[go: up one dir, main page]
More Web Proxy on the site http://driver.im/

CN112823167A - 抗-αvβ8抗体和组合物及其用途 - Google Patents

抗-αvβ8抗体和组合物及其用途 Download PDF

Info

Publication number
CN112823167A
CN112823167A CN201980057769.8A CN201980057769A CN112823167A CN 112823167 A CN112823167 A CN 112823167A CN 201980057769 A CN201980057769 A CN 201980057769A CN 112823167 A CN112823167 A CN 112823167A
Authority
CN
China
Prior art keywords
antibody
amino acid
acid sequence
seq
region
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201980057769.8A
Other languages
English (en)
Inventor
K·S·尼森
D·塞缪尔
C·R·霍尔斯特
M·R·德雷弗
D·谢帕德
R·J·阿克赫斯特
A·阿塔基利特
D·美亚
I·J·朗登
J·达尔波尔图
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Pfizer Corp SRL
University of California San Diego UCSD
Original Assignee
Pfizer Corp SRL
University of California San Diego UCSD
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Pfizer Corp SRL, University of California San Diego UCSD filed Critical Pfizer Corp SRL
Publication of CN112823167A publication Critical patent/CN112823167A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2839—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the integrin superfamily
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2818—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against CD28 or CD152
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2827—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against B7 molecules, e.g. CD80, CD86
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2878—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6854—Immunoglobulins
    • G01N33/6857—Antibody fragments
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A61K2039/507—Comprising a combination of two or more separate antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/545—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the dose, timing or administration schedule
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/567—Framework region [FR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/71—Decreased effector function due to an Fc-modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/734—Complement-dependent cytotoxicity [CDC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提供了特异性结合αvβ8整联素的抗体及其抗原结合片段。本发明包括使用所述抗体的用途和相关方法。

Description

抗-αvβ8抗体和组合物及其用途
相关申请
本申请要求2018年9月7日提交的美国序列号62/728,688和2019年8月23日提交的美国序列号62/890,945的优先权，其全部内容通过引用整体并入本文。
序列表
本说明书进一步通过引用合并于2019年9月5日随附提交的序列表。按照37C.F.R.§1.52(e)(5)，序列表文本文件(标识为PC72413A_SequenceListing_ST25.txt)为184,211字节，并于2019年9月3日创建。通过电子方式随附提交的序列表不超出本说明书的范围，因此不包含新的内容。
联合研究声明涉及的各方
当前要求保护的发明是由以下列出的联合研究协议涉及的各方完成的或代表其完成的。联合研究协议在要求保护的发明完成之日或之前有效，并且要求保护的发明是由于在联合研究协议范围内开展的活动而完成的。联合研究协议涉及的各方是代表其旧金山分校和辉瑞公司的美国加利福尼亚大学董事会。
技术领域
本发明涉及特异性结合αvβ8整合素的抗体及其抗原结合片段及其组合物、方法和用途。
背景技术
转化生长因子β(TGFβ)是适应性免疫和先天性免疫的有效抑制因子并且是调节性T细胞亚组进行免疫抑制的重要介质。Th17细胞的诱导需要TGFβ，其可通过诱导粒细胞性炎症来促进肿瘤进展，并且促进肿瘤细胞的上皮至间质转化和纤维化肿瘤基质的分泌和积聚，所述纤维化肿瘤基质可促进从一些实体瘤排除免疫细胞。由于所有这些原因，已研究TGFβ的抑制作为辅助免疫疗法，尤其在所谓的“免疫排除”肿瘤中(Gorelik等人,Nat.Med.7:1118-1122,2001；Tauriello等人,Nature 554:538-543,2018；Mariathasan等人,Nature 554:544-548,2018,Dodagatta等人,J Immunother Cancer.7:62.2019；美国专利号10,167,334)。但是，由于TGFβ在多种生物系统中起重要的自身稳定作用，TGFβ信号传导的全身性靶向由于非所需的副作用而呈现许多挑战(Hata和Akhurst Nat.Rev.DrugDev.11,791-811,2012；Akhurst等人,Cold Spring Harbor Perspectives.10,2017；Flavell等人,Nat.Rev.Immunol.10:554-567,2010)。
先前研究已表明，结合检查点抑制，TGFβ信号传导的抑制可以增强对辐射或疫苗治疗的反应(Vanpouille-Box等人,Cancer Res.75:2232-2242,2015；Terabe等人,OncoImmunology 6(5):e1308616,2017)。通过几种机制调节TGFβ的体内活性。例如，TGFβ分泌为无活性或潜伏复合物，其中被切割的潜伏相关肽(latency associated peptide)(LAP)结构域包覆活性TGFβ成熟肽。潜伏-TGFβ可通过潜伏TGFβ结合蛋白(LTBP)共价连接至胞外基质或通过糖蛋白A重复主要蛋白(GARP)呈现于细胞表面上。早期体外数据表明，TGFβ的潜伏复合物可被高温、酸性pH和各种蛋白酶活化(Annes等人,J Cell Sci.116:217-24,2003)，然而，这些机制在体内的重要性仍有待确定。
已证明αv整合素家族的成员，尤其是αvβ1、αvβ6和αvβ8在潜伏-TGFβ活化中发挥了作用。整合素αvβ8是由ITGαV和ITGβ8亚单位组成的跨膜非共价异二聚体。αvβ8的表达在αv整合素中是独特的，其中其由免疫细胞(例如树突状细胞、调节性T细胞和肿瘤相关巨噬细胞)的表达已成为用于调节主动免疫反应的TGFβ的背景性活化剂。树突状细胞(DC)的αvβ8表达充当T细胞刺激过程中TGFβ产生的介质，并且在免疫反应过程中以Th1分化为代价强烈影响Treg和Th17细胞的分化和发展。在DC或所有白细胞中具有Itgb8条件性缺失的小鼠证明抗原特异性Th17细胞的TGFβ依赖性诱导的显著抑制，并且随后在某些自体免疫的临床前模型中保护免受器官功能障碍，例如多发性硬化症(实验性自体免疫脑脊髓炎)和过敏性哮喘(Travis等人,Nature.449(7160):361-5,2007；Melton等人,J Clin.Invest.120(12):4436-44,2010)。
TGFβ在免疫抑制细胞至肿瘤的分化和募集两者中起作用，并且作为肿瘤固有因子有助于免疫抑制肿瘤微环境。在一些癌症中，TGFβ可以通过影响肿瘤微环境的许多方面，包括血管生成、转移、上皮间质转化和可能最重要地，抑制浸润性免疫细胞来促即进肿瘤。
因此，鉴于TGFβ在肿瘤微环境中的突出作用以及与全身性靶向TGFβ信号传导相关的许多挑战(Hata和Akhurst Nat.Rev.Drug Dev.11,791-811,2012；Akhurst等人,ColdSpring Harbor Perspectives 10,2017；Flavell等人,Nat.Rev.Immunol.10:554-567,2010)，需要发展选择性抑制αvβ8-依赖性潜伏-TGFβ活化的策略。
发明内容
本文公开了抗体(例如，人源化和嵌合抗体)及其抗原结合片段，其特异性结合至αvβ8整合素(也在本文中互换地称为“AVB8”、“αvβ8”或“avb8”)(例如，来自人类、小鼠、食蟹猴和/或大鼠的αvβ8整合素)。在某些方面，抗体及其抗原结合片段结合至αvβ8整合素并且最终减少例如肿瘤或肿瘤微环境中的TGFβ(例如，TGFβ1和TGFβ3)信号传导。
成熟TGFβ以无活性或潜伏形式存在于具有潜伏相关肽(LAP)结构域的复合物中。αvβ8整合素与LAP的结合导致活性TGFβ(例如，TGFβ1和TGFβ3)的释放。减少αvβ8整合素与LAP的结合可防止释放活性TGFβ，从而减少TGFβ信号传导。已知TGFβ例如在肿瘤微环境中具有免疫抑制作用，因此使用本文所述的抗体降低TGFβ活性和/或信号传导可导致免疫反应(例如体内抗肿瘤反应)的活化。
由于免疫细胞(例如，树突状细胞、调节性T细胞、肿瘤相关巨噬细胞)和肿瘤细胞上αvβ8整合素的受限表达，本文公开的抗体可导致TGFβ信号传导的更靶向的非全身性减少。因此，本公开内容的抗体及其抗原结合片段能够更加选择性地拮抗免疫系统和/或肿瘤微环境中的TGFβ活性，从而增强受试者中的抗肿瘤免疫反应。在本文公开的一些实施方案中，已显示针对αvβ8整合素的抗体单独或与其他免疫调节剂(例如检查点抑制剂的调节剂(例如，PD-1、PD-L1、CTLA-4的抑制剂或4-1BB的激动剂))或抗癌疗法(例如放射疗法)组合在几种癌症(包括例如鳞状细胞癌、乳腺癌和/或结肠癌)的动物模型中引起生长抑制和/或完全肿瘤消退。
因此，在某些方面，本公开内容提供了以高亲和力和特异性结合至αvβ8整合素的抗体及其抗原结合片段、编码抗体及其抗原结合片段的核酸分子、表达载体、宿主细胞和用于制备其的方法。在某些方面，抗体及其抗原结合片段呈现改变的效应功能(例如，具有降低的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)活性和/或降低的补体依赖性细胞毒性(CDC)活性)。在某些方面，抗αvβ8整合素抗体及其抗原结合片段与其所衍生的鼠类杂交瘤抗体及其抗原结合片段相比呈现增强的αvβ8整合素的结合亲和力。本文公开的人源化抗αvβ8整合素抗体及其抗原结合片段可单独或与其他药剂或治疗性模式(例如，免疫调节剂或抗癌疗法)组合使用以治疗、预防和/或诊断病症，例如癌性病症(例如，实体和软组织肿瘤)。因此，公开了用于检测αvβ8整合素的组合物和方法以及用于使用抗αvβ8整合素抗体及其抗原结合片段治疗各种病症(包括癌症)的方法。
本领域技术人员将认识到或能够仅使用常规实验即可确定本文所述的本发明的特定实施方案的许多等效物。这样的等效物旨在被以下实施方案(E)涵盖。
E1.一种经分离的抗体或其抗原结合片段，其特异性结合至αvβ8整合素，其中所述抗体或其抗原结合片段具有以下特性中的至少一种：
i.表示为KD的对人类αvβ8整合素的结合亲和力，其低于如美国专利号9,969,804中所公开的鼠类抗体ADWA11的KD，所述专利通过引用以其整体并入本文，确认氨基酸序列并且如例如本说明书的SEQ ID NO:20-33和71-76中所阐述的，例如，本发明的ADWA11抗体的KD低于536pM(例如，1、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、370、400、450、500、510、520、530、531、532、533、534或535pM)；
ii.对人类αvβ8整合素的KD，其例如对经纯化的人类αvβ8整合素的KD低于或等于200pM(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、180、190或200pM)；
iii.对人类αvβ8整合素的KD，其对经纯化的人类αvβ8整合素的KD低于或等于100pM；
iv.对小鼠αvβ8整合素的KD，其低于鼠类抗体ADWA11的KD，例如低于489pM(例如，1、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、370、400、450、460、470、480、485、486、487或488pM)；
v.对小鼠αvβ8整合素的KD，其对经纯化的小鼠αvβ8整合素为70.8+/-19.9pM；
vi.对食蟹猴αvβ8整合素的KD，其低于鼠类抗体ADWA11的KD，例如低于507pM(例如，1、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、370、400、450、500、501、502、503、504、505或506pM)；
vii.对食蟹猴αvβ8整合素的KD，其对经纯化的食蟹猴αvβ8整合素低于或等于100pM；
viii.对大鼠αvβ8整合素的KD，其为约160pM；
ix.对人类、食蟹猴、小鼠和大鼠αvβ8整合素中的至少两种、三种或所有大致相等的亲和力，例如低于100pM(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、95或98pM)的KD，例如如使用Biacore亲和力测定法所确定的；
x.抑制TGFβ反式激活的IC50，其低于鼠类抗体ADWA11的IC50，例如低于183pM(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、175、180、181或182pM)；
xi.抑制U251细胞中的TGFβ反式激活的IC50，其为约199+/-93.6pM；
xii.抑制TGFβ反式激活的IC50，其为约100pM至约300pM；
xiii.对U251细胞的EC50，其为约126+/-34pM(例如，约50、60、70、80、90、100、110、115、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、140、150、160、170、180或190pM)；
xiv.对U251细胞的EC50，其为约256+/-115pM(例如，约120、140、160、180、200、220、240、260、280、290、300、320、340、360、380、400pM)；
xv.对U251细胞的EC50，其为约80pM至约400pM；
xvi.对C8-S细胞的EC50，其为约115pM；
xvii.对C8-S细胞的EC50，其为约145+/-23.7pM；
xviii.对C8-S细胞的EC50，其为约110pM至约180pM；
xix.至少一个预测的人类药代动力学(PK)参数，其选自：
a.中央室的清除率(CL)，其为约0.12-0.15mL/h/kg；
b.室间分布清除率(CLF)，其为约0.15-0.51mL/h/kg；
c.中央室的分布容积(V1)，其为约36-39mL/kg；
d.周边室的分布容积(V2)，其为约21-33mL/kg；和/或
e.终末半衰期(t1/2)，其为约12天；
f.终末半衰期(t1/2)，其为约15-17天；或
xx.没有与人类Fcγ受体或C1q的可检测到的结合。
E2.实施方案E1所述的经分离的抗体或其抗原结合片段，其中对人类αvβ8整合素的KD低于鼠类抗体ADWA11的KD，例如低于536pM(例如，1、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、370、400、450、500、510、520、530、531、532、533、534或535pM)。
E3.实施方案E1或E2所述的经分离的抗体或其抗原结合片段，其中例如对经纯化的人类αvβ8整合素，对人类αvβ8整合素的KD低于或等于100pM(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90或100pM)。
E4.前述实施方案中任一项所述的经分离的抗体或其抗原结合片段，其中对小鼠αvβ8整合素的KD低于鼠类抗体ADWA11的KD，例如低于489pM(例如，1、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、370、400、450、460、470、480、485、486、487或488pM)。
E5.前述实施方案中任一项所述的经分离的抗体或其抗原结合片段，其中对小鼠αvβ8整合素的KD为约70.8+/-19.9pM。
E6.前述实施方案中任一项所述的经分离的抗体或其抗原结合片段，其中对食蟹猴αvβ8整合素的KD低于鼠类抗体ADWA11的KD，例如低于507pM(例如，1、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、370、400、450、500、501、502、503、504、505或506pM)。
E7.前述实施方案中任一项所述的经分离的抗体或其抗原结合片段，其中对食蟹猴αvβ8整合素的KD低于100pM。
E8.前述实施方案中任一项所述的经分离的抗体或其抗原结合片段，其中对大鼠αvβ8整合素的KD为约160pM。
E9.前述实施方案中任一项所述的经分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述经分离的抗体或其抗原结合片段显示对人类、食蟹猴、小鼠和大鼠αvβ8整合素中的至少两种、三种或所有大致相等的亲和力，例如低于100pM(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、95pM)的KD，例如如使用Biacore亲和力测定法所确定的。
E10.前述实施方案中任一项所述的经分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述经分离的抗体或其抗原结合片段显示对人类、食蟹猴、小鼠和大鼠αvβ8整合素中的至少两种、三种或所有大致相等的亲和力，例如低于100pM(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、95或98pM)的KD，例如如使用Biacore亲和力测定法所确定的。
E11.前述实施方案中任一项所述的经分离的抗体或其抗原结合片段，其中抑制TGFβ反式激活的IC50低于鼠类抗体ADWA11，例如低于183pM(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、175、180、181或182pM)。
E12.前述实施方案中任一项所述的经分离的抗体或其抗原结合片段，其中抑制U251细胞中的TGFβ反式激活的IC50为约199+/-93.6pM。
E13.前述实施方案中任一项所述的经分离的抗体或其抗原结合片段，其中抑制TGFβ反式激活的IC50为约100pM至约300pM。
E14.前述实施方案中任一项所述的经分离的抗体或其抗原结合片段，其中对U251细胞的EC50为约126pM，其中标准偏差为加或减34pM。
E15.前述实施方案中任一项所述的经分离的抗体或其抗原结合片段，其中对U251细胞的EC50为约256pM，其中标准偏差为加或减115pM。
E16.前述实施方案中任一项所述的经分离的抗体或其抗原结合片段，其中对U251细胞的EC50为约100pM至约400pM。
E17.前述实施方案中任一项所述的经分离的抗体或其抗原结合片段，其中对C8-S细胞的EC50为约115pM。
E18.前述实施方案中任一项所述的经分离的抗体或其抗原结合片段，其中对C8-S细胞的EC50为约145+/-23.7pM。
E19.前述实施方案中任一项所述的经分离的抗体或其抗原结合片段，其中对C8-S细胞的EC50为约110pM至约180pM。
E20.前述实施方案中任一项所述的经分离的抗体或其抗原结合片段，其具有至少一个预测的人类药代动力学(PK)参数，其选自由以下各项组成的组：
(i)中央室的清除率(CL)，其为约0.12-0.15mL/h/kg；
(ii)室间分布清除率(CLF)，其为约0.15-0.51mL/h/kg；
(iii)中央室的分布容积(V1)，其为约36-39mL/kg；
(iv)周边室的分布容积(V2)，其为约21-33mL/kg；和/或(v)终末半衰期(t1/2)，其为约12-17天。
E21.前述实施方案中任一项所述的经分离的抗体或其抗原结合片段，其中经分离的抗体或其抗原结合片段显示没有与人类Fcγ受体或C1q的可检测到的结合。
E22.前述实施方案中任一项所述的经分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段进一步具有以下特性中的至少一种：
(i)特异性结合至αvβ8整合素(例如，来自人类、小鼠、食蟹猴和/或大鼠的αvβ8整合素)；
(ii)减少αvβ8整合素与潜伏相关肽(LAP)之间的相互作用；
(iii)减少TGF-β信号传导；
(iv)以IC50≤10nM有效地阻断αvβ8整合素介导的TGFβ活化；
(v)对非人类灵长类(NHP)直系同源物具有相当的Kd(5倍内)；
(vi)选择性结合人类αvβ8，并且不可检测到地结合αvβ8的同源物(例如，αvβ1、αvβ3、αvβ5和αvβ6)；
(vii)单独或与免疫调节剂，例如检查点抑制剂的调节剂，例如PD-1、PD-L1、CTLA-4的抑制剂或刺激分子(例如4-1BB)的激动剂组合，在癌症的动物模型中引起生长抑制和/或完全肿瘤消退；
(viii)与抗癌疗法(例如放射疗法)组合在癌症的动物模型中引起生长抑制和/或完全肿瘤消退；
(ix)例如在单独或与免疫调节剂(例如，PD-1、PD-L1或CTLA-4的抑制剂)组合以≤10mg/kg施用时，在同系肿瘤移植模型中显示肿瘤生长的至少60％的减少；
(x)在向受试者施用时，在一种或多种免疫调节剂，例如检查点抑制剂的拮抗剂，例如PD-1、PD-L1或CTLA-4的拮抗剂或免疫反应的活化剂，例如4-1BB激动剂存在的情况下增加抗肿瘤反应；
(xi)具有不依赖于肿瘤模型中αvβ8整合素的表达的功效；
(xii)增加肿瘤微环境中CD8+GzmB+ T细胞的丰度；
(xiii)在与检查点抑制剂的拮抗剂(例如，抗PD-1或抗PD-L1抗体)组合使用时，例如在鳞状细胞癌、乳腺癌和/或结肠癌的同系模型中显示肿瘤生长的减少，例如至少＞80％的减少；
(xiv)如通过Kaplan-Meier分析所确定的，显示受试者的总存活率的统计学上显著的改善；
(xv)具有高度的热稳定性；
(xvi)显示高浓度下的最少聚集；和
(xvii)可在大规模制备条件下显示可再现表达和纯度。
E23.一种特异性结合至人类αvβ8整合素的经分离的抗体或其抗原结合片段，其包含：
一个、两个或三个来自重链可变区的CDR(例如，H1、H2或H3)，和/或一个、两个或三个来自轻链可变区的CDR(例如，L1、L2或L3)，其选自：
(i)包含SEQ ID NO:8或14的氨基酸序列的CDR-H1，
包含SEQ ID NO:9或15的氨基酸序列的CDR-H2，
包含SEQ ID NO:10或16的氨基酸序列的CDR-H3，
包含SEQ ID NO:11或17的氨基酸序列的CDR-L1，
包含SEQ ID NO:12或18的氨基酸序列的CDR-L2，和
包含SEQ ID NO:13或19的氨基酸序列的CDR-L3，或
(ii)相对于SEQ ID NO:8或14包含至少一个氨基酸改变但不超过两个、三个或四个改变(例如，置换、缺失或插入，例如保守性置换)的CDR-H1，
相对于SEQ ID NO:9或15包含至少一个氨基酸改变但不超过两个、三个或四个改变(例如，置换、缺失或插入，例如保守性置换)的CDR-H2，
相对于SEQ ID NO:10或16包含至少一个氨基酸改变但不超过两个、三个或四个改变(例如，置换、缺失或插入，例如保守性置换)的CDR-H3，
相对于SEQ ID NO:11或17包含至少一个氨基酸改变但不超过两个、三个或四个改变(例如，置换、缺失或插入，例如保守性置换)的CDR-L1，
相对于SEQ ID NO:12或18包含至少一个氨基酸改变但不超过两个、三个或四个改变(例如，置换、缺失或插入，例如保守性置换)的CDR-L2，或
相对于SEQ ID NO:13或19包含至少一个氨基酸改变但不超过两个、三个或四个改变(例如，置换、缺失或插入，例如保守性置换)的CDR-L3，任选地其中：
CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2或CDR-L3中的任一项不包含以下中的任一项的氨基酸序列：
(a)分别为SEQ ID NO:22、23、24、25、26和27，
(b)分别为SEQ ID NO:28、29、30、31、32和33，
(c)分别为SEQ ID NO:22、23、24、71、72和73，或
(d)分别为SEQ ID NO:28、29、30、74、75和76。
可替代地，或与本文所提供的实施方案(例如，E1-E23)中的任一项组合，所述抗体或其抗原结合片段具有以下方面、特点和实施方案中的一种或多种。
E24.一种特异性结合至人类αvβ8整合素的经分离的抗体或其抗原结合片段，其包含：
一个、两个或三个来自重链可变区的CDR(例如，H1、H2或H3)，和/或一个、两个或三个来自轻链可变区的CDR(例如，L1、L2或L3)，其选自：
(i)包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的CDR-H1，
包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的CDR-H2，
包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的CDR-H3，
包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的CDR-L1，
包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的CDR-L2，和
包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR-L3，或
(ii)相对于SEQ ID NO:8包含至少一个氨基酸改变但不超过两个三个或四个改变(例如，置换、缺失或插入，例如保守性置换)的CDR-H1，
相对于SEQ ID NO:9包含至少一个氨基酸改变但不超过两个、三个或四个改变(例如，置换、缺失或插入，例如保守性置换)的CDR-H2，
相对于SEQ ID NO:10包含至少一个氨基酸改变但不超过两个、三个或四个改变(例如，置换、缺失或插入，例如保守性置换)的CDR-H3，
相对于SEQ ID NO:11包含至少一个氨基酸改变但不超过两个、三个或四个改变(例如，置换、缺失或插入，例如保守性置换)的CDR-L1，
相对于SEQ ID NO:12包含至少一个氨基酸改变但不超过两个、三个或四个改变(例如，置换、缺失或插入，例如保守性置换)的CDR-L2，或
相对于SEQ ID NO:13包含至少一个氨基酸改变但不超过两个、三个或四个改变(例如，置换、缺失或插入，例如保守性置换)的CDR-L3，任选地其中：
CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2或CDR-L3中的任一项不包含以下中的任一项的氨基酸序列：
(a)分别为SEQ ID NO:22、23、24、25、26和27，或
(b)分别为SEQ ID NO:22、23、24、71、72和73。
E25.一种特异性结合至人类αvβ8整合素的经分离的抗体或其抗原结合片段，其包含：
一个、两个或三个来自重链可变区的互补决定区(CDR)(例如，H1、H2或H3)，和/或一个、两个或三个来自轻链可变区的CDR(例如，L1、L2或L3)，其选自：
包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的CDR-H2，
包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的CDR-L1，
包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的CDR-L2，和
包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR-L3。
E26.实施方案E24或E25所述的经分离的抗体或其抗原结合片段，其包含：
包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的CDR-H1，
包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的CDR-H2，和
包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的CDR-H3。
E27.实施方案E24至E26中任一项所述的经分离的抗体或其抗原结合片段，其包含：
包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的CDR-L1，
包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的CDR-L2，和
包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR-L3。
E28.一种特异性结合至人类αvβ8整合素的经分离的抗体或其抗原结合片段，其包含：
包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的CDR-H1，
包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的CDR-H2，
包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的CDR-H3，
包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的CDR-L1，
包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的CDR-L2，和
包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR-L3。
E29.一种特异性结合至人类αvβ8整合素的经分离的抗体或其抗原结合片段，其包含一个、两个或三个来自重链可变区的互补决定区(CDR)(例如，H1、H2或H3)，和/或一个、两个或三个来自轻链可变区的CDR(例如，L1、L2或L3)：
包含DYYMN(SEQ ID NO:8)的氨基酸序列的CDR-H1；
包含WIDPDX1GNTIYX2PKFQG(SEQ ID NO:131)的氨基酸序列的CDR-H2，其中X1可以是以下中的任一项：氨基酸、除N以外的氨基酸、N的保守性置换、N或Q；并且X2可以是以下中的任一项：氨基酸、除D以外的氨基酸、D的保守性置换、D或E；
包含RLLMDY(SEQ ID NO:10)的氨基酸序列的CDR-H3；
包含RSTKSLX3HFNGNTYLF(SEQ ID NO:132)的氨基酸序列的CDR-L1，其中X3可以是以下中的任一项：氨基酸、除L以外的氨基酸、L的保守性置换、L或S；
包含YYMSX4LAS(SEQ ID NO:133)的氨基酸序列的CDR-L2，其中X4可以是以下中的任一项：氨基酸、除N以外的氨基酸、N的保守性置换、N或S；和/或
包含X5QSLEYPFT(SEQ ID NO:134)的氨基酸序列的CDR-L3，其中X5可以是以下中的任一项：氨基酸、除M以外的氨基酸、M的保守性置换、M或Q；
例如，其中CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3不包含分别为SEQ IDNO:22、23、24、25、26和27或分别为SEQ ID NO:22、23、24、71、72和73的氨基酸序列。
E30.实施方案E29所述的经分离的抗体或其抗原结合片段，其中X1为Q，并且X2为E。
E31.实施方案E29或E30所述的经分离的抗体或其抗原结合片段，其中X3为S。
E32.实施方案E29至E31中任一项所述的经分离的抗体或其抗原结合片段，其中X4为S。
E33.实施方案E29至E32中任一项所述的经分离的抗体或其抗原结合片段，其中X5为Q。
E34.实施方案E29所述的经分离的抗体或其抗原结合片段，其中X1为Q，X2为E，X3为S，并且X5为Q。
E35.实施方案E29所述的经分离的抗体或其抗原结合片段，其中X1为Q，X2为E，并且X3为S。
E36.实施方案E29所述的经分离的抗体或其抗原结合片段，其中X1为Q，X2为E，X3为S，X4为S，并且X5为Q。
E37.一种特异性结合至人类αvβ8整合素的经分离的抗体或其抗原结合片段，其包含一个、两个或三个来自重链可变区的互补决定区(CDR)(例如，H1、H2或H3)，和/或一个、两个或三个来自轻链可变区的CDR(例如，L1、L2或L3)：
包含DYYMN(SEQ ID NO:8)的氨基酸序列的CDR-H1；
包含WIDPDX1GX2TIYX3X4X5X6X7G(SEQ ID NO:167)的氨基酸序列的CDR-H2，其中X1可以是以下中的任一项：氨基酸、除N以外的氨基酸、N的保守性置换、N或Q；X2可以是以下中的任一项：氨基酸、除N以外的氨基酸、N的保守性置换、N或Q；X3可以是以下中的任一项：氨基酸、除D以外的氨基酸、D的保守性置换、D或E；X4可以是以下中的任一项：氨基酸、除P以外的氨基酸、P的保守性置换、P、Q、D或A；X5可以是以下中的任一项：氨基酸、除K以外的氨基酸、K的保守性置换、K、S或A；X6可以是以下中的任一项：氨基酸、除F以外的氨基酸、F的保守性置换、F或V；并且X7可以是以下中的任一项：氨基酸、除Q以外的氨基酸、Q的保守性置换、Q或K；
包含RLLMDY(SEQ ID NO:10)的氨基酸序列的CDR-H3；
包含RSTKSX8X9HFNGNX10YLF(SEQ ID NO:168)的氨基酸序列的CDR-L1，其中X8可以是以下中的任一项：氨基酸、除L以外的氨基酸、L的保守性置换、L或I；X9可以是以下中的任一项：氨基酸、除L以外的氨基酸、L的保守性置换、L或S；并且X10可以是以下中的任一项：氨基酸、除T以外的氨基酸、T的保守性置换、T或S；
包含YX11X12SX13LX14S(SEQ ID NO:169)的氨基酸序列的CDR-L2，其中X11可以是以下中的任一项：氨基酸、除Y以外的氨基酸、Y的保守性置换、Y或A；X12可以是以下中的任一项：氨基酸、除M以外的氨基酸、M的保守性置换、M或A；X13可以是以下中的任一项：氨基酸、除N以外的氨基酸、N的保守性置换、N或S；并且X14可以是以下中的任一项：氨基酸、除A外的氨基酸、A的保守性置换、A或Q；和/或
包含X15QSX16X17X18PX19T(SEQ ID NO:170)的氨基酸序列的CDR-L3，其中X15可以是以下中的任一项：氨基酸、除M以外的氨基酸、M的保守性置换、M或Q；X16可以是以下中的任一项：氨基酸、除L以外的氨基酸、L的保守性置换、L或Y；X17可以是以下中的任一项：氨基酸、除E以外的氨基酸、E的保守性置换、E或S；X18可以是以下中的任一项：氨基酸、除Y以外的氨基酸、Y的保守性置换、Y或T；并且X19可以是以下中的任一项：氨基酸、除F以外的氨基酸、F的保守性置换、F、L或W；
例如，其中CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3不包含分别为SEQ IDNO:22、23、24、25、26和27或分别为SEQ ID NO:22、23、24、71、72和73的氨基酸序列，任选地其中：
X1为Q，X2为N，X3为E，X4为P，X5为K，X6为F，并且X7为Q，
X8为L，X9为S，并且X10为T，
X11为Y，X12为M，X13为S，并且X14为A，和/或
X15为Q，X16为L，X17为E，X18为Y，并且X19为F。
E38.一种特异性结合至人类αvβ8整合素的经分离的抗体或其抗原结合片段，其包含一个、两个或三个来自重链可变区的互补决定区(CDR)(例如，H1、H2或H3)，和/或一个、两个或三个来自轻链可变区的CDR(例如，L1、L2或L3)：
包含DYYMN(SEQ ID NO:8)的氨基酸序列的CDR-H1；
包含WIDPDX1GNTIYX2PKX3QG(SEQ ID NO:171)的氨基酸序列的CDR-H2，其中X1可以是以下中的任一项：氨基酸、除N以外的氨基酸、N的保守性置换、N或Q；X2可以是以下中的任一项：氨基酸、除D以外的氨基酸、D的保守性置换、D或E；并且X3可以是以下中的任一项：氨基酸、除F以外的氨基酸、F的保守性置换、F或V；
包含RLLMDY(SEQ ID NO:10)的氨基酸序列的CDR-H3；
包含RSTKSLX4HFNGNTYLF(SEQ ID NO:172)的氨基酸序列的CDR-L1，其中X4可以是以下中的任一项：氨基酸、除L以外的氨基酸、L的保守性置换、L或S；
包含YYX5SX6LAS(SEQ ID NO:173)的氨基酸序列的CDR-L2，其中X5可以是以下中的任一项：氨基酸、除M以外的氨基酸、M的保守性置换、M或A；并且X6可以是以下中的任一项：氨基酸、除N以外的氨基酸、N的保守性置换、N或S；和/或
包含X7QSX8EYPFT(SEQ ID NO:174)的氨基酸序列的CDR-L3，其中X7可以是以下中的任一项：氨基酸、除M以外的氨基酸、M的保守性置换、M或Q；并且X8可以是以下中的任一项：氨基酸、除L以外的氨基酸、L的保守性置换、L或Y；
例如，其中CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3不包含分别为SEQ IDNO:22、23、24、25、26和27或分别为SEQ ID NO:22、23、24、71、72和73的氨基酸序列，任选地其中：
X1为Q，X2为E，并且X3为F，
X4为S，
X5为M并且X6为S，和/或
X7为Q并且X8为L。
E39.一种特异性结合至人类αvβ8整合素的经分离的抗体或其抗原结合片段，其包含一个、两个或三个来自包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的VH区的CDR序列，其中CDR序列如根据Kabat所定义的。
E40.一种特异性结合至人类αvβ8整合素的经分离的抗体或其抗原结合片段，其包含一个、两个或三个来自包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的VL区的CDR序列，其中CDR序列如根据Kabat所定义的。
E41.一种特异性结合至人类αvβ8整合素的经分离的抗体或其抗原结合片段，其包含一个、两个或三个来自包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的VH区的CDR序列和一个、两个或三个来自包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的VL区的CDR-L1序列，其中CDR序列如根据Kabat所定义的。
E42.一种特异性结合至人类αvβ8整合素的经分离的抗体或其抗原结合片段，其包含一个、两个或三个来自由SEQ ID NO:189、190或191的核酸序列编码的多肽的CDR序列，其中CDR序列如根据Kabat所定义的。
E43.一种特异性结合至人类αvβ8整合素的经分离的抗体或其抗原结合片段，其包含一个、两个或三个来自由SEQ ID NO:185或186的核酸序列编码的多肽的CDR序列，其中CDR序列如根据Kabat所定义的。
E44.一种特异性结合至人类αvβ8整合素的经分离的抗体或其抗原结合片段，其包含一个、两个或三个来自由SEQ ID NO:189、190或191的核酸序列编码的多肽的CDR序列和一个、两个或三个来自由SEQ ID NO:185或186的核酸序列编码的多肽的CDR序列，其中CDR序列如根据Kabat所定义的。
E45.一种特异性结合至人类αvβ8整合素的经分离的抗体或其抗原结合片段，其包含一个或多个选自以下的互补决定区(CDR)：
(i)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CDR-H1，
包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDR-H2，
包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR-H3，
包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的CDR-L1，
包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的CDR-L2，和
包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的CDR-L3；或
(ii)相对于SEQ ID NO:14包含至少一个氨基酸改变但不超过两个、三个或四个改变(例如，置换、缺失或插入，例如保守性置换)的CDR-H1，
相对于SEQ ID NO:15包含至少一个氨基酸改变但不超过两个、三个或四个改变(例如，置换、缺失或插入，例如保守性置换)的CDR-H2，
相对于SEQ ID NO:16包含至少一个氨基酸改变但不超过两个、三个或四个改变(例如，置换、缺失或插入，例如保守性置换)的CDR-H3，
相对于SEQ ID NO:17包含至少一个氨基酸改变但不超过两个、三个或四个改变(例如，置换、缺失或插入，例如保守性置换)的CDR-L1，
相对于SEQ ID NO:18包含至少一个氨基酸改变但不超过两个、三个或四个改变(例如，置换、缺失或插入，例如保守性置换)的CDR-L2，或
相对于SEQ ID NO:19包含至少一个氨基酸改变但不超过两个、三个或四个改变(例如，置换、缺失或插入，例如保守性置换)的CDR-L3，任选地其中：
CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2或CDR-L3中的任一项不包含以下中的任一项的氨基酸序列：
(a)分别为SEQ ID NO:28、29、30、31、32和33，或
(b)分别为SEQ ID NO:28、29、30、74、75和76。
E46.一种特异性结合至人类αvβ8整合素的经分离的抗体或其抗原结合片段，其包含一个或多个选自以下的互补决定区(CDR)：
包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDR-H2，
包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的CDR-L1，和
包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的CDR-L2。
E47.实施方案E45或E46所述的经分离的抗体或其抗原结合片段，其包含：
包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CDR-H1，
包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDR-H2，和
包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR-H3。
E48.实施方案E45至E47中任一项所述的经分离的抗体或其抗原结合片段，其包含：
包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的CDR-L1，
包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的CDR-L2，和
包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的CDR-L3。
E49.一种特异性结合至人类αvβ8整合素的经分离的抗体或其抗原结合片段，其包含：
包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CDR-H1，
包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDR-H2，
包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR-H3，
包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的CDR-L1，
包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的CDR-L2，和
