聚合物(例如，肝素、聚乙二醇和泊洛沙姆)、粘液溶解剂(例如，乙酰半胱氨酸、艾蒿、菠萝蛋白酶(bromelain)、木瓜蛋白酶、大青(clerodendrum)、溴己新(bromhexine)、羧甲司坦(carbocisteine)、依普拉酮(eprazinone)、美司钠(mesna)、氨溴索(ambroxol)、索布瑞醇(sobrerol)、多米奥醇(domiodol)、来托司坦(letosteine)、司替罗宁(stepronin)、硫普罗宁(tiopronin)、凝溶胶蛋白(gelsolin)、胸腺肽(thymosin)β4、链球菌DNA酶α(dornasealfa)、奈替克新(neltenexine)和厄多司坦(erdosteine))和DNA酶(例如，rhDNA酶)。可将表面改变剂安置在纳米颗粒内和/或LNP表面上(例如通过涂布、吸附、共价连接或其他方法)。
脂质纳米颗粒还可包含一种或多种官能化脂质。例如，脂质可以用炔基官能化，该炔基当在适当反应条件下暴露于叠氮化物时可能经历环加成反应。具体地，脂质双层可以通过这一方式，用一个或多个可有效地促进膜渗透、细胞识别或成像的基团官能化。LNP的表面还可与一种或多种有用的抗体缀合。可用于靶向细胞递送、成像和膜渗透的官能团和缀合物是本领域众所周知的。
除这些组分之外，脂质纳米颗粒可包括可用于药物组合物中的任何物质。例如，脂质纳米颗粒可包括一种或多种药学上可接受的赋形剂或辅助成分，如但不限于一种或多种溶剂、分散介质、稀释剂、分散助剂、悬浮助剂、造粒助剂、崩解剂、填充剂、助流剂、液体媒介物、粘合剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂或乳化剂、缓冲剂、润滑剂、油、防腐剂和其他物质。还可包括赋形剂，如蜡、黄油、着色剂、涂布剂、调味剂和芳香剂。药学上可接受的赋形剂是本领域中众所周知的(参见例如，Remington’s The Science and Practice of Pharmacy,第21版,A.R.Gennaro；Lippincott,Williams&Wilkins,Baltimore,MD,2006)。
稀释剂的实例可包括但不限于碳酸钙、碳酸钠、磷酸钙、磷酸二钙、硫酸钙、磷酸氢钙、磷酸钠、乳糖、蔗糖、纤维素、微晶纤维素、高岭土、甘露糖醇、山梨糖醇、肌醇、氯化钠、干淀粉、玉米淀粉、粉末状糖和/或它们的组合。造粒剂和分散剂可选自由以下组成的非限制性列表：马铃薯淀粉、玉米淀粉、木薯淀粉、羟基乙酸淀粉钠、粘土、海藻酸、瓜尔胶、柑桔渣、琼脂、膨润土、纤维素和木制品、天然海绵、阳离子交换树脂、碳酸钙、硅酸盐、碳酸钠、交联聚(乙烯基-吡咯烷酮)(交联聚维酮)、羧甲基淀粉钠(羟基乙酸淀粉钠)、羧甲基纤维素、交联羧甲基纤维素(croscarmellose)钠、甲基纤维素、预胶凝淀粉(淀粉1500)、微晶淀粉、不溶于水的淀粉、羧甲基纤维素钙、硅酸铝镁
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月桂基硫酸钠、季铵化合物和/或它们的组合。
表面活性剂和/或乳化剂可包括但不限于天然乳化剂(例如阿拉伯胶、琼脂、海藻酸、海藻酸钠、黄芪胶、角叉菜(chondrux)、胆固醇、黄原胶、果胶、明胶、蛋黄、酪蛋白、羊毛脂、胆固醇、蜡和卵磷脂)、胶质粘土(例如，膨润土[硅酸铝]和
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[硅酸铝镁])、长链氨基酸衍生物、高分子量醇(例如，硬脂醇、鲸蜡醇、油醇、三醋精单硬脂酸酯、乙二醇二硬脂酸酯、甘油单硬脂酸酯和丙二醇单硬脂酸酯、聚乙烯醇)、卡波姆(carbomer)(例如，羧基聚亚甲基、聚丙烯酸、丙烯酸聚合物和羧基乙烯基聚合物)、角叉菜胶、纤维素衍生物(例如，羧基甲基纤维素钠、粉末状纤维素、羟甲基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、甲基纤维素)、脱水山梨糖醇脂肪酸酯(例如，聚氧乙烯脱水山梨糖醇单月桂酸酯
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聚氧乙烯脱水山梨糖醇
Figure BDA0003064795710003224
聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯
Figure BDA0003064795710003225
脱水山梨糖醇单棕榈酸酯
Figure BDA0003064795710003226
脱水山梨糖醇单硬脂酸酯
Figure BDA0003064795710003227
脱水山梨糖醇三硬脂酸酯
Figure BDA0003064795710003228
甘油单油酸酯、脱水山梨糖醇单油酸酯
Figure BDA0003064795710003229
聚氧乙烯酯(例如，聚氧乙烯单硬脂酸酯
Figure BDA0003064795710003231
聚氧乙烯氢化蓖麻油、聚乙氧基化蓖麻油、聚氧亚甲基硬脂酸酯和
Figure BDA0003064795710003232
)、蔗糖脂肪酸酯、聚乙二醇脂肪酸酯(例如，
Figure BDA0003064795710003233
)、聚氧乙烯醚(例如，聚氧乙烯月桂基醚
Figure BDA0003064795710003234
)、聚(乙烯基-吡咯烷酮)、二乙二醇单月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯、油酸钠、油酸钾、油酸乙酯、油酸、月桂酸乙酯、月桂基硫酸钠、
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鲸蜡烷三甲基溴化铵、绿化鲸蜡基吡啶、苯扎氯铵、多库酯钠和/或它们的组合。
粘合剂可以是淀粉(例如，玉米淀粉和淀粉糊浆)；明胶；糖(例如，蔗糖、葡萄糖、右旋糖、糊精、糖蜜、乳糖、乳糖醇、甘露糖醇)；天然和合成胶状物(例如，阿拉伯胶、海藻酸钠、爱尔兰苔藓提取物、panwar胶、印度树胶、依莎贝果壳粘胶(mucilage of isapol husks)、羧甲基纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、微晶纤维素、乙酸纤维素、聚(乙烯基-吡咯烷酮)、硅酸铝镁
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和松木阿拉伯半乳聚糖(larch arabogalactan))；海藻酸盐；聚氧化乙烯；聚乙二醇；无机钙盐；硅酸；聚甲基丙烯酸酯；蜡；水；醇；和它们的组合，或任何其他适合的粘合剂。
防腐剂的实例可包括但不限于抗氧化剂、螯合剂、抗微生物防腐剂、抗真菌防腐剂、醇类防腐剂、酸性防腐剂和/或其他防腐剂。抗氧化剂的实例包括但不限于α生育酚、抗坏血酸、棕榈酸抗坏血酸酯、丁基化羟基苯甲醚、丁基化羟基甲苯、单硫代甘油、焦亚硫酸钾、丙酸、没食子酸丙酯、抗坏血酸钠、亚硫酸氢钠、焦亚硫酸钠和/或亚硫酸钠。螯合剂的实例包括乙二胺四乙酸(EDTA)、柠檬酸单水合物、依地酸二钠(disodium edetate)、依地酸二钾、依地酸、富马酸、苹果酸、磷酸、依地酸钠、酒石酸和/或依地酸三钠。抗微生物防腐剂的实例包括但不限于苯扎氯铵、苄索氯铵(benzethoniumchloride)、苯甲醇、溴硝醇(bronopol)、西曲溴胺(cetrimide)、鲸蜡基氯化吡啶、氯己定(chlorhexidine)、氯丁醇、氯甲酚(chlorocresol)、氯二甲苯酚(chloroxylenol)、甲酚(cresol)、乙醇、甘油、海克替啶(hexetidine)、伊咪脲(imidurea)、苯酚、苯氧基乙醇、苯乙醇、硝酸苯汞(phenylmercuricnitrate)、丙二醇和/或硫柳汞(thimerosal)。抗真菌防腐剂的实例包括但不限于对羟基苯甲酸丁酯、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、苯甲酸、羟基苯甲酸、苯甲酸钾、山梨酸钾、苯甲酸钠、丙酸钠和/或山梨酸。醇类防腐剂的实例包括但不限于乙醇、聚乙二醇、苯甲醇、苯酚、酚类化合物、双酚、氯丁醇、羟基苯甲酸酯和/或苯乙醇。酸性防腐剂的实例包括但不限于维生素A、维生素C、维生素E、β-胡萝卜素、柠檬酸、乙酸、脱氢抗坏血酸、抗坏血酸、山梨酸和/或植酸。其他防腐剂包括但不限于生育酚、生育酚乙酸酯、甲磺酸地特肟(deteroximemesylate)、西曲溴铵、丁基化羟基苯甲醚(BHA)、丁基化羟基甲苯(BHT)、乙二胺、月桂基硫酸钠(SLS)、月桂基醚硫酸钠(SLES)、亚硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钾、焦亚硫酸钾、
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对羟基苯甲酸甲酯、
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Figure BDA0003064795710003244
NEOLONETM、KATHONTM和/或
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缓冲剂的实例包括但不限于柠檬酸盐缓冲溶液、乙酸盐缓冲溶液、磷酸盐缓冲溶液、氯化铵、碳酸钙、氯化钙、柠檬酸钙、葡乳醛酸钙、葡庚糖酸钙、葡糖酸钙、d-葡糖酸、甘油磷酸钙、乳酸钙、乳糖醛酸钙、丙酸、乙酰丙酸钙、戊酸、磷酸二钙、磷酸、磷酸三钙、三碱式磷酸钙、乙酸钾、氯化钾、葡糖酸钾、钾混合物、磷酸二钾、磷酸一钾、磷酸钾混合物、乙酸钠、碳酸氢钠、氯化钠、柠檬酸钠、乳酸钠、磷酸二钠、磷酸一钠、磷酸钠混合物、氨丁三醇、氨基磺酸盐缓冲液(例如，HEPES)、氢氧化镁、氢氧化铝、海藻酸、无热原质水、等渗生理盐水、林格氏溶液(Ringer's solution)、乙醇和/或它们的组合。润滑剂可选自由以下组成的非限制性组：硬脂酸镁、硬脂酸钙、硬脂酸、二氧化硅、滑石、麦芽、山嵛酸甘油酯、氢化植物油、聚乙二醇、苯甲酸钠、乙酸钠、氯化钠、亮氨酸、月桂基硫酸镁、月桂基硫酸钠以及它们的组合。
油的实例包括但不限于杏仁油、杏桃仁油、鳄梨油、巴巴苏油、佛手柑油、黑醋栗油、琉璃苣油、杜松油、洋甘菊油、芥花油、葛缕子油、巴西棕榈油、蓖麻油、肉桂油、可可脂、椰子油、鳕鱼肝油、咖啡油、玉米油、棉籽油、鸸鹋油、尤加利油(eucalyptus)、月见草油、鱼油、亚麻籽油、草叶油、葫芦油、葡萄籽油、榛子油、海索油(hyssop)、肉豆蔻酸异丙酯、荷荷巴油、石栗油、杂薰衣草油、薰衣草油、柠檬油、山苍子油、澳洲坚果油、锦葵油、芒果籽油、池花籽油、貂油、肉豆蔻油、橄榄油、橙油、大西洋胄胸鲷油(orange roughy)、棕榈油、棕榈仁油、桃仁油、花生油、罂粟籽油、南瓜籽油、菜籽油、米糠油、迷迭香油、红花油、檀木油、山茶花油、香薄荷油、沙棘油、芝麻油、乳木果油、硅酮、大豆油、向日葵油、茶树油、蓟油、山茶油、延兰草油、核桃油和小麦胚芽油，以及硬脂酸丁酯、辛酸甘油三酯、癸酸甘油三酯、环甲基硅酮、癸二酸二乙酯、二甲基硅酮360、西甲硅油(simethicone)、肉豆蔻酸异丙酯、矿物油、辛基十二烷醇、油醇、硅油和/或它们的组合。
LNP组合物
本文所述的脂质纳米颗粒可被设计用于一种或多种特定应用或目标。脂质纳米颗粒的成分及其相对量可基于特定应用或目标，和/或基于一种或多种成分的功效、毒性、费用、易用性、可用率或其他特征选择。相似地，脂质纳米颗粒的特定配制物可根据例如特定成分组合的功效和毒性，针对特定应用或目标选择。脂质纳米颗粒配制物的功效和耐受性可能受配制物稳定性的影响。
各种组分的成分可按特定比例，例如摩尔百分数提供。
例如，在任一前述或相关方面，本公开的LNP包含结构脂质或其盐。在一些方面，结构脂质是胆固醇或其盐。在其他方面，胆固醇的mol％为LNP中存在的植物甾醇的mol％的约1％％至50％。在其他方面，胆固醇的mol％为LNP中存在的植物甾醇的mol％的约10％％至40％。在一些方面，胆固醇的mol％为LNP中存在的植物甾醇的mol％的约20％％至30％。在其他方面，胆固醇的mol％为LNP中存在的植物甾醇的mol％的约30％。
在任一前述或相关方面，本公开的LNP包含约30mol％至约60mol％的可电离脂质、约0mol％至约30mol％的磷脂、约18.5mol％至约48.5mol％的甾醇，以及约0mol％至约10mol％的PEG脂质。
在任一前述或相关方面，本公开的LNP包含约35mol％至约55mol％的可电离脂质、约5mol％至约25mol％的磷脂、约30mol％至约40mol％的甾醇，以及约0mol％至约10mol％的PEG脂质。
在任一前述或相关方面，本公开的LNP包含约50mol％的可电离脂质、约10mol％的磷脂、约38.5mol％的甾醇，以及约1.5mol％的PEG脂质。
在某些实施方案中，脂质纳米颗粒的可电离脂质组分包括约30mol％至约60mol％的可电离脂质、约0mol％至约30mol％的非阳离子辅助脂质、约18.5mol％至约48.5mol％的植物甾醇(任选地包括一种或多种结构脂质)，以及约0mol％至约10mol％的PEG脂质，前提条件是总mol％不超过100％。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒的可电离脂质组分包括约35mol％至约55mol％的可电离脂质、约5mol％至约25mol％的非阳离子辅助脂质、约30mol％至约40mol％的植物甾醇(任选地包括一种或多种结构脂质)，以及约0mol％至约10mol％的PEG脂质。在一个特定实施方案中，脂质组分包括约50mol％的可电离脂质、约10mol％的非阳离子辅助脂质、约38.5mol％的植物甾醇(任选地包括一种或多种结构脂质)，以及约1.5mol％的PEG脂质。在另一个特定实施方案中，脂质组分包括约40mol％的可电离脂质、约20mol％的非阳离子辅助脂质、约38.5mol％的植物甾醇(任选地包括一种或多种结构脂质)，以及约1.5mol％的PEG脂质。在一些实施方案中，植物甾醇可以是β-谷甾醇，非阳离子辅助脂质可以是磷脂如DOPE、DSPC或磷脂替代物如油酸。在其他实施方案中，PEG脂质可以是PEG-DMG并且/或者结构脂质可以是胆固醇。
在一些方面，本公开的LNP包含约30mol％至约60mol％的可电离脂质、约0mol％至约30mol％的非阳离子辅助脂质、约18.5mol％至约48.5mol％的植物甾醇，以及约0mol％至约10mol％的PEG脂质。在一些方面，本公开的LNP包含约30mol％至约60mol％的可电离脂质、约0mol％至约30mol％的非阳离子辅助脂质、约18.5mol％至约48.5mol％的植物甾醇和结构脂质，以及约0mol％至约10mol％的PEG脂质。在一些方面，本公开的LNP包含约30mol％至约60mol％的可电离脂质、约0mol％至约30mol％的非阳离子辅助脂质、约18.5mol％至约48.5mol％的植物甾醇和胆固醇，以及约0mol％至约10mol％的PEG脂质。
在一些方面，本公开的LNP包含约35mol％至约55mol％的可电离脂质、约5mol％至约25mol％的非阳离子辅助脂质、约30mol％至约40mol％的植物甾醇，以及约0mol％至约10mol％的PEG脂质。在一些方面，本公开的LNP包含约35mol％至约55mol％的可电离脂质、约5mol％至约25mol％的非阳离子辅助脂质、约30mol％至约40mol％的植物甾醇和结构脂质，以及约0mol％至约10mol％的PEG脂质。在一些方面，本公开的LNP包含约35mol％至约55mol％的可电离脂质、约5mol％至约25mol％的非阳离子辅助脂质、约30mol％至约40mol％的植物甾醇和胆固醇，以及约0mol％至约10mol％的PEG脂质。
在一些方面，本公开的LNP包含约50mol％的可电离脂质、约10mol％的非阳离子辅助脂质、约38.5mol％的植物甾醇，以及约1.5mol％的PEG脂质。在一些方面，本公开的LNP包含约50mol％的可电离脂质、约10mol％的非阳离子辅助脂质、约38.5mol％的植物甾醇和结构脂质，以及约1.5mol％的PEG脂质。在一些方面，本公开的LNP包含约50mol％的可电离脂质、约10mol％的非阳离子辅助脂质、约38.5mol％的植物甾醇和胆固醇，以及约1.5mol％的PEG脂质。
在一些方面，本公开的LNP包含约40mol％的可电离脂质、约20mol％的非阳离子辅助脂质、约38.5mol％的植物甾醇，以及约1.5mol％的PEG脂质。在一些方面，本公开的LNP包含约40mol％的可电离脂质、约20mol％的非阳离子辅助脂质、约38.5mol％的植物甾醇和结构脂质，以及约1.5mol％的PEG脂质。在一些方面，本公开的LNP包含约40mol％的可电离脂质、约20mol％的非阳离子辅助脂质、约38.5mol％的植物甾醇和胆固醇，以及约1.5mol％的PEG脂质。
在一些方面，本公开的LNP包含约45mol％的可电离脂质、约10mol％的非阳离子辅助脂质、约38.5mol％的植物甾醇，以及约1.5mol％的PEG脂质。在一些方面，本公开的LNP包含约45mol％的可电离脂质、约10mol％的非阳离子辅助脂质、约38.5mol％的植物甾醇和结构脂质，以及约1.5mol％的PEG脂质。在一些方面，本公开的LNP包含约45mol％的可电离脂质、约10mol％的非阳离子辅助脂质、约38.5mol％的植物甾醇和胆固醇，以及约1.5mol％的PEG脂质。
在一些方面，本公开的LNP包含约55mol％的可电离脂质、约5mol％的非阳离子辅助脂质、约38.5mol％的植物甾醇，以及约1.5mol％的PEG脂质。在一些方面，本公开的LNP包含约55mol％的可电离脂质、约5mol％的非阳离子辅助脂质、约38.5mol％的植物甾醇和结构脂质，以及约1.5mol％的PEG脂质。在一些方面，本公开的LNP包含约55mol％的可电离脂质、约5mol％的非阳离子辅助脂质、约38.5mol％的植物甾醇和胆固醇，以及约1.5mol％的PEG脂质。
在一些方面，本公开的LNP包含约60mol％的可电离脂质、约5mol％的非阳离子辅助脂质、约33.5mol％的植物甾醇，以及约1.5mol％的PEG脂质。在一些方面，本公开的LNP包含约60mol％的可电离脂质、约5mol％的非阳离子辅助脂质、约33.5mol％的植物甾醇和结构脂质，以及约1.5mol％的PEG脂质。在一些方面，本公开的LNP包含约60mol％的可电离脂质、约5mol％的非阳离子辅助脂质、约33.5mol％的植物甾醇和胆固醇，以及约1.5mol％的PEG脂质。
在一些方面，本公开的LNP包含约45mol％的可电离脂质、约20mol％的非阳离子辅助脂质、约33.5mol％的植物甾醇，以及约1.5mol％的PEG脂质。在一些方面，本公开的LNP包含约45mol％的可电离脂质、约20mol％的非阳离子辅助脂质、约33.5mol％的植物甾醇和结构脂质，以及约1.5mol％的PEG脂质。在一些方面，本公开的LNP包含约45mol％的可电离脂质、约20mol％的非阳离子辅助脂质、约33.5mol％的植物甾醇和胆固醇，以及约1.5mol％的PEG脂质。
在一些方面，本公开的LNP包含约50mol％的可电离脂质、约20mol％的非阳离子辅助脂质、约28.5mol％的植物甾醇，以及约1.5mol％的PEG脂质。在一些方面，本公开的LNP包含约50mol％的可电离脂质、约20mol％的非阳离子辅助脂质、约28.5mol％的植物甾醇和结构脂质，以及约1.5mol％的PEG脂质。在一些方面，本公开的LNP包含约50mol％的可电离脂质、约20mol％的非阳离子辅助脂质、约28.5mol％的植物甾醇和胆固醇，以及约1.5mol％的PEG脂质。
在一些方面，本公开的LNP包含约55mol％的可电离脂质、约20mol％的非阳离子辅助脂质、约23.5mol％的植物甾醇，以及约1.5mol％的PEG脂质。在一些方面，本公开的LNP包含约55mol％的可电离脂质、约20mol％的非阳离子辅助脂质、约23.5mol％的植物甾醇和结构脂质，以及约1.5mol％的PEG脂质。在一些方面，本公开的LNP包含约55mol％的可电离脂质、约20mol％的非阳离子辅助脂质、约23.5mol％的植物甾醇和胆固醇，以及约1.5mol％的PEG脂质。
在一些方面，本公开的LNP包含约60mol％的可电离脂质、约20mol％的非阳离子辅助脂质、约18.5mol％的植物甾醇，以及约1.5mol％的PEG脂质。在一些方面，本公开的LNP包含约60mol％的可电离脂质、约20mol％的非阳离子辅助脂质、约18.5mol％的植物甾醇和结构脂质，以及约1.5mol％的PEG脂质。在一些方面，本公开的LNP包含约60mol％的可电离脂质、约20mol％的非阳离子辅助脂质、约18.5mol％的植物甾醇和胆固醇，以及约1.5mol％的PEG脂质。
在一些方面，本公开的LNP包含约40mol％的可电离脂质、约15mol％的非阳离子辅助脂质、约43.5mol％的植物甾醇，以及约1.5mol％的PEG脂质。在一些方面，本公开的LNP包含约40mol％的可电离脂质、约15mol％的非阳离子辅助脂质、约43.5mol％的植物甾醇和结构脂质，以及约1.5mol％的PEG脂质。在一些方面，本公开的LNP包含约40mol％的可电离脂质、约15mol％的非阳离子辅助脂质、约43.5mol％的植物甾醇和胆固醇，以及约1.5mol％的PEG脂质。
在一些方面，本公开的LNP包含约50mol％的可电离脂质、约15mol％的非阳离子辅助脂质、约33.5mol％的植物甾醇，以及约1.5mol％的PEG脂质。在一些方面，本公开的LNP包含约50mol％的可电离脂质、约15mol％的非阳离子辅助脂质、约33.5mol％的植物甾醇和结构脂质，以及约1.5mol％的PEG脂质。在一些方面，本公开的LNP包含约50mol％的可电离脂质、约15mol％的非阳离子辅助脂质、约33.5mol％的植物甾醇和胆固醇，以及约1.5mol％的PEG脂质。
在一些方面，本公开的LNP包含约55mol％的可电离脂质、约15mol％的非阳离子辅助脂质、约28.5mol％的植物甾醇，以及约1.5mol％的PEG脂质。在一些方面，本公开的LNP包含约55mol％的可电离脂质、约15mol％的非阳离子辅助脂质、约28.5mol％的植物甾醇和结构脂质，以及约1.5mol％的PEG脂质。在一些方面，本公开的LNP包含约55mol％的可电离脂质、约15mol％的非阳离子辅助脂质、约28.5mol％的植物甾醇和胆固醇，以及约1.5mol％的PEG脂质。
在一些方面，本公开的LNP包含约60mol％的可电离脂质、约15mol％的非阳离子辅助脂质、约23.5mol％的植物甾醇，以及约1.5mol％的PEG脂质。在一些方面，本公开的LNP包含约60mol％的可电离脂质、约15mol％的非阳离子辅助脂质、约23.5mol％的植物甾醇和结构脂质，以及约1.5mol％的PEG脂质。在一些方面，本公开的LNP包含约60mol％的可电离脂质、约15mol％的非阳离子辅助脂质、约23.5mol％的植物甾醇和胆固醇，以及约1.5mol％的PEG脂质。
在一些方面，本公开的LNP包含约40mol％的可电离脂质、约10mol％的非阳离子辅助脂质、约48.5mol％的植物甾醇，以及约1.5mol％的PEG脂质。在一些方面，本公开的LNP包含约40mol％的可电离脂质、约10mol％的非阳离子辅助脂质、约48.5mol％的植物甾醇和结构脂质，以及约1.5mol％的PEG脂质。在一些方面，本公开的LNP包含约40mol％的可电离脂质、约10mol％的非阳离子辅助脂质、约48.5mol％的植物甾醇和胆固醇，以及约1.5mol％的PEG脂质。
在一些方面，本公开的LNP包含约45mol％的可电离脂质、约10mol％的非阳离子辅助脂质、约43.5mol％的植物甾醇，以及约1.5mol％的PEG脂质。在一些方面，本公开的LNP包含约45mol％的可电离脂质、约10mol％的非阳离子辅助脂质、约43.5mol％的植物甾醇和结构脂质，以及约1.5mol％的PEG脂质。在一些方面，本公开的LNP包含约45mol％的可电离脂质、约10mol％的非阳离子辅助脂质、约43.5mol％的植物甾醇和胆固醇，以及约1.5mol％的PEG脂质。
在一些方面，本公开的LNP包含约55mol％的可电离脂质、约10mol％的非阳离子辅助脂质、约33.5mol％的植物甾醇，以及约1.5mol％的PEG脂质。在一些方面，本公开的LNP包含约55mol％的可电离脂质、约10mol％的非阳离子辅助脂质、约33.5mol％的植物甾醇和结构脂质，以及约1.5mol％的PEG脂质。在一些方面，本公开的LNP包含约55mol％的可电离脂质、约10mol％的非阳离子辅助脂质、约33.5mol％的植物甾醇和胆固醇，以及约1.5mol％的PEG脂质。
在一些方面，本公开的LNP包含约60mol％的可电离脂质、约10mol％的非阳离子辅助脂质、约28.5mol％的植物甾醇，以及约1.5mol％的PEG脂质。在一些方面，本公开的LNP包含约60mol％的可电离脂质、约10mol％的非阳离子辅助脂质、约28.5mol％的植物甾醇和结构脂质，以及约1.5mol％的PEG脂质。在一些方面，本公开的LNP包含约60mol％的可电离脂质、约10mol％的非阳离子辅助脂质、约28.5mol％的植物甾醇和胆固醇，以及约1.5mol％的PEG脂质。
在一些方面，本公开的LNP包含约40mol％的可电离脂质、约5mol％的非阳离子辅助脂质、约53.5mol％的植物甾醇，以及约1.5mol％的PEG脂质。在一些方面，本公开的LNP包含约40mol％的可电离脂质、约5mol％的非阳离子辅助脂质、约53.5mol％的植物甾醇和结构脂质，以及约1.5mol％的PEG脂质。在一些方面，本公开的LNP包含约40mol％的可电离脂质、约5mol％的非阳离子辅助脂质、约53.5mol％的植物甾醇和胆固醇，以及约1.5mol％的PEG脂质。
在一些方面，本公开的LNP包含约45mol％的可电离脂质、约5mol％的非阳离子辅助脂质、约48.5mol％的植物甾醇，以及约1.5mol％的PEG脂质。在一些方面，本公开的LNP包含约45mol％的可电离脂质、约5mol％的非阳离子辅助脂质、约48.5mol％的植物甾醇和结构脂质，以及约1.5mol％的PEG脂质。在一些方面，本公开的LNP包含约45mol％的可电离脂质、约5mol％的非阳离子辅助脂质、约48.5mol％的植物甾醇和胆固醇，以及约1.5mol％的PEG脂质。
在一些方面，本公开的LNP包含约50mol％的可电离脂质、约5mol％的非阳离子辅助脂质、约43.5mol％的植物甾醇，以及约1.5mol％的PEG脂质。在一些方面，本公开的LNP包含约50mol％的可电离脂质、约5mol％的非阳离子辅助脂质、约43.5mol％的植物甾醇和结构脂质，以及约1.5mol％的PEG脂质。在一些方面，本公开的LNP包含约50mol％的可电离脂质、约5mol％的非阳离子辅助脂质、约43.5mol％的植物甾醇和胆固醇，以及约1.5mol％的PEG脂质。
在一些方面，本公开的LNP包含约40mol％的可电离脂质、约20mol％的非阳离子辅助脂质、约40mol％的植物甾醇，以及约0mol％的PEG脂质。在一些方面，本公开的LNP包含约40mol％的可电离脂质、约20mol％的非阳离子辅助脂质、约40mol％的植物甾醇和结构脂质，以及约0mol％的PEG脂质。在一些方面，本公开的LNP包含约40mol％的可电离脂质、约20mol％的非阳离子辅助脂质、约40mol％的植物甾醇和胆固醇，以及约0mol％的PEG脂质。
在一些方面，本公开的LNP包含约45mol％的可电离脂质、约20mol％的非阳离子辅助脂质、约35mol％的植物甾醇，以及约0mol％的PEG脂质。在一些方面，本公开的LNP包含约45mol％的可电离脂质、约20mol％的非阳离子辅助脂质、约35mol％的植物甾醇和结构脂质，以及约0mol％的PEG脂质。在一些方面，本公开的LNP包含约45mol％的可电离脂质、约20mol％的非阳离子辅助脂质、约35mol％的植物甾醇和胆固醇，以及约0mol％的PEG脂质。
在一些方面，本公开的LNP包含约50mol％的可电离脂质、约20mol％的非阳离子辅助脂质、约30mol％的植物甾醇，以及约0mol％的PEG脂质。在一些方面，本公开的LNP包含约50mol％的可电离脂质、约20mol％的非阳离子辅助脂质、约30mol％的植物甾醇和结构脂质，以及约0mol％的PEG脂质。在一些方面，本公开的LNP包含约50mol％的可电离脂质、约20mol％的非阳离子辅助脂质、约30mol％的植物甾醇和胆固醇，以及约0mol％的PEG脂质。
在一些方面，本公开的LNP包含约55mol％的可电离脂质、约20mol％的非阳离子辅助脂质、约25mol％的植物甾醇，以及约0mol％的PEG脂质。在一些方面，本公开的LNP包含约55mol％的可电离脂质、约20mol％的非阳离子辅助脂质、约25mol％的植物甾醇和结构脂质，以及约0mol％的PEG脂质。在一些方面，本公开的LNP包含约55mol％的可电离脂质、约20mol％的非阳离子辅助脂质、约25mol％的植物甾醇和胆固醇，以及约0mol％的PEG脂质。
在一些方面，本公开的LNP包含约60mol％的可电离脂质、约20mol％的非阳离子辅助脂质、约20mol％的植物甾醇，以及约0mol％的PEG脂质。在一些方面，本公开的LNP包含约60mol％的可电离脂质、约20mol％的非阳离子辅助脂质、约20mol％的植物甾醇和结构脂质，以及约0mol％的PEG脂质。在一些方面，本公开的LNP包含约60mol％的可电离脂质、约20mol％的非阳离子辅助脂质、约20mol％的植物甾醇和胆固醇，以及约0mol％的PEG脂质。
在一些方面，本公开的LNP包含约40mol％的可电离脂质、约15mol％的非阳离子辅助脂质、约45mol％的植物甾醇，以及约0mol％的PEG脂质。在一些方面，本公开的LNP包含约40mol％的可电离脂质、约15mol％的非阳离子辅助脂质、约45mol％的植物甾醇和结构脂质，以及约0mol％的PEG脂质。在一些方面，本公开的LNP包含约40mol％的可电离脂质、约15mol％的非阳离子辅助脂质、约45mol％的植物甾醇和胆固醇，以及约0mol％的PEG脂质。
在一些方面，本公开的LNP包含约45mol％的可电离脂质、约15mol％的非阳离子辅助脂质、约40mol％的植物甾醇，以及约0mol％的PEG脂质。在一些方面，本公开的LNP包含约45mol％的可电离脂质、约15mol％的非阳离子辅助脂质、约40mol％的植物甾醇和结构脂质，以及约0mol％的PEG脂质。在一些方面，本公开的LNP包含约45mol％的可电离脂质、约15mol％的非阳离子辅助脂质、约40mol％的植物甾醇和胆固醇，以及约0mol％的PEG脂质。
在一些方面，本公开的LNP包含约50mol％的可电离脂质、约15mol％的非阳离子辅助脂质、约35mol％的植物甾醇，以及约0mol％的PEG脂质。在一些方面，本公开的LNP包含约50mol％的可电离脂质、约15mol％的非阳离子辅助脂质、约35mol％的植物甾醇和结构脂质，以及约0mol％的PEG脂质。在一些方面，本公开的LNP包含约50mol％的可电离脂质、约15mol％的非阳离子辅助脂质、约35mol％的植物甾醇和胆固醇，以及约0mol％的PEG脂质。
在一些方面，本公开的LNP包含约55mol％的可电离脂质、约15mol％的非阳离子辅助脂质、约30mol％的植物甾醇，以及约0mol％的PEG脂质。在一些方面，本公开的LNP包含约55mol％的可电离脂质、约15mol％的非阳离子辅助脂质、约30mol％的植物甾醇和结构脂质，以及约0mol％的PEG脂质。在一些方面，本公开的LNP包含约55mol％的可电离脂质、约15mol％的非阳离子辅助脂质、约30mol％的植物甾醇和胆固醇，以及约0mol％的PEG脂质。
在一些方面，本公开的LNP包含约60mol％的可电离脂质、约15mol％的非阳离子辅助脂质、约25mol％的植物甾醇，以及约0mol％的PEG脂质。在一些方面，本公开的LNP包含约60mol％的可电离脂质、约15mol％的非阳离子辅助脂质、约25mol％的植物甾醇和结构脂质，以及约0mol％的PEG脂质。在一些方面，本公开的LNP包含约60mol％的可电离脂质、约15mol％的非阳离子辅助脂质、约25mol％的植物甾醇和胆固醇，以及约0mol％的PEG脂质。
在一些方面，本公开的LNP包含约40mol％的可电离脂质、约10mol％的非阳离子辅助脂质、约50mol％的植物甾醇，以及约0mol％的PEG脂质。在一些方面，本公开的LNP包含约40mol％的可电离脂质、约10mol％的非阳离子辅助脂质、约50mol％的植物甾醇和结构脂质，以及约0mol％的PEG脂质。在一些方面，本公开的LNP包含约40mol％的可电离脂质、约10mol％的非阳离子辅助脂质、约50mol％的植物甾醇和胆固醇，以及约0mol％的PEG脂质。
