CN113009153A - 一种基于磁微粒化学发光的新冠病毒中和抗体检测试剂盒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于磁微粒化学发光的新冠病毒中和抗体检测试剂盒，由设在盒体内的偶联有RBD蛋白1的磁微球、作为阳性对照的RBD中和抗体标准品溶液、阴性对照、样品稀释液、RBD蛋白2酶结合物、20×浓缩洗涤液、发光液构成。本发明还公开了所述试剂盒在检测含新型冠状病毒中和抗体生物样品中的应用。实验证实本发明的试剂盒稳定性高、选择性强，检测速度快、费用低廉、易于操作，克服了现有技术中检测中和抗体时，实验室环境要求高、操作时长等缺点，将操作时间由120分钟缩短至35分钟。本发明的试剂盒不仅能够用于判断新冠疫苗接种后中和抗体的情况，也可以用于普通新冠抗体筛查，具有极大的临床应用前景。

Description

一种基于磁微粒化学发光的新冠病毒中和抗体检测试剂盒及 其应用

技术领域

本发明涉及一种新型冠状病毒(SARS-CoV-2)中和抗体的检测，尤其涉及一种基于磁微粒化学发光的新冠病毒中和抗体检测试剂盒及其应用，属于临床检验技术领域。

背景技术

由新冠病毒(SARS-CoV-2)引起的新冠肺炎(COVID-19)大流行是一个世纪以来人类面临的最严峻挑战。新型冠状病毒即“SARS-CoV-2”感染后常见体征有呼吸道症状、发热、咳嗽、气促和呼吸困难等。在较严重病例中，感染可导致肺炎、严重急性呼吸综合征、肾衰竭，甚至死亡。因其传染力、存活力很高，一年时间内全球感染总人数已接近9000万人。专家们普遍认为，在研发出一个安全有效的疫苗并成功实施全球疫苗接种计划以前，全社会都无法回到疫情前的正常状态。

研究表明，冠状病毒S蛋白是病毒毒力的关键因子，是决定病毒毒力、组织嗜性和宿主范围的关键部分，也是中和抗体和疫苗设计的主要靶标。而评价疫苗接种后的效果，最直接的检测方法为新冠中和抗体的检测。因为，能识别新冠病毒的S(刺突)蛋白上的RBD区(受体结合域)的中和抗体，就可以阻断新冠病毒和人细胞上的ACE2受体结合，使得新冠病毒无法感染人细胞。此外，中和抗体可以与其他免疫成分——例如补体、吞噬细胞和自然杀伤细胞等——相互作用。这些效应反应都可以帮助清除病毒和被感染的细胞。中和抗体浓度越高，一般保护作用越好。因此，早期预测疫苗好坏的指标之一，就是看它能诱发人体内产生多少中和抗体。

传统的检测中和抗体的方法为活病毒或假病毒中和试验。试验方法需要专业细胞培养过程，对实验等级要求高，周期长、操作复杂，不适合普通接种疫苗人群高通量筛查。

中和抗体滴度可以反映出血液样品中抗体水平的指标，即接种疫苗后人体内免疫应答的好坏或强弱。随着新型冠状病毒疫苗的上市，对接种新冠疫苗人群和新冠感染后康复人群的中和抗体评价需要快速、可靠的、稳定、安全的评价方法。目前已有关于新型冠状病毒中和抗体酶联免疫的竞争抑制检测方法(CN202010919164.X、CN202010952237.5)，但上述专利中公布的实验检测方法均属酶联免疫法，在实验操作中存在操作时间长(2-3小时)，手工操作等缺点。因新冠病毒传染力很强，增加人工操作和反应时间，也相应增加了操作人员被感染的可能性。此外，因竞争抑制法中，因加样时间和加样间隔的影响，易对最终检测结果造成假阳结果，会影响最终对中和抗体含量的判断。而间接法因特异性较差，血清中非特异性IgG可直接吸附到酶标板或包被抗原的表面，也会造成最终检测结果的假阳性。

磁微粒化学发光技术是将磁性分离技术、化学发光技术、免疫分析技术三者结合起来的一种新兴分析方法。该技术充分利用了磁性分离技术的快速易自动化性，化学发光技术的高灵敏度性，以及免疫分析的特异性，是目前最受欢迎的标记免疫分析技术。

现有技术中，经检索用重组RBD蛋白1包被磁性微球，辣根过氧化物酶标记RBD蛋白2制备酶结合物，并利用全自动磁微粒免疫分析仪在反应中形成RBD磁微球-新冠病毒中和抗体-RBD蛋白酶结合物夹心复合物，加入发光液，读取发光值。依据发光值与样本中RBD中和抗体的有效浓度成正比原理制备有关基于磁微粒化学发光的新冠病毒中和抗体检测试剂盒及其应用还未见报道。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一种基于磁微粒化学发光的新冠病毒中和抗体检测试剂盒及其应用。