包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的CDR-L3。
E50.一种特异性结合至人类αvβ8整合素的经分离的抗体或其抗原结合片段，其包含：
包含GFNIKDYYMN(SEQ ID NO:14)的氨基酸序列的CDR-H1；
包含WIDPDX1GN(SEQ ID NO:135)的氨基酸序列的CDR-H2，其中X1可以是以下中的任一项：氨基酸、除N以外的氨基酸、N的保守性置换、N或Q；
包含RLLMDY(SEQ ID NO:16)的氨基酸序列的CDR-H3；
包含STKSLX2HFNGNTYL(SEQ ID NO:136)的氨基酸序列的CDR-L1，其中X2可以是以下中的任一项：氨基酸、除L以外的氨基酸、L的保守性置换、L或S；
包含YYMSX3(SEQ ID NO:137)的氨基酸序列的CDR-L2，其中X3可以是以下中的任一项：氨基酸、除N以外的氨基酸、N的保守性置换、N或S；和
包含QSLEYPFT(SEQ ID NO:19)的氨基酸序列的CDR-L3；
例如，其中CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3不包含分别为SEQ IDNO:28、29、30、31、32和33或分别为SEQ ID NO:28、29、30、74、75和76的氨基酸序列。
E51.实施方案E50所述的经分离的抗体或其抗原结合片段，其中X1为Q，X2为S，并且X3为S。
E52.一种特异性结合至人类αvβ8整合素的经分离的抗体或其抗原结合片段，其包含：
包含GFNIX1DYYMN(SEQ ID NO:175)的氨基酸序列的CDR-H1，其中X1可以是以下中的任一项：氨基酸、除K以外的氨基酸、K的保守性置换、K或A；
包含WIDPDX2GX3(SEQ ID NO:176)的氨基酸序列的CDR-H2，其中X2可以是以下中的任一项：氨基酸、除N以外的氨基酸、N的保守性置换、N或Q；并且X3可以是以下中的任一项：氨基酸、除N以外的氨基酸、N的保守性置换、N或Q；
包含RLLMDY(SEQ ID NO:16)的氨基酸序列的CDR-H3；
包含STKSX4X5HFNGNX6YL(SEQ ID NO:177)的氨基酸序列的CDR-L1，其中X4可以是以下中的任一项：氨基酸、除L以外的氨基酸、L的保守性置换、L或I；X5可以是以下中的任一项：氨基酸、除L以外的氨基酸、L的保守性置换、L或S；并且X6可以是以下中的任一项：氨基酸、除T以外的氨基酸、T的保守性置换、T或S；
包含YX7X8SX9(SEQ ID NO:178)的氨基酸序列的CDR-L2，其中X7可以是以下中的任一项：氨基酸、除Y以外的氨基酸、Y的保守性置换、Y或A；X8可以是以下中的任一项：氨基酸、除M以外的氨基酸、M的保守性置换、M或A；并且X9可以是以下中的任一项：氨基酸、除N以外的氨基酸、N的保守性置换、N或S；和
包含QSX10X11X12PX13T(SEQ ID NO:197)的氨基酸序列的CDR-L3，其中X10可以是以下中的任一项：氨基酸、除L以外的氨基酸、L的保守性置换、L或Y；X11可以是以下中的任一项：氨基酸、除E以外的氨基酸、E的保守性置换、E或S；X12可以是以下中的任一项：氨基酸、除Y以外的氨基酸、Y的保守性置换、Y或T；并且X13可以是以下中的任一项：氨基酸、除F以外的氨基酸、F的保守性置换、F、L或W；
例如，其中CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3不包含分别为SEQ IDNO:28、29、30、31、32和33或分别为SEQ ID NO:28、29、30、74、75和76的氨基酸序列，任选地其中：
X1为Q，X2为N，X3为E，X4为P，X5为K，X6为F，并且X7为Q，
X8为L，X9为S，并且X10为T,
X11为Y，X12为M，X13为S，并且X14为A，和/或
X15为Q，X16为L，X17为E，X18为Y，并且X19为F。
E53.一种特异性结合至人类αvβ8整合素的经分离的抗体或其抗原结合片段，其包含：
包含GFNIKDYYMN(SEQ ID NO:14)的氨基酸序列的CDR-H1；
包含WIDPDX1GN(SEQ ID NO:135)的氨基酸序列的CDR-H2，其中X1可以是以下中的任一项：氨基酸、除N以外的氨基酸、N的保守性置换、N或Q；
包含RLLMDY(SEQ ID NO:16)的氨基酸序列的CDR-H3；
包含STKSLX2HFNGNTYL(SEQ ID NO:136)的氨基酸序列的CDR-L1，其中X2可以是以下中的任一项：氨基酸、除L以外的氨基酸、L的保守性置换、L或S；
包含YYX3SX4(SEQ ID NO:179)的氨基酸序列的CDR-L2，其中X3可以是以下中的任一项：氨基酸、除M以外的氨基酸、M的保守性置换、M或A；并且X4可以是以下中的任一项：氨基酸、除N以外的氨基酸、N的保守性置换、N或S；和
包含QSX5EYPFT(SEQ ID NO:180)的氨基酸序列的CDR-L3，其中X5可以是以下中的任一项：氨基酸、除L以外的氨基酸、L的保守性置换、L或Y；
例如，其中CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3不包含分别为SEQ IDNO:28、29、30、31、32和33或分别为SEQ ID NO:28、29、30、74、75和76的氨基酸序列，任选地其中：
X1为Q，
X2为S，
X3为M并且X4为S，和/或
X5为L。
E54.一种特异性结合至人类αvβ8整合素的经分离的抗体或其抗原结合片段，其包含一个、两个或三个来自包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的VH区的CDR序列，其中CDR序列如根据Chothia所定义的。
E55.一种特异性结合至人类αvβ8整合素的经分离的抗体或其抗原结合片段，其包含一个、两个或三个来自包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的VL区的CDR序列，其中CDR序列如根据Chothia所定义的。
E56.一种特异性结合至人类αvβ8整合素的经分离的抗体或其抗原结合片段，其包含一个、两个或三个来自包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的VH区的CDR序列和一个、两个或三个来自包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的VL区的CDR-L1序列，其中CDR序列如根据Chothia所定义的。
E57.一种特异性结合至人类αvβ8整合素的经分离的抗体或其抗原结合片段，其包含一个、两个或三个来自由SEQ ID NO:189、190或191的核酸序列编码的多肽的CDR序列，其中CDR序列如根据Chothia所定义的。
E58.一种特异性结合至人类αvβ8整合素的经分离的抗体或其抗原结合片段，其包含一个、两个或三个来自由SEQ ID NO:185或186的核酸序列编码的多肽的CDR序列，其中CDR序列如根据Chothia所定义的。
E59.一种特异性结合至人类αvβ8整合素的经分离的抗体或其抗原结合片段，其包含一个、两个或三个来自由SEQ ID NO:189、190或191的核酸序列编码的多肽的CDR序列和一个、两个或三个来自由SEQ ID NO:185、186的核酸序列编码的多肽的CDR序列，其中CDR序列如根据Chothia所定义的。
E60.前述实施方案中任一项所述的经分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含VH框架区(例如，FR1、FR2、FR3或FR4中的一种、两种、三种或四种)，所述VH框架区包含与VH区的VH框架区具有至少80％、85％、87％、90％、92％、93％、95％、97％、98％或优选100％序列同一性的氨基酸序列，所述VH区包含SEQ ID NO:6、34-46、88-91或93中的任一项的氨基酸序列。
E61.前述实施方案中任一项所述的经分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含VL框架区(例如，FR1、FR2、FR3或FR4中的一种、两种、三种或四种)，所述VL框架区包含与VL区的VL框架区具有至少80％、85％、87％、90％、92％、93％、95％、97％、98％或优选100％序列同一性的氨基酸序列，所述VL区包含SEQ ID NO:7、47-69或92中的任一项的氨基酸序列。
E62.前述实施方案中任一项所述的经分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含VH框架区(例如，FR1、FR2、FR3或FR4中的一种、两种、三种或四种)，所述VH框架区包含与IGHV3-07、IGHV1-46、IGHV3-23、IGHV3-30、IGHV1-69或IGHV3-48的种系氨基酸序列具有至少80％、85％、87％、90％、92％、93％、95％、97％、98％或100％序列同一性的氨基酸序列。
E63.前述实施方案中任一项所述的经分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含VL框架区(例如，FR1、FR2、FR3或FR4中的一种、两种、三种或四种)，所述VL框架区包含与IGKV1-39、IGKV2-28、IGKV2-30、IGKV4-1或IGKV3-11的种系氨基酸序列具有至少80％、85％、87％、90％、92％、93％、95％、97％、98％或100％序列同一性的氨基酸序列。
E64.前述实施方案中任一项所述的经分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含VH框架区(例如，FR1、FR2、FR3或FR4中的一种、两种、三种或四种)，所述VH框架区包含相对于VH区的VH框架区包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22或23个置换的氨基酸序列，所述VH区包含SEQ ID NO:6、34-46、88-91或93中的任一项的氨基酸序列。
E65.前述实施方案中任一项所述的经分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含VL框架区(例如，FR1、FR2、FR3或FR4中的一种、两种、三种或四种)，所述VL框架区包含相对于VL区的VL框架区包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22或23个置换的氨基酸序列，所述VL区包含SEQ ID NO:7、47-69或92中的任一项的氨基酸序列。
E66.前述实施方案中任一项所述的经分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含VH框架区(例如，FR1、FR2、FR3或FR4中的一种、两种、三种或四种)，所述VH框架区包含相对于IGHV3-07、IGHV1-46、IGHV3-23、IGHV3-30、IGHV1-69或IGHV3-48的种系氨基酸序列包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22或23个置换的氨基酸序列。
E67.前述实施方案中任一项所述的经分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含VL框架区(例如，FR1、FR2、FR3或FR4中的一种、两种、三种或四种)，所述VL框架区包含相对于IGKV1-39、IGKV2-28、IGKV2-30、IGKV4-1或IGKV3-11的种系氨基酸序列包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22或23个置换的氨基酸序列。
E68.前述实施方案中任一项所述的经分离的抗体或其抗原结合片段，其包含含有一个或多个选自E233、E318、K320和R322的位置处的置换(例如，E233P、E318A、K320A和R322A)的鼠类IgG1 Fc区，例如，其中如根据Eu编号方案(参见例如美国专利号5,624,821)编号，所述鼠类IgG1 Fc区包含E233P、E318A、K320A和R322A置换中的一种或多种。
E69.前述实施方案中任一项所述的经分离的抗体或其抗原结合片段，其包含含有一个或多个选自L234、L235和G237的位置处的置换(例如，L234A、L235A和G237A)的人类IgG1 Fc区，例如，其中如根据Eu编号方案编号，人类IgG1 Fc区包含L234A、L235A和G237A置换中的一种或多种。
E70.前述实施方案中任一项所述的经分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体进一步包含VH区，所述VH区包含IGHV3-07、IGHV1-46、IGHV3-23、IGHV3-30、IGHV1-69或IGHV3-48的种系VH氨基酸序列的变体，其中如根据SEQ ID NO:127的氨基酸序列编号，VH区包含一个或多个位置T28、F29、A49、R72、N74、A75和/或L79处的置换(例如，一个或多个选自T28N、F29I、A49G、R72A、N74T、A75S和L79A的置换)，任选地其中VH区包含以下置换：
(i)T28N和F29I；
(ii)T28N、F29I和R72A；
(iii)T28N、F29I、R72A、A49G和L79A；
(iv)T28N、F29I、R72A、N74T和A75S；或
(v)T28N、F29I、R72A、A49G、L79A、N74T和A75S，
其中(i)-(v)如根据SEQ ID NO:127的氨基酸序列编号，任选地其中：
根据SEQ ID NO:127的氨基酸序列编号，VH区包含置换T28N、F29I、R72A、A49G、L79A、N74T和A75S。
E71.前述实施方案中任一项所述的经分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体进一步包含VH区，其包含以下中的一个或多个(例如，2、3、4、5、6个或所有)：
(a)位置28处的Asn，
(b)位置29处的Ile，
(c)位置49处的Gly，
(d)位置72处的Ala，
(e)位置74处的Thr，
(f)位置75处的Ser，和
(g)位置79处的Ala，其根据SEQ ID NO:127的氨基酸序列编号，任选地其中VH区包含：
(i)位置28处的Asn和位置29处的Ile；
(ii)位置28处的Asn、位置29处的Ile和位置72处的Ala；
(iii)位置28处的Asn、位置29处的Ile、位置72处的Ala、位置49处的Gly和位置79处的Ala；
(iv)位置28处的Asn、位置29处的Ile、位置72处的Ala、位置74处的Thr和位置75处的Ser；或
(v)位置28处的Asn、位置29处的Ile、位置721处的Ala、位置49处的Gly、位置79处的Ala、位置74处的Thr和位置75处的Ser，其根据SEQ ID NO:127的氨基酸序列编号，任选地其中：
根据SEQ ID NO:127的氨基酸序列编号，VH区包含位置28处的Asn、位置29处的Ile、位置72处的Ala、位置49处的Gly、位置79处的Ala、位置743处的Thr和位置75处的Ser。
E72.前述实施方案中任一项所述的经分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体进一步包含VL区，其包含IGKV1-39、IGKV2-28、IGKV2-30、IGKV4-1或IGKV3-11的种系VL氨基酸序列的变体，其中如根据SEQ ID NO:128的氨基酸序列编号，VH区包含一个或多个位置Y36和/或L46处的置换(例如，Y36F和/或L46R)，任选地其中VL区包含以下置换：
(i)L46R；或
(ii)L46R和Y36F，
其中(i)-(v)如根据SEQ ID NO:128的氨基酸序列编号，任选地其中根据SEQ IDNO:128的氨基酸序列编号，VL区包含置换L46R。
E73.前述实施方案中任一项所述的经分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体进一步包含含有以下中的一个或两个的VL区：
(a)位置36处的Tyr，和
(b)位置46处的Leu，其根据SEQ ID NO:128的氨基酸序列编号，任选地其中VL区包含：
(i)位置46处的Leu；或
(ii)位置46处的Leu和位置36处的Tyr，其根据SEQ ID NO:128的氨基酸序列编号，任选地其中：
根据SEQ ID NO:128的氨基酸序列编号，VL区包含位置46处的Leu。
E74.一种特异性结合至人类αvβ8整合素的经分离的抗体或其抗原结合片段，其包含一个或多个前述实施方案中任一项所述的CDR，其中一个或多个CDR包含至少一个氨基酸改变但不超过两个、三个或四个改变(例如，置换、缺失或插入，例如保守性置换)；其中CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3不包含分别为SEQ ID NO:22、23、24、25、26和27、分别为SEQ ID NO:22、23、24、71、72和73、分别为SEQ ID NO:28、29、30、31、32和33或分别为SEQ ID NO:28、29、30、74、75和76的氨基酸序列。
E75.前述实施方案中任一项所述的经分离的抗体或其抗原结合片段，其进一步包含含有表1中所阐述的氨基酸序列的VH区。
E76.前述实施方案中任一项所述的经分离的抗体或其抗原结合片段，其进一步包含含有表1中所阐述的氨基酸序列的VL区。
E77.前述实施方案中任一项所述的经分离的抗体或其抗原结合片段，其包含含有与SEQ ID NO:6、34-46、88-91或93中的任一项具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的VH区。
E78.实施方案E77所述的经分离的抗体或其抗原结合片段，其包含含有SEQ IDNO:6的氨基酸序列的VH区。
E79.前述实施方案中任一项所述的经分离的抗体或其抗原结合片段，其包含含有与SEQ ID NO:7、47-69或92中的任一项具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的VL区。
E80.实施方案E79所述的经分离的抗体或其抗原结合片段，其包含与SEQ ID NO:7的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性(例如，100％)的VL区。
E81.一种特异性结合至人类αvβ8整合素的经分离的抗体或其抗原结合片段，其包含含有与SEQ ID NO:6、34-46、88-91或93中的任一项具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的VH区。
E82.实施方案E81所述的经分离的抗体或其抗原结合片段，其包含与SEQ ID NO:6的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性(例如，100％)的VH区。
E83.实施方案E81或E82所述的经分离的抗体或其抗原结合片段，其进一步包含与SEQ ID NO:7的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性(例如，100％)的VL区。
E84.实施方案E81所述的经分离的抗体或其抗原结合片段，其包含含有SEQ IDNO:6的氨基酸序列的VH区。
E85.实施方案E84所述的经分离的抗体或其抗原结合片段，其包含含有SEQ IDNO:7的氨基酸序列的VL区。
E86.一种特异性结合至人类αvβ8整合素的经分离的抗体或其抗原结合片段，其包含含有与SEQ ID NO:7、47-69或92中的任一项具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的VL区。
E87.实施方案E86所述的经分离的抗体或其抗原结合片段，其包含与SEQ ID NO:7的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性(例如，100％)的VL区。
E88.实施方案E86或E87所述的经分离的抗体或其抗原结合片段，其进一步包含与SEQ ID NO:6的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性(例如，100％)的VH区。
E89.实施方案E86所述的经分离的抗体或其抗原结合片段，其包含含有选自SEQID NO:7、47-69或92的氨基酸序列的VL区。
E90.一种特异性结合至人类αvβ8整合素的经分离的抗体或其抗原结合片段，其包含含有SEQ ID NO:39的氨基酸序列的VH区，其中根据SEQ ID NO:39编号，一个或多个所述SEQ ID NO:39的氨基酸残基包含一个或多个选自K30A、N55Q、N57Q、D61E、P62A、K63A和F64V的氨基酸置换。
E91.一种特异性结合至人类αvβ8整合素的经分离的抗体或其抗原结合片段，其包含含有以下中的至少一种的VH区：
(a)位置30处的Ala
(b)位置55处的Gln，
(c)位置57处的Gln，
(d)位置61处的Glu，
(e)位置62处的Ala，
(f)位置63处的Ala，和
(g)位置64处的Val，其根据SEQ ID NO:39编号。
E92.实施方案E90所述的经分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述SEQ ID NO:39包含：
(i)N55Q和D61E；或
(ii)N55Q、D61E和F64V，其根据SEQ ID NO:39编号，任选地其中根据SEQ ID NO:39编号，所述SEQ ID NO:39包含N55Q和D61E置换。
E93.实施方案E91所述的经分离的抗体或其抗原结合片段，其中VH区包含：
(i)位置55处的Gln和位置61处的Glu；或
(ii)位置55处的Gln、位置61处的Glu和位置64处的Val，其根据SEQ ID NO:39编号，任选地其中根据SEQ ID NO:39编号，VH区包含位置55处的Gln和位置61处的Glu。
E94.实施方案E90或E92所述的经分离的抗体或其抗原结合片段，其进一步包含含有SEQ ID NO:47的氨基酸序列的VL区，其中根据SEQ ID NO:47编号，一个或多个所述SEQID NO:47的氨基酸残基包含一个或多个选自L30S、Y55A、M56A、N58S、A60Q、M94Q、L97Y、F101L、F101W和Q105G或其任何组合的氨基酸置换，任选地其中一个或多个所述SEQ ID NO:47的氨基酸残基包含一个或多个选自L30S、M56A、N58S、M94Q、L97Y和Q105G的氨基酸置换。
E95.实施方案E91或E93所述的经分离的抗体或其抗原结合片段，其进一步包含含有以下中的至少一种的VL区：
(a)位置30处的Ser，
(b)位置55处的Ala，
(c)位置56处的Ala，
(d)位置58处的Ser，
(e)位置60处的Gln，
(f)位置94处的Gln，
(g)位置97处的Tyr，
(h)位置101处的Leu，
(i)位置101处的Trp，和
(j)位置105处的Gly，其根据SEQ ID NO:47编号，任选地其中VL区包含以下中的至少一种：
(a)位置30处的Ser，
(b)位置56处的Ala，
(c)位置58处的Ser，
(d)位置94处的Gln，
(e)位置97处的Tyr，和
(f)位置105处的Gly。
E96.实施方案E94所述的经分离的抗体或其抗原结合片段，其中根据SEQ ID NO:47编号，所述SEQ ID NO:47包含L30S、M56A、N58S、M94Q、L97Y和/或Q105G置换。
E97.实施方案E95所述的经分离的抗体或其抗原结合片段，其中根据SEQ ID NO:47编号，VL区包含位置30处的Ser、位置56处的Ala、位置58处的Ser、位置94处的Gln、位置97处的Tyr和/或位置105处的Gly。
E98.实施方案E94所述的经分离的抗体或其抗原结合片段，其中根据SEQ ID NO:47编号，所述SEQ ID NO:47包含L30S、N58S、M94Q和/或Q105G置换，任选地其中所述SEQ IDNO:47包含L30S、N58S、M94Q和Q105G置换中的所有。
E99.实施方案E95所述的经分离的抗体或其抗原结合片段，其中根据SEQ ID NO:47编号，VL区包含位置30处的Ser、位置58处的Ser、位置94处的Gln和/或位置105处的Gly，任选地其中VL区包含以下中的所有：位置30处的Ser、位置58处的Ser、位置94处的Gln和位置105处的Gly。
E100.实施方案E94所述的经分离的抗体或其抗原结合片段，其中根据SEQ ID NO:39编号，所述SEQ ID NO:39包含N55Q和D61E置换，并且根据SEQ ID NO:47编号，所述SEQ IDNO:47包含L30S、N58S、M94Q和Q105G置换。
E101.实施方案E95所述的经分离的抗体或其抗原结合片段，其中根据SEQ ID NO:39编号，VH区包含位置55处的Gln和位置61处的Glu，并且根据SEQ ID NO:47编号，VL区包含位置30处的Ser、位置58处的Ser、位置94处的Gln和位置105处的Gly。
E102.一种特异性结合至人类αvβ8整合素的经分离的抗体或其抗原结合片段，其包含含有SEQ ID NO:47的氨基酸序列的VL区，其中根据SEQ ID NO:47编号，一个或多个所述SEQ ID NO:47的氨基酸残基包含一个或多个选自L30S、Y55A、M56A、N58S、A60Q、M94Q、L97Y、F101L、F101W和Q105G或其任何组合(例如，L30S、M56A、N58S、M94Q、L97Y和Q105G中的所有)的氨基酸置换，任选地其中一个或多个所述SEQ ID NO:47的氨基酸残基包含一个或多个选自L30S、M56A、N58S、M94Q、L97Y和Q105G的氨基酸置换。
E103.实施方案E102所述的经分离的抗体或其抗原结合片段，其中根据SEQ IDNO:47编号，所述SEQ ID NO:47包含L30S、N58S、M94Q和/或Q105G置换。
E104.实施方案E102所述的经分离的抗体或其抗原结合片段，其进一步包含含有SEQ ID NO:39的氨基酸序列的VH区，其中根据SEQ ID NO:39编号，SEQ ID NO:39的序列包含一个或多个选自K30A、N55Q、N57Q、D61E、P62A、K63A和F64V或其任何组合的氨基酸置换。
E105.实施方案E104所述的经分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述SEQ IDNO:39包含N55Q和D61E置换。
E106.前述实施方案中任一项所述的经分离的抗体或其抗原结合片段，其包含含有与SEQ ID NO:2或3具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的重链。
E107.前述实施方案中任一项所述的经分离的抗体或其抗原结合片段，其进一步包含含有与SEQ ID NO:5具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的轻链。
E108.一种特异性结合至人类αvβ8整合素的经分离的抗体或其抗原结合片段，其包含含有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的轻链可变区。
E109.一种特异性结合至人类αvβ8整合素的经分离的抗体或其抗原结合片段，其包含含有SEQ ID NO:2或3的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的轻链。
E110.一种特异性结合至人类αvβ8整合素的经分离的抗体或其抗原结合片段，其包含：
(a)含有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的轻链和
(b)含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的重链，其有或无C端赖氨酸残基。
E111.一种特异性结合至人类αvβ8整合素的经分离的抗体或其抗原结合片段，其包含含有由保藏于ATCC并且具有保藏编号PTA-124917的质粒的插入序列编码的氨基酸序列的重链、含有由保藏于ATCC并且具有保藏编号PTA-124918的质粒的插入序列编码的氨基酸序列的轻链或两者。
E112.一种特异性结合至人类αvβ8整合素的经分离的抗体或其抗原结合片段，其包含含有与SEQ ID NO:2或3具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％(例如，100％)序列同一性的氨基酸序列的重链，任选地其中重链包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列。
E113.一种特异性结合至人类αvβ8整合素的经分离的抗体或其抗原结合片段，其包含含有与SEQ ID NO:5具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％(例如，100％)序列同一性的氨基酸序列的轻链，任选地其中轻链包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列，任选地其中经分离的抗体或其抗原结合片段进一步包含含有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的重链。
E114.一种特异性结合至人类αvβ8整合素的经分离的抗体或其抗原结合片段，其包含含有包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的重链和包含含有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的轻链。
E115.一种特异性结合至人类αvβ8整合素的经分离的抗体或其抗原结合片段，其包含含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的重链和包含含有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的轻链。
E116.一种特异性结合至人类αvβ8整合素的经分离的抗体或其抗原结合片段，其包含：
包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的CDR-H1，
包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列的CDR-H2，
包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列的CDR-H3，
包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列的CDR-L1，
包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列的CDR-L2，和
包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列的CDR-L3；并且
其中所述抗体进一步包含VH框架区(例如，FR1、FR2、FR3或FR4中的一种、两种、三种或所有四种)，其包含与包含SEQ ID NO:6、34-46、88-91或93中的任一项的氨基酸序列的VH区的VH框架区具有至少80％、85％、87％、90％、92％、93％、95％、97％、98％或优选100％序列同一性的氨基酸序列，或具有至少一个但少于二十个改变，例如整个VH框架区(包括FR1、FR2、FR3和FR4)的氨基酸序列的氨基酸置换或缺失的氨基酸序列。
E117.一种特异性结合至人类αvβ8整合素的经分离的抗体或其抗原结合片段，其包含：
包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的CDR-H1，
包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列的CDR-H2，
包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列的CDR-H3，
包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列的CDR-L1，
包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列的CDR-L2，和
包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列的CDR-L3；并且
其中所述抗体进一步包含VL框架区(例如，FR1、FR2、FR3或FR4)，其包含与包含SEQID NO:7、47-69或92中的任一项的氨基酸序列的VL区的VL框架区具有至少80％、85％、87％、90％、92％、93％、95％、97％、98％或优选100％序列同一性的氨基酸序列，或具有至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、十个、十五个但少于二十个改变，例如整个VL框架区(包括FR1、FR2、FR3和FR4)的氨基酸序列的氨基酸置换或缺失的氨基酸序列。
E118.一种特异性结合至人类αvβ8整合素的经分离的抗体或其抗原结合片段，其包含：
包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的CDR-H1，
包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列的CDR-H2，
包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列的CDR-H3，
包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列的CDR-L1，
包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列的CDR-L2，和
包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列的CDR-L3；并且
其中所述抗体包含VH框架区(例如，FR1、FR2、FR3或FR4)，其包含与IGHV3-07、IGHV1-46、IGHV3-23、IGHV3-30、IGHV1-69或IGHV3-48的种系氨基酸序列内的VH框架区具有至少80％、85％、87％、90％、92％、93％、95％、97％、98％或100％序列同一性的氨基酸序列，或具有至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、十个、十五个但少于二十个改变，例如整个VH框架区(包括FR1、FR2、FR3和FR4)的氨基酸序列的氨基酸置换或缺失的氨基酸序列。
E119.一种特异性结合至人类αvβ8整合素的经分离的抗体或其抗原结合片段，其包含：
包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的CDR-H1,
包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列的CDR-H2,
包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列的CDR-H3,
包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列的CDR-L1,
包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列的CDR-L2，和
包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列的CDR-L3；并且
其中所述抗体包含VH区，其包含IGHV3-07、IGHV1-46、IGHV3-23、IGHV3-30、IGHV1-69或IGHV3-48的种系VH氨基酸序列的变体，其中如根据SEQ ID NO:127的氨基酸序列编号，VH区包含一个或多个位置T28、F29、A49、R71、N73、A74和/或L78处的置换(例如，一个或多个选自T28N、F29I、A49G、R72A、N74T、A75S和L79A的置换)，任选地其中VH区包含以下置换：
(i)T28N和F29I；
(ii)T28N、F29I和R72A；
(iii)T28N、F29I、R72A、A49G和L79A；
(iv)T28N、F29I、R72A、N74T和A75S；或
(v)T28N、F29I、R72A、A49G、L79A、N74T和A75S，
其中(i)-(v)如根据SEQ ID NO:127的氨基酸序列编号，任选地其中：
根据SEQ ID NO:127的氨基酸序列编号，VH区包含置换T28N、F29I、R72A、A49G、L79A、N74T和A75S。
E120.一种特异性结合至人类αvβ8整合素的经分离的抗体或其抗原结合片段，其包含：
包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的CDR-H1，
包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列的CDR-H2，
包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列的CDR-H3，
包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列的CDR-L1，
包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列的CDR-L2，和
包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列的CDR-L3；并且
其中所述抗体包含含有以下中的一个或多个(例如，2个、3个、4个、5个、6个或所有)的VH区：
(a)位置28处的Asn，
(b)位置29处的Ile，
(c)位置49处的Gly，
(d)位置72处的Ala，
(e)位置74处的Thr，
(f)位置75处的Ser，和
(g)位置79处的Ala，其根据SEQ ID NO:127的氨基酸序列编号，任选地其中VH区包含：
(i)位置28处的Asn和位置29处的Ile；
(ii)位置28处的Asn、位置29处的Ile和位置72处的Ala；
(iii)位置28处的Asn、位置29处的Ile、位置72处的Ala、位置49处的Gly和位置79处的Ala；
(iv)位置28处的Asn、位置29处的Ile、位置72处的Ala、位置74处的Thr和位置75处的Ser；或
(v)位置28处的Asn、位置29处的Ile、位置72处的Ala、位置49处的Gly、位置79处的Ala、位置74处的Thr和位置75处的Ser，其根据SEQ ID NO:127的氨基酸序列编号，任选地其中：
根据SEQ ID NO:127的氨基酸序列编号，VH区包含位置28处的Asn、位置29处的Ile、位置72处的Ala、位置49处的Gly、位置79处的Ala、位置74处的Thr和位置75处的Ser。
E121.一种特异性结合至人类αvβ8整合素的经分离的抗体或其抗原结合片段，其包含：
包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的CDR-H1，
包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列的CDR-H2，
包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列的CDR-H3，
包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列的CDR-L1，
包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列的CDR-L2，和
包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列的CDR-L3；并且
其中所述抗体包含VL框架区(例如，FR1、FR2、FR3或FR4)，其包含与IGKV1-39、IGKV2-28、IGKV2-30、IGKV4-1或IGKV3-11的种系氨基酸序列具有至少80％、85％、87％、90％、92％、93％、95％、97％、98％或100％序列同一性的氨基酸序列，或具有至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、十个、十五个但少于二十个改变，例如整个VL框架区(包括FR1、FR2、FR3和FR4)的氨基酸序列的氨基酸置换或缺失的氨基酸序列。
E122.一种特异性结合至人类αvβ8整合素的经分离的抗体或其抗原结合片段，其包含：
包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的CDR-H1，
包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列的CDR-H2，
包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列的CDR-H3，
包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列的CDR-L1，
包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列的CDR-L2，和
包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列的CDR-L3；并且
其中所述抗体包含VL区，其包含IGKV1-39、IGKV2-28、IGKV2-30、IGKV4-1或IGKV3-11的种系VL氨基酸序列的变体，其中如根据SEQ ID NO:128的氨基酸序列编号，VL区包含一个或多个位置Y36和/或L46处的置换(例如，Y36F和/或L46R)，任选地其中VL区包含以下置换：
(i)L46R；或
(ii)L46R和Y36F，
其中(i)和(ii)根据SEQ ID NO:128的氨基酸序列编号，任选地其中根据SEQ IDNO:128的氨基酸序列编号，VL区包含置换L46R。
E123.一种特异性结合至人类αvβ8整合素的经分离的抗体或其抗原结合片段，其包含：
包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的CDR-H1，
包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列的CDR-H2，
包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列的CDR-H3，
包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列的CDR-L1，
包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列的CDR-L2，和
包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列的CDR-L3；并且
其中所述抗体包含含有以下中的一个或两个的VL区：
(a)位置36处的Tyr，和
(b)位置46处的Leu，其根据SEQ ID NO:128的氨基酸序列编号，任选地其中VL区包含：
(i)位置46处的Leu；或
(ii)位置46处的Leu和位置36处的Tyr，其根据SEQ ID NO:128的氨基酸序列编号，任选地其中：
根据SEQ ID NO:128的氨基酸序列编号，VL区包含位置46处的Leu。
E124.一种特异性结合至人类αvβ8整合素的经分离的抗体或其抗原结合片段，其包含：
包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的CDR-H1，
包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列的CDR-H2，
包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列的CDR-H3，
包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列的CDR-L1，
包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列的CDR-L2，和
包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列的CDR-L3；并且
其进一步包含鼠类IgG1 Fc区，如根据Eu编号方案编号，所述鼠类IgG1 Fc区例如相对于表1中所阐述的鼠类IgG1 Fc包含选自位置E233、E318、K320和R322的一个或多个置换(例如，E233P、E318A、K320A和R322A)。
E125.实施方案E124所述的经分离的抗体或其抗原结合片段，其中如根据Eu编号方案编号，所述鼠类IgG1 Fc区例如相对于表1中所阐述的鼠类IgG1 Fc包含E233P、E318A、K320A和R322A置换。
E126.一种特异性结合至人类αvβ8整合素的经分离的抗体或其抗原结合片段，其包含：
包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的CDR-H1，
包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列的CDR-H2，
包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列的CDR-H3，
包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列的CDR-L1，
包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列的CDR-L2，和
包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列的CDR-L3；并且