在一些方面，本公开的LNP包含约45mol％的可电离脂质、约10mol％的非阳离子辅助脂质、约45mol％的植物甾醇，以及约0mol％的PEG脂质。在一些方面，本公开的LNP包含约45mol％的可电离脂质、约10mol％的非阳离子辅助脂质、约45mol％的植物甾醇和结构脂质，以及约0mol％的PEG脂质。在一些方面，本公开的LNP包含约45mol％的可电离脂质、约10mol％的非阳离子辅助脂质、约45mol％的植物甾醇和胆固醇，以及约0mol％的PEG脂质。
在一些方面，本公开的LNP包含约50mol％的可电离脂质、约0mol％的非阳离子辅助脂质、约48.5mol％的植物甾醇，以及约1.5mol％的PEG脂质。在一些方面，本公开的LNP包含约50mol％的可电离脂质、约0mol％的非阳离子辅助脂质、约48.5mol％的植物甾醇和结构脂质，以及约1.5mol％的PEG脂质。在一些方面，本公开的LNP包含约50mol％的可电离脂质、约0mol％的非阳离子辅助脂质、约48.5mol％的植物甾醇和胆固醇，以及约1.5mol％的PEG脂质。
在一些方面，本公开的LNP包含约50mol％的可电离脂质、约10mol％的非阳离子辅助脂质、约40mol％的植物甾醇，以及约0mol％的PEG脂质。在一些方面，本公开的LNP包含约50mol％的可电离脂质、约10mol％的非阳离子辅助脂质、约40mol％的植物甾醇和结构脂质，以及约0mol％的PEG脂质。在一些方面，本公开的LNP包含约50mol％的可电离脂质、约10mol％的非阳离子辅助脂质、约40mol％的植物甾醇和胆固醇，以及约0mol％的PEG脂质。
在一些方面，本公开的LNP包含约55mol％的可电离脂质、约10mol％的非阳离子辅助脂质、约35mol％的植物甾醇，以及约0mol％的PEG脂质。在一些方面，本公开的LNP包含约55mol％的可电离脂质、约10mol％的非阳离子辅助脂质、约35mol％的植物甾醇和结构脂质，以及约0mol％的PEG脂质。在一些方面，本公开的LNP包含约55mol％的可电离脂质、约10mol％的非阳离子辅助脂质、约35mol％的植物甾醇和胆固醇，以及约0mol％的PEG脂质。
在一些方面，本公开的LNP包含约60mol％的可电离脂质、约10mol％的非阳离子辅助脂质、约30mol％的植物甾醇，以及约0mol％的PEG脂质。在一些方面，本公开的LNP包含约60mol％的可电离脂质、约10mol％的非阳离子辅助脂质、约30mol％的植物甾醇和结构脂质，以及约0mol％的PEG脂质。在一些方面，本公开的LNP包含约60mol％的可电离脂质、约10mol％的非阳离子辅助脂质、约30mol％的植物甾醇和胆固醇，以及约0mol％的PEG脂质。
在关于本文实施方案的一些方面，本公开的LNP的植物甾醇和结构脂质组分包含约10:1至1:10的植物甾醇:结构脂质，如约10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9和1:10的植物甾醇:结构脂质(例如，β-谷甾醇:胆固醇)。
在一些实施方案中，LNP的植物甾醇组分是植物甾醇和结构脂质(如胆固醇)的共混物，其中植物甾醇(例如，β-谷甾醇)和结构脂质(例如，胆固醇)各自以特定摩尔％存在。例如，在一些实施方案中，脂质纳米颗粒包含15mol％至40mol％的植物甾醇(例如，β-谷甾醇)。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒包含约15mol％、16mol％、17mol％、18mol％、19mol％、20mol％、21mol％、22mol％、23mol％、24mol％、25mol％、26mol％、27mol％、28mol％、29mol％、30mol％、31mol％、32mol％、33mol％、34mol％、35mol％、36mol％、37mol％、38mol％、30mol％或40mol％的植物甾醇(例如，β-谷甾醇)和0mol％、1mol％、2mol％、3mol％、4mol％、5mol％、6mol％、7mol％、8mol％、9mol％、10mol％、11mol％、12mol％、13mol％、14mol％、15mol％、16mol％、17mol％、18mol％、19mol％、20mol％、21mol％、22mol％、23mol％、24mol％或25mol％的结构脂质(例如，胆固醇)。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒包含大于20mol％的植物甾醇(例如，β-谷甾醇)和小于20mol％的结构脂质(例如，胆固醇)，使得植物甾醇和结构脂质的总mol％在30mol％与40mol％之间。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒包含分别为约20mol％、约21mol％、约22mol％、约23mol％、约24mol％、约25mol％、约26mol％、约27mol％、约28mol％、约29mol％、约30mol％、约31mol％、约32mol％、约33mol％、约34mol％、约35mol％、约37mol％、约38mol％、约39mol％或约40mol％的植物甾醇(例如，β-谷甾醇)；和约19mol％、约18mol％、约17mol％、约16mol％、约15mol％、约14mol％、约13mol％、约12mol％、约11mol％、约10mol％、约9mol％、约8mol％、约7mol％、约6mol％、约5mol％、约4mol％、约3mol％、约2mol％、约1mol％或约0mol％的结构脂质(例如，胆固醇)。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒包含约28mol％的植物甾醇(例如，β-谷甾醇)和约10mol％的结构脂质(例如，胆固醇)。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒包含38.5％的总摩尔％的植物甾醇和结构脂质(例如，胆固醇)。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒包含28.5mol％的植物甾醇(例如，β-谷甾醇)和10mol％的结构脂质(例如，胆固醇)。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒包含18.5mol％的植物甾醇(例如，β-谷甾醇)和20mol％的结构脂质(例如，胆固醇)。
脂质纳米颗粒中核酸分子的量可取决于脂质纳米颗粒的尺寸、组成、所期望的目标和/或应用或其他特性，以及治疗剂和/或预防剂的特性。例如，可用于脂质纳米颗粒中的RNA的量可取决于RNA的尺寸、序列和其他特征。脂质纳米颗粒中一种或多种核酸分子和其他成分(例如，脂质)的相对量也可变化。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒中可电离脂质组分与一种或多种核酸分子的wt/wt比率可为约5:1至约60:1，如5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1、20:1、25:1、30:1、35:1、40:1、45:1、50:1和60:1。例如，可电离脂质组分与一种或多种核酸分子的wt/wt比率可为约10:1至约40:1。在某些实施方案中，wt/wt比率为约20:1。LNP中一种或多种核酸分子的量可例如使用吸收光谱法(例如，紫外线-可见光谱法)来测量。
在一些实施方案中，脂质纳米颗粒包括一种或多种RNA和一种或多种可电离脂质，可选择它们的量以提供特定的N:P比。组合物的N:P比是指一种或多种脂质中的氮原子与RNA中的磷酸基团的数量的摩尔比。一般来讲，较低的N:P比是优选的。可选择一种或多种RNA、脂质及其量以提供约2:1至约30:1，如2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、12:1、14:1、16:1、18:1、20:1、22:1、24:1、26:1、28:1或30:1的N:P比。在某些实施方案中，N:P比可为约2:1至约8:1。在其他实施方案中，N:P比为约5:1至约8:1。例如，N:P比可为约5.0:1、约5.5:1、约5.67:1、约5.7:1、约5.8:1、约5.9:1、约6.0:1、约6.5:1或约7.0:1。例如，N:P比可为约5.67:1。在另一个实施方案中，N:P比可为约5.8:1。
在一些实施方案中，包含脂质纳米颗粒的配制物还可包含盐，如氯化物盐。
在一些实施方案中，包含脂质纳米颗粒的配制物还可包含糖，如二糖。在一些实施方案中，配制物还包含糖但不包含盐，如氯化物盐。
物理特性
脂质纳米颗粒的特征可取决于其组分。例如，包括胆固醇作为结构脂质的脂质纳米颗粒可具有与包括不同结构脂质的脂质纳米颗粒不同的特征。类似地，脂质纳米颗粒的特征可取决于其组分的绝对或相对量。例如，包括较高摩尔分数的磷脂的脂质纳米颗粒可具有与包括较低摩尔分数的磷脂的脂质纳米颗粒不同的特征。特征还可取决于制备脂质纳米颗粒的方法和条件而变化。
脂质纳米颗粒可通过多种方法表征。例如，可使用显微术(例如，透射电子显微术或扫描电子显微术)检查脂质纳米颗粒的形态和尺寸分布。动态光散射或电势测定法(例如，电势测定滴定法)可用于测量ζ电势。动态光散射还可用于测定粒度。还可使用仪器如Zetasizer Nano ZS(Malvern Instruments Ltd,Malvern,Worcestershire,UK)测量脂质纳米颗粒的多种特征，如粒度、多分散指数和ζ电势。
如例如通过动态光散射(DLS)所测量，脂质纳米颗粒的平均尺寸可以在数十纳米与数百纳米之间。例如，平均尺寸可为约40nm至约150nm，如约40nm、45nm、50nm、55nm、60nm、65nm、70nm、75nm、80nm、85nm、90nm、95nm、100nm、105nm、110nm、115nm、120nm、125nm、130nm、135nm、140nm、145nm或150nm。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒的平均尺寸可为约50nm至约100nm、约50nm至约90nm、约50nm至约80nm、约50nm至约70nm、约50nm至约60nm、约60nm至约100nm、约60nm至约90nm、约60nm至约80nm、约60nm至约70nm、约70nm至约100nm、约70nm至约90nm、约70nm至约80nm、约80nm至约100nm、约80nm至约90nm或约90nm至约100nm。在某些实施方案中，脂质纳米颗粒的平均尺寸可为约70nm至约100nm。在一个特定实施方案中，平均尺寸可为约80nm。在其他实施方案中，平均尺寸可为约100nm。
脂质纳米颗粒可以是相对均质的。多分散指数可用于指示LNP的均质性，例如脂质纳米颗粒的粒度分布。如本文所用，“多分散指数”是描述体系的粒度分布的均质性的比率。较小的值(例如，小于0.3)指示较窄的粒度分布。较小(例如，小于0.3)多分散指数一般指示较窄的粒度分布。脂质纳米颗粒可具有约0至约0.25，如0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.10、0.11、0.12、0.13、0.14、0.15、0.16、0.17、0.18、0.19、0.20、0.21、0.22、0.23、0.24或0.25的多分散指数。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒的多分散指数可为约0.10至约0.20。
脂质纳米颗粒的ζ电势可用于指示组合物的电动电势。如本文所用，“ζ电势”是例如颗粒组合物中脂质的电动电势。
例如，ζ电势可描述脂质纳米颗粒的表面电荷。具有相对较低电荷，即带正电或带负电的脂质纳米颗粒一般是所希望的，因为带较高电荷的物质可能与体内的细胞、组织和其他元件发生不希望的相互作用。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒的ζ电势可为约-10mV至约+20mV、约-10mV至约+15mV、约-10mV至约+10mV、约-10mV至约+5mV、约-10mV至约0mV、约-10mV至约-5mV、约-5mV至约+20mV、约-5mV至约+15mV、约-5mV至约+10mV、约-5mV至约+5mV、约-5mV至约0mV、约0mV至约+20mV、约0mV至约+15mV、约0mV至约+10mV、约0mV至约+5mV、约+5mV至约+20mV、约+5mV至约+15mV或约+5mV至约+10mV。
核酸分子的包封效率描述了在制备后被包封在脂质纳米颗粒中或以其他方式与脂质纳米颗粒结合的核酸分子的量相对于所提供的初始量的比率。较高的包封效率是理想的(例如，接近100％)。包封效率可例如通过比较在用一种或多种有机溶剂或洗涤剂分裂脂质纳米颗粒前后含脂质纳米颗粒的溶液中核酸分子的量来测量。荧光可用于测量溶液中游离核酸分子(例如，RNA)的量。对于本文所述的脂质纳米颗粒，核酸分子的包封效率可为至少50％，例如50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。在一些实施方案中，包封效率可为至少80％。在某些实施方案中，包封效率可为至少90％。
脂质纳米颗粒可任选地包含一种或多种包衣。例如，脂质纳米颗粒可被配制成具有包衣的胶囊、膜片或片剂形式。包括本文所述的组合物的胶囊、膜片或片剂可具有任何有用尺寸、拉伸强度、硬度或密度。
药物组合物
本公开包括药物组合物，所述药物组合物包含与一种或多种药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂组合的本文所述的mRNA或纳米颗粒(例如，脂质纳米颗粒)。在特定实施方案中，mRNA存在于纳米颗粒，例如脂质纳米颗粒中。在特定实施方案中，mRNA或纳米颗粒存在于药物组合物中。在各个实施方案中，存在于药物组合物中的一种或多种mRNA被包封在纳米颗粒例如脂质纳米颗粒中。在特定实施方案中，第一mRNA与第二mRNA的摩尔比为约1:50、约1:25、约1:10、约1:5、约1:4、约1:3、约1:2、约1:1、约2:1、约3:1、约4:1，或者约5:1、约10:1、约25:1或约50:1。在特定实施方案中，第一mRNA与第二mRNA的摩尔比大于1:1。
在一些实施方案中，编码OX40L的第一mRNA、编码栓系IL-12的第二mRNA和编码细胞缔合性IL-15的至少第三mRNA以不同的重量比共同配制(例如，在LNP中)，例如每种mRNA具有相等数量(按重量计)或者任一种mRNA存在的量是其他mRNA的数量(按重量计)的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、75或100倍。
在一些实施方案中，编码OX40L的第一mRNA、编码栓系IL-12的第二mRNA和编码细胞缔合性IL-15的至少第三mRNA共同配制(例如，在LNP中)，其中每种mRNA或配制物中存在的任一种mRNA的质量不同。例如，第一mRNA相对于配制物(例如，LNP)中的第二和/或第三mRNA共同配制，其中第一mRNA存在的量是第二mRNA和/或第三mRNA的量的质量的10％-100％、20％-80％、30％-70％或40％-50％。在另一个实施方案中，第一mRNA和第二mRNA相对于配制物(例如，LNP)中的第三mRNA共同配制，其中第一mRNA和第二mRNA存在的量是第三mRNA的质量的10％-100％、20％-80％、30％-70％或40％-50％。
在一些实施方案中，OX40L:拴系IL-12:细胞缔合性IL-15mRNA以某一重量(质量)比共同配制(例如，在LNP中)，使得拴系IL-12和细胞缔合性IL-15mRNA的量大致相等，并且OX40LmRNA以较低的重量(质量)，如少1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5或5.0倍的重量(质量)存在。在一些实施方案中，OX40L:拴系IL-12:细胞缔合性IL-15mRNA以1:1:1重量(质量)比共同配制(例如，在LNP中)。在一些实施方案中，OX40L:拴系IL-12:细胞缔合性IL-15mRNA以0.1:1:1重量(质量)比共同配制(例如，在LNP中)。
在一些实施方案中，编码OX40L、拴系IL-12和细胞缔合性IL-15的mRNA中的任一者共同配制(例如，在LNP中)，其中一种mRNA的量是另一种mRNA的质量的10％-100％。在一些实施方案中，OX40L:拴系IL-12:细胞缔合性IL-15mRNA以0.1-1:0.1-1:0.1-1重量(质量)比共同配制(例如，在LNP中)。
在一些实施方案中，编码细胞缔合性IL-15多肽的mRNA是以1:1摩尔比共同配制(例如，在LNP中)的编码IL-15的mRNA和编码IL-15Rα的mRNA。在一些实施方案中，编码细胞缔合性IL-15多肽的mRNA是以1:1.4重量(质量)比共同配制(例如，在LNP中)的编码IL-15的mRNA和编码IL-15Rα的mRNA。因此，在一些实施方案中，编码OX40L:拴系IL-12:IL-15:IL-15Rα的mRNA的重量(质量)比为2.4:2.4:1:1.4。在一个实施方案中，本公开提供了一种LNP，所述LNP包含2.4:2.4:1:1.4重量(质量)比的编码OX40L:拴系IL-12:IL-15:IL-15Rα的mRNA。
在一些实施方案中，编码OX40L的第一mRNA与编码拴系IL-12的第二mRNA与编码可操作地连接至IL-15Rα的IL-15的第三mRNA的重量(质量)比为1:1:1。在一个实施方案中，本公开提供了一种LNP，所述LNP包含1:1:1重量(质量)比的编码OX40L:拴系IL-12:IL-15:IL-15Rα的mRNA。在一些实施方案中，编码OX40L的第一mRNA与编码拴系IL-12的第二mRNA与编码可操作地连接至IL-15Rα的IL-15的第三mRNA的重量(质量)比为约0.1:1:1。在一个实施方案中，本公开提供了一种LNP，所述LNP包含0.1:1:1重量(质量)比的编码OX40L:拴系IL-12:IL-15:IL-15Rα的mRNA。在一些实施方案中，编码OX40L的第一mRNA与编码栓系IL-12的第二mRNA与编码IL-15的第三mRNA与编码IL-15Rα的第四mRNA的重量(质量)比为2.4:2.4:1:1.4。在一个实施方案中，本公开提供了一种LNP，所述LNP包含2.4:2.4:1:1.4重量(质量)比的编码OX40L:拴系IL-12:IL-15:IL-15Rα的mRNA。在一些实施方案中，编码OX40L的第一mRNA与编码栓系IL-12的第二mRNA与编码IL-15的第三mRNA与编码IL-15Rα的第四mRNA的摩尔比为约0.24:2.4:1:1.4。在一个实施方案中，本公开提供了一种LNP，所述LNP包含0.24:2.4:1:1.4重量(质量)比的编码OX40L:拴系IL-12:IL-15:IL-15Rα的mRNA。
药物组合物可任选地包含一种或多种另外的活性物质，例如治疗和/或预防活性物质。本公开的药物组合物可以是无菌的和/或无热原的。在配制和/或制造药物制剂时的一般考虑事项可见于例如Remington:The Science and Practice of Pharmacy第21版,Lippincott Williams&Wilkins,2005(以引用方式整体并入本文)中。在特定实施方案中，药物组合物包含mRNA和脂质纳米颗粒或其复合物。
本文所述的药物组合物的配制物可通过药理学领域中已知或今后开发的任何方法来制备。一般来讲，此类制备方法包括以下步骤：使活性成分与赋形剂和/或一种或多种其他辅助成分缔合，接着如果必要和/或合乎需要，将产品划分、成形和/或包装成期望的单剂量或多剂量单位。
根据本公开的药物组合物中的活性成分、药学上可接受的赋形剂和/或任何其他成分的相对量将取决于所治疗受试者的身份、身材和/或状况而变化，并且进一步取决于组合物的施用途径而变化。举例来说，组合物可包含0.1％至100％，例如0.5％至70％、1％至30％、5％至80％或至少80％(w/w)的活性成分。
本公开的mRNA可使用一种或多种赋形剂配制，以便：(1)增大稳定性；(2)增加细胞转染；(3)允许持续释放或延迟释放(例如，从mRNA的贮库配制物中)；(4)改变生物分布(例如，将mRNA靶向特定组织或细胞类型)；(5)增加体内mRNA编码的多肽的翻译；和/或(6)改变体内mRNA编码的多肽的释放曲线。除传统的赋形剂如任何和所有溶剂、分散介质、稀释剂或其他液体媒介物、分散助剂或悬浮助剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂或乳化剂、防腐剂之外，本公开的赋形剂还可包括但不限于类脂质、脂质体、脂质纳米颗粒(例如，脂质体和胶束)、聚合物、脂质复合物、核-壳纳米颗粒、肽、蛋白质、碳水化合物、用mRNA转染的细胞(例如，用于移植到受试者体内)、透明质酸酶、纳米颗粒模拟物，以及它们的组合。因此，本公开的配制物可包含一种或多种赋形剂，每种赋形剂的量共同增加mRNA的稳定性，增加mRNA的细胞转染，增加mRNA编码的多肽的表达，和/或改变mRNA编码的多肽的释放曲线。此外，本公开的mRNA可使用自组装核酸纳米颗粒来配制。
用于配制药物组合物的各种赋形剂和制备所述组合物的技术在本领域中是已知的(参见Remington:The Science and Practice of Pharmacy,第21版,A.R.Gennaro,Lippincott,Williams&Wilkins,Baltimore,MD,2006；以引用方式整体并入本文)。常规赋形剂介质的使用可涵盖在本公开的范围内，除非任何常规赋形剂介质与物质或其衍生物不相容，方式为如产生任何不希望的生物效应或另外以有害的方式与药物组合物的任何其他组分相互作用。赋形剂可包括例如：抗粘剂、抗氧化剂、粘合剂、包衣、压缩助剂、崩解剂、染料(颜料)、软化剂、乳化剂、填充剂(稀释剂)、成膜剂或包衣、助流剂(流动增强剂)、润滑剂、防腐剂、印刷油墨、吸附剂、悬浮剂或分散剂、甜味剂以及水合用水。示例性赋形剂包括但不限于：丁基化羟基甲苯(BHT)、碳酸钙、磷酸氢二钙、硬脂酸钙、交联羧甲基纤维素钠、交联聚乙烯吡咯烷酮、柠檬酸、交联聚维酮、半胱氨酸、乙基纤维素、明胶、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、乳糖、硬脂酸镁、麦芽糖醇、甘露糖醇、甲硫氨酸、甲基纤维素、对羟基苯甲酸甲酯、微晶纤维素、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚维酮、预胶凝淀粉、对羟基苯甲酸丙酯、视黄醇棕榈酸酯、虫胶、二氧化硅、羧甲基纤维素钠、柠檬酸钠、羟基乙酸淀粉钠、山梨糖醇、淀粉(玉米)、硬脂酸、蔗糖、滑石、二氧化钛、维生素A、维生素E、维生素C和木糖醇。
在一些实施方案中，本文所述的配制物可包含至少一种药学上可接受的盐。可包括在本公开的配制物中的药学上可接受的盐的实例包括但不限于酸加成盐、碱金属或碱土金属盐、碱性残基如胺的无机或有机酸盐；酸性残基如羧酸的碱金属或有机盐等。代表性酸加成盐包括乙酸盐(acetate)、乙酸(acetic acid)盐、己二酸盐、海藻酸盐、抗坏血酸盐、天冬氨酸盐、苯磺酸盐(benzenesulfonate)、苯磺酸(benzene sulfonic acid)盐、苯甲酸盐、硫酸氢盐、硼酸盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、柠檬酸盐、环戊烷丙酸盐、二葡萄糖酸盐、十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、富马酸盐、葡庚糖酸盐、甘油磷酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、氢溴酸盐、盐酸盐、氢碘酸盐、2-羟基-乙磺酸盐、乳糖醛酸盐、乳酸盐、月桂酸盐、月桂基硫酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、甲磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、油酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、双羟萘酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、磷酸盐、苦味酸盐、新戊酸盐、丙酸盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、甲苯磺酸盐、十一酸盐、戊酸盐等。代表性碱金属或碱土金属盐包括钠、锂、钾、钙、镁等；以及无毒铵、季铵和胺阳离子，包括但不限于铵、四甲铵、四乙铵、甲胺、二甲胺、三甲胺、三乙胺、乙胺等。
在一些实施方案中，本文所述的配制物可包含至少一种类型的mRNA。作为非限制性实例，所述配制物可包含1、2、3、4、5或超过5种本文所述的mRNA。在一些实施方案中，本文所述的配制物可包含至少一种编码多肽的mRNA和至少一种核酸序列，如但不限于siRNA、shRNA、snoRNA和miRNA。
用于例如肠胃外施用的液体剂型包括但不限于药学上可接受的乳液、微乳液、纳米乳液、溶液、悬浮液、糖浆和/或酏剂。除活性成分之外，液体剂型还可包含本领域中常用的惰性稀释剂，例如像水或其他溶剂；增溶剂和乳化剂，如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苯甲酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺、油(尤其棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氢糠醇、聚乙二醇和脱水山梨糖醇脂肪酸酯，以及它们的混合物。除惰性稀释剂外，口服组合物还可包括佐剂，如润湿剂、乳化剂和/或悬浮剂。在用于肠胃外施用的某些实施方案中，将组合物与增溶剂如
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醇、油、改性油、二醇、聚山梨醇酯、环糊精、聚合物和/或它们的组合混合。
可注射制剂，例如无菌可注射水性或油性悬浮液，可根据已知技术使用合适的分散剂或润湿剂和/或悬浮剂来配制。无菌可注射制剂可以是于无毒肠胃外可接受的稀释剂和/或溶剂中的无菌可注射溶液、悬浮液和/或乳液，例如于1,3-丁二醇中的溶液。在可使用的可接受媒介物和溶剂之中有水、林格氏溶液、U.S.P.以及等渗氯化钠溶液。通常采用无菌不挥发性油作为溶剂或悬浮介质。出于此目的，可以采用任何温和的不挥发性油，包括合成甘油单酯或甘油二酯。脂肪酸(如油酸)可用于可注射液的制备。可注射配制物可例如通过滤过细菌截留过滤器，和/或通过并入呈无菌固体组合物形式的灭菌剂来进行灭菌，所述无菌固体组合物在使用前能够溶解或分散于无菌水或其他无菌可注射介质中。
在一些实施方案中，包含至少一种本文所述的mRNA的药物组合物施用至哺乳动物(例如，人)。尽管本文所提供的药物组合物的描述主要涉及适于向人施用的药物组合物，但本领域技术人员应当理解，此类组合物一般适于向任何其他动物施用，例如向非人哺乳动物施用。为了使适于向人施用的药物组合物适于向各种动物施用而对所述组合物进行的修改是众所周知的，并且普通技术的兽医药理学家可仅通过普通的(如果有的话)实验来设计和/或进行这种修改。预期施用药物组合物的受试者包括但不限于人和/或其他灵长类动物；哺乳动物，包括商业上相关的哺乳动物，如牛、猪、马、绵羊、猫、狗、小鼠和/或大鼠；和/或鸟类，包括商业上相关的鸟类，如家禽、鸡、鸭、鹅和/或火鸡。在特定实施方案中，为受试者提供两种或更多种本文所述的mRNA。在特定实施方案中，第一mRNA和第二mRNA在相同时间或在不同时间例如依序提供给受试者。在特定实施方案中，第一mRNA和第二mRNA在相同的药物组合物或配制物中提供给受试者，例如，以促进这两种mRNA被相同的细胞摄取。
本公开还包括药盒，所述药盒包括包含编码增强免疫应答的多肽的mRNA的容器。在另一个实施方案中，所述药盒包括容器，所述容器包含编码增强免疫应答的多肽的mRNA，以及编码一种或多种目标抗原的一种或多种另外的mRNA。在其他实施方案中，所述药盒包括包含编码增强免疫应答的多肽的mRNA的第一容器和包含编码一种或多种目标抗原的一种或多种mRNA的第二容器。在特定实施方案中，用于增强免疫应答的mRNA和编码一种或多种抗原的一种或多种mRNA存在于相同或不同的纳米颗粒和/或药物组合物中。在特定实施方案中，mRNA被冻干、干燥或冷冻干燥。
使用方法
在一些实施方案中，本公开提供了一种用于治疗有需要的受试者(例如，人受试者)的癌症的方法。在一些实施方案中，本公开提供了一种用于增强对癌症的免疫应答的方法。在一些实施方案中，本公开提供了一种用于增强对白血病细胞(例如，AML细胞)的免疫应答的方法。在一些实施方案中，本公开提供了一种用于增强对实体瘤的免疫应答的方法。在一些实施方案中，增强免疫应答包括刺激细胞因子产生。在另一个实施方案中，增强免疫应答包括增强细胞免疫(T细胞应答)，如激活T细胞。在一些实施方案中，增强免疫应答包括激活NK细胞。可通过本领域确立的用于评估免疫应答的多种方法来评估受试者中免疫应答的增强，所述方法包括但不限于通过对激活标志物进行细胞内染色来确定T细胞激活和NK细胞激活的水平。
播散性癌症
在一些实施方案中，本公开提供了一种用于治疗有需要的受试者(例如，人受试者)的播散性癌症的方法。在一些实施方案中，对播散性癌症的治疗包括增强对所述播散性癌症的免疫应答。播散性癌症包括转移性癌症和位于受试者循环(例如，血液)内的癌症，这些癌症通常不形成实体瘤。通常不形成实体瘤的播散性癌症包括但不限于具有大量髓系群体的癌症，以及多发性骨髓瘤和B细胞白血病。
在一些实施方案中，播散性癌症是血液学癌症。如本文所用，术语“血液学癌症”包括淋巴瘤、白血病、骨髓瘤或淋巴恶性肿瘤，以及脾脏和淋巴结的癌症。示例性淋巴瘤包括B细胞淋巴瘤(B细胞血液学癌症)和T细胞淋巴瘤。B细胞淋巴瘤包括霍奇金淋巴瘤和大多数非霍奇金淋巴瘤。B细胞淋巴瘤的非限制性实例包括弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、粘膜相关淋巴组织淋巴瘤、小细胞淋巴细胞淋巴瘤(与慢性淋巴细胞白血病重叠)、套细胞淋巴瘤(MCL)、伯基特淋巴瘤、纵隔大B细胞淋巴瘤、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症(Waldenstrom macroglobulinemia)、结边缘区B细胞淋巴瘤、脾边缘区淋巴瘤、血管内大B细胞淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤、淋巴瘤样肉芽肿病。T细胞淋巴瘤的非限制性实例包括结外T细胞淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、间变性大细胞淋巴瘤和血管免疫母细胞T细胞淋巴瘤。血液学恶性肿瘤还包括白血病，如但不限于继发性白血病、慢性淋巴细胞白血病、急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病和急性淋巴细胞白血病。血液学恶性肿瘤还包括骨髓瘤，如但不限于多发性骨髓瘤和冒烟型多发性骨髓瘤(smoldering multiple myeloma)。术语血液学恶性肿瘤涵盖其他血液学和/或B细胞或T细胞相关的癌症。
在一些实施方案中，播散性癌症是髓系恶性肿瘤。髓系恶性肿瘤包括骨髓增生异常综合征(MDS)、骨髓增生性病症或赘瘤(MPD)和急性髓系白血病(AML)。
在一些实施方案中，播散性癌症是原发性肿瘤的转移瘤。在一些实施方案中，播散性癌症是原发性肿瘤的先前转移瘤的转移瘤。在一些实施方案中，播散性癌细胞与原发性肿瘤或转移瘤分离并进入循环。此类播散性癌细胞可在远离衍生所述细胞的原发性肿瘤或转移瘤的位置处形成肿瘤。
实体瘤
在一些实施方案中，本公开提供了一种用于治疗有需要的受试者(例如，人受试者)的实体瘤的方法。在一些实施方案中，对实体瘤的治疗包括增强对实体瘤的免疫应答。
在一些实施方案中，所述方法包括肿瘤内施用本文所公开的组合物和/或mRNA。在一些实施方案中，肿瘤内施用全身性地促进免疫应答。在一些实施方案中，肿瘤内施用通过全身性地促进免疫应答而导致未治疗的肿瘤的缩小或延迟。
“实体瘤”包括但不限于肉瘤、黑素瘤、癌或其他实体瘤癌。“肉瘤”通常是指由类似胚胎性结缔组织的物质组成，并且通常由嵌入纤维状或均质物质中的紧密堆积的细胞组成的肿瘤。肉瘤包括但不限于软骨肉瘤、纤维肉瘤、淋巴肉瘤、黑素肉瘤、粘液肉瘤、骨肉瘤、阿贝迈斯肉瘤、脂肪性肉瘤、脂肪肉瘤、肺泡软组织肉瘤、成釉细胞肉瘤、葡萄状肉瘤、绿色肉瘤、绒毛膜癌、胚胎性肉瘤、维尔姆斯氏肿瘤肉瘤、子宫内膜肉瘤、间质肉瘤、尤文氏肉瘤、筋膜肉瘤、成纤维细胞肉瘤、巨细胞肉瘤、粒细胞肉瘤、何杰金氏肉瘤、自发性多发性出血肉瘤、B细胞的成免疫细胞肉瘤、淋巴瘤、T细胞的成免疫细胞肉瘤、詹森肉瘤、卡波西肉瘤、肝星形细胞肉瘤、血管肉瘤、白色肉瘤、恶性间叶瘤肉瘤、骨膜外肉瘤、骨网状细胞肉瘤、劳斯肉瘤、浆液囊性肉瘤、滑膜肉瘤，或毛细血管扩张性肉瘤。