本发明所述的基于磁微粒化学发光的新冠病毒中和抗体检测试剂盒，由设在盒体内的偶联有RBD蛋白1的磁微球、作为阳性对照的RBD中和抗体标准品溶液、阴性对照、样品稀释液、RBD蛋白2酶结合物、20×浓缩洗涤液、发光液构成；

其特征在于：

所述磁微球偶联有浓度为5-20μg/mg的重组RBD蛋白1；该磁性微球的工作浓度为0.2-0.5mg/mL，稀释液为保存液；

所述RBD中和抗体标准品溶液为：样品稀释液稀释的浓度为1000ng/ml的RBD中和抗体溶液；

所述阴性对照为正常人新冠病毒SARS-CoV-2抗体阴性血清；

所述样品稀释液的配方是：除菌的1000mL纯水中，含NaCl 8g、NaH₂PO₄·2H₂O0.2g、Na₂HPO₄·12H₂O 2.9g、CTAB 1g、酪蛋白钠盐5g、TritonX-100 0.1mL、Proclin3001mL，pH为7.4；

所述RBD蛋白2酶结合物是辣根过氧化物酶标记的重组RBD蛋白2；

RBD蛋白的包被量采用棋盘法依照灵敏度，检测范围为指标进行选择。HRP标记的新冠刺突蛋白RBD2使用量的优化方法是：在RBD蛋白1的磁微球溶液中加入不同浓度的中和抗体标准溶液，再加入HRP标记的RBD蛋白2，选择HRP标记RBD蛋白2使用量为其检测结果阳性/阴性最大值的酶标记结合物的稀释浓度，结果是该RBD蛋白2酶结合物使用的效价浓度为1:10000，稀释液为酶结合物稀释液；RBD酶结合物的制备方法为：利用过碘酸钠法标记的RBD蛋白2与辣根过氧化物酶的结合物。制备方法不限于此方法，其余蛋白标记方法亦可。

所述20×浓缩洗涤液的配方是：除菌的50mL双蒸水中，含NaCl 8.0g、NaH₂PO₄·2H₂O 0.2g、Na₂HPO₄·12H₂ O 2.9g、吐温20 0.5mL；

所述发光液包括A液和B液，浓度为3.0mmol/L的鲁米诺溶液与0.3mmol/L对碘苯酚溶液等体积比的混合液命名为A液；浓度为7.5mmol/L的过氧化脲命名为B液；使用时将A液与B液按体积比1﹕1混合。

上述基于磁微粒化学发光的新冠病毒中和抗体检测试剂盒中，所述磁微球的制备方法是：

1.1)配制偶联缓冲液：即配制0.01mol/L的MES缓冲溶液，并调整pH值为6.0；

MES 1.95g

纯化水 定容至1000mL

过滤除菌，4℃保存；

1.2)配制洗涤液，洗涤液的配方及制法是：

1.3)配制保存液，保存液的配方及制法是：

1.4)偶联操作

(1)RBD蛋白1酸化处理

酸处理：取1mL浓度为1mg/mL的RBD蛋白1溶液至2.0mL低吸附EP管，向EP管加入0.2mL酸化处理液A，室温40rpm滚轴混匀30min；

中和：向酸处理后的RBD蛋白1溶液中加入0.4mL处理液B中和，缓慢吸打后备用；其中：

处理液A：

硼酸 1.06g

磷酸二氢钠 2.34g

超纯水 定容至100mL

调pH值至2.0；

过滤除菌，4℃保存；

处理液B：

硼酸 1.06g

磷酸二氢钠 2.34g

超纯水 定容至100mL

调pH值至9.5；

过滤除菌，4℃保存；

(2)羧基磁性微球的活化：取5mg羧基磁性微球，加入500μL的EDC/NHS溶液室温下活化30min，磁分离，偶联缓冲液洗涤磁性微球，得活化后的磁性微球；

其中，所述EDC是：1-乙基-(3-二甲基胺基丙基)碳化二亚胺盐酸盐，所述NHS是：N-羟基丁二酰亚胺，其溶液使用偶联缓冲液为溶剂配制，其浓度均为2mg/mL，使用前将EDC与NHS溶液等体积比混匀即得到EDC/NHS溶液；

(3)羧基磁性微球与酸化RBD蛋白1偶联：向上述活化后的磁性微球中加入浓度为0.5-1mg/mL的酸化RBD蛋白1，使磁微球偶联RBD蛋白1的浓度为5-20μg/mg，室温反应3h，磁分离，洗涤液洗涤，使用孔径为10μm的有机系尼龙微孔滤膜抽滤磁珠，抽滤过程中持续搅拌，即得免疫磁性微球，加保存液于4℃保存，备用；使用时用保存液稀释使磁性微球的工作浓度为0.2-0.5mg/mL。