其进一步包含人类IgG1 Fc区，如根据Eu编号方案编号，所述人类IgG1 Fc区例如相对于表1中所阐述的人类IgG1 Fc包含选自位置L234、L235和G237的一个或多个置换(例如，L234A、L235A和G237A)。
E127.实施方案E126所述的经分离的抗体或其抗原结合片段，其中如根据Eu编号方案编号，所述人类IgG1 Fc区例如相对于表1中所阐述的人类IgG1 Fc包含L234A、L235A和G237A置换。
E128.一种特异性结合至人类αvβ8整合素的经分离的抗体或其抗原结合片段，其包含：
包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的CDR-H1，
包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列的CDR-H2，
包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列的CDR-H3，
包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列的CDR-L1，
包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列的CDR-L2，和
包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列的CDR-L3；并且
其中所述抗体进一步包含VH框架区(例如，FR1、FR2、FR3或FR4中的一种、两种、三种或四种)，其包含与包含SEQ ID NO:6、34-46、88-91或93中的任一项的氨基酸序列的VH区的VH框架区具有至少80％、85％、87％、90％、92％、93％、95％、97％、98％或优选100％序列同一性的氨基酸序列。
E129.一种特异性结合至人类αvβ8整合素的经分离的抗体或其抗原结合片段，其包含：
包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的CDR-H1，
包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列的CDR-H2，
包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列的CDR-H3，
包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列的CDR-L1，
包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列的CDR-L2，和
包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列的CDR-L3；并且
其中所述抗体进一步包含VL框架区(例如，FR1、FR2、FR3或FR4中的一种、两种、三种或四种)，其包含与包含SEQ ID NO:7、47-69或92中的任一项的氨基酸序列的VL区的VL框架区具有至少80％、85％、87％、90％、92％、93％、95％、97％、98％或优选100％序列同一性的氨基酸序列。
E130.一种特异性结合至人类αvβ8整合素的经分离的抗体或其抗原结合片段，其包含：
包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的CDR-H1，
包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列的CDR-H2，
包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列的CDR-H3，
包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列的CDR-L1，
包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列的CDR-L2，和
包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列的CDR-L3；并且
其中所述抗体进一步包含VH框架区(例如，FR1、FR2、FR3或FR4中的一种、两种、三种或四种)，其包含与IGHV3-07、IGHV1-46、IGHV3-23、IGHV3-30、IGHV1-69或IGHV3-48的种系氨基酸序列内的VH框架区具有至少80％、85％、87％、90％、92％、93％、95％、97％、98％或100％序列同一性的氨基酸序列。
E131.一种特异性结合至人类αvβ8整合素的经分离的抗体或其抗原结合片段，其包含：
包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的CDR-H1，
包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列的CDR-H2，
包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列的CDR-H3，
包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列的CDR-L1，
包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列的CDR-L2，和
包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列的CDR-L3；并且
其中所述抗体进一步包含VL框架区(例如，FR1、FR2、FR3或FR4中的一种、两种、三种或四种)，其包含与IGKV1-39、IGKV2-28、IGKV2-30、IGKV4-1或IGKV3-11的种系氨基酸序列具有至少80％、85％、87％、90％、92％、93％、95％、97％、98％或100％序列同一性的氨基酸序列。
E132.一种特异性结合至人类αvβ8整合素的经分离的抗体或其抗原结合片段，其包含：
包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的CDR-H1，
包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列的CDR-H2，
包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列的CDR-H3，
包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列的CDR-L1，
包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列的CDR-L2，和
包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列的CDR-L3；并且
其进一步包含鼠类IgG1 Fc区，如根据Eu编号方案编号，所述鼠类IgG1 Fc区例如相对于表1中所阐述的鼠类IgG1 Fc包含选自位置E233、E318、K320和R322的一个或多个置换(例如，E233P、E318A、K320A和R322A)。
E133.实施方案E132所述的经分离的抗体或其抗原结合片段，其中如根据Eu编号方案编号，所述鼠类IgG1 Fc区例如相对于表1中所阐述的鼠类IgG1 Fc包含E233P、E318A、K320A和R322A置换。
E134.一种特异性结合至人类αvβ8整合素的经分离的抗体或其抗原结合片段，其包含：
包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的CDR-H1，
包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列的CDR-H2，
包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列的CDR-H3，
包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列的CDR-L1，
包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列的CDR-L2，和
包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列的CDR-L3；并且
其进一步包含人类IgG1 Fc区，如根据Eu编号方案编号，所述人类IgG1 Fc区例如相对于表1中所阐述的人类IgG1 Fc包含L234A、L235A和G237A置换。
E135.一种特异性结合至人类αvβ8整合素的经分离的抗体或其抗原结合片段，其包含：
包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列的CDR-H1，
包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的CDR-H2，
包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的CDR-H3，
包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列的CDR-L1，
包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列的CDR-L2，和
包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的CDR-L3；并且
其中所述抗体进一步包含VH框架区(例如，FR1、FR2、FR3或FR4中的一种、两种、三种或四种)，其包含与包含SEQ ID NO:6、34-46、88-91或93中的任一项的氨基酸序列的VH区的VH框架区具有至少80％、85％、87％、90％、92％、93％、95％、97％、98％或优选100％序列同一性的氨基酸序列。
E136.一种特异性结合至人类αvβ8整合素的经分离的抗体或其抗原结合片段，其包含：
包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列的CDR-H1，
包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的CDR-H2，
包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的CDR-H3，
包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列的CDR-L1，
包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列的CDR-L2，和
包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列的CDR-L3；并且
其中所述抗体进一步包含VH框架区(例如，FR1、FR2、FR3或FR4中的一种、两种、三种或四种)，其包含与包含SEQ ID NO:6、34-46、88-91或93中的任一项的氨基酸序列的VH区的VH框架区具有至少80％、85％、87％、90％、92％、93％、95％、97％、98％或优选100％序列同一性的氨基酸序列。
E137.一种特异性结合至人类αvβ8整合素的经分离的抗体或其抗原结合片段，其包含：
包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列的CDR-H1，
包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的CDR-H2，
包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的CDR-H3，
包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列的CDR-L1，
包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列的CDR-L2，和
包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的CDR-L3；并且
其中所述抗体进一步包含VL框架区(例如，FR1、FR2、FR3或FR4中的一种、两种、三种或四种)，其包含与包含SEQ ID NO:7、47-69或92中的任一项的氨基酸序列的VL区的VL框架区具有至少80％、85％、87％、90％、92％、93％、95％、97％、98％或优选100％序列同一性的氨基酸序列。
E138.一种特异性结合至人类αvβ8整合素的经分离的抗体或其抗原结合片段，其包含：
包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列的CDR-H1，
包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的CDR-H2，
包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的CDR-H3，
包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列的CDR-L1，
包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列的CDR-L2，和
包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的CDR-L3；并且
其中所述抗体进一步包含VH框架区(例如，FR1、FR2、FR3或FR4中的一种、两种、三种或四种)，其包含与IGHV3-07、IGHV1-46、IGHV3-23、IGHV3-30、IGHV1-69或IGHV3-48的种系氨基酸序列具有至少80％、85％、87％、90％、92％、93％、95％、97％、98％或100％序列同一性的氨基酸序列。
E139.一种特异性结合至人类αvβ8整合素的经分离的抗体或其抗原结合片段，其包含：
包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列的CDR-H1，
包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的CDR-H2，
包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的CDR-H3，
包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列的CDR-L1，
包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列的CDR-L2，和
包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的CDR-L3；并且
其中所述抗体进一步包含VL框架区(例如，FR1、FR2、FR3或FR4中的一种、两种、三种或四种)，其包含与IGKV1-39、IGKV2-28、IGKV2-30、IGKV4-1或IGKV3-11的种系氨基酸序列具有至少80％、85％、87％、90％、92％、93％、95％、97％、98％或100％序列同一性的氨基酸序列。
E140.一种经分离的抗体或其抗原结合片段，其包含：
包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列的CDR-H1，
包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的CDR-H2，
包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的CDR-H3，
包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列的CDR-L1，
包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列的CDR-L2，和
包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的CDR-L3；并且
其进一步包含人类IgG1 Fc区，如根据Eu编号方案编号，所述人类IgG1 Fc区例如相对于表1中所阐述的人类IgG1 Fc包含选自位置L234、L235和G237的一个或多个置换(例如，L234A、L235A和G237A)。
E141.实施方案E140所述的经分离的抗体或其抗原结合片段，其中如根据Eu编号方案编号，所述人类IgG1 Fc区例如相对于表1中所阐述的人类IgG1 Fc包含L234A、L235A和G237A置换。
E142.前述实施方案中任一项所述的经分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体为多特异性抗体(例如，双特异性抗体)。
E143.前述实施方案中任一项所述的经分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体为多价抗体(例如，二价抗体)。
E144.前述实施方案中任一项所述的经分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体为人源化抗体、人类抗体、鼠类抗体、嵌合抗体或骆驼抗体。
E145.一种特异性结合至αvβ8整合素的经分离的抗体或其抗原结合片段，其包含VH区和VL区，其中所述VH区和VL区包含以下氨基酸序列：
(i)分别为SEQ ID NO:6和7，或与其具有至少80％、85％、87％、90％、92％、93％、95％、97％、98％或优选100％序列同一性的氨基酸序列；
(ii)分别为SEQ ID NO:34和65，或与其具有至少80％、85％、87％、90％、92％、93％、95％、97％、98％或优选100％序列同一性的氨基酸序列；
(iii)分别为SEQ ID NO:34和62，或与其具有至少80％、85％、87％、90％、92％、93％、95％、97％、98％或优选100％序列同一性的氨基酸序列；
(iv)分别为SEQ ID NO:34和66，或与其具有至少80％、85％、87％、90％、92％、93％、95％、97％、98％或优选100％序列同一性的氨基酸序列；
(v)分别为SEQ ID NO:34和63，或与其具有至少80％、85％、87％、90％、92％、93％、95％、97％、98％或优选100％序列同一性的氨基酸序列；
(vi)分别为SEQ ID NO:34和64，或与其具有至少80％、85％、87％、90％、92％、93％、95％、97％、98％或优选100％序列同一性的氨基酸序列；
(vii)分别为SEQ ID NO:37和65，或与其具有至少80％、85％、87％、90％、92％、93％、95％、97％、98％或优选100％序列同一性的氨基酸序列；
(viii)分别为SEQ ID NO:37和62，或与其具有至少80％、85％、87％、90％、92％、93％、95％、97％、98％或优选100％序列同一性的氨基酸序列；
(ix)分别为SEQ ID NO:37和66，或与其具有至少80％、85％、87％、90％、92％、93％、95％、97％、98％或优选100％序列同一性的氨基酸序列；
(x)分别为SEQ ID NO:37和63，或与其具有至少80％、85％、87％、90％、92％、93％、95％、97％、98％或优选100％序列同一性的氨基酸序列；
(xi)分别为SEQ ID NO:37和64，或与其具有至少80％、85％、87％、90％、92％、93％、95％、97％、98％或优选100％序列同一性的氨基酸序列；
(xii)分别为SEQ ID NO:36和65，或与其具有至少80％、85％、87％、90％、92％、93％、95％、97％、98％或优选100％序列同一性的氨基酸序列；
(xiii)分别为SEQ ID NO:36和62，或与其具有至少80％、85％、87％、90％、92％、93％、95％、97％、98％或优选100％序列同一性的氨基酸序列；
(xiv)分别为SEQ ID NO:36和66，或与其具有至少80％、85％、87％、90％、92％、93％、95％、97％、98％或优选100％序列同一性的氨基酸序列；
(xv)分别为SEQ ID NO:36和63，或与其具有至少80％、85％、87％、90％、92％、93％、95％、97％、98％或优选100％序列同一性的氨基酸序列；
(xvi)分别为SEQ ID NO:36和64，或与其具有至少80％、85％、87％、90％、92％、93％、95％、97％、98％或优选100％序列同一性的氨基酸序列；
(xvii)分别为SEQ ID NO:35和65，或与其具有至少80％、85％、87％、90％、92％、93％、95％、97％、98％或优选100％序列同一性的氨基酸序列；
(xviii)分别为SEQ ID NO:35和62，或与其具有至少80％、85％、87％、90％、92％、93％、95％、97％、98％或优选100％序列同一性的氨基酸序列；
(xix)分别为SEQ ID NO:35和66，或与其具有至少80％、85％、87％、90％、92％、93％、95％、97％、98％或优选100％序列同一性的氨基酸序列；
(xx)分别为SEQ ID NO:35和63，或与其具有至少80％、85％、87％、90％、92％、93％、95％、97％、98％或优选100％序列同一性的氨基酸序列；
(xxi)分别为SEQ ID NO:35和64，或与其具有至少80％、85％、87％、90％、92％、93％、95％、97％、98％或优选100％序列同一性的氨基酸序列；
(xxii)分别为SEQ ID NO:38和65，或与其具有至少80％、85％、87％、90％、92％、93％、95％、97％、98％或优选100％序列同一性的氨基酸序列；
(xxiii)分别为SEQ ID NO:38和62，或与其具有至少80％、85％、87％、90％、92％、93％、95％、97％、98％或优选100％序列同一性的氨基酸序列；
(xxiv)分别为SEQ ID NO:38和66，或与其具有至少80％、85％、87％、90％、92％、93％、95％、97％、98％或优选100％序列同一性的氨基酸序列；
(xxv)分别为SEQ ID NO:38和63，或与其具有至少80％、85％、87％、90％、92％、93％、95％、97％、98％或优选100％序列同一性的氨基酸序列；
(xxvi)分别为SEQ ID NO:38和64，或与其具有至少80％、85％、87％、90％、92％、93％、95％、97％、98％或优选100％序列同一性的氨基酸序列；
(xxvii)分别为SEQ ID NO:20和21，或与其具有至少80％、85％、87％、90％、92％、93％、95％、97％、98％或优选100％序列同一性的氨基酸序列；
(xxviii)分别为SEQ ID NO:88和47，或与其具有至少80％、85％、87％、90％、92％、93％、95％、97％、98％或优选100％序列同一性的氨基酸序列；
(xxix)分别为SEQ ID NO:89和47，或与其具有至少80％、85％、87％、90％、92％、93％、95％、97％、98％或优选100％序列同一性的氨基酸序列；
(xxx)分别为SEQ ID NO:90和47，或与其具有至少80％、85％、87％、90％、92％、93％、95％、97％、98％或优选100％序列同一性的氨基酸序列；
(xxxi)分别为SEQ ID NO:90和92，或与其具有至少80％、85％、87％、90％、92％、93％、95％、97％、98％或优选100％序列同一性的氨基酸序列；
(xxxii)分别为SEQ ID NO:39和47，或与其具有至少80％、85％、87％、90％、92％、93％、95％、97％、98％或优选100％序列同一性的氨基酸序列；
(xxxiii)分别为SEQ ID NO:6和67，或与其具有至少80％、85％、87％、90％、92％、93％、95％、97％、98％或优选100％序列同一性的氨基酸序列；
(xxxiv)分别为SEQ ID NO:6和68，或与其具有至少80％、85％、87％、90％、92％、93％、95％、97％、98％或优选100％序列同一性的氨基酸序列；
(xxxv)分别为SEQ ID NO:6和69，或与其具有至少80％、85％、87％、90％、92％、93％、95％、97％、98％或优选100％序列同一性的氨基酸序列；
(xxxvi)分别为SEQ ID NO:93和67，或与其具有至少80％、85％、87％、90％、92％、93％、95％、97％、98％或优选100％序列同一性的氨基酸序列；
(xxxvii)分别为SEQ ID NO:93和68，或与其具有至少80％、85％、87％、90％、92％、93％、95％、97％、98％或优选100％序列同一性的氨基酸序列；
(xxxviii)分别为SEQ ID NO:93和69，或与其具有至少80％、85％、87％、90％、92％、93％、95％、97％、98％或优选100％序列同一性的氨基酸序列；或
(xxxix)分别为SEQ ID NO:93和7，或与其具有至少80％、85％、87％、90％、92％、93％、95％、97％、98％或优选100％序列同一性的氨基酸序列，最佳地其中：
所述VH区和VL区包含以下的氨基酸序列：
(i)分别为SEQ ID NO:6和7；
(ii)分别为SEQ ID NO:34和65；
(iii)分别为SEQ ID NO:34和62；
(iv)分别为SEQ ID NO:34和66；
(v)分别为SEQ ID NO:34和63；
(vi)分别为SEQ ID NO:34和64；
(vii)分别为SEQ ID NO:37和65；
(viii)分别为SEQ ID NO:37和62；
(ix)分别为SEQ ID NO:37和66；
(x)分别为SEQ ID NO:37和63；
(xi)分别为SEQ ID NO:37和64；
(xii)分别为SEQ ID NO:36和65；
(xiii)分别为SEQ ID NO:36和62；
(xiv)分别为SEQ ID NO:36和66；
(xv)分别为SEQ ID NO:36和63；
(xvi)分别为SEQ ID NO:36和64；
(xvii)分别为SEQ ID NO:35和65；
(xviii)分别为SEQ ID NO:35和62；
(xix)分别为SEQ ID NO:35和66；
(xx)分别为SEQ ID NO:35和63；
(xxi)分别为SEQ ID NO:35和64；
(xxii)分别为SEQ ID NO:38和65；
(xxiii)分别为SEQ ID NO:38和62；
(xxiv)分别为SEQ ID NO:38和66；
(xxv)分别为SEQ ID NO:38和63；
(xxvi)分别为SEQ ID NO:38和64；
(xxvii)分别为SEQ ID NO:20和21；
(xxviii)分别为SEQ ID NO:88和47；
(xxix)分别为SEQ ID NO:89和47；
(xxx)分别为SEQ ID NO:90和47；
(xxxi)分别为SEQ ID NO:90和92；
(xxxii)分别为SEQ ID NO:39和47；
(xxxiii)分别为SEQ ID NO:6和67；
(xxxiv)分别为SEQ ID NO:6和68；
(xxxv)分别为SEQ ID NO:6和69；
(xxxvi)分别为SEQ ID NO:93和67；
(xxxvii)分别为SEQ ID NO:93和68；
(xxxviii)分别为SEQ ID NO:93和69；或
(xxxix)分别为SEQ ID NO:93和7。
E146.前述实施方案中任一项所述的经分离的抗体或其抗原结合片段，其包含或具有选自例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgD和IgE的重链恒定区的重链恒定区(Fc)。
E147.前述实施方案中任一项所述的经分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体属于选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其任何变体的同型。
E148.前述实施方案中任一项所述的经分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含IgG1或IgG2(例如，人类IgG1或人类IgG2)的重链恒定区。
E149.前述实施方案中任一项所述的经分离的抗体或其抗原结合片段，其包含或具有人类IgG1的重链恒定区。
E150.前述实施方案中任一项所述的经分离的抗体或其抗原结合片段，其包含或具有选自例如κ或λ的轻链恒定区的轻链恒定区。
E151.前述实施方案中任一项所述的经分离的抗体或其抗原结合片段，其包含或具有κ(例如，人类κ)轻链恒定区。
E152.前述实施方案中任一项所述的经分离的抗体或其抗原结合片段，其包含具有改变的铰链区以减少效应细胞功能的重链的Fc区。
E153.前述实施方案中任一项所述的经分离的抗体或其抗原结合片段，其具有降低的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和/或降低的补体依赖性细胞毒性(CDC)。
E154.前述实施方案中任一项所述的经分离的抗体或其抗原结合片段，根据Eu编号方案编号，所述经分离的抗体或其抗原结合片段例如与人类IgG1相比包含具有L234、L235或G237中的至少一个位置处的置换的铰链区。
E155.前述实施方案中任一项所述的经分离的抗体或其抗原结合片段，其包含人类IgG1 Fc区，根据Eu编号方案编号，所述人类IgG1Fc区包含至少一个选自L234A、L235A和G237A的置换。
E156.前述实施方案中任一项所述的经分离的抗体或其抗原结合片段，其具有包含EPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGAP(SEQ ID NO:126)的氨基酸序列的铰链区。
E157.前述实施方案中任一项所述的经分离的抗体或其抗原结合片段，其被改变以移除免疫原性T细胞表位。
E158.实施方案E157所述的经分离的抗体或其抗原结合片段，其包含VL，根据SEQID NO:47编号，所述VL包含至少一个选自由L30S、N58S、M56A、M94Q、L97Y和Q105G组成的组的置换。
E159.前述实施方案中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段具有以下特性中的至少一种：
(i)表示为KD的对人类αvβ8整合素的结合亲和力，其低于鼠类抗体ADWA11，例如低于536pM；
(ii)对人类αvβ8整合素的KD，其对经纯化的人类αvβ8整合素的KD低于或等于100pM；
(iii)对小鼠αvβ8整合素的KD，其低于100pM；
(iv)对食蟹猴αvβ8整合素的KD，其低于100pM；
(v)对大鼠αvβ8整合素的KD，其为约160pM；
(vi)对人类、食蟹猴、小鼠和大鼠αvβ8整合素中的至少两种、三种或所有大致相等的亲和力，例如低于100pM的KD，例如如使用Biacore亲和力测定法所确定的；
(vii)抑制TGFβ反式激活的IC50，其低于183pM；
(viii)抑制U251细胞中的TGFβ反式激活的IC50，其为约100pM至约300pM；
(ix)对U251细胞的EC50，其为约100pM至约400pM；
(x)对C8-S细胞的EC50，其为约110pM至约180pM；
(xi)至少一个预测的人类药代动力学(PK)参数，其选自：
a.中央室的清除率(CL)，其为约0.12-0.15mL/h/kg；
b.室间分布清除率(CLF)，其为约0.15-0.51mL/h/kg；
c.中央室的分布容积(V1)，其为约36-39mL/kg；
d.周边室的分布容积(V2)，其为约21-33mL/kg；和/或
e.终末半衰期(t1/2)，其为约12-17天；和
(xii)没有与人类Fcγ受体或C1q的可检测到的结合。
E160.前述实施方案中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段具有以下特性中的至少一种：
(i)特异性结合至αvβ8整合素而不结合至其他整合素；
(ii)减少αvβ8整合素与潜伏相关肽(LAP)之间的相互作用；
(iii)减少TGF-β信号传导；
(iv)以IC50≤10nM有效地阻断αvβ8整合素介导的TGFβ活化；
(v)对非人类灵长类(NHP)直系同源物具有相当的Kd(5倍内)；
(vi)选择性结合人类αvβ8，并且不可检测到地结合αvβ8的同源物(例如，αvβ1、αvβ3、αvβ5和αvβ6)；
(vii)单独或与免疫调节剂，例如检查点抑制剂的调节剂，例如PD-1、PD-L1、CTLA-4的抑制剂或刺激分子(例如4-1BB)的激动剂组合，在癌症(例如鳞状细胞癌、乳腺癌和/或结肠癌)的人类受试者或动物模型中引起生长抑制和/或完全肿瘤消退；
(viii)与抗癌疗法(例如放射疗法)组合在癌症的动物模型中引起生长抑制和/或完全肿瘤消退；
(ix)例如在单独或与免疫调节剂(例如，PD-1、PD-L1或CTLA-4的抑制剂)组合以≤10mg/kg施用时，在同系肿瘤移植模型中显示肿瘤生长的至少60％的减少；
(x)在向受试者(例如小鼠或人类受试者)施用时，在一种或多种免疫调节剂，例如检查点抑制剂的拮抗剂或检查点活化剂的激动剂，例如PD-1、PD-L1或CTLA-4的拮抗剂或免疫反应的活化剂，例如4-1BB激动剂存在的情况下增加抗肿瘤反应；
(xi)具有不依赖于肿瘤模型中αvβ8整合素的表达的功效；
(xii)可增加肿瘤微环境中CD8+GzmB+ T细胞的丰度，例如作为单一疗法；
(xiii)在与检查点抑制剂的拮抗剂(例如，抗PD-1或抗PD-L1抗体)组合使用时，例如在鳞状细胞癌、乳腺癌和/或结肠癌的同系模型中显示肿瘤生长的减少，例如至少＞80％的减少；
(xiv)如通过Kaplan-Meier分析所确定的，显示受试者的总存活率的统计学上显著的改善；
(xv)显示高度的热稳定性；
(xvi)显示高浓度下的最少聚集；和
(xvii)可在大规模制备条件下显示可再现表达和纯度。
E161.前述实施方案中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段具有以下特性中的至少一种：
(i)表示为KD的对人类αvβ8整合素的结合亲和力，其低于鼠类抗体ADWA11的KD，例如低于536pM；
(ii)对人类αvβ8整合素的KD，其对经纯化的人类αvβ8整合素的KD低于或等于100pM；
(iii)对小鼠αvβ8整合素的KD，其低于100pM；
(iv)对食蟹猴αvβ8整合素的KD，其低于100pM；
(v)对大鼠αvβ8整合素的KD，其为约160pM；
(vi)对人类、食蟹猴、小鼠和大鼠αvβ8整合素中的至少两种、三种或所有大致相等的亲和力，例如低于100pM的KD，如使用Biacore亲和力测定法所确定的；
(vii)抑制TGFβ反式激活的IC50，其低于183pM；
(viii)抑制U251细胞中的TGFβ反式激活的IC50，其为约100pM至约300pM；
(ix)对U251细胞的EC50，其为约126pM，其中标准偏差为加或减34pM；
(x)对U251细胞的EC50，其为约256pM，其中标准偏差为加或减115pM；
(xi)对U251细胞的EC50，其为约80pM至约400pM；
(xii)对C8-S细胞的EC50，其为约115pM；
(xiii)对C8-S细胞的EC50，其为约145pM，其中标准偏差为加或减23.7pM；
(xiv)对C8-S细胞的EC50，其为约110pM至约180pM；
(xv)至少一个预测的人类药代动力学(PK)参数，其选自：
a.中央室的清除率(CL)，其为约0.12-0.15mL/h/kg；
b.室间分布清除率(CLF)，其为约0.15-0.51mL/h/kg；
c.中央室的分布容积(V1)，其为约36-39mL/kg；
d.周边室的分布容积(V2)，其为约21-33mL/kg；和/或
e.终末半衰期(t1/2)，其为约12-17天；和
(xvi)没有与人类Fcγ受体或C1q的可检测到的结合。
E162.前述实施方案中任一项所述的经分离的抗体或其抗原结合片段，其以对经纯化的人类αvβ8整合素的KD低于或等于100pM结合人类αvβ8整合素。
E163.前述实施方案中任一项所述的经分离的抗体或其抗原结合片段，其以KD低于536pM结合人类αvβ8整合素。
E164.前述实施方案中任一项所述的经分离的抗体或其抗原结合片段，其以IC50低于183pM抑制TGFβ活化。
E165.前述实施方案中任一项所述的经分离的抗体或其抗原结合片段，其以IC50为100pM至约300pM抑制TGFβ活化。
E166.前述实施方案中任一项所述的经分离的抗体或其抗原结合片段，其以199+/-93.6pM的IC50抑制U251细胞中的TGFβ活化。
E167.一种药物组合物，其包含前述实施方案中任一项所述的抗体或其抗原结合片段和药学上可接受的承载体或赋形剂。
E168.一种核酸分子，其编码实施方案E1至E166中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
E169.一种核酸分子，其包含：
(i)与SEQ ID NO:1、183、189或191具有至少80％、85％、87％、90％、92％、93％、95％、97％、98％或100％序列同一性并且编码重链的核苷酸序列；
(ii)与SEQ ID NO:190具有至少80％、85％、87％、90％、92％、93％、95％、97％、98％或100％序列同一性并且编码重链可变区的核苷酸序列；
(iii)与SEQ ID NO:192或193具有至少80％、85％、87％、90％、92％、93％、95％、97％、98％或100％序列同一性并且编码重链恒定区的核苷酸序列；或
(iv)与保藏于ATCC并且具有保藏编号PTA-124917的质粒的插入序列的核酸序列具有至少80％、85％、87％、90％、92％、93％、95％、97％、98％或100％序列同一性的核苷酸序列。
E170.一种核酸分子，其包含：
(i)与SEQ ID NO:4或185具有至少80％、85％、87％、90％、92％、93％、95％、97％、98％或100％序列同一性并且编码轻链的核苷酸序列；
(ii)与SEQ ID NO:186具有至少80％、85％、87％、90％、92％、93％、95％、97％、98％或100％序列同一性并且编码轻链可变区的核苷酸序列；
(iii)与SEQ ID NO:194具有至少80％、85％、87％、90％、92％、93％、95％、97％、98％或100％序列同一性并且编码轻链恒定区的核苷酸序列；或
(iv)与保藏于ATCC并且具有保藏编号PTA-124918的质粒的插入序列的核酸序列具有至少80％、85％、87％、90％、92％、93％、95％、97％、98％或100％序列同一性的核苷酸序列。
E171.一种核酸分子，其包含与SEQ ID NO:1或183具有至少80％、85％、87％、90％、92％、93％、95％、97％、98％或100％序列同一性的核苷酸序列和与SEQ ID NO:4具有至少80％、85％、87％、90％、92％、93％、95％、97％、98％或100％序列同一性的核苷酸序列。
E172.一种核酸分子，其包含与SEQ ID NO:189或191具有至少80％、85％、87％、90％、92％、93％、95％、97％、98％或100％序列同一性的核苷酸序列和与SEQ ID NO:185具有至少80％、85％、87％、90％、92％、93％、95％、97％、98％或100％序列同一性的核苷酸序列。
E173.一种载体，其包含实施方案E168至E172中任一项所述的核酸分子。
E174.一种宿主细胞，其包含实施方案E168至E172中任一项所述的核酸分子或实施方案E173所述的载体。
E175.实施方案E174所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞为哺乳动物细胞，例如人类细胞。
E176.实施方案E175所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞为CHO细胞、COS细胞、HEK-293细胞、NS0细胞、
Figure BDA0002961224610000591
细胞或Sp2.0细胞。
E177.一种制备特异性结合至人类αvβ8整合素的经分离的抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括在其中所述抗体或抗原结合片段由所述宿主细胞表达的条件下培养实施方案E174至E176中任一项所述的宿主细胞。
E178.实施方案E177所述的方法，其进一步包含分离所述抗体或其抗原结合片段。
E179.一种减少有此需要的受试者中的TGFβ信号传导的方法，所述方法包括向有此需要的受试者施用治疗有效量的实施方案E1至E166中任一项所述的抗体或其抗原结合片段或实施方案E167中的任一项所述的药物组合物。
E180.一种降低有此需要的受试者中的αvβ8整合素活性的方法，所述方法包括向有此需要的受试者施用治疗有效量的实施方案E1至E166中任一项所述的抗体或其抗原结合片段或实施方案E167所述的药物组合物。
E181.一种治疗与异常(例如，增加的)TGFβ信号传导相关或由其介导的疾病、病症或病况的方法，所述方法包括向有此需要的受试者施用治疗有效量的实施方案E1至E166中任一项所述的抗体或其抗原结合片段或实施方案E167所述的药物组合物。
E182.一种诱导受试者中的抗肿瘤反应的方法，所述方法包括向有此需要的受试者施用治疗有效量的实施方案E1至E166中任一项所述的抗体或其抗原结合片段或实施方案E167中任一项所述的药物组合物，任选地其中所述抗体或其抗原结合片段与第二疗法组合施用，任选地其中所述抗体或其抗原结合片段与第二疗法同时、顺序或分开施用，任选地其中：
(i)所述抗体或其抗原结合片段在施用第二疗法之前施用，或
(ii)所述抗体或其抗原结合片段在施用第二疗法之后施用。
E183.实施方案E1至E166中任一项所述的抗体或其抗原结合片段或实施方案E167所述的药物组合物，其用于降低受试者中的αvβ8整合素的活性。
E184.一种治疗癌症的方法，所述方法包括向有此需要的受试者施用治疗有效量的实施方案E1至E166中任一项所述的抗体或其抗原结合片段或实施方案E167所述的药物组合物。
E185.实施方案E184所述的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段具有以下特性中的至少一种：
(i)特异性结合至αvβ8整合素(例如，来自人类、小鼠、食蟹猴和/或大鼠的αvβ8整合素)；
(ii)减少αvβ8整合素与潜伏相关肽(LAP)之间的相互作用；
(iii)减少TGF-β信号传导；
(iv)以IC50≤10nM阻断αvβ8整合素介导的TGFβ活化；
(v)对非人类灵长类(NHP)直系同源物具有相当的Kd(5倍内)；
(vi)选择性结合人类αvβ8，并且不可检测到地结合αvβ8的同源物(例如，αvβ1、αvβ3、αvβ5和αvβ6)；
(vii)单独或与免疫调节剂，例如检查点抑制剂的调节剂，例如PD-1、CTLA-4的抑制剂或刺激分子(例如4-1BB)的激动剂组合，在选自例如鳞状细胞癌、乳腺癌和结肠癌的癌症的动物模型中引起生长抑制和/或完全肿瘤消退；
(viii)与抗癌疗法(例如放射疗法)组合在癌症的动物模型中引起生长抑制和/或完全肿瘤消退；
(ix)例如在以≤10mg/kg施用时，在同系肿瘤移植模型中显示肿瘤生长的至少60％的减少；
(x)在向受试者(例如小鼠或人类受试者)施用时在一种或多种免疫调节剂，例如检查点抑制剂的拮抗剂，例如PD-1或CTLA-4的拮抗剂或免疫反应的活化剂，例如4-1BB激动剂存在的情况下增加抗肿瘤反应；
(xi)具有不依赖于肿瘤模型中αvβ8整合素的表达的功效；
(xii)足以增加肿瘤微环境中CD8+GzmB+ T细胞的丰度，例如作为单一疗法；
(xiii)在与检查点抑制剂的拮抗剂(例如，抗PD-1或抗PD-L1抗体)组合使用时，例如在鳞状细胞癌、乳腺癌和/或结肠癌的同系模型中显示肿瘤生长的至少80％的减少；
(xiv)如通过Kaplan-Meier分析所确定的，显示受试者(例如人类或小鼠)的总存活率的统计学上显著的改善；
(xv)显示高度的热稳定性；
(xvi)显示高浓度下的最少聚集；和
(xvii)可在大规模制备条件下显示可再现表达和纯度。
E186.实施方案E184或E185所述的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段具有以下特性中的至少一种：
(i)表示为KD的对人类αvβ8整合素的结合亲和力，其低于鼠类抗体ADWA11的KD，例如低于536pM；
(ii)对人类αvβ8整合素的KD，其对经纯化的人类αvβ8整合素的KD低于或等于100pM；
(iii)对小鼠αvβ8整合素的KD，其低于100pM；
(iv)对食蟹猴αvβ8整合素的KD，其低于100pM；
(v)对大鼠αvβ8整合素的KD，其为约160pM；
(vi)显示对人类、食蟹猴、小鼠和大鼠αvβ8整合素中的至少两种、三种或所有大致相等的亲和力，例如低于100pM的KD，例如如使用Biacore亲和力测定法所确定的；
(vii)抑制TGFβ反式激活的IC50，其低于183pM；
(viii)抑制U251细胞中的TGFβ反式激活的IC50，其为约199+/-93.6pM；
(ix)抑制TGFβ反式激活的IC50，其为约100pM至约300pM；
(x)对U251细胞的EC50，其为约126pM，其中标准偏差为加或减34pM；
(xi)对U251细胞的EC50，其为约256pM，其中标准偏差为加或减115pM；
(xii)对U251细胞的EC50，其为约80pM至约400pM；
(xiii)对C8-S细胞的EC50，其为约115pM；
(xiv)对C8-S细胞的EC50，其为约145pM，其中标准偏差为加或减23.7pM；
(xv)对C8-S细胞的EC50，其为约110pM至约180pM；
(xvi)至少一个预测的人类药代动力学(PK)参数，其选自：
a.中央室的清除率(CL)，其为约0.12-0.15mL/h/kg；
b.室间分布清除率(CLF)，其为约0.15-0.51mL/h/kg；
c.中央室的分布容积(V1)，其为约36-39mL/kg；
d.周边室的分布容积(V2)，其为约21-33mL/kg；和/或
e.终末半衰期(t1/2)，其为约12-17天；和
(xvii)显示没有与人类Fcγ受体或C1q的可检测到的结合。
E187.实施方案E184至E186中任一项所述的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段是根据实施方案E1至E166中任一项所述或实施方案E167所述的药物组合物。