术语“黑素瘤”是指起源于皮肤和其他器官的黑色素系统的肿瘤。可用本文所提供的化合物或方法治疗的黑素瘤包括例如肢端-雀斑样痣性黑素瘤、无黑色素性黑素瘤、良性幼年黑素瘤、克劳德曼黑素瘤、S91黑素瘤、哈-帕二氏黑素瘤、幼年黑素瘤、恶性雀斑样痣黑素瘤、恶性黑素瘤、转移性黑素瘤、结节状黑素瘤、指甲下黑素瘤或浅表扩散性黑素瘤。
术语“癌”是指由趋于浸润周围组织并产生转移的上皮细胞组成的恶性的新生长。示例性癌包括例如腺样囊性癌、腺癌、肾上腺皮质癌、肺泡癌、肺泡细胞癌、基底细胞癌、基底上皮细胞癌、基底细胞样癌、鳞状基底细胞癌、细支气管肺泡癌、细支气管癌、支气管癌、脑状癌、胆管细胞癌、绒毛膜癌、胶质性癌(colloid carcinoma)、粉刺状癌、子宫体癌、筛状癌、铠甲状癌、皮肤癌、圆柱细胞癌(cylindrical carcinoma)、柱状细胞癌(cylindricalcell carcinoma)、导管癌、硬癌(carcinoma durum)、胚胎性癌、髓样癌(encephaloidcarcinoma)、表皮样癌、腺样上皮细胞癌、外植癌、溃疡性癌、纤维癌、胶样癌(gelatiniformcarcinoma)、胶状癌(gelatinous carcinoma)、巨大细胞癌(giant cell carcinoma)、巨细胞癌(carcinoma gigantocellulare)、腺癌(glandular carcinoma)、粒层细胞癌、发母质癌、多血癌、肝细胞癌、许特耳细胞癌、透明细胞癌、肾上腺样癌、幼稚型胚胎性癌、原位癌、表皮内癌、上皮内癌、侵蚀性溃疡，库尔契茨基细胞癌，大细胞癌，透镜状癌、豆状癌、脂瘤样癌、淋巴上皮癌(lymphoepithelial carcinoma)、髓样癌(carcinoma medullare)、髓样癌(medullary carcinoma)、黑色素癌、软癌、粘液癌(mucinous carcinoma)、粘液癌(carcinoma muciparum)、粘液细胞癌(carcinoma mucocellulare)、粘液表皮样癌、粘液癌(carcinoma mucosum)、粘液癌(mucous carcinoma)、粘液瘤样癌、鼻咽癌、燕麦细胞癌、骨化性癌、骨样癌、乳头状癌、门静脉周癌、浸润前期癌、棘细胞癌、软糊状癌、肾脏的肾细胞癌、储备细胞癌、肉瘤样癌、施耐德氏癌、硬癌(scirrhous carcinoma)、阴囊癌、印戒细胞癌、单纯癌、小细胞癌、马铃薯状癌、球状细胞癌、梭形细胞癌、髓样癌(carcinomaspongiosum)、鳞癌、鳞状细胞癌、串癌(string carcinoma)、毛细管扩张性癌(carcinomatelangiectaticum)、毛细管扩张性癌(carcinoma telangiectodes)、移行细胞癌、结节性皮癌(carcinoma tuberosum)、结节性皮癌(tuberous carcinoma)、疣状癌或绒毛状癌。
适于根据本发明的方法治疗的癌症和/或肿瘤包括可经由直接肿瘤内和/或区域施用(即，在靶肿瘤区域内施用)可接近的那些。例如，通过简单的注射器注射即可接近的肿瘤易于治疗。其中注射需要一些成像和/或引导施用的肿瘤，和/或其中通过图像引导的经皮注射或导管/套管直接进入位或内窥镜检查实现注射的肿瘤也适于治疗。
在一些实施方案中，实体瘤包含免疫原性的肿瘤微环境。在一些实施方案中，免疫原性肿瘤微环境的特征在于较大程度的T细胞浸润和Th1细胞因子表达。在一些实施方案中，实体瘤包含免疫学上贫瘠的肿瘤微环境。在一些实施方案中，免疫学上贫瘠的肿瘤微环境的特征在于稀少的T细胞浸润。在一些实施方案中，实体瘤对免疫检查点疗法有抗性和/或无应答。Mosley等人描述了这些不同的肿瘤微环境(Mosley等人Rational Selection ofSyngenic Preclinical Tumor Models for Immunotherapeutic Drug Discovery,CancerImmunology Research,doi:10.1158/2326-6066.CIR-16-0114(2016)，以引用方式并入本文)。
在某些实施方案中，本文所述的mRNA可用于调节肿瘤微环境和/或可基于要治疗的受试者中的肿瘤微环境选择用于治疗。在一些实施方案中，mRNA用于治疗具有发炎的肿瘤微环境的肿瘤。在一些实施方案中，mRNA用于治疗具有免疫抑制性肿瘤微环境的肿瘤。在一些实施方案中，mRNA用于治疗具有免疫学上贫瘠的肿瘤微环境的肿瘤。
在一些实施方案中，本文所述的任何方法包括向受试者施用本公开的组合物(或其脂质纳米颗粒或其药物组合物)，所述组合物包含：
(i)编码人OX40L多肽的mRNA和编码可操作地连接至包含跨膜结构域的膜结构域的人IL-12多肽的mRNA；
(ii)编码人OX40L多肽的mRNA、编码人IL-15多肽的mRNA和编码人IL-15Rα多肽的mRNA；
(iii)编码人OX40L多肽的mRNA和编码可操作性地连接至人IL-15Rα多肽的人IL-15多肽的mRNA；
(iv)编码可操作地连接至包含跨膜结构域的膜结构域的人IL-12多肽的mRNA、编码人IL-15多肽的mRNA和编码人IL-15Rα多肽的mRNA；
(v)编码可操作地连接至包含跨膜结构域的膜结构域的人IL-12多肽的mRNA和编码可操作地连接至人IL-15Rα多肽的人IL-15多肽的mRNA；
(vi)编码人OX40L多肽的mRNA、编码可操作地连接至包含跨膜结构域的膜结构域的人IL-12多肽的mRNA、编码人IL-15多肽的mRNA和编码人IL-15Rα多肽的mRNA；或
(vii)编码人OX40L多肽的mRNA、编码可操作地连接至包含跨膜结构域的膜结构域的人IL-12多肽的mRNA和编码可操作地连接至人IL-15Rα多肽的人IL-15多肽的mRNA。
当使用多种mRNA时，它们可被例如共同配制在相同的脂质纳米颗粒中，和/或可被共同施用。或者，不同的mRNA可在不同时间施用至受试者。例如，一种mRNA组合物(例如，编码OX40L多肽)可在施用第二种mRNA组合物(例如，编码IL-12多肽和/或IL-15多肽)之前1-30天，例如3天、5天、7天、10天、14天、21天、28天施用。
将本公开的组合物以有效量施用至受试者。一般来讲，有效量的组合物将允许在细胞中有效产生编码的多肽。效率的度量可包括多肽翻译(由多肽表达指示)、mRNA降解水平和免疫应答指标。
本公开的用于治疗癌症(例如，实体瘤或播散性癌症如髓系恶性肿瘤)的方法可用于多种临床或治疗应用中。例如，所述方法可用于刺激患有癌症的受试者的抗癌免疫(例如，患有髓系恶性肿瘤的受试者的抗恶性肿瘤免疫)。
在某些实施方案中，向受试者施用至少一种本文所述的mRNA组合物。在相关实施方案中，向受试者提供或施用包含所述一种或多种mRNA的纳米颗粒(例如，脂质纳米颗粒)。在其他相关实施方案中，向受试者提供或向受试者施用本公开的药物组合物。在特定实施方案中，药物组合物包含如本文所述的一种或多种mRNA，或者所述药物组合物包含含有所述一种或多种mRNA的纳米颗粒。在特定实施方案中，所述一种或多种mRNA存在于纳米颗粒，例如脂质纳米颗粒中。在特定实施方案中，所述一种或多种mRNA或纳米颗粒存在于药物组合物中。
在一些实施方案中，将所述一种或多种mRNA、纳米颗粒或药物组合物肠胃外施用至患者。在特定实施方案中，受试者是哺乳动物，例如人。在各个实施方案中，向受试者提供有效量的所述一种或多种mRNA。
治疗癌症的方法还可包括用增强受试者中的抗肿瘤应答和/或对肿瘤具有细胞毒性的其他剂(例如，化学治疗剂)对受试者进行治疗。用于组合疗法中的合适治疗剂包括小分子化学治疗剂，包括蛋白质酪氨酸激酶抑制剂，以及生物抗癌剂，如抗癌抗体，包括但不限于以下进一步讨论的那些。组合疗法可包括向受试者施用增强抗肿瘤免疫的免疫检查点抑制剂，如PD-1抑制剂、PD-L1抑制剂和CTLA-4抑制剂以及它们的组合(例如，PD-1抑制剂+CTLA-4抑制剂，PD-L1抑制剂+CTLA-4抑制剂，或PD-1抑制剂+PD-L1抑制剂)。在一个实施方案中，调节免疫检查点的剂是抗体。在另一个实施方案中，调节免疫检查点的剂是蛋白质或小分子调节剂。在另一个实施方案中，所述剂(如mRNA)编码免疫检查点的抗体调节剂。可用于组合疗法中的免疫检查点抑制剂的非限制性实例包括派姆单抗、阿仑单抗、纳武单抗、皮地立珠单抗、奥法木单抗、MEDI0680和PDR001、AMP-224、PF-06801591、BGB-A317、REGN2810、SHR-1210、TSR-042、affimer、阿维鲁单抗(avelumab)(MSB0010718C)、阿特珠单抗(atezolizumab)(MPDL3280A)、德瓦鲁单抗(durvalumab)(MEDI4736)、BMS936559、伊匹单抗(ipilimumab)、替西木单抗(tremelimumab)、AGEN1884、MEDI6469和MOXR0916。
在一个实施方案中，单剂量的本公开的mRNA(例如，编码人OX40L多肽的mRNA+编码拴系人IL-12多肽的mRNA+编码人IL-15多肽的mRNA+编码人IL-15Rα的多肽的mRNA(或编码可操作地连接至人IL-15Rα多肽的人IL-15多肽的mRNA))与至少一种免疫检查点抑制剂(例如，抗CTLA-4、抗PD-L1、抗PD-1或它们的组合)治疗组合使用。在另一个实施方案中，多剂量(例如，Q7Dx3)的本公开的mRNA(例如，编码人OX40L多肽的mRNA+编码拴系人IL-12多肽的mRNA+编码人IL-15多肽的mRNA+编码人IL-15Rα的多肽的mRNA(或编码可操作地连接至人IL-15Rα多肽的人IL-15多肽的mRNA))与至少一种免疫检查点抑制剂(例如，抗CTLA-4、抗PD-L1、抗PD-1或它们的组合)治疗组合使用。免疫检查点抑制剂治疗可包括施用单剂量的检查点抑制剂，或更典型地施用多剂量的检查点抑制剂。
可通过任何合适的途径将包含本公开的一种或多种mRNA的药物组合物施用至受试者。在一些实施方案中、本公开的组合物是通过多种途径中的一个或多个施用，包括肠胃外(例如，皮下、皮内、静脉内、腹膜内、肌肉内、关节内、动脉内、滑膜内、胸骨内、鞘内、病灶内或颅内注射，以及任何合适的输液技术)、口服、透皮或皮内、间皮(interdermal)、直肠、阴道内、表面(例如，通过粉末、软膏、乳膏、凝胶、洗剂和/或滴剂)、粘膜、鼻、颊、肠、玻璃体、肿瘤内、舌下、鼻内；通过气管内滴注、支气管滴注和/或吸入；呈经口喷雾和/或粉末、鼻喷雾和/或气雾剂形式，和/或通过门静脉导管施用。在一些实施方案中、组合物可经静脉内、肌肉内、皮内、动脉内、肿瘤内、皮下或通过吸入施用。在一些实施方案中，组合物通过静脉内施用。然而，考虑到药物递送科学中可能的进展，本公开涵盖通过任何适当途径递送本公开的组合物。一般来讲，最适当的施用途径将取决于多种因素，包括含一种或多种mRNA的药物组合物的性质(例如，其在各种身体环境如血流和胃肠道中的稳定性)、患者的状况(例如，患者是否能耐受特定施用途径)。
在某些实施方案中，施用的本公开的组合物的剂量水平可足以在给定剂量内递送约0.0001mg/kg至约10mg/kg、约0.001mg/kg至约10mg/kg、约0.005mg/kg至约10mg/kg、约0.01mg/kg至约10mg/kg、约0.1mg/kg至约10mg/kg、约1mg/kg至约10mg/kg、约2mg/kg至约10mg/kg、约5mg/kg至约10mg/kg、约0.0001mg/kg至约5mg/kg、约0.001mg/kg至约5mg/kg、约0.005mg/kg至约5mg/kg、约0.01mg/kg至约5mg/kg、约0.1mg/kg至约10mg/kg、约1mg/kg至约5mg/kg、约2mg/kg至约5mg/kg、约0.0001mg/kg至约1mg/kg、约0.001mg/kg至约1mg/kg、约0.005mg/kg至约1mg/kg、约0.01mg/kg至约1mg/kg或约0.1mg/kg至约1mg/kg，其中1mg/kg剂量提供每1kg受试者体重1mg mRNA或纳米颗粒。在特定实施方案中，可施用约0.005mg/kg至约5mg/kg的本公开mRNA或纳米颗粒的剂量。
剂量可每天以相同或不同量施用一次或多次，以获得期望的mRNA表达水平和/或效应(例如，治疗效应)。期望的剂量可例如以例如一天三次、一天二次、一天一次、每隔一天一次、每三天一次、每周一次、每两周一次、每三周一次或每四周一次递送。在某些实施方案中，期望的剂量可使用多次施用(例如，二次、三次、四次、五次、六次、七次、八次、九次、十次、十一次、十二次、十三次、十四次或更多次施用)单剂量递送，这称为“分次给药”。例如，期望的每周2mg/kg的剂量可通过在一周的过程中每周三次施用0.67mg/kg而不是单次施用2mg/kg大剂量来施用至受试者。在一些实施方案中，相对于相同总剂量的单次大剂量，分次给药方案产生增强的抗癌功效。在一些实施方案中，相对于相同总剂量的单次大剂量，分次给药方案产生较小的毒性。在一些实施方案中，相对于单次大剂量，分次给药方案更易被受试者耐受。在一些实施方案中，分次给药的功效增强是由于对mRNA编码的多肽的暴露增加或增强。测量暴露的方法包括但不限于测定样品中mRNA编码的多肽的浓度，测定mRNA编码的多肽的半衰期和/或测定样品(例如，血浆)中的药物浓度与时间的曲线下面积(AUC)。
在一些实施方案中，可例如在手术程序之前或之后或在急性疾病、病症或疾患的情况下施用单剂量。任何特定患者的特定治疗有效剂量、预防有效剂量或其他适当剂量水平将取决于多种因素，包括正在治疗的病症(如果有的话)的严重性和性质；所采用的一种或多种mRNA；所采用的特定组合物；患者的年龄、体重、健康状况、性别和饮食；施用时间；施用途径；和所采用的特定药物组合物的排泄率；治疗的持续时间；与所采用的特定药物组合物组合使用或偶然使用的药物；以及在医学领域众所周知的类似的因素。
在一些实施方案中，本公开的药物组合物可与另一种剂，例如另一种治疗剂、预防剂和/或诊断剂组合施用。“与……组合”不意欲表明这些剂必须在相同时间施用和/或被配制成一起递送，不过这些递送方法都在本公开的范围内。例如，包含一种或多种不同mRNA的一种或多种组合物可组合施用。组合物可在一种或多种其他期望的治疗剂或医疗程序的同时、之前或之后施用。一般来讲，各剂将以关于该剂所确定的剂量和/或时程施用。在一些实施方案中，本公开涵盖递送本公开的组合物或其成像、诊断性或预防性组合物与改善其生物利用率、降低和/或改良其代谢、抑制其排泄和/或改善其在体内的分布的剂的组合。
可与本公开的组合物组合施用的示例性治疗剂包括但不限于细胞毒性剂、化学治疗剂、低甲基化剂、促凋亡剂、小分子/激酶抑制剂，以及其他治疗剂，包括现在或以后批准用于癌症(如AML或MDS)的治疗剂。细胞毒性剂可包括例如紫杉酚(taxol)、细胞松弛素B(cytochalasin B)、短杆菌肽D(gramicidin D)、溴化乙锭(ethidium bromide)、依米丁(emetine)、丝裂霉素(mitomycin)、依托泊苷(etoposide)、替尼泊苷(teniposide)、长春新碱、长春碱、秋水仙碱(colchicine)、多柔比星、柔红霉素(daunorubicin)、二羟基蒽二酮(dihydroxyanthracinedione)、米托蒽醌、光辉霉素(mithramycin)、放线菌素D、1-去氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因(procaine)、丁卡因(tetracaine)、利多卡因(lidocaine)、普萘洛尔、嘌呤霉素、类美登素(maytansinoid)、拉奇霉素(rachelmycin)及其类似物。放射性离子也可用作治疗剂，并且包括例如放射性碘、锶、磷、钯、铯、铱、钴、钇、钐和镨。其他治疗剂可包括例如抗代谢物(例如，甲氨蝶呤、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷和5-氟尿嘧啶和达卡巴嗪(decarbazine))、烷化剂(例如，氮芥(mechlorethamine)、噻替哌(thiotepa)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、拉奇霉素、美法仑(melphalan)、卡莫司汀(carmustine)、罗莫司丁(lomustine)、环磷酰胺、白消安(busulfan)、二溴甘露醇、链脲佐菌素、丝裂霉素C和顺二氯二胺络铂(II)(DDP)，和顺铂)、蒽环霉素(例如，柔红霉素和多柔比星)、抗生素(例如，更生霉素、博莱霉素、光辉霉素和安曲霉素)，以及抗有丝分裂剂(例如，长春新碱、长春碱、紫杉酚和类美登素)。
用于以组合方案使用的疗法(治疗剂或程序)的特定组合将考虑到期望的治疗剂和/或程序和要实现的期望治疗效应的相容性。还应当理解，所采用的疗法可针对相同病症实现期望的效应(例如，可用于治疗癌症的组合物可与化学治疗剂同时施用)，或者这些疗法可实现不同效应(例如，控制任何不利效应)。
药盒
在一些实施方案中，本公开提供了一种包含本文所述的mRNA的药盒。例如，在一些实施方案中，其包含共同配制在脂质纳米颗粒中的(i)编码OX40L多肽的mRNA；(ii)编码IL-12多肽的mRNA；(iii)编码IL-15多肽的mRNA；和(iv)编码IL-15Rα多肽的mRNA。在一些实施方案中，其包含共同配制在脂质纳米颗粒中的(i)编码OX40L多肽的mRNA；(ii)编码IL-12多肽的mRNA；(iii)编码可操作地连接至IL-15Rα多肽的IL-15的mRNA。因此，在一些实施方案中，药盒包括：容器，所述容器包括包封本文所述的mRNA的脂质纳米颗粒和任选的药学上可接受的载体，或药物组合物；以及包装插入物，所述包装插入物包括用于施用所述脂质纳米颗粒或药物组合物的说明书。在一些实施方案中，药盒包括：容器，所述容器包括包封本文所述的mRNA的脂质纳米颗粒和任选的药学上可接受的载体，或药物组合物；以及包装插入物，所述包装插入物包括用于施用脂质纳米颗粒或药物组合物以治疗个体的癌症(例如，实体瘤或播散性癌症如髓系恶性肿瘤)或延迟癌症的进展的说明书。在一些方面，所述包装插入物还包括用于将脂质纳米颗粒或药物组合物与包含检查点抑制剂多肽和任选的药学上可接受的载体的组合物组合施用以治疗个体的癌症(例如，实体瘤或播散性癌症如髓系恶性肿瘤)或延迟癌症的进展的说明书。
在一些实施方案中，药盒包括：药物，所述药物包含包封本文所述的mRNA的脂质纳米颗粒和任选的药学上可接受的载体；或药物组合物；以及包装插入物，所述包装插入物包括用于单独地或与包含检查点抑制剂多肽和任选的药学上可接受的载体的组合物组合地施用所述药物的说明书。在一些实施方案中，药盒包括：药物，所述药物包含包封本文所述的mRNA的脂质纳米颗粒和任选的药学上可接受的载体，或药物组合物；以及包装插入物，所述包装插入物包括用于单独地或与包含检查点抑制剂多肽和任选的药学上可接受的载体的组合物组合地施用所述药物以治疗个体的癌症(例如，实体瘤或播散性癌症如髓系恶性肿瘤)或延迟癌症的进展的说明书。在一些方面，所述药盒还包括包装插入物，所述包装插入物包括用于在施用第二药物之前、同时或之后施用第一药物以治疗个体的癌症(例如，实体瘤或播散性癌症如髓系恶性肿瘤)或延迟癌症的进展的说明书。
定义
远位效应：如本文所用，“远位效应”是指在癌症(包括转移性癌症)的治疗中的现象，其中将治疗(例如，编码OX40L、拴系IL-12和细胞缔合性IL-15的mRNA)局部施用至肿瘤不仅导致所治疗的肿瘤的大小减小，而且导致治疗区域以外的肿瘤的大小减小。在一些实施方案中，远位效应是局部的区域性远位效应，其中相对于所治疗的肿瘤，近端或附近的肿瘤受到影响。在一些实施方案中，相对于所治疗的肿瘤，远端的肿瘤中发生远位效应。在一些实施方案中，通过肿瘤内注射施用治疗(例如，编码OX40L、拴系IL-12和细胞缔合性IL-15的mRNA)，导致所注射的肿瘤以及近端或远端未注射肿瘤的肿瘤大小减小。
施用：如本文所用，“施用”是指将组合物递送至受试者或患者的方法。可选择施用方法以靶向递送(例如，特异性地递送)至身体的特定区域或系统。例如，施用可以是肠胃外(例如，皮下、皮内、静脉内、腹膜内、肌肉内、关节内、动脉内、滑膜内、胸骨内、鞘内、病灶内或颅内注射，以及任何合适的输液技术)、口服、透皮或皮内、间皮(interdermal)、直肠、阴道内、表面(例如，通过粉末、软膏、乳膏、凝胶、洗剂和/或滴剂)、粘膜、鼻、颊、肠、玻璃体、肿瘤内、舌下、鼻内；通过气管内滴注、支气管滴注和/或吸入；呈经口喷雾和/或粉末、鼻喷雾和/或气雾剂形式，和/或通过门静脉导管施用。
大约，约：如本文所用，术语“大约”或“约”在应用于一个或多个目标值时，是指类似于所阐述的参考值的值。在某些实施方案中，术语“大约”或“大约”是指在所阐述的参考值的任一方向上的(大于或小于)25％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更小范围内的值的范围，除非另外说明或以其他方式从上下文显而易见(除了这样的数值将超过可能值的100％的情况)。
癌症：如本文所用，“癌症”是涉及异常和/或失调的细胞生长的疾患。术语癌症涵盖良性和恶性癌症。示例性的非限制性癌症包括肾上腺皮质癌、晚期癌症、肛门癌、再生障碍性贫血、胆管癌、膀胱癌、骨癌、骨转移、脑肿瘤、脑癌、乳腺癌、儿童癌症、原发灶不明癌症、卡斯尔曼氏病(Castleman disease)、宫颈癌、结直肠癌、子宫内膜癌、食道癌、尤文氏家族肿瘤、眼癌、胆囊癌、胃肠道类癌肿瘤、胃肠道间质瘤、妊娠滋养细胞疾病、霍奇金疾病、卡波西肉瘤、肾细胞癌、喉癌和下咽癌、急性淋巴细胞白血病、急性髓系白血病、慢性淋巴细胞白血病、慢性髓系白血病、慢性粒单核细胞白血病、骨髓增生异常综合征(包括难治性贫血和难治性细胞减少)、骨髓增生性赘瘤或疾病(包括真性红细胞增多症、原发性血小板增多症和原发性骨髓纤维化)、肝癌(例如，肝细胞癌)、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、肺类癌瘤、皮肤淋巴瘤、恶性间皮瘤、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合征、鼻腔和鼻窦癌、鼻咽癌、成神经细胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、口腔和口咽癌、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、阴茎癌、垂体瘤、前列腺癌、成视网膜细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、成人软组织肉瘤、基底和鳞状细胞皮肤癌、黑素瘤、小肠癌、胃癌、睾丸癌、喉癌、胸腺癌、甲状腺癌、子宫肉瘤、阴道癌、外阴癌、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、维尔姆斯氏肿瘤，以及由癌症治疗引起的继发性癌症。在一些实施方案中，癌症是肝癌(例如，肝细胞癌)、卵巢癌或结直肠癌。在其他实施方案中，癌症是基于血液的癌症或造血癌症。在一些实施方案中，癌症是髓系恶性肿瘤，如AML。
细胞缔合性：如本文所用，术语“细胞缔合性”是指mRNA编码的多肽在细胞表面上的位置，或者是天然的(例如，呈野生型形式)或者是经过设计的，由于改变mRNA编码的多肽(例如，通过重组技术)，使得所述多肽在表达时与细胞表面缔合。在一些实施方案中，“细胞缔合性”是指与细胞表面天然缔合的mRNA编码的多肽(例如，包括跨膜结构域)或在表达时编码缔合的多肽(例如，形成复合物)的mRNA的组合，其与细胞表面结合。例如，编码IL-15的mRNA和编码IL-15Rα的mRNA在表达时形成复合物，其中IL-15与膜结合受体缔合，从而将IL-15在与受体结合时限制在细胞表面。在其他实施方案中，“细胞缔合性”是指编码天然可溶性多肽(例如，细胞因子，如IL-12)的mRNA，所述多肽被工程化为包含膜结构域(例如，跨膜结构域)，所述膜结构域将所述多肽限制于细胞表面。在本文中这也称为栓系多肽或栓系细胞因子。
可切割接头：如本文所用，术语“可切割接头”是指可并入多顺反子mRNA构建体中使得可由同一mRNA产生等摩尔水平的多个基因的接头，通常是肽接头(例如，长度为约5-30个氨基酸，通常长度为约10-20个氨基酸)。可切割接头的非限制性实例包括2A肽家族，包括F2A、P2A、T2A和E2A，它们首次在小核糖核酸病毒中发现，当并入mRNA构建体(例如，在两个多肽结构域之间)时，通过使核糖体跳过2A元件的C末端处的肽键合成，从而导致2A序列的末端与下游的下一个肽之间的分离来发挥作用。
缀合：如本文所用，术语“缀合”当关于用于两个或更多个部分使用时，意指所述部分直接或通过一个或多个用作连接剂的其他部分彼此物理缔合或连接，以形成足够稳定的结构，使得所述部分在使用所述结构的条件(例如，生理条件)下保持物理缔合。在一些实施方案中，两个或更多个部分可通过直接共价化学键缀合。在其他实施方案中，两个或更多个部分可通过离子键合或氢键合缀合。
接触：如本文所用，术语“接触”是指在两个或更多个实体之间建立物理连接。例如，使细胞与mRNA或脂质纳米颗粒组合物接触是指使细胞和mRNA或脂质纳米颗粒共享物理连接。使细胞与外部实体在体内、体外和离体接触的方法在生物学领域中是众所周知的。在本公开的示例性实施方案中，使哺乳动物细胞与组合物(例如，本公开的分离的mRNA、纳米颗粒或药物组合物)接触的步骤在体内进行。例如，使脂质纳米颗粒组合物与可能置于生物体(例如，哺乳动物)体内的细胞(例如，哺乳动物细胞)接触可通过任何合适的施用途径(例如，肠胃外施用至生物体，包括静脉内、肌肉内、皮内和皮下施用)进行。对于体外存在的细胞，可例如通过将组合物(例如，脂质纳米颗粒或分离的mRNA)添加到细胞的培养基中来使所述组合物与所述细胞接触，并且可涉及或导致转染。此外，纳米颗粒组合物可接触多于一种细胞。
播散性癌症：如本文所用，术语“播散性癌症”是指受试者体内循环的癌细胞。在一些实施方案中，播散性癌细胞已与原发性肿瘤分离。在一些实施方案中，播散性癌症包括通常不形成实体瘤并且在受试者的整个循环中，例如在受试者的血液中发现的癌症。在一些实施方案中，播散性癌细胞是源自造血谱系的那些。在一些实施方案中，播散性癌症包括具有大量髓系群体如髓系恶性肿瘤的那些，以及淋巴瘤、白血病等。
包封：如本文所用，术语“包封”意指封闭、包围或封装。在一些实施方案中，化合物、mRNA或其他组合物可被完全包封，部分包封或基本上包封。例如，在一些实施方案中，本公开的mRNA可被包封在脂质纳米颗粒，例如脂质体中。
有效量：如本文所用，术语剂的“有效量”是足以产生有益或期望结果例如临床结果的量，且因此“有效量”取决于施加其的情形。例如，在施用治疗癌症的剂的情形下，剂的有效量是例如与没有施用所述剂所获得的应答相比，足以实现如本文所定义的癌症治疗的量。在一些实施方案中，治疗有效量是要递送的剂(例如，核酸、药物、治疗剂、诊断剂或预防剂)当施用至患有或易患感染、疾病、病症和/或疾患的受试者时足以改善所述感染、疾病、病症和/或疾患的症状，诊断所述感染、疾病、病症和/或疾患，预防所述感染、疾病、病症和/或疾患和/或延迟所述感染、疾病、病症和/或疾患的发作的量。
表达：如本文所用，核酸序列的“表达”是指以下事件中的一个或多个：(1)从DNA序列产生RNA模板(例如，通过转录)；(2)加工RNA转录物(例如，通过剪接、编辑、5’帽形成和/或3’端加工)；(3)RNA翻译成多肽或蛋白质；以及(4)多肽或蛋白质的翻译后修饰。
分次给药：如本文所用，“分次给药”是指这样的给药方案：其包括服用mRNA的预期剂量(例如，mRNA的总量)并在指定时间段内将所述预期剂量分成至少两个剂量(给药间隔，例如，每周一次、每两周一次、每两月一次)，使得将mRNA的预期剂量或总量在该时间段内以多剂量施用至受试者而不是按所述预期剂量的单次大剂量施用。在一些实施方案中，将一个剂量分成两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个剂量。在一些实施方案中，分次给药包括输注，其中随时间推移不断提供所述剂量。
片段：如本文所使用，“片段”是指部分。例如，蛋白质的片段可包括通过消化从培养的细胞中分离的全长蛋白质获得的多肽或通过重组DNA技术获得的多肽。
异源：如本文所用，“异源”表示一个序列(例如，氨基酸序列或编码氨基酸序列的核酸)通常不存在于给定多肽或核酸中。例如，对应于一个蛋白质的结构域或基序的氨基酸序列可与第二蛋白质异源。
疏水氨基酸：如本文所用，“疏水氨基酸”是具有不带电的非极性侧链的氨基酸。天然存在的疏水氨基酸的实例是丙氨酸(Ala)、缬氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)、异亮氨酸(Ile)、脯氨酸(Pro)、苯丙氨酸(Phe)、甲硫氨酸(Met)和色氨酸(Trp)。
同一性：如本文所用，术语“同一性”是指聚合分子之间，例如核酸分子(例如，DNA分子和/或RNA分子)之间和/或多肽分子之间的总体相关性。对两个mRNA序列的同一性百分比的计算例如可通过出于最优比较目的比对两个序列来进行(例如可在第一核酸序列和第二核酸序列中的一者或两者中引入空位以达成最优比对，并且可出于比较目的而忽视非同一序列)。在某些实施方案中，出于比较目的而比对的序列的长度为参考序列的长度的至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或100％。然后比较相应核苷酸位置处的核苷酸。当第一序列中的位置由与第二序列中的相应位置相同核苷酸占据时，那么在该位置的分子是相同的。两个序列之间的同一性百分比是在考虑需要被引入以达成两个序列的最优比对的空位的数目和各空位的长度的情况下，由序列共有的相同位置的数目的函数。序列的比较和两个序列之间一致性百分比的确定可使用数学算法来完成。例如，两个核酸序列之间的同一性百分比可使用如以下中所述的那些方法的方法确定：Computational Molecular Biology,Lesk,A.M.,编辑,Oxford UniversityPress,New York,1988；Biocomputing:Informatics and Genome Projects,Smith,D.W.,编辑,Academic Press,New York,1993；Sequence Analysis in Molecular Biology,vonHeinje,G.,Academic Press,1987；Computer Analysis of Sequence Data,第I部分,Griffin,A.M.和Griffin,H.G.,编辑,Humana Press,New Jersey,1994；以及SequenceAnalysis Primer,Gribskov,M.和Devereux,J.,编辑,M Stockton Press,New York,1991；所述文献各自以引用方式并入本文。例如，可使用Meyers和Miller(CABIOS,1989,4:11-17)的算法来确定两个核苷酸序列之间的同一性百分比，所述算法已被并入ALIGN程序(2.0版)中，所述程序使用PAM120权重残基表、空位长度罚分12和空位罚分4。两个核苷酸序列之间的同一性百分比可或者使用GCG软件包中的GAP程序，在利用NWSgapdna.CMP矩阵下确定。通常用于确定序列之间的同一性百分比的方法包括但不限于Carillo,H.和Lipman,D.,SIAMJ Applied Math.,48:1073(1988)中公开的那些；所述文献以引用方式并入本文。用于确定同一性的技术被编纂在可公开获得的计算机程序中。用以确定两个序列之间的同源性的示例性计算机软件包括但不限于GCG程序包(Devereux等人,Nucleic AcidsResearch,12(1):387,1984)、BLASTP、BLASTN和FASTA(Altschul,S.F.等人,J.Molec.Biol.,215,403,1990)。
免疫检查点抑制剂：“免疫检查点抑制剂”或简称“检查点抑制剂”是指阻止免疫细胞被癌细胞关闭的分子。如本文所用，术语检查点抑制剂是指多肽(例如，抗体)或编码此类多肽的多核苷酸(例如，mRNA)，所述多肽或多核苷酸中和或抑制抑制性检查点分子，如细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)、程序性死亡1受体(PD-1)或PD-1配体1(PD-L1)。
免疫应答：术语“免疫应答”是指例如淋巴细胞、抗原呈递细胞、吞噬细胞、粒细胞以及由上述细胞或肝脏产生的可溶性大分子(包括抗体、细胞因子和补体)的作用，所述作用产生侵入病原体、感染病原体的细胞或组织、癌细胞、或在自身免疫性或病理性炎症的情况下正常人细胞或组织的选择性损伤、破坏人体或从人体消除。在一些情况下，施用包含脂质组分和包封治疗剂的纳米颗粒可触发免疫应答，其可以由(i)包封的治疗剂(例如，mRNA)，(ii)这种包封的治疗剂的表达产物(例如，由mRNA编码的多肽)，(iii)纳米颗粒的脂质组分，或(iv)它们的组合引起。
插入：如本文所用，“插入”或“添加”是指氨基酸或核苷酸序列的变化，分别导致与参考序列例如在天然存在的分子中发现的序列相比分子中添加了一个或多个氨基酸残基或核苷酸。例如，异源多肽(例如，BH3结构域)的氨基酸序列可在适于插入的位点插入支架多肽(例如，SteA支架多肽)中。在一些实施方案中，插入可以是置换，例如，如果形成支架多肽的环(例如，SteA或SteA衍生物的环1或环2)的氨基酸序列被异源多肽的氨基酸序列置换。