上述基于磁微粒化学发光的新冠病毒中和抗体检测试剂盒中：所述RBD蛋白1是利用CHO细胞表达的新型冠状病毒SARS-CoV-2全长RBD融合人源Fc的重组蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，编码所述RBD蛋白1的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；RBD蛋白2是利用CHO细胞表达的新型冠状病毒SARS-CoV-2全长RBD的重组蛋白，其氨基酸序列如SEQ IDNo.3所示，编码所述RBD蛋白2的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；所述的RBD中和抗体是用来自于测定的新冠康复患者中和抗体可变区序列并与人源化Fc融合，通过CHO细胞重组表达形成的。

上述基于磁微粒化学发光的新冠病毒中和抗体检测试剂盒中，所述磁微球偶联有优选浓度为10-20μg/mg的重组RBD蛋白1；该磁性微球的工作浓度优选为0.3-0.5mg/mL，稀释液为保存液。

上述基于磁微粒化学发光的新冠病毒中和抗体检测试剂盒中，所述酶结合物稀释液的配方是：除菌的1000mL纯水中，含NaCl 8g、NaH₂PO₄·2H₂O 0.2g、Na₂HPO₄·12H₂O 2.9g、表面活性剂S9 3g、酪蛋白钠盐5g、BSA10g、Proclin300 1mL。

本发明所述基于磁微粒化学发光的新冠病毒中和抗体检测试剂盒在检测含新型冠状病毒中和抗体生物样品中的应用。

其中，检测含新型冠状病毒中和抗体样品的方法是：

a)利用全自动磁微粒化学发光分析仪向反应杯中加入样本5μL、样品稀释液50μL、加入浓度为0.2-0.5mg/mL的偶联有重组RBD蛋白1的磁微球悬浮液50μL；阳性对照、阴性对照按a)同样步骤操作；

b)混匀后37℃温育15分钟；

c)用磁性分离架或磁性分离器，清洗液洗涤4-5次；

d)再向全自动磁微粒化学发光分析仪反应杯中加入辣根过氧化物酶标记的重组RBD蛋白2溶液100uL；

e)混匀后37℃温育15分钟；

f)用磁性分离架或磁性分离器，清洗液洗涤4-5次；

g)每个反应杯中加入发光底物A液和发光底物B液各50μL；

h)混匀后1～5分钟检测发光强度；

i)读取样品、阳性对照、阴性对照的RLU值；

J)SARS-CoV-2中和抗体检测的阳性cutoff、本试剂盒的cut-off值计算公式为：

0.18×(阴性对照发光强度平均值+阳性对照发光强度平均值)

结果判定标准：

S/CO≥1：阳性，S/CO＜1：阴性。

本发明所述基于磁微粒化学发光的新冠病毒中和抗体检测试剂盒的应用及该指标在接种新冠疫苗人群和新冠感染后康复人群的中和抗体评价中的应用。

本发明提供的基于磁微粒化学发光的新冠病毒中和抗体检测试剂盒是基于磁微粒化学发光法制备，在检测过程上全部实现机器自动化，具有高通量、灵敏度高、特异性好、重复性好等特点，可在生物安全二级实验室或普通实验室开展的快速中和抗体检测方法，有利于疫病流行病学调查、免疫抗体监测以及疫苗免疫效力评价。

本发明所述基于磁微粒化学发光的新冠病毒中和抗体检测试剂盒的检测原理为：用重组RBD蛋白1包被磁性微球，辣根过氧化物酶标记重组RBD蛋白2制备酶结合物，在第一步反应中，将样本、样品稀释液、偶联有重组RBD蛋白1的磁微球利用全自动磁微粒免疫分析仪依次加入至反应杯内，37℃温浴15分钟，经洗涤后，再加入辣根过氧化物酶标记的重组RBD蛋白2即酶结合物，37℃温浴15min，形成RBD磁微球-新冠病毒中和抗体-RBD蛋白酶结合物夹心复合物，经洗涤后，加入发光液，温浴3分钟，读取发光值。发光值与样本中RBD中和抗体的有效浓度成正比。

本发明的有益效果是：(1)本发明公开的一种基于磁微粒化学发光双抗原夹心法检测新型冠状病毒中和抗体试剂盒，提供了一种基于磁微粒化学发光法更便捷的检测方法，该方法具有稳定性高、灵敏度高、选择性强，检测速度快、费用低廉、易于操作等优点。克服了现有技术中检测新型冠状病毒中和抗体时，操作复杂，操作时长，结果易受加样时间影响等缺点，操作时间由120分钟缩短至35分钟。(2)本发明公开的一种基于磁微粒化学发光双抗原夹心法检测新型冠状病毒中和抗体试剂盒不仅能够用于判断新冠疫苗接种后中和抗体的情况，也可以用于普通新冠抗体筛查，具有极大的临床应用前景。