E188.实施方案E184至E187中任一项所述的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段以足以增加CD45+细胞、CD3+ T细胞、CD4+ T细胞、CD8+ T细胞和/或表达颗粒酶B的细胞浸润的量施用。
E189.实施方案E184至E188中任一项所述的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段以足以增加CD8+ T细胞浸润的量施用。
E190.实施方案E184至E189中任一项所述的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段以足以增加CD8+ T细胞上颗粒酶B的表达的量施用。
E191.实施方案E184至E190中任一项所述的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段以足以增加具有升高的Ly6G表达水平的炎性巨噬细胞的积聚的量施用。
E192.实施方案E184至E191中任一项所述的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段以足以增加CD45+CD11b+CD11c-Ly6G-Ly6C高CD206低炎性巨噬细胞的积聚的量施用。
E193.实施方案E184至E192中任一项所述的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段以足以增加第二疗法的反应的量施用。
E194.实施方案E184至E193中任一项所述的方法，其中在向动物肿瘤模型施用时，所述抗体或其抗原结合片段的功效不依赖于肿瘤模型的αvβ8整合素的表达。
E195.实施方案E184至E194中任一项所述的方法，其中施用所述抗体或其抗原结合片段与第二疗法组合进行。
E196.实施方案E195所述的方法，其中所述第二疗法包含抗癌疗法、细胞毒性剂或细胞生长抑制剂，例如化学治疗剂、激素治疗、疫苗和/或免疫疗法。
E197.实施方案E195或E196所述的方法，其中所述第二疗法为或包含手术、辐射、冷冻手术和/或热疗法。
E198.实施方案E195至E197中任一项所述的方法，其中所述第二疗法包含免疫检查点分子的调节剂，例如抑制剂或激动剂，任选地其中所述第二疗法为或包含选自由以下各项组成的组的免疫检查点分子的调节剂：PD1、PD-L1、4-1BB、OX40、CTLA-4、PD-L2、TIM-3、LAG-3、VISTA、CD160、BTLA、TIGIT、2B4、TGFβ、LAIR1及其组合。
E199.实施方案E198所述的方法，其中免疫检查点分子的抑制剂为PD1、PD-L1、CTLA-4、PD-L2、TIM-3、LAG-3、VISTA、BTLA、TIGIT、2B4、TGFβ或LAIR1的抑制剂。
E200.实施方案E199所述的方法，其中免疫检查点分子的抑制剂为PD1的抑制剂，例如抗PD1的抗体。
E201.实施方案E199所述的方法，其中免疫检查点分子的抑制剂为抑制剂CTLA-4，例如抗CTLA-4的抗体或可溶性CTLA-4融合物。
E202.实施方案E195至E201所述的方法，其中所述第二疗法包含共刺激分子的激动剂。
E203.实施方案E202所述的方法，其中共刺激分子的激动剂选自以下中的至少一种：4-1BB(CD137)、OX40、CD2、CD27、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、ICOS(CD278)、GITR、CD30、CD40、BAFFR、HVEM、CD7、LIGHT、NKG2C、SLAMF7、NKp80、CD160或B7-H3。
E204.实施方案E202所述的方法，其中共刺激分子的激动剂为41-BB激动剂。
E205.实施方案E195至E204所述的方法，其中所述第二疗法包含PARP1的抑制剂(例如，奥拉帕尼(olaparib)、芦卡帕尼(rucaparib)、尼拉帕尼(niraparib)、维利帕尼(veliparib)、依尼帕瑞(iniparib)、他拉柔帕尼(talazoparib)、3-胺基苯甲酰胺、CEP9722、E7016、BSI-201、KU-0059436、AG014699、MK-4827或BGB-290)。
E206.实施方案E184至E205所述的方法，其中所述癌症选自由以下各项组成的组：实体瘤、血液癌(例如，白血病、淋巴瘤、骨髓瘤，例如多发性骨髓瘤)和转移性病灶。
E207.实施方案E206所述的方法，其中所述癌症为实体瘤。
E208.实施方案E206或E207所述的方法，其中所述癌症为实体瘤，并且选自恶性肿瘤，例如肉瘤和癌瘤，例如各种器官系统的腺癌，例如影响肺(例如，非小细胞肺癌(NSCLC))、乳房、卵巢、淋巴、胃肠道(例如，结肠)、肛门、生殖器和泌尿生殖道(例如，肾、尿道上皮、膀胱细胞、前列腺)、咽、CNS(例如，脑、神经或胶细胞)、头颈部(例如，头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)、皮肤(例如，黑素瘤，例如晚期黑素瘤)、胰脏、结肠、直肠、肾(例如，肾细胞癌)、肝的腺癌、小肠癌和食道癌、胃食道癌、甲状腺癌和子宫颈癌。
E209.实施方案E184至E208中任一项所述的方法，其中所述癌症为淋巴增生性疾病(例如，移植后淋巴增生性疾病)或血液癌、T细胞淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤或白血病(例如，髓系白血病或淋巴系白血病)。
E210.实施方案E184至E209中任一项所述的方法，其中所述癌症为早期、中期、晚期或转移性癌症。
E211.实施方案E184至E210中任一项所述的方法，其中所述癌症选自由以下各项组成的组：肾细胞癌、卵巢癌和头颈部鳞状细胞癌。
E212.实施方案E211所述的方法，其进一步包括施用检查点抑制剂的抑制剂，例如PD-1、PD-L1或CTLA-4的抑制剂。
E213.实施方案E212所述的方法，其中所述PD-L1的抑制剂不是阿维鲁单抗(avelumab)。
E214.实施方案E211或E212所述的方法，其中所述癌症为肾癌，例如肾细胞癌(RCC)。
E215.实施方案E214所述的方法，其中所述癌症为选自由以下各项组成的组的肾癌：转移性RCC、透明细胞肾细胞癌(ccRCC)、非透明细胞肾细胞癌(ncRCC)和高危肾细胞癌。
E216.实施方案E215所述的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段作为第1线或第2线疗法施用。
E217.实施方案E184至E216中任一项所述的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段作为第1线疗法施用。
E218.实施方案E184至E216中任一项所述的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段作为第2线疗法施用。
E219.实施方案E184至E212中任一项所述的方法，其中所述癌症为卵巢癌。
E220.实施方案E219所述的方法，其中所述第二疗法为PARP1的抑制剂(例如，奥拉帕尼、芦卡帕尼、尼拉帕尼、维利帕尼、依尼帕瑞、他拉柔帕尼、3-胺基苯甲酰胺、CEP 9722、E7016、BSI-201、KU-0059436、AG014699、MK-4827或BGB-290)。
E221.实施方案E219所述的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段作为第2线疗法施用，任选地其中所述受试者为耐铂的。
E222.实施方案E219所述的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段作为第1线疗法施用。
E223.实施方案E184至E222中任一项所述的方法，其中所述癌症为头颈部鳞状细胞癌。
E224.实施方案E223所述的方法，其中所述方法进一步包括施用辐射疗法。
E225.实施方案E223或E224所述的方法，其中所述癌症为耐铂的和/或复发性癌症。
E226.实施方案E179至E225中任一项所述的方法，其中所述受试者为人类。
E227.实施方案E179至E226中任一项所述的方法，其包含静脉内施用所述抗体或其抗原结合片段或药物组合物。
E228.实施方案E179至E227中任一项所述的方法，其包含皮下施用所述抗体或其抗原结合片段或药物组合物。
E229.实施方案E179至E228中任一项所述的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段或药物组合物约一周两次、一周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次、每五周一次、每六周一次、每七周一次、每八周一次、每九周一次、每十周一次、每月两次、每月一次、每两月一次、每三月一次、每四月一次、每五月一次、每六月一次、每七月一次、每八月一次、每九月一次、每十月一次、每十一月一次或每十二月一次进行施用。
E230.实施方案E179至E229中任一项所述的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段每两周，例如多达12次(例如，多达10、8、6、5、4或3次)施用。
E231.实施方案E230所述的方法，其中每个施用包含5-10mg/kg(例如，5、6、7、8、9或10mg/kg)的所述抗体或其抗原结合片段。
E232.实施方案E231所述的方法，其中每个施用包含约7mg/kg。
E233.实施方案E179至E229中任一项所述的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段每四周，例如多达6次(例如，多达6、5、4、3、2或1次)施用。
E234.实施方案E233所述的方法，其中每个施用包含10-15mg/kg(例如，10、11、12、13、14或15mg/kg)的所述抗体或其抗原结合片段。
E235.实施方案E234所述的方法，其中每个施用包含约12mg/kg。
E236.一种使用实施方案E1至E166中任一项所述的抗体或其抗原结合片段或实施方案E167所述的药物组合物检测样品、组织或细胞中的αvβ8整合素(例如，人类αvβ8整合素)的方法，所述方法包括使所述样品、组织或细胞与所述抗体接触并且检测所述抗体。
E237.一种试剂盒，其包含实施方案E1至E166中任一项所述的抗体或其抗原结合片段或实施方案E167所述的药物组合物。
E238.实施方案E1至E166中任一项所述的抗体或其抗原结合片段或实施方案E167所述的药物组合物，其例如在本文所述的方法实施方案中的任一项中用作药物。
E239.一种经分离的抗体或其抗原结合片段，其特异性结合αvβ8整合素，其中所述抗体或片段为至少一种选自由以下各项组成的组的抗体或片段：
(a)包含以下的抗体或其抗原结合片段：包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR-L1)；包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的CDR-L2；包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR-L3；包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的重链CDR1(CDR-H1)；包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的CDR-H2；以及包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的CDR-H3；
(b)包含以下的抗体或其抗原结合片段：包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的CDR-L1；包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的CDR-L2；包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的CDR-L3；包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CDR-H1；包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDR-H2；以及包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR-H3；
(c)包含可变轻链(VL)区和可变重链(VH)区的抗体或其抗原结合片段，所述VL区包含由保藏于ATCC并且具有保藏编号PTA-124918的质粒的插入序列编码的氨基酸序列，所述VH区包含由保藏于ATCC、具有保藏编号PTA-124917的质粒的插入序列编码的氨基酸序列；
(d)包含VL区和VH区的抗体或其抗原结合片段，所述VL区包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列，所述VH区包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列；
(e)包含VL区和VH区的抗体或其抗原结合片段，所述VL区包含选自由SEQ ID NO:62-66组成的组的氨基酸序列，所述VH区包含选自由SEQ ID NO:34-38组成的组的氨基酸序列；
(f)包含VL区和VH区的抗体或其抗原结合片段，所述VL区包含选自由SEQ ID NO:47和92组成的组的氨基酸序列，所述VH区包含选自由SEQ ID NO:39和88-91组成的组的氨基酸序列；
(g)包含VL区和VH区的抗体或其抗原结合片段，所述VL区包含选自由SEQ ID NO:7和67-69组成的组的氨基酸序列，所述VH区包含选自由SEQ ID NO:6和93组成的组的氨基酸序列；
(h)包含VL区和VH区的抗体或其抗原结合片段，所述VL区包含选自由SEQ ID NO:7、47-69和92组成的组的氨基酸序列，所述VH区包含选自由SEQ ID NO:6、34-46、88-91和93组成的组的氨基酸序列；
(i)包含轻链(LC)区和重链(HC)区的抗体或其抗原结合片段，所述LC区包含SEQID NO:5的氨基酸序列，所述HC区包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列；
(j)包含LC区和HC区的抗体或其抗原结合片段，所述LC区包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列，所述HC区包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列；
(k)包含LC区和HC区的抗体或其抗原结合片段，所述LC区包含SEQ ID NO:123的氨基酸序列，所述HC区包含SEQ ID NO:124或182的氨基酸序列；
(l)包含VL区和VH区的抗体或其抗原结合片段，所述VL区由SEQ ID NO:186的核酸序列编码，所述VH区由SEQ ID NO:190的核酸序列编码；和
(m)包含LC区和HC区的抗体或其抗原结合片段，所述LC区由SEQ ID NO:185的核酸序列编码，所述HC区由SEQ ID NO:189或191的核酸序列编码。
E240.实施方案E239所述的经分离的抗体或其抗原结合片段，其包含VL区和VH区，所述VL区包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列，所述VH区包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列。
E241.实施方案E239或E240所述的经分离的抗体或其抗原结合片段，其包含VL区和VH区，所述VL区包含与SEQ ID NO:7至少95％同一的氨基酸序列，所述VH区包含与SEQ IDNO:6至少95％同一的氨基酸序列。
E242.实施方案E239所述的经分离的抗体或其抗原结合片段，其包含LC区和HC区，所述LC区包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列，所述HC区包含SEQ ID NO:2或3的氨基酸序列。
E243.实施方案E239或E242所述的经分离的抗体或其抗原结合片段，其包含LC区和HC区，所述LC区包含与SEQ ID NO:5至少95％同一的氨基酸序列，所述HC区包含与SEQ IDNO:2或3至少95％同一的氨基酸序列。
E244.一种经分离的抗体或其抗原结合片段，其特异性结合αvβ8整合素，其中所述抗体或片段包含VH区和/或VL区，所述VH区包含与选自由SEQ ID NO:6、34-46、88-91和93组成的组的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列，所述VL区包含与选自由SEQ ID NO:7、47-69和92组成的组的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。
E245.一种经分离的抗体或其抗原结合片段，其特异性结合αvβ8整合素，其中所述抗体或片段包含：
(i)抗体HC，其包含与SEQ ID NO:2或3具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列；和/或
(ii)抗体LC，其包含与SEQ ID NO:5具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。
E246.一种特异性结合αvβ8整合素的经分离的抗体，其包含LC和HC，所述LC由SEQID NO:5的氨基酸序列组成，所述HC由SEQ ID NO:2或3的氨基酸序列组成。
E247.一种特异性结合αvβ8整合素的经分离的抗体，其包含：
抗体VL区，其包含来自包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的所述VL区的所述CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；和
抗体VH区，其包含来自包含SED ID NO:6的氨基酸序列的所述VH区的所述CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3。
E248.实施方案E247所述的经分离的抗体，其包含抗体重链恒定区和抗体轻链恒定区，所述抗体重链恒定区包含SEQ ID NO:181或184的氨基酸序列，所述抗体轻链恒定区包含SEQ ID NO:83的氨基酸序列。
E249.一种特异性结合αvβ8整合素的经分离的抗体，其包含：
a)抗体VL区，其包含来自包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的所述VL区的第一、第二和第三CDR；
抗体VH区，其包含来自包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的所述VH区的第一、第二和第三CDR；
抗体轻链恒定(CL)区，其包含SEQ ID NO:83的氨基酸序列；和
抗体重链(CH)恒定区，其包含SEQ ID NO:181或184的氨基酸序列；
b)抗体VL区，其包含与SEQ ID NO:7至少95％同一的氨基酸序列；和抗体VH区，其包含与SEQ ID NO:6至少95％同一的氨基酸序列；或
c)抗体LC区，其包含与SEQ ID NO:5至少95％同一的氨基酸序列；和抗体HC，其包含与SEQ ID NO:2或3至少95％同一的氨基酸序列。
E250.一种经分离的抗体或其抗原结合片段，其特异性结合αvβ8整合素，其包含抗体VH和抗体VL，所述抗体VH包含由保藏于ATCC并且具有保藏编号PTA-124917的所述插入序列编码的氨基酸序列，所述抗体VL包含由保藏于ATCC并且具有保藏编号PTA-124918的所述插入序列编码的氨基酸序列。
E251.一种经分离的抗体或其抗原结合片段，其特异性结合αvβ8整合素，其中所述抗体或片段具有以下特性中的至少一种：
a.表示为KD的对人类αvβ8整合素的结合亲和力，其低于鼠类抗体ADWA11的KD，例如低于约536pM；
b.对人类αvβ8整合素的KD，其低于或等于约100pM；
c.对小鼠αvβ8整合素的KD，其低于鼠类抗体ADWA11的KD，例如低于约489pM；
d.对小鼠αvβ8整合素的KD，其低于约100pM；
e.对食蟹猴αvβ8整合素的KD，其低于鼠类抗体ADWA11的KD，例如低于约507pM；
f.对食蟹猴αvβ8整合素的KD，其低于或等于约100pM；
g.对大鼠αvβ8整合素的KD，其为约160pM；
h.对人类、食蟹猴、小鼠和大鼠αvβ8整合素中的至少两种、三种或所有大致相等的亲和力，例如如使用Biacore亲和力测定法所确定的，低于100pM的KD；
i.抑制TGFβ反式激活的IC50，其为约100pM至约300pM；
j.U251细胞的EC30，其为约100pM至约400pM；
k.对C8-S细胞的EC50，其为约110pM至约180pM；和
l.至少一个预测的人类药代动力学(PK)参数，其选自：
i.中央室的清除率(CL)，其为约0.12mL/h/kg；
ii.室间分布清除率(CLF)，其为约0.51mL/h/kg；
iii.中央室的分布容积(V1)，其为约36mL/kg；
iv.周边室的分布容积(V2)，其为约33mL/kg；
v.终末半衰期(t1/2)，其为约15至17天；和
vi.没有与人类Fcγ受体或C1q的可检测到的结合。
E252.前述实施方案中任一项所述的经分离的抗体或其抗原结合片段，其包含人类IgG1 Fc区，如根据Kabat的Eu编号进行编号，所述人类IgG1 Fc区包含选自位置L234、L235和G237的一个或多个置换(例如，L234A、L235A和G237A中的一个或多个)。
E253.前述实施方案中任一项所述的经分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体为人源化抗体、人类抗体、鼠类抗体、嵌合抗体或骆驼抗体。
E254.前述实施方案中任一项所述的经分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体重链同型选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其任何变体；和/或其中所述轻链恒定区选自κ或λ。
E255.前述实施方案中任一项所述的经分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体重链同型为IgG1和/或其中所述轻链恒定区为κ轻链。
E256.一种抗体或其抗原结合片段，其与实施方案E242的抗体或其抗原结合片段竞争结合αvβ8整合素。
E257.一种药物组合物，其包含前述实施方案中任一项所述的抗体或其抗原结合片段和药学上可接受的承载体或赋形剂。
E258.实施方案E257所述的药物组合物，其包含：i)包含抗体重链和抗体轻链的抗体或其抗原结合片段，所述抗体重链由SEQ ID NO:2的氨基酸序列编码，所述抗体轻链由SEQ ID NO:5的氨基酸序列编码，ii)包含抗体重链和抗体轻链的抗体或其抗原结合片段，所述抗体重链由SEQ ID NO:3的氨基酸序列编码，所述抗体轻链由SEQ ID NO:5的氨基酸序列编码，或iii)两者。
E259.一种经分离的核酸分子，其编码实施方案E239至E256中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
E260.实施方案E259所述的经分离的核酸，其中所述经分离的核酸编码所述抗体或其抗原结合片段的VH区、VL区或两者，并且其中所述核酸包含：SEQ ID NO:190的核酸序列、SEQ ID NO:186的核酸序列或两者。
E261.实施方案E259所述的经分离的核酸，其中所述经分离的核酸编码所述抗体或其抗原结合片段的重链恒定区、轻链恒定区、或两者，并且其中所述核酸包含SEQ ID NO:192或193的核酸序列；SEQ ID NO:194的核酸序列；或两者。
E262.实施方案E259所述的经分离的核酸，其中所述经分离的核酸编码所述抗体或其抗原结合片段的所述HC、LC或两者，并且其中所述核酸包含：SEQ ID NO:189或190的核酸序列；SEQ ID NO:185的核酸序列；或两者。
E263.实施方案E259所述的经分离的核酸，其中所述经分离的核酸包含保藏于ATCC并且具有保藏编号PTA-124917的质粒的插入序列的核酸序列、保藏于ATCC并且具有保藏编号PTA-124918的质粒的插入序列的核酸序列或两者。
E264.实施方案E259所述的经分离的核酸，其中所述经分离的核酸包含与SEQ IDNO:189或SEQ ID NO:191具有至少80％、85％、87％、90％、92％、93％、95％、97％、98％或100％序列同一性的核酸序列；与SEQ ID NO:185具有至少80％、85％、87％、90％、92％、93％、95％、97％、98％或100％序列同一性的核酸序列；或两者。
E265.一种载体，其包含实施方案E259至E264中任一项所述的核酸。
E266.一种宿主细胞，其包含实施方案E259至E264中任一项所述的核酸或实施方案E265所述的载体。
E267.实施方案E265所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是选自由以下各项组成的组的哺乳动物细胞：CHO细胞、COS细胞、HEK-293细胞、NS0细胞、
Figure BDA0002961224610000741
细胞和Sp2.0细胞。
E268.一种制备经分离的抗体或其抗原结合片段的方法，其包含在其中所述抗体或片段由实施方案266所述的宿主细胞表达的条件下培养所述宿主细胞和分离所述抗体或片段。
E269.一种降低有此需要的受试者中的αvβ8整合素活性的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的实施方案E239至E256中任一项所述的抗体或其抗原结合片段或实施方案E257或E258所述的药物组合物。
E270.一种治疗癌症的方法，其包括向有此需要的受试者施用治疗有效量的实施方案E239至E256中任一项所述的抗体或其抗原结合片段或实施方案E257或E258所述的药物组合物。
E271.实施方案E270所述的方法，其进一步施用细胞毒性剂、细胞生长抑制剂、化学治疗剂、激素治疗、疫苗、免疫疗法、手术、辐射、冷冻手术、热疗法或其组合。
E272.实施方案E271所述的方法，其中所述进一步施用与治疗有效量的所述抗体或其抗原结合片段或药物组合同时、顺序或分开施用。
E273.实施方案E271所述的方法，其中所述免疫疗法包含选自由以下各项组成的组的免疫检查点分子的调节剂：抗PD1抗体、抗PD-L1抗体、抗PD-L2抗体、抗CTLA-4抗体、可溶性CTLA-4融合蛋白及其组合，并且其中所述抗PD-L1抗体不是阿维鲁单抗。
E274.实施方案E270至E273中任一项所述的方法，其中所述癌症选自由以下各项组成的组：头颈部鳞状细胞癌、透明细胞型或乳头状细胞型的肾细胞癌、卵巢癌、输卵管癌、原发性腹膜癌、胃癌、胃食道接合处癌、食道癌、肺鳞状细胞癌、胰腺导管腺癌、胆管癌、子宫癌、黑素瘤、尿道上皮癌及其组合。
E275.一种使用实施方案E239至E256所述的抗体或其抗原结合片段检测样品、组织或细胞中的αvβ8整合素的方法，其包括使所述样品、组织或细胞与所述抗体或其抗原结合片段接触和检测所述抗体或其抗原结合片段。
E276.一种试剂盒，其包含实施方案E239至E256中任一项所述的抗体或片段或实施方案E257或E258所述的药物组合物并且任选地包含实施方案E273所述的调节剂。
E277.实施方案E239至E256中任一项所述的抗体或其抗原结合片段或实施方案E257或E258所述的药物组合物，其用于降低有此需要的受试者中的αvβ8整合素活性以治疗癌症。
E278.实施方案E239至E256中任一项所述的抗体或其抗原结合片段或实施方案E257或E258所述的药物组合物，其用于治疗癌症，任选地其中所述抗体或其抗原结合片段或所述药物组合物用于与免疫疗法组合同时、顺序或分开施用，其中所述组合任选地提供协同治疗效果。
E279.实施方案E278所述的抗体或其抗原结合片段或药物组合物，其中所述癌症选自由以下各项组成的组：头颈部鳞状细胞癌、透明细胞型或乳头状细胞型的肾细胞癌、卵巢癌、输卵管癌、原发性腹膜癌、胃癌、胃食道接合处癌、食道癌、肺鳞状细胞癌、胰腺导管腺癌、胆管癌、子宫癌、黑素瘤、尿道上皮癌及其组合，任选地其中所述抗体或其抗原结合片段或所述药物组合物或组合用于与施用免疫疗法或辐射疗法一起使用。
E280.实施方案E239至E256中任一项所述的抗体或其抗原结合片段或实施方案E257或E258所述的药物组合物用于治疗癌症的用途。
E281.实施方案E239至E256中任一项所述的抗体或其抗原结合片段在制备药物中的用途，所述药物用于治疗癌症。
E282.一种治疗癌症的方法，其包括向有此需要的受试者施用治疗有效量的(i)特异性结合αvβ8整合素的抗体或其抗原结合片段，和(ii)抗PD1、抗PD-L1或抗PD-L2免疫检查点分子的调节剂。
E283.实施方案E282所述的方法，其中所述癌症为鳞状细胞癌。
E284.实施方案E282所述的方法，其中所述癌症为乳腺癌或结肠癌。
E285.实施方案E282至E284中任一项所述的方法，其中所述调节剂选自由以下各项组成的组：抗PD1抗体、抗PD-L1抗体和抗PD-L2抗体。
附图说明
当结合附图阅读时将更好地了解上述发明内容以及本发明的以下发明详述。出于举例说明本发明的目的，显示以下一个或多个附图实施方案，然而，应当理解，本发明不限于所显示的精确排列和手段。
图1A显示了比较小鼠杂交瘤抗体ADWA11(称为“mADWA11”“ADWA11”或“杂交瘤小鼠ADWA11”；SEQ ID NO:20)、人源化ADWA11 VH05-2/VK01(2.4)抗体(“huADWA11-2.4”、“ADWA11 2.4”或“人源化ADWA11-2.4”；SEQ ID NO:6)和IGHV3-07种系(“IMGT”或“DP-54”；SEQ ID NO:195)序列的重链可变区氨基酸序列的序列比对。根据Kabat，带下划线的氨基酸残基为CDR序列。
图1B显示了比较小鼠杂交瘤抗体ADWA11(称为“mADWA11”“AWDA11”或“杂交瘤小鼠ADWA11”；SEQ ID NO:21)、人源化ADWA11 VH05-2/VK01(2.4)抗体(“huADWA11-2.4”、“ADWA11 2.4”或“人源化ADWA11 2.4”；SEQ ID NO:7)和IGKV1-39种系(“IMGT”或“DPK-9”；SEQ ID NO:196)序列的轻链可变区氨基酸序列的序列比对。根据Kabat，带下划线的氨基酸残基为CDR序列。
图2显示了如通过ELISA所确定的，比较小鼠杂交瘤抗体ADWA2和ADWA11对人类整合素αvβ3(“AVB3”)和αvβ6(“AVB6”)的结合特异性的代表性图。ADWA2和ADWA11不结合整合素αvβ3(“AVB3”)和αvβ6(“AVB6”)，而对照αV结合抗体(“AlphaV mAb”)结合αvβ3和αvβ6两者。
图3A显示了代表性图，其显示了如通过ELISA所确定的，小鼠杂交瘤ADWA11抗体结合至人类αvβ8。
图3B显示了代表性图，其显示了如通过ELISA所确定的，人源化抗体ADWA11 VH05/VK01(2.4)结合至人类αvβ8。
图4A显示了代表性图，其显示了如通过ELISA所确定的，与亲本人源化ADWA11_VH05/VK01(ADWA VH_1.5和ADWA VL_1.1)抗体与人类αvβ8的结合亲和力相比，重链可变区中具有K30A、N55Q、N57Q、D61E、P62A或K63A氨基酸置换的ADWA11 VH05/VK01 Fab与人类αvβ8的结合亲和力。重链可变区中具有K30A、N55Q、N57Q、D61E、P62A或K63A氨基酸置换的Fab保持对人类αvβ8的结合亲和力。
图4B显示了代表性图，其显示了如通过ELISA所确定的，与亲本ADWA11 VH05-2/VK01抗体与人类αvβ8的结合亲和力相比，重链可变区中具有氨基酸置换(例如F64V)或轻链可变区中具有氨基酸置换(例如，L30S、Y55A、A60Q、M94Q、L97Y、F101L、F101W或Q105G)的ADWA11 VH05-2/VK01 Fab与人类αvβ8的结合亲和力。与人源化ADWA11 VH05-2/VK01抗体相比，轻链可变区中具有Y55A、A60Q、F101L或F101W氨基酸置换的Fab表现出与人类αvβ8的结合亲和力降低。所测试的其他Fab保持对人类αvβ8的结合亲和力。
图4C显示了代表性图，其显示了如通过ELISA所确定的，并且与亲本抗体(VH05-2_VK01亲本)相比，具有如表5中所示的氨基酸置换的组合的称为VH05-2/VK01(2.1)(ADWA112.1)、VH05-2/VK01(2.2)(ADWA 2.2)、VH05-2/VK01(2.3)(ADWA 2.3)、VH05-2/VK01(2.4)(ADWA 2.4)、VH05-2(F64V)/VK01(2.1)、VH05-2(F64V)/VK01(2.3)和VH05-2(F64V)/VK01(2.4)的ADWA11 VH05-2/VK01Fab与人类αvβ8的结合亲和力。所测试的每种Fab保持对人类αvβ8的结合亲和力。
图5显示了如通过Biacore所确定的，比较小鼠杂交瘤ADWA11(“MsADWA11”或“mADWA11”)和人源化ADWA11 VH05-1/VK01(“ADWA11 5-1_1”)和ADWA11 VH05-2/VK01(“ADWA11 5-2_1”)对人类整合素αvβ3(avb3)和αvβ6(avb6)的结合特异性的代表性图。ADWA11抗体不结合整合素αvβ3(avb3)和αvβ6(avb6)，而对照αV结合抗体(“抗av”)结合αvβ3和αvβ6两者。
图6A显示了杂交瘤ADWA11(“Ms ADWA11”)Fab与人类αvβ8的代表性Biacore结合痕量。
图6B显示了也称为ADWA11 VH05-2/VK01(2.4)或“ADWA11 2.4”Fab的人源化ADWA11_5-2 2.4 Fab与人类αvβ8的代表性Biacore结合痕量。
图6C显示了代表性表格，其显示了如通过Biacore评估，与亲本小鼠抗体Fab(“MsADWA11”)相比，在本文中称为ADWA11 5-2 2.4(也称为ADWA11 2.4和ADWA11 VH05-2/VK01(2.4))的人源化Fab ADWA11保持对人类αvβ8的亲和力和跨物种反应性。ADWA11 5-22.4表现出对人类、食蟹猴、小鼠和大鼠αvβ8的相等的亲和力，其中KD＜200pM。亲本小鼠抗体表现出对人类、食蟹猴和小鼠αvβ8的相等的亲和力，其中KD为489-536pM。
图7A显示了比较重链可变区中具有单个氨基酸置换(例如，F64V)或轻链可变区中具有单个氨基酸置换(例如，L30S、M94Q、L97Y、F101L或Q105G)的ADWA11 VH05-2/VK01(亲本)Fab(“ADWA11”)的U251细胞结合数据的代表性图。与亲本抗体相比，轻链可变区中具有F101L氨基酸置换的Fab表现出与U251细胞(人类αvβ8)的结合降低。所测试的其他Fab保持与U251细胞(人类αvβ8)的结合。
图7B显示了比较轻链可变区中具有单个氨基酸置换(例如，M56A或N58S)的ADWA11VH05-2/VK01(亲本)Fab(“ADWA11”)的U251细胞结合数据的代表性图。M56A和N58S Fab保持与U251细胞(人类αvβ8)的结合。
图7C显示了代表性图，其显示了与亲本抗体相比，具有根据表5称为2.1、2.2、2.3、2.4、2.1(F64V)、2.3(F64V)和2.4(F64V)的氨基酸置换的组合的ADWA11 VH05-2/VK01 Fab(“ADWA11”)的U251细胞结合数据。所测试的每种Fab保持与经固定的U251细胞的结合。
图8显示了比较抗体ADWA11 mIgG_4mut和ADWA11 VH05/VK01与U251细胞的结合亲和力的代表性图。
图9A显示了代表性图，其显示了具有氨基酸置换的组合的称为ADWA11_VH05-2/VK01(2.1)和ADWA11_VH05-2/VK01(2.4)的ADWA11 VH05-2/VK01与U251(人类胶质母细胞瘤)或C8-S(小鼠星形胶质细胞)细胞的结合。ADWA11 VH05-2/VK01(2.1)和ADWA11 VH05-2/VK01(2.4)抗体保持与U251细胞(人类avb8)和C8-S(小鼠avb8)的结合。
图9B显示了描绘整合素特异性抗体(例如，ADWA11 VH05-2/VK01(2.4))与表达αvβ3、αvβ5、αvβ6和αvβ8的HEK细胞的结合的代表性图。结果显示了ADWA11 VH05-2/VK01(2.4)与表达αvβ8的HEK细胞的饱和结合和没有与表达αvβ3、αvβ5、αvβ6的细胞的结合。结果证明ADWA11 VH05-2/VK01(2.4)与人类αvβ8的特异性结合。
图10A显示了比较小鼠杂交瘤ADWA11(“mFab”)和人源化ADWA11 Fab：ADWA11VH01/VK01、ADWA11 VH02/VK01、ADWA11 VH02/VK02、ADWA11 VH05/VK02和ADWA11 VH05/VK01对U251细胞的TGFβ反式激活的作用的代表性图。VH01/VK01、VH02/VK01和VH02/VK02Fab显示活性降低，而VH05/VK01保持活性，并且与小鼠杂交瘤ADWA11 Fab(“mFab”)相比，VH05/VK02表现出改善的活性以阻断U251反式激活测定中的TGFβ活化。
图10B显示了比较重链可变区中具有氨基酸置换(例如F64V)或轻链可变区中具有氨基酸置换(例如，L30S、M94Q、L97Y、F101L、F101W或Q105G)的指定ADWA11 VH05-2/VK01Fab对U251细胞中的TGFβ反式激活的作用的代表性图。与人源化亲本ADWA11VH05-2/VK01Fab相比，轻链可变区中具有F101L或F101W单个氨基酸置换的Fab显示对TGFβ反式激活的作用降低。所测试的其他Fab在TGFβ反式激活测定中保持活性。
图10C显示了比较具有氨基酸置换，包括根据表5称为2.1、2.2、2.3、2.4、2.1(F64V)、2.3(F64V)和2.4(F64V)的氨基酸置换的组合的ADWA11 VH05-2/VK01 Fab的作用的代表性图。与亲本ADWA11 VH05-2/VK01 Fab相比，VH02-2/VK01(2.3)和VH05-2(F64V)/VK01(2.3)Fab显示对TGFβ反式激活的作用降低。所测试的其他Fab在TGFβ反式激活测定中保持活性。
图10D显示了比较重链可变区中具有指定氨基酸置换(例如F64V)或轻链可变区中具有指定氨基酸置换(例如，L30S、M94Q、L97Y、Q105G、M56A或N58S)的ADWA11 VH05-2/VK01(亲本)Fab的作用的代表性图。与亲本ADWA11 VH05-2/VK01 Fab相比，所测试的Fab在TGFβ反式激活测定中保持活性。
图10E显示了代表性图，其显示了人源化ADWA11 VH05/VK01、VH05/VK01-D61E(VH05-1/VK01)和VH05/VK01-N55Q-D61E(VH05-2/VK01)IgG对U251细胞的TGFβ反式激活的作用。所测试的抗体在TGFβ反式激活测定中保持活性。
图10F描绘了代表性图，其显示了与同型对照抗体相比，ADWA11_VH05-2_VK01(2.4)对U251细胞(左图)和C8-S(右图)的TGFβ反式激活的作用。额外实验证明，使用U251细胞的TGFβ反式激活测定中ADWA11 VH05-2/VK01(2.4)的IC50为199±93.6pM(平均值±标准偏差)。
图11显示了代表性图，其显示了与表1中所阐述的阳性对照肽相比，不同ADWA11VH05-2VK01 CDR肽的应答者(抗原性)的百分比。肽抗原性评分用于选择具有降低的免疫原性风险的可能的CDR序列。
图12A显示了代表性图，其显示了EMT6乳腺癌肿瘤模型中抗αvβ8(ADWA11)、抗PD1抗体(“PD-1”，RMP1-14)、mIgG1_4mut同型(2B8)和大鼠IgG2a同型(2A3)处理的组合的功效。每周三次使用数显卡尺来测量肿瘤生长，并且以肿瘤体积(长度×宽度×宽度×0.5)报道。绘制各处理组中平均肿瘤体积+/-SEM，直至各组中10只小鼠剩余少于8只。存活定义为达到1000mm3的时间。与所测试的其他组合相比，抗PD1和ADWA11的组合更大程度地抑制肿瘤生长和改善总存活率。
图12B显示了代表性图，其显示了上图中1、3、10和20mg/kg的抗αvβ8抗体(ADWA11)作为单一疗法和同型对照(mIgG1_4mut同型(2B8))在EMT6乳腺癌模型中的功效。还显示了EMT6乳腺癌肿瘤模型中1、3、10和20mg/kg的抗αvβ8抗体ADWA11与抗PD1抗体(RMP1-14，10mg/kg)的组合和大鼠IgG2a同型(2A3)。在研究的第0天、第4天和第8天用抗体处理小鼠，并且每周三次使用数显卡尺来测量肿瘤生长，并且以肿瘤体积(长度×宽度×宽度×0.5)报道。
图13显示了代表性图，其显示了抗αvβ8(ADWA11)、抗41BB(MAB9371)、抗CTL4(9D9)、mIgG1_4mut同型(2B8)和大鼠IgG2a同型(2A3)处理的组合在EMT6肿瘤模型中的功效。每周三次使用数显卡尺来测量肿瘤生长，并且以肿瘤体积(长度×宽度×宽度×0.5)报道，绘制各处理组中的平均肿瘤体积+/-SEM，直至各组中10只小鼠剩余少于8只，并且存活定义为达到1000mm3的时间。与所测试的其他组合相比，抗4-1BB和ADWA11或抗CLTA4和ADWA11处理的组合更大程度地抑制肿瘤生长和改善总存活率。
图14A描绘了代表性图，其显示了在CT26肿瘤模型中，与辐射疗法与同型对照(mIgG4mut(2B8)+5Gy辐射组)相比，抗αvβ8抗体和辐射疗法(ADWA11+5Gy辐射组)的组合更大程度地抑制肿瘤生长和改善总存活率。每周3次使用数显卡尺来测量肿瘤生长，并且以肿瘤体积(长度×宽度×宽度×0.5)报道，绘制各处理组中的平均肿瘤体积+/-SEM，并且存活定义为达到1000mm3的时间。*p＜0.05相比于无处理，**P＜0.05相比于辐射+2B8。
图14B上图描绘了在第12天从在第0天、第4天和第8天用10mg/kg同型对照(对照)或ADWA11抗体(抗ITGαVβ8)处理的小鼠收集的CT26肿瘤组织中的CD45、CD8和表达颗粒酶B的细胞的密度，n＝6；p＝P值。下图描绘了在第一个10mg/kg剂量的同型对照(同型)、ADWA11抗体(抗ITGαVβ8)、与5Gy的肿瘤靶向辐射组合的同型或与5Gy的肿瘤靶向辐射组合的ADWA11抗体后12天收集的肿瘤组织中CD45、CD8、颗粒酶B和IFNγ的基因表达。抗体处理在研究的第1天、第4天和第8天静脉内施用，并且辐射疗法在研究的第5天施用。各处理组中包括五只小鼠；以图表表示平均值和平均值的标准误差。
图15描绘了代表性曲线图，其显示了EMT6肿瘤模型中CD45(总淋巴细胞和骨髓细胞)、CD3(总T细胞)、CD4 T细胞、CD8 T细胞和颗粒酶B(活化的CD8和NK细胞)的密度的IHC分析。ADWA11(2.4)(本文中也称为ADWA11VH05-2/VK01(2.4))处理增加所分析的所有细胞类型的密度。每组N＝10，p值是针对图上标记的双尾t检验。
图16A显示了示意图，其显示了CCK168肿瘤模型的治疗方案。提供了四个处理组的肿瘤细胞植入和腹膜内(i.p.)抗体注射的时间线。
图16B显示了在CCK168肿瘤模型中使用2000mm3的肿瘤体积作为存活临界值(cutoff)的代表性Kaplan-Meier存活曲线。各组中n＝10。通过对数-秩和Mantel-Cox检验，**p＜0.01。
图16C描绘了代表性图，其显示了图16B中所示的肿瘤的个体生长曲线。当肿瘤达到≥2000mm3时或如果观察到大量肿瘤溃烂，则在45天终点之前处死小鼠。与抗PD1抗体、ADWA11或单独同型对照处理或仅累加在一起的个体效果相比，抗PD1抗体和ADWA11处理的组合更大程度地协同抑制肿瘤生长和改善总存活率。显示的数据是3个独立的生物学重复的代表。
图17A描绘了鉴定肿瘤浸润性单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞的门控策略。活的单细胞首先用包括Ly6G、SiglecF、CD90和B220的集堆门(dump gate)进行门控，以消除中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、淋巴细胞和B细胞。随后通过流式细胞术分析和门控阴性染色的细胞。巨噬细胞被鉴定为CD45+CD11b+CD64高F4/80高，以及树突状细胞被鉴定为CD45+CD11b+F4/80-CD64-MHCII高CD11c高。在巨噬细胞群中，与免疫刺激性巨噬细胞同一的特征被鉴定为Ly6C高CD206低，并且免疫抑制性巨噬细胞被鉴定为Ly6C低CD206高。集堆通道Ly6G+SiglecF+CD90.2+B220+。
图17B显示了代表性图，其显示了针对作为图17A中所述的解聚肿瘤中的多色流式细胞术图的一部分分析的整合素αvβ8的细胞表面染色。代表性流式细胞术图显示了CCK168肿瘤模型中荧光减一(fluorescence minus one；FMO)对照染色和ADWA11抗体染色。N＝4个肿瘤。
图18A描绘了代表性图，其显示了从CCK168分离的CD45阴性细胞上的ADWA11染色。针对CD45的存在分析活的单细胞。使用ADWA11抗体，CCK168肿瘤模型中4％的CD45阴性细胞对αvβ8表达呈阳性。
图18B描绘了αvβ8在CCK168、CT26和EMT6细胞系中的表达。使用同型和抗αvβ8(ALDWA11)染色抗体通过流式细胞术分析活的单细胞的αvβ8表达。CCK168和EMT6细胞系具有可检测到的αvβ8表达，而CT26细胞系不具有可检测到的αvβ8表达。
图19A描绘了代表性图，其显示了具有CCK168肿瘤的小鼠的瘤内CD8+ T细胞总数，所述小鼠用单独的对照抗体、抗PD1、ADWA11或组合的抗PD1和ADWA11进行处理。显示了所有CD45+细胞的CD4和CD8表达的代表性流式细胞术图以及各组中的各小鼠的CD8+细胞数与CD45+细胞的比率。
图19B显示了从各处理组中的小鼠收获的针对抗CD8和DAPI染色的CCK168肿瘤切片的代表性免疫荧光显微图。比例尺为50μm。