插入位点：如本文所用，“插入位点”是支架多肽的适于插入异源多肽的氨基酸序列的位置或区域。应当理解，插入位点还可指编码多肽的mRNA的位置或区域(例如，编码支架多肽中的给定氨基酸的mRNA的密码子)。在一些实施方案中，将异源多肽的氨基酸序列插入支架多肽对支架多肽的稳定性(例如，构象稳定性)、表达水平或总体二级结构几乎没有影响。
细胞内结构域：如本文所用，术语“细胞内结构域”、“IC”和“ICD”是指位于细胞内部的多肽区域。在一些实施方案中，细胞内结构域将信号传递至细胞。在一些实施方案中，由本文所述的多核苷酸(例如，mRNA)编码的拴系IL-12多肽包含的细胞内结构域将信号传递至细胞。在一些实施方案中，由本文所述的多核苷酸(例如，mRNA)编码的拴系IL-12多肽包含的细胞内结构域不将信号传递至细胞。
分离的：如本文所使用，术语“分离的”是指已从其缔合(无论在自然中或在实验设置中)的至少一些组分中分离的物质或实体。分离的物质可相对于它们所缔合的物质具有不同水平的纯度。分离的物质和/或实体可从至少约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或更多的它们最初缔合的其他组分中分离。在一些实施方案中，分离的剂为大于约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或多于约99％纯。如本文所用，如果一种物质基本上不含其他组分，则该物质是“纯的”。
脂质体：如本文所用，“脂质体”意指包括封闭含水内部的含脂质的膜的结构。脂质体可具有一个或多个脂质膜。脂质体包括单层(single-layered)脂质体(在本领域中也称为单层(unilamellar)脂质体)和多层(multi-layered)脂质体(在本领域中也称为多层(multilamellar)脂质体)。
接头：如本文所用，“接头”(包括如本文提及的膜接头、亚基接头和异源肽接头)是指一组原子，例如10-1,000个原子，并且可包含原子或基团如但不限于碳、氨基、烷基氨基、氧、硫、亚砜、磺酰基、羰基和亚胺。接头可以在第一末端与核碱基或糖部分上的修饰核苷或核苷酸连接，且在第二末端与有效载荷(例如，可检测剂或治疗剂)连接。接头可具有足够的长度以不干扰并入核酸序列中。接头可用于任何有用的目的，如形成多核苷酸多聚体(例如，通过两个或更多个嵌合多核苷酸分子或IVT多核苷酸的连接)或多核苷酸缀合物，以及施用有效载荷，如本文所述。可并入接头中的化学基团的实例包括但不限于烷基、烯基、炔基、酰氨基、氨基、醚、硫醚、酯、亚烷基、杂亚烷基、芳基或杂环基，其各自均可如本文所述是任选取代的。接头的实例包括但不限于不饱和烷烃、聚乙二醇(例如，乙二醇或丙二醇单体单元，例如二乙二醇、二丙二醇、三乙二醇、三丙二醇、四乙二醇或四乙二醇)以及葡聚糖聚合物及其衍生物。其他实例包括但不限于接头内的可切割部分，例如像二硫键(-S-S-)或偶氮键(-N＝N-)，其可使用还原剂或光分解进行切割。选择性可切割键的非限制性实例包括可例如通过使用三(2-羧乙基)膦(TCEP)或其他还原剂和/或光分解切割的酰胺键，以及可例如通过酸性或碱性水解切割的酯键。
转移：如本文所用，术语“转移”是指癌症从最初作为原发性肿瘤出现的部位扩散到身体遥远部位的过程。由于该过程而引起的继发性肿瘤可称为“转移瘤”。
mRNA：如本文所用，“mRNA”是指信使核糖核酸。mRNA可以是天然或非天然存在的。例如，mRNA可包括修饰的和/或非天然存在的组分，如一个或多个核碱基、核苷、核苷酸或接头。mRNA可包括帽结构、链终止核苷、茎环、聚A序列和/或聚腺苷酸化信号。mRNA可具有编码多肽的核苷酸序列。mRNA的翻译，例如，哺乳动物细胞内部的mRNA的体内翻译可产生多肽。传统上，mRNA分子的基本组分包括至少一个编码区、5’非翻译区(5’UTR)、3’UTR、5’帽和聚A序列。
微RNA(miRNA)：如本文所用，“微RNA(miRNA)”是小的非编码RNA分子，可在基因表达的转录后调控中发挥作用(例如，通过RNA沉默，例如通过切割mRNA，通过缩短mRNA的聚A尾使其去稳定，和/或通过干扰核糖体将mRNA翻译为多肽的效率)。成熟的miRNA通常长约22个核苷酸。
微RNA-122(miR-122)：如本文所用，除非另外指明，否则“微RNA-122(miR-122)”是指来自任何脊椎动物来源(包括例如人)的任何天然miR-122。miR-122通常在肝脏中高表达，在肝脏中其可调节脂肪酸代谢。在肝癌，例如肝细胞癌中，miR-122水平降低。miR-122是肝脏中表达量最高的miRNA之一，在肝脏中其调节靶标，包括但不限于CAT-1、CD320、AldoA、Hjv、Hfe、ADAM10、IGFR1、CCNG1和ADAM17。成熟的人miR-122可具有序列AACGCCAUUAUCACACUAAAUA(SEQ ID NO:73，对应于hsa-miR-122-3p)或UGGAGUGUGACAAUGGUGUUUG(SEQ ID NO:82，对应于hsa-miR-122-5p)。
微小RNA-21(miR-21)：如本文所用，除非另外指明，否则“微RNA-21(miR-21)”是指来自任何脊椎动物来源(包括例如人)的任何天然miR-21。与正常肝脏相比，肝癌(例如，肝细胞癌)中的miR-21水平升高。成熟的人miR-21可具有序列UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA(SEQID NO:84，对应于has-miR-21-5p)或5’-CAACACCAGUCGAUGGGCUGU-3’(SEQ ID NO:85，对应于has-miR-21-3p)。
微小RNA-142(miR-142)：如本文所用，除非另外指明，否则“微RNA-142(miR-142)”是指来自任何脊椎动物来源(包括例如人)的任何天然miR-142。miR-142通常在骨髓细胞中高表达。成熟的人miR-142可具有序列UGUAGUGUUUCCUACUUUAUGGA(SEQ ID NO:127，对应于hsa-miR-142-3p)或CAUAAAGUAGAAAGCACUACU(SEQ ID NO:128，对应于hsa-miR-142-5p)。
微RNA(miRNA)结合位点：如本文所用，“微RNA(miRNA)结合位点”是指miRNA靶位点或miRNA识别位点，或miRNA所结合或缔合的任何核苷酸序列。在一些实施方案中，miRNA结合位点代表至少与miRNA的“种子”区域结合的mRNA的核苷酸位置或区域。应当理解，“结合”可遵循传统沃森-克里克(Watson-Crick)杂交规则或可反映微RNA与靶序列在或邻近微RNA位点处的任何稳定的缔合。
miRNA种子：如本文所用，miRNA的“种子”区是指成熟miRNA的2-8位区域中的序列，所述序列通常与miRNA结合位点具有完美的沃森-克里克互补性。miRNA种子可包含成熟miRNA的2-8或2-7位。在一些实施方案中，miRNA种子可包含7个核苷酸(例如，成熟miRNA的核苷酸2-8)，其中相应miRNA结合位点中的种子互补位点侧翼为与miRNA位置1相对的腺嘌呤(A)。在一些实施方案中，miRNA种子可包含6个核苷酸(例如，成熟miRNA的核苷酸2-7)，其中相应miRNA结合位点中的种子互补位点侧翼为miRNA位置1相对的腺嘌呤(A)。当提及miRNA结合位点时，miRNA种子序列理解为与结合至miRNA结合位点的miRNA种子序列具有互补性(例如，部分互补性、实质互补性或完整互补性)。
修饰的：如本文所用，“修饰的”是指本公开的分子的改变的状态或结构。可以许多方式，包括化学上、结构上和功能上的方式修饰分子。在一个实施方案中，本公开的mRNA分子通过引入非天然的核苷和/或核苷酸来修饰，例如在它涉及天然核糖核苷酸A、U、G和C时。非规范核苷酸如帽结构虽然它们不同于A、C、G、U核糖核苷酸的化学结构，但不被认为“修饰的”。
髓系恶性肿瘤：如本文所用，术语“髓系恶性肿瘤”是指以造血祖细胞中一种或多种获得性体细胞突变为特征的慢性和急性克隆性病症，如骨髓增生异常病症(MDS)和骨髓增生性赘瘤(MPN)。示例性的髓系恶性肿瘤包括但不限于急性髓系白血病(AML)和慢性粒单核细胞白血病(CMML)。此外，MPN包括多种疾病，如慢性髓系白血病(CML)和非CML MPN，如真性红细胞增多症(PV)、原发性血小板增多症(ET)和原发性骨髓纤维化(PMF)。
纳米颗粒：如本文所用，“纳米颗粒”是指具有小于约1000nm尺度的任何一种结构特征的颗粒，与相同材料的大块样品相比，所述颗粒表现出新颖的特性。常规地，纳米颗粒具有小于约500nm、小于约200nm或约100nm尺度的任何一种结构特征。同样常规地，纳米颗粒具有约50nm至约500nm、约50nm至约200nm或约70至约120nm尺度的任何一种结构特征。在示例性实施方案中，纳米颗粒是具有约1-1000nm量级的一个或多个尺寸的颗粒。在其他示例性实施方案中，纳米颗粒是具有约10-500nm量级的一个或多个尺寸的颗粒。在其他示例性实施方案中，纳米颗粒是具有约50-200nm量级的一个或多个尺寸的颗粒。球形纳米颗粒的直径将在例如约50-100或70-120纳米之间。就其运输和特性而言，纳米颗粒最常表现为一个单元。应注意，将纳米颗粒与相应的大块材料区分开的新颖特性通常在1000nm以下尺度或约100nm的尺寸下显现，但例如对于长圆形、管状等颗粒等来说，纳米颗粒可具有更大的尺寸。尽管大多数分子的尺寸适合上述概要，但通常不将单个分子称为纳米颗粒。
核酸：如本文所用，术语“核酸”以其最广泛含义使用，并且涵盖包含核苷酸聚合物的任何化合物和/或物质。这些聚合物通常也被称为多核苷酸。本公开的示例性核酸或多核苷酸包括但不限于核糖核酸(RNA)、脱氧核糖核酸(DNA)、DNA-RNA杂合体、RNAi诱导剂、RNAi剂、siRNA、shRNA、miRNA、反义RNA、核酶、催化性DNA、诱导三螺旋形成的RNA、苏糖核酸(TNA)、二醇核酸(GNA)、肽核酸(PNA)、锁核酸(LNA，包括具有β-D-核糖构型的LNA、具有α-L-核糖构型的α-LNA(LNA的非对映体)、具有2’-氨基官能化的2’-氨基-LNA以及具有2’-氨基官能化的2’-氨基-α-LNA)或其杂合体。
可操作地连接：如本文所使用，短语“可操作地连接”是指两个或更多个分子、构建体、转录物、实体、部分等之间的功能连接。
患者：如本文所使用，“患者”是指可寻求或有治疗需要、要求治疗、正接受治疗、将接受治疗的受试者，或针对特定疾病或疾患在受过训练的专业人员的护理下的受试者。在特定实施方案中，患者是人患者。在一些实施方案中，患者是罹患癌症(例如，肝癌或结直肠癌)的患者。
药学上可接受的：本文采用短语“药学上可接受的”来指在合理医学判断范围内，适用于与人和动物组织接触而无过量毒性、刺激、过敏反应或其他问题或并发症，与合理的利益/风险比相称的那些化合物、材料、组合物和/或剂型。
药学上可接受的赋形剂：如本文所用，短语“药学上可接受的赋形剂”是指除了本文所述的化合物以外的任何成分(例如，能够悬浮或溶解活性化合物的媒介物)并且在患者中具有基本上无毒和非炎症性的特性。赋形剂可包括例如：抗粘剂、抗氧化剂、粘合剂、包衣、压缩助剂、崩解剂、染料(颜料)、软化剂、乳化剂、填充剂(稀释剂)、成膜剂或包衣、调味剂、香料、助流剂(流动增强剂)、润滑剂、防腐剂、印刷油墨、吸附剂、悬浮剂或分散剂、甜味剂以及水合用水。示例性赋形剂包括但不限于：丁基化羟基甲苯(BHT)、碳酸钙、磷酸氢二钙、硬脂酸钙、交联羧甲基纤维素钠、交联聚乙烯吡咯烷酮、柠檬酸、交联聚维酮、半胱氨酸、乙基纤维素、明胶、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、乳糖、硬脂酸镁、麦芽糖醇、甘露糖醇、甲硫氨酸、甲基纤维素、对羟基苯甲酸甲酯、微晶纤维素、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚维酮、预胶凝淀粉、对羟基苯甲酸丙酯、视黄醇棕榈酸酯、虫胶、二氧化硅、羧甲基纤维素钠、柠檬酸钠、羟基乙酸淀粉钠、山梨糖醇、淀粉(玉米)、硬脂酸、蔗糖、滑石、二氧化钛、维生素A、维生素E、维生素C和木糖醇。
药学上可接受的盐：如本文所用，“药学上可接受的盐”是指所公开化合物的衍生物，其中通过将现有的酸或碱部分转化为其盐形式(例如，通过使游离碱基与合适的有机酸反应)来修饰母体化合物。药学上可接受的盐的实例包括但不限于碱性残基如胺的无机或有机酸盐；酸性残基如羧酸的碱金属或有机盐等。代表性酸加成盐包括乙酸盐(acetate)、乙酸(acetic acid)盐、己二酸盐、海藻酸盐、抗坏血酸盐、天冬氨酸盐、苯磺酸盐(benzenesulfonate)、苯磺酸(benzene sulfonic acid)盐、苯甲酸盐、硫酸氢盐、硼酸盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、柠檬酸盐、环戊烷丙酸盐、二葡萄糖酸盐、十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、富马酸盐、葡庚糖酸盐、甘油磷酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、氢溴酸盐、盐酸盐、氢碘酸盐、2-羟基-乙磺酸盐、乳糖醛酸盐、乳酸盐、月桂酸盐、月桂基硫酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、甲磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、油酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、双羟萘酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、磷酸盐、苦味酸盐、新戊酸盐、丙酸盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、甲苯磺酸盐、十一酸盐、戊酸盐等。代表性碱金属或碱土金属盐包括钠、锂、钾、钙、镁等；以及无毒铵、季铵和胺阳离子，包括但不限于铵、四甲铵、四乙铵、甲胺、二甲胺、三甲胺、三乙胺、乙胺等。本公开的药学上可接受的盐包括母体化合物的常规无毒盐，其例如由无毒的无机或有机酸形成。本公开的药学上可接受的盐可通过常规化学方法由含有碱性或酸性部分的母体化合物合成。一般来讲，这些盐可以通过使这些化合物的游离酸或碱形式与化学计量的适当的碱或酸在水中或在有机溶剂中或在两者的混合物中反应来制备；一般来讲，非水性介质如乙醚、乙酸乙酯、乙醇、异丙醇或乙腈是优选的。合适的盐的列表可见于Remington’s Pharmaceutical Sciences,第17版,Mack Publishing Company,Easton,Pa.,1985,p.1418,Pharmaceutical Salts:Properties,Selection,and Use,P.H.Stahl和C.G.Wermuth(编辑),Wiley-VCH,2008，以及Berge等人,Journal of Pharmaceutical Science,66,1-19(1977)，所述文献各自以引用方式整体并入本文。
多肽：如本文所用，术语“多肽”或“目标多肽”是指通常通过肽键连接的氨基酸残基的聚合物，其可天然地(例如，分离或纯化)或合成产生。
受试者：如本文所用，术语“受试者”是指可例如出于实验、诊断、预防和/或治疗目的向其施用根据本公开的组合物的任何生物体。典型的受试者包括动物(例如，哺乳动物，如小鼠、大鼠、兔、非人类灵长类动物和人类)和/或植物。在一些实施方案中，受试者可以是患者。
基本上：如本文所用，术语“基本上”是指展现总体或接近总体范围或程度的目标特征或特性的定性情况。生物领域的普通技术人员将了解生物和化学现象很少(如果曾发生)达到完全和/或进行至完全或达成或避免绝对结果。因此，在本文中使用术语“基本上”来捕获许多生物和化学现象中固有的潜在完整性不足。
罹患：“罹患”疾病、病症和/或疾患的个体已被诊断出患有疾病、病症和/或疾患或者展现疾病、病症和/或疾患的一种或多种症状。
靶向部分：如本文所用，“靶向部分”是可将纳米颗粒靶向特定细胞、组织和/或器官类型的化合物或剂。
治疗剂：术语“治疗剂”是指当施用至受试者时具有治疗、诊断和/或预防作用和/或引发期望的生物和/或药理学作用的剂。
转染：如本文所用，术语“转染”是指将物质(例如，多核苷酸，如mRNA)引入细胞中的方法。
跨膜结构域：如本文所用，术语“跨膜结构域”、“TM”和“TMD”是指跨过细胞质膜的多肽区域。
治疗：如本文所用，术语“治疗”是指部分或完全缓解，改善，改进，缓和特定感染、疾病、病症和/或疾患的一种或多种症状或特征，延迟其发作，抑制其进展，降低其严重性和/或降低其发生率。例如，“治疗”癌症可指抑制肿瘤的存活、生长和/或扩散。为了降低发生与疾病、病症和/或疾患相关的病理学的风险，可以将治疗施用至没有表现出疾病、病症和/或疾患迹象的受试者和/或仅表现出疾病、病症和/或疾患的早期迹象的受试者。
肿瘤微环境”：如本文所用，“肿瘤微环境”是指肿瘤内就浸润性免疫细胞和/或炎性细胞的存在或不存在而言的细胞组成以及肿瘤内此类细胞的一种或多种类型。在一些实施方案中，肿瘤微环境是“发炎的肿瘤微环境”，其是指存在浸润到肿瘤中的免疫细胞和/或炎性细胞，其中主要的细胞类型是粒细胞。在一些实施方案中，肿瘤微环境是“免疫抑制性肿瘤微环境”，其是指存在浸润到肿瘤中的免疫细胞和/或炎性细胞，其中主要的细胞类型是单核细胞和巨噬细胞。在一些实施方案中，肿瘤微环境是“免疫学上贫瘠的肿瘤微环境”，其是指不存在免疫细胞和/或炎性细胞显著浸润到肿瘤中。
I型整合膜蛋白：如本文所用，术语“I型整合膜蛋白”是指在细胞外空间中具有其氨基末端且包含一个α螺旋跨膜结构域的整合膜蛋白(即，具有至少一个跨过脂质双层的跨膜结构域的蛋白质)。
预防：如本文所用，术语“预防”是指部分或完全抑制癌症的一种或多种症状或特征的发作，包括预防成功治疗后的复发或重现。
肿瘤：如本文所用，“肿瘤”是组织的异常生长，无论是良性还是恶性的。
未修饰的：如本文所用，“未修饰的”是指在以任何方式改变之前的任何物质、化合物或分子。修饰的可以是但不总是指生物分子的野生型或天然形式。分子可经历一系列修饰，由此每个修饰的分子可以充当“未修饰的”起始分子用于随后的修饰。
等效方案和范围
本领域技术人员将仅使用常规实验就会认识到或能够确定根据本文所述的本公开的具体实施方案的许多等效方案。本公开的范围不旨在限于以下描述，而是如所附权利要求中所述。
除非相反地指明或者从上下文中显而易见，否则在权利要求中，如“一个”、“一种”和“所述”的冠词可以表示一个或多于一个。除非相反地指明或者从上下文中显而易见，否则如果在给定的产物或过程中存在、采用或以其他方式涉及组成员中的一个、超过一个或全部，则包括“或”在一个或多个组成员之间的主张或描述得到满足。本公开包括其中给定产物或过程中存在、采用或与其他方式涉及组中的确切一个成员的实施方案。本公开还包括其中给定产物或过程中存在、采用或与其他方式涉及组成员中的超过一个或全部的实施方案。
还应注意，术语“包含”旨在是开放的并且允许但不要求包括额外的要素或步骤。因此当在本文中使用术语“包含”时，也包括和涵盖术语“由……组成”。
在给出范围的情况下，包括端点。此外，应当理解，除非另外指明或从上下文和本领域普通技术人员的理解中显而易见，否则在本公开的不同实施方案中，表示为范围的值可假定为所述范围内的任何具体值或子范围，精确到该范围的下限单位的十分位一，除非上下文另外明确规定。
所有引用的来源，例如，参考文献、出版物、数据库、数据库条目和本文引用的技术，均以引用方式并入本申请，即使在引用中没有明确陈述。在引用的来源和本申请的陈述冲突的情况下，应当以本申请中的陈述为准。
其他实施方案
本公开涉及以下实施方案。在本节中，术语实施方案缩写为“E”，后接序号。例如，E1等同于实施方案1。
E1.一种治疗有需要的受试者的髓系恶性肿瘤的方法，所述方法包括向所述受试者施用至少两种选自由以下组成的组的信使RNA(mRNA)：
(i)编码OX40L多肽的mRNA；
(ii)编码可操作地连接至IL-15Rα多肽的IL-15多肽的mRNA；
(iii)编码IL-15多肽的mRNA和编码IL-15Rα多肽的mRNA；和
(iv)编码可操作地连接至包含跨膜结构域的膜结构域的IL-12多肽的mRNA。
E2.如实施方案1所述的方法，其中所述至少两种mRNA选自由以下组成的组：
(i)编码OX40L多肽的mRNA和编码可操作地连接至包含跨膜结构域的膜结构域的IL-12多肽的mRNA；
(ii)编码OX40L多肽的mRNA、编码IL-15多肽的mRNA和编码IL-15Rα多肽的mRNA；
(iii)编码OX40L多肽的mRNA和编码可操作性地连接至IL-15Rα多肽的IL-15多肽的mRNA；
(iv)编码IL-15多肽的mRNA、编码IL-15Rα多肽的mRNA和编码可操作地连接至包含跨膜结构域的膜结构域的IL-12多肽的mRNA；
(v)编码可操作性地连接至IL-15Rα多肽的IL-15多肽的mRNA和编码可操作地连接至包含跨膜结构域的膜结构域的IL-12多肽的mRNA；
(vi)编码OX40L多肽的mRNA、编码IL-15多肽的mRNA、编码IL-15Rα多肽的mRNA和编码可操作地连接至包含跨膜结构域的膜结构域的IL-12多肽的mRNA；以及
(vii)编码OX40L多肽的mRNA、编码可操作性地连接至IL-15Rα多肽的IL-15多肽的mRNA和编码可操作地连接至包含跨膜结构域的膜结构域的IL-12多肽的mRNA。
E3.如实施方案1或实施方案2所述的方法，其中所述OX40L多肽包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。
E4.如实施方案3所述的方法，其中所述OX40L多肽由包含SEQ ID NO:11所示核苷酸序列的核苷酸序列或与SEQ ID NO:11所示核苷酸序列具有至少80％同一性的核苷酸序列编码。
E5.如实施方案1-4中任一项所述的方法，其中所述IL-12多肽包含可操作地连接至IL-12p35亚基(IL-12A)多肽的IL-12p40亚基(IL-12B)多肽。
E6.如实施方案5所述的方法，其中所述IL-12多肽包含SEQ ID NO:39或SEQ IDNO:40所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:39或SEQ ID NO:40所示的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。
E7.如实施方案6所述的方法，其中所述IL-12多肽由包含SEQ ID NO:46所示核苷酸序列的核苷酸序列或与SEQ ID NO:46所示核苷酸序列具有至少80％同一性的核苷酸序列编码。
E8.如实施方案5所述的方法，其中所述IL-12B多肽通过肽接头可操作地连接至所述IL-12A多肽。
E9.如实施方案8所述的方法，其中所述IL-12B多肽位于所述IL-12A多肽的5’末端或所述肽接头的5’末端；或者其中所述IL-12A多肽位于所述IL-12B多肽的5’末端或所述肽接头的5’末端。
E10.如实施方案1-9中任一项所述的方法，其中所述IL-12多肽经由肽接头可操作地连接至所述跨膜结构域。
E11.如实施方案1-10中任一项所述的方法，其中可操作地连接至所述IL-12多肽的膜结构域的跨膜结构域包含源自I型整合膜蛋白的跨膜结构域。
E12.如实施方案1-10中任一项所述的方法，其中可操作地连接至所述IL-12多肽的膜结构域的跨膜结构域选自由以下组成的组：分化簇8(CD8)跨膜结构域、血小板源性生长因子受体(PDGFR)跨膜结构域和分化簇80(CD80)跨膜结构域。
E13.如实施方案12所述的方法，所述PDGFR-β跨膜结构域包含SEQ ID NO:42所示的氨基酸序列；所述CD8跨膜结构域包含SEQ ID NO:41所示的氨基酸序列；并且所述CD80跨膜结构域包含SEQ ID NO:43所示的氨基酸序列。
E14.如实施方案1-13中任一项所述的方法，其中可操作地连接至所述IL-12多肽的跨膜结构域包含细胞内结构域。
E15.如实施方案14所述的方法，其中所述细胞内结构域与所述跨膜结构域源自相同的多肽，或者其中所述细胞内结构域与所述跨膜结构域源自不同的多肽。
E16.如实施方案14所述的方法，其中所述胞内结构域选自由以下组成的组：PDGFR细胞内结构域、截短的PDGFR细胞内结构域，和CD80细胞内结构域。
E17.如实施方案16所述的方法，其中所述细胞内结构域是包含PDGFR-β细胞内结构域的PDGFR细胞内结构域，所述PDGFR-β细胞内结构域包含SEQ ID NO:48所示的氨基酸序列。
E18.如实施方案16所述的方法，其中所述细胞内结构域是包含在E570或G739处截短的PDGFR-β细胞内结构域的截短PDGFR细胞内结构域。
E19.如实施方案18所述的方法，其中所述在E570处截短的截短PDGFR-β细胞内结构域包含SEQ ID NO:49所示的氨基酸序列，并且其中所述在G739处截短的截短PDGFR-β跨膜结构域包含SEQ ID NO:50所示的氨基酸序列。
E20.如实施方案16所述的方法，其中所述细胞内结构域是包含SEQ ID NO:47所示氨基酸序列的CD80细胞内结构域。
E21.如实施方案1-20中任一项所述的方法，其中可操作地连接至所述IL-12多肽的跨膜结构域包含：
(i)PDGFR-β跨膜结构域和PDGFR-β细胞内结构域；
(ii)PDGFR-β跨膜结构域和在E570处截短的截短PDGFR-β细胞内结构域；
(iii)PDGFR-β跨膜结构域和在G739处截短的截短PDGFR-β细胞内结构域；或
(iv)CD80跨膜结构域和CD80细胞内结构域。
E22.如实施方案1-21中任一项所述的方法，其中所述膜结构域通过肽接头可操作地连接至所述IL-12A多肽，或者其中所述膜结构域通过肽接头可操作地连接至所述IL-12B多肽。
E23.如实施方案1-22中任一项所述的方法，其中所述IL-15Rα多肽包含sushi结构域。
E24.如实施方案23所述的方法，其中所述IL-15Rα多肽还包含细胞内结构域和跨膜结构域。
E25.如实施方案24所述的方法，其中所述细胞内结构域和所述跨膜结构域源自IL-15Rα。
E26.如实施方案24所述的方法，其中所述细胞内结构域和所述跨膜结构域源自异源多肽。
E27.如实施方案1-26中任一项所述的方法，其中所述IL-15多肽包含SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。
E28.如实施方案27所述的方法，其中所述IL-15多肽由包含SEQ ID NO:122所示核苷酸序列的核苷酸序列或与SEQ ID NO:122所示核苷酸序列具有至少80％同一性的核苷酸序列编码。
E29.如实施方案1-28中任一项所述的方法，其中所述IL-15Rα多肽包含SEQ IDNO:13所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。
E30.如实施方案29所述的方法，其中所述IL-15Rα多肽由包含SEQ ID NO:22所示核苷酸序列的核苷酸序列或与SEQ ID NO:22所示核苷酸序列具有至少80％同一性的核苷酸序列编码。
E31.如实施方案1-22中任一项所述的方法，其中可操作地连接至IL-15Rα多肽的IL-15多肽包含SEQ ID NO:23、27和123中任一个所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:23、27和123中任一个所示的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。
E32.如实施方案31所述的方法，其中可操作地连接至IL-15Rα多肽的IL-15多肽由包含SEQ ID NO:24-26、28-30和124-126中任一个所示的核苷酸序列的核苷酸序列或与SEQID NO:24-26、28-30和124-126中任一个所示的核苷酸序列具有至少80％同一性的核苷酸序列编码。
E33.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中每种mRNA包含3’非翻译区(UTR)。
E34.如实施方案33所述的方法，其中所述3’UTR包含至少一个微RNA(miR)结合位点。
E35.如实施方案34所述的方法，其中所述至少一个miR结合位点是miR-122结合位点。
E36.如实施方案35所述的方法，其中所述miR-122结合位点是miR-122-3p或miR-122-5p结合位点。
E37.如实施方案36所述的方法，其中所述miR-122-5p结合位点包含SEQ ID NO:83所示的核苷酸序列，并且其中所述miR-122-3p结合位点包含SEQ ID NO:74所示的核苷酸序列。
E38.如实施方案1-32中任一项所述的方法，其中每种mRNA包含3’UTR，所述3’UTR包含SEQ ID NO:77或SEQ ID NO:121所示的核苷酸序列。
E39.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中每种mRNA包含5’非翻译区(UTR)。
E40.如实施方案39所述的方法，其中所述5’UTR包含SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:76所示的核苷酸序列。
E41.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中每种mRNA包括至少一种化学修饰。
E42.如实施方案41所述的方法，其中所述化学修饰选自由以下组成的组：假尿苷、N1-甲基假尿苷、2-硫代尿苷、4’-硫代尿苷、5-甲基胞嘧啶、2-硫代-1-甲基-1-脱氮-假尿苷、2-硫代-1-甲基-假尿苷、2-硫代-5-氮杂-尿苷、2-硫代-二氢假尿苷、2-硫代-二氢尿苷、2-硫代-假尿苷、4-甲氧基-2-硫代-假尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-硫代-1-甲基-假尿苷、4-硫代-假尿苷、5-氮杂-尿苷、二氢假尿苷、5-甲基尿苷、5-甲基尿苷、5-甲氧基尿苷和2’-O-甲基尿苷。
E43.如实施方案1-40中任一项所述的方法，其中每种mRNA中至少95％的尿苷是N1-甲基假尿苷。
E44.如实施方案43所述的方法，其中每种mRNA中至少99％的尿苷是N1-甲基假尿苷。
E45.如实施方案43所述的方法，其中每种mRNA中100％的尿苷是N1-甲基假尿苷。
E46.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中将每种mRNA配制在相同的脂质纳米颗粒中。
E47.如实施方案1-45中任一项所述的方法，其中将每种mRNA配制在单独的脂质纳米颗粒中。
E48.如实施方案46或实施方案47所述的方法，其中所述脂质纳米颗粒包含摩尔比为约20％-60％:5％-25％:25％-55％:0.5％-15％的可电离氨基脂质:磷脂:结构脂质:PEG修饰脂质。
E49.如实施方案46或实施方案47所述的方法，其中所述脂质纳米颗粒包含摩尔比为约50％:约10％:约38.5％:约1.5％的可电离脂质:磷脂:甾醇:PEG修饰脂质。
E50.如实施方案46或实施方案47所述的方法，其中所述脂质纳米颗粒包含摩尔比为50:38.5:10:1.5的可电离脂质:胆固醇:DSPC:PEG修饰脂质。
E51.如实施方案48-50中任一项所述的方法，其中所述可电离脂质选自由以下组成的组：例如，2,2-二亚油基-4-二甲基氨基乙基-[1,3]-二氧戊环(DLin-KC2-DMA)、4-二甲基氨基丁酸二亚油基-甲酯(DLin-MC3-DMA)和9-((4-(二甲基氨基)丁酰基)氧基)十七烷二酸二((Z)-壬-2-烯-1-基)酯(L319)。
E52.如实施方案48-50中任一项所述的方法，其中所述可电离脂质包括化合物II。
E53.如实施方案46或实施方案47所述的方法，其中所述脂质纳米颗粒包含摩尔比为约20％-60％:5％-25％:25％-55％:0.5％-15％的化合物II:磷脂:胆固醇:PEG修饰脂质。
E54.如实施方案53所述的方法，其中所述脂质纳米颗粒包含摩尔比为约50％:约10％:约38.5％:约1.5％的化合物II:磷脂:胆固醇:PEG修饰脂质。
E55.如实施方案48-54中任一项所述的方法，其中所述PEG修饰脂质是PEG-DMG或化合物I。
E56.如实施方案46或实施方案47所述的方法，其中所述脂质纳米颗粒包含摩尔比为50:38.5:10:1.5的化合物II:胆固醇:磷脂:化合物I，或化合物II:胆固醇:DSPC:化合物I。
E57.如实施方案46或实施方案47所述的方法，其中所述脂质纳米颗粒包含摩尔比为40:38.5:20:1.5的化合物II:胆固醇:磷脂:化合物I，或化合物II:胆固醇:DSPC:化合物I。