附图说明

图1：本发明所述基于磁微粒化学发光的新冠病毒中和抗体检测试剂盒拟合曲线。

具体实施方式

下面结合具体附图和实施例对本发明内容进行详细说明。如下所述例子仅是本发明的较佳实施方式而已，应该说明的是，下述说明仅仅是为了解释本发明，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对实施方式所做的任何简单修改，等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。

下述实施例中，所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均从商业途径得到。

实施例1：本发明所述基于磁微粒化学发光的新冠病毒中和抗体检测试剂盒的制备

(一)磁微球的制备：

1.1)配制偶联缓冲液：即配制0.01mol/L的MES缓冲溶液，并调整pH值为6.0；

MES 1.95g

纯化水 定容至1000mL

过滤除菌，4℃保存；

1.2)配制洗涤液，洗涤液的配方及制法是：

1.3)配制保存液，保存液的配方及制法是：

1.4)偶联操作

(1)RBD蛋白1酸化处理

酸处理：取1mL浓度为1mg/mL的RBD蛋白1溶液至2.0mL低吸附EP管，向EP管加入0.2mL酸化处理液A，室温40rpm滚轴混匀30min；

中和：向酸处理后的抗体溶液中加入0.4mL处理液B中和，缓慢吸打后备用；其中：

处理液A：

硼酸 1.06g

磷酸二氢钠 2.34g

超纯水 定容至100mL

调pH值至2.0；

过滤除菌，4℃保存；

处理液B：

硼酸 1.06g

磷酸二氢钠 2.34g

超纯水 定容至100mL

调pH值至9.5；

过滤除菌，4℃保存；

(2)羧基磁性微球的活化：取5mg羧基磁性微球，加入500μL的EDC/NHS溶液室温下活化30min，磁分离，偶联缓冲液洗涤磁性微球，得活化后的磁性微球；

其中，所述EDC是：1-乙基-(3-二甲基胺基丙基)碳化二亚胺盐酸盐，所述NHS是：N-羟基丁二酰亚胺，其溶液使用偶联缓冲液为溶剂配制，其浓度均为2mg/mL，使用前将EDC与NHS溶液等体积比混匀即得到EDC/NHS溶液；

(3)羧基磁性微球与酸化RBD蛋白1偶联：向上述活化后的磁性微球中加入浓度为0.5-1mg/mL的酸化RBD蛋白1，使磁微球偶联RBD蛋白1的浓度为5-20μg/mg，室温反应3h，磁分离，洗涤液洗涤，使用孔径为10μm的有机系尼龙微孔滤膜抽滤磁珠，抽滤过程中持续搅拌，即得免疫磁性微球，加保存液于4℃保存，备用；使用时用保存液稀释使磁性微球的工作浓度为0.2-0.5mg/mL。

(二)试剂盒溶液的配制：

样本稀释液配方是：

20×浓缩洗涤液的配方是：除菌的50mL双蒸水中，含NaCl 8.0g、NaH₂PO₄·2H₂O0.2g、Na₂HPO₄·12H₂O 2.9g、吐温20 0.5mL；

阴性对照为正常人新冠病毒SARS-CoV-2抗体阴性血清；

RBD中和抗体标准品溶液(阳性对照)为；样品稀释液稀释的浓度为1000ng/ml的RBD中和抗体溶液；

RBD蛋白1制备方法为利用CHO细胞表达的新型冠状病毒SARS-CoV-2全长RBD融合人源Fc的重组蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，编码所述RBD蛋白1的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；制备过程为生物领域人员熟知方法。

RBD蛋白的包被量采用棋盘法依照灵敏度，检测范围为指标进行选择。

RBD蛋白2制备方法为RBD蛋白2是利用CHO细胞表达的新型冠状病毒SARS-CoV-2全长RBD的重组蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID No.3所示，编码所述RBD蛋白2的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；制备过程为生物领域人员熟知方法。

RBD中和抗体是用来自于测定的新冠康复患者中和抗体可变区序列并与人源化Fc融合，通过CHO细胞重组表达形成的。

RBD蛋白2酶结合物的制备方法为：利用过碘酸钠法标记的RBD蛋白2与辣根过氧化物酶(HRP)的结合物。制备方法不限于此方法，其余蛋白标记方法亦可。

HRP标记的新冠刺突蛋白RBD2使用量的优化：在RBD蛋白1的磁微球溶液中加入不同浓度的中和抗体标准溶液，再加入HRP标记的RBD蛋白2，选择HRP标记RBD蛋白2使用量为其检测结果阳性/阴性最大值的酶标记结合物的稀释浓度，优选的使用效价浓度为1:10000。