图19C显示了代表性流式细胞术图，其显示了针对CD8表达进行门控的细胞中颗粒酶B的细胞内染色，以及各组中的各小鼠中表达可检测到的颗粒酶B的CD8+细胞的百分比。
图19D显示了代表性流式细胞术图，其显示了门控为CD45+Ly6G-CD11b+CD64高F4/80高的细胞的免疫刺激性巨噬细胞(Ly6c高，CD206低)和免疫抑制性巨噬细胞(CD206高，Ly6c低)。在巨噬细胞群中，免疫刺激性巨噬细胞被鉴定为Ly6C高CD206低，并且免疫抑制性巨噬细胞被鉴定为Ly6C低CD206高，以及各小鼠的免疫刺激性巨噬细胞的百分比。图中的数据为平均值±SEM，每组n＝10。通过单向ANOVA，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001。
图20描绘了代表性图，其显示了在CCK168肿瘤微环境中CD4+和CD8+ T细胞上的ADWA11染色。活的单CD45+细胞针对CD4和CD8进行门控，并且用ADWA11染色。显示了来自4个处理组中的每一个的小鼠的代表性图。
图21A显示了代表性图，其显示了CD8+ T细胞的免疫耗竭。显微图显示了在先前有或没有用抗CD8耗竭性抗体或同型对照抗体处理的情况下，在组合性抗PD-1/ADWA11疗法之后分离的CCK168肿瘤中，用DAPI复染色的抗CD8的免疫染色。
图21B显示了代表性图，其显示了在ADWA11/抗PD-1组合疗法之前24小时用抗CD8耗竭性抗体或同型对照抗体预处理的CCK168肿瘤的平均肿瘤生长曲线。
图21C显示了代表性图，其显示了在ADWA11/抗PD-1组合疗法之后，用抗CD8耗竭性抗体或同型对照抗体提前一天预处理的具有CCK168肿瘤的小鼠的存活。数据报道为存活百分比，各组中n＝10。通过对数-秩和Mantel-Cox测试，**p＜0.01。
图22A显示了代表性图，其显示了从用ADWA-11或对照抗体处理的小鼠收获的并且用检测巨噬细胞的针对CD8、F4/80的抗体和检测TGFβ信号传导的磷酸化SMAD3(pS3)染色的CCK168肿瘤。左侧显示了低倍率合并图像和仅显示pSMAD3的图像，并且右侧显示了放大的合并图像和来自方形区域的各单个抗体的图像。
图22B显示了代表性图，其描绘了对照和ADWA11处理的小鼠中的pSmad3(pS3)染色密度的定量。ADWA11处理降低CCK168肿瘤中的pSmad3密度。
图23A显示了代表性图，其阐述在30种不同人类癌症中针对整合素-β8mRNA表达从癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas；TCGA)提取的数据。各点代表单个肿瘤样品。此图中所示的结果是基于由TCGA研究网(TCGA Research Network)产生的数据。
图23B显示了代表性图，其显示了针对成熟单核细胞(CD16+单核细胞)、肿瘤相关巨噬细胞(CD14+巨噬细胞)、两种单核细胞衍生的树突状细胞群(BCDA1+moDC和BCDA3+moDC)或嗜酸性粒细胞进行门控并且针对αvβ8表达而染色的新鲜、去鉴定的卵巢癌和肾细胞癌的解聚细胞的流式细胞术数据。还分析了来自正常扁桃体的组织作为对照。门控策略显示于图23C中；各肿瘤类型n＝2。
图23C为代表性图，其显示了人类肿瘤活组织检查样品。活的单CD45+细胞针对SSC-A(hi)进行门控以移除粒细胞。SSC-A(lo)针对HLA-DR+CD3-进行门控并用CD14和CD16进行染色。CD14+CD16+指定为CD16+单核细胞。CD16-细胞针对CD11c进一步染色。CD14+CD11c+细胞用CD1c和CD141进一步染色。CD1c+CD141-指定为CD1c+MoDC。CD141+CD1c-指定为CD141+MoDC。CD1c-CD141-细胞用CD64进一步染色，并且CD64+群指定为CD14+TAM。
图24A显示了代表性图，其显示了用浓度为0.01至10mg/ml范围内的ADWA11进行TMLC细胞共培养生物测定的结果。基于PAI-1萤光素酶报道分子活性，将TGFβ活性报道为相对萤光素酶单位。每个ADWA11剂量n＝3，重复3次。
图24B显示了代表性图，其显示了在浓度为0.001至10mg/ml的ADWA-11存在的情况下，在用TGFβ1的潜伏相关肽(LAP)包被的培养皿上进行的细胞黏附测定的结果。黏附细胞用结晶紫染色，并且黏附表示为595nm处的吸光度。每个ADWA11剂量n＝3，重复3次。
图24C描绘了代表性图，其显示了针对整合素αvβ3、αvβ5、αvβ6和αvβ8的抗体用于野生型结肠癌细胞、SW-480(其不表达这些整合素中的任一种)或经转染以表达β3(SW-itgb3)、β6(SW-itgb6)或β8(SW-itgb8)的SW-480细胞的流式细胞术。针对所测试的各抗体和细胞类型显示了代表性流式细胞术图。
图25A显示了代表性图，其描绘了在TG32小鼠中拟合为0.1、0.3和3mg/kg i.v.给药ADWA11(2.4)的二室非线性药代动力学模型。圆圈：观测数据。线：模型拟合。
图25B显示了代表性图，其描绘了在TG32小鼠中拟合为3mg/kg i.v.给药ADWA112.4的二室药代动力学模型。圆圈：观测数据。线：模型拟合。
图26显示了代表性图，其描绘了在分别以4、40和100mg/kg单次IV推注施用之后，食蟹猴中的ADWA11 2.4的二室药代动力学。圆圈：观测数据。线：模型拟合。
图27A-27B显示了代表性图，其说明了在12mg/kg Q28D和7mg/kg Q14D之后，预测的人类ADWA11 2.4药代动力学。CP为预测的血浆浓度；CAVG为Cavg或平均血浆浓度；啮齿动物NOAEL为在啮齿动物中无观察到的不良作用水平的Cave；并且NHP NOAEL为在非人类灵长类动物中无观察到的不良作用水平的Cave。
图28描绘了代表性图，其显示了使用2000mm3的肿瘤体积作为CCK168肿瘤模型的存活临界值的Kaplan-Meier存活曲线。处理组为同型对照、抗PD1抗体、ADWA11_4mut和抗PD1抗体和ADWA11_4mut的组合。与抗PD1抗体、ADWA11_4mut或单独的同型对照处理或组合处理的预期加成作用相比，抗PD1抗体和ADWA11_4mut处理的组合更大程度地协同改善总存活率。
图29A显示了描绘代表性存活曲线的图，并且图29B显示了在第5天植入有皮下CT26细胞并且用同型对照抗体、抗PD1、ADWA11_4mut或抗PD1和ADWA11_4mut的组合加上5Gy辐射剂量处理的小鼠的代表性个体肿瘤生长曲线。一组用同型对照抗体处理的小鼠未接受辐射疗法。数据报道为存活百分比，各组中n＝10。通过对数-秩和Mantel-Cox测试，***p＜0.001，****p＜0.0001。
图29C显示了描绘处理开始后存活50天的CT26治愈小鼠中的代表性肿瘤再攻击的图。在开始与辐射疗法组合的免疫疗法后51天，将亲本CT26细胞植入CT-26治愈小鼠的原始肿瘤植入部位的对侧腹部。对照小鼠未接受辐射，并且先前未暴露于肿瘤细胞。跟踪再攻击的小鼠30天。对照，n＝10；RT加上抗PD1，n＝3；RT加上ADWA11_mut，n＝5；RT加上ADWA11_mut和抗PD1，n＝7。
图30A显示了描绘代表性存活曲线的图，以及图30B显示了描绘在用同型对照抗体、ADWA11_4mut、4-1BB、抗CTLA4、抗PD-1或ADWA-11_4mut和4-1BB、抗CTLA4或抗PD-1的组合处理后原位地植入有EMT6细胞的小鼠的代表性个体生长曲线的图。数据报道为存活百分比，各组中n＝10。通过对数-秩和Mantel-Cox测试，****p＜0.0001
图30C显示了描绘代表性存活曲线的图，以及图30D显示了描绘用抗CTLA4或4-1BB的活化剂处理的小鼠的代表性个体生长曲线的图。
图30E显示了描绘小鼠中肿瘤再攻击的结果的代表性图，所述小鼠在用ADWA-11_4mut和抗CTLA4的协同组合或ADWA-11_4mut和4-1BB的活化剂的协同组合处理后肿瘤完全消退下存活50天。对照小鼠先前未暴露于肿瘤。评估再攻击的小鼠30天。对照n＝5，ADWA-11_4mut+抗CTLA4 n＝6，ADWA-11_4mut+4-1BB n＝5。
图31A描绘了使用CD8a和颗粒酶B特异性taqman探针的MC38肿瘤组织中的mRNA基因表达分析。在指定剂量水平的第一剂同型对照或ADWA11 2.4抗体后12天收集肿瘤组织。在研究的第1天、第5天和第9天静脉内施用进行处理，各处理组中包括5只小鼠。*＝p值＜0.05。
图31B显示了代表性图，其描绘了同型(10mg/kg)、ADWA11 2.4(10mg/kg)、抗PD-1抗体(RMP1-14，10mg/kg)和组合ADWA11 2.4(10mg/kg)和抗PD1抗体(RMP1-14，10mg/kg)处理的小鼠中MC38肿瘤模型的肿瘤生长率。另外，代表性图显示了用与10mg/kg抗PD-1抗体(RMP1-14)组合的0.03、0.3、3和30mg/kg的剂量的ADWA11(抗ITGAVB8(ADWA11_mIgG_4mut)抗体处理的小鼠中MC38肿瘤的肿瘤生长率。对于所有图，在研究的第1天、第5天和第9天施用抗体。
发明详述
本文公开了特异性结合至αvβ8整合素(例如，人类αvβ8整合素)的抗体及其抗原结合片段，并且进一步公开了拮抗αvβ8整合素活性(例如，拮抗TGFβ的活化、拮抗TGFβ产生的介导、拮抗Treg和Th17细胞的调节)或其与TGFβ1和TGFβ3的相互作用或活性TGFβ的释放的抗体。提供了制备抗αvβ8整合素抗体、包含抗αvβ8整合素抗体的组合物的方法和使用抗αvβ8整合素抗体的方法。在一些实施方案中，提供了重组(例如人源化)抗体，其结合αvβ8整合素(例如，人类αvβ8整合素)。在一些实施方案中，还提供了能够形成结合αvβ8整合素的抗体的人源化抗体重链和轻链。在一些实施方案中，提供了包含一个或多个特定互补决定区(CDR)的人源化抗体、重链和轻链。在一些实施方案中，人源化抗αvβ8整合素抗体具有改变的效应功能。在一些实施方案中，相对于本发明的其他相同抗αvβ8整合素抗体，本发明的抗体具有降低的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)活性和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)活性。
提供了编码结合αvβ8整合素(例如，人类αvβ8整合素)的抗体或其抗原结合片段的多核苷酸。还提供了编码抗体重链或轻链的多核苷酸。提供了表达抗αvβ8整合素抗体(包括人源化抗体)的宿主细胞。提供了使用抗αvβ8整合素抗体(包括人源化抗体)的治疗方法。
抗αvβ8整合素抗体及其抗原结合片段，包括人源化抗体可用于预防、治疗和/或改善由异常(例如，增加的)TGFβ信号传导引起的和/或与其相关的疾病、病症或病况。这样的疾病、病症或病况包括癌症(例如，控制具有异常(例如，增加的)TGFβ信号传导的癌细胞的增殖)。
不希望受任何特定理论束缚，成熟TGFβ以无活性或潜伏形式存在于具有潜伏相关肽(LAP)域的复合物中。将αvβ8整合素结合至LAP引起活性TGFβ(例如，TGFβ1和TGFβ3)的释放。减少αvβ8整合素与LAP的结合可防止释放活性TGFβ，从而减少TGFβ信号传导。已知TGFβ例如在肿瘤微环境中具有免疫抑制效果，因此使用本文所述的抗体降低TGFβ活性和/或信号传导会引起免疫反应(例如体内抗肿瘤反应)的活化。因此，本公开内容的抗体及其抗原结合片段能够选择性拮抗免疫系统和/或肿瘤微环境中的TGFβ活性，因此增强受试者中的抗肿瘤免疫反应。在本文实施例中所公开的一些实施方案中，已显示针对αvβ8整合素的抗体及其抗原结合片段单独或与其他免疫调节剂(例如检查点抑制剂的调节剂(例如，PD-1、PD-L1、CTLA-4的抑制剂或4-1BB的激动剂))或抗癌疗法(例如放射疗法)组合会引起动物模型中几种癌症的生长抑制和/或完全肿瘤消退，所述癌症包括鳞状细胞癌、乳腺癌和结肠癌。因此，包括人源化抗体的抗αvβ8整合素抗体及其抗原结合片段单独或与第二疗法组合可用于预防、治疗和/或改善癌症，例如实体瘤，例如选自以下的实体瘤：肾细胞癌(RCC)、卵巢癌或头颈部鳞状细胞癌(SCCHN)。
本文所使用的章节标题仅出于组织目的并且不应解释为限制所描述的主题。
本文所引用的所有参考文献(包括专利申请、专利公开和Genbank登录号)均通过引用并入本文，如同每个单独的参考文献具体地并且单独地指出通过引用以其整体并入本文一般。
本领域技术人员通常充分理解并且通常使用常规方法来采用本文所描述的或所参考的技术和程序，例如在以下中描述的广泛使用的方法：Sambrook等人,MolecularCloning:A Laboratory Manual第3版(2001)Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(F.M.Ausubel等人编,(2003))；METHODS IN ENZYMOLOGY系列(Academic Press,Inc.)：PCR 2:A PRACTICALAPPROACH(M.J.MacPherson,B.D.Hames和G.R.Taylor编(1995))、Harlow和Lane编(1988)ANTIBODIES,A LABORATORY MANUAL和ANIMAL CELL CULTURE(R.I.Freshney编(1987))；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait编,1984)；Methods in Molecular Biology,Humana Press；Cell Biology:A Laboratory Notebook(J.E.Cellis编,1998)AcademicPress；Animal Cell Culture(R.I.Freshney编,1987)；Introduction to Cell andTissue Culture(J.P.Mather和P.E.Roberts,1998)Plenum Press；Cell and TissueCulture Laboratory Procedures(A.Doyle,J.B.Griffiths和D.G.Newell编,1993-8)J.Wiley and Sons；Handbook of Experimental Immunology(D.M.Weir和C.C.Blackwell编)；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(J.M.Miller和M.P.Calos编,1987)；PCR:The Polymerase Chain Reaction,(Mullis等人编,1994)；Current Protocols inImmunology(J.E.Coligan等人编,1991)；Short Protocols in Molecular Biology(Wileyand Sons,1999)；Immunobiology(C.A.Janeway和P.Travers,1997)；Antibodies(P.Finch,1997)；Antibodies:A Practical Approach(D.Catty编,IRL Press,1988-1989)；Monoclonal Antibodies:A Practical Approach(P.Shepherd和C.Dean编,OxfordUniversity Press,2000)；Using Antibodies:A Laboratory Manual(E.Harlow和D.Lane(Cold Spring Harbor Laboratory Press,1999))；The Antibodies(M.Zanetti和J.D.Capra编,Harwood Academic Publishers,1995)；和Cancer:Principles andPractice of Oncology(V.T.DeVita等人编,J.B.Lippincott Company,1993)；和其更新版本。
I.定义
通过参考下述本发明的示例性实施方案的详细描述和其中包括的实例可更易于理解本发明。
除非另外定义，否则本文中所使用的所有技术和科学术语具有本领域普通技术人员通常所理解的相同含义。在有冲突的情况下，将以本说明书(包括定义)为准。
此外，除非情况另有需要或另外明确地指出，否则单数术语应包括复数并且复数术语应包括单数。
应理解本文所述的本发明的方面和实施方案包括“由”方面和实施方案“组成”和/或“基本上由”方面和实施方案“组成”。除非另外指出，否则如本文所用，单数形式“一个(a)”、“一种(an)”和“所述(the)”包括复数个参考物。
在本申请中，除非明确地陈述或本领域技术人员所理解的，否则“或”的使用意味着“和/或”。在多项从属权利要求的情况下，“或”的使用是指一个以上的前述独立权利要求或从属权利要求。
“约”或“大致”与可测量的数值变量结合使用时是指变量的指定值，并且是指指定值的实验误差内(例如，平均值的95％置信区间内)或指定值的10％内(无论哪个更大)的变量的所有值。数值范围包括定义所述范围的数字。
尽管阐述本发明的广泛范围的数值范围和参数为近似值，但尽可能精确地报道具体实例中所阐述的数值。然而，任何数值均固有地含有某些必然由其各个测试测量中所发现的标准偏差造成的误差。此外，本文中所公开的所有范围应理解为涵盖其中所包含的任何和所有子范围。例如，“1至10”的所陈述的范围应视为包括最小值1与最大值10之间(并且包括端值)的任何和所有子范围；即，以最小值1或更大(例如1至6.1)开始并且以最大值10或更小(例如5.5至10)结束的所有子范围。
在整个本说明书和权利要求中，词语“包含”或例如“包括”或“含有”的变化形式应理解为意味着包括所陈述的整数或整数组但不排除任何其他整数或整数组。除非另外为情况所需，否则单数术语应包括复数并且复数术语应包括单数。在术语“例如”或“诸如”之后的任何一个或多个实例并不意味着穷尽性或限制性。
应理解在本文中任何地方的实施方案皆用语言“包含”描述，或还提供了用术语“由…组成”和/或“基本上由…组成”所描述的类似实施方案。
当本发明的方面或实施方案根据Markush组或其他替代组进行描述时，本发明不仅涵盖整体列出的全部组，而且单独地涵盖该组的各成员和主要组的所有可能亚组，并且还涵盖缺乏一个或多个该组成员的主要组。本发明还设想明确排除所要求保护的发明中的任何组成员中的一种或多种。
应理解，本文所用的术语仅出于描述特定实施方案的目的，并且不旨在限制。在本说明书和随后的权利要求中，将引用多个术语，所述术语应经定义而具有以下含义。
术语“经分离的分子”(其中分子为例如多肽、多核苷酸或抗体或其片段)是以下分子：其藉助于其来源或衍生源(1)不与在其天然状态下与其伴随的天然的相关组分结合；(2)实质上不含来自相同物种的其他分子；(3)由来自不同物种的细胞表达，或(4)自然界中不存在。因此，经化学合成或在与天然来源的细胞不同的细胞系统中表达的分子将与其天然相关组分“分离”。使用本领域众所周知的纯化技术，通过分离也可使分子实质上不含天然相关的组分。可通过本领域众所周知的多种方式测定分子纯度或均匀性。例如，使用本领域众所周知的技术，多肽样品的纯度可使用聚丙烯酰胺凝胶电泳和凝胶染色以使多肽可视化来测定。出于某些目的，可通过使用HPLC或本领域众所周知的用于纯化的其他方式来提供更高的分辨率。
如本文所用，“实质上纯的”是指目标种类是存在的主要种类(即，以摩尔计其比组合物中的任何其他单个种类更丰富)，并且优选地，实质上经纯化的级分为其中目标种类(例如，糖蛋白，包括抗体或受体)包含至少约50％(以摩尔计)的所存在的所有大分子种类的组合物。通常，实质上纯的组合物将包含超过约80％、更优选超过约85％、90％、95％和99％的组合物中所存在的所有大分子种类。最优选地，将目标种类纯化至基本均匀性(无法通过常规检测方法在组合物中检测到的污染种类)，其中组合物基本上由单个大分子种类组成。在某些实施方案中，实质上纯的材料是至少50％纯的(即，不含污染物)、更优选至少90％纯的、更优选至少95％纯的、还更优选至少98％纯的、以及最优选至少99％纯的材料。
如本领域中已知，术语“同一性”是指两个或更多个多肽分子或两个或更多个核酸分子的序列之间的关系，如通过比较所述序列而确定的。在本领域中，视具体情况而定，“同一性”还指多肽或核酸分子序列之间的序列相关性程度，如通过核苷酸或氨基酸序列串之间的匹配所确定的。“同一性”测量两个或更多个序列之间的同一匹配百分比，其中通过计算机程序的特定数学模型(即“算法”)解决缺口比对。
术语“相似性”为相关概念，但相比于“同一性”，其是指包括同一匹配与保守置换匹配的相似性量度。由于保守置换适用于多肽而非核酸分子，因此相似性仅涉及多肽序列比较。如果两个多肽序列具有例如10/20个同一氨基酸，并且剩余所有为非保守置换，则同一性和相似性百分比两者将均为50％。如果在同一实例中，还有5个位置存在保守置换，则同一性百分比仍为50％，但相似性百分比将为75％(15/20)。因此，在存在保守置换的情况下，两个多肽序列之间的相似性程度将高于这两个序列之间的同一性百分比。
根据本发明的多肽或抗体“片段”或“部分”可通过截短，例如通过从多肽的N端和/或C端末端移除一个或多个氨基酸来制备。可以这种方式从N末端和/或C末端移除多达10、多达20、多达30、多达40或更多个氨基酸。片段还可通过一个或多个内部缺失产生。
变体抗体可包含如上文所讨论的特定序列和片段的1、2、3、4、5、多达10、多达20、多达30个或更多个氨基酸置换和/或缺失和/或插入。“缺失”变体可包含缺失单个氨基酸；缺失较小氨基酸组，例如2、3、4或5个氨基酸；或缺失较大氨基酸区，例如缺失特定氨基酸域或其他特点。“插入”变体可包含插入单个氨基酸；插入较小氨基酸组，例如2、3、4或5个氨基酸；或插入较大氨基酸区，例如插入特定氨基酸域或其他特点。“置换”变体优选涉及用相同数目的氨基酸取代一个或多个氨基酸和进行保守氨基酸置换。例如，氨基酸可用具有相似特性的替代性氨基酸置换，例如另一种碱性氨基酸、另一种酸性氨基酸、另一种中性氨基酸、另一种带电氨基酸、另一种亲水性氨基酸、另一种疏水性氨基酸、另一种极性氨基酸、另一种芳族氨基酸或另一种脂族氨基酸。
置换变体将抗体分子中的至少一个氨基酸残基移除并且将不同残基插入其位置。最引人关注的置换型诱变的位点包括高变区，但也考虑框架改变。保守置换显示于“保守置换”的标题下。如果这样的置换导致生物活性变化，则可引入以下所示的命名为“示例性置换”或如下文关于氨基酸类别进一步描述的更实质性的变化，并且筛选产物。
氨基酸和置换
Figure BDA0002961224610000941
Figure BDA0002961224610000951
Figure BDA0002961224610000961
抗体生物特性的实质性修饰是通过选择置换来实现的，所述置换在维持以下的作用中显著不同：(a)多肽主链在置换区域中的结构，例如呈β片状或螺旋状构象；(b)分子在目标位点处的电荷或疏水性；或(c)侧链的堆积。基于常见侧链特性将天然存在的残基分为以下组：
i.非极性：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；
ii.极性，不带电荷：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；
iii.酸性(带负电)：Asp、Glu；
iv.碱性(带正电)：Lys、Arg；
v.影响链定向的残基：Gly、Pro；和
vi.芳族：Trp、Tyr、Phe、His。
通过将这些类别中的一种的成员交换成另一类别的成员来进行非保守置换。
例如可进行的一种类型的置换为将抗体中可化学反应的一个或多个半胱氨酸改变为例如但不限于丙氨酸或丝氨酸的另一残基。例如，可存在非典型(例如，不优选或常见)半胱氨酸的置换。置换可在抗体可变结构域的CDR或框架区或恒定区中进行。在一些实施方案中，半胱氨酸为典型的(例如，优选或最常见的)。不参与维持抗体的适当构象的任何半胱氨酸残基一般可用丝氨酸进行置换，以改善分子的氧化稳定性并且防止异常交联。相反，尤其当抗体为例如Fv片段的抗体片段时，可将一个或多个半胱氨酸键添加至抗体以改善其稳定性。
“抗体”为能够经由至少一个位于免疫球蛋白分子的可变区的抗原识别位点特异性结合至例如碳水化合物、多核苷酸、脂质、多肽等目标的免疫球蛋白分子。如本文所用，所述术语不仅涵盖完整多克隆或单克隆抗体，而且除非另外指定，否则还涵盖其与完整抗体竞争特异性结合的任何抗原结合片段、包含抗原结合片段的融合蛋白，以及包含抗原识别位点的免疫球蛋白分子的任何其他经修饰的构象。抗原结合片段包括例如Fab、Fab’、F(ab’)2、Fd、Fv、结构域抗体(dAb，例如鲨鱼和骆驼抗体)、包括互补决定区(CDR)的片段、单链可变片段抗体(scFv)、巨型抗体、微型抗体、内抗体、双抗体、三抗体、四抗体、v-NAR和双scFv和含有足以使特定抗原结合至多肽的至少一部分免疫球蛋白的多肽。
抗体包括任何类别的抗体，例如IgG、IgA或IgM(或其亚类)，并且所述抗体无需为任何特定类别。取决于免疫球蛋白重链(HC)的恒定区的抗体氨基酸序列，免疫球蛋白可分为不同类别。存在五大类免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且这些免疫球蛋白中的几个可以进一步划分成亚类(同型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应于不同类别的免疫球蛋白的重链恒定区分别称为α、δ、ε、γ和μ。不同类别的免疫球蛋白的亚单位结构和三维构象是众所周知的。
如本文中可互换地使用的术语抗体(或仅“抗体部分”)的“抗原结合部分”或“抗原结合片段”是指保持特异性结合至抗原(例如，αvβ8整合素)的能力的抗体的一个或多个片段。已证明抗体的抗原结合功能可由全长抗体的片段来执行。术语抗体的“抗原结合片段”内涵盖的结合片段的实例包括(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab’)2片段，包含两个由铰链区处的二硫桥键连接的Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体的单个臂的VL和VH结构域组成的Fv片段，(v)dAb片段(Ward等人，(1989)Nature 341:544-546)，其由VH结构域组成；和(vi)经分离的互补决定区(CDR)、二硫键连接的Fv(dsFv)和抗个体基因型(抗Id)抗体和内抗体。此外，尽管Fv片段的两个结构域VL和VH是通过单独的基因编码，但其可使用重组方法通过合成接头连接，所述合成接头使得其能够成为单个蛋白链，其中VL和VH区配对以形成单价分子(称为单链Fv(scFv))；参见例如Bird等人,Science 242:423-426(1988)和Huston等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883(1988))。此类单链抗体还旨在涵盖于术语抗体的“抗原结合片段”内。还涵盖单链抗体的其他形式，例如双抗体。双抗体为二价、双特异性抗体，其中VH和VL结构域表达在单个多肽链上，但使用很短而不允许同一链上的两个结构域之间配对的接头，从而迫使所述结构域与其他链的互补结构域配对并形成两个抗原结合位点(参见例如Holliger等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448(1993)；Poljak等人，1994,Structure 2:1121-1123)。
抗体可来源于任何包括但不限于人类、猴、猪、马、兔、狗、猫、小鼠等的哺乳动物或其他动物，例如鸟类(例如鸡)、鱼类(例如鲨鱼)和骆驼(例如美洲驼)。
抗体的“可变区”是指单独或组合形式的抗体轻链(VL)的可变区或抗体重链(VH)的可变区。如本领域中已知的，重链和轻链的可变区各自由通过三个“互补决定区(CDR)”(也称为高变区(HVR))连接的四个框架区(FR)组成，并且有助于抗体的抗原结合位点的形成。如果需要受试者可变区的变体，特别是在CDR区外部(即在框架区中)的氨基酸残基中具有置换，则可通过比较所述受试者可变区与其他抗体的可变区来鉴定合适的氨基酸置换，优选保守氨基酸置换，所述其他抗体的可变区含有与所述受试者可变区相同的典型类别的CDR1和CDR2序列(Chothia和Lesk,J.Mol.Biol.196(4):901-917,1987)。
在某些实施方案中，CDR的确定性划定以及包含抗体结合位点的残基的鉴定通过解析抗体的结构和/或解析抗体-配体复合物的结构来实现。在某些实施方案中，这可通过本领域技术人员已知的各种技术中的任一项来实现，例如X射线晶体分析法。在某些实施方案中，可采用各种分析方法以鉴定或近似鉴定CDR区。在某些实施方案中，可采用各种分析方法以鉴定或近似鉴定CDR区。这类方法的实例包括但不限于Kabat定义、Chothia定义、AbM定义、接触定义和构象定义。
对于编号形成CDR的氨基酸残基，本领域中存在几种编号方法。Kabat编号方法是用于编号抗体中的残基的标准并且通常还用于鉴定CDR。参见例如Johnson和Wu,2000,Nucleic Acids Res.,28:214-8。Chothia定义类似于Kabat定义，但Chothia定义考虑某些结构环区的位置。参见例如Chothia等人,1986,J.Mol.Biol.,196:901-17；Chothia等人,1989,Nature,342:877-83。AbM定义使用通过Oxford Molecular Group产生的计算机程序的集成套件进行抗体结构建模。参见例如Martin等人,1989,Proc Natl Acad Sci(USA),86:9268-9272；“AbMTM,A Computer Program for Modeling Variable Regions ofAntibodies,”Oxford,UK；Oxford Molecular,Ltd。AbM定义使用知识数据库和从头计算法的组合从一级序列对抗体的三级结构进行建模，例如通过以下描述的那些：Samudrala等人，1999，“Ab Initio Protein Structure Prediction Using a Combined HierarchicalApproach,”在PROTEINS,Structure,Function and Genetics Suppl.,3:194-198中。
接触定义是基于可用复合晶体结构的分析。参见例如MacCallum等人,1996,J.Mol.Biol.,5:732-45。在另一方法(在本文中称为CDR的“构象定义”)中，CDR的位置可鉴定为对抗原结合贡献焓的残基。参见例如Makabe等人,2008,Journal of BiologicalChemistry,283:1156-1166。虽然其他CDR边界定义可不严格遵循上述方法中的一种，但仍会与Kabat CDR的至少一部分重叠，但其可根据以下预测或实验发现而缩短或延长：具体残基或残基组不会显著影响抗原结合。如本文所用，CDR可指由本领域中已知的任何方法，包括方法的组合所定义的CDR。本文中所用的方法可利用根据这些方法中的任一项定义的CDR。对于任何含有超过一个CDR的给定实施方案，CDR可根据Kabat定义、Chothia定义、扩展定义、AbM定义、接触定义和/或构象定义中的任一项进行定义。
如本文所用的关于抗体或由此特异性结合的抗原的“接触残基”是指包含至少一个重原子(即，非氢)的抗体/抗原上存在的氨基酸残基，所述重原子在同源抗体/抗原上存在的氨基酸残基的重原子的
Figure BDA0002961224610001001
或更小范围内。
“框架”(FR)残基是除CDR残基以外的抗体可变结构域残基。VH或VL结构域框架包含四个框架子区FR1、FR2、FR3和FR4，穿插有呈以下结构的CDR：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。
可变结构域中的残基通常是根据Kabat编号，Kabat提供用于抗体的编译的重链可变结构域或轻链可变结构域的编号系统。参见Kabat等人，1991，Sequences of Proteinsof Immunological Interest,第5版.Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,MD。使用此编号系统，实际线性氨基酸序列可含有对应于可变结构域的FR或CDR的缩短或向其中插入的较少或额外的氨基酸。例如，重链可变结构域可包含H2的残基52后的单个氨基酸插入序列(根据Kabat的残基52a)和重链FR残基82后的插入残基(例如，根据Kabat的残基82a、82b和82c)。对于给定抗体，可通过将抗体序列的同源区与“标准”Kabat编号序列进行比对来确定残基的Kabat编号。用于分配Kabat编号的各种算法是可获得的。在Abysis的版本2.3.3(www.abysis.org)中实施的算法可用于将Kabat编号分配给可变区CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H2和CDR-H3，并且AbM定义随后可用于CDR-H1。
如本文所用，“单克隆抗体”是指从实质上均质的抗体(即除了可能以少量存在的可能的天然存在的突变以外构成所述群体的各个抗体是同一的)群体获得的抗体。单克隆抗体针对单个抗原位点具有高度特异性。此外，与典型地包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，各单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。修饰语“单克隆”指示抗体的特征是从实质上均质的抗体群获得，并且不应理解为需要通过任何特定方法来产生所述抗体。例如，根据本发明使用的单克隆抗体可通过首先由Kohler和Milstein,1975,Nature 256:495所描述的杂交瘤方法制备，或可通过例如美国专利号4,816,567中所描述的重组DNA方法制备。例如，单克隆抗体还可从使用McCafferty等人,1990,Nature348:552-554中所描述的技术产生的噬菌体文库中分离。如本文所用，“人源化”抗体是指非人类(例如鼠类)抗体的形式，其为含有来源于非人类免疫球蛋白的最小序列的嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(例如Fv、Fab、Fab’、F(ab’)2或抗体的其他抗原结合亚序列)。优选地，人源化抗体为具有所需要的特异性、亲和力和能力的人类免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体的CDR的残基被来自例如小鼠、大鼠或兔的非人类物种(供体抗体)的CDR的残基取代。人源化抗体可包含以下残基：既不存在于受体抗体中也不存在于所导入的CDR或框架序列中，但包括所述残基以进一步完善和优化抗体效力。
本发明的抗体或其抗原结合片段可以是亲和力成熟的。例如，亲和力成熟抗体可通过本领域中已知的程序产生(Marks等人,1992,Bio/Technology,10:`9-783；Barbas等人,1994,Proc Nat.Acad.Sci,USA 91:3809-3813；Schier等人,1995,Gene,169:147-155；Yelton等人,1995,J.Immunol.,155:1994-2004；Jackson等人,1995,J.Immunol.,154(7):3310-9；Hawkins等人,1992,J.Mol.Biol.,226:889-896；和WO2004/058184)。
“人类抗体”是具有以下氨基酸序列的抗体：对应于由人类产生和/或已使用如本文公开的制备人类抗体的技术中的任一项制备的抗体的氨基酸序列。人类抗体的此定义具体排除包含非人类抗原结合残基的人源化抗体。
术语“嵌合抗体”意指其中可变区序列来源于一个物种并且恒定区序列来源于另一物种的抗体，例如其中可变区序列来源于小鼠抗体并且恒定区序列来源于人类抗体的抗体，反之亦然。该术语还涵盖包含来自一个物种的一个个体(例如，第一小鼠)的V区和来自同一物种的另一个体(例如，第二小鼠)的恒定区的抗体。
术语“抗原(Ag)”是指用于免疫接种免疫活性的脊椎动物以产生识别Ag的抗体(Ab)或筛选表达文库(例如噬菌体、酵母或核糖体展示文库以及其他文库)的分子实体。在本文中，Ag被称为较概括的名称并且通常旨在包括被Ab特异性识别的目标分子，因此包括所述分子的片段或模拟物，其用于产生Ab的免疫接种过程或用于选择Ab的文库筛选。因此，对于结合至αvβ8整合素的本发明的抗体，来自哺乳动物物种(例如，人类、猴、小鼠和大鼠αvβ8整合素)的全长αvβ8整合素，包括单体和多聚体，例如其二聚体、三聚体等，以及αvβ8整合素的截短和其他变体称为抗原。
一般来说，术语“表位”是指与抗体特异性结合的抗原(例如，蛋白质、核酸、碳水化合物或脂质等)的区域或区，即与抗体物理接触的区域或区。因此，术语“表位”是指能够在一个或多个抗体的抗原结合区处被抗体识别并且与其结合的分子部分。通常，在“抗体或其抗原结合部分”(Ab)与其相应抗原之间的分子的相互作用的情况下定义表位。表位通常由例如氨基酸或糖侧链的分子的表面分组组成，并且具有特定三维结构特征以及特定电荷特征。在一些实施方案中，表位可是蛋白质表位。蛋白质表位可以是线性的或构象的。在线性表位中，蛋白质与相互作用分子(例如抗体)之间的所有相互作用点沿着蛋白质的一级氨基酸序列线性存在。“非线性表位”或“构象表位”包含在对表位具有特异性的抗体所结合的抗原蛋白质内的非相邻多肽(或氨基酸)。如本文所用，如通过本领域众所周知的任何方法(例如通过常规免疫测定)所确定的，术语“抗原表位”定义为可与抗体特异性结合的抗原的一部分。可替代地，在探索过程中，抗体的产生和表征可阐明关于所需要的表位的信息。根据此信息，随后可竞争性筛选结合至相同表位的抗体。实现这一点的方法是进行竞争和交叉竞争研究，以寻找为结合至αvβ8整合素而彼此竞争或交叉竞争的抗体，例如为结合至抗原而进行竞争的抗体。
与表位“优先结合”或“特异性结合”(在本文中可互换使用)的抗体是本领域众所周知的术语，并且用于测定这样的特异性或优先结合的方法也是本领域众所周知的。如果分子与特定细胞或物质的反应或缔合比其与替代性细胞或物质更频繁、更快速、持续时间更长和/或亲和力更高，则称该分子呈现“特异性结合”或“优先结合”。如果与抗体与其他物质的结合相比，抗体以更大的亲和力、亲合力、更容易和/或以更长的持续时间与目标结合，则抗体与目标“特异性结合”或“优先结合”。此外，如果与抗体与样品中存在的其他物质的结合相比，抗体以更大亲和力、亲合力、更容易和/或以更长持续时间与样品中的目标结合，则抗体与目标“特异性结合”或“优先结合”。例如，与抗体与其他αvβ8整合素表位或非αvβ8整合素表位的结合相比，特异性或优先结合至αvβ8整合素表位的抗体是以更大亲和力、亲合力、更容易和/或以更长持续时间结合该表位的抗体。通过阅读该定义还应理解，例如特异性或优先结合至第一目标的抗体(或部分或表位)可以或可以不特异性或优先结合至第二目标。由此，“特异性结合”或“优先结合”未必需要(尽管其可包括)排他性结合。通常，但不一定，提及结合意味着优先结合。“特异性结合”或“优先结合”包括化合物(例如蛋白质、核酸、抗体等)识别和结合至特定分子，但实质上不识别或结合样品中的其他分子。例如，识别并且结合至样品中的同源配体或结合伴侣(例如结合αvβ8整合素的抗αvβ8整合素抗体)但实质上并不识别或结合样品中的其他分子的抗体或肽受体特异性结合至该同源配体或结合伴侣。因此，在指定测定条件下，指定结合部分(例如，抗体或其抗原结合片段或受体或其配体结合部分)优先结合至特定目标分子，并且不大量结合至测试样品中存在的其他组分。
多种测定形式可用于选择特异性结合感兴趣的分子的抗体或肽。例如，固相ELISA免疫测定、免疫沉淀、BiacoreTM(GE Healthcare,Piscataway,NJ)、KinExA、荧光活化细胞分选(FACS)、OctetTM(FortéBio,Inc.,Menlo Park,CA)和蛋白质印迹(Western blot)分析在可用于鉴定抗体或其抗原结合片段或受体或其配体结合部分的许多测定中，所述抗体与抗原特异性反应，所述受体或其配体结合部分与同源配体或结合伴侣特异性结合。通常，特异性或选择性反应将是背景信号或噪声的至少两倍、更通常是背景的10倍以上、甚至更通常是背景的50倍以上、更通常是背景的100倍以上、还更通常是背景的500倍以上、甚至更通常是背景的1000倍以上以及甚至更通常是背景的10,000倍以上。另外，当平衡解离常数(KD)≤1μM、优选≤100nM、更优选≤10nM、甚至更优选≤100pM、还更优选≤10pM并且甚至更优选≤1pM时，称抗体“特异性结合”抗原。在一些实施方案中，当平衡解离常数(KD)≤7nM时，称抗体“特异性结合”抗原。
术语“结合亲和力”在本文中用作两个分子(例如抗体或其片段和抗原)之间的非共价相互作用的强度的量度。术语“结合亲和力”用于描述单价相互作用(固有活性)。
另外，为测定抗αvβ8整合素抗体与表达αvβ8整合素的细胞的结合亲和力，可进行细胞结合实验以测定表观亲和力。抗体与表达目标的细胞的表观亲和力可计算为平衡结合滴定曲线的EC50，其中抗原结合群体的几何平均荧光强度(gMFI)是通过流式细胞术进行定量的。
通过单价相互作用，两个分子(例如，抗体或其片段和抗原)之间的结合亲和力可通过测定解离常数(KD)进行定量。反之，KD可通过使用例如表面等离子体共振(SPR)方法(Biacore)对复合物形成和解离进行动力学测量来测定。对应于单价复合物的缔合和解离的速率常数分别称为缔合速率常数ka(或kon)和解离速率常数kd(或koff)。KD经由等式KD＝kd/ka与ka和kd相关。解离常数值可直接通过众所周知的方法测定，并且复合混合物的解离常数值甚至可通过例如诸如Caceci等人(1984,Byte 9:340-362)中所阐述的这些方法来计算。例如，KD可使用例如由Wong和Lohman(1993,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5428-5432)所公开的双过滤片硝化纤维过滤器结合测定来确立。用于评估配体(例如针对目标抗原的抗体)的结合能力的其他标准测定是本领域中已知的，包括例如ELISA、蛋白质印迹、RIA和流式细胞术分析和在本文中的其他地方所例示的其他测定。抗体的结合动力学和结合亲和力还可通过本领域中已知的标准测定来评估，例如诸如通过使用BiacoreTM系统或KinExA进行表面等离子体共振(SPR)。
可以进行竞争性结合测定，其中将抗体与抗原的结合与目标的另一配体(例如以其他方式结合目标的另一抗体或可溶性受体)与该目标的结合进行比较。出现50％抑制的浓度称为Ki。在理想条件下，Ki等于KD。Ki值应永不小于KD，因此可以方便地替换Ki的测量以提供KD的上限。
遵循上述定义，与不同分子相互作用相关的结合亲和力(例如比较不同抗体对给定抗原的结合亲和力)可通过比较单个抗体/抗原复合物的KD值来进行比较。抗体或其他结合伴侣的KD值可使用本领域中公认的方法进行测定。一种用于测定KD的方法是通过使用表面等离子体共振，通常使用生物传感器系统(例如
Figure BDA0002961224610001051
系统)。
类似地，相互作用的特异性可通过测定和比较感兴趣的相互作用(例如抗体与抗原之间的特异性相互作用)的KD值与非感兴趣的相互作用(例如已知并不结合αvβ8整合素的对照抗体)的KD值来进行评估。
特异性结合其目标的抗体可以以高亲和力结合其目标，其如上文所讨论的表现低KD，并且可以以更低亲和力结合至其他非目标分子。例如，抗体可以以1×10-6M或更大、更优选1×10-5M或更大、更优选1×10-4M或更大、更优选1×10-3M或更大、甚至更优选1×10-2M或更大的KD结合至非目标分子。本发明的抗体优选能够以与结合至另一非αvβ8整合素分子的抗体亲和力相比至少两倍、10倍、50倍、100倍、200倍、500倍、1,000倍或10,000倍或更大的亲和力结合至其目标。
如本文所用，关于抗体的术语“竞争”是指第一抗体或其抗原结合片段以充分类似于第二抗体或其抗原结合片段的结合的方式结合至表位，使得在第二抗体存在的情况下第一抗体与其同源表位的结合的结果相比于在第二抗体不存在的情况下第一抗体的结合可检测到地减少。替代方案可能但不必如此：在第一抗体存在下第二抗体与其表位的结合还可检测到地减少。即，第一抗体可抑制第二抗体与其表位的结合，而第二抗体并不抑制第一抗体与其相应表位的结合。然而，在各抗体可检测到地抑制另一抗体与其同源表位或配体结合的情况下，无论程度是否相同、更大或更小，所述抗体被称为彼此“交叉竞争”结合其相应的一个或多个表位。本发明涵盖竞争和交叉竞争抗体两者。无论发生这样的竞争或交叉竞争的机制(例如空间位阻、构象变化或结合至共同表位或其部分)是什么，本领域技术人员基于本文中所提供的教导将理解，这样的竞争和/或交叉竞争抗体被本文公开的方法涵盖并且可适用于本文公开的方法。
标准竞争测定可用于确定两个抗体是否与彼此竞争。一种用于抗体竞争的合适的测定涉及使用Biacore技术，其可使用表面等离子体共振(SPR)技术，通常使用生物传感器系统(例如
Figure BDA0002961224610001061
系统)测量相互作用的程度。例如，SPR可用于体外竞争性结合抑制测定，以确定一个抗体抑制第二抗体的结合的能力。用于测量抗体竞争的另一测定使用基于ELISA的方法。
此外，基于抗体竞争的用于将抗体“分组”的高通量方法描述于国际专利申请号WO2003/48731中。如果一种抗体(或片段)减少另一抗体(或片段)与αvβ8整合素的结合，则存在竞争。例如，可使用顺序结合竞争测定，其中顺序添加不同抗体。可添加第一抗体以达到接近饱和的结合。然后，添加第二抗体。如果未检测到第二抗体与αvβ8整合素的结合，或与在第一抗体不存在的情况下的平行测定(所述值可设定为100％)相比显著减少(例如减少至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％或至少约90％)，则将两种抗体视为彼此竞争。
另外，在实施例9中提供示例性抗体表位分组测定，其使用人类与小鼠αvβ8整合素蛋白质之间的结构域交换以评估几种抗体之间的可能表位。本领域技术人员结合本文提供的教导将理解，存在以下各种本领域中已知的测定，其可用于测定至少两种相对于彼此与目标的结合，并且本文包括这样的测定。
抗αvβ8整合素抗体可使用本领域众所周知的方法进行表征。例如，一种方法为鉴定其结合的表位或“表位定位”。本领域中已知许多对蛋白质上的表位位置进行定位和表征的方法，包括解决抗体-抗原复合物的晶体结构、竞争测定、基因片段表达测定和基于合成肽的测定，如例如Harlow和Lane,Using Antibodies,a Laboratory Manual,Cold SpringHarbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York,1999的第11章中所描述的。在额外的实例中，表位定位可用于确定抗αvβ8整合素抗体结合的序列。表位定位可从各种来源商购获得，例如Pepscan Systems(Edelhertweg 15,8219 PH Lelystad,TheNetherlands)。表位可以是线性表位，即包含在氨基酸的单一链段中；或构象表位，其由可能不一定包含在单一链段中的氨基酸的三维相互作用形成。不同长度(例如，至少4-6个氨基酸长)的肽可被分离或(例如，以重组方式)合成并用于抗αvβ8整合素抗体的结合测定。