E58.如实施方案1-57中任一项所述的方法，其中所述髓系恶性肿瘤选自由以下组成的组：骨髓增生异常综合征(MDS)、骨髓增生性疾病(MPD)和急性髓系白血病(AML)。
E59.如实施方案58所述的方法，其中所述髓系恶性肿瘤是AML。
E60.如实施方案1-59中任一项所述的方法，其中所述至少两种mRNA以肿瘤内方式施用。
E61.如实施方案1-59中任一项所述的方法，其中所述至少两种mRNA以静脉内方式施用。
E62.如实施方案1-61中任一项所述的方法，所述方法包括施用检查点抑制剂多肽。
E63.如实施方案62所述的方法，其中所述检查点抑制剂多肽抑制PD-1、PD-L1、CTLA-4或它们的组合。
E64.如实施方案63所述的方法，其中所述检查点抑制剂多肽是抗体或编码所述抗体的mRNA。
E65.如实施方案64所述的方法，其中所述抗体是抗CTLA-4抗体或其特异性地结合CTLA-4的抗原结合片段、抗PD-1抗体或其特异性地结合PD-1的抗原结合片段、抗PD-L1抗体或其特异性地结合PD-L1的抗原结合片段，以及它们的组合。
E66.如实施方案65所述的方法，其中所述抗PD-L1抗体是阿特珠单抗、阿维鲁单抗或度伐鲁单抗，其中所述抗CTLA-4抗体是曲美木单抗或伊匹单抗，并且其中所述抗PD-1抗体是纳武单抗或派姆单抗。
E67.一种脂质纳米颗粒，所述脂质纳米颗粒包含至少两种包封的信使RNA(mRNA)，其中所述至少两种mRNA选自由以下组成的组：
(i)编码OX40L多肽的mRNA；
(ii)编码可操作地连接至IL-15Rα多肽的IL-15多肽的mRNA；
(iii)编码IL-15多肽的mRNA和编码IL-15Rα多肽的mRNA；和
(iv)编码可操作地连接至包含跨膜结构域的膜结构域的IL-12多肽的mRNA。
E68.如实施方案67所述的脂质纳米颗粒，其中所述至少两种mRNA选自由以下组成的组：
(i)编码OX40L多肽的mRNA和编码可操作地连接至包含跨膜结构域的膜结构域的IL-12多肽的mRNA；
(ii)编码OX40L多肽的mRNA、编码IL-15多肽的mRNA和编码IL-15Rα多肽的mRNA；
(iii)编码OX40L多肽的mRNA和编码可操作性地连接至IL-15Rα多肽的IL-15多肽的mRNA；
(iv)编码IL-15多肽的mRNA、编码IL-15Rα多肽的mRNA和编码可操作地连接至包含跨膜结构域的膜结构域的IL-12多肽的mRNA；
(v)编码可操作性地连接至IL-15Rα多肽的IL-15多肽的mRNA和编码可操作地连接至包含跨膜结构域的膜结构域的IL-12多肽的mRNA；
(vi)编码OX40L多肽的mRNA、编码IL-15多肽的mRNA、编码IL-15Rα多肽的mRNA和编码可操作地连接至包含跨膜结构域的膜结构域的IL-12多肽的mRNA；以及
(vii)编码OX40L多肽的mRNA、编码可操作性地连接至IL-15Rα多肽的IL-15多肽的mRNA和编码可操作地连接至包含跨膜结构域的膜结构域的IL-12多肽的mRNA。
E69.一种脂质纳米颗粒，所述脂质纳米颗粒包含：编码OX40L多肽的mRNA、编码IL-15多肽的mRNA、编码IL-15Rα多肽的mRNA和编码可操作地连接至包含跨膜结构域的膜结构域的IL-12多肽的mRNA。
E70.一种脂质纳米颗粒，所述脂质纳米颗粒包含：
(i)编码人OX40L多肽的mRNA，其中所述人OX40L多肽包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；
(ii)编码人IL-15多肽的mRNA，其中所述人IL-15多肽包含SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列；
(iii)编码人IL-15Rα多肽的mRNA，其中所述人IL-15Rα多肽包含SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列；以及
(iv)编码可操作地连接至包含跨膜结构域的膜结构域的人IL-12多肽的mRNA，其中所述人IL-12多肽包含SEQ ID NO:61所示的氨基酸序列，
其中所述脂质纳米颗粒包含摩尔比为约20％-60％:5％-25％:25％-55％:0.5％-15％的可电离氨基脂质:磷脂:结构脂质:PEG修饰脂质。
E71.一种脂质纳米颗粒，所述脂质纳米颗粒包含：
(i)编码人OX40L多肽的mRNA，其中所述mRNA包含SEQ ID NO:11所示的核苷酸序列或与SEQ ID NO:11所示的核苷酸序列具有至少80％同一性的核苷酸序列；
(ii)编码人IL-15多肽的mRNA，其中所述mRNA包含SEQ ID NO:122所示的核苷酸序列或与SEQ ID NO:122所示的核苷酸序列具有至少80％同一性的核苷酸序列；
(iii)编码人IL-15Rα多肽的mRNA，其中所述mRNA包含SEQ ID NO:22所示的核苷酸序列或与SEQ ID NO:22所示的核苷酸序列具有至少80％同一性的核苷酸序列；以及
(iv)编码可操作地连接至包含跨膜结构域的膜结构域的人IL-12多肽的mRNA，其中所述mRNA包含SEQ ID NO:60所示的核苷酸序列或与SEQ ID NO:60所示的核苷酸序列具有至少80％同一性的核苷酸序列，
其中所述脂质纳米颗粒包含摩尔比为约20％-60％:5％-25％:25％-55％:0.5％-15％的可电离氨基脂质:磷脂:结构脂质:PEG修饰脂质。
E72.如实施方案68-71中任一项所述的脂质纳米颗粒，所述脂质纳米颗粒包含比例为1:1:1:1的OX40L:IL-15:IL-15Rα:IL-12。
E73.如实施方案67-72中任一项所述的脂质纳米颗粒，所述脂质纳米颗粒被配制成用于肿瘤内递送。
E74.如实施方案67-72中任一项所述的脂质纳米颗粒，所述脂质纳米颗粒被配制成用于静脉内递送。
E75.如实施方案67-69中任一项所述的脂质纳米颗粒，其中所述脂质纳米颗粒包含摩尔比为约20％-60％:5％-25％:25％-55％:0.5％-15％的可电离氨基脂质:磷脂:结构脂质:PEG修饰脂质。
E76.如实施方案70-75中任一项所述的脂质纳米颗粒，其中所述脂质纳米颗粒
包含摩尔比为约50％:约10％:约38.5％:约1.5％的可电离脂质:磷脂:甾醇:PEG修饰脂质。
E77.如实施方案67-74中任一项所述的脂质纳米颗粒，其中所述脂质纳米颗粒包含摩尔比为50:38.5:10:1.5的可电离脂质:胆固醇:DSPC:PEG修饰脂质。
E78.如实施方案70-77中任一项所述的脂质纳米颗粒，其中所述可电离脂质选自由以下组成的组：例如，2,2-二亚油基-4-二甲基氨基乙基-[1,3]-二氧戊环(DLin-KC2-DMA)、4-二甲基氨基丁酸二亚油基-甲酯(DLin-MC3-DMA)和9-((4-(二甲基氨基)丁酰基)氧基)十七烷二酸二((Z)-壬-2-烯-1-基)酯(L319)。
E79.如实施方案70-78中任一项所述的脂质纳米颗粒，其中所述可电离脂质包括化合物II。
E80.如实施方案67-74中任一项所述的脂质纳米颗粒，其中所述脂质纳米颗粒包含摩尔比为约20％-60％:5％-25％:25％-55％:0.5％-15％的化合物II:磷脂:胆固醇:PEG修饰脂质。
E81.如实施方案80所述的脂质纳米颗粒，其中所述脂质纳米颗粒包含摩尔比为约50％:约10％:约38.5％:约1.5％的化合物II:磷脂:胆固醇:PEG修饰脂质。
E82.如实施方案70-81中任一项所述的脂质纳米颗粒，其中所述PEG修饰脂质是PEG-DMG或化合物I。
E83.如实施方案67-82中任一项所述的脂质纳米颗粒，其中所述脂质纳米颗粒包含摩尔比为50:38.5:10:1.5的化合物II:胆固醇:磷脂:化合物I，或化合物II:胆固醇:DSPC:化合物I。
E84.如实施方案67-82中任一项所述的脂质纳米颗粒，其中所述脂质纳米颗粒包含摩尔比为40:38.5:20:1.5的化合物II:胆固醇:磷脂:化合物I，或化合物II:胆固醇:DSPC:化合物I。
E85.一种用于治疗有需要的受试者的髓系恶性肿瘤的方法，所述方法包括向所述受试者施用如实施方案67-84中任一项所述的脂质纳米颗粒。
E86.如实施方案85所述的方法，所述方法还包括施用免疫检查点抑制剂多肽。
E87.如实施方案86所述的方法，其中所述检查点抑制剂多肽抑制PD-1、PD-L1、CTLA-4或它们的组合。
E88.如实施方案87所述的方法，其中所述检查点抑制剂多肽是抗体或编码所述抗体的mRNA。
E89.如实施方案88所述的方法，其中所述抗体是抗CTLA-4抗体或其特异性地结合CTLA-4的抗原结合片段、抗PD-1抗体或其特异性地结合PD-1的抗原结合片段、抗PD-L1抗体或其特异性地结合PD-L1的抗原结合片段，以及它们的组合。
E90.如实施方案89所述的方法，其中所述抗PD-L1抗体是阿特珠单抗、阿维鲁单抗或度伐鲁单抗，其中所述抗CTLA-4抗体是曲美木单抗或伊匹单抗，并且其中所述抗PD-1抗体是纳武单抗或派姆单抗。
E91.如实施方案67-84中任一项所述的脂质纳米颗粒，和任选的药学上可接受的载体，其用于治疗个体的髓系恶性肿瘤或延迟髓系恶性肿瘤的进展，其中治疗包括施用所述脂质纳米颗粒。
E92.如实施方案67-84中任一项所述的脂质纳米颗粒，和任选的药学上可接受的载体，其用于治疗个体的髓系恶性肿瘤或延迟髓系恶性肿瘤的进展，其中治疗包括与包含免疫检查点抑制性多肽和任选的药学上可接受的载体的组合物组合施用所述脂质纳米颗粒。
E93.如实施方案67-84中任一项所述的脂质纳米颗粒和任选的药学上可接受的载体在制造用于治疗个体的髓系恶性肿瘤或延迟髓系恶性肿瘤的进展的药物中的用途，其中所述药物包含所述脂质纳米颗粒和任选的药学上可接受的载体，并且其中所述治疗包括施用所述药物。
E94.如实施方案67-84中任一项所述的脂质纳米颗粒和任选的药学上可接受的载体在制造用于治疗个体的髓系恶性肿瘤或延迟髓系恶性肿瘤的进展的药物中的用途，其中所述药物包含所述脂质纳米颗粒和任选的药学上可接受的载体，并且其中所述治疗包括与包含免疫检查点抑制剂多肽和任选的药学上可接受的载体的组合物组合施用所述药物。
E95.一种药盒，所述药盒包括：容器，所述容器包括如实施方案67-84中任一项所述的脂质纳米颗粒和任选的药学上可接受的载体；以及包装插入物，所述包装插入物包括用于施用所述脂质纳米颗粒以治疗个体的髓系恶性肿瘤或延迟髓系恶性肿瘤的进展的说明书。
E96.如实施方案95所述的药盒，其中所述包装插入物还包括用于将所述脂质纳米颗粒与包含免疫检查点抑制剂多肽和任选的药学上可接受的载体的组合物组合施用以治疗个体的髓系恶性肿瘤或延迟髓系恶性肿瘤的进展的说明书。
E97.一种药盒，所述药盒包括：容器，所述容器包括如实施方案67-84中任一项所述的脂质纳米颗粒和任选的药学上可接受的载体；以及包装插入物，所述包装插入物包括用于单独地或与包含免疫检查点抑制剂多肽和任选的药学上可接受的载体的组合物组合地施用所述药物以治疗个体的髓系恶性肿瘤或延迟髓系恶性肿瘤的进展的说明书。
E98.一种用于增强受试者中的免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者施用如实施方案67-84中任一项所述的脂质纳米颗粒。
E99.一种用于增强受试者中的T细胞激活的方法，所述方法包括向所述受试者施用如实施方案67-84中任一项所述的脂质纳米颗粒。
E100.一种用于增强受试者中的NK细胞激活的方法，所述方法包括向所述受试者施用如实施方案67-84中任一项所述的脂质纳米颗粒。
E101.如实施方案98-100中任一项所述的方法，其中所述受试者患有髓系恶性肿瘤。
E102.如实施方案98-101中任一项所述的方法，所述方法还包括施用免疫检查点抑制剂多肽。
E103.一种治疗有需要的受试者的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用至少两种选自由以下组成的组的信使RNA(mRNA)：
(i)编码OX40L多肽的mRNA；
(ii)编码可操作地连接至IL-15Rα多肽的IL-15多肽的mRNA；
(iii)编码IL-15多肽的mRNA和编码IL-15Rα多肽的mRNA；和
(iv)编码可操作地连接至包含跨膜结构域的膜结构域的IL-12多肽的mRNA。
E104.如实施方案103所述的方法，其中所述至少两种mRNA选自由以下组成的组：
(i)编码OX40L多肽的mRNA和编码可操作地连接至包含跨膜结构域的膜结构域的IL-12多肽的mRNA；
(ii)编码OX40L多肽的mRNA、编码IL-15多肽的mRNA和编码IL-15Rα多肽的mRNA；
(iii)编码OX40L多肽的mRNA和编码可操作性地连接至IL-15Rα多肽的IL-15多肽的mRNA；
(iv)编码IL-15多肽的mRNA、编码IL-15Rα多肽的mRNA和编码可操作地连接至包含跨膜结构域的膜结构域的IL-12多肽的mRNA；
(v)编码可操作性地连接至IL-15Rα多肽的IL-15多肽的mRNA和编码可操作地连接至包含跨膜结构域的膜结构域的IL-12多肽的mRNA；
(vi)编码OX40L多肽的mRNA、编码IL-15多肽的mRNA、编码IL-15Rα多肽的mRNA和编码可操作地连接至包含跨膜结构域的膜结构域的IL-12多肽的mRNA；以及
(vii)编码OX40L多肽的mRNA、编码可操作性地连接至IL-15Rα多肽的IL-15多肽的mRNA和编码可操作地连接至包含跨膜结构域的膜结构域的IL-12多肽的mRNA。
E105.如实施方案103或实施方案104所述的方法，其中所述OX40L多肽包含SEQ IDNO:1所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。
E106.如实施方案105所述的方法，其中所述OX40L多肽由包含SEQ ID NO:11所示核苷酸序列的核苷酸序列或与SEQ ID NO:11所示核苷酸序列具有至少80％同一性的核苷酸序列编码。
E107.如实施方案103-106中任一项所述的方法，其中所述IL-12多肽包含可操作地连接至IL-12p35亚基(IL-12A)多肽的IL-12p40亚基(IL-12B)多肽。
E108.如实施方案107所述的方法，其中所述IL-12B多肽通过肽接头可操作地连接至所述IL-12A多肽。
E109.如实施方案108所述的方法，其中所述IL-12B多肽位于所述IL-12A多肽的5’末端或所述肽接头的5’末端；或者其中所述IL-12A多肽位于所述IL-12B多肽的5’末端或所述肽接头的5’末端。
E110.如实施方案103-109中任一项所述的方法，其中所述IL-12多肽跨膜结构域包含源自I型整合膜蛋白的跨膜结构域。
E111.如实施方案103-109中任一项所述的方法，其中所述IL-12多肽跨膜结构域选自由以下组成的组：分化簇8(CD8)跨膜结构域、血小板源性生长因子受体(PDGFR)跨膜结构域和分化簇80(CD80)跨膜结构域。
E112.如实施方案111所述的方法，所述PDGFR-β跨膜结构域包含SEQ ID NO:42所示的氨基酸序列；所述CD8跨膜结构域包含SEQ ID NO:41所示的氨基酸序列；并且所述CD80跨膜结构域包含SEQ ID NO:43所示的氨基酸序列。
E113.如实施方案103-112中任一项所述的方法，其中所述IL-12多肽膜结构域包含细胞内结构域。
E114.如实施方案E113所述的方法，其中所述细胞内结构域与所述跨膜结构域源自相同的多肽，或者其中所述细胞内结构域与所述跨膜结构域源自不同的多肽。
E115.如实施方案113所述的方法，其中所述胞内结构域选自由以下组成的组：PDGFR细胞内结构域、截短的PDGFR细胞内结构域，和CD80细胞内结构域。
E116.如实施方案115所述的方法，其中所述细胞内结构域是包含PDGFR-β细胞内结构域的PDGFR细胞内结构域，所述PDGFR-β细胞内结构域包含SEQ ID NO:48所示的氨基酸序列。
E117.如实施方案115所述的方法，其中所述细胞内结构域是包含在E570或G739处截短的PDGFR-β细胞内结构域的截短PDGFR细胞内结构域。
E118.如实施方案117所述的方法，其中所述在E570处截短的截短PDGFR-β细胞内结构域包含SEQ ID NO:49所示的氨基酸序列，并且其中所述在G739处截短的截短PDGFR-β跨膜结构域包含SEQ ID NO:50所示的氨基酸序列。
E119.如实施方案115所述的方法，其中所述细胞内结构域是包含SEQ ID NO:47所示氨基酸序列的CD80细胞内结构域。
E120.如实施方案103-119中任一项所述的方法，其中所述IL-12多肽膜结构域包含：
(i)PDGFR-β跨膜结构域和PDGFR-β细胞内结构域；
(ii)PDGFR-β跨膜结构域和在E570处截短的截短PDGFR-β细胞内结构域；
(iii)PDGFR-β跨膜结构域和在G739处截短的截短PDGFR-β细胞内结构域；或
(iv)CD80跨膜结构域和CD80细胞内结构域。
E121.如实施方案103-120中任一项所述的方法，其中所述IL-12多肽膜结构域通过肽接头可操作地连接至所述IL-12A多肽，或者其中所述IL-12多肽膜结构域通过肽接头可操作地连接至所述IL-12B多肽。
E122.如实施方案103-121中任一项所述的方法，其中所述IL-15Rα多肽包含sushi结构域。
E123.如实施方案122所述的方法，其中所述IL-15Rα多肽还包含细胞内结构域和跨膜结构域。
E124.如实施方案123所述的方法，其中所述细胞内结构域和所述跨膜结构域源自IL-15Rα。
E125.如实施方案123所述的方法，其中所述细胞内结构域和所述跨膜结构域源自异源多肽。
E126.如实施方案103-125中任一项所述的方法，其中所述IL-15多肽包含SEQ IDNO:17所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。
E127.如实施方案126所述的方法，其中所述IL-15多肽由包含SEQ ID NO:122所示核苷酸序列的核苷酸序列或与SEQ ID NO:122所示核苷酸序列具有至少80％同一性的核苷酸序列编码。
E128.如实施方案103-127中任一项所述的方法，其中所述IL-15Rα多肽包含SEQID NO:13所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。
E129.如实施方案128所述的方法，其中所述IL-15Rα多肽由包含SEQ ID NO:22所示核苷酸序列的核苷酸序列或与SEQ ID NO:22所示核苷酸序列具有至少80％同一性的核苷酸序列编码。
E130.如实施方案103-121中任一项所述的方法，其中可操作地连接至IL-15Rα多肽的IL-15多肽包含SEQ ID NO:23、27和123中任一个所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:23、27和123中任一个所示的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。
E131.如实施方案130所述的方法，其中可操作地连接至IL-15Rα多肽的IL-15多肽由包含SEQ ID NO:24-26、28-30和124-126中任一个所示的核苷酸序列的核苷酸序列或与SEQ ID NO:24-26、28-30和124-126中任一个所示的核苷酸序列具有至少80％同一性的核苷酸序列编码。
E132.如实施方案103-131中任一项所述的方法，其中所述癌症是实体瘤。
E133.如实施方案132所述的方法，其中所述实体瘤包含免疫抑制性肿瘤微环境。
E134.如实施方案132-133中任一项所述的方法，其中所述实体瘤对免疫检查点抑制剂疗法无应答。
E135.如实施方案103-131中任一项所述的方法，其中所述癌症是播散性癌症。
E136.如实施方案135所述的方法，其中所述播散性癌症是血液学癌症。
E137.如实施方案135所述的方法，其中所述播散性癌症是髓系恶性肿瘤。
E138.如实施方案137所述的方法，其中所述髓系恶性肿瘤选自由以下组成的组：骨髓增生异常综合征(MDS)、骨髓增生性疾病(MPD)和急性髓系白血病(AML)。
E139.如实施方案138所述的方法，其中所述髓系恶性肿瘤是AML。
E140.如实施方案103-139中任一项所述的方法，其中所述至少两种mRNA以肿瘤内方式施用。
E141.如实施方案103-139中任一项所述的方法，其中所述至少两种mRNA以静脉内方式施用。
E142.如实施方案103-131中任一项所述的方法，其中所述癌症是实体瘤，并且其中所述至少两种mRNA以肿瘤内方式施用。
E143.如实施方案103-131中任一项所述的方法，其中所述癌症是播散性癌症，并且其中所述至少两种mRNA以静脉内方式施用。
E144.一种治疗人患者的播散性癌症的方法，所述方法包括向所述患者全身性地施用：
(i)编码人OX40L的第一mRNA；和
(ii)编码免疫增强剂的至少一种第二mRNA，其中所述免疫增强剂是激活T细胞、NK细胞或T细胞和NK细胞两者的细胞缔合性细胞因子，
其中所述第一mRNA和所述第二mRNA被包封在相同或不同的脂质纳米颗粒中。
E145.一种治疗人患者的播散性癌症的方法，所述方法包括向所述患者全身性地施用包含脂质纳米颗粒(LNP)和药学上可接受的载体的药物组合物，其中所述LNP包含：
(i)编码人OX40L的第一mRNA；和
(ii)编码免疫增强剂的至少一种第二mRNA，其中所述免疫增强剂是激活T细胞、NK细胞或T细胞和NK细胞两者的细胞缔合性细胞因子。
E146.一种治疗人患者的播散性癌症的方法，所述方法包括向所述患者施用给药方案，所述给药方案包括：
(i)第一分次剂量的药物组合物，所述药物组合物包含编码人OX40L的第一mRNA和编码免疫增强剂的至少一种第二mRNA，其中所述免疫增强剂是激活T细胞、NK细胞或T细胞和NK细胞两者的细胞缔合性细胞因子，和
(ii)至少一个第二分次剂量的所述药物组合物，
其中相对于相同给药间隔期间相同量的mRNA的单个剂量，所述第一分次剂量和所述第二分次剂量增加了所述患者中对所述mRNA编码的多肽的暴露，从而治疗所述患者的所述播散性癌症。
E147.如实施方案146所述的方法，其中所述第一分次剂量和所述第二分次剂量相对于相同量的mRNA的单个剂量，增强所述治疗的抗肿瘤功效。
E148.如实施方案146和147中任一项所述的方法，其中所述第一分次剂量和所述第二分次剂量强抗肿瘤功效，并且具有降低的毒性和更好的耐受性。
E149.如实施方案144-146中任一项所述的方法，其中所述OX40L多肽包含SEQ IDNO:1所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。
E150.如实施方案149所述的方法，其中所述OX40L多肽由包含SEQ ID NO:11所示核苷酸序列的核苷酸序列或与SEQ ID NO:11所示核苷酸序列具有至少80％同一性的核苷酸序列编码。
E151.如实施方案144-150中任一项所述的方法，其中所述细胞缔合性细胞因子是可操作地连接至包含跨膜结构域的膜结构域的人IL-12多肽。
E152.如实施方案144-150中任一项所述的方法，其中所述细胞缔合性细胞因子是反式呈递的人IL-15。
E153.如实施方案152所述的方法，其中所述反式呈递的人IL-15是可操作地连接至人IL-15Rα多肽的人IL-15多肽。
E154.如实施方案152所述的方法，其中所述反式呈递的人IL-15由编码人IL-15多肽的第一mRNA和编码IL-15Rα多肽的第二mRNA编码。
E155.如实施方案150-154中任一项所述的方法，所述方法包括施用编码第二免疫增强剂的第三mRNA，其中所述免疫增强剂是激活T细胞、NK细胞或T细胞和NK细胞两者的细胞缔合性细胞因子。
E156.如实施方案155所述的方法，其中所述第二免疫增强剂是可操作地连接至包含跨膜结构域的膜结构域的人IL-12多肽。
E157.如实施方案150和156中任一项所述的方法，其中所述IL-12多肽包含可操作地连接至IL-12p35亚基(IL-12A)多肽的IL-12p40亚基(IL-12B)多肽。
E158.如实施方案157所述的方法，其中所述IL-12B多肽通过肽接头可操作地连接至所述IL-12A多肽。
E159.如实施方案158所述的方法，其中所述IL-12B多肽位于所述IL-12A多肽的5’末端或所述肽接头的5’末端；或者其中所述IL-12A多肽位于所述IL-12B多肽的5’末端或所述肽接头的5’末端。
E160.如实施方案150和155-159中任一项所述的方法，其中所述IL-12多肽跨膜结构域包含源自I型整合膜蛋白的跨膜结构域。
E161.如实施方案150和155-159中任一项所述的方法，其中所述IL-12多肽跨膜结构域选自由以下组成的组：分化簇8(CD8)跨膜结构域、血小板源性生长因子受体(PDGFR)跨膜结构域和分化簇80(CD80)跨膜结构域。
E162.如实施方案161所述的方法，所述PDGFR-β跨膜结构域包含SEQ ID NO:42所示的氨基酸序列；所述CD8跨膜结构域包含SEQ ID NO:41所示的氨基酸序列；并且所述CD80跨膜结构域包含SEQ ID NO:43所示的氨基酸序列。
E163.如实施方案150和155-162中任一项所述的方法，其中所述IL-12多肽膜结构域包含细胞内结构域。
E164.如实施方案163所述的方法，其中所述细胞内结构域与所述跨膜结构域源自相同的多肽，或者其中所述细胞内结构域与所述跨膜结构域源自不同的多肽。
E165.如实施方案163所述的方法，其中所述胞内结构域选自由以下组成的组：PDGFR细胞内结构域、截短的PDGFR细胞内结构域，和CD80细胞内结构域。
E166.如实施方案165所述的方法，其中所述细胞内结构域是包含PDGFR-β细胞内结构域的PDGFR细胞内结构域，所述PDGFR-β细胞内结构域包含SEQ ID NO:48所示的氨基酸序列。
E167.如实施方案165所述的方法，其中所述细胞内结构域是包含在E570或G739处截短的PDGFR-β细胞内结构域的截短PDGFR细胞内结构域。
E168.如实施方案167所述的方法，其中所述在E570处截短的截短PDGFR-β细胞内结构域包含SEQ ID NO:49所示的氨基酸序列，并且其中所述在G739处截短的截短PDGFR-β跨膜结构域包含SEQ ID NO:50所示的氨基酸序列。
E169.如实施方案165所述的方法，其中所述细胞内结构域是包含SEQ ID NO:47所示氨基酸序列的CD80细胞内结构域。
E170.如实施方案148和153-159中任一项所述的方法，其中所述IL-12多肽膜结构域包含：
(i)PDGFR-β跨膜结构域和PDGFR-β细胞内结构域；
(ii)PDGFR-β跨膜结构域和在E570处截短的截短PDGFR-β细胞内结构域；
(iii)PDGFR-β跨膜结构域和在G739处截短的截短PDGFR-β细胞内结构域；或
(iv)CD80跨膜结构域和CD80细胞内结构域。
E171.如实施方案150和155-170中任一项所述的方法，其中所述IL-12多肽膜结构域通过肽接头可操作地连接至所述IL-12A多肽，或者其中所述IL-12多肽膜结构域通过肽接头可操作地连接至所述IL-12B多肽。
E172.如实施方案153-171中任一项所述的方法，其中所述IL-15Rα多肽包含sushi结构域。
E173.如实施方案172所述的方法，其中所述IL-15Rα多肽还包含细胞内结构域和跨膜结构域。
E174.如实施方案173所述的方法，其中所述细胞内结构域和所述跨膜结构域源自IL-15Rα。
E175.如实施方案173所述的方法，其中所述细胞内结构域和所述跨膜结构域源自异源多肽。
E176.如实施方案153-175中任一项所述的方法，其中所述IL-15多肽包含SEQ IDNO:17所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。
E177.如实施方案176所述的方法，其中所述IL-15多肽由包含SEQ ID NO:122所示核苷酸序列的核苷酸序列或与SEQ ID NO:122所示核苷酸序列具有至少80％同一性的核苷酸序列编码。
E178.如实施方案153-177中任一项所述的方法，其中所述IL-15Rα多肽包含SEQID NO:13所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。
E179.如实施方案178所述的方法，其中所述IL-15Rα多肽由包含SEQ ID NO:22所示核苷酸序列的核苷酸序列或与SEQ ID NO:22所示核苷酸序列具有至少80％同一性的核苷酸序列编码。
E180.如实施方案152和154-171中任一项所述的方法，其中可操作地连接至IL-15Rα多肽的IL-15多肽包含SEQ ID NO:23、27和123中任一个所示的氨基酸序列或与SEQ IDNO:23、27和123中任一个所示的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。
E181.如实施方案180所述的方法，其中可操作地连接至IL-15Rα多肽的IL-15多肽由包含SEQ ID NO:24-26、28-30和124-126中任一个所示的核苷酸序列的核苷酸序列或与SEQ ID NO:24-26、28-30和124-126中任一个所示的核苷酸序列具有至少80％同一性的核苷酸序列编码。
E182.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中每种mRNA包含3’非翻译区(UTR)。
E183.如实施方案182所述的方法，其中所述3’UTR包含至少一个微RNA(miR)结合位点。
E184.如实施方案183所述的方法，其中所述至少一个miR结合位点是miR-122结合位点。
E185.如实施方案184所述的方法，其中所述miR-122结合位点是miR-122-3p或miR-122-5p结合位点。
E186.如实施方案185所述的方法，其中所述miR-122-5p结合位点包含SEQ ID NO:83所示的核苷酸序列，并且其中所述miR-122-3p结合位点包含SEQ ID NO:74所示的核苷酸序列。
E187.如实施方案103-181中任一项所述的方法，其中每种mRNA包含3’UTR，所述3’UTR包含SEQ ID NO:77或SEQ ID NO:121所示的核苷酸序列。
E188.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中每种mRNA包含5’非翻译区(UTR)。
E189.如实施方案188所述的方法，其中所述5’UTR包含SEQ ID NO:12或SEQ IDNO:76所示的核苷酸序列。
E190.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中每种mRNA包括至少一种化学修饰。
E191.如实施方案190所述的方法，其中所述化学修饰选自由以下组成的组：假尿苷、N1-甲基假尿苷、2-硫代尿苷、4’-硫代尿苷、5-甲基胞嘧啶、2-硫代-1-甲基-1-脱氮-假尿苷、2-硫代-1-甲基-假尿苷、2-硫代-5-氮杂-尿苷、2-硫代-二氢假尿苷、2-硫代-二氢尿苷、2-硫代-假尿苷、4-甲氧基-2-硫代-假尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-硫代-1-甲基-假尿苷、4-硫代-假尿苷、5-氮杂-尿苷、二氢假尿苷、5-甲基尿苷、5-甲基尿苷、5-甲氧基尿苷和2’-O-甲基尿苷。
E192.如实施方案103-189中任一项所述的方法，其中每种mRNA中至少95％的尿苷是N1-甲基假尿苷。
E193.如实施方案192所述的方法，其中每种mRNA中至少99％的尿苷是N1-甲基假尿苷。
E194.如实施方案192所述的方法，其中每种mRNA中100％的尿苷是N1-甲基假尿苷。
E195.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中将每种mRNA配制在相同的脂质纳米颗粒中。
E196.如实施方案103-144和146-194中任一项所述的方法，其中将每种mRNA配制在单独的脂质纳米颗粒中。
E197.如实施方案195-196中任一项所述的方法，其中所述脂质纳米颗粒包含摩尔比为约20％-60％:5％-25％:25％-55％:0.5％-15％的可电离氨基脂质:磷脂:结构脂质:PEG修饰脂质。
E198.如实施方案195-196中任一项所述的方法，其中所述脂质纳米颗粒包含摩尔比为约50％:约10％:约38.5％:约1.5％的可电离脂质:磷脂:甾醇:PEG修饰脂质。
E199.如实施方案195-196中任一项所述的方法，其中所述脂质纳米颗粒包含摩尔比为50:38.5:10:1.5的可电离脂质:胆固醇:DSPC:PEG修饰脂质。
E200.如实施方案197-199中任一项所述的方法，其中所述可电离脂质选自由以下组成的组：例如，2,2-二亚油基-4-二甲基氨基乙基-[1,3]-二氧戊环(DLin-KC2-DMA)、4-二甲基氨基丁酸二亚油基-甲酯(DLin-MC3-DMA)和9-((4-(二甲基氨基)丁酰基)氧基)十七烷二酸二((Z)-壬-2-烯-1-基)酯(L319)。