酶结合物稀释液的配方是：除菌的1000mL纯水中，含NaCl 8g、NaH₂PO₄·2H₂O0.2g、Na₂HPO₄·12H₂O 2.9g、表面活性剂S9 3g、酪蛋白钠盐5g、BSA 10g、Proclin300 1mL；

发光液包括A液和B液，浓度为3.0mmol/L的鲁米诺溶液与0.3mmol/L对碘苯酚溶液等体积比的混合液命名为A液；浓度为7.5mmol/L的过氧化脲命名为B液；使用时将A液与B液按体积比1﹕1混合。

(三)一种基于磁微粒化学发光的新冠病毒中和抗体检测试剂盒，由设在盒体内的偶联有RBD蛋白1的磁微球、作为阳性对照的RBD中和抗体标准品溶液、阴性对照、样品稀释液、RBD蛋白2酶结合物、20×浓缩洗涤液、发光液构成；

其中：所述磁微球偶联有浓度为5-20μg/mg的重组RBD蛋白1；该磁性微球的工作浓度为0.2-0.5mg/mL，稀释液为保存液；优选：所述磁微球偶联有浓度为10-20μg/mg的重组RBD蛋白1；该磁性微球的工作浓度为0.3-0.5mg/mL，稀释液为保存液。所述RBD蛋白2酶结合物是辣根过氧化物酶标记的重组RBD蛋白2；该RBD蛋白2酶结合物使用的效价浓度为1:10000，稀释液为酶结合物稀释液

实施例2：本发明所述基于磁微粒化学发光的新冠病毒中和抗体检测试剂盒在检测含新型冠状病毒中和抗体生物样品中的应用。

其中，检测含新型冠状病毒中和抗体样品优选的方法是：

a)利用全自动磁微粒化学发光分析仪向反应杯中加入样本5μL、样品稀释液50μL、加入浓度为0.2-0.5mg/mL的偶联有重组RBD蛋白1的磁微球磁微粒悬浮液50μL；阳性对照、阴性对照按a)同样步骤操作；

b)混匀后37℃温育15分钟；

c)用磁性分离架或磁性分离器，清洗液洗涤4-5次；

d)再向全自动磁微粒化学发光分析仪反应杯中加入辣根过氧化物酶标记的重组RBD蛋白2溶液100uL；

e)混匀后37℃温育15分钟；

f)用磁性分离架或磁性分离器，清洗液洗涤4-5次；

g)每个反应杯中加入发光底物A液和发光底物B液各50μL；

h)混匀后1～5分钟检测发光强度；

i)读取样品、阳性对照、阴性对照的RLU值；

J)SARS-CoV-2中和抗体检测的阳性cutoff、本试剂盒的cut-off值计算公式为：

0.18×(阴性对照发光强度平均值+阳性对照发光强度平均值)

结果判定标准：

S/CO≥1：阳性，S/CO＜1：阴性。

实施例3：本发明所述基于磁微粒化学发光的新冠病毒中和抗体检测试剂盒的线性、准确性、精密度的检测

1)试剂盒的线性

(1)定标品配制：用样品稀释液分别将RBD中和抗体稀释至10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、250ng/mL、500ng/mL、1000ng/mL。

(2)定标品测试：将配制好的定标品通过实施例2所述方法检测，得到RLU值；

(3)标准曲线的建立：根据校准品的制备浓度和RLU值采用合适的拟合方式生成该批试剂的校准曲线。见表1和图1。

表1试剂盒线性

浓度	0ng/ml	10ng/ml	20ng/ml	50ng/ml	100ng/ml	250ng/ml	500ng/ml	1000ng/ml
									RLU	23258	398748	736886	4248972	12038794	40245372	86548971	123549786

2)精密性试验：

以100ng/mL RBD中和抗体标准品平行测试10次，结果统计见表2。

表2：精密性试验结果

精密性：CV％＝5.23％

实施例4：本发明所述基于磁微粒化学发光的新冠病毒中和抗体检测试剂盒在注射疫苗临床样本筛查中的应用

使用200例完成临床注射新冠疫苗免疫样本与500例未注射新冠疫苗样本，与临床细胞中和实验比对，计算本发明试剂盒测定结果与中和实验结果符合或差异程度的统计学指标，评价方法如表3。

表3本发明试剂盒与细胞中和试验对比

灵敏度计算：189/(189+8)×100％＝95.9％。

特异性计算：500/(500+3)×100％＝99.4％

总符合率：(189+500)/(189+8+500+3)×100％＝98.4％

以上试验说明，本发明提供的检测新型冠状病毒中和抗体的试剂盒及其检测方法，与中和抗体检测金标准有很好的一致性，可以用于接种新型冠状病毒疫苗后中和抗体产生评估，其灵敏度、特异性均较好，利于临床准确评估疫苗效果。