另外，抗αvβ8整合素抗体结合的表位可通过使用来源于αvβ8整合素序列(例如，人类αvβ8整合素序列)的重叠肽和测定抗体结合在系统筛选中进行确定。根据基因片段表达测定，可将编码αvβ8整合素的开放阅读框随机或通过特异性基因构造片段化并测定αvβ8整合素与待测试的抗体的表达片段的反应性。基因片段可例如通过PCR产生，并且随后在放射性氨基酸存在的情况下体外转录并且翻译成蛋白质。随后通过免疫沉淀和凝胶电泳测定抗体与放射性标记的αvβ8整合素片段的结合。
某些表位还可通过使用展示于噬菌体颗粒(噬菌体文库)或酵母(酵母展示)的表面上的随机肽序列的大型文库来鉴定。可替代地，可在简单结合测定中测试重叠肽片段的定义文库与测试抗体的结合。在额外的实例中，可进行抗原的诱变、结构域交换实验和丙氨酸扫描诱变以鉴定表位结合所需、足够和/或必需的残基。例如，可使用突变的αvβ8整合素进行丙氨酸扫描诱变实验，其中αvβ8整合素多肽的各种残基已经用丙氨酸取代。通过评估抗体与突变的αvβ8整合素的结合，可评估特定αvβ8整合素残基对抗体结合的重要性。
可用于表征抗αvβ8整合素抗体的又一方法是使用竞争测定，其使用已知结合至相同抗原(即αvβ8整合素上的各种片段)的其他抗体以确定抗αvβ8整合素抗体是否结合至与其他抗体相同的表位。竞争测定是本领域技术人员公知的。
此外，可以使用各种实验和计算表位定位方法以不同的详细程度定义和表征给定抗体/抗原结合对的表位。所述实验方法包括诱变、X射线晶体分析法、核磁共振(NMR)光谱分析、氢/氘交换质谱分析(H/D-MS)和本领域众所周知的各种竞争结合方法。由于各方法依赖于独特原理，因此对表位的描述与测定表位的方法密切相关。因此，取决于采用的表位定位方法，将以不同方式定义给定抗体/抗原对的表位。
在其最详述的程度上，用于Ag和Ab之间的相互作用的表位可通过定义存在于Ag-Ab相互作用中的原子接触的空间坐标以及关于其对结合热力学的相对贡献的信息来定义。在不太详细的程度上，表位可通过定义Ag和Ab之间原子接触的空间坐标来表征。在更不详细的程度上，表位可通过其包含的氨基酸残基来表征，如由特定标准定义，例如由Ab和Ag中的原子(例如，重原子，即非氢原子)之间的距离定义。在更不详细的程度上，表位可通过功能，例如通过与其他Ab的竞争结合来表征。表位还可更一般地定义为包含氨基酸残基，对于所述氨基酸残基，被另一氨基酸置换将改变Ab和Ag之间的相互作用的特征(例如使用丙氨酸扫描)。
根据取决于所使用的表位定位方法而在不同细节程度下获得表位的描述和定义的事实，因此可类似地在不同细节水平下执行对同一Ag上的不同Ab的表位的比较。
如果在氨基酸程度下描述，例如从X射线结构确定的表位含有同一组氨基酸残基，则称所述表位是相同的。如果表位共享至少一个氨基酸，则称所述表位是重叠的。如果表位不共享氨基酸残基，则称所述表位是独立(独特)的。
如果相应抗体的结合是相互排他的，即一个抗体的结合排除另一抗体的同时或连续结合，则称特征在于竞争结合的表位是重叠的。如果抗原能够同时容纳两个相应抗体的结合，则称表位是独立(独特)的。
术语“互补位”的定义是通过颠倒观点而从上述“表位”的定义得出。因此，术语“互补位”是指特异性结合抗原的抗体上的区域或区，即与抗原(αvβ8整合素或其部分)进行接触的抗体上的氨基酸残基，正如在本文中的其他地方定义的“接触”。
给定抗体/抗原对的表位和互补位可通过常规方法来鉴定。例如，表位的大体位置可通过评估抗体结合至不同片段或变体αvβ8整合素多肽的能力来确定。与抗体(表位)进行接触的αvβ8整合素内的特定氨基酸和与αvβ8整合素(互补位)进行接触的抗体中的特定氨基酸还可使用常规方法(例如实例中所述的方法)来确定。例如，可将抗体和目标分子组合并且可使抗体/抗原复合物结晶。可测定复合物的晶体结构并且将其用于鉴定抗体与其目标之间相互作用的特定位点。
根据本发明的抗体可结合至与本文具体公开的本发明的抗体相同的表位或αvβ8整合素(例如人类αvβ8整合素)的结构域。出于这样的鉴定目的，可使用的分析和测定包括评估如实施例1-26中所描述的生物活性测定中感兴趣的抗体与αvβ8整合素受体之间的αvβ8整合素的结合竞争的测定。
抗体或其抗原结合片段可具有与本发明的另一抗体为结合至如本文所述的αvβ8整合素(例如，人类αvβ8整合素)而进行竞争或交叉竞争的能力。例如，本发明的抗体可与本文中所述的抗体为结合至αvβ8整合素或结合至与本文中所公开的抗体结合的αvβ8整合素的合适片段或变体而进行竞争或交叉竞争。
即，如果第一抗体与第二抗体竞争结合αvβ8整合素，但在第二抗体首先结合至αvβ8整合素的情况下，所述第一抗体并不进行竞争，则认为其与所述第二抗体竞争(也称为单向竞争)。在抗体与另一抗体竞争而不管哪个抗体首先结合至αvβ8整合素的情况下，则所述抗体与另一抗体“交叉竞争”结合至αvβ8整合素。可基于竞争或交叉竞争抗体在标准结合测定中与本发明的已知抗体竞争/交叉竞争的能力来鉴定这样的竞争或交叉竞争抗体。例如，可使用例如通过使用BiacoreTM系统的SPR、ELISA测定或流式细胞术证明竞争/交叉竞争。这样的竞争/交叉竞争可表明两个抗体结合至相同、重叠或类似的表位。
因此，本发明的抗体可通过包括结合测定的方法来鉴定，所述结合测定评估测试抗体是否能够与参考抗体竞争/交叉竞争目标分子上的结合位点。用于进行竞争性结合测定的方法公开于本文中和/或是本领域众所周知的。例如，其可涉及使用以下条件使本发明的参考抗体结合至目标分子：在所述条件下，抗体可结合至目标分子。随后可使抗体/目标复合物暴露于测试抗体/第二抗体并且可评估所述测试抗体能够置换来自抗体/目标复合物的本发明的参考抗体的程度。替代性方法可涉及在允许抗体结合的条件下使测试抗体与目标分子接触，随后添加能够结合该目标分子的本发明的参考抗体，并且评估本发明的参考抗体能够在多大程度上取代抗体/目标复合物中的测试抗体或同时结合至目标(即，非竞争抗体)。
测试抗体抑制本发明的参考抗体与目标结合的能力证明测试抗体可与本发明的参考抗体竞争结合目标并且因此所述测试抗体结合至与本发明的参考抗体相同或实质上相同的αvβ8整合素蛋白质上的表位或区域。在此类方法中被鉴定为与本发明的参考抗体竞争的测试抗体也是本发明的抗体。测试抗体可结合与本发明的参考抗体相同的αvβ8整合素区域并且可与本发明的参考抗体竞争的事实表明测试抗体可充当与本发明的抗体相同的结合位点处的配体并且该测试抗体因此可模拟参考抗体的作用，并且因此是本发明的抗体。这可通过在其他方面相同的条件下使用如本文中其他地方更充分描述的测定比较测试抗体存在的情况下αvβ8整合素的活性与参考抗体存在的情况下αvβ8整合素的活性来确认。
本发明的参考抗体或其抗原结合片段可以是如本文所述的抗体，例如如本文所述的表1中的抗体和其任何变体或片段，其保持结合至αvβ8整合素的能力。
如先前在本文中其他地方所述，特异性结合可参考抗体与并非目标的分子的结合来评估。这种比较可通过将抗体与目标结合的能力与抗体与另一分子结合的能力进行比较来进行。这种比较可如上文所述在KD或Ki的评估中进行。用于这种比较的其他分子可以是非目标分子的任何分子。优选地，其他分子与目标分子并不相同。优选地，目标分子并非目标分子的片段。
用于测定特异性结合的其他分子可在结构或功能方面与目标无关。例如，其他分子可为环境中的无关材料或伴随材料。
用于测定特异性结合的其他分子可为涉及与目标分子，例如αvβ8整合素(例如，人类αvβ8整合素)相同的体内途径的另一分子。通过确保本发明的抗体相比于另一这样的分子对αvβ8整合素具有特异性，可避免非所需的体内交叉反应。
本发明的抗体可保持结合至与目标分子相关的一些分子的能力。
可替代地，本发明的抗体可具有对特定目标分子的特异性。例如，其可结合至如本文中所述的一个目标分子，但可能并不结合或可能以显著降低的亲和力结合至如本文所述的不同的目标分子。例如，全长成熟人类αvβ8整合素可用作目标，但结合至该目标的抗体可能无法结合至或可能以较低亲和力结合至例如来自其他物种的其他αvβ8整合素蛋白质，例如其他哺乳动物αvβ8整合素。在一些实施方案中，抗体结合至人类和小鼠αvβ8整合素两者。
“Fc融合”蛋白是其中一个或多个多肽可操作地连接至Fc多肽的蛋白质。Fc融合将免疫球蛋白的Fc区与融合伴侣组合。
“天然序列Fc区”包含与自然界中所发现的Fc区的氨基酸序列相同的氨基酸序列。“变异Fc区”包含藉助于至少一个氨基酸修饰而与天然序列Fc区的氨基酸序列不同但又保留天然序列Fc区的至少一种效应功能的氨基酸序列。优选地，与天然序列Fc区相比或与亲本多肽的Fc区相比，在天然序列Fc区中或在亲本多肽的Fc区中，变异Fc区具有至少一个氨基酸置换，例如约一至约十个氨基酸置换，并且优选约一至约五个氨基酸置换。在本文中，变异Fc区与天然序列Fc区和/或与亲本多肽的Fc区优选具有至少约80％序列同一性，并且与其最优选具有至少约90％序列同一性，与其更优选具有至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％序列同一性。
如本领域中已知，抗体的“恒定区”是指单独或组合形式的抗体轻链的恒定区或抗体重链的恒定区。
如本文中可互换地使用的术语“IgG Fc区”、“Fc区”、“Fc结构域”和“Fc”是指IgG分子的一部分，其与通过木瓜蛋白酶消化IgG分子获得的可结晶片段相关。如本文所用，该术语涉及不包括第一恒定区免疫球蛋白结构域的抗体恒定区并且还涉及该区域的部分。因此，Fc是指IgA、IgD和IgG的最后两个恒定区免疫球蛋白结构域，和IgE和IgM的最后三个恒定区免疫球蛋白结构域以及这些结构域的柔性铰链N端或其部分。对于IgA和IgM，Fc可包括J链。对于IgG，Fc包含免疫球蛋白结构域Cγ2和Cγ3(C伽玛2和C伽玛3)以及Cγ1(C伽玛1)与Cγ2(C伽玛2)之间的铰链。虽然可改变Fc区的边界，但人类IgG重链Fc区通常定义为包含相对于其羧基端的残基C226或P230，其中编号是根据如Kabat等人,1991描述的Edelman等人,1969,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 63(1):78-85的Eu索引。通常，Fc结构域包含人类IgG1恒定结构域的约氨基酸残基236至约447。示例性人类野生型IgG1 Fc结构域氨基酸序列阐述于SEQ ID NO:81和SEQ ID NO:82(包括任选地末端赖氨酸(K)残基)中。Fc多肽可指代此独立区域，或在抗体或其抗原结合片段、或Fc融合蛋白的情况下的此区域。
重链恒定结构域包含Fc区并且进一步包含CH1结构域和铰链以及IgG重链的CH2和CH3(和任选地IgA和IgE的CH4)结构域。
“功能性Fc区”拥有至少一种天然序列Fc区的效应功能。示例性“效应功能”包括C1q结合；补体依赖性细胞毒性；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性；吞噬作用；细胞表面受体(例如B细胞受体)的下调等。这样的效应功能一般需要Fc区与结合结构域(例如，抗体可变结构域或其抗原结合片段)组合，并且可使用本领域中已知的用于评价这样的抗体效应功能的各种测定来进行评估。
“天然序列Fc区”包含与自然界中所发现的Fc区的氨基酸序列同一的氨基酸序列。天然序列人类Fc区包括天然序列人类IgG1 Fc区(非A和A异型)；天然序列人类IgG2 Fc区；天然序列人类IgG3 Fc区；和天然序列人类IgG4 Fc区，以及其天然存在的变体。
“变异Fc区”包含与天然序列Fc区的氨基酸序列相差至少一个氨基酸修饰的氨基酸序列。
“Fc受体”或“FcR”描述结合至抗体的Fc区的受体。在一些实施方案中，FcγR是天然人类FcR。在一些实施方案中，FcR是结合IgG抗体的FcR(γ受体)并且包括FcγRI、FcγRII和FcγRIII亚类的受体，包括这些受体的等位基因变体和可变剪接形式。FcγRII受体包括FcγRIIA(“活化受体”)和FcγRIIB(“抑制受体”)，其具有类似的氨基酸序列，不同之处主要在于其细胞质结构域。活化受体FcγRIIA在其细胞质结构域中含有基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)。抑制受体FcγRIIB在其细胞质结构域中含有基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)(参见，例如Daeron,Annu.Rev.Immunol.15:203-234(1997))。FcR例如在Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol 9:457-92(1991)；Capel等人,Immunomethods 4:25-34(1994)；和de Haas等人,J.Lab.Clin.Med.126:330-41(1995)中有所综述。其他FcR，包括将来鉴定的FcR，涵盖于本文的术语“FcR”。
术语“Fc受体”或“FcR”还包括新生儿受体FcRn，其负责将母体IgG转移至胎儿(Guyer等人,J.Immunol.117:587(1976)和Kim等人,J.Immunol.24:249(1994))并且调节免疫球蛋白的稳态。与FcRn的结合的测量方法是已知的(参见，例如Ghetie和Ward.,Immunol.Today 18(12):592-598(1997)；Ghetie等人,Nature Biotechnology,15(7):637-640(1997)；Hinton等人,J.Biol.Chem.279(8):6213-6216(2004)；WO 2004/92219(Hinton等人))。
“效应功能”是指可归因于抗体Fc区的生物活性，其随抗体同型变化。抗体效应功能的实例包括：Clq结合和补体依赖性细胞毒性(CDC)；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(例如B细胞受体)的下调；和B细胞活化。
“人类效应细胞”是表达一种或多种FcR并且执行效应功能的白细胞。在某些实施方案中，所述细胞至少表达FcγRIII并且执行一种或多种ADCC效应功能。介导ADCC的人类白细胞的实例包括外周血单核细胞(PBMC)、自然杀伤(NK)细胞、单核细胞、巨噬细胞、细胞毒性T细胞和中性粒细胞。效应细胞可从天然来源，例如从血液分离。
“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”或“ADCC”是指细胞毒性形式，其中结合至存在于某些细胞毒性细胞(例如，NK细胞、中性粒细胞和巨噬细胞)上的Fc受体(FcR)上的分泌Ig使得这些细胞毒性效应细胞能够特异性结合至携带抗原的目标细胞并且随后用细胞毒素杀死目标细胞。用于介导ADCC的初级细胞NK细胞仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。FcR在造血细胞上的表达概述于Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol.9:457-92(1991)的第464页的表3中。为评估感兴趣的分子的ADCC活性，可进行体外ADCC测定，例如美国专利号5,500,362或5,821,337或美国专利号6,737,056(Presta)中所述的体外ADCC测定。适用于这样的测定的效应细胞包括PBMC和NK细胞。可替代地或另外地，可在体内评估感兴趣的分子的ADCC活性，例如在动物模型中，例如Clynes等人,Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)95:652-656(1998)中所公开的动物模型。例如在美国专利号7,923,538和美国专利号7,994,290中描述了具有改变的Fc区氨基酸序列和提高或降低的ADCC活性的另外的抗体。
具有“增强的ADCC活性”的抗体是指在体外或体内介导ADCC方面相比于亲本抗体更有效的抗体，其中所述抗体和亲本抗体在至少一个结构方面不同，并且当用于测定时这样的抗体和亲本抗体的量基本上是相同的。在一些实施方案中，所述抗体和亲本抗体具有相同氨基酸序列，但所述抗体无岩藻糖基化而亲本抗体是岩藻糖基化的。在一些实施方案中，ADCC活性将使用如本文公开的体外ADCC测定来确定，但涵盖用于确定ADCC活性的其他测定或方法，例如在动物模型等中。在一些实施方案中，具有增强的ADCC活性的抗体具有对FcγRIIIA增强的亲和力。
具有“改变的”FcR结合亲和力或ADCC活性的抗体是相比于亲本抗体具有增强的或减弱的FcR结合活性和/或ADCC活性的抗体，其中所述抗体和亲本抗体在至少一个结构方面不同。“展示增加的与FcR的结合”的抗体以比亲本抗体更好的亲和力结合至少一种FcR。“展示降低的与FcR的结合”的抗体以比亲本抗体更低的亲和力结合至少一种FcR。相比于天然序列IgG Fc区，展示与FcR降低的结合的这类抗体与FcR的结合可极少或无明显结合，例如与FcR 0-20％结合。
“对FcγRIIIA增强的亲和力”是指相比于亲本抗体，所述抗体对FcγRIIIA(在一些实例中也称为CD 16a)具有更高的亲和力，其中所述抗体和亲本抗体在至少一个结构方面不同。
“糖型”是指复合物寡糖结构，其包含各种碳水化合物单元的键。这样的结构例如在Essentials of Glycobiology Varki等人编,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY(1999)中描述，其还提供了标准糖生物学命名法的综述。这类糖型包括但不限于G2、G1、G0、G-1和G-2(参见，例如国际专利公开号WO 99/22764)。
“糖基化模式”定义为碳水化合物单元的模式，所述碳水化合物单元共价附着于蛋白质(例如糖型)以及一个或多个位点，在所述一个或多个位点，一个或多个糖型共价附着至蛋白质的肽主链，更具体而言附着至免疫球蛋白的肽主链。
“补体依赖性细胞毒性”或“CDC”是指目标细胞在补体存在的情况下裂解。经典补体途径的活化由补体系统的第一组分(Clq)结合至(适当亚类的)抗体起始，所述抗体结合至其同源抗原。为评估补体活化，可进行CDC测定，例如，如在Gazzano-Santoro等人,J.Immunol.Methods 202:163(1996)中所描述的。例如在美国专利号6,194,551 B l、美国专利号7,923,538、美国专利号7,994,290和WO 1999/51642中描述了具有改变的Fc区氨基酸序列和增加或降低的Clq结合能力的抗体。还参见例如Idusogie等人,J。
如本文所用，术语“野生型氨基酸”、“野生型IgG”、“野生型抗体”或“野生型mAb”是指天然存在于某一群体(例如，人类、小鼠、大鼠、细胞等)内的氨基酸或核酸的序列。
如本文所用，术语“αvβ8整合素”一般是指包含α整合素亚单位(例如，整合素α-V亚单位，例如ITGAV，例如包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列)和β整合素亚单位(例如，整合素亚单位β8，例如ITGB8，例如包含SEQ ID NO:78的氨基酸序列)的蛋白复合物。如本文所用，“人类αvβ8整合素”一般是指αvβ8整合素，其例如包含人类ITGAVα亚单位，例如包含SEQ ID NO:77的序列；和人类ITGB8β亚单位，例如包含SEQ ID NO:78的序列。如本文所用，“鼠类αvβ8整合素”或“小鼠αvβ8整合素”一般是指αvβ8整合素，其例如包含鼠类ITGAVα亚单位，例如包含SEQ ID NO:79的序列；和鼠类ITGB8β亚单位，例如包含SEQ ID NO:80的序列。术语αvβ8整合素通常包括αvβ8整合素同源物和直系同源物，包括但不限于人类、食蟹猴、大鼠、兔和小鼠。如本文所用，“αvβ8整合素”通常是指哺乳动物αvβ8整合素，例如人类、大鼠、小鼠、非人类灵长类动物、牛、绵羊或猪αvβ8整合素(例如，包含分别来自人类、大鼠、小鼠、非人类灵长类动物、牛、绵羊或猪的整合素α-V亚单位和整合素β8亚单位)。整合素α-V亚单位的非限制性示例性实例包括人类(参见例如Genbank登录号P06756.2，SEQ ID NO:77)、食蟹猴(参见例如SEQ ID NO:84)和小鼠(参见例如SEQ ID NO:79)αvβ8整合素。整合素β8亚单位的非限制性示例性实例包括人类(参见例如Genbank登录号P26012.1，SEQ ID NO:78)、食蟹猴(参见例如SEQ ID NO:85)和小鼠(参见例如SEQ ID NO:80)αvβ8整合素。术语“αvβ8整合素”还涵盖这类αvβ8整合素亚单位分子的片段、变体、同种型和其他同源物。变体αvβ8整合素分子的特征一般在于具有与天然存在的αvβ8整合素相同类型的活性，例如结合αvβ8整合素配体的能力，例如如本文中所述，诱导受体介导的活性的能力和结合或不结合本发明的抗体或其抗原片段的能力。
TGFβ和LAP的示例性氨基酸和核苷酸序列是本领域已知的。例如，包含TGFβ1和LAP的前体多肽(例如，人类序列UniProt登录号P01137)经翻译后处理成对应于LAP的UniProt登录号P01137的约氨基酸30-278和对应于人类TGFβ1的UniProt登录号P01137的约氨基酸279-390。类似地，包含TGFβ3和LAP的前体多肽(例如，人类序列UniProt登录号P10600)经翻译后处理成对应于LAP的UniProt登录号P10600的约氨基酸24-300和对应于人类TGFβ3的UniProt登录号10600的约氨基酸301-412。
αvβ8整合素可包含一种或多种、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、五种或更多种、六种或更多种、七种或更多种、八种或更多种、九种或更多种、十种或更多种、十二种或更多种或十五种或更多种的表面可获得的αvβ8整合素的残基。目标分子可包含已知的来自αvβ8整合素的表位。
如在本文其他地方所概述的，抗体分子的某些位置可变化。如本文所用的“位置”意指蛋白质序列中的位置。位置可顺序或根据已建立的格式编号，例如可使用EU索引和Kabat索引对抗体的氨基酸残基进行编号。例如，位置297为人类抗体IgG1中的位置。如以上所概述的，相应位置一般通过与其他亲本序列比对来确定。
如本文所用的“残基”意指在蛋白质中的位置及其相关氨基酸同一性。例如，天冬酰胺297(也称为Asn297、也称为N297)是人类抗体IgG1中的残基。
如本领域中已知，如在本文中可互换地使用的“多核苷酸”或“核酸”是指任何长度的核苷酸链，并且包括DNA和RNA。核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、经修饰的核苷酸或碱基和/或其类似物，或任何可通过DNA或RNA聚合酶掺入链中的底物。多核苷酸可包含经修饰的核苷酸，例如甲基化核苷酸及其类似物。如果存在，则可在链组装之前或之后对核苷酸结构进行修饰。核苷酸的序列可被非核苷酸组分中断。多核苷酸可在聚合之后进一步修饰，例如通过与标记组分缀合。其他类型的修饰包括例如“帽”；用类似物置换一种或多种天然存在的核苷酸；核苷酸间修饰，例如具有不带电键(例如膦酸甲酯、磷酸三酯、胺基磷酸酯、胺基甲酸酯等)和具有带电键(例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)的修饰、含有侧接部分(例如蛋白质(例如核酸酶、毒素、抗体、信号肽、聚-L-赖氨酸等))的修饰、具有嵌入剂(例如吖啶、补骨脂素等)的修饰、含有螯合剂(例如金属、放射性金属、硼、氧化金属等)的修饰、含有烷基化剂的修饰、具有经修饰的键(例如α异头核酸等)的修饰，以及一种或多种多核苷酸的未修饰形式。另外，通常存在于糖中的任何羟基可以例如被膦酸酯基、磷酸基团取代，被标准保护基团保护，或被活化以制备与另外的核苷酸的另外的键，或可缀合至固体支持物。5’和3’端OH可被磷酸化或被1至20个碳原子的胺或有机封端基团部分置换。其他羟基也可衍生成标准保护基团。多核苷酸还可包含本领域通常已知的类似形式的核糖或脱氧核糖，包含例如2’-O-甲基-、2’-O-烯丙基、2’-氟-或2’-叠氮基-核糖、碳环糖类似物、α-或β-异头糖、差向异构糖(例如阿拉伯糖、木糖或来苏糖)；哌喃糖、呋喃糖、景天庚酮糖、非环类似物和非碱基核苷类似物(例如甲基核糖苷)。一个或多个磷酸二酯键可被替代性连接基团取代。这些替代性连接基团包括但不限于其中磷酸被P(O)S(“硫代酸酯”)、P(S)S(“二硫代酸酯”)、(O)NR2(“酰胺化物”)、P(O)R、P(O)OR’、CO或CH2(“甲缩醛”)取代的实施方案，其中R或R’各自独立地为H或被置换或未被置换的烷基(1-20个C)，其任选地含有醚(-O-)键、芳基、烯基、环烷基、环烯基或芳醛基。多核苷酸中并非所有键需要相同。前述描述适用于本文所述的所有多核苷酸，包括RNA和DNA。
如本文所用，“载体”意指构建体，其能够递送并且优选在宿主细胞中表达感兴趣的一种或多种基因或一种或多种序列。载体的实例包括但不限于病毒载体、裸DNA或RNA表达载体、质粒、黏粒或噬菌体载体、与阳离子缩合剂缔合的DNA或RNA表达载体、包封于脂质体中的DNA或RNA表达载体和某些真核细胞，例如生产细胞。
“宿主细胞”包括可以是或已成为用于掺入多核苷酸插入物的一种或多种载体的受体的单个细胞或细胞培养物。宿主细胞包括单个宿主细胞的后代，并且后代可能由于自然、偶然或故意突变而不一定与原始亲本细胞完全相同(在形态或基因组DNA互补物方面)。宿主细胞包括用本发明的多核苷酸在体内转染和/或转化的细胞。
宿主细胞可以是原核细胞或真核细胞。示例性真核细胞包括哺乳动物细胞，例如灵长类动物或非灵长类动物细胞；真菌细胞，例如酵母；植物细胞；和昆虫细胞。
对细胞培养物敏感和蛋白质或多肽表达敏感的任何宿主细胞均可根据本发明使用。在某些实施方案中，宿主细胞是哺乳动物。可作为宿主用于表达的哺乳动物细胞系是本领域众所周知的并且包括许多可从美国典型培养物保藏中心(American Type CultureCollection；ATCC)获得的永生化细胞系。非限制性示例性哺乳动物细胞包括但不限于NS0细胞、HEK 293和中国仓鼠卵巢(CHO)细胞及其衍生物，例如293-6E和CHO DG44细胞，CHODXB11，和
Figure BDA0002961224610001191
CHOK1SV细胞(BioWa/Lonza,Allendale,NJ)。哺乳动物宿主细胞还包括但不限于人类宫颈癌细胞(HeLa，ATCC CCL 2)、幼仓鼠肾(BHK，ATCC CCL 10)细胞、猴肾细胞(COS)和人类肝细胞癌细胞(例如Hep G2)。可根据本发明使用的哺乳动物细胞的其他非限制性实例包括人类视网膜母细胞(
Figure BDA0002961224610001201
CruCell,Leiden,The Netherlands)；由SV40(COS-7，ATCC CRL 1651)转化的猴肾CV1细胞系；经亚克隆以用于在悬浮培养物中生长的人类胚胎肾细胞系293(HEK 293)或293细胞(Graham等人,1977,J.Gen Virol.36:59)；小鼠塞托利细胞(TM4，Mather,1980,Biol.Reprod.23:243-251)；猴肾细胞(CV1 ATCC CCL70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL-1 587)；犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL 34)；水牛鼠肝细胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人类肺细胞(W138，ATCC CCL 75)；人类肝细胞(Hep G2，HB 8065)；小鼠乳腺肿瘤细胞(MMT 060562，ATCC CCL51)；TR1细胞(Mather等人,1982,Annals N.Y.Acad.Sci.383:44-68)；MRC 5细胞；FS4细胞；人类肝癌细胞系(Hep G2)；和大量骨髓瘤细胞系，包括但不限于BALB/c小鼠骨髓瘤细胞系(NS0/1，ECACC号：85110503)、NS0细胞和Sp2/0细胞。
另外，任何数量的市售和非市售的表达多肽或蛋白质的细胞系均可根据本发明使用。本领域技术人员将理解，不同细胞系可能具有不同的营养需求和/或可能需要不同的培养条件以实现最佳生长和多肽或蛋白质表达，并且将能够视需要改变条件。
本发明包括本领域已知或本文公开的用于产生感兴趣的蛋白质的任何真核生物表达系统，例如在昆虫细胞系统、酵母表达系统或哺乳动物细胞系统中的表达，例如但不限于CHO细胞。
如本文所用，“表达控制序列”意指指导核酸转录的核酸序列。表达控制序列可以是启动子，例如组成型或诱导型启动子或增强子。表达控制序列可操作地连接至待转录的核酸序列。
如在本文中可互换地使用的术语“前导肽”或“前导序列”或“前导信号序列”或“信号序列”意指任何核酸序列或由此编码的氨基酸序列，其可存在于核酸分子的5’末端上和/或多肽的N端处或附近，当存在时其可介导多肽运输至目的细胞器，包括但不限于从细胞分泌多肽。这样的前导序列包括但不限于包含例如ATGGGATGGAGCTGTATCATCCTCTTCTTGGTAGCAACAGCTACAGGCGTGCACTCC(SEQ ID NO:187)的核酸序列和由此编码的氨基酸序列，例如但不限于MGWSCIILFLVATATGVHS(SEQ ID NO:188)。本发明涵盖本领域中已知或待鉴定的可导致多肽运输至所希望的细胞器(例如内质网)和/或从细胞分泌的这些和任何其他前导信号(核酸和氨基酸序列)。一般来说，信号肽被从成熟多肽中移除和/或不存在于成熟多肽中。
如本文所用，“治疗”是用于获得有益的或所希望的临床结果的方法。出于本发明的目的，有益的或所希望的临床结果包括但不限于以下中的一种或多种：存活率改善(死亡率降低)、减少对疾病的炎性反应、组织纤维化量减少、疾病病灶的外观改善、病理性病灶局限于局部位点、减少疾病的损害程度、减少疾病的持续时间和/或与疾病相关的症状的数量、程度或持续时间。该术语包括施用本发明的化合物或药剂以预防或延迟疾病的症状、并发症或生物化学标志发作，缓解所述症状或阻止或抑制疾病、病况或病症的进一步发展。治疗可以是预防性的(以预防或延迟疾病发作或预防其临床或亚临床症状显现)或治疗性抑制或缓解在疾病显现后的症状。在一些实施方案中，所述疾病、病况或病症是癌症。
如本文所使用，术语“癌症”旨在包括所有类型的癌性生长或致癌过程、转移性组织或恶性转化细胞、组织或器官，而与组织病理学类型或侵袭阶段无关。癌性病症的实例包括但不限于实体瘤、血液癌症、软组织肿瘤和转移性病灶。实体瘤的实例包括各种器官系统的恶性肿瘤，例如肉瘤和癌瘤(包括腺癌和鳞状细胞癌)，例如影响肝、肺、乳房、淋巴、胃肠(例如，结肠)、泌尿生殖道(例如，肾、尿道上皮细胞)、前列腺和咽的恶性肿瘤。腺癌包括恶性肿瘤，例如大部分结肠癌、直肠癌、肾细胞癌、肝癌、非小细胞肺癌、小肠癌和食道癌。鳞状细胞癌包括恶性肿瘤，例如肺、食道、皮肤、头颈区、口腔、肛门和子宫颈中的恶性肿瘤。在一个实施方案中，癌症为黑素瘤，例如晚期黑素瘤。还可使用本发明的方法和组合物来治疗前述癌症的转移性病灶。可使用本文公开的抗体分子治疗，例如减少其生长的示例性癌症包括通常对免疫疗法有反应的癌症。
“改善”意指与未施用抗αvβ8整合素抗体相比，一种或多种症状减轻或转佳。“改善”还包括症状的持续时间缩短或减少。
如本文所用，药物、化合物或药物组合物的“有效剂量”或“有效量”是足以影响任何一种或多种有益或所希望的结果的量。在更具体方面，有效量预防、缓解或改善疾病(例如癌症)的症状和/或延长被治疗的受试者的存活期。对于预防性用途，有益或所希望的结果包括消除或降低疾病的风险、减轻疾病的严重程度或延迟疾病的发作，包括疾病、其并发症和在疾病发展期间所呈现的中间病理性表型的生物化学、组织和/或行为症状。对于治疗性用途，有益或所希望的结果包括例如减少αvβ8整合素介导的疾病、病症或病况的一种或多种的症状、降低治疗疾病所需要的其他药物的剂量、增强另一药物的效应和/或延迟患者的疾病进展的临床结果。有效剂量可以以一次或多次施用形式进行施用。出于本发明的目的，药物、化合物或药物组合物的有效剂量是足以直接或间接完成预防性或治疗性治疗的量。如在临床背景下所理解的，药物、化合物或药物组合物的有效剂量可以或不可以连同另一种药物、化合物或药物组合物实现。因此，“有效剂量”可视为在施用一种或多种治疗剂的情况下，并且如果连同一种或多种其他药剂，可实现或已实现所希望的结果，则单一药剂可视为以有效量给出。
抗体或其抗原结合片段可与一种或多种疗法(例如，在本文中称为“第二疗法”)组合施用。“与……组合”并不意味着疗法或治疗剂必须同时施用和/或配制用于一起递送，但这些递送方法在本文所述的范围内。抗αvβ8整合素抗体或其抗原结合片段可与一种或多种其他疗法或治疗剂同时施用、在一种或多种其他疗法或治疗剂之前或之后施用。可以以任何顺序施用抗αvβ8整合素抗体或其抗原结合片段和第二疗法，例如其他药剂或治疗方案。通常，各种药剂将以针对该药剂所确定的剂量和/或时间表来施用。将进一步理解的是，在该组合中使用的额外治疗剂可在单一组合物中一起施用或在不同组合物中分开施用。在一些实施方案中，组合使用的水平将低于单独使用的水平。
“协同组合”或“协同”起作用的组合是与单独疗法组合的仅仅累加效应相比，呈现未预测到的增加的效应的组合。
“个体”或“受试者”是哺乳动物，更优选是人类。哺乳动物还包括但不限于农场动物(例如，母牛、猪、马、鸡等)、运动型动物、宠物、灵长类动物、马、狗、猫、小鼠和大鼠。在一些实施方案中，个体处于由结合至其受体的αvβ8整合素和由此介导的信号传导而介导或与其相关的疾病、病症或病况的风险下。在某些实施方案中，受试者患有如本文所述的病症或病况，例如癌症。
如本文所用，“药学上可接受的承载体”或“药学上可接受的赋形剂”包括在与活性成分组合时使所述成分保持生物活性并且与受试者的免疫系统无反应性的任何材料。实例包括但不限于标准药物承载体中的任一项，例如磷酸盐缓冲盐水溶液、水、乳液(例如油/水乳液)和各种类型的湿润剂。对于气溶胶或肠胃外施用的优选稀释剂是磷酸盐缓冲盐水(PBS)或普通生理盐水(0.9％)。包含这类承载体的组合物通过已知常规方法(参见例如Remington’s Pharmaceutical Sciences,第18版,A.Gennaro,编,Mack Publishing Co.,Easton,PA,1990；和Remington,The Science and Practice of Pharmacy第20版MackPublishing,2000)配制。
本文描述了示例性方法和材料，但与本文所述的方法和材料类似或等效的方法和材料还可用于实施或测试本发明。所述材料、方法和实例仅是说明性的并且不旨在限制。
II.抗αvβ8整合素抗体
本发明涉及结合至αvβ8整合素的抗体及其抗原结合片段。优选地，所述抗体特异性结合至αvβ8整合素，即，其结合至αvβ8整合素但其不可检测到地结合或以较低亲和力结合至其他αv整合素(例如，αvβ3整合素、αvβ5整合素和αvβ6整合素)。本发明还涉及展现改变的效应功能的抗αvβ8整合素抗体。在一些实施方案中，改变的效应功能是降低的ADCC。在一些实施方案中，改变的效应功能是降低的CDC。本发明还涉及包含这样的抗体的组合物；以及这样的抗体的用途，包括治疗性和药物用途。
在一个实施方案中，本公开内容提供了以下中的任一项或组合物(包括药物组合物)，所述组合物包含具有轻链序列或其片段和来源于但不与小鼠杂交瘤抗体ADWA-11(也称为ADWA11、mADWA11、mADWA-11)同一的重链或其片段的抗体，如通过引用整体并入本文的美国专利号9,969,804中所公开的，并且如例如本说明书的SEQ ID NO:20-33和71-76中所阐述的。
适用于本发明的抗体可涵盖单克隆抗体、多克隆抗体、抗体片段(例如，Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、Fc等)、嵌合抗体、双特异性抗体、杂缀合抗体、单链(ScFv)、其突变体、包含抗体片段(例如，结构域抗体)的融合蛋白、人源化抗体以及包含所需要的特异性的抗原识别位点的免疫球蛋白分子的任何其他修饰构象，包括抗体的糖基化变体、抗体的氨基酸序列变体和共价修饰的抗体。抗体可以是鼠类、大鼠、人类或任何其他来源(包括嵌合或人源化抗体)。在一些实施方案中，抗αvβ8整合素抗体为单克隆抗体。在一些实施方案中，抗αvβ8整合素抗体为人类或人源化抗体。在一些实施方案中，抗αvβ8整合素抗体为嵌合抗体。
本发明的抗αvβ8整合素抗体可通过本领域中已知的任何方法制备。用于产生人类和小鼠抗体的通用技术是本领域已知的和/或在本文中描述。
初始鉴定之后，候选抗αvβ8整合素抗体的活性可通过已知用于测试靶向生物活性的生物测定来进一步证实和优化。在一些实施方案中，使用体外细胞测定进一步表征候选抗αvβ8整合素抗体。例如，可使用生物测定直接筛选候选物。鉴定和表征抗αvβ8整合素抗体的方法中的一些详细描述于实例中。
下表1是例如如本文所述的鼠类、嵌合和人源化抗αvβ8整合素抗体的氨基酸和核苷酸序列的概述，重链和轻链CDR的氨基酸和核苷酸序列、重链和轻链可变区的氨基酸和核苷酸序列以及重链和轻链的氨基酸和核苷酸序列显示于此表中。通常，除非特别指出，否则本发明的抗αvβ8整合素抗体可包括如表1中所阐述的一种或多种Kabat CDR和/或Chothia高变环的任何组合。在一些实施方案中，本发明的抗αvβ8整合素抗体可包括如表1中所阐述的一种或多种VH和/或VL序列的任何组合。在一些实施方案中，本发明的抗αvβ8整合素抗体可包括如表1中所述的一种或多种框架区(例如，FR1、FR2、FR3和FR4)的任何组合。一般可理解，并且如表1所示，每个VH和VL序列通常包括三个CDR和四个FR，其从胺基末端至羧基末端按以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。
在一些实施方案中，其中抗αvβ8整合素抗体在重链多肽上包含C末端赖氨酸(K)氨基酸残基(例如，人类IgG1重链包含末端赖氨酸)的，本领域技术人员将理解，可夹持赖氨酸残基，产生具有缺乏C末端赖氨酸残基的重链的抗体。另外，所述抗体重链可使用不编码赖氨酸的核酸产生。因此，在一些实施方案中，抗αvβ8整合素抗体包含重链，其中不存在另外存在的末端赖氨酸。
表1：αvβ8整合素抗体和其他肽的氨基酸和核苷酸序列
Figure BDA0002961224610001251
Figure BDA0002961224610001261
Figure BDA0002961224610001271
Figure BDA0002961224610001281
Figure BDA0002961224610001291
Figure BDA0002961224610001301
Figure BDA0002961224610001311
Figure BDA0002961224610001321
Figure BDA0002961224610001331
Figure BDA0002961224610001341
Figure BDA0002961224610001351
Figure BDA0002961224610001361
Figure BDA0002961224610001371
Figure BDA0002961224610001381
Figure BDA0002961224610001391
Figure BDA0002961224610001401
Figure BDA0002961224610001411
Figure BDA0002961224610001421
Figure BDA0002961224610001431
Figure BDA0002961224610001441
Figure BDA0002961224610001451
Figure BDA0002961224610001461
Figure BDA0002961224610001471
Figure BDA0002961224610001481
Figure BDA0002961224610001491
Figure BDA0002961224610001501
Figure BDA0002961224610001511
*在一些肽中，甲硫氨酸被正亮氨酸取代。
Figure BDA0002961224610001512
Figure BDA0002961224610001521
Figure BDA0002961224610001531
表15：根据Kabat的示例性轻链CDR
Figure BDA0002961224610001541
Figure BDA0002961224610001551
表16：根据Chothia的示例性重链CDR
Figure BDA0002961224610001552
Figure BDA0002961224610001561
Figure BDA0002961224610001571
表17：根据Chothia的示例性轻链CDR
Figure BDA0002961224610001572
Figure BDA0002961224610001581
Figure BDA0002961224610001591
在一些方面，所述抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO:11-13、17-19、25-27、31-33或71-76中的至少一种氨基酸序列中所阐述的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。
在一些方面，所述抗体或其抗原结合片段进一步包含如SEQ ID NO:8-10、14-16、22-24或28-30中的至少一种氨基酸序列中所阐述的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3。
在一些方面，所述抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO:7的氨基酸序列中所阐述的CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3和如SEQ ID NO:6的氨基酸序列中所阐述的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3。
在一些方面，所述抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO:7的氨基酸序列中所阐述的CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3和如SEQ ID NO:20的氨基酸序列中所阐述的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3。
在一些方面，所述抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO:7的氨基酸序列中所阐述的CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3和如SEQ ID NO:34-46、88-91或93中的任一项的氨基酸序列中所阐述的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3。
在一些方面，所述抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO:21的氨基酸序列中所阐述的CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3和如SEQ ID NO:6的氨基酸序列中所阐述的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3。
在一些方面，所述抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO:47-69或92中的任一项的氨基酸序列中所阐述的CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3和如SEQ ID NO:6的氨基酸序列中所阐述的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3。
在一些方面，所述抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO:5的氨基酸序列中所阐述的CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3和如SEQ ID NO:2的氨基酸序列中所阐述的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3。
在一些方面，所述抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO:5的氨基酸序列中所阐述的CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3和如SEQ ID NO:3的氨基酸序列中所阐述的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3。
在一些方面，所述抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO:5的氨基酸序列中所阐述的CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3和如SEQ ID NO:124或SEQ ID NO:182的氨基酸序列中所阐述的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3。
在一些方面，所述抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO:123的氨基酸序列中所阐述的CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3和如SEQ ID NO:124或SEQ ID NO:182的氨基酸序列中所阐述的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3。
在一些方面，所述抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO:123的氨基酸序列中所阐述的CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3和如SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的氨基酸序列中所阐述的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3。