E201.如实施方案197-199中任一项所述的方法，其中所述可电离脂质包括化合物II。
E202.如实施方案195-196中任一项所述的方法，其中所述脂质纳米颗粒包含摩尔比为约20％-60％:5％-25％:25％-55％:0.5％-15％的化合物II:磷脂:胆固醇:PEG修饰脂质。
E203.如实施方案202所述的方法，其中所述脂质纳米颗粒包含摩尔比为约50％:约10％:约38.5％:约1.5％的化合物II:磷脂:胆固醇:PEG修饰脂质。
E204.如实施方案197-203中任一项所述的方法，其中所述PEG修饰脂质是PEG-DMG或化合物I。
E205.如实施方案195-196中任一项所述的方法，其中所述脂质纳米颗粒包含摩尔比为50:38.5:10:1.5的化合物II:胆固醇:磷脂:化合物I，或化合物II:胆固醇:DSPC:化合物I。
E206.如实施方案195-196中任一项所述的方法，其中所述脂质纳米颗粒包含摩尔比为40:38.5:20:1.5的化合物II:胆固醇:磷脂:化合物I，或化合物II:胆固醇:DSPC:化合物I。
E207.如实施方案103-206中任一项所述的方法，所述方法包括施用检查点抑制剂多肽。
E208.如实施方案207所述的方法，其中所述检查点抑制剂多肽抑制PD-1、PD-L1、CTLA-4或它们的组合。
E209.如实施方案208所述的方法，其中所述检查点抑制剂多肽是抗体或编码所述抗体的mRNA。
E210.如实施方案209所述的方法，其中所述抗体是抗CTLA-4抗体或其特异性地结合CTLA-4的抗原结合片段、抗PD-1抗体或其特异性地结合PD-1的抗原结合片段、抗PD-L1抗体或其特异性地结合PD-L1的抗原结合片段，以及它们的组合。
E211.如实施方案210所述的方法，其中所述抗PD-L1抗体是阿特珠单抗、阿维鲁单抗或度伐鲁单抗，其中所述抗CTLA-4抗体是曲美木单抗或伊匹单抗，并且其中所述抗PD-1抗体是纳武单抗或派姆单抗。
E212.一种脂质纳米颗粒，所述脂质纳米颗粒包含至少两种包封的信使RNA(mRNA)，其中所述至少两种mRNA选自由以下组成的组：
(i)编码OX40L多肽的mRNA；
(ii)编码可操作地连接至IL-15Rα多肽的IL-15多肽的mRNA；
(iii)编码IL-15多肽的mRNA和编码IL-15Rα多肽的mRNA；和
(iv)编码IL-12多肽的mRNA。
E213.如实施方案212所述的脂质纳米颗粒，其中所述至少两种mRNA选自由以下组成的组：
(i)编码OX40L多肽的mRNA和编码IL-12多肽的mRNA；
(ii)编码OX40L多肽的mRNA、编码IL-15多肽的mRNA和编码IL-15Rα多肽的mRNA；
(iii)编码OX40L多肽的mRNA和编码可操作性地连接至IL-15Rα多肽的IL-15多肽的mRNA；
(iv)编码IL-15多肽的mRNA、编码IL-15Rα多肽的mRNA和编码IL-12多肽的mRNA；
(v)编码可操作性地连接至IL-15Rα多肽的IL-15多肽的mRNA和编码IL-12多肽的mRNA；
(vi)编码OX40L多肽的mRNA、编码IL-15多肽的mRNA、编码IL-15Rα多肽的mRNA和编码IL-12多肽的mRNA；以及
(vii)编码OX40L多肽的mRNA、编码可操作性地连接至IL-15Rα多肽的IL-15多肽的mRNA和编码IL-12多肽的mRNA。
E214.一种脂质纳米颗粒，所述脂质纳米颗粒包含：编码OX40L多肽的mRNA、编码IL-15多肽的mRNA、编码IL-15Rα多肽的mRNA和编码IL-12多肽的mRNA。
E215.一种脂质纳米颗粒，所述脂质纳米颗粒包含：
(i)编码人OX40L多肽的mRNA，其中所述人OX40L多肽包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；
(ii)编码人IL-15多肽的mRNA，其中所述人IL-15多肽包含SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列；
(iii)编码人IL-15Rα多肽的mRNA，其中所述人IL-15Rα多肽包含SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列；以及
(iv)编码人IL-12多肽的mRNA，其中所述人IL-12多肽包含SEQ ID NO:61所示的氨基酸序列，
其中所述脂质纳米颗粒包含摩尔比为约20％-60％:5％-25％:25％-55％:0.5％-15％的可电离氨基脂质:磷脂:结构脂质:PEG修饰脂质。
E216.一种脂质纳米颗粒，所述脂质纳米颗粒包含：
(i)编码人OX40L多肽的mRNA，其中所述mRNA包含SEQ ID NO:11所示的核苷酸序列或与SEQ ID NO:11所示的核苷酸序列具有至少80％同一性的核苷酸序列；
(ii)编码人IL-15多肽的mRNA，其中所述mRNA包含SEQ ID NO:122所示的核苷酸序列或与SEQ ID NO:122所示的核苷酸序列具有至少80％同一性的核苷酸序列；
(iii)编码人IL-15Rα多肽的mRNA，其中所述mRNA包含SEQ ID NO:22所示的核苷酸序列或与SEQ ID NO:22所示的核苷酸序列具有至少80％同一性的核苷酸序列；以及
(iv)编码人IL-12多肽的mRNA，其中所述mRNA包含SEQ ID NO:60所示的核苷酸序列或与SEQ ID NO:60所示的核苷酸序列具有至少80％同一性的核苷酸序列，
其中所述脂质纳米颗粒包含摩尔比为约20％-60％:5％-25％:25％-55％:0.5％-15％的可电离氨基脂质:磷脂:结构脂质:PEG修饰脂质。
E217.如实施方案213-216中任一项所述的脂质纳米颗粒，所述脂质纳米颗粒包含比例为1:1:1:1的OX40L:IL-15:IL-15Rα:IL-12。
E218.如实施方案212-217中任一项所述的脂质纳米颗粒，所述脂质纳米颗粒被配制成用于肿瘤内递送。
E219.如实施方案212-217中任一项所述的脂质纳米颗粒，所述脂质纳米颗粒被配制成用于静脉内递送。
E220.如实施方案212-214中任一项所述的脂质纳米颗粒，其中所述脂质纳米颗粒包含摩尔比为约20％-60％:5％-25％:25％-55％:0.5％-15％的可电离氨基脂质:磷脂:结构脂质:PEG修饰脂质。
E221.如实施方案215-220中任一项所述的脂质纳米颗粒，其中所述脂质纳米颗粒包含摩尔比为约50％:约10％:约38.5％:约1.5％的可电离脂质:磷脂:甾醇:PEG修饰脂质。
E222.如实施方案212-219中任一项所述的脂质纳米颗粒，其中所述脂质纳米颗粒包含摩尔比为50:38.5:10:1.5的可电离脂质:胆固醇:DSPC:PEG修饰脂质。
E223.如实施方案215-222中任一项所述的脂质纳米颗粒，其中所述可电离脂质选自由以下组成的组：例如，2,2-二亚油基-4-二甲基氨基乙基-[1,3]-二氧戊环(DLin-KC2-DMA)、4-二甲基氨基丁酸二亚油基-甲酯(DLin-MC3-DMA)和9-((4-(二甲基氨基)丁酰基)氧基)十七烷二酸二((Z)-壬-2-烯-1-基)酯(L319)。
E224.如实施方案215-223中任一项所述的脂质纳米颗粒，其中所述可电离脂质包括化合物II。
E225.如实施方案212-219中任一项所述的脂质纳米颗粒，其中所述脂质纳米颗粒包含摩尔比为约20％-60％:5％-25％:25％-55％:0.5％-15％的化合物II:磷脂:胆固醇:PEG修饰脂质。
E226.如实施方案225所述的脂质纳米颗粒，其中所述脂质纳米颗粒包含摩尔比为约50％:约10％:约38.5％:约1.5％的化合物II:磷脂:胆固醇:PEG修饰脂质。
E227.如实施方案215-226中任一项所述的脂质纳米颗粒，其中所述PEG修饰脂质是PEG-DMG或化合物I。
E228.如实施方案212-227中任一项所述的脂质纳米颗粒，其中所述脂质纳米颗粒包含摩尔比为50:38.5:10:1.5的化合物II:胆固醇:磷脂:化合物I，或化合物II:胆固醇:DSPC:化合物I。
E229.如实施方案212-227中任一项所述的脂质纳米颗粒，其中所述脂质纳米颗粒包含摩尔比为40:38.5:20:1.5的化合物II:胆固醇:磷脂:化合物I，或化合物II:胆固醇:DSPC:化合物I。
E230.一种用于治疗有需要的受试者的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用如实施方案212-229中任一项所述的脂质纳米颗粒。
E231.如实施方案230所述的方法，其中所述癌症是播散性癌症或实体瘤。
E232.如实施方案231所述的方法，其中所述播散性癌症是髓系恶性肿瘤。
E233.如实施方案230-232中任一项所述的方法，所述方法还包括施用免疫检查点抑制剂多肽。
E234.如实施方案233所述的方法，其中所述检查点抑制剂多肽抑制PD-1、PD-L1、CTLA-4或它们的组合。
E235.如实施方案234所述的方法，其中所述检查点抑制剂多肽是抗体或编码所述抗体的mRNA。
E236.如实施方案235所述的方法，其中所述抗体是抗CTLA-4抗体或其特异性地结合CTLA-4的抗原结合片段、抗PD-1抗体或其特异性地结合PD-1的抗原结合片段、抗PD-L1抗体或其特异性地结合PD-L1的抗原结合片段，以及它们的组合。
E237.如实施方案236所述的方法，其中所述抗PD-L1抗体是阿特珠单抗、阿维鲁单抗或度伐鲁单抗，其中所述抗CTLA-4抗体是曲美木单抗或伊匹单抗，并且其中所述抗PD-1抗体是纳武单抗或派姆单抗。
E238.如实施方案212-229中任一项所述的脂质纳米颗粒，和任选的药学上可接受的载体，其用于治疗个体的癌性或延迟癌性的进展，其中治疗包括施用所述脂质纳米颗粒。
E239.如实施方案212-229中任一项所述的脂质纳米颗粒，和任选的药学上可接受的载体，其用于治疗个体的癌症或延迟癌症的进展，其中治疗包括与包含免疫检查点抑制性多肽和任选的药学上可接受的载体的组合物组合施用所述脂质纳米颗粒。
E240.如实施方案238-239中任一项所述的脂质纳米颗粒，其中所述癌症是播散性癌症或实体瘤。
E241.如实施方案212-229中任一项所述的脂质纳米颗粒和任选的药学上可接受的载体在制造用于治疗个体的癌症或延迟癌症的进展的药物中的用途，其中所述药物包含所述脂质纳米颗粒和任选的药学上可接受的载体，并且其中所述治疗包括施用所述药物。
E242.如实施方案212-229中任一项所述的脂质纳米颗粒和任选的药学上可接受的载体在制造用于治疗个体的癌症或延迟癌症的进展的药物中的用途，其中所述药物包含所述脂质纳米颗粒和任选的药学上可接受的载体，并且其中所述治疗包括与包含免疫检查点抑制剂多肽和任选的药学上可接受的载体的组合物组合施用所述药物。
E243.根据实施方案241-242中任一项所述的脂质纳米颗粒的用途，其中所述癌症是播散性癌症或实体瘤。
E244.一种药盒，所述药盒包括：容器，所述容器包括如实施方案212-229中任一项所述的脂质纳米颗粒和任选的药学上可接受的载体；以及包装插入物，所述包装插入物包括用于施用所述脂质纳米颗粒以治疗个体的癌症或延迟癌症的进展的说明书。
E245.如实施方案244所述的药盒，其中所述包装插入物还包括用于将所述脂质纳米颗粒与包含免疫检查点抑制剂多肽和任选的药学上可接受的载体的组合物组合施用以治疗个体的癌症或延迟癌症的进展的说明书。
E246.一种药盒，所述药盒包括：容器，所述容器包括如实施方案212-229中任一项所述的脂质纳米颗粒和任选的药学上可接受的载体；以及包装插入物，所述包装插入物包括用于单独地或与包含免疫检查点抑制剂多肽和任选的药学上可接受的载体的组合物组合地施用所述药物以治疗个体的癌症或延迟癌症的进展的说明书。
E247.如实施方案244-246中任一项所述的药盒，其中所述癌症是播散性癌症或实体瘤。
E248.一种用于增强受试者中的免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者施用如实施方案212-229中任一项所述的脂质纳米颗粒。
E249.一种用于增强受试者中的T细胞激活的方法，所述方法包括向所述受试者施用如实施方案212-229中任一项所述的脂质纳米颗粒。
E250.一种用于增强受试者中的NK细胞激活的方法，所述方法包括向所述受试者施用如实施方案212-229中任一项所述的脂质纳米颗粒。
E251.如实施方案248-250中任一项所述的方法，其中所述受试者患有癌症。
E252.如实施方案251所述的方法，其中所述癌症是播散性癌症或实体瘤。
E253.如实施方案248-252中任一项所述的方法，所述方法还包括施用免疫检查点抑制剂多肽。
E254.如实施方案212-214和218-219中任一项所述的脂质纳米颗粒，所述脂质纳米颗粒包含：
(i)可电离脂质；
(ii)甾醇或其他结构脂质；
(iii)如权利要求1-76中任一项所述的多核苷酸；
(iv)任选地，非阳离子辅助脂质或磷脂；和
(v)任选地，PEG脂质。
E255.如实施方案254所述的脂质纳米颗粒，所述脂质纳米颗粒包含植物甾醇或植物甾醇与胆固醇的组合。
E256.如实施方案255所述的脂质纳米颗粒，其中所述植物甾醇选自由以下组成的组：β-谷甾醇、豆甾醇、β-谷甾烷醇、菜油甾醇、菜子甾醇以及它们的组合。
E257.如权利要求255所述的脂质纳米颗粒，其中所述植物甾醇包括谷甾醇或其盐或酯。
E258.如实施方案255所述的脂质纳米颗粒，其中所述植物甾醇包括豆甾醇或其盐或酯。
E259.如实施方案255所述的脂质纳米颗粒，其中所述植物甾醇是β-谷甾醇
Figure BDA0003064795710004151
或其盐或酯。
E260.如实施方案254所述的脂质纳米颗粒，其中所述植物甾醇或其盐或酯选自由以下组成的组：β-谷甾醇、β-谷甾烷醇、菜油甾醇、菜子甾醇、化合物S-140、化合物S-151、化合物S-156、化合物S-157、化合物S-159、化合物S-160、化合物S-164、化合物S-165、化合物S-170、化合物S-173、化合物S-175以及它们的组合。
E261.如实施方案260所述的脂质纳米颗粒，其中所述植物甾醇是β-谷甾醇。
E262.如实施方案260所述的脂质纳米颗粒，其中所述植物甾醇是β-谷甾烷醇。
E263.如实施方案260所述的脂质纳米颗粒，其中所述植物甾醇是菜油甾醇。
E264.如实施方案260所述的脂质纳米颗粒，其中所述植物甾醇是菜子甾醇。
E265.如实施方案254-264中任一项所述的脂质纳米颗粒，其中所述可电离脂质包括式(I I)、(I IA)、(I IB)、(I II)、(I IIa)、(I IIb)、(I IIc)、(I IId)、(I IIe)、(IIIf)、(I IIg)、(I III)、(I VI)、(I VI-a)、(I VII)、(I VIII)、(I VIIa)、(I VIIIa)、(IVIIIb)、(I VIIb-1)、(I VIIb-2)、(I VIIb-3)、(I VIIc)、(I VIId)、(I VIIIc)、(IVIIId)、(I IX)、(I IXa1)、(I IXa2)、(I IXa3)、(I IXa4)、(I IXa5)、(I IXa6)、(I IXa7)或(I IXa8)中任一个的化合物。
E266.如实施方案254-264中任一项所述的脂质纳米颗粒，其中所述可电离脂质包括选自由以下组成的组的化合物：化合物X、化合物Y、化合物I-48、化合物I-50、化合物I-109、化合物I-111、化合物I-113、化合物I-181、化合物I-182、化合物I-244、化合物I-292、化合物I-301、化合物I-309、化合物I-317、化合物I-321、化合物I-322、化合物I-326、化合物I-328、化合物I-330、化合物I-331、化合物I-332、化合物I-347、化合物I-348、化合物I-349、化合物I-350、化合物I-352和化合物I-M。
E267.如实施方案254-264中任一项所述的脂质纳米颗粒，其中所述可电离脂质包括选自由以下组成的组的化合物：化合物X、化合物Y、化合物I-321、化合物I-292、化合物I-326、化合物I-182、化合物I-301、化合物I-48、化合物I-50、化合物I-328、化合物I-330、化合物I-109、化合物I-111和化合物I-181。
E268.如实施方案254-267中任一项所述的脂质纳米颗粒，其中所述LNP包含磷脂，并且其中所述磷脂包括选自由DSPC、DMPE和化合物H-409组成的组的化合物。
E269.如实施方案254-268中任一项所述的脂质纳米颗粒，其中所述LNP包含PEG脂质。
E270.如实施方案269所述的脂质纳米颗粒，其中所述PEG脂质选自由以下组成的组：PEG修饰的磷脂酰乙醇胺、PEG修饰的磷脂酸、PEG修饰的神经酰胺、PEG修饰的二烷基胺、PEG修饰的二酰基甘油、PEG修饰的二烷基甘油以及它们的混合物。
E271.如实施方案270所述的脂质纳米颗粒，其中所述PEG脂质包括选自由以下组成的组的化合物：化合物P-415、化合物P-416、化合物P-417、化合物P-419、化合物P-420、化合物P-423、化合物P-424、化合物P-428、化合物P-L1、化合物P-L2、化合物P-L3、化合物P-L4、化合物P-L6、化合物P-L8、化合物P-L9、化合物P-L16、化合物P-L17、化合物P-L18、化合物P-L19、化合物P-L22、化合物P-L23和化合物P-L25。
E272.如实施方案271所述的脂质纳米颗粒，其中所述PEG脂质包括选自由以下组成的组的化合物：化合物P-428、化合物PL-16、化合物PL-17、化合物PL-18、化合物PL-19、化合物PL-1和化合物PL-2。
E273.如实施方案254-272中任一项所述的脂质纳米颗粒，所述脂质纳米颗粒包含约30mol％至约60mol％的可电离脂质、约0mol％至约30mol％的非阳离子辅助脂质或磷脂、约18.5mol％至约48.5mol％的甾醇或其他结构脂质，以及约0mol％至约10mol％的PEG脂质。
E274.如实施方案254-272中任一项所述的脂质纳米颗粒，所述脂质纳米颗粒包含约35mol％至约55mol％的可电离脂质、约5mol％至约25mol％的非阳离子辅助脂质或磷脂、约30mol％至约40mol％的甾醇或其他结构脂质，以及约0mol％至约10mol％的PEG脂质。
E275.如实施方案254-272中任一项所述的脂质纳米颗粒，所述脂质纳米颗粒包含约50mol％的可电离脂质、约10mol％的非阳离子辅助脂质或磷脂、约38.5mol％的甾醇或其他结构脂质，以及约1.5mol％的PEG脂质。
E276.如实施方案254-275中任一项所述的脂质纳米颗粒，其中甾醇或其他结构脂质的mol％是18.5％植物甾醇，并且结构脂质的总mol％是38.5％。
E277.如实施方案254-275中任一项所述的脂质纳米颗粒，其中甾醇或其他结构脂质的mol％是28.5％植物甾醇，并且结构脂质的总mol％是38.5％。
实施例
通过参考以下实施例将更充分地理解本公开。然而，它们不应被解释为限制本公开的范围。应当理解，本文所述的实施例和实施方案仅为了举例说明的目的，并且本领域技术人员将想到根据本发明的各种修改或变化，这些均包括在本申请的精神和权限以及所附权利要求书的范围之内。
实施例1：AML细胞系的LNP转染效率
在该实施例中，研究转染条件和LNP组分以优化体外AML细胞的转染效率。
在第一系列实验中，在存在或不存在以下各项的条件下，用LNP中的mRNA转染AML细胞：人血清、小鼠血清、人免疫球蛋白(IgM或IgG)、人PBMC或人补体(含或不含人血清、人IgM和/或人IgG)。结果(数据未显示)证明，添加人血清、人PBMC、人补体或人补体和人免疫球蛋白使体外AML细胞系转染效率增加。结果表明，免疫球蛋白识别以及补体在免疫球蛋白上沉积，然后是补体受体结合，都是AML细胞摄取LNP中的mRNA所必需的。
在第二系列实验中，使用含有不同PEG修饰脂质的LNP比较体外AML细胞转染。配制脂质纳米颗粒，其包含：50％可电离氨基脂质(化合物X)、10％磷脂、38.5％胆固醇和1.5％PEG修饰脂质，其中PEG修饰脂质是1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油甲氧基聚乙二醇(PEG-DMG)或化合物428。在存在或不存在人血清的情况下，将Kasumi-1AML细胞在体外用以下转染：(i)无LNP，(ii)化合物X/PEG-DMG LNP或(iii)化合物X/化合物428LNP。结果示于图1中，该图显示了在存在人血清的情况下化合物X/PEG-DMG LNP或化合物X/化合物428LNP对AML细胞的有效转染。
在第三系列实验中，测试了一系列AML细胞系(ATCC或DSMZ)的转染效率，对化合物X/PEG-DMG LNP和化合物X/化合物428LNP进行了比较。结果汇总于下表17中：
表17：不同LNP的AML细胞转染效率的比较
Figure BDA0003064795710004191
*HS＝人血清
在另一个实验中，评估了LNP在原代AML细胞中的转染效率。具体地，在人血清中调理LNP后，将8种不同的原代AML样品用化合物X/PEG-DMG LNP或化合物X/化合物428LNP转染。结果示于图2，该图显示了化合物X/PEG-DMG LNP或化合物X/化合物428LNP对AML细胞的有效转染。
结果证明，化合物X/PEG-DMG LNP和化合物X/化合物428LNP在测试的不同细胞系中表现出相当的转染效率。
实施例2：
OX40L、IL-12和IL-15mRNA的组合疗法对肿瘤生长的抑制
在该实施例中，使用急性髓系白血病(AML)的鼠肿瘤模型检查利用编码mOX40L、mIL-12和hIL-15/IL-15Rα的mRNA的组合疗法在实体瘤和播散性癌症中的功效。
在DBA/2小鼠中皮下建立AML肿瘤。根据供应商的说明书培养小鼠AML细胞P388D1(ATCC编号CCL-46；ATCC,Manassas,VA)。将细胞皮下接种到小鼠中以产生皮下肿瘤。监测肿瘤的大小和可触知性。考虑到该系的细胞起源及其在小鼠中的生长特征，P388D1细胞可充当播散性癌症和实体瘤的模型。
一旦肿瘤形成，就将动物分成三组。第1组用对照mRNA NST(12.5μg)治疗，第2组用编码mOX40L的mRNA(5μg)和编码连接至hIL-15Rα的sushi结构域的hIL-15(hIL-15RLI)的mRNA(5μg)治疗，并且第3组用编码mOX40L的mRNA(5μg)、编码hIL-15RLI的mRNA(5μg)和编码mIL-12的mRNA(2.5μg)治疗。编码mOX40L的mRNA编码如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。编码IL-15RLI的mRNA包含含有SEQ ID NO:32的开放阅读框，其编码如SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列。对于第2组，还包括对照mRNA NST，以使每只动物的总mRNA剂量达到12.5μg。将mRNAs配制在单独的脂质纳米颗粒中，所述脂质纳米颗粒包含：50％可电离氨基脂质(化合物X)、10％磷脂、38.5％胆固醇和1.5％PEG脂质。每7天(Q7D)对每组进行肿瘤内给药，从肿瘤植入后7天开始。第1组和第2组用三个剂量治疗。第3组用单剂量治疗，因为在所用剂量水平下观察到一些毒性。
结果示于图3A(第1组)、图3B(第2组)和图3C(第3组)的图中，这些图示出了随时间推移的肿瘤体积。
结果证明，与单独使用mOX40L进行治疗相比，使用mOX40L和hIL-15RLI的双联体组合疗法可减慢肿瘤生长，而使用mOX40L、hIL-15RLI和mIL-12的三联体组合疗法可显著抑制肿瘤生长，其中观察到一个完全缓解。这些结果证明了mRNA组合疗法在癌症中的功效。
实施例3：细胞缔合的和拴系的IL-15构建体的体外表达和生物活性
为了评估在癌症中增强抗肿瘤功效的潜力，我们产生了能够反式呈递IL-15的编码细胞缔合性IL-15构建体的一种或多种mRNA。
具体地，制备了在3’UTR中包含编码IL-15多肽和miRNA结合位点(miR-122)的核苷酸序列的mRNA。序列是：hIL-15+hIL-15Rα(细胞缔合性IL-15；分别是SEQ ID NO:17和13)，编码人IL-15和IL-15Rα，其包含sushi结构域和跨膜结构域(图4A)；hIL-15_IL-15Rα(拴系的IL-15；SEQ ID NO:27)，编码连接至全长人IL-15Rα的人IL-15(图4B)；和hIL-15RLI(SEQID NO:31)，编码通过接头连接至IL-15的IL-15Rαsushi结构域的嵌合体(图4C)；hIL-15_CD80TID(拴系的IL-15；SEQ ID NO:123)，编码连接至sushi结构域和源自CD80的跨膜结构域和细胞内结构域的人IL-15(图4D)。mRNA开放阅读框序列分别示于SEQ ID NO:122、22、28、32和124中。各mRNA包含具有SEQ ID NO:117或SEQ ID NO:12所示序列的5’UTR，和具有SEQ ID NO:121或SEQ ID NO:77所示序列的3’UTR。
细胞缔合性IL-15构建体包含两个编码独立组分的独立mRNA，其中IL-15以高亲和力结合至IL-15Rαsushi结构域，从而将IL-15限制于表达IL-15Rα的细胞。拴系的IL-15与连接至IL-15Rα的IL-15细胞因子产生融合蛋白，IL-15Rα天然地在细胞膜上表达，从而将IL-15拴系在表达其的细胞中。
转染前一天，将HeLa细胞接种在6孔板(BD Biosciences,San Jose,USA)上。接下来，每孔使用含2μg mRNA和4μLLipofectamine 2000的150μL Opti-MEM分别将包含hIL-15+hIL-15Rα；hIL-15_IL-15Rα；hIL-15RLI；或hIL-15_CD80TID的mRNA转染到HeLa细胞中并孵育。暴露于不含mRNA的转染试剂的HeLa细胞充当阴性对照(即，“模拟物(Mock)”)。4小时后除去转染培养基，并在剩余的孵育期间替换为新鲜的生长培养基。24小时后，从每个孔中收集上清液，并使用恒定量的裂解缓冲液裂解每个孔中的细胞。然后通过标准ELISA测定法定量每个孔的上清液和裂解物中的IL-15的量(ng/孔)。
图5A显示拴系的IL-15(hIL-15_IL-15Rα)仅在裂解物中表达，而不在上清液中表达，表明成功地拴系至细胞。相比之下，编码hIL-15和hIL-15Rα以及hIL-15RLI的独立mRNA导致IL-15在上清液和裂解物中均表达。
为了评估生物活性，将25,000CTLL-2细胞与固定数目的丝裂霉素C处理的HeLa细胞一起培养，所述HeLa细胞来自用所述构建体之一转染的HeLa细胞培养物，并且还包括来自HeLa细胞培养物的上清液的固定稀释物。还将以1:1摩尔比混合在一起的重组人IL-15和人IL-15Rα(rhIL-15/IL-15Rα)添加到阴性对照培养物的子集(“Mock+rhIL-15/IL-15Rα”)中。培养72小时后，根据制造商的说明书使用
Figure BDA0003064795710004221
发光细胞活力测定试剂盒(Promega Corporation,Madison,WI)确定各培养物中CTLL-2细胞的增殖。
图5B显示测试的所有IL-15构建体均诱导T细胞增殖，这表明各构建体的生物活性。
使用编码相同构建体的不同mRNA型式进行另外的实验以测试IL-15构建体的表达。方法与上述方法相同。具体地，在用Lipofectamine转染HeLa细胞后24小时收集裂解物和上清液。使用购自R&D Systems的IL-15/IL-15Rα复合ELISA试剂盒(DY6924)测量表达。具有tPA6信号肽的hIL-15_IL-15Rα(“tPA6 IL15-IL-15Rα”)由SEQ ID NO:28、29(var2)或30(var3)；具有IgE信号肽的hIL-15_IL-15Ra(“IgE IL15-IL15Rα”)由SEQ ID NO:24、25(var2)或26(var3)编码；并且hIL-15_CD80TID(“tPA6 ILR接头80TID”)由SEQ ID No:124、125(var2)或126(var3)编码。编码hIL-15和hIL-15Ra的独立mRNA(Hs IL15_mod/Hs IL15Ramod1)。图5C示出了用各种mRNA转染的细胞中上清液和裂解物中的IL-15蛋白质表达。图5D示出了脱落蛋白质的百分比，其计算为上清液表达/裂解物表达+上清液表达。这些结果表明，上清液中表达量低并不仅仅是由于整体表达量低，而是翻译的总蛋白的较低百分比终结于上清液。此外，结果显示，在用连接至CD80的跨膜结构域和细胞内结构域的hIL-15转染的细胞中，上清液中几乎无表达。
实施例4：对用栓系和细胞缔合性细胞因子mRNA进行的AML治疗的进一步表征
在该实施例中，使用C1498肿瘤模型进一步检查栓系和细胞缔合性细胞因子mRNA构建体的治疗功效。C1498肿瘤模型用于确定在播散性癌症和实体瘤中的功效，因为这些AML细胞用于形成皮下肿瘤(即，实体瘤)。除了利用编码实施例3中描述的细胞缔合性人IL-15构建体的mRNA，还利用了编码拴系鼠IL-12的mRNA。具体地，制备编码通过接头与小鼠PGFRB跨膜结构域连接的鼠IL-12多肽的mRNA(mIL-12PTM)。氨基酸序列提供于SEQ ID NO:45中，并且开放阅读框提供于SEQ ID NO:44中。
在C57Bl/6小鼠中建立C1498同系皮下肿瘤，并用LNP中的单(mOX40L或细胞缔合性hIL-15/IL-15Rα或mIL-12TM)、双联体(mOX40L+细胞缔合性hIL-15/IL-15Rα)或三联体mRNA(mOX40L+细胞缔合性hIL-15/IL-15Rα+mIL-12TM)构建体对小鼠进行肿瘤内治疗。配制LNP，其包含：50％可电离氨基脂质(化合物X)、10％磷脂、38.5％胆固醇和1.5％PEG修饰脂质，其中PEG修饰脂质是1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油甲氧基聚乙二醇(PEG-DMG)。用总共含12.5μgmRNA的LNP治疗小鼠。mOX40L和hIL-15/IL-15Rα构建体各自以5μg mRNA使用，mIL-12TM构建体作为单剂时以5μg mRNA使用，当组合使用时以2.5μg mRNA使用，NST对照mRNA在必要时将总mRNA提到12.5μg。
图6A至图6F中提供的结果示出了用单剂(图6B、图6C和图6D)、双联体mRNA组合(图6E)或三联体mRNA组合(图6F)治疗的小鼠中如通过65天内的肿瘤体积测量的肿瘤生长。结果证明，三联体组合在C1498皮下肿瘤模型中高度有效，观察到6个完全应答(CR)。
图7A至图7C中提供的结果示出了用各种单剂(图7A)、各种mOX40L+hIL-15/IL-15Rα双联体(图7B)和各种mOX40L+hIL-15/IL-15Rα+mIL-12TM三联体体(图7C)治疗的小鼠的存活百分比。结果证明，使用栓系细胞因子的mOX40L+hIL-15/IL-15Rα+mIL-12TM三联体组合显著改善C1498皮下肿瘤模型中小鼠的存活率。
重复实验证明了相似的肿瘤生长抑制作用，表明三联体肿瘤内治疗的功效是可再现的。第二项研究(n＝15)的结果和这两项研究(n＝30)的合并结果示于表18中，该表示出了用对照、单剂或三联体mRNA组合治疗的小鼠中如通过65天内的肿瘤体积测量的肿瘤生长：
表18：组合mRNA在C1498肿瘤模型中的功效
Figure BDA0003064795710004241
mOX40L+hIL-15/IL-15Rα+mIL-12TM的组合展现出47％的完全应答(CR)率，而单剂的CR率为13％-17％，表明当肿瘤内施用时三联体组合比任何单剂都更有效。此外，对所有应答者的再攻击均未导致再生长，表明了持久的抗肿瘤免疫应答。
另外，在总共四项独立研究(n＝59总计)中比较了使用mOX40L+hIL-15/IL-15Rα+mIL-12TM三联体的单剂量治疗与使用三联体的多剂量治疗(Q7Dx3)的功效。此外，将三联体的单剂量或多剂量方案与mOX40L+mIL-12TM和mIL-12TM+hIL-15/IL-15Rα双联体组合进行了比较。表19中汇总了代表性研究(n＝15)的结果(与NST对照相比)，并且还汇总了三联体组合的四项肿瘤内研究的结果(表19)：
表19：单剂量和多剂量组合mRNA的功效
Figure BDA0003064795710004251
结果表明，单剂量和多剂量肿瘤内治疗方案均有效地抑制肿瘤生长，未观察到多次给药有显著优势。这些结果还指示了双联体组合的功效，在该模型中，mOX40L+mIL-12TM的组合与多剂量的三联体组合同样有效。
总之，这些结果指示，栓系或细胞缔合性细胞因子与共刺激分子(例如，OX40L)的组合在包括播散性癌症和实体瘤在内的癌症中提供抗肿瘤功效。
实施例5：栓系细胞因子mRNA
和免疫检查点抑制剂的组合AML治疗