序列表

<110>山东莱博生物科技有限公司

<120>一种基于磁微粒化学发光的新冠病毒中和抗体检测试剂盒及其应用

<141>2021-02-23

<160>4

<210> 1

<211> 228

<212>PRT

<213>人工序列

<221> RBD蛋白1的氨基酸序列

<222>（1）…（228）

<400> 1

GIYQTSNFRV QPTESIVRFP NITNLCPFGE VFNATRFASV YAWNRKRISN CVADYSVLYN 60

SASFSTFKCY GVSPTKLNDL CFTNVYADSF VIRGDEVRQI APGQTGKIAD YNYKLPDDFT 120

GCVIAWNSNN LDSKVGGNYN YLYRLFRKSN LKPFERDIST EIYQAGSTPC NGVEGFNCYF 180

PLQSYGFQPT NGVGYQPYRV VVLSFELLHA PATVCGPKKS TNHHHHHH 228

<210> 2

<211> 684

<212> DNA

<213>人工序列

<221>编码RBD蛋白1的核苷酸序列

<222>（1）…（684）

<400> 2

ggcatctacc agaccagcaa cttccgcgtg cagcccaccg agagcatcgt gcgcttcccc 60

aacatcacca acctgtgccc cttcggcgag gtgttcaacg ccacccgctt cgccagcgtg 120

tacgcctgga accgcaagcg catcagcaac tgcgtggccg actacagcgt gctgtacaac 180

agcgccagct tcagcacctt caagtgctac ggcgtgagcc ccaccaagct gaacgacctg 240

tgcttcacca acgtgtacgc cgacagcttc gtgatccgcg gcgacgaggt gcgccagatc 300

gcccccggcc agaccggcaa gatcgccgac tacaactaca agctgcccga cgacttcacc 360

ggctgcgtga tcgcctggaa cagcaacaac ctggacagca aggtgggcgg caactacaac 420

tacctgtacc gcctgttccg caagagcaac ctgaagccct tcgagcgcga catcagcacc 480

gagatctacc aggccggcag caccccctgc aacggcgtgg agggcttcaa ctgctacttc 540

cccctgcaga gctacggctt ccagcccacc aacggcgtgg gctaccagcc ctaccgcgtg 600

gtggtgctga gcttcgagct gctgcacgcc cccgccaccg tgtgcggccc caagaagagc 660

accaaccacc accaccacca ccac 684

<210> 3

<211> 553

<212> PRT

<213>人工序列

<221> RBD蛋白2的氨基酸序列

<222>（1）…（553）

<400> 3

HHHHHHGIYQ TSNFRVQPTE SIVRFPNITN LCPFGEVFNA TRFASVYAWN RKRISNCVAD 60

YSVLYNSASF STFKCYGVSP TKLNDLCFTN VYADSFVIRG DEVRQIAPGQ TGKIADYNYK 120

LPDDFTGCVI AWNSNNLDSK VGGNYNYLYR LFRKSNLKPF ERDISTEIYQ AGSTPCNGVE 180

GFNCYFPLQS YGFQPTNGVG YQPYRVVVLS FELLHAPATV CGPKKSTNGG GGSMKWVTLI 240

SFIFLFSSAR SRNLQRVARE AEHKSEIAHR YNDLKEETFK AVTMITFAQY LQRCSYDGLS 300

KLVKDVVDLA QKCVANEDAP ECTKSLPSIF LDEICQVEKL RDSYGTMADC CSKADPERNE 360

CFLSFKVSQP DFVQPYQRPA SDVICKEYQD NRVPFLGHFI YSVARREPFL YAPTILSLAA 420

DYEHALQTCC KESDVGACLD EKAAAIKERA KKVSVKQQYS CGILKKFGER TFKADKLALL 480

SQKYPKAPLS EMLKILQHVM GIYKECCEGD MVECMDDRAE LMTYMCSKQD VFSSKIKDCC 540

EKPVVERSEC IIE 553

<210> 4

<211> 1659

<212> DNA

<213>人工序列

<221> 编码RBD蛋白2的核苷酸序列

<222>（1）…（1659）

<400> 4

caccaccacc accaccacgg catctaccag accagcaact tccgcgtgca gcccaccgag 60

agcatcgtgc gcttccccaa catcaccaac ctgtgcccct tcggcgaggt gttcaacgcc 120

acccgcttcg ccagcgtgta cgcctggaac cgcaagcgca tcagcaactg cgtggccgac 180