在一些方面，所述抗体或其抗原结合片段包含如由保藏于ATCC、具有保藏编号PTA-124918的质粒的插入序列编码的氨基酸序列中所阐述的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。
在一些方面，所述抗体或其抗原结合片段包含如由保藏于ATCC、具有保藏编号PTA-124917的质粒的插入序列编码的氨基酸序列中所阐述的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3。
在一些方面，所述抗体或其抗原结合片段包含由保藏于ATCC、具有保藏编号PTA-124918的质粒的插入序列编码的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3氨基酸序列，和由保藏于ATCC、具有保藏编号PTA-124917的质粒的插入序列编码的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3氨基酸序列。
在一些方面，所述抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区，所述轻链可变区包含由保藏于ATCC、具有保藏编号PTA-124918的质粒的插入序列编码的氨基酸序列。
在一些方面，所述抗体或其抗原结合片段包含重链可变区，所述重链可变区包含由保藏于ATCC、具有保藏编号PTA-124917的质粒的插入序列编码的氨基酸序列。
在一些方面，所述抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的CDR-L1、含有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的CDR-L2、含有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR-L3、含有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的CDR-H1、含有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的CDR-H2和含有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的CDR-H3。
在一些方面，所述抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的CDR-L1、含有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的CDR-L2、含有SEQ ID NO:19的氨基酸序列的CDR-L3、含有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CDR-H1、含有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDR-H2和含有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR-H3。
在一些方面，抗体或其抗原结合片段可包含VH，其包含与SEQ ID NO:6、34-46、88-91和93(例如，SEQ ID NO:6)中的任一项的氨基酸序列至少90％同一的氨基酸序列。VH可包含与SEQ ID NO:6、34-46、88-91和93(例如，SEQ ID NO:6)中的任一项的氨基酸序列至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一的氨基酸序列。VH可包含SEQ IDNO:6、34-46、88-91和93(例如，SEQ ID NO:6)中的任一项的氨基酸序列。
在一些方面，抗体或其抗原结合片段可包含VH，其包含与SEQ ID NO:6的氨基酸序列至少90％同一的氨基酸序列。VH可包含与SEQ ID NO:6的氨基酸序列至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一的氨基酸序列。VH可包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含VH，其包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含由SEQ ID NO:6的氨基酸序列组成的VH。
在一些方面，抗体或其抗原结合片段可包含VL，其包含与SEQ ID NO:7、47-69和92(例如，SEQ ID NO:7)中的任一项的氨基酸序列至少90％同一的氨基酸序列。VL可包含与SEQ ID NO:7、47-69和92(例如，SEQ ID NO:7)中的任一项的氨基酸序列至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一的氨基酸序列。VL可包含SEQ ID NO:7、47-69和92(例如，SEQ ID NO:7)中的任一项的氨基酸序列。
在一些方面，抗体或其抗原结合片段可包含VL，其包含与SEQ ID NO:7的氨基酸序列至少90％同一的氨基酸序列。VL可包含与SEQ ID NO:7的氨基酸序列至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一的氨基酸序列。VL可包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含VL，其包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含由SEQ ID NO:7的氨基酸序列组成的VL。
在一些方面，抗体或其抗原结合片段可包含重链，其包含含有SEQ ID NO:6、34-46、88-91和93(例如，SEQ ID NO:6)中的任一项的氨基酸序列的VH，并且其进一步包含IgG1恒定结构域(例如，包含SEQ ID NO:81、82、181或184中的任一项的氨基酸序列的IgG1恒定结构域)。在一些方面，抗体或抗原结合片段变体包含对全长重链的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个保守或非保守置换和/或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个添加和/或缺失。在另一方面，变体与全长重链共享至少65％、至少75％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性，并且其中所述抗体或抗原结合片段特异性结合αvβ8整合素。
在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含重链并且进一步包含IgG1恒定结构域，所述重链包含含有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的VH，所述IgG1恒定结构域包含SEQ IDNO:181或SEQ ID NO:184的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含由SEQ ID NO:6的氨基酸序列组成的VH，并且进一步包含由SEQ ID NO:181或SEQ ID NO:184的氨基酸序列组成的IgG1恒定结构域。在一些实施方案中，所述抗体缺乏一种或多种效应功能。在其他实施方案中，所述抗体分子具有重链恒定区，所述重链恒定区选自例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgD和IgE的重链恒定区；特别地，选自例如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的(例如人类)重链恒定区。在另一个实施方案中，所述抗体分子具有轻链恒定区，所述轻链恒定区选自例如κ(例如，由SEQ ID NO:83的氨基酸序列编码)或λ的(例如人类)轻链恒定区。恒定区可变化，例如突变以改变抗体的特性(例如，以增加或减少以下中的一种或多种：Fc受体结合、抗体糖基化、半胱氨酸残基的数目、效应细胞功能和/或补体功能)。在一个实施方案中，所述抗体具有：效应功能；并且可以固定补体。在其他实施方案中，所述抗体不募集效应细胞或固定补体。在另一实施方案中，抗体结合Fc受体的能力降低或无结合Fc受体的能力。例如，其为不支持结合至Fc受体的同型或亚型、片段或其他突变，例如其具有诱变或缺失的Fc受体结合区。
用于改变抗体恒定区的方法是本领域已知的。具有改变的功能，例如，效应配体(例如细胞上的FcR或补体的C1组分)的改变的亲和力的抗体可通过用不同残基取代抗体的恒定部分中的至少一个氨基酸残基来产生(参见例如EP 388151A1、美国专利号5,624,821和美国专利号5,648,260，其所有内容通过引用并入本文)。可描述如果应用于鼠类或其他物种则免疫球蛋白会降低或消除这些功能的类似变化类型。
在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含轻链，并进一步包含κ恒定结构域，所述轻链包含含有SEQ ID NO:7、47-69和92中的任一项(例如，SEQ ID NO:7)的氨基酸序列的VL，所述κ恒定结构域包含SEQ ID NO:83的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含轻链，并进一步包含κ恒定结构域，所述轻链包含由SEQ ID NO:7的氨基酸序列组成的VL，所述κ恒定结构域由SEQ ID NO:83的氨基酸序列组成。
在一些方面，抗体或其抗原结合片段包含重链(HC)，所述HC包含与SEQ ID NO:2的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含HC，所述HC包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含由SEQ ID NO:2的氨基酸序列组成的HC。在一些实施方案中，所述抗体缺乏一种或多种效应功能。
在一些方面，抗体或其抗原结合片段包含重链(HC)，所述HC包含与SEQ ID NO:3的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含HC，所述HC包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含由SEQ ID NO:3的氨基酸序列组成的HC。在一些实施方案中，所述抗体缺乏一种或多种效应功能。在一些方面，抗体或其抗原结合片段包含轻链(LC)，所述LC包含与SEQ ID NO:5至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含LC，所述LC包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含LC，所述LC由SEQ ID NO:5的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，所述抗体缺乏效应功能。
种系置换
在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含以下重链CDR序列：(i)包含SEQ ID NO:22的CDR-H1、包含SEQ ID NO:23的CDR-H2以及包含SEQ ID NO:24的CDR-H3；和/或(ii)以下轻链CDR序列：包含SEQ ID NO:25或71的CDR-L1、包含SEQ ID NO:26或72的CDR-L2以及包含SEQ ID NO:27或73的CDR-L3。在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含以下重链CDR序列：(i)包含SEQ ID NO:28的CDR-H1、包含SEQ ID NO:29的CDR-H2以及包含SEQ ID NO:30的CDR-H3；和/或(ii)以下轻链CDR序列：包含SEQ ID NO:31或74的CDR-L1、包含SEQ ID NO:32或75的CDR-L2以及包含SEQ ID NO:33或76的CDR-L3。这些是小鼠CDR并且优选地经移植或在人类VH和VL结构域的情况下以其他方式添加。可获得多种受体人种系序列，并且用于人类的非人物种抗体的“人源化”过程将在本领域中众所周知并且还在本文的其他地方讨论。因此，本领域技术人员将理解，在人类V结构域氨基酸序列的情况下可置放上述小鼠CDR序列。藉此，通常进行受体人类种系序列的改变以保持原始亲本(即供体)抗体的抗体结合和其他所希望的特征。CDR和框架区(FW)两者可如下进行改造。
在某些实施方案中，相对于SEQ ID NO:25、31、71或74，在CDR-L1中进行不超过11个、或不超过10个、不超过9个、不超过8个、不超过7个、不超过6个、不超过5个、不超过4个、不超过3个、不超过2个、或不超过1个置换。在某些实施方案中，相对于SEQ ID NO:26、32、72或75的氨基酸序列，在CDR-L2中进行不超过6个、不超过5个、不超过4个、不超过3个、不超过3个、不超过2个或不超过一个置换。在某些实施方案中，相对于SEQ ID NO:27、33、73、76的氨基酸序列，在CDR-L3中进行不超过8个、不超过7个、不超过6个、不超过5个、不超过4个、不超过3个、不超过3个、不超过2个或不超过一个置换。在一些实施方案中，相对于SEQ ID NO:22或28的氨基酸序列，在CDR-H1中进行不超过10个、不超过9个、不超过8个、不超过7个、不超过6个、不超过5个、不超过4个、不超过3个、不超过2个或不超过1个置换。在一些实施方案中，相对于SEQ ID NO:23或29的氨基酸序列，在CDR-H2中进行不超过17个、不超过16个、不超过15个、不超过14个、不超过13个、不超过12个、不超过11个、或不超过10个、不超过9个、不超过8个、不超过7个、不超过6个、不超过5个、不超过4个、不超过3个、不超过2个或不超过1个置换。在一些实施方案中，相对于SEQ ID NO:24或30的氨基酸序列，在CDR-H3中进行不超过12个、不超过11个、或不超过10个、不超过9个、不超过8个、不超过7个、不超过6个、不超过5个、不超过4个、不超过3个、不超过2个或不超过1个置换。在某些实施方案中，一个或多个置换不使结合亲和力(KD)值改变超过1000倍、超过100倍或10倍。在某些实施方案中，置换为根据表1的保守置换。
在某些实施方案中，如例如在美国专利申请公开号2017/0073395和Townsend等人,2015,Proc.Nat.Acad.Sci.USA 112(50):15354-15359)中所描述的，置换为人类种系置换，其中(供体)CDR残基被相应人类种系(受体)残基取代，以提高人类氨基酸含量并且可能减少抗体的免疫原性。
用于将人类种系残基引入抗体CDR的方法和文库详细描述于美国专利申请公开号2017/0073395和Townsend等人,2015,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.112(50):15354-15359中，并且两者通过引用整体并入本文。
所述抗体或其抗原结合片段可包含VH框架，所述VH框架包含人类种系VH框架序列。VH框架序列可来自人类VH3种系、VH1种系、VH5种系或VH4种系。优选的人类种系重链框架是衍生自VH1、VH3或VH5种系的框架。例如，可使用来自以下种系的VH框架：IGHV3-07、IGHV1-46、IGHV3-23、IGHV3-30、IGHV1-69或IGHV3-48(种系名称基于IMGT种系定义)。优选的人类种系轻链框架是衍生自VK或Vλ种系的框架。例如，可使用来自以下种系的VL框架：IGKV1-39、IGKV2-28、IGKV2-30、IGKV4-1或IGKV3-11(种系名称基于IMGT种系定义)。可替代地或另外地，框架序列可以是人类种系共有框架序列，例如以下各项的框架：人类Vλ1共有序列、VK1共有序列、VK2共有序列、VK3共有序列、VH3种系共有序列、VH1种系共有序列、VH5种系共有序列、或VH4种系共有序列。人类种系框架的序列可从各种公共数据库获得，例如V-base、IMGT、NCBI或Abysis。
所述抗体或其抗原结合片段可包含VL框架，所述VL框架包含人类种系VL框架序列。VL框架可包含一个或多个氨基酸置换、添加或缺失，同时仍保留与衍生所述VL框架的种系的功能和结构相似性。在一些方面，VL框架与人类种系VL框架序列至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一。在一些方面，所述抗体或其抗原结合片段包含VL框架，所述VL框架相对于人类种系VL框架序列包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个氨基酸置换、添加或缺失。在一些方面，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸置换、添加或缺失仅在框架区。在一些方面，同一性％是基于与不包括在本文中定义为CDR的这些部分的VL的相似性。
人类种系VL框架可以是DPK9(IMGT名称：IGKV1-39，例如SEQ ID NO:128)的框架。人类种系VL框架可以是IGKV2-28的框架。人类种系VL框架可以是DPK18(IMGT名称：IGKV2-30)的框架。人类种系VL框架可以是DPK24(IMGT名称：IGKV4-1)的框架。人类种系VL框架可以是HK102_V1(IMGT名称：IGKV1-5)的框架。人类种系VL框架可以是Vg_38K(IMGT名称：IGKV3-11)的框架。人类种系VL框架可以是人类Vλ共有序列的框架。人类种系VL框架可以是人类Vλ1共有序列的框架。人类种系VL框架可以是人类Vλ3共有序列的框架。人类种系VL框架可以是人类VK共有序列的框架。人类种系VL框架可以是人类VK1共有序列的框架。人类种系VL框架可以是人类VK2共有序列的框架。人类种系VL框架可以是人类VK3共有序列的框架。
在一些方面，VL框架为DPK9(SEQ ID NO:128)。还预测其他类似框架区递送本发明的有利抗体，所述抗体包含SEQ ID NO:11-13和17-19的CDR；和由以下VL氨基酸序列指定的CDR：7、47-69和92，包括例如IGKV2-28、IGKV2-30、IGKV4-1或IGKV3-11，其可包含分别与DPK-9的FW区99、97、97、96、80、76、66、97、97、96、76和74％的同一性，和一个或更少个共同结构特点的氨基酸差异(Kabat编号)(A)CDR(游标区)正下方的残基L2、L4、L35、L36、L46、L47、L48、L49、L64、L66、L68、L69、L71，(B)VH/VL链封装残基：L36、L38、L44、L46、L87和(C)典型CDR结构支撑残基L2、L48、L64、L71(参见Lo,“Antibody Humanization by CDRGrafting”,(2004)Antibody Engineering,第248卷,Methods in Molecular Biology第135-159页和O’Brien和Jones,“Humanization of Monoclonal Antibodies by CDRGrafting”,(2003)Recombinant Antibodies for Cancer Therapy,第207卷,Methods inMolecular Biology第81-100页)。特别优选的是分别与DPK9共享99、97、97、96、80、76、66％同一性的IGKV2-28、IGKV2-30、IGKV4-1或IGKV3-11的框架区，并且在这些共同结构特点中无氨基酸差异。在一些方面，同一性％是基于与不包括在本文中定义为CDR的这些部分的VL的相似性。
所述抗体或其抗原结合片段可包含VH框架，所述VH框架包含人类种系VH框架序列。VH框架可包含一个或多个氨基酸置换、添加或缺失，同时仍保留与衍生所述VH框架的种系的功能和结构相似性。在一些方面，VH框架与人类种系VH框架序列至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一。在一些方面，所述抗体或其抗原结合片段包含VH框架，所述VH框架相对于人类种系VH框架序列包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个氨基酸置换、添加或缺失。在一些方面，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸置换、添加或缺失仅在框架区。在一些方面，同一性％是基于与不包括在本文中定义为CDR的这些部分的VH的相似性。
人类种系VH框架可以是例如IGHV3-07(也称为DP-54)、IGHV1-46、IGHV3-23、IGHV3-30、IGHV1-69或IGHV3-48的框架。人类种系VH框架可以是人类VH种系共有序列的框架。人类种系VH框架可以是人类VH3种系共有序列的框架。人类种系VH框架可以是人类VH5种系共有序列的框架。人类种系VH框架可以是人类VH1种系共有序列的框架。人类种系VH框架可以是人类VH4种系共有序列的框架。
在一些方面，VH框架是IGHV3-07(SEQ ID NO:127)。还预测其他类似框架区递送本发明的有利抗体，所述抗体包含SEQ ID NO:8-10和14-16的CDR和由以下VH氨基酸序列中的任一项指定的CDR：SEQ ID NO:6、34-46、88-91和93，包括IGHV3-07、IGHV1-46、IGHV3-23、IGHV3-30、IGHV1-69或IGHV3-48，其可包含分别与DP-54的FW区93、92、92、99、97、97、96、96、94、94、93、92％的同一性和一个或更少个共同结构特点的氨基酸差异(Kabat编号)(A)CDR(游标区)正下方的残基H2、H47、H48和H49、H67、H69、H71、H73、H93、H94，(B)VH/VL链封装残基：H37、H39、H45、H47、H91、H93和(C)典型CDR结构支撑残基H24、H71、H94(参见Lo 2004，以及O’Brien和Jones 2003)。DP-50、IGHV3-30*09、IGHV3-30*15的示例性框架区分别与DP-54共享93、92和92％同一性，并且在这些共同结构特点中无氨基酸差异。在一些方面，同一性％是基于与不包括在本文中定义为CDR的这些部分的VH的相似性。
在某些实施方案中，本文所述的抗体或其抗原结合片段包含：(i)VH，其包含与SEQID NO:6的氨基酸序列至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一的氨基酸序列，和/或(ii)VL，其包含与SEQ ID NO:7的氨基酸序列至少50％、至少60％、至少66％、至少70％、至少75％、至少76％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一的氨基酸序列。本发明还涵盖这些VL和VH序列的任何组合。
在某些实施方案中，本文所述的抗体或其抗原结合片段包含：(i)HC，其包含与SEQID NO:2或SEQ ID NO:3的氨基酸序列至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一的氨基酸序列；和/或(ii)LC，其包含与SEQ ID NO:5的氨基酸序列至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一的氨基酸序列。本发明还涵盖这些HC和LC序列的任何组合。
在某些实施方案中，本文所述的抗体或其抗原结合片段包含Fc结构域。Fc结构域可衍生自IgA(例如IgA1或IgA2)、IgG、IgE或IgG(例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)。
本发明进一步提供抗体或其抗原结合片段，其与潜伏相关肽(LAP)竞争结合人类αvβ8整合素。例如，如果抗体或其抗原结合片段结合至人类αvβ8整合素阻止LAP后续结合至人类αvβ8整合素，则所述抗体或其抗原结合片段与LAP竞争结合人类αvβ8整合素。
本发明提供的抗体和抗原结合片段包括单克隆抗体、多克隆抗体、抗体片段(例如，Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、Fc等)、嵌合抗体、双特异性抗体、杂缀合抗体、单链(ScFv)、其突变体、包含抗体片段的融合蛋白、结构域抗体(dAb)、人源化抗体以及包含所需要的特异性的抗原识别位点的免疫球蛋白分子的任何其他修饰构象，包括抗体的糖基化变体、抗体的氨基酸序列变体和共价修饰抗体。抗体和抗原结合片段可以是鼠类、大鼠、人类或任何其他来源(包括嵌合或人源化抗体)。在一些实施方案中，抗体为单克隆抗体。在一些实施方案中，抗体为嵌合、人源化或人类抗体。在某些实施方案中，所述抗体为人类抗体。在某些实施方案中，所述抗体为人源化抗体。
抗αvβ8整合素抗体的生物活性
除了结合αvβ8整合素上的表位之外，本发明的抗体或其抗原结合片段可介导生物活性。即，本发明包括经分离的抗体或其抗原结合片段，其特异性结合αvβ8整合素并且介导至少一种选自以下的可检测到的活性：
(i)特异性结合至αvβ8整合素(例如，来自人类、小鼠、食蟹猴和/或大鼠的αvβ8整合素)；
(ii)减少αvβ8整合素与潜伏相关肽(LAP)之间的相互作用；
(iii)减少TGF-β信号传导；
(iv)以IC50≤10nM有效地阻断αvβ8整合素介导的TGFβ活化；
(v)对非人类灵长类(NHP)直系同源物具有相当的Kd(5倍内)；
(vi)选择性结合人类αvβ8，并且不可检测到地结合αvβ8的同源物(例如，αvβ1、αvβ3、αvβ5和αvβ6)；
(vii)单独或与免疫调节剂，例如检查点抑制剂的调节剂，例如PD-1、PD-L1、CTLA-4的抑制剂或刺激分子(例如4-1BB)的激动剂组合，在选自鳞状细胞癌、乳腺癌和结肠癌的癌症的动物模型中引起生长抑制和/或完全肿瘤消退；
(viii)与抗癌疗法(例如放射疗法)组合在癌症的动物模型中引起生长抑制和/或完全肿瘤消退；
(ix)例如在以≤10mg/kg施用时，在同系肿瘤移植模型中显示肿瘤生长的至少60％的减少；
(x)在向受试者(例如小鼠或人类受试者)施用时，在一种或多种免疫调节剂，例如检查点抑制剂的拮抗剂或检查点活化剂的激动剂，例如PD-1、PD-L1或CTLA-4的拮抗剂或免疫反应的活化剂，例如4-1BB激动剂存在的情况下增加抗肿瘤反应；
(xi)具有不依赖于肿瘤模型中αvβ8整合素的表达的功效；
(xii)增加肿瘤微环境中CD8+GzmB+ T细胞的丰度，例如作为单一疗法；
(xiii)在与检查点抑制剂的拮抗剂(例如，抗PD-1或抗PD-L1抗体)组合使用时，例如在鳞状细胞癌、乳腺癌和/或结肠癌的同系模型中显示肿瘤生长的减少，例如至少＞80％的减少；
(xiv)如通过Kaplan-Meier分析所确定的，显示受试者(例如人类或小鼠)的总存活率的统计学上显著的改善；
(xv)显示合适的配制物特性，包括高度的热稳定性和高浓度下的最少聚集；或
(xvi)可在大规模制备条件下显示可再现表达和纯度。
在一些实施方案中，抗αvβ8整合素抗体或其抗原结合片段具有以下特性中的至少一种：
i.表示为KD的对人类αvβ8整合素的结合亲和力，其低于鼠类抗体ADWA11的KD，例如低于536pM(例如，1、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、370、400、450、500、510、520、530、531、532、533、534或535pM)；
ii.对人类αvβ8整合素的KD，其例如对经纯化的人类αvβ8整合素的KD低于或等于100pM(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90或100pM)；
iii.对小鼠αvβ8整合素的KD，其低于鼠类抗体ADWA11的KD，例如低于489pM(例如，1、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、370、400、450、460、470、480、485、486、487或488pM)；
iv.对食蟹猴αvβ8整合素的KD，其低于鼠类抗体ADWA11的KD，例如低于507pM(例如，1、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、370、400、450、500、501、502、503、504、505或506pM)；
v.对大鼠αvβ8整合素的KD，其为约160pM；
vi.显示对人类、食蟹猴、小鼠和大鼠αvβ8整合素中的至少两种、三种或所有大致相等的亲和力，例如低于100pM(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90或95pM)的KD，例如如使用Biacore亲和力测定法所确定的；
vii.抑制TGFβ反式激活的IC50，其低于鼠类抗体ADWA11，例如低于183pM(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、175、180、181或182pM)；
viii.抑制U251细胞中的TGFβ反式激活的IC50，其为约100、120、140、160、180、200、220、240、260、280、300、320或340pM；
ix.对U251细胞的EC50，其为约126pM，其中标准偏差为加或减34pM；
x.对U251细胞的EC50，其为约256pM，其中标准偏差为加或减115pM；
xi.对C8-S细胞的EC50，其为约115pM；
xii.对C8-S细胞的EC50，其为约145pM，其中标准偏差为加或减23.7pM；
xiii.至少一个预测的人类药代动力学(PK)参数，其选自：
a.中央室的清除率(CL)，其为约0.12-0.15mL/h/kg；
b.室间分布清除率(CLF)，其为约0.15-0.51mL/h/kg；
c.中央室的分布容积(V1)，其为约36-39mL/kg；
d.周边室的分布容积(V2)，其为约21-33mL/kg；和/或
e.终末半衰期(t1/2)，其为约12-17天；或
xiv.显示没有与人类Fcγ受体或C1q的可检测到的结合。
在一些实施方案中，抗αvβ8整合素抗体或其抗原结合片段结合具有高表观亲和力的αvβ8整合素+细胞(例如，表达αvβ8整合素的细胞)。可使用流式细胞术评估表观亲和力结合以检测抗体与表现目标蛋白(例如αvβ8整合素)的细胞的结合。细胞可用编码αvβ8整合素的核酸短暂或稳定转染。可替代地，细胞可以是在其表面上天然表达αvβ8整合素的细胞。不管αvβ8整合素+细胞的来源如何，均可使用多种本领域中公认的方法容易地评估抗体与细胞的结合。所述抗体或其抗原结合片段结合人类αvβ8整合素、食蟹猴αvβ8整合素、小鼠αvβ8整合素、大鼠αvβ8整合素。
本发明包括抗体或其抗原结合片段，其特异性结合αvβ8整合素和拮抗由αvβ8整合素介导的活性(例如，TGFβ信号传导，其可由抑制αvβ8整合素与潜伏相关肽(LAP)的相互作用介导)。存在许多本领域中已知的测定用于测定由TGFβ信号传导所介导的活性的抑制。一种这样的测定为TGFβ途径反式激活测定。在这样的测定的一个实例中，SMAD的表达，其通过使用萤光素酶报道分子可充当经监测的TGFβ信号传导和途径活化的标志物。抗αvβ8整合素抗体结合αvβ8整合素和拮抗TGFβ信号传导的作用(例如，通过抑制αvβ8整合素与LAP的相互作用)的能力因此通过测量在所述抗体存在或不存在的情况下表达的SMAD的水平来评估。优选地，所述抗体可介导萤光素酶的剂量依赖性减少，其中EC50为约1pM、约2pM、约3pM、约4pM、约5pM、约6pM、约7pM、约8pM、约9pM、约10pM、约20pM、约30pM、约40pM、约50pM、约60pM、约70pM、约80pM、约90pM、约100pM、约125pM、约150pM、约175pM、约200pM、约225pM、约250pM、约275pM、约300pM、约400pM或约500pM(例如，EC50在约1pM与约100pM之间，例如EC50在约1pM与约200pM之间，例如EC50在约1pM与约300pM之间，例如EC50在约1pM与约400pM之间，例如EC50在约1pM与约500pM之间)。更优选地，所述抗体或其抗原结合片段抑制TGFβ信号传导(例如，TGFβ反式激活，例如SMAD的TGFβ反式激活)，其中EC50为约100pM(例如，EC50在约5pM与约175pM之间，例如EC50在约25pM与约175pM之间，例如EC50为约100pM、约105pM、约110pM、约115pM、约120pM、约125pM、约130pM、约135pM、约140pM、约145pM、约150pM、约155pM、约160pM、约165pM、约170pM或约175pM)。在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段抑制TGFβ信号传导(例如，TGFβ反式激活，例如SMAD的TGFβ反式激活)，其中EC50低于约5nM(例如，低于约0.001、0.01、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.1、5.5、6、7、8、9、10、15、20或25nM)。在实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段抑制TGFβ信号传导(例如，TGFβ反式激活，例如SMAD的TGFβ反式激活)，其中EC50为约5nM(例如，约0.001、0.01、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.1、5.5、6、7、8、9、10、15、20或25nM)。
在一些实施方案中，本公开内容的抗体或其抗原结合片段抑制TGFβ信号传导，其中EC50为约145+/-23.7pM。在一些实施方案中，本公开内容的抗体或其抗原结合片段抑制C8-S中的TGFβ信号传导，其中EC50为约145+/-23.7pM。在一些实施方案中，本公开内容的抗体或其抗原结合片段抑制C8-S细胞中的TGFβ信号传导，其中EC50为约110pM至约180pM。
在一些实施方案中，本公开内容的抗体或其抗原结合片段抑制TGFβ信号传导，其中EC50为约256+/-115pM。在一些实施方案中，本公开内容的抗体或其抗原结合片段抑制U251细胞中的TGFβ信号传导，其中EC50为约256+/-115pM。在一些实施方案中，本公开内容的抗体或其抗原结合片段抑制U251细胞中的TGFβ信号传导，其中EC50为约80pM至约400pM。
本发明涵盖抗体或其抗原结合片段，其结合人类αvβ8整合素但不可检测到地结合人类蛋白质αvβ3整合素、αvβ5整合素或αvβ6整合素。
III.抗αvβ8整合素抗体表达和产生
编码抗αvβ8整合素抗体的核酸
本发明还提供了编码抗体中的任一项(包括本文所述的抗体片段和经修饰的抗体)的多核苷酸。本发明还提供了制备本文所述的多核苷酸中的任一项的方法。多核苷酸可通过本领域中已知的程序制备和表达。
所希望的抗体、所定义的抗体片段或其抗原结合片段和编码这样的抗体或其片段的核酸的序列可使用标准定序技术测定。可将编码所希望的抗体、所定义得抗体片段或其抗原结合片段的核酸序列插入用于重组生产和表征的各种载体(例如克隆和表达载体)中。编码重链、重链的所定义的抗体片段或抗原结合片段的核酸，和编码轻链、轻链的所定义的抗体片段或抗原结合片段的核酸可克隆至同一载体，或不同载体中。
编码以上氨基酸序列的多核苷酸编码与如本文公开的本发明的抗体或其抗原结合片段的氨基酸序列至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明提供了编码一种或多种包含选自由以下各项组成的组的氨基酸序列的蛋白质的多核苷酸：SEQ ID NO:2、3和5-76(例如，包含SEQ ID NO:1、4、183、185、186、189、190或191中所阐述的序列的多核苷酸)，或编码与SEQ ID NO:2、3、5-76、88-93、123、124和182至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％并且更优选同一的氨基酸序列的核苷酸序列。
本发明提供了多核苷酸，其包含如SEQ ID NO:1、183、189或191中的一种或多种所阐述的和编码抗体重链的核酸序列，或与SEQ ID NO:1、183、189或191至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一和编码抗体重链的核苷酸序列。
本发明提供了多核苷酸，其包含如SEQ ID NO:4或185中的一种或多种所阐述的和编码抗体轻链的核酸序列，或与SEQ ID NO:4或185至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一和编码抗体轻链的核苷酸序列。
本发明提供了多核苷酸，其包含如SEQ ID NO:190中所阐述的和编码抗体重链可变区的核酸序列，或与SEQ ID NO:190至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或同一和编码抗体重链可变区的核苷酸序列。
本发明提供了多核苷酸，其包含如SEQ ID NO:186中所阐述的和编码抗体轻链可变区的核酸序列，或与SEQ ID NO:186至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或同一和编码抗体轻链可变区的核苷酸序列。
本发明提供了多核苷酸，其包含如SEQ ID NO:192或193中所阐述的和编码抗体重链恒定区的核酸序列，或与SEQ ID NO:192或193至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或同一和编码抗体重链恒定区的核苷酸序列。
本发明提供了多核苷酸，其包含如SEQ ID NO:194中所阐述的和编码抗体轻链恒定区的核酸序列，或与SEQ ID NO:194至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或同一和编码抗体轻链恒定区的核苷酸序列。
本发明提供了包含如SEQ ID NO:189所阐述的核酸序列的多核苷酸。本发明提供包含如SEQ ID NO:190所阐述的核酸序列的多核苷酸。本发明提供包含如SEQ ID NO:185所阐述的核酸序列的多核苷酸。
本发明提供了多核苷酸，其包含保藏于ATCC并且具有保藏编号PTA-124917和/或保藏编号PTA-124918的质粒的DNA插入序列的核酸序列中的一种或两种。
本发明提供了多核苷酸，其包含保藏于ATCC并且具有保藏编号PTA-124917和/或保藏编号PTA-124918的质粒的插入序列的核酸序列。
本发明提供了包含如SEQ ID NO:1、183和4中所阐述的一种或多种核酸分子的细胞。
本发明提供了包含如SEQ ID NO:185、189和190中所阐述的一种或多种核酸分子的细胞。
在另一方面，本发明提供了编码抗αvβ8整合素抗体(例如，抗人类αvβ8整合素抗体)的多核苷酸及其变体，其中这样的变体多核苷酸与本文公开的特定核酸序列中的任一项共享至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少87％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性。这些量并不旨在限制，并且所叙述的百分比之间的增量具体地设想为本公开内容的部分。
本发明提供了由本文所述的核酸分子编码的多肽。
在一个实施方案中，VH和VL结构域或其抗原结合片段或全长HC或LC由分开的多核苷酸编码。可替代地，VH和VL两者或其抗原结合片段或HC和LC由单个多核苷酸编码。
本公开内容还涵盖与任何这样的序列互补的多核苷酸。多核苷酸可以是单股(编码或反义)或双股的，并且可以是DNA(染色体组、cDNA、或合成)或RNA分子。RNA分子包括HnRNA分子，其含有内含子并且以一对一方式对应于DNA分子；和mRNA分子，其不含内含子。额外的编码或非编码序列可(但未必)存在于本公开内容的多核苷酸内，并且多核苷酸可(但未必)连接至其他分子和/或支撑材料。
多核苷酸可包含天然序列(即，编码抗体或其片段的内源序列)或可包含这样的序列的变体。多核苷酸变体含有一个或多个置换、添加、缺失和/或插入，使得相对于天然免疫反应性分子经编码的多肽的免疫反应性不降低。对于经编码的多肽的免疫反应性的影响可通常如本文所述评估。在一些实施方案中，变体呈现与编码天然抗体或其片段的多核苷酸序列至少约70％的同一性，在一些实施方案中至少约80％的同一性，在一些实施方案中至少约90％的同一性，并且在一些实施方案中至少约95％的同一性。这些量并不旨在限制，并且所叙述的百分比之间的增量具体地设想为本公开内容的部分。
如下文所述，针对最大对应性比对时，如果两个序列中的核苷酸或氨基酸序列相同，则称两个多核苷酸或多肽序列“同一”。两个序列之间的比较通常通过在比较窗口上比较序列以鉴定并且比较局部区域的序列相似性来进行。如本文所用，“比较窗口”是指具有至少约20个邻接位置，通常30至约75个，或40至约50个连续位置的区段，其中一个序列与具有相同数目个连续位置的参考序列在两个序列最佳比对之后可以进行比较。
用于比较的最佳序列比对可使用生物信息软件的
Figure BDA0002961224610001791
套件(
Figure BDA0002961224610001793
Inc.,Madison,WI)中的
Figure BDA0002961224610001792
程序、使用预设参数来进行。该程序包含以下参考文献中所述的几种比对方案：Dayhoff,M.O.,1978,A model of evolutionary change inproteins-Matrices for detecting distant relationships。在Dayhoff,M.O.(编)Atlasof Protein Sequence and Structure,National Biomedical Research Foundation,Washington DC第5卷,第3增刊,第345-358页；Hein J.,1990,Unified Approach toAlignment and Phylogenes第626-645页Methods in Enzymology第183卷,AcademicPress,Inc.,San Diego,CA；Higgins,D.G.和Sharp,P.M.,1989,CABIOS 5:151-153；Myers,E.W.和Muller W.,1988,CABIOS 4:11-17；Robinson,E.D.,1971,Comb.Theor.11:105；Santou,N.,Nes,M.,1987,Mol.Biol.Evol.4:406-425；Sneath,P.H.A.和Sokal,R.R.,1973,Numerical Taxonomy the Principles and Practice of Numerical Taxonomy,FreemanPress,San Francisco,CA；Wilbur,W.J.和Lipman,D.J.,1983,Proc.Natl.Acad.Sci.USA80:726-730中。
在一些实施方案中，“序列同一性百分比”通过比较具有至少20个位置的比较窗口内的两个最佳比对序列来确定，其中与用于最佳比对两个序列的参考序列(其不包含添加或缺失)相比，比较窗口中的多核苷酸或多肽序列的部分可包含20％或更少、通常5至15％或10至12％的添加或缺失(即，缺口)。百分比通过以下计算：确定同一核酸碱基或氨基酸残基在两个序列中存在的位置的数目以产生匹配位置数，将匹配位置数除以参考序列的位置总数(即，窗口大小)，并且将结果乘以100以产生序列同一性百分比。
变体还可或可替代地实质上与天然基因或其部分或互补物同源。这样的多核苷酸变体在中等严格条件下能够与编码天然抗体(或互补序列)的天然存在的DNA序列杂交。
合适的“中等严格条件”包括在5×SSC、0.5％SDS、1.0mM EDTA(pH 8.0)的溶液中预洗涤；在50℃至65℃下，5×SSC，杂交过夜；随后在65℃下用含有0.1％SDS的2×、0.5×和0.2×SSC中的各者洗涤两次，持续20分钟。
如本文所用，“高度严格条件”或“高严格度条件”如下：(1)使用低离子强度和高温用于洗涤，例如在50℃下0.015M氯化钠/0.0015M柠檬酸钠/0.1％十二烷基硫酸钠；(2)在杂交期间使用变性剂，例如甲酰胺，例如在42℃下具有0.1％牛血清白蛋白的50％(v/v)甲酰胺/0.1％Ficoll/0.1％聚乙烯吡咯烷酮/具有750mM氯化钠、75mM柠檬酸钠的pH 6.5的50mM磷酸钠缓冲液；或(3)在42℃下使用50％甲酰胺、5X SSC(0.75M NaCl，0.075M柠檬酸钠)、50mM磷酸钠(pH 6.8)、0.1％焦磷酸钠、5X Denhardt溶液、超声处理鲑鱼精子DNA(50μg/mL)、0.1％SDS和10％硫酸葡聚糖，其中在42℃下在0.2X SSC(氯化钠/柠檬酸钠)中和在55℃下在50％甲酰胺中洗液，随后在55℃下用由含EDTA的0.1X SSC组成的高严格度洗液洗涤。本领域技术人员将知道如何视需要调节温度、离子强度等以适应例如探针长度等的因素。
本领域普通技术人员将了解，由于遗传密码的简并性，存在许多编码如本文所述的多肽的核苷酸序列。这些多核苷酸中的一些与任何天然基因的核苷酸序列具有最小同源性。尽管如此，本公开内容特别考虑了由于密码子使用差异而变化的多核苷酸。此外，包含本文所提供的多核苷酸序列的基因的等位基因在本公开内容的范围内。等位基因是由于核苷酸的一个或多个突变或改变(例如缺失、添加和/或置换)而改变的内源基因。所得mRNA和蛋白质可以(但未必)具有改变的结构或功能。等位基因可使用标准技术(例如杂交、扩增和/或数据库序列比较)来鉴定。
本发明的多核苷酸可以使用化学合成、重组方法或PCR获得。化学多核苷酸合成方法在本领域是众所周知的并且不需要在本文中详细描述。本领域技术人员可使用本文提供的序列和商业DNA合成仪来产生所希望的DNA序列。
为使用重组方法制备多核苷酸，可以将包含所希望的序列的多核苷酸插入合适的载体中，并且可以将载体转而引入合适的宿主细胞中进行复制和扩增，如本文中进一步讨论的。多核苷酸可以通过本领域中已知的任何方式插入宿主细胞中。通过直接摄取、内吞作用、转染、F-接合或电穿孔引入外源性多核苷酸来转化细胞。一旦引入，外源性多核苷酸可以作为非整合载体(例如质粒)维持在细胞内或整合至宿主细胞基因组中。如此扩增的多核苷酸可通过本领域众所周知的方法与宿主细胞分离。参见，例如Sambrook等人,1989。