在该实施例中，使用实施例4中描述的C1498肿瘤模型检查栓系和细胞缔合性细胞因子mRNA构建体与免疫检查点抑制剂的组合治疗的功效。用单独的或与来自BioXCell的抗mCTLA-4抗体、抗mPD-L1抗体或抗mPD-1抗体的治疗组合的LNP包封的三联体mOX40L+hIL-15/IL-15Rα+mIL-12TM mRNA构建体对小鼠进行肿瘤内治疗。检查三联体mRNA的单剂量和多剂量治疗方案。对于多剂量给药，每周一次施用mRNA构建体，持续两周(Q7Dx2)或持续三周(Q7Dx3)。将单独的或与免疫检查点抑制剂组合的NST mRNA构建体用作阴性对照。
在第一系列实验中，小鼠(n＝12)用单剂量的mOX40L+hIL-15/IL-15Rα+mIL-12TM三联体mRNA组合(12.5μg，肿瘤内)与抗mCTLA-4抗体治疗(10mg/kg；每周两次，持续两周，共四个剂量)组合治疗。结果示于表20中。
表20：与抗mCTLA-4抗体组合的功效
Figure BDA0003064795710004261
结果证明，添加抗mCTLA-4免疫检查点抑制剂，提高了单剂量的mOX40L+hIL-15/IL-15Rα+mIL-12TM三联体mRNA构建体的完全应答(CR)率。更具体地，对于单剂量的仅三联体的肿瘤内治疗，观察到50％的CR率(6/12)，而单剂量的三联体与抗mCTLA-4治疗的组合导致75％的CR率(9/12)。
在第二系列实验中，小鼠(n＝15)用单剂量或多剂量(每周一次，持续三周，共三个剂量)的mOX40L+hIL-15/IL-15Rα+mIL-12TM三联体mRNA组合(12.5μg，肿瘤内)与抗mPD-L1抗体治疗(10mg/kg；每周两次，持续两周，共四个剂量)组合治疗。对于单剂量实验，与单独使用三联体mRNA的治疗相比，添加抗mPD-L1治疗未观察到显著CR改善(数据未显示)。多剂量三联体mRNA治疗的结果示于表21中：
表21：mRNA与免疫检查点抑制剂组合的功效
Figure BDA0003064795710004262
Figure BDA0003064795710004271
结果证明，添加抗mPD-L1免疫检查点抑制剂，提高了mOX40L+hIL-15/IL-15Rα+mIL-12TM三联体mRNA构建体的多剂量方案的完全应答(CR)率。更具体地，对于仅三联体的多剂量方案的肿瘤内治疗，观察到40％的CR率(6/15)，而多剂量的三联体与抗mPD-L1治疗的组合导致80％的CR率(12/15)。
在第三系列实验中，小鼠(n＝15)用多剂量(每周一次，持续两周，共两个剂量)的mOX40L+hIL-15/IL-15Rα+mIL-12TM三联体mRNA构建体(12.5μg，肿瘤内)与抗mPD-L1抗体治疗(10mg/kg；每周两次，持续两周，共四个剂量)或抗mPD-1抗体治疗(10mg/kg；每周两次，持续两周，共四个剂量)组合治疗。结果示于表21中，这些结果证明添加抗mPD-L1或抗mPD-1免疫检查点抑制剂，提高了mOX40L+hIL-15/IL-15Rα+mIL-12TM三联体mRNA构建体的完全应答(CR)率。更具体地，对于仅三联体的多剂量方案的肿瘤内治疗，观察到33％的CR率(5/15)，而三联体与抗mPD-L1治疗的组合导致60％的CR率(9/15)，且与抗mPD-1治疗的组合导致93％的CR率(14/15)。
这些实验证实了肿瘤内使用单剂量或多剂量的单独三联体mRNA构建体的抗肿瘤效力，并证明了与免疫检查点抑制剂组合治疗可进一步提高所述疗法的效力。
实施例6：播散性AML模型和mRNA治疗的表征
为了进一步评估上述mRNA构建体的组合在治疗AML中的功效，产生了播散性AML模型以概括人AML疾病的生理特征。AML细胞表达GFP和荧光素酶，由此允许通过对血液中的GFP+细胞进行生物发光成像(BLI)和流式细胞术测量来监测白血病负荷。通过尾静脉注射将这样的AML细胞静脉内植入C57BL/6小鼠中。植入后5天，长骨和脾脏中可见BLI信号，而植入后15天，通过流式细胞术可检测到GFP+细胞(数据未显示)。因此，所述模型通过在疾病进展过程中在各种造血组织中传播得以概括人类疾病。
编码OX40L、mIL-12TM(包含连接至鼠PDGFR跨膜结构域的鼠IL-12的拴系IL-12构建体)和细胞缔合性hIL-15(编码人IL-15和人IL-15Rα的单独mRNA)的mRNA分别为如上所述制备。将mRNA配制在摩尔比为50％可电离氨基脂质(化合物X)、10％磷脂、38.5％胆固醇和1.5％PEG修饰脂质的单独LNP中，其中PEG修饰脂质是化合物428。
给小鼠施用Tris/蔗糖作为对照，或在植入后第9天静脉内施用2mg/kg(总mRNA)的编码mOX40L、mIL-12TM、hIL-15和hIL-15Rα的mRNA。通过向小鼠腹膜内施用荧光素5-10分钟，在90天内通过BLI测量光输出，然后在IVIS体内成像系统(Perkin Elmer)上对小鼠进行成像。图8A显示当施用编码mOX40L、拴系mIL-12和细胞缔合性hIL-15的mRNA时，3/5小鼠没有可测量的AML疾病。当用AML细胞再次攻击这些小鼠时，在第70天3/3小鼠没有可测量的BLI信号(数据未显示)。此外，在再次攻击后的第21天收集血液，通过流式细胞术检测组织样品中AML细胞的天然GFP荧光来检测每微升血液中GFP+细胞的数量，对所述组织样品针对小鼠CD45进行共同染色，随后在BD LSRFortessa流式细胞仪上进行分析。图8B显示，相对于接受Tris/蔗糖的小鼠，接受编码mOX40L、拴系mIL-12和细胞缔合性hIL-15的mRNA的小鼠具有减少的GFP+细胞。
进行了单独的研究以评估基于给药方案的功效变化，因为之前发现，虽然单次给药2mg/kg的mRNA可产生功效，但在此模型中，当以此剂量水平每周重复给药时观察到毒性事件。因此，将小鼠AML细胞植入小鼠体内，并将在植入后7天BLI信号为5x105至5x106光子/秒的小鼠在第9天静脉内给予包封编码mOX40L、拴系mIL-12和细胞缔合性hIL-15的mRNA的LNP，如上所述。小鼠要么每周一次接受2mg/kg的总mRNA，持续三周(Q7Dx3)，要么在三周内接受总计2mg/kg的mRNA(“分次剂量”)，即，0.22mg/kg的mRNA每周三次持续三周(TIWx3)，即，每周0.67mg/kg，或0.67mg/kg每周一次持续三周。表22示出了植入后多达49天的BLI测量值，其中分次低剂量的mRNA诱导的功效优于每周一次大剂量递送的相同剂量，且等效于递送三倍mRNA总量的高剂量组。
表22：组合mRNA的分次剂量的功效
Figure BDA0003064795710004291
另外，如上所述确定相同小鼠的血液中GFP+细胞的数量。图9示出了每微升血液中GFP+细胞的总数(左)和GFP+CD45+细胞的百分比(右)。两种给药方案导致的血液中GFP+细胞水平相似，比接受对照的小鼠低。
还确定了接受各种剂量的小鼠的存活率。除上述给药方案之外，一组小鼠还接受了一次剂量的2mg/kg的mRNA组合。图10提供了结果，显示每周一次接受2mg/kg持续三周或每周三次接受0.22mg/kg持续三周的小鼠有较高存活率。
为了确定编码mOX40L、拴系mIL-12和细胞缔合性hIL-15的mRNA的组合是否提供保护性免疫，通过尾静脉注射用鼠AML细胞再次攻击对组合治疗完全应答的小鼠。保护性免疫对于开发有效的免疫疗法至关重要，因为持久的记忆应答可防止复发。如图11所示，所有经再攻击的完全应答者在再攻击后70天均无白血病。图12和图13分别显示，如通过血液中GFP+细胞的数量测量，所有再攻击的小鼠均存活并且没有疾病负担。
这些结果指示，编码OX40L、拴系IL-12和细胞缔合性IL-15的mRNA的组合提供了保护性免疫，这是癌症免疫疗法的重要特征。重要的是，静脉内施用mRNA时观察到了这种功效。
实施例7：播散性AML模型和分次剂量的mRNA治疗的进一步表征
如实施例6中所述，意外地发现编码mOX40L、拴系mIL-12和细胞缔合性hIL-15的mRNA在播散性AML模型中的功效会基于给药方案而变化。为了进一步评估这一发现，评估了两种不同的LNP配制物中mRNA的生物分布。
具体地，在小鼠中植入鼠AML细胞后15天，给小鼠施用配制在实施例6中所述的LNP(LNP1)或包含50:10:10:28.5:1.5的化合物X/胆固醇/β-谷甾醇/PEG-DMG的LNP(LNP2)中的编码mOX40L的mRNA。含有β-谷甾醇的此类脂质纳米颗粒(LNP)在2019年1月30日提交的PCT申请号PCT/US19/15913中作进一步描述，所述申请的全部内容明确以引用方式并入本文。
以2mg/kg、0.67mg/kg或0.22mk/kg的单剂量施用mRNA，施用后24小时通过流式细胞术分析mOX40L表达。或者，小鼠每周三次持续一周(TIW)接受0.22mg/kg，并在第三次剂量后24小时确定mOX40L表达。
从外周血、脾脏和骨髓中收集细胞用于表达分析。评估单个细胞类型，即GFP+AML细胞、CD3+ T细胞、CD19+ B细胞、CD11b+粒细胞/单核细胞、CD11c+树突状细胞、其他CD11b+CD11c+髓系细胞和Ter119+红系谱系细胞的mOX40L表达。图14提供了以0.22mg/kg TIW施用的两种LNP的结果，这些结果指示，就转染细胞数量或蛋白质产生量而言，分次剂量与大剂量相比没有明显的益处，这在所有测试的剂量方案中都是一致的(数据未显示)。在体内转染AML细胞以及多种正常的造血细胞。树突状细胞是所有评估的造血组织中转染效果最好的细胞类型。
为了进一步评估分次给药的功效，在携带播散性AML细胞的小鼠中评估血清细胞因子水平。小鼠接受2mg/kg大剂量的编码mOX40L、拴系mIL-12和细胞缔合性hIL-15的mRNA，或每周两次持续一周接受0.22mg/kg的所述组合。使用基于Luminex珠粒的多分析物免疫测定法(ThermoFisher Scientific,Waltham,MA)，在54小时内收集血清，并在几个时间点评估小鼠IFNγ、内源性小鼠IL-15/IL-15R和小鼠IP-10的表达。图15提供了结果，这些结果指示所述大剂量在第一剂量后诱导更高的细胞因子水平，这对应于递送的更高的mRNA剂量；然而，在第二次分次剂量后，细胞因子水平在剂量后6小时达到峰值，甚至高于更高大剂量实现的水平。
进行了另一项研究以评估接受编码mOX40L、拴系mIL-12和/或细胞缔合性hIL-15的单种mRNA或mRNA组合的小鼠的血清细胞因子水平。每周三次施用如上所述包封在LNP1或LNP2中的mRNA，并在每次剂量后6和24小时收集血清用于分析小鼠IFNγ和小鼠IL-15/IL-15R。图16提供了结果，这些结果指示无论LNP配制物如何，编码mOX40L、拴系mIL-12和细胞缔合性hIL-15的mRNA的三联体组合以及编码栓系mIL-12和细胞缔合性hIL-15的双链体组合的血清水平均达到峰值。该结果在其他研究中得到了证实(数据未显示)。这三种组分的其他组合也诱导细胞因子，但仅在包括栓系mIL-12和细胞缔合性hIL-15的治疗中观察到血清细胞因子的较高峰值。
在单独的研究中，评估了以相同的剂量在不同的时间长度内施用的编码mOX40L、拴系mIL-12和细胞缔合性hIL-15的mRNA的功效。具体地，小鼠接受0.22mg/kg配制在单独的LNP(LNP1或LNP2)中的编码mOX40L、拴系mIL-12和细胞缔合性hIL-15的mRNA，每周三次持续一周、两周或三周，或者每周两次持续三周。表23显示当给药两或三周时，这些mRNA的组合的功效相似，但是如果仅给药一周则显著较低。将给药时程延长一周以上，可将完全应答率从40％提高到70％-80％。在每周两次或每周三次持续三周的给药之间显示出相似的功效。
表23：不同给药时程下组合mRNA的功效
Figure BDA0003064795710004321
实施例8：mRNA组合治疗在播散性AML模型中的功效的表征
以上实施例中描述了编码mOX40L、拴系mIL-12和细胞缔合性hIL-15的mRNA的组合的增强的抗白血病功效，尤其是分次给药。为了进一步评估这种功效，评估了分次剂量施用的单一疗法和双重疗法。
具体地，如实施例6中所述，将编码mOX40L、细胞缔合性hIL-15和栓系mIL-12的mRNA配制在LNP中，并在植入鼠播散性AML细胞后第9天以单剂或组合的形式施用至小鼠，所述小鼠截至第7天的BLI测量值为5x105至5x106光子/秒。小鼠接受0.22mg/kg mRNA(0.22mpk)，每周三次持续三周(TIWx3)。表24示出了如通过BLI测定的疾病负担。mOX40L和栓系mIL-12作为单剂减轻疾病负担，而细胞缔合性hIL-15相对于对照未减轻疾病负担。将编码mOX40L的mRNA添加到编码拴系mIL-12或细胞缔合性hIL-15的mRNA中可增强抗肿瘤功效，而拴系mIL-12和细胞缔合性hIL-15的组合则提供了最小的功效。值得注意的是，所有mRNA(mOX40L、拴系mIL-12和细胞缔合性hIL-15)的组合最有效。
表24：单一或组合mRNA在播散性AML中的功效
Figure BDA0003064795710004331
另外，评估了接受各种组合的小鼠的体重。具体地，确定了接受以下的小鼠的体重变化百分比：mOX40L+细胞缔合性hIL-15；mOX40L+栓系mIL-12；细胞缔合性hIL-15+栓系mIL-12；或mOX40L+细胞缔合性hIL-15+栓系mIL-12，剂量为0.22mg/kg，每周三次，持续三周。图17A至图17D提供了结果，这些结果显示拴系mIL-12和细胞缔合性hIL-15的双联体组合在第一周引起体重减轻。总之，在接受细胞缔合性hIL-15和栓系mIL-12的小鼠体内，体重减轻、细胞因子的有效诱导和抗白血病应答的缺乏表明，细胞因子的诱导并不足以实现功效，尽管它可能是需要的。该实施例还证明OX40L是抗白血病功效的必要组分。
实施例9：不同的个别mRNA剂量下mRNA组合治疗在播散性AML模型中的功效的表征
在先前的实施例中，以相同的重量(质量)比(1:1:1)组合施用编码OX40L、拴系IL-12和细胞缔合性IL-15的mRNA。当编码细胞缔合性IL-15的mRNA包含编码hIL-15的mRNA和编码hIL-15Rα的mRNA时，所述两种mRNA以1:1的摩尔比配制。为了评估组合中个别组分的化学计量的影响，评估不同的比率。
将播散性鼠AML细胞如实施例6中所述植入小鼠中。在植入后9天向BLI测量值为5x105至5x106光子/秒的小鼠施用指定比率的以下mRNA，总mRNA剂量为0.22mg/kg，每周三次，持续三周：mOX40L:细胞缔合性hIL-15:栓系mIL-12重量(质量)比为1:1:1；mOX40L:细胞缔合性hIL-15重量(质量)比为1:1；mOX40L:栓系mIL-12重量(质量)比为1:1；栓系mIL-12:细胞缔合性hIL-15重量(质量)比为1:1；mOX40L:细胞缔合性hIL-15:栓系mIL-12重量(质量)比为1:1:0.1；mOX40L:细胞缔合性hIL-15:栓系mIL-12重量(质量)比为1:0.1:1；或mOX40L:细胞缔合性hIL-15:栓系mIL-12重量(质量)比为0.1:1:1。表25提供了结果，这些结果指示虽然栓系mIL-12和细胞缔合性hIL-15的组合是无效的且有潜在毒性，包括mOX40L，即使是栓系mIL-12和细胞缔合性hIL-15的十分之一的量，可挽救功效，也缓解体重减轻(数据未显示)。
表25：组合mRNA比率的功效
Figure BDA0003064795710004341
为了进一步评估编码mOX40L、拴系mIL-12和细胞缔合性hIL-15的mRNA组合的给药，施用0.22mg/kg或0.11mg/kg的总mRNA，每周三次，持续两周。表26示出了将剂量减半时三联体组合的相似抗肿瘤功效。但是，当以更低的剂量(即，0.11mg/kg)施用mOX40L与拴系mIL-12或细胞缔合性hIL-15的双联体组合时，抗肿瘤功效几乎丧失。具体地，完全应答率从60％-80％降低至20％。因此，在该模型中，三联体组合显示出优于任何相应双联体组合的功效。
表26：组合mRNA剂量的功效
Figure BDA0003064795710004351
实施例10：mRNA和免疫检查点抑制剂对播散性AML的组合治疗
在该实施例中，使用实施例6中描述的播散性鼠AML模型检查栓系和细胞缔合性细胞因子mRNA构建体与免疫检查点抑制剂的组合治疗的功效。
具体地，将抗mPD-L1或抗mCTLA-4抗体(BioXCell)每周两次持续两周(BIWx2)以10mg/kg的剂量施用至小鼠，每周三次持续两周(TIWx2)以0.11mg/kg的剂量施用至接受编码mOX40L、栓系mIL-12和细胞缔合性hIL-15的小鼠。如实施例6中所述制备和配制mRNA。表27提供了结果，这些结果显示抗mCTLA-4抗体的抗肿瘤功效略微增加。
表27：mRNA与免疫检查点抑制剂组合的功效
Figure BDA0003064795710004352
Figure BDA0003064795710004361
在单独的研究中，评估了将免疫检查点抑制剂添加到mOX40L与拴系mIL-12或细胞缔合性hIL-15的组合中的效果。具体地，每周三次持续2周接受0.11mg/kg总mRNA(编码mOX40L和栓系mIL-12或细胞缔合性hIL-15的mRNA)的小鼠每周两次持续两周(BIWx2)接受抗mPD-L1或抗mCTLA-4抗体。表27提供了结果，这些结果显示，当将双联体组合与免疫检查点抑制剂组合时功效显著提高。
总之，这些结果指示向本文所述的mRNA组合中添加免疫检查点抑制剂可增强针对AML的抗肿瘤功效。
实施例11：拴系和细胞缔合性细胞因子mRNA在检查点疗法抗性实体瘤中的功效
为了确定栓系和细胞缔合性细胞因子mRNA与共刺激mRNA的组合是否在实体瘤中诱导抗肿瘤功效，使用MC38-R同系结肠腺癌模型。与具有较少免疫抑制性且对免疫检查点抑制剂治疗部分敏感的MC38-S模型相比，MC38-R模型具有免疫抑制性且对免疫检查点抑制剂治疗具有抵抗力。在C57BL/6小鼠中皮下建立MC38-R肿瘤。将如上所述的编码mOX40L、拴系mIL-12和/或细胞缔合性hIL-15的mRNA配制在包含化合物X的单独LNP中，并以10μg总mRNA的单剂量肿瘤内施用至已建立的肿瘤。表28提供了结果，这些结果指示与mOX40L+栓系mIL-12、mOX40L+细胞缔合性hIL-15和栓系mIL-12+细胞缔合性hIL-15的双联体组合相比，编码mOX40L、栓系mIL-12和细胞缔合性hIL-15的mRNA的三联体组合在减小肿瘤体积方面更有效。
表28：组合mRNA在检查点疗法抗性模型中的功效
Figure BDA0003064795710004362
Figure BDA0003064795710004371
值得注意的是，三联体组合与双联体组合相比增强的功效与在C1498模型中观察到的功效形成对比(参见表19)。虽然在两个模型中均有效，但在此实验中，三联体比mOX40L和拴系mIL-12的双联体显著更有效。
接下来，评估了在MC38-R模型中多次给药mRNA组合的功效。具体地，以10μg总mRNA的剂量每周一次持续3周(Q7Dx3)肿瘤内施用包含化合物X和包封的编码mOX40L、拴系mIL-12和/或细胞缔合性hIL-15的mRNA的LNP。表28提供了结果，这些结果指示多剂量的mOX40L、拴系mIL-12和细胞缔合性hIL-15的三联体组合比单剂量更有效。此外，多次给药增强了拴系mIL-12和细胞缔合性hIL-15的双联体组合的功效。值得注意的是，三联体组合的抗肿瘤功效仍然比双联体组合更有效。
为了进一步评估三联体组合在实体瘤中的功效，评估与检查点抑制剂的组合。具体地，将单剂量(即，10μg总mRNA)的包含化合物X和包封的编码mOX40L、拴系mIL-12和细胞缔合性hIL-15的mRNA的LNP与抗mCTLA-4抗体(BioXcell)组合施用至患有MC38-R肿瘤的小鼠。图18A至图18B显示当与抗mCLTA-4抗体一起施用时，三联体组合的功效增强。
为了确定LNP配制物是否赋予三联体组合的功效，将包含化合物X的LNP与包含化合物428和化合物X的LNP进行比较。将编码mOX40L、栓系mIL-12和细胞缔合性hIL-15的mRNA配制在单独LNP中并以10μg总mRNA的单剂量或多剂量(即，每周一次，连续三周)施用至患有MC38-R肿瘤的小鼠。表29显示单剂量的两种LNP配制物之间的抗肿瘤功效相当，而多剂量的包含化合物X且有无化合物428的两种LNP的功效都提高。
表29：不同LNP配制物中的mRNA组合的功效
Figure BDA0003064795710004381
总之，这些结果指示，编码mOX40L、拴系mIL-12和细胞缔合性hIL-15的mRNA的组合在单一或多次给药方案下对实体瘤有效。
实施例12：栓系和细胞缔合性细胞因子mRNA在实体肿瘤中的远位效应
为了进一步评估编码mOX40L、拴系mIL-12和细胞缔合性hIL-15的mRNA组合在实体瘤中的抗肿瘤功效，评估该组合的远位效应。具体地，测试了未治疗的肿瘤是否将从在治疗的肿瘤中看到的抗肿瘤效应中受益。
在一项研究中，利用了CT26同系结肠癌模型。CT26是研究最广泛的同系小鼠肿瘤模型之一，用于筛选和评估癌症免疫疗法中使用的小分子细胞毒性剂和生物应答修饰剂。将CT26肿瘤细胞注入BALB/c小鼠的每个腹侧，以建立皮下肿瘤。为了分析mRNA的三联体组合的远位效应，仅在一个肿瘤中施用配制在包含化合物X的单独LNP中的编码mOX40L、拴系mIL-12和细胞缔合性hIL-15的mRNA(“治疗的”)。mRNA以单剂量或多剂量(一周一次，持续三周，“Q7Dx3”)的5μg总mRNA施用，mOX40L:栓系mIL-12:细胞缔合性hIL-15的重量(质量)比为1:1:1。表30显示无论给药时程如何，治疗和未治疗的肿瘤均对mRNA的三联体组合有应答。
表30：mRNA组合的远位效应
Figure BDA0003064795710004391
在第二项研究中，将A20小鼠B细胞淋巴瘤细胞(A20，ATCC号TIB-208；ATCC,Manassas,VA)注射到BALB/c小鼠中，以产生皮下肿瘤。在小鼠的两个腹侧建立肿瘤以评估其远位效应。将编码mOX40L、拴系mIL-12和细胞缔合性hIL-15的mRNA配制在包含化合物X的单独LNP中，并施用至其中一个肿瘤(“治疗的”)。mRNA以单剂量或多剂量(即，每周一次，持续两周)的5μg总mRNA肿瘤内施用，mOX40L:栓系mIL-12:细胞缔合性hIL-15的重量(质量)比为1:1:1。表30显示无论给药时程如何，治疗和未治疗的肿瘤均对mRNA的三联体组合有应答。
实施例13：通过在接种AML细胞的小鼠中施用栓系和细胞缔合性细胞因子mRNA来进行免疫激活
在该实施例中，如以上实施例6中所述，在接种GFP+AML细胞的小鼠中研究了用编码mOX40L、拴系mIL-12和细胞缔合性hIL-15的mRNA的组合治疗后的免疫激活。如BLI信号增加所测量，未治疗的AML细胞在各种造血组织中增殖。在AML植入后第12天，将荷瘤小鼠用包封在脂质纳米颗粒中的1:1:1重量(质量)比的mOX40L、栓系mIL-12和细胞缔合性hIL-15mRNA的组合治疗，以0.22mg/kg/剂量的剂量静脉内施用，每周三次(两次剂量之间间隔至少48小时)，持续两周(TIWx2)。配制脂质纳米颗粒，所述脂质纳米颗粒包含：50％可电离氨基脂质(化合物X)、10％磷脂、38.5％胆固醇和1.5％PEG修饰脂质，其中PEG修饰脂质是化合物428。作为对照，以相同的剂量水平和时程向以相似方式接种的小鼠施用包封在相同脂质纳米颗粒配制物中的对照mRNA(NST)。
为了评估该组合治疗如何影响免疫细胞群，在24小时(第1次剂量后24小时)、第6天(第3次剂量后24小时)和第13天(第6次剂量后24小时)收集组织(脾脏、骨髓和淋巴结)和外周血，并通过流式细胞术进行分析。使用以下门控策略从活CD45+细胞中鉴定出免疫细胞群：
NK细胞：CD3-CD49b+；
NKT细胞：CD3+CD49b+；
CD4+ T细胞：CD3+CD49b-CD8-CD4+Foxp3-；
CD8+ T细胞：CD3+CD49b-CD8+CD4-；
CD8+cDC1：CD11c+MHC II+B220-CD8+；
CD103+cDC1：CD11c+MHC II+B220-CD103+；
cDC2：CD11c+，MHC II+B220-Ly6C-CD24+；
iDC：CD11c+，MHC II+B220-CD11b+Ly6C+。
早在第1次剂量后24小时，相对于给予对照mRNA的小鼠血液，施用编码mOX40L、拴系mIL-12和细胞缔合性hIL-15的mRNA的组合的小鼠的外周血NK细胞总数增加。然而，在第6次剂量后24小时(即，第13天)，外周血和免疫组织(脾脏、骨髓和淋巴结)中的NK细胞数量均下降，表明NK细胞水平已恢复到基线(数据未显示)。分析NK细胞占活CD45+细胞的百分比时，观察到相同的结果。(图19A至图19D)。使用标志物Ki-67对NK细胞增殖进行进一步研究表，显示早在第一次剂量后24小时NK细胞在外周血、脾脏、骨髓中的增殖增加，在腹股沟淋巴结中的增殖程度较小(数据未显示)。还使用CD25(IL-2Rα)(数据未显示)和CD69(图20A至图20D)标志物评估NK细胞激活。结果显示，编码mOX40L、拴系mIL-12和细胞缔合性hIL-15的mRNA的组合在治疗的小鼠的多个造血组织中诱导NK细胞的激活、增殖和扩增。
还研究了NKT细胞应答的动力学。具体地，分析了总NKT细胞数(数据未显示)和NKT细胞占CD45+细胞的百分比(图21A至图21D)，并且观察到NKT细胞扩增。对Ki-67表达的评估表明，NKT细胞增殖也增加(数据未显示)。相对于对照小鼠(数据未显示)，经三联体治疗的小鼠中的激活标志物CD25(数据未显示)和CD69(图22A至图22D)的表达也增加。
用编码mOX40L、拴系mIL-12和细胞缔合性hIL-15的mRNA的组合进行治疗还诱导CD8+ T细胞的扩增，如通过第6天(第3次剂量后24小时)和持续至第13天(第6次剂量后24小时)的绝对数或占活CD45+细胞的百分比(图23A至图23D)所测量的。到第6天CD8+ T细胞增殖(Ki-67表达)也增加，并在研究的13天中保持升高(数据未显示)。相似地，到第6天激活标志物CD25(数据未显示)和CD69(图24A至图24D)也被上调，并持续增加直至第13天。
用编码mOX40L、拴系mIL-12和细胞缔合性hIL-15的mRNA的组合进行治疗还导致CD4+ T细胞的扩增，如以绝对数或占活CD45+细胞的百分比(图25A至图25D)，CD4+ T细胞增殖增加(数据未显示)和CD4+ T细胞激活标志物上调(图26A至图26D)所测量的。
树突状细胞群(CD8+cDC1，CD103+cDC1，cDC2和iDC)的细胞数量和占活CD45+细胞的百分比也增加，如分别在脾脏(图27A至图27D)以及淋巴结(图28A至图28D)中测量的。DC群体还显示出CD86成熟标志物的表达的早期增加，到第13天逐渐减少回到基线水平(图29A至图29D，图30A至图30D)。这项研究表明，编码mOX40L、拴系mIL-12和细胞缔合性hIL-15的mRNA的组合具有免疫刺激作用，导致先天性和适应性免疫细胞(CD4+ T细胞、CD8+T细胞、NK细胞、NKT细胞、CD8+cDC1、CD103+cDC1、cDC2和iDC)的数量以及增殖、激活和成熟标志物的表达增加。
实施例14：拴系和细胞缔合性细胞因子mRNA在Batf3 KO小鼠的播散性AML治疗中的功效
对Batf3基因敲除(KO)小鼠评估编码OX40L、拴系IL-12和细胞缔合性IL-15的mRNA的功效，以评估树突状细胞在介导抗白血病应答中的作用。Batf3 KO小鼠缺乏Batf3(碱性亮氨酸拉链转录因子，ATF样)基因的外显子1-2。Batf3在CD11c+CD8α+传统树突状细胞(cDC)中高度表达，所述细胞在抗原交叉呈递中发挥作用。Batf3 KO小鼠缺乏CD8α+树突状细胞，在TLR-3诱导的IL-12产生方面存在缺陷，并且在肺、肠、肠系膜淋巴结(MLN)、真皮和皮肤引流淋巴结中也缺乏CD103+CD11b-DC。Batf3 KO小鼠在CD8+ T细胞启动方面存在缺陷，并且不能排斥高度免疫原性的同系肿瘤。(Hildner K等人,Science 322(5904):1097-1100(2008))。
在这项研究中，根据研究设计，将编码mOX40L、拴系mIL-12和细胞缔合性hIL-15的mRNA静脉内施用至C57BL/6或Batf3 KO小鼠，如表31所汇总：
表31：编码mOX40L、拴系mIL-12和细胞缔合性hIL-15的mRNA的功效
Figure BDA0003064795710004421
Figure BDA0003064795710004431
如以上实施例6中所述，在第0天给小鼠接种表达GFP的AML细胞。一旦建立了AML细胞，就如实施例13中所述静脉内施用包封在LNP中的mRNA，每周三次，持续两周(TIWx2)。每周两次对小鼠进行成像以监测疾病负担。AML细胞在未治疗的和经对照mRNA(NST)治疗的小鼠中继续扩增。在C57BL/6和Batf3 KO小鼠中，施用包封编码mOX40L、拴系mIL-12和细胞缔合性hIL-15的mRNA的LNP都减轻AML疾病负担(例如，降低BLI信号)。表31指出了C57BL/6(CR＝7)和Batf3 KO(CR＝6)组中的完全应答者。
这些结果表明，尽管施用编码OX40L、拴系IL-12和细胞缔合性IL-15的mRNA导致各种交叉呈递的DC的扩增和激活(参见例如，实施例13)，但该mRNA组合影响抗肿瘤应答的能力并不取决于具有功能性交叉呈递DC群，如C57BL/6和Batf3 KO小鼠治疗后100天AML疾病负担抑制和存活率提高(图31)所示。
实施例15：在播散性AML的治疗中，IFNγ中和或T细胞耗竭使拴系和细胞缔合性细胞因子mRNA的抗肿瘤功效消除
如以上实施例中所述，在鼠AML研究中进一步评估了T细胞在介导编码mOX40L、拴系mIL-12和细胞缔合性hIL-15的mRNA的组合的功效中的作用。简而言之，给C57BL/6小鼠静脉内尾静脉注射1x106个MLL-AF9细胞(第0天)。在AML植入后第9天，用mOX40L、拴系mIL-12和细胞缔合性hIL-15mRNA的组合治疗荷瘤小鼠(n＝15)，所述mRNA以1:1:1重量(质量)比包封在脂质纳米颗粒中，并以0.11mg/kg/剂量的剂量每周三次持续两周(TIWx2)静脉内施用。作为对照，以相同的剂量和相同的时程向以相似方式接种的小鼠施用包封在脂质纳米颗粒中的对照mRNA(NST)。在开始mRNA施用前一天开始，对小鼠进行四次腹膜内注射CD8+耗尽抗体(2.43，BP0061，BioXCell)或大鼠IgG2b同种型对照(LTF-2，BP0090，BioXCell)，如表32汇总：
表32：CD8+耗尽小鼠中的mOX40L+mIL-12TM+hIL-15/IL-15RαmRNA
Figure BDA0003064795710004441
a在第9、11、14、16、18和21天静脉内施用mRNA
b在第8、9、10和14天腹膜内施用抗体
抗CD8抗体的施用导致早在植入后11天(第1次mRNA剂量后2天)发生CD8+ T细胞耗尽，并持续直至第22天(数据未显示)。CD8+ T细胞的耗尽导致编码OX40L、拴系IL-12和细胞缔合性IL-15的mRNA的组合的治疗功效消除(表32)。与同种型抗体一起施用mRNA组合可成功减轻AML疾病负担，直至植入后60天达到10个完全应答者。相比之下，用mRNA组合治疗的CD8+ T细胞耗尽的小鼠无法控制AML疾病负担，如应答者数量显著减少(CR＝1)所证明。对AML进展的抑制是特定于mRNA组合的，因为接受对照mRNA的小鼠无法控制AML进展，无论是否接受同种型对照或抗CD8抗体。结果证明，mOX40L+hIL-15/IL-15Rα+mIL-12TM在控制AML中的功效取决于CD8+ T细胞功能。
在另一个实验中，使用抗CD4抗体(GK1.5，BP0003-1，BioXCell)研究CD4+ T细胞在介导mOX40L+hIL-15/IL-15Rα+mIL-12TM针对AML的功效中的作用，以耗尽接种GFP+AML细胞并用包封在LNP中的mOX40L+hIL-15/IL-15Rα+mIL-12TM mRNA治疗的小鼠中的CD4+ T细胞。研究设计汇总于表33中：
表33：mOX40L+hIL-15/IL-15Rα+mIL-12TM在CD4+耗尽小鼠中的功效
Figure BDA0003064795710004451
a在第9、11、14、16、18和21天静脉内施用mRNA
b在第8、9、10和14天腹膜内施用抗体
抗CD4抗体的施用导致早在植入后11天(第1次mRNA剂量后2天)发生CD4+ T细胞耗尽，并持续直至第22天(数据未显示)。CD4+ T细胞的耗尽导致编码mOX40L、拴系mIL-12和细胞缔合性hIL-15的mRNA的组合的治疗功效消除(表33)。在未给予抗体(CR＝8)或同种型抗体(CR＝4)的小鼠中，施用mRNA组合成功减轻了AML疾病负担。相比之下，用mRNA组合治疗的CD4+ T细胞耗尽的小鼠无法控制AML疾病负担。对AML进展的抑制是特定于三联体治疗的，因为接受对照mRNA的小鼠无法控制AML进展，无论是否接受同种型对照或抗CD4抗体。直至植入后30天动物的存活曲线示于图32中。施用mOX40L+hIL-15/IL-15Rα+mIL-12TM的荷瘤小鼠大多数(11/15)存活直至植入后30天。相比之下，用mRNA组合治疗的CD4+ T细胞耗尽的小鼠没有一个存活超过植入后第22天。结果证明，mOX40L+hIL-15/IL-15Rα+mIL-12TM在控制AML中的功效也是CD4+ T细胞依赖性的。