tacagcgtgc tgtacaacag cgccagcttc agcaccttca agtgctacgg cgtgagcccc 240

accaagctga acgacctgtg cttcaccaac gtgtacgccg acagcttcgt gatccgcggc 300

gacgaggtgc gccagatcgc ccccggccag accggcaaga tcgccgacta caactacaag 360

ctgcccgacg acttcaccgg ctgcgtgatc gcctggaaca gcaacaacct ggacagcaag 420

gtgggcggca actacaacta cctgtaccgc ctgttccgca agagcaacct gaagcccttc 480

gagcgcgaca tcagcaccga gatctaccag gccggcagca ccccctgcaa cggcgtggag 540

ggcttcaact gctacttccc cctgcagagc tacggcttcc agcccaccaa cggcgtgggc 600

taccagccct accgcgtggt ggtgctgagc ttcgagctgc tgcacgcccc cgccaccgtg 660

tgcggcccca agaagagcac caacggcggc ggcggcagca tgaagtgggt gaccctgatc 720

agcttcatct tcctgttcag cagcgcccgc agccgcaacc tgcagcgcgt ggcccgcgag 780

gccgagcaca agagcgagat cgcccaccgc tacaacgacc tgaaggagga gaccttcaag 840

gccgtgacca tgatcacctt cgcccagtac ctgcagcgct gcagctacga cggcctgagc 900

aagctggtga aggacgtggt ggacctggcc cagaagtgcg tggccaacga ggacgccccc 960

gagtgcacca agagcctgcc cagcatcttc ctggacgaga tctgccaggt ggagaagctg 1020

cgcgacagct acggcaccat ggccgactgc tgcagcaagg ccgaccccga gcgcaacgag 1080

tgcttcctga gcttcaaggt gagccagccc gacttcgtgc agccctacca gcgccccgcc 1140

agcgacgtga tctgcaagga gtaccaggac aaccgcgtgc ccttcctggg ccacttcatc 1200

tacagcgtgg cccgccgcga gcccttcctg tacgccccca ccatcctgag cctggccgcc 1260

gactacgagc acgccctgca gacctgctgc aaggagagcg acgtgggcgc ctgcctggac 1320

gagaaggccg ccgccatcaa ggagcgcgcc aagaaggtga gcgtgaagca gcagtacagc 1380

tgcggcatcc tgaagaagtt cggcgagcgc accttcaagg ccgacaagct ggccctgctg 1440

agccagaagt accccaaggc ccccctgagc gagatgctga agatcctgca gcacgtgatg 1500

ggcatctaca aggagtgctg cgagggcgac atggtggagt gcatggacga ccgcgccgag 1560

ctgatgacct acatgtgcag caagcaggac gtgttcagca gcaagatcaa ggactgctgc 1620

gagaagcccg tggtggagcg cagcgagtgc atcatcgag 1659

Claims (7)

1.一种基于磁微粒化学发光的新冠病毒中和抗体检测试剂盒，由设在盒体内的偶联有RBD蛋白1的磁微球、作为阳性对照的RBD中和抗体标准品溶液、阴性对照、样品稀释液、RBD蛋白2酶结合物、20×浓缩洗涤液、发光液构成；

其特征在于：

所述磁微球偶联有浓度为5-20μg/mg的重组RBD蛋白1；该磁性微球的工作浓度为0.2-0.5mg/mL，稀释液为保存液；

所述RBD中和抗体标准品溶液为：样品稀释液稀释的浓度为1000ng/ml的RBD中和抗体溶液；

所述阴性对照为正常人新冠病毒SARS-CoV-2抗体阴性血清；

所述样品稀释液的配方是：除菌的1000mL纯水中，含NaCl 8g、NaH₂PO₄·2H₂O 0.2g、Na₂HPO₄·12H₂O 2.9g、CTAB 1g、酪蛋白钠盐5g、TritonX-100 0.1mL、Proclin300 1mL，pH为7.4；

所述RBD蛋白2酶结合物是辣根过氧化物酶标记的重组RBD蛋白2；该RBD蛋白2酶结合物使用的效价浓度为1:10000，稀释液为酶结合物稀释液；

所述20×浓缩洗涤液的配方是：除菌的50mL双蒸水中，含NaCl 8.0g、NaH₂PO₄·2H₂O0.2g、Na₂HPO₄·12H₂O 2.9g、吐温20 0.5mL；

所述发光液包括A液和B液，浓度为3.0mmol/L的鲁米诺溶液与0.3mmol/L对碘苯酚溶液等体积比的混合液命名为A液；浓度为7.5mmol/L的过氧化脲命名为B液；使用时将A液与B液按体积比1﹕1混合。