进行了另一个实验以确定IFNγ在介导该mRNA组合的抗白血病活性中的作用。给接种AML的小鼠(n＝15)腹膜内施用IFNγ中和抗体(XMG1.2，BioXCell)，同时施用mOX40L+hIL-15/IL-15Rα+mIL-12TM mRNA或对照mRNA(NST)。研究设计汇总于表34中：
表34：mOX40L+hIL-15/IL-15Rα+mIL-12TM在经抗IFNγ治疗的小鼠中的功效
Figure BDA0003064795710004461
a在抗体施用后第9、12、14、16、19和21天静脉内施用mRNA
b在mRNA施用前9、12、14、16、19和21天腹膜内施用抗体
如通过BLI测量，AML疾病负担显示，给予小鼠抗IFNγ抗体后，mOX40L+hIL-15/IL-15Rα+mIL-12TM的抗白血病功效严重减弱(表34)。直至植入后60天，在未给予抗体(CR＝5)或给予同种型对照抗体(CR＝5)的小鼠中，施用hIL-15/IL-15Rα+mIL-12TM成功减轻了AML疾病负担。相比之下，经抗IFNγ抗体治疗的小鼠无法控制AML疾病负担，即使用mOX40L+hIL-15/IL-15Rα+mIL-12TM治疗。对AML进展的抑制是mOX40L+hIL-15/IL-15Rα+mIL-12TM特定的，因为接受对照mRNA的小鼠无法控制AML进展，无论是否接受同种型对照或抗IFNγ抗体。直至植入后50天动物的存活曲线示于图33中。到植入后第22天，用mOX40L+hIL-15/IL-15Rα+mIL-12TM和抗IFNγ抗体治疗的所有小鼠均死于疾病，而用mOX40L+hIL-15/IL-15Rα+mIL-12TM治疗的所有其他小鼠在同一时间点的存活率为约70％，至植入后50天存活率为约25％。
进一步研究了IFNγ中和的下游效应，结果示于图34A至图34B、图35A至图35B、图36A至图36B和图37A至图37B中。结果显示，mOX40L+hIL-15/IL-15Rα+mIL-12TM治疗导致由IFNγ信号传导诱导的标志物上调：单核细胞上的MHC II(图34A至图34B)和髓系细胞上的检查点蛋白PD-L1(图35A至图35B)，包括粒细胞(图36A至图36B)和单核细胞(图37A至图37B)。施用抗IFNγ抗体后，对应细胞群中的MHC II和PD-L1降低至基线水平，表明IFNγ信号传导被完全阻断。结果证明，IFNγ在介导mOX40L+hIL-15/IL-15Rα+mIL-12TM mRNA组合的抗白血病功效中起重要作用。
实施例16：非人灵长类动物中栓系和细胞缔合性细胞因子mRNA的施用
向非人灵长类动物(NHP)施用编码人OX40L、拴系人IL-12和细胞缔合性人IL-15的mRNA的组合，以进一步评估该组合的免疫刺激效应。该研究评估了不同的施用途径–皮下(SC)或静脉内(IV)–和施用时程，如表35所汇总：
表35：NHP中的hIL-12TM+hOX40L+hIL-15/15Rα
Figure BDA0003064795710004471
Conc.＝浓度；IVinf.＝静脉内输注；SC＝皮下注射
剂量水平指示以1:1:1重量(质量)比施用的mRNA总量，如实施例13中所述配制在LNP中的hIL-12TM+hOX40L+hIL-15/IL-15Rα各自为例如0.033、0.1或0.3mg/kg/剂量，该组合的总mRNA剂量为0.1、0.3或1.0mg/kg/剂量。在剂量前(第0天)和剂量后各个时间点收集血清，以测量各灵长类动物中IFNγ和IP-10(CXCL10)细胞因子表达的诱导。使用可商购获得的灵长类动物IFNγELISA试剂盒(DY961，R&D)和Cyno CXCL10 ELISA试剂盒(DIY1266Y-003，Kingfisher Biotech)按照制造商的说明以1:10、1:30、1:90和1:270的稀释度对收集的血清进行测试。
如图38A至图38F所示，mRNA组合的施用导致在每次施用后以剂量依赖性方式诱导IFNγ(图38A至图38C)和IP-10(CXCL10)(图38D至图38F)，与施用途径无关。研究表明，hIL-12TM+hOX40L+hIL-15/IL-15RαmRNA在NHP中具有生物活性，并以剂量依赖性方式诱导与免疫激活相关的下游细胞因子。
还从第1组(对照组)和第2组(0.1mg/kg/剂量)的食蟹猴中收集组织(最终剂量后24小时收集的脾脏部分和整个股骨)，以进一步评估hIL-12TM+hOX40L+hIL-15/IL-15Rα对免疫系统的局部和全身效应。使用以下门控策略从活CD45+中鉴定出免疫细胞群：
NK细胞：CD3-CD7+CD16+；
NKT细胞：CD3+CD16+；
CD4+ T细胞：CD3+CD16-CD8-CD4+；
CD8+ T细胞：CD3+CD16-CD8+CD4-。
相对于经对照物品治疗的食蟹猴中相同细胞群的数量，施用hIL-12TM+hOX40L+hIL-15/IL-15Rα组合导致食蟹猴的脾脏和骨髓中NK、NKT和CD8+ T细胞的扩增(图39A至图39C)。尽管与在脾脏样品中观察到的相同细胞群的增加相比，骨髓免疫细胞(例如，NK、CD8+T和NKT细胞)的数量增加并不那么显著，但是对骨髓免疫细胞群的进一步分析指示，如通过CD69表达增加所测量的，与施用对照物品的动物中的骨髓细胞相比，这些免疫细胞的更大群体被激活(图40A至图40D)。
其他实施方案
应当理解，虽然描述了本公开连同其详细描述，但是前述描述旨在说明而不限制本公开的范围，本发明的范围由所附权利要求书的范围限定。其他方面、优点和改变均在权利要求书的范围之内。
本文所述的所有参考文献均以引用方式整体并入。
序列表概述
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Claims (106)

1.一种治疗人患者的癌症的方法，所述方法包括向所述患者施用：
(i)编码人OX40L的第一mRNA；和
(ii)编码免疫增强剂的至少一种第二mRNA，其中所述免疫增强剂是激活T细胞、NK细胞或T细胞和NK细胞两者的细胞缔合性细胞因子，
其中所述第一mRNA和所述至少一种第二mRNA被包封在相同或不同的脂质纳米颗粒中。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述癌症是播散性癌症，并且其中所述第一mRNA和所述至少一种第二mRNA以全身方式施用。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述播散性癌症是血液学癌症。
4.如权利要求2所述的方法，其中所述播散性癌症是髓系恶性肿瘤。
5.如权利要求4所述的方法，其中所述髓系恶性肿瘤选自由以下组成的组：骨髓增生异常综合征(MDS)、骨髓增生性疾病(MPD)和急性髓系白血病(AML)。
6.如权利要求1所述的方法，其中所述癌症是实体瘤，并且其中所述第一mRNA和所述至少一种第二mRNA以肿瘤内方式施用。
7.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述至少一种第二mRNA是：
(i)编码反式呈递的人IL-15的mRNA；
(ii)编码可操作地连接至包含跨膜结构域的膜结构域的人IL-12多肽的mRNA；或
(iii)编码反式呈递的人IL-15的mRNA和编码可操作地连接至膜结构域的人IL-12多肽的mRNA。
8.如权利要求7所述的方法，其中所述反式呈递的人IL-15：(i)是可操作地连接至人IL-15Rα多肽的人IL-15多肽；或(ii)由编码人IL-15多肽的第一mRNA和编码人IL-15Rα多肽的第二mRNA编码。
9.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述OX40L多肽包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。
10.如权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述OX40L多肽由包含SEQ ID NO:11所示核苷酸序列的核苷酸序列或与SEQ ID NO:11所示核苷酸序列具有至少80％同一性的核苷酸序列编码。
11.如权利要求7-10中任一项所述的方法，其中所述IL-12多肽包含任选地经由肽接头可操作地连接至IL-12p35亚基(IL-12A)多肽的IL-12p40亚基(IL-12B)多肽。
12.如权利要求11所述的方法，其中所述IL-12B多肽位于所述IL-12A多肽的5’末端或所述肽接头的5’末端；或者其中所述IL-12A多肽位于所述IL-12B多肽的5’末端或所述肽接头的5’末端。
13.如权利要求7-12中任一项所述的方法，其中：(i)所述IL-12多肽跨膜结构域包含源自I型整合膜蛋白的跨膜结构域；或(ii)所述IL-12多肽跨膜结构域选自由以下组成的组：分化簇8(CD8)跨膜结构域、血小板源性生长因子受体(PDGFR)跨膜结构域和分化簇80(CD80)跨膜结构域。
14.如权利要求13所述的方法，所述PDGFR-β跨膜结构域包含SEQ ID NO:42所示的氨基酸序列；所述CD8跨膜结构域包含SEQ ID NO:41所示的氨基酸序列；并且所述CD80跨膜结构域包含SEQ ID NO:43所示的氨基酸序列。
15.如权利要求7-14中任一项所述的方法，其中所述IL-12多肽膜结构域包含细胞内结构域，其中(i)所述细胞内结构域与所述跨膜结构域源自相同的多肽，或者其中所述细胞内结构域与所述跨膜结构域源自不同的多肽；或(ii)所述细胞内结构域选自由以下组成的组：PDGFR细胞内结构域、截短的PDGFR细胞内结构域，和CD80细胞内结构域。
16.如权利要求15所述的方法，其中所述细胞内结构域是：(i)PDGFR细胞内结构域，所述PDGFR细胞内结构域包含含有SEQ ID NO:48所示氨基酸序列的PDGFR-β细胞内结构域；(ii)是截短的PDGFR细胞内结构域，所述截短的PDGFR细胞内结构域包含在E570或G739处截短的PDGFR-β细胞内结构域；或(iii)是CD80细胞内结构域，所述CD80细胞内结构域包含SEQID NO:47所示的氨基酸序列。
17.如权利要求16所述的方法，其中所述在E570处截短的截短PDGFR-β细胞内结构域包含SEQ ID NO:49所示的氨基酸序列，并且其中所述在G739处截短的截短PDGFR-β跨膜结构域包含SEQ ID NO:50所示的氨基酸序列。
18.如权利要求7-17中任一项所述的方法，其中所述IL-12多肽膜结构域包含：
(i)PDGFR-β跨膜结构域和PDGFR-β细胞内结构域；
(ii)PDGFR-β跨膜结构域和在E570处截短的截短PDGFR-β细胞内结构域；
(iii)PDGFR-β跨膜结构域和在G739处截短的截短PDGFR-β细胞内结构域；或
(iv)CD80跨膜结构域和CD80细胞内结构域。
19.如权利要求7-18中任一项所述的方法，其中所述IL-12多肽膜结构域通过肽接头可操作地连接至所述IL-12A多肽，或者其中所述IL-12多肽膜结构域通过肽接头可操作地连接至所述IL-12B多肽。
20.如权利要求7-19中任一项所述的方法，其中所述IL-15Rα多肽包含sushi结构域。
21.如权利要求20所述的方法，其中所述IL-15Rα多肽还包含细胞内结构域和跨膜结构域，并且其中所述细胞内结构域和所述跨膜结构域源自IL-15Rα或异源多肽。
22.如权利要求7-21中任一项所述的方法，其中所述IL-15多肽包含SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列，并且其中所述IL-15Rα多肽包含SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。
23.如权利要求22所述的方法，其中所述IL-15多肽由包含SEQ ID NO:122所示核苷酸序列的核苷酸序列或与SEQ ID NO:122所示核苷酸序列具有至少80％同一性的核苷酸序列编码，并且其中所述IL-15Rα多肽由包含SEQ ID NO:22所示核苷酸序列的核苷酸序列或与SEQ ID NO:22所示核苷酸序列具有至少80％同一性的核苷酸序列编码。
24.如权利要求6-23中任一项所述的方法，其中所述实体瘤包含免疫抑制性肿瘤微环境，或者其中所述实体瘤对免疫检查点抑制剂疗法无应答。
25.如权利要求1-24中任一项所述的方法，所述方法包括：
(i)第一分次剂量的包含所述第一mRNA和所述至少一种第二mRNA的药物组合物，和
(ii)至少一个第二分次剂量的所述药物组合物，其中相对于相同给药间隔期间相同量的mRNA的单个剂量，所述第一分次剂量和所述第二分次剂量增加了所述患者中对所述mRNA编码的多肽的暴露，从而治疗所述患者的所述播散性癌症。
26.如权利要求25所述的方法，其中所述第一分次剂量和所述第二分次剂量：(i)相对于相同量的mRNA的单个剂量，增强所述治疗的抗肿瘤功效；(ii)增强抗肿瘤功效，并且具有降低的毒性和更好的耐受性；或(i)和(ii)。
27.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中每种mRNA包含3’非翻译区(UTR)。
28.如权利要求27所述的方法，其中所述3’UTR包含至少一个微RNA(miR)结合位点，其中所述至少一个miR结合位点是miR-122结合位点，并且其中所述miR-122结合位点是miR-122-3p或miR-122-5p结合位点。
29.如权利要求28所述的方法，其中所述miR-122-5p结合位点包含SEQ ID NO:83所示的核苷酸序列，并且其中所述miR-122-3p结合位点包含SEQ ID NO:74所示的核苷酸序列。
30.如权利要求1-26中任一项所述的方法，其中每种mRNA包含3’UTR，所述3’UTR包含SEQ ID NO:77或SEQ ID NO:121所示的核苷酸序列。
31.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中每种mRNA包含5’非翻译区(UTR)。
32.如权利要求31所述的方法，其中所述5’UTR包含SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:133所示的核苷酸序列。
33.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中每种mRNA包括至少一种化学修饰。
34.如权利要求33所述的方法，其中所述化学修饰选自由以下组成的组：假尿苷、N1-甲基假尿苷、2-硫代尿苷、4’-硫代尿苷、5-甲基胞嘧啶、2-硫代-1-甲基-1-脱氮-假尿苷、2-硫代-1-甲基-假尿苷、2-硫代-5-氮杂-尿苷、2-硫代-二氢假尿苷、2-硫代-二氢尿苷、2-硫代-假尿苷、4-甲氧基-2-硫代-假尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-硫代-1-甲基-假尿苷、4-硫代-假尿苷、5-氮杂-尿苷、二氢假尿苷、5-甲基尿苷、5-甲基尿苷、5-甲氧基尿苷和2’-O-甲基尿苷。
35.如权利要求1-32中任一项所述的方法，其中(i)每种mRNA中至少95％的尿苷是N1-甲基假尿苷；(ii)每种mRNA中至少99％的尿苷是N1-甲基假尿苷；或(iii)每种mRNA中100％的尿苷是N1-甲基假尿苷。
36.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述脂质纳米颗粒包含摩尔比为约20％-60％:5％-25％:25％-55％:0.5％-15％的可电离氨基脂质:磷脂:结构脂质:PEG修饰脂质。
37.如权利要求1-35中任一项所述的方法，其中所述脂质纳米颗粒包含摩尔比为约50％:约10％:约38.5％:约1.5％的可电离脂质:磷脂:甾醇:PEG修饰脂质。
38.如权利要求1-35中任一项所述的方法，其中所述脂质纳米颗粒包含摩尔比为50:38.5:10:1.5的可电离脂质:胆固醇:DSPC:PEG修饰脂质。
39.如权利要求36-38中任一项所述的方法，其中所述可电离脂质选自由以下组成的组：例如，2,2-二亚油基-4-二甲基氨基乙基-[1,3]-二氧戊环(DLin-KC2-DMA)、4-二甲基氨基丁酸二亚油基-甲酯(DLin-MC3-DMA)和9-((4-(二甲基氨基)丁酰基)氧基)十七烷二酸二((Z)-壬-2-烯-1-基)酯(L319)。
40.如权利要求36-39中任一项所述的方法，其中所述可电离脂质包括化合物X。
41.如权利要求1-35中任一项所述的方法，其中所述脂质纳米颗粒包含摩尔比为约20％-60％:5％-25％:25％-55％:0.5％-15％的化合物X:磷脂:胆固醇:PEG修饰脂质。
42.如权利要求41所述的方法，其中所述脂质纳米颗粒包含摩尔比为约50％:约10％:约38.5％:约1.5％的化合物X:磷脂:胆固醇:PEG修饰脂质。
43.如权利要求36-42中任一项所述的方法，其中所述PEG修饰脂质是PEG-DMG或化合物P-428。
44.如权利要求36-43中任一项所述的方法，其中所述脂质纳米颗粒包含植物甾醇或植物甾醇与胆固醇的组合。
45.如权利要求44所述的方法，其中所述植物甾醇选自由以下组成的组：β-谷甾醇、豆甾醇、β-谷甾烷醇、菜油甾醇、菜子甾醇以及它们的组合。
46.如权利要求44所述的方法，其中所述植物甾醇包括(i)谷甾醇或其盐或酯，或(ii)豆甾醇或其盐或酯。
47.如权利要求44所述的方法，其中所述植物甾醇是β-谷甾醇
Figure FDA0003064795700000081
或其盐或酯。
48.如权利要求1-35中任一项所述的方法，其中所述脂质纳米颗粒包含(i)摩尔比为50:38.5:10:1.5的化合物X:胆固醇:磷脂:化合物P-428，或化合物X:胆固醇:DSPC:化合物P-428；或(ii)摩尔比为40:38.5:20:1.5的化合物X:胆固醇:磷脂:化合物P-428，或化合物X:胆固醇:DSPC:化合物P-428。
49.如权利要求44-47中任一项所述的方法，其中甾醇或其他结构脂质的mol％是18.5％植物甾醇，并且结构脂质的总mol％是38.5％。
50.如权利要求44-47中任一项所述的方法，其中甾醇或其他结构脂质的mol％是28.5％植物甾醇，并且结构脂质的总mol％是38.5％。
51.如权利要求1-35中任一项所述的方法，其中所述脂质纳米颗粒包含：
(i)约50mol％可电离脂质，其中所述可电离脂质是化合物X；
(ii)约10mol％磷脂，其中所述磷脂是DSPC；
(iii)约38.5mol％结构脂质，其中所述结构脂质选自β-谷甾醇和胆固醇；和
(iv)约1.5mol％PEG脂质，其中所述PEG脂质是PEG-DMG。
52.如权利要求1-35中任一项所述的方法，其中所述脂质纳米颗粒包含摩尔比为50:10:10:28.5:1.5的化合物X:DSPC:胆固醇:β-谷甾醇:PEG-DMG。
53.如前述权利要求中任一项所述的方法，所述方法包括施用检查点抑制剂多肽，其中所述检查点抑制剂多肽抑制PD-1、PD-L1、CTLA-4或它们的组合。
54.如权利要求53所述的方法，其中所述检查点抑制剂多肽是抗体或编码所述抗体的mRNA。
55.如权利要求54所述的方法，其中所述抗体是抗CTLA-4抗体或其特异性地结合CTLA-4的抗原结合片段、抗PD-1抗体或其特异性地结合PD-1的抗原结合片段、抗PD-L1抗体或其特异性地结合PD-L1的抗原结合片段，以及它们的组合。
56.如权利要求55所述的方法，其中所述抗PD-L1抗体是阿特珠单抗、阿维鲁单抗或度伐鲁单抗，其中所述抗CTLA-4抗体是曲美木单抗或伊匹单抗，并且其中所述抗PD-1抗体是纳武单抗或派姆单抗。
57.一种脂质纳米颗粒，所述脂质纳米颗粒包含：
(i)编码人OX40L的第一mRNA；和
(ii)编码免疫增强剂的至少一种第二mRNA，其中所述免疫增强剂是激活T细胞、NK细胞或T细胞和NK细胞两者的细胞缔合性细胞因子。
58.一种脂质纳米颗粒，所述脂质纳米颗粒包含：
(i)可电离脂质；
(ii)甾醇或其他结构脂质；
(iii)编码人OX40的第一mRNA；
(iv)编码免疫增强剂的至少一种第二mRNA，其中所述免疫增强剂是激活T细胞、NK细胞或T细胞和NK细胞两者的细胞缔合性细胞因子；
(v)任选地，非阳离子辅助脂质或磷脂；和
(vi)任选地，PEG脂质。
59.如权利要求57-58中任一项所述的脂质纳米颗粒，其中所述至少一种第二mRNA是：
(i)编码反式呈递的人IL-15的mRNA；
(ii)编码可操作地连接至包含跨膜结构域的膜结构域的人IL-12多肽的mRNA；或
(iii)编码反式呈递的人IL-15的mRNA和编码可操作地连接至膜结构域的人IL-12多肽的mRNA。
60.如权利要求59所述的脂质纳米颗粒，其中所述反式呈递的人IL-15：(i)是可操作地连接至人IL-15Rα多肽的人IL-15多肽；或(ii)由编码人IL-15多肽的第一mRNA和编码人IL-15Rα多肽的第二mRNA编码。
61.如权利要求57-60中任一项所述的脂质纳米颗粒，其中所述OX40L多肽包含SEQ IDNO:1所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。
62.如权利要求57-61中任一项所述的脂质纳米颗粒，其中所述OX40L多肽由包含SEQID NO:11所示核苷酸序列的核苷酸序列或与SEQ ID NO:11所示核苷酸序列具有至少80％同一性的核苷酸序列编码。
63.如权利要求59-62中任一项所述的脂质纳米颗粒，其中所述IL-12多肽包含任选地经由肽接头可操作地连接至IL-12p35亚基(IL-12A)多肽的IL-12p40亚基(IL-12B)多肽。
64.如权利要求63所述的脂质纳米颗粒，其中所述IL-12B多肽位于所述IL-12A多肽的5’末端或所述肽接头的5’末端；或者其中所述IL-12A多肽位于所述IL-12B多肽的5’末端或所述肽接头的5’末端。
65.如权利要求59-64中任一项所述的脂质纳米颗粒，其中：(i)所述IL-12多肽跨膜结构域包含源自I型整合膜蛋白的跨膜结构域；或(ii)所述IL-12多肽跨膜结构域选自由以下组成的组：分化簇8(CD8)跨膜结构域、血小板源性生长因子受体(PDGFR)跨膜结构域和分化簇80(CD80)跨膜结构域。
66.如权利要求65所述的脂质纳米颗粒，所述PDGFR-β跨膜结构域包含SEQ ID NO:42所示的氨基酸序列；所述CD8跨膜结构域包含SEQ ID NO:41所示的氨基酸序列；并且所述CD80跨膜结构域包含SEQ ID NO:43所示的氨基酸序列。
67.如权利要求59-66中任一项所述的脂质纳米颗粒，其中所述IL-12多肽膜结构域包含细胞内结构域，其中(i)所述细胞内结构域与所述跨膜结构域源自相同的多肽，或者其中所述细胞内结构域与所述跨膜结构域源自不同的多肽；或(ii)所述细胞内结构域选自由以下组成的组：PDGFR细胞内结构域、截短的PDGFR细胞内结构域，和CD80细胞内结构域。
68.如权利要求67所述的脂质纳米颗粒，其中所述细胞内结构域是：(i)PDGFR细胞内结构域，所述PDGFR细胞内结构域包含含有SEQ ID NO:48所示氨基酸序列的PDGFR-β细胞内结构域；(ii)是截短的PDGFR细胞内结构域，所述截短的PDGFR细胞内结构域包含在E570或G739处截短的PDGFR-β细胞内结构域；或(iii)是CD80细胞内结构域，所述CD80细胞内结构域包含SEQ ID NO:47所示的氨基酸序列。
69.如权利要求68所述的脂质纳米颗粒，其中所述在E570处截短的截短PDGFR-β细胞内结构域包含SEQ ID NO:49所示的氨基酸序列，并且其中所述在G739处截短的截短PDGFR-β跨膜结构域包含SEQ ID NO:50所示的氨基酸序列。
70.如权利要求59-69中任一项所述的脂质纳米颗粒，其中所述IL-12多肽膜结构域包含：
(i)PDGFR-β跨膜结构域和PDGFR-β细胞内结构域；
(ii)PDGFR-β跨膜结构域和在E570处截短的截短PDGFR-β细胞内结构域；
(iii)PDGFR-β跨膜结构域和在G739处截短的截短PDGFR-β细胞内结构域；或
(iv)CD80跨膜结构域和CD80细胞内结构域。
71.如权利要求59-70中任一项所述的脂质纳米颗粒，其中所述IL-12多肽膜结构域通过肽接头可操作地连接至所述IL-12A多肽，或者其中所述IL-12多肽膜结构域通过肽接头可操作地连接至所述IL-12B多肽。
72.如权利要求59-71中任一项所述的脂质纳米颗粒，其中所述IL-15Rα多肽包含sushi结构域。
73.如权利要求73所述的脂质纳米颗粒，其中所述IL-15Rα多肽还包含细胞内结构域和跨膜结构域，并且其中所述细胞内结构域和所述跨膜结构域源自IL-15Rα或异源多肽。
74.如权利要求59-73中任一项所述的脂质纳米颗粒，其中所述IL-15多肽包含SEQ IDNO:17所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列，并且其中所述IL-15Rα多肽包含SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。
75.如权利要求74所述的脂质纳米颗粒，其中所述IL-15多肽由包含SEQ ID NO:122所示核苷酸序列的核苷酸序列或与SEQ ID NO:122所示核苷酸序列具有至少80％同一性的核苷酸序列编码，并且其中所述IL-15Rα多肽由包含SEQ ID NO:22所示核苷酸序列的核苷酸序列或与SEQ ID NO:22所示核苷酸序列具有至少80％同一性的核苷酸序列编码。
76.一种脂质纳米颗粒，所述脂质纳米颗粒包含：
(i)编码人OX40L多肽的第一mRNA，其中所述mRNA包含SEQ ID NO:11所示的核苷酸序列；
(ii)编码人IL-12多肽的第二mRNA，其中所述mRNA包含SEQ ID NO:60所示的核苷酸序列；
(iii)编码人IL-15多肽的第三mRNA，其中所述mRNA包含SEQ ID NO:122所示的核苷酸序列；和
(iv)编码人IL-15Rα多肽的第四mRNA，其中所述mRNA包含SEQ ID NO:22所示的核苷酸序列。
77.如权利要求57-76中任一项所述的脂质纳米颗粒，其中每种mRNA包含3’非翻译区(UTR)。
78.如权利要求77所述的脂质纳米颗粒，其中所述3’UTR包含至少一个微RNA(miR)结合位点，其中所述至少一个miR结合位点是miR-122结合位点，并且其中所述miR-122结合位点是miR-122-3p或miR-122-5p结合位点。
79.如权利要求78所述的脂质纳米颗粒，其中所述miR-122-5p结合位点包含SEQ IDNO:83所示的核苷酸序列，并且其中所述miR-122-3p结合位点包含SEQ ID NO:74所示的核苷酸序列。
80.如权利要求57-76中任一项所述的脂质纳米颗粒，其中每种mRNA包含3’UTR，所述3’UTR包含SEQ ID NO:77或SEQ ID NO:121所示的核苷酸序列。
81.如权利要求57-80中任一项所述的脂质纳米颗粒，其中每种mRNA包含5’非翻译区(UTR)。
82.如权利要求81所述的脂质纳米颗粒，其中所述5’UTR包含SEQ ID NO:12或SEQ IDNO:133所示的核苷酸序列。
83.如权利要求57-82中任一项所述的脂质纳米颗粒，其中每种mRNA包括至少一种化学修饰。
84.如权利要求83所述的脂质纳米颗粒，其中所述化学修饰选自由以下组成的组：假尿苷、N1-甲基假尿苷、2-硫代尿苷、4’-硫代尿苷、5-甲基胞嘧啶、2-硫代-1-甲基-1-脱氮-假尿苷、2-硫代-1-甲基-假尿苷、2-硫代-5-氮杂-尿苷、2-硫代-二氢假尿苷、2-硫代-二氢尿苷、2-硫代-假尿苷、4-甲氧基-2-硫代-假尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-硫代-1-甲基-假尿苷、4-硫代-假尿苷、5-氮杂-尿苷、二氢假尿苷、5-甲基尿苷、5-甲基尿苷、5-甲氧基尿苷和2’-O-甲基尿苷。
85.如权利要求57-82中任一项所述的脂质纳米颗粒，其中(i)每种mRNA中至少95％的尿苷是N1-甲基假尿苷；(ii)每种mRNA中至少99％的尿苷是N1-甲基假尿苷；或(iii)每种mRNA中100％的尿苷是N1-甲基假尿苷。
86.如权利要求57-85中任一项所述的脂质纳米颗粒，其中所述脂质纳米颗粒包含摩尔比为约20％-60％:5％-25％:25％-55％:0.5％-15％的可电离氨基脂质:磷脂:结构脂质:PEG修饰脂质。
87.如权利要求57-85中任一项所述的脂质纳米颗粒，其中所述脂质纳米颗粒包含摩尔比为约50％:约10％:约38.5％:约1.5％的可电离脂质:磷脂:甾醇:PEG修饰脂质。
88.如权利要求57-85中任一项所述的脂质纳米颗粒，其中所述脂质纳米颗粒包含摩尔比为50:38.5:10:1.5的可电离脂质:胆固醇:DSPC:PEG修饰脂质。
89.如权利要求86-88中任一项所述的脂质纳米颗粒，其中所述可电离脂质选自由以下组成的组：例如，2,2-二亚油基-4-二甲基氨基乙基-[1,3]-二氧戊环(DLin-KC2-DMA)、4-二甲基氨基丁酸二亚油基-甲酯(DLin-MC3-DMA)和9-((4-(二甲基氨基)丁酰基)氧基)十七烷二酸二((Z)-壬-2-烯-1-基)酯(L319)。
90.如权利要求86-89中任一项所述的脂质纳米颗粒，其中所述可电离脂质包括化合物X。
91.如权利要求57-85中任一项所述的脂质纳米颗粒，其中所述脂质纳米颗粒包含摩尔比为约20％-60％:5％-25％:25％-55％:0.5％-15％的化合物X:磷脂:胆固醇:PEG修饰脂质。
92.如权利要求91所述的脂质纳米颗粒，其中所述脂质纳米颗粒包含摩尔比为约50％:约10％:约38.5％:约1.5％的化合物X:磷脂:胆固醇:PEG修饰脂质。
93.如权利要求86-92中任一项所述的脂质纳米颗粒，其中所述PEG修饰脂质是PEG-DMG或化合物P-428。
94.如权利要求86-93中任一项所述的脂质纳米颗粒，其中所述脂质纳米颗粒包含植物甾醇或植物甾醇与胆固醇的组合。
95.如权利要求94所述的脂质纳米颗粒，其中所述植物甾醇选自由以下组成的组：β-谷甾醇、豆甾醇、β-谷甾烷醇、菜油甾醇、菜子甾醇以及它们的组合。
96.如权利要求94所述的脂质纳米颗粒，其中所述植物甾醇包括(i)谷甾醇或其盐或酯，或(ii)豆甾醇或其盐或酯。
97.如权利要求94所述的脂质纳米颗粒，其中所述植物甾醇是β-谷甾醇
Figure FDA0003064795700000161
或其盐或酯。
98.如权利要求53-85中任一项所述的脂质纳米颗粒，其中所述脂质纳米颗粒包含(i)摩尔比为50:38.5:10:1.5的化合物X:胆固醇:磷脂:化合物P-428，或化合物X:胆固醇:DSPC:化合物P-428；或(ii)摩尔比为40:38.5:20:1.5的化合物X:胆固醇:磷脂:化合物P-428，或化合物X:胆固醇:DSPC:化合物P-428。
99.如权利要求94-97中任一项所述的脂质纳米颗粒，其中甾醇或其他结构脂质的mol％是18.5％植物甾醇，并且结构脂质的总mol％是38.5％。
100.如权利要求94-97中任一项所述的脂质纳米颗粒，其中甾醇或其他结构脂质的mol％是28.5％植物甾醇，并且结构脂质的总mol％是38.5％。
101.如权利要求53-85中任一项所述的脂质纳米颗粒，其中所述脂质纳米颗粒包含：
(i)约50mol％可电离脂质，其中所述可电离脂质是化合物X；
(ii)约10mol％磷脂，其中所述磷脂是DSPC；
(iii)约38.5mol％结构脂质，其中所述结构脂质选自β-谷甾醇和胆固醇；和
(iv)约1.5mol％PEG脂质，其中所述PEG脂质是PEG-DMG。
102.如权利要求53-85中任一项所述的脂质纳米颗粒，其中所述脂质纳米颗粒包含摩尔比为50:10:10:28.5:1.5的化合物X:DSPC:胆固醇:β-谷甾醇:PEG-DMG。
103.如权利要求53-102中任一项所述的脂质纳米颗粒，所述脂质纳米颗粒被配制成用于肿瘤内递送。
104.如权利要求53-102中任一项所述的脂质纳米颗粒，所述脂质纳米颗粒被配制成用于静脉内递送。
105.如权利要求53-102中任一项所述的脂质纳米颗粒，其中所述mRNA被共同配制在相同的脂质纳米颗粒中，并且其中所述编码人OX40L、拴系人IL-12和细胞缔合性人IL-15的mRNA以1:1:1的重量(质量)比共同配制。
106.如权利要求105所述的脂质纳米颗粒，其中所述编码细胞缔合性人IL-15的mRNA由编码人IL-15和人IL-15Rα的两种mRNA编码，并且其中所述两种mRNA以1:1的摩尔比共同配制。
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