2.根据权利要求1所述基于磁微粒化学发光的新冠病毒中和抗体检测试剂盒，其特征在于，所述磁微球的制备方法是：

1.1)配制偶联缓冲液：即配制0.01mol/L的MES缓冲溶液，并调整pH值为6.0；

MES 1.95g

纯化水 定容至1000mL

过滤除菌，4℃保存；

1.2)配制洗涤液，洗涤液的配方及制法是：

过滤除菌，4℃保存；

1.3)配制保存液，保存液的配方及制法是：

过滤除菌，4℃保存；

1.4)偶联操作

(1)RBD蛋白1酸化处理

酸处理：取1mL浓度为1mg/mL的RBD蛋白1溶液至2.0mL低吸附EP管，向EP管加入0.2mL酸化处理液A，室温40rpm滚轴混匀30min；

中和：向酸处理后的RBD蛋白1溶液中加入0.4mL处理液B中和，缓慢吸打后备用；其中：

处理液A：

硼酸 1.06g

磷酸二氢钠 2.34g

超纯水 定容至100mL

调pH值至2.0；

过滤除菌，4℃保存；

处理液B：

硼酸 1.06g

磷酸二氢钠 2.34g

超纯水 定容至100mL

调pH值至9.5；

过滤除菌，4℃保存；

(2)羧基磁性微球的活化：取5mg羧基磁性微球，加入500μL的EDC/NHS溶液室温下活化30min，磁分离，偶联缓冲液洗涤磁性微球，得活化后的磁性微球；

其中，所述EDC是：1-乙基-(3-二甲基胺基丙基)碳化二亚胺盐酸盐，所述NHS是：N-羟基丁二酰亚胺，其溶液使用偶联缓冲液为溶剂配制，其浓度均为2mg/mL，使用前将EDC与NHS溶液等体积比混匀即得到EDC/NHS溶液；

(3)羧基磁性微球与酸化RBD蛋白1偶联：向上述活化后的磁性微球中加入浓度为0.5-1mg/mL的酸化RBD蛋白1，使磁微球偶联RBD蛋白1的浓度为5-20μg/mg，室温反应3h，磁分离，洗涤液洗涤，使用孔径为10μm的有机系尼龙微孔滤膜抽滤磁珠，抽滤过程中持续搅拌，即得免疫磁性微球，加保存液于4℃保存，备用；使用时用保存液稀释使磁性微球的工作浓度为0.2-0.5mg/mL。

3.根据权利要求1所述基于磁微粒化学发光的新冠病毒中和抗体检测试剂盒，其特征在于：所述RBD蛋白1是利用CHO细胞表达的新型冠状病毒SARS-CoV-2全长RBD融合人源Fc的重组蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，编码所述RBD蛋白1的核苷酸序列如SEQ IDNo.2所示；RBD蛋白2是利用CHO细胞表达的新型冠状病毒SARS-CoV-2全长RBD的重组蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID No.3所示，编码所述RBD蛋白2的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；所述的RBD中和抗体是用来自于测定的新冠康复患者中和抗体可变区序列并与人源化Fc融合，通过CHO细胞重组表达形成的。

4.根据权利要求1所述基于磁微粒化学发光的新冠病毒中和抗体检测试剂盒，其特征在于，所述磁微球偶联有浓度为10-20μg/mg的重组RBD蛋白1；该磁性微球的工作浓度为0.3-0.5mg/mL，稀释液为保存液。

5.根据权利要求1所述基于磁微粒化学发光的新冠病毒中和抗体检测试剂盒，其特征在于，所述酶结合物稀释液的配方是：除菌的1000mL纯水中，含NaCl 8g、NaH₂PO₄·2H₂O0.2g、Na₂HPO₄·12H₂O 2.9g、表面活性剂S9 3g、酪蛋白钠盐5g、BSA 10g、Proclin300 1mL。

6.权利要求1所述基于磁微粒化学发光的新冠病毒中和抗体检测试剂盒在检测含新型冠状病毒中和抗体生物样品中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，检测含新型冠状病毒中和抗体样品的方法是：

a)利用全自动磁微粒化学发光分析仪向反应杯中加入样本5μL、样品稀释液50μL、加入浓度为0.2-0.5mg/mL的偶联有重组RBD蛋白1的磁微球磁微粒悬浮液50μL；阳性对照、阴性对照按a)同样步骤操作；

b)混匀后37℃温育15分钟；

c)用磁性分离架或磁性分离器，清洗液洗涤4-5次；

d)再向全自动磁微粒化学发光分析仪反应杯中加入辣根过氧化物酶标记的重组RBD蛋白2溶液100uL；

e)混匀后37℃温育15分钟；

f)用磁性分离架或磁性分离器，清洗液洗涤4-5次；

g)每个反应杯中加入发光底物A液和发光底物B液各50μL；

h)混匀后1～5分钟检测发光强度；

i)读取样品、阳性对照、阴性对照的RLU值；

J)SARS-CoV-2中和抗体检测的阳性cutoff、本试剂盒的cut-off值计算公式为：

0.18×(阴性对照发光强度平均值+阳性对照发光强度平均值)

结果判定标准：

S/CO≥1：阳性，S/CO＜1：阴性。

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