可替代地，PCR允许DNA序列复制。PCR技术在本领域中是众所周知的并且描述于美国专利号4,683,195、4,800,159、4,754,065和4,683,202以及PCR:The Polymerase ChainReaction,Mullis等人编,Birkauswer Press,Boston,1994中。
RNA可通过使用合适载体中的经分离的DNA并且将其插入合适的宿主细胞获得。当细胞复制并且DNA被转录成RNA时，随后可使用本领域技术人员众所周知的方法分离RNA，例如，如Sambrook等人,1989中所阐述的。
在一些实施方案中，第一载体包含编码重链的多核苷酸并且第二载体包含编码轻链的多核苷酸。在一些实施方案中，第一载体和第二载体以相似量(例如相似摩尔量或相似质量)转染至宿主细胞中。在一些实施方案中，将摩尔比或质量比为5:1至1:5的第一载体和第二载体转染至宿主细胞中。在一些实施方案中，使用质量比为1:1至1:5的编码重链的载体和编码轻链的载体。在一些实施方案中，使用质量比为1:2的编码重链的载体和编码轻链的载体。
载体
在一些实施方案中，选择针对在CHO或CHO衍生的细胞或NSO细胞中表达多肽而优化的载体。示例性的这样的载体描述于例如Running Deer等人,Biotechnol.Prog.20:880-889(2004)中。
合适的克隆和表达载体可包括多种组分，例如启动子、增强子和其他转录调节序列。载体还可经构建以允许抗体可变结构域后续克隆至不同载体中。合适的克隆载体可根据标准技术构建，或可选自大量在本领域中可用的克隆载体。虽然所选克隆载体可根据意欲使用的宿主细胞而变化，但有用的克隆载体通常将具有自我复制的能力，可具有特定限制性核酸内切酶的单一目标，和/或可携带可用于选择含有载体的克隆的标志物的基因。合适的实例包括质粒和细菌病毒，例如pUC18、pUC19、Bluescript(例如pBS SK+)及其衍生物、mp18、mp19、pBR322、pMB9、ColE1、pCR1、RP4、噬菌体DNA和穿梭载体，例如pSA3和pAT28。这些和许多其他克隆载体可购自例如BioRad、Strategene和Invitrogen的商业供应商。进一步提供表达载体。表达载体通常为含有根据本公开内容的多核苷酸的可复制多核苷酸构建体。暗示表达载体作为游离基因或作为染色体DNA的整合部分在宿主细胞中必须是可复制的。合适的表达载体包括但不限于质粒、病毒载体(包括腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒)、黏粒和PCT公开号WO 87/04462中所公开的一种或多种表达载体。载体组分通常可包括但不限于以下中的一种或多种：信号序列；复制起点；一种或多种标志物基因；合适的转录控制元件(例如启动子、增强子和终止子)。对于表达(即翻译)而言，通常还需要一种或多种翻译控制元件，例如核糖体结合位点、翻译起始位点和终止密码子。
含有感兴趣的多核苷酸的载体和/或多核苷酸本身可通过多种适当方式中的任一种引入宿主细胞中，包括电穿孔、使用氯化钙、氯化铷、磷酸钙、DEAE-葡聚糖或其他物质转染；微弹轰击；脂质体转染；和感染(例如在载体为例如痘苗病毒的感染物的情况下)。引入载体或多核苷酸的选择通常取决于宿主细胞的特点。
宿主细胞
抗体或其抗原结合片段可使用适合的宿主细胞以重组方式制备。编码抗体或其抗原结合片段的核酸可克隆至表达载体中，所述表达载体随后可经引入宿主细胞，例如大肠杆菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞、猿猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞，其中所述细胞并不会另外产生免疫球蛋白，以获得重组宿主细胞中抗体的合成。优选的宿主细胞包括本领域众所周知的许多细胞中的CHO细胞、人类胚肾HEK-293细胞或Sp2.0细胞。抗体片段可通过全长抗体的蛋白水解或其他降解、通过重组方法或通过化学合成来产生。抗体的多肽片段(尤其是多达约50个氨基酸的较短多肽)可以通过化学合成来方便地制备。用于蛋白质和肽的化学合成方法是本领域中已知的并且可商购获得。
在各种实施方案中，抗αvβ8整合素重链抗体重链和/或抗αvβ8整合素轻链可在例如细菌细胞的原核细胞中；或在例如真菌细胞(例如酵母)、植物细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞的真核细胞中表达。这样的表达可例如根据本领域中已知的程序来进行。可用于表现多肽的示例性真核细胞包括但不限于COS细胞，包括COS 7细胞；293细胞，包括293-6E细胞；CHO细胞，包括CHO-S、DG44.Lecl3 CHO细胞和FUT8 CHO细胞；
Figure BDA0002961224610001831
细胞(Crucell)；和NSO细胞。在一些实施方案中，抗αvβ8整合素重链和/或抗αvβ8整合素轻链可在酵母中表达。参见，例如美国公开号2006/0270045 Al。在一些实施方案中，特定真核宿主细胞基于其对抗αvβ8整合素重链和/或抗αvβ8整合素轻链进行所希望的翻译后修饰的能力来进行选择。例如，在一些实施方案中，CHO细胞产生多肽，所述多肽的唾液酸化水平高于293细胞中所产生的相同多肽。
向所希望的宿主细胞中引入一种或多种核酸可通过任何方法来完成，包括但不限于磷酸钙转染、DEAE-聚葡萄糖介导的转染、阳离子脂质介导的转染、电穿孔、转导、感染等。非限制性示例性方法描述于例如Sambrook等人,Molecular Cloning,A LaboratoryManual,第3版Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)中。根据任何合适的方法，核酸可以在所希望的宿主细胞中短暂或稳定转染。
抗αvβ8整合素抗体可通过任何合适的方法纯化。这样的方法包括但不限于使用亲和基质或疏水相互作用层析。合适的亲和配体包括结合抗体恒定区的配体。例如，蛋白A、蛋白G、蛋白A/G或抗体亲和柱可用于结合恒定区和纯化抗αvβ8整合素抗体。疏水相互作用层析(例如丁基或苯基柱)也可适用于纯化一些多肽。本领域中已知许多用于纯化多肽的方法。
在一些实施方案中，抗αvβ8整合素抗体在无细胞系统中产生。非限制性示例性无细胞系统描述于例如Sitaraman等人,Methods Mol.Biol.498:229-44(2009)；Spirin,Trends Biotechnol.22:538-45(2004)；Endo等人,Biotechnol.Adv.21:695-713(2003)中。
IV.用途和医学疗法
治疗性用途
在一些方面，本发明提供通过使用抗αvβ8整合素抗体或其抗原结合片段抑制αvβ8整合素活性的治疗方法，其中治疗方法包括施用治疗有效量的包含抗αvβ8整合素抗体或其抗原结合片段的药物组合物。治疗的病症为可通过去除、抑制或降低αvβ8整合素活性或信号传导而得到改善、改良、抑制或预防的任何疾病或病况。特别地，本发明的抗αvβ8整合素抗体，包括人源化和嵌合抗体可用于预防、治疗和/或改善由受试者(例如，患有癌症的受试者的肿瘤微环境内)的异常(例如，增加的)αvβ8整合素活性和/或TGFβ信号传导引起和/或与其相关的疾病、病症或病况。在一些实施方案中，所述疾病、病症或病况包含呼吸病况(例如，哮喘)、纤维化或贫血。在一些实施方案中，所述疾病、病症或病况可用疫苗治疗或预防。
在一些方面，本发明提供了一种用于选择性抑制肿瘤微环境中的细胞(包括例如树突状细胞、T调节细胞、肿瘤相关巨噬细胞和/或肿瘤自身细胞)的αvβ8依赖性潜伏TGFβ活化的方法。不受任何特定理论束缚，通过施用本发明的抗αvβ8整合素抗体介导的免疫系统和/或肿瘤微环境内的TGFβ活化的更精确和选择性拮抗作用可促进受试者中的抗肿瘤免疫反应而不干扰TGFβ的更广泛自身稳定功能。可预期不干扰TGFβ的更广泛自身稳定功能的受试者内的这类抗肿瘤免疫反应会提供优于全身性TGFβ抑制的安全和治疗优势。
本文提供的方法还可用于减少和/或减弱受试者(例如，患有癌症的受试者的肿瘤微环境内)的TGFβ活性(例如，TGFβ肿瘤促进活性)。可通过向受试者(例如，患有癌症的受试者)施用治疗有效量的本发明的抗αvβ8整合素抗体来减少和/或减弱肿瘤微环境内影响血管生成、转移、上皮-间质转化和/或抑制浸润性免疫细胞(例如，肿瘤浸润性淋巴细胞，例如T细胞、B细胞、自然杀伤细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、树突状细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞)的TGFβ活性。
在一些情况下，向患有癌症的受试者施用抗αvβ8整合素抗体或其抗原结合片段增加从受试者获得的肿瘤样品(例如，实体瘤样品)中的浸润性免疫细胞，例如CD45总淋巴细胞和骨髓细胞、CD3 T细胞、CD4 T细胞、CD8 T细胞和表达颗粒酶B的细胞(例如，活化的CD8和NK细胞)的量(例如，如通过免疫组织化学(IHC)分析所确定的密度)。与从参考肿瘤样品(例如，从患有类似癌症的相同受试者或不同受试者获得的肿瘤样品，其中肿瘤样品在施用(例如，第一次施用或后续施用)抗αvβ8整合素抗体或其抗原结合片段之前获得)获得的浸润性免疫细胞的量(例如，密度)相比，浸润性免疫细胞的量(例如，密度)的增加可例如通过从患有癌症的受试者获得的肿瘤样品(例如，实体瘤样品)的免疫组织化学(IHC)分析来确定。
在一个方面，本发明涉及使用抗αvβ8整合素抗体或其抗原结合片段体内治疗受试者，从而抑制或减少癌性肿瘤的生长。在一些实施方案中，使用抗αvβ8整合素抗体或其抗原结合片段体内治疗的受试者患有原发癌，例如局部晚期癌。在一些实施方案中，使用抗αvβ8整合素抗体或其抗原结合片段体内治疗的受试者患有复发性癌症，例如转移性癌症。
在一个方面，本发明涉及使用抗αvβ8整合素抗体或其抗原结合片段体内治疗患有表达αvβ8整合素、整合素β8(ITGβ8)和/或整合素αV(ITGαV)的癌症或肿瘤的受试者。在一些实施方案中，αvβ8、β8整合素和/或αV整合素的表达为蛋白质表达。在一些实施方案中，αvβ8、β8整合素和/或αV整合素的表达为mRNA表达。在一些实施方案中，相对于正常组织或样品中、对照组织或样品中、治疗前组织或样品和/或治疗后组织或样品中αvβ8、β8整合素和/或αV整合素表达水平，αvβ8、β8整合素和/或αV整合素的表达是增加的表达。在一个实施方案中，用于确定αvβ8、β8整合素和/或αV整合素的相对表达水平的组织或样品可以从患有癌症或肿瘤的受试者、从患有同一类型的癌症或肿瘤或不同类型的癌症或肿瘤的不同受试者或从无癌症或肿瘤的受试者中获得。
在一些实施方案中，相对于正常组织或样品中、对照组织或样品中、治疗前组织或样品和/或治疗后组织或样品中的表达水平，αvβ8、β8整合素和/或αV整合素的mRNA表达是增加的表达。在一些实施方案中，相对于正常组织或样品、对照组织或样品中、治疗前组织或样品和/或治疗后组织或样品中的αvβ8、β8整合素和/或αV整合素的mRNA表达水平，αvβ8、β8整合素和/或αV整合素的mRNA表达增加约5％、约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约100％、约150％、约200％、约300％、约400％、约500％。
可单独使用(例如，作为单一疗法)抗αvβ8整合素抗体或其抗原结合片段以抑制癌性肿瘤的生长。可替代地，可以与以下中的一种或多种组合使用抗αvβ8整合素抗体或其抗原结合片段：(例如，癌症或感染性病症的)护理标准治疗、另一种抗体或其抗原结合片段、免疫调节剂(例如，共刺激分子的活化剂或抑制分子的抑制剂)；疫苗，例如治疗性癌症疫苗；或其他形式的细胞免疫疗法。
因此，在一个实施方案中，本发明提供了一种抑制受试者中的肿瘤细胞的生长的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的本文所述的抗αvβ8整合素抗体或其抗原结合片段。
在一个实施方案中，所述方法适用于体内治疗癌症。为实现免疫性增强，抗αvβ8整合素抗体或其抗原结合片段可与感兴趣的抗原一起施用。当抗αvβ8整合素抗体或其抗原结合片段与一种或多种药剂组合施用时，组合可以任一顺序或同时施用。
在另一方面，提供了一种治疗受试者的方法，例如减少或改善受试者的过度增生性病况或病症(例如癌症)，例如实体瘤、血液癌、软组织肿瘤或转移性病灶。所述方法包括单独或与其他药剂或治疗模式组合向所述受试者施用一种或多种本文所述的抗αvβ8整合素抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，可施用本发明的抗αvβ8整合素抗体或其抗原结合片段作为未治疗受试者中的第1线疗法，或作为例如癌症复发或恶化后的第2线疗法。
可使用本文中所公开的抗体分子治疗，例如减少生长的示例性癌症包括通常对免疫疗法有反应的癌症。用于治疗的癌症的非限制性实例包括黑素瘤(例如，转移性恶性黑素瘤、皮肤恶性黑素瘤)、肾细胞癌(RCC)(例如，透明细胞癌、乳头状细胞癌)、前列腺癌(例如，激素难治性前列腺腺癌)、乳腺癌、卵巢癌(例如，上皮卵巢癌、输卵管或原发性腹膜癌)、头颈癌(例如，头颈部鳞状细胞癌(SCCHN))、结肠癌、食道癌(例如，腺癌和鳞状细胞癌)、胃癌(例如，胃和胃食道接合处的腺癌)、胰腺癌(例如胰腺导管腺癌)、胆管癌症(例如，胆管癌)；子宫内膜癌(例如，子宫体子宫内膜癌)、尿道上皮癌和肺癌(例如，非小细胞肺癌、鳞状细胞癌)。另外，可使用本文所述的抗体分子治疗难治性或复发性恶性肿瘤。
可治疗的其他癌症的实例包括骨癌、皮肤或眼内恶性黑素瘤、直肠癌、肛门癌、睾丸癌、子宫颈癌、阴道癌、外阴癌、Merkel细胞癌、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、小肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、慢性或急性白血病(包括急性髓性白血病、慢性髓性白血病、急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病)、儿童实体瘤、淋巴细胞性淋巴瘤、膀胱癌、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合征、肾癌或输尿管癌、肾盂癌、中枢神经系统(CNS)赘瘤、原发性CNS淋巴瘤、肿瘤血管生成、脊椎轴肿瘤、脑干胶质瘤、垂体腺瘤、卡波西肉瘤、表皮样癌、鳞状细胞癌、T细胞淋巴瘤、环境诱发的癌症(包括由石棉诱发的癌症(例如，间皮瘤))和所述癌症的组合。在一些实施方案中，癌症选自肾细胞癌、卵巢癌、头颈部鳞状细胞癌和皮肤癌(例如，黑素瘤，例如晚期黑素瘤)。
在一些情况下，癌症选自由以下各项组成的组：实体瘤、血液癌(例如，白血病、淋巴瘤、骨髓瘤，例如多发性骨髓瘤)和转移性病灶。癌症可以是实体瘤，例如实体瘤，例如恶性肿瘤，例如肉瘤和癌瘤，例如各种器官系统的腺癌，例如影响肺(例如，非小细胞肺癌(NSCLC))、乳房、卵巢、淋巴、胃肠道(例如，结肠)、肛门、生殖器和泌尿生殖道(例如，肾、尿道上皮、膀胱细胞、前列腺)、咽、CNS(例如，脑、神经或胶质细胞)、头颈部(例如，头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)、皮肤(例如，黑素瘤，例如晚期黑素瘤)、胰脏、结肠、直肠、肾(例如，肾细胞癌)、肝的腺癌、小肠癌和食道癌、胃食道癌、甲状腺癌和子宫颈癌。在一些情况下，癌症可以是淋巴增生性疾病(例如，移植后淋巴增生性疾病)或血液癌、T细胞淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤或白血病(例如，髓系白血病或淋巴系白血病)。在一些情况下，癌症为早期、中期、晚期或转移性癌症。在特定情况下，癌症为肾细胞癌、卵巢癌或头颈部鳞状细胞癌。
在其他实施方案中，癌症是血液恶性肿瘤或癌症，包括但不限于白血病或淋巴瘤。例如，抗αvβ8整合素抗体或其抗原结合片段可用于治疗癌症和恶性肿瘤，包括但不限于例如急性白血病，包括但不限于例如B细胞急性淋巴细胞白血病(“BALL”)、T细胞急性淋巴细胞白血病(“TALL”)、急性淋巴细胞白血病(ALL)；一种或多种慢性白血病，包括但不限于例如慢性髓性白血病(CML)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)；其他血液学癌症或血液学病况，包括但不限于例如B细胞前淋巴细胞性白血病、母细胞性浆细胞样树突状细胞赘瘤、伯基特淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、毛细胞白血病、小细胞或大细胞滤泡性淋巴瘤、恶性淋巴组织增生性病况、MALT淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常和骨髓增生异常综合征、非霍奇金淋巴瘤、浆母细胞淋巴瘤、浆细胞样树突状细胞赘瘤、Waldenstrom巨球蛋白血症和“白血病前期”，其是由骨髓血细胞无效产生(或发育不良)等引起的各种血液学病况的多样化集合。
在一个实施方案中，癌症选自肺癌(例如，非小细胞肺癌(NSCLC)(例如，具有鳞状和/或非鳞状组织学的NSCLC或NSCLC腺癌))、黑素瘤(例如，晚期黑素瘤)、皮肤鳞状细胞癌(皮肤SCC)(例如，转移性皮肤SCC)、肾癌(例如，肾细胞癌，例如透明细胞肾细胞癌)、肝癌、骨髓瘤(例如，多发性骨髓瘤)、前列腺癌、乳腺癌(例如，不表达雌激素受体、孕酮受体或Her2/neu中的一种、两种或全部的乳腺癌，例如三阴性乳腺癌)、结肠直肠癌、胰脏癌、头颈癌(例如，头颈部鳞状细胞癌(HNSCC))、肛门癌、胃食道癌、甲状腺癌、子宫颈癌、淋巴增生性疾病(例如，移植后淋巴增生性疾病)或血液癌、T细胞淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤或白血病(例如，髓系白血病)。
在另一个实施方案中，癌症选自癌瘤(例如，晚期或转移性癌瘤)、黑素瘤或肺癌，例如非小细胞肺癌。
在一个实施方案中，癌症是肺癌，例如非小细胞肺癌。
在另一实施方案中，癌症是前列腺癌，例如晚期前列腺癌。
在又一实施方案中，癌症是骨髓瘤，例如多发性骨髓瘤。
在又一实施方案中，癌症是肾癌，例如肾细胞癌(RCC)(例如转移性RCC或透明细胞肾细胞癌)。
在一些实施方案中，当癌症是皮肤癌(例如，黑素瘤，例如晚期黑素瘤，例如皮肤鳞状细胞癌，例如转移性皮肤鳞状细胞癌)时。
在一个实施方案中，癌症是黑素瘤，例如晚期黑素瘤。在一个实施方案中，癌症是对其他疗法无反应的晚期或不可切除性黑素瘤。
在一些实施方案中，癌症是肾癌，例如肾细胞癌(RCC)。在一些情况下，肾癌为转移性RCC、透明细胞肾细胞癌(ccRCC)或非透明细胞肾细胞癌(ncRCC)。在一些情况下，当癌症是RCC，例如ccRCC时，可施用本发明的抗αvβ8整合素抗体或其抗原结合片段作为第1线或第2线疗法。
在一些实施方案中，当癌症是卵巢癌时，可施用本发明的抗αvβ8整合素抗体或其抗原结合片段作为耐铂患者的第2线疗法。
在一些实施方案中，所述癌症是耐铂和/或复发性癌症。
本文公开的方法和组合物适用于治疗与前述癌症相关的转移性病灶。
组合疗法
肿瘤通过多种机制逃避宿主免疫监视。可通过由肿瘤表达并且免疫抑制的蛋白质的失活来克服这些许多这些机制。这些包括TGF-β(Kehrl,J.等人,(1986)J.Exp.Med.163:1037-1050)、IL-10(Howard,M.和O’Garra,A.(1992)Immunology Today 13:198-200))和Fas配体(Hahne,M.等人,(1996)Science 274:1363-1365)。可与抗αvβ8整合素抗体或其抗原结合片段组合使用这些实体中的每一个的抗体或其抗原结合片段以抵消免疫抑制剂的作用并且有利于宿主的肿瘤免疫反应。
可以以未缀合形式或与第二药剂(例如细胞毒性药物)、放射性同位素或蛋白质(例如蛋白质毒素或病毒蛋白质)缀合使用本文公开的抗体或抗原结合片段。该方法包括：向需要这样的治疗的受试者施用单独的抗体分子或与细胞毒性药物缀合的抗体分子。所述抗体分子可用于递送各种治疗剂，例如细胞毒性部分，例如治疗药物、放射性同位素、植物、真菌或细菌来源的分子或生物蛋白(例如，蛋白质毒素)或颗粒(例如，重组病毒颗粒，例如，通过病毒外壳蛋白)或其混合物。
在某些实施方案中，抗αvβ8整合素抗体或其抗原结合片段可与其他疗法组合使用以提供意想不到的协同治疗效果，其可提供比添加两种单独疗法的仅累加效应更大的效果。例如，组合疗法可包括与一种或多种额外治疗剂(例如一种或多种抗癌剂、细胞毒性剂或细胞生长抑制剂、激素治疗、疫苗和/或其他免疫疗法)共配制和/或共施用的本发明的组合物。在其他实施方案中，抗体分子与其他治疗性治疗模式(包括手术、辐射、冷冻手术和/或热疗法)组合施用。这种协同组合疗法可以有利地利用较低剂量的所施用的治疗剂，从而避免与各种单一疗法相关的可能毒性或并发症。
在某些实施方案中，本文所述的方法和组合物与一种或多种其他抗体分子、化学疗法、其他抗癌疗法(例如，靶向抗癌疗法或溶瘤药物)、细胞毒性剂、基于免疫的疗法(例如，细胞因子)、手术和/或辐射程序组合施用。可组合施用的示例性细胞毒性剂包括抗微管剂、拓朴异构酶抑制剂、抗代谢物、有丝分裂抑制剂、烷基化剂、蒽环类、长春花生物碱、插入剂、能够干扰信号转导途径的药剂、促进细胞凋亡的药剂、蛋白酶体抑制剂和辐射(例如局部或全身照射)。
可替代地，或组合前述组合，本文所述的方法和组合物可与以下中的一种或多种组合施用：免疫调节剂(例如，共刺激分子的活化剂或抑制分子的抑制剂)；疫苗，例如治疗性癌症疫苗；或其他形式的细胞免疫疗法。
抗αvβ8整合素抗体或其抗原结合片段的示例性非限制性协同组合和用途包括以下。
在某些实施方案中，抗αvβ8整合素抗体或其抗原结合片段与共刺激分子或抑制分子(例如共同抑制配体或受体的调节剂)组合施用。
在一个实施方案中，抗αvβ8整合素抗体或其抗原结合片段与共刺激分子的调节剂(例如激动剂)组合施用。在一个实施方案中，共刺激分子的激动剂选自4-1BB(CD137)、OX40、CD2、CD27、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、ICOS(CD278)、GITR、CD30、CD40、BAFFR、HVEM、CD7、LIGHT、NKG2C、SLAMF7、NKp80、CD160或B7-H3的激动剂(例如，激动性抗体或其抗原结合片段，或可溶性融合物)。
在另一个实施方案中，抗αvβ8整合素抗体或其抗原结合片段与免疫调节剂，例如共刺激分子，例如与阳性信号(其包括4-1BB(CD137)、CD28、CD27、ICOS和GITR的共刺激结构域)相关的激动剂或调节剂组合使用。
示例性GITR调节剂包括例如GITR融合蛋白和抗GITR抗体(例如二价抗GITR抗体)，例如美国专利号6,111,090、欧洲专利号090505B1、美国专利号8,586,023、PCT公开号WO2010/003118和2011/090754中所描述的GITR融合蛋白，或例如美国专利号7,025,962、欧洲专利号1947183B1、美国专利号7,812,135、美国专利号8,388,967、美国专利号8,591,886、欧洲专利号EP 1866339、PCT公开号WO 2011/028683、PCT公开号WO 2013/039954、PCT公开号WO2005/007190、PCT公开号WO 2007/133822、PCT公开号WO2005/055808、PCT公开号WO99/40196、PCT公开号WO 2001/03720、PCT公开号WO99/20758、PCT公开号WO2006/083289、PCT公开号WO 2005/115451、美国专利号7,618,632号和PCT公开号WO 2011/051726中所描述的抗GITR抗体。
在一个实施方案中，抗αvβ8整合素抗体或其抗原结合片段与免疫检查点分子的抑制分子的抑制剂组合施用。本领域普通技术人员应理解，术语“免疫检查点”意指CD4和CD8T细胞的细胞表面上的一组分子。这些分子可有效充当“闸”以下调或抑制抗肿瘤免疫反应。免疫检查点分子包括但不限于程序性死亡1(PD-1)、细胞毒性T淋巴细胞抗原4(CTLA-4)、B7H1、B7H4、OX-40、CD137、CD40、LAG-3和TIM-3，其直接抑制免疫细胞。可充当适用于本发明的方法的免疫检查点抑制剂的免疫治疗剂包括但不限于PD-1、PD-L1、PD-L2、CTLA4、TIM-3、LAG-3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CEACAM和/或TGFβ的抑制剂。抑制分子的抑制作用可通过在DNA、RNA或蛋白质水平上的抑制来进行。在实施方案中，可使用抑制核酸(例如dsRNA、siRNA或shRNA)抑制抑制分子的表达。在其他实施方案中，抑制信号的抑制剂是多肽，例如可溶性配体或抗体或其抗原结合片段，其结合至抑制分子。
在一个实施方案中，抑制剂是可溶性配体(例如，CTLA-4-Ig或TIM-3-Ig)或结合至PD-1、PD-L1、PD-L2或CTLA4的抗体或抗体片段。例如，抗PD-1抗体分子可与抗CTLA-4抗体(例如伊匹单抗(ipilimumab))组合施用例如以治疗癌症(例如，选自以下的癌症：黑素瘤，例如转移性黑素瘤；肺癌，例如非小细胞肺癌；或前列腺癌)。示例性抗CTLA4抗体包括Tremelimumab(可从辉瑞获得的IgG2单克隆抗体，先前称为替西单抗ticilimumab，CP-675,206)；和伊匹单抗(CTLA-4抗体，也称为MDX-010，CAS号477202-00-9)。在一个实施方案中，治疗后，例如在有或无BRAF抑制剂(例如，维罗非尼(vemurafenib)或达拉非尼(dabrafenib))下用抗CTLA4抗体(例如，伊匹单抗)治疗黑素瘤后施用抗αvβ8整合素抗体或其抗原结合片段。抗CTLA-4抗体(例如伊匹单抗)的示例性剂量为约3mg/kg。
可用于活化宿主免疫反应性的其他抗体可与抗αvβ8整合素抗体或其抗原结合片段组合使用。这些包括树突状细胞表面上的活化DC功能和抗原呈递的分子。抗CD40抗体能够有效置换T辅助细胞活性(Ridge,J.等人,(1998)Nature 393:474-478)，并且可与抗αvβ8整合素抗体或其抗原结合片段结合使用。还可提供针针对T细胞共刺激分子(例如CTLA-4(例如美国专利号5,811,097)、OX-40(Weinberg,A.等人,(2000)Immunol 164:2160-2169)、4-1BB(Melero,I.等人,(1997)Nature Medicine 3:682-685(1997))和ICOS(Hutloff,A.等人,(1999)Nature 397:262-266))的抗体以提高T细胞活化水平。
在某些实施方案中，本文所述的抗αvβ8整合素抗体或其抗原结合片段与本领域中已知的PD-1、PD-L1和/或PD-L2的一种或多种抑制剂组合施用。在一个实施方案中，抗αvβ8整合素抗体或其抗原结合片段与免疫检查点抑制剂(例如，抗PD-1、抗PD-L1和/或抗PD-L2抗体或其抗原结合片段)同时施用给先前尚未用免疫检查点抑制剂治疗的受试者。在一个实施方案中，抗αvβ8整合素抗体或其抗原结合片段与免疫检查点抑制剂(例如，抗PD-1、抗PD-L1和/或抗PD-L2抗体或其抗原结合片段)同时施用给先前已用免疫检查点抑制剂治疗并且其中癌症或肿瘤已经进展(例如，局部晚期、转移)的受试者。在一个实施方案中，在28天的周期中两周一次(例如，每2周)施用抗αvβ8整合素抗体或其抗原结合片段，并且在每个28天的周期的第1天每4周施用免疫检查点抑制剂。在一个实施方案中，在28天的周期向患有癌症或肿瘤的受试者两周一次施用抗αvβ8整合素抗体或其抗原结合片段，并且在每个28天的周期的第1天每4周施用免疫检查点抑制剂(例如，抗PD-1、抗PD-L1和/或抗PD-L2抗体或其抗原结合片段)。在一个实施方案中，免疫检查点抑制剂是PCT公开号WO2016/092419中所述的抗PD1抗体或其抗原结合片段(例如，RN888，如称作PF-06801591或萨善利单抗(sasanlimab))。在一个实施方案中，癌症或肿瘤为鳞状细胞癌，例如头部或颈部鳞状细胞癌(SCCHN)、肾细胞癌(RCC)、乳腺癌或结肠癌。
PD-1、PD-L1和/或PD-L2的抑制剂可以是抗体、其抗原结合片段、免疫粘附素、融合蛋白或寡肽。在一些实施方案中，抗PD-1抗体选自MDX-1106、Merck 3475或CT-011。在一个实施方案中，抗PD-1抗体为纳武单抗(nivolumab)
Figure BDA0002961224610001954
派姆单抗(pembrolizumab)
Figure BDA0002961224610001955
斯帕塔利单抗(spartalizumab)、匹地利珠单抗(pidilizumab)、替雷利珠单抗(tislelizumab)、AMP-224、AMP-514、cemiplimab或萨善利单抗(RN888、mAb7、PF-06801591)。在一个实施方案中，抗PD-L1抗体为MEDI4736、MPDL3280A(YW243.55.s70)、BMS-936559(MDX-1105)、阿特珠单抗(atezolizumab)
Figure BDA0002961224610001951
德瓦鲁单抗(durvalumab)
Figure BDA0002961224610001952
或阿维鲁单抗
Figure BDA0002961224610001953
在一个实施方案中，抗PD-L1抗体不是阿维鲁单抗。在一个实施方案中，抗PD-1抗体描述于PCT公开号WO2016/092419中，包括但不限于mAb7(也称为RN888、PF-06801591或萨善利单抗)。
在一些实施方案中，PD-1抑制剂是与恒定区(例如免疫球蛋白序列的Fc区)融合的免疫粘附素(例如包含PD-L1或PD-L2的胞外或PD-1结合部分的免疫粘附素)。在一些实施方案中，PD-1抑制剂为AMP-224。在一些实施方案中，PD-L1抑制剂为抗PD-L1抗体。在一些实施方案中，抗PD-L1结合拮抗剂选自YW243.55.s70(也称为MPDL3280A，阿特珠单抗)、MEDI-4736、MSB-0010718C或MDX-1105。也称为BMS-936559的MDX-1105是WO2007/005874中所描述的抗PD-L1抗体。也称为MPDL3280A的抗体YW243.55.S70(分别为SEQ ID No.20和21中所示的重链和轻链可变区序列)是WO 2010/077634中所描述的抗PD-L1。
MDX-1106(也称为MDX-1106-04、ONO-4538或BMS-936558)是WO2006/121168中所描述的抗PD-1抗体。Merck 3745(也称为MK-3475或SCH-900475)是WO2009/114335中所描述的抗PD-1抗体。匹地利珠单抗(CT-011；Cure Tech)是结合至PD-1的人源化IgG1k单克隆抗体。匹地利珠单抗和其他人源化抗PD-1单克隆抗体公开于WO2009/101611中。在其他实施方案中，抗PD-1抗体是派姆单抗。派姆单抗(商品名KEYTRUDA，先前为lambrolizumab，也称为MK-3475)公开于例如Hamid,O.等人,(2013)New England Journal of Medicine 369(2):134-44中。AMP-224(B7-DCIg；Amplimmune；例如公开于WO2010/027827和WO2011/066342中)是PD-L2 Fc融合可溶性受体，其阻断PD-1与B7-H1之间的相互作用。其他抗PD-1抗体包括AMP-514(Amplimmune)等，例如在US 8,609,089、US 2010028330和/或US 20120114649中所公开的抗PD-1抗体。
在一些实施方案中，抗PD-1抗体为MDX-1106。MDX-1106的替代名称包括MDX-1106-04、ONO-4538、BMS-936558或纳武单抗。在一些实施方案中，抗PD-1抗体为纳武单抗(CAS登记号：946414-94-4)。纳武单抗(还称为BMS-936558或MDX1106；Bristol-Myers Squibb)是特异性阻断PD-1的完全人类IgG4单克隆抗体。特异性结合至PD-1的纳武单抗(克隆5C4)和其他人类单克隆抗体公开于US 8,008,449和WO2006/121168中。拉立珠单抗(也称为派姆单抗或MK03475；Merck)是结合至PD-1的人源化IgG4单克隆抗体。派姆单抗和其他人源化抗PD-1抗体公开于US 8,354,509和WO2009/114335中。MDPL3280A(Genentech/Roche)是结合至PD-L1的人类Fc优化的IgG1单克隆抗体。MDPL3280A(也称为YW243.55.s70)和其他针对PD-L1的人类单克隆抗体公开于美国专利号7,943,743和美国公开号20120039906中。YW243.55.s70(重链和轻链可变区显示在SEQ ID NO 20和21中)的序列还阐述于WO2010/077634和US 8,217,149中。MDX-1105(也称为BMS-936559)和其他抗PD-L1结合剂公开于WO2007/005874中。
在其他实施方案中，抗αvβ8整合素抗体或其抗原结合片段与细胞因子(例如白介素-21、白介素-2、白介素-12或白介素-15)组合施用。在某些实施方案中，本文所描述的抗αvβ8整合素抗体或其抗原结合片段和细胞因子的组合用于治疗癌症，例如如本文所述的癌症(例如，实体瘤或黑素瘤)。
在本文所述的所有方法中，抗αvβ8整合素抗体或其抗原结合片段可组合其他形式的免疫疗法，例如细胞因子治疗(例如，干扰素、GM-CSF、G-CSF、IL-2、IL-21)或双特异性抗体疗法(其提供增强的肿瘤抗原呈递(参见，例如Holliger(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:6444-6448；Poljak(1994)Structure 2:1121-1123))。
可用于与抗αvβ8整合素抗体或其抗原结合片段组合的示例性免疫调节剂包括但不限于例如阿夫土珠单抗(afutuzumab)(可从
Figure BDA0002961224610001971
获得)；培非格司亭(pegfilgrastim)
Figure BDA0002961224610001972
来那度胺(lenalidomide)(CC-5013，
Figure BDA0002961224610001973
)；沙立度胺(thalidomide)
Figure BDA0002961224610001974
actimid(CC4047)；和细胞因子，例如IL-21或IRX-2(包括可从IRXTherapeutics获得的白介素1、白介素2和干扰素γCAS 951209-71-5的人类细胞因子的混合物)。
在一些实施方案中，癌症为卵巢癌，并且抗αvβ8整合素抗体或其抗原结合片段与PARP1的抑制剂(例如，奥拉帕尼、芦卡帕尼、尼拉帕尼、维利帕尼、依尼帕瑞、他拉柔帕尼、3-胺基苯甲酰胺、CEP 9722、E7016、BSI-201、KU-0059436、AG014699、MK-4827或BGB-290)组合施用。
在一些实施方案中，癌症为头颈癌，例如头颈部鳞状细胞癌。在一些实施方案中，抗αvβ8整合素抗体或其抗原结合片段与辐射疗法组合施用。
诊断用途
本发明的抗αvβ8整合素抗体或其抗原结合片段还可用于例如出于诊断目的检测和/或测量样品中的αvβ8整合素或表达αvβ8整合素的细胞。例如，抗αvβ8整合素抗体或其片段可以用于诊断由αvβ8整合素的异常表达(例如过表达、低表达、表达不足等)表征的病况或疾病。αvβ8整合素的示例性诊断测定可包含例如使从患者获得的样品与本发明的抗-抗-αvβ8整合素抗体或其抗原结合片段接触，其中抗αvβ8整合素抗体或其抗原结合片段用可检测到的标记或报道分子进行标记。
在一个方面，本发明提供了用于在体外(例如，在生物样品中，例如组织活检，例如来自癌性组织)或在体内(例如，在受试者中体内成像)检测αvβ8整合素蛋白质的存在的诊断方法。所述方法包括：(i)使样品与本文所述的抗体或其抗原结合片段接触，或向所述受试者施用抗体或其抗原结合片段；(任选地)(ii)使参考样品，例如对照样品(例如，对照生物样品，例如血浆、组织、活组织检查)或对照受试者))接触；和(iii)检测抗体或其抗原结合片段与样品或受试者或对照样品或受试者之间的复合物的形成，其中变化，例如相对于对照样品或受试者在样品或受试者中的复合物的形成中统计学上显著的变化指示αvβ8整合素在样品中的存在。可通过可检测到的物质直接或间接标记抗体分子以促进结合或非结合抗体的检测。合适的可检测到的物质包括各种酶、辅基、荧光材料、发光材料和放射性材料，其如上文所述并且更详细地描述于下文中。
术语“样品”，当其是指用于检测多肽的样品时，包括但不限于细胞、细胞裂解物、细胞的蛋白质或膜提取物、体液或组织样品。
抗体分子与αvβ8整合素之间的复合物形成可以通过测量或可视化结合至αvβ8整合素抗原的结合分子或未结合的结合分子来检测。可以使用常规检测测定，例如酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)或组织免疫组织化学。替代标记所述抗体或其抗原结合片段，αvβ8整合素的存在可利用用可检测到的物质标记的标准物和未标记的抗体分子通过竞争免疫测定在样品中测定。在该测定中，组合生物样品、经标记的标准物和抗体或其抗原结合片段，并且测定结合至未标记结合分子的经标记的标准物的量。样品中αvβ8整合素的量与结合至所述抗体或其抗原结合片段的经标记的标准物的量成反比。
V.组合物
本公开内容还提供了包含有效量的本文所述的抗αvβ8整合素抗体的药物组合物。本文中还描述所述组合物的实例以及如何配制所述组合物。在一些实施方案中，组合物包含一种或多种抗αvβ8整合素抗体。在一些实施方案中，抗αvβ8整合素抗体识别αvβ8整合素(例如，来自人类、小鼠、食蟹猴或大鼠的αvβ8整合素)。在一些实施方案中，抗αvβ8整合素抗体是人源化抗体。在一些实施方案中，抗αvβ8整合素抗体是嵌合抗体。在一些实施方案中，抗αvβ8整合素抗体包含能够触发所希望的免疫反应(例如抗体介导的裂解或ADCC)的恒定区。
本公开内容中所用的组合物可进一步包含呈冻干配制物或水溶液形式的药学上可接受的承载体、赋形剂或稳定剂。
如本文所用，“药学上可接受的承载体”或“药学上可接受的赋形剂”包括任何材料，其在与活性成分组合时使得成分保持生物活性并且与受试者的免疫系统无反应性。实例包括但不限于标准药物承载体中任一项，例如磷酸盐缓冲盐水溶液、水、乳液(例如油/水乳液)和各种类型的湿润剂。对于气溶胶或肠胃外施用的优选稀释剂为磷酸盐缓冲盐水(PBS)或生理盐水(0.9％)。包含这类承载体的组合物通过常规方法(参见，例如Remington’s Pharmaceutical Sciences,第18版,A.Gennaro,编,Mack Publishing Co.,Easton,PA,1990；和Remington,The Science and Practice of Pharmacy第20版Mack Publishing,2000)配制。
可接受的承载体、赋形剂或稳定剂在剂量和浓度下对接受者无毒性，并且可包含缓冲液，例如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；包括抗坏血酸和甲硫氨酸的抗氧化剂；防腐剂(例如十八烷基二甲基苯甲基氯化铵；氯化六烃季铵；氯苄烷铵、苯扎氯铵；苯酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷基酯，例如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(低于约10个残基)多肽；蛋白质，例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、双糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或右旋糖苷；螯合剂，例如EDTA；糖，例如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐反离子，例如钠离子；金属复合物(例如，Zn-蛋白质复合物)；和/或非离子表面活性剂，例如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。本文中进一步描述了药学上可接受的赋形剂。
抗αvβ8整合素抗体及其组合物还可与用于增强和/或互补药剂有效性的其他药剂(包括另一种治疗剂(例如，免疫检查点分子的抑制剂)结合使用。
本公开内容还提供了包含药物组合物、包含编码本公开内容的抗体的多核苷酸的组合物。在一些实施方案中，组合物包含表达载体，其包含编码如本文所述的抗体的多核苷酸。在一些实施方案中，组合物包含SEQ ID NO:1或4的多核苷酸中的任一种或两者。在一些实施方案中，组合物包含SEQ ID NO:183或4的多核苷酸中的任一种或两者。在一些实施方案中，组合物包含SEQ ID NO:185或189的多核苷酸中的任一种或两者。在一些实施方案中，组合物包含SEQ ID NO:185或191的多核苷酸中的任一种或两者。
在另一方面，多核苷酸可编码本公开内容的抗体的VH、VL和/或VH和VL两者。即，组合物包含编码本公开内容的抗体或其抗原结合片段的一种多核苷酸或一种以上多核苷酸。
本公开内容的药物化合物可包含一种或多种药学上可接受的盐。所述盐的实例包括酸加成盐和碱加成盐。酸加成盐包括来源于无毒无机酸的那些，例如盐酸、硝酸、磷酸、硫酸、氢溴酸、氢碘酸亚磷酸等；以及来源于无毒有机酸的那些，例如脂族单羧酸和二羧酸、苯基取代的烷酸、羟基烷酸、芳族酸、脂族和芳族磺酸等。碱加成盐包括衍生自碱土金属(例如钠、钾、镁、钙等)以及衍生自无毒有机胺(例如，N,N’-二苯甲基乙二胺、N-甲基葡糖胺、氯普鲁卡因(chloroprocaine)、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、普鲁卡因等)的那些。
本公开内容的药物组合物还可包括药学上可接受的抗氧化剂。药学上可接受的抗氧化剂的实例包括：(1)水溶性抗氧化剂，例如抗坏血酸、半胱氨酸盐酸盐、硫酸氢钠、偏亚硫酸氢钠、亚硫酸钠等；(2)油溶性抗氧化剂，例如抗坏血酸棕榈酸酯、丁基化羟基大茴香醚(BHA)、丁基化羟基甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚等；和(3)金属螯合剂，例如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨糖醇、酒石酸、磷酸等。
可用于本公开内容的药物组合物的合适的水性和非水性承载体的实例包括水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)和其合适的混合物、植物油(例如橄榄油)和可注射有机酯(例如油酸乙酯)。适当流动性可例如通过使用包衣材料(例如卵磷脂)、在分散体的情况下通过维持所需要的粒度和通过使用表面活性剂来维持。
这些组合物还可含有佐剂，例如防腐剂、湿润剂、乳化剂和分散剂。可通过灭菌程序与通过包含各种抗细菌剂和抗真菌剂(例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚山梨酸等)来确保防止微生物的存在。还可能需要在组合物中包含等渗剂，例如糖、氯化钠等。另外，可注射药物形式的延长吸收可通过包含延迟吸收的药剂(例如单硬脂酸铝和明胶)来实现。
药物组合物通常必须在制备和储存条件下无菌并且稳定。组合物可配制为溶液、微乳液、脂质体或适合于较高药物浓度的其他有序结构。承载体可为含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)和其合适混合物的溶剂或分散介质。适当流动性可例如通过使用例如卵磷脂的包衣、通过在分散体的情况下维持所需要的粒度和通过使用表面活性剂来维持。在多数情况下，组合物中适合包含等渗剂，例如糖、多元醇(例如甘露糖醇、山梨糖醇)或氯化钠。可注射组合物的延长吸收可通过在组合物中包含延迟吸收剂(例如单硬脂酸盐和明胶)来实现。
无菌可注射溶液可通过将所需要的量的活性化合物与上述一种成分或成分组合一起掺入适当溶剂中，然后视需要进行灭菌微过滤来制备。
通常，分散体通过将活性化合物掺入含有碱性分散介质和来自以上所列举的成分的所需要的其他成分的无菌媒介物中来制备。在无菌粉末用于制备无菌可注射溶液的情况下，优选制备方法为真空干燥和冷冻干燥(冻干)，其从其预先无菌过滤溶液产生活性成分加任何额外所希望的成分的粉末。
本公开内容的药物组合物可以以适用于经眼施用的配制物来制备、包装或出售。这样的配制物在水溶液或油性液体承载体中可例如呈包含例如0.1％-1.0％(w/w)活性成分的溶液或悬浮液的滴眼剂形式。这样的滴剂可进一步包含本文所述的缓冲剂、盐或一种或多种其他额外成分。其他有用的可经眼施用的配制物包括以微晶形式或在脂质体制备物中包含活性成分的那些。
如本文所用，“额外成分”包括但不限于以下中的一种或多种：赋形剂；表面活性剂；分散剂；惰性稀释剂；粒化剂和崩解剂；粘合剂；润滑剂；甜味剂；调味剂；着色剂；防腐剂；生理学上可降解的组合物，例如明胶；水性媒介物和溶剂；油性媒介物和溶剂；悬浮剂；分散剂或湿润剂；乳化剂、缓和剂；缓冲液；盐；增稠剂；填充剂；乳化剂；抗氧化剂；抗生素；抗真菌剂；稳定剂；和药学上可接受的聚合或疏水性材料。本公开内容的药物组合物可包含的其他“额外成分”是本领域中已知的并且描述于例如Remington’s PharmaceuticalSciences,Genaro编,Mack出版公司,Easton,PA(1985)，其通过引用并入本文。
在一个实施方案中，在含有100mg抗αvβ8整合素抗体或其抗原结合片段的小瓶中于1mL缓冲水溶液中配制抗αvβ8整合素抗体或其抗原结合片段。
在一个实施方案中，抗αvβ8整合素抗体或其抗原结合片段以静脉内配制物施用，所述静脉内配制物呈含有约0.1mg/mL、约1mg/mL、约2mg/mL、约3mg/mL、约4mg/mL、5mg/mL、或在一些实施方案中约10mg/mL、或在一些实施方案中约15mg/mL、或在一些实施方案中约20mg/mL的抗体、或在一些实施方案中约25mg/mL、或在一些实施方案中约50mg/mL、或在一些实施方案中约100mg/mL和5％右旋糖的无菌水溶液。在一些实施方案中，静脉内配制物为含有0.1mg/mL至15mg/mL的抗αvβ8整合素抗体或其抗原结合片段的5％右旋糖的无菌水溶液。在一些实施方案中，抗αvβ8整合素抗体或其抗原结合片段配制在含有乙酸钠、聚山梨醇酯80和氯化钠的组合物中，pH在约5至6的范围内。在一些实施方案中，静脉内配制物是无菌水溶液，其含有5或10mg/mL的抗体，以及20mM醋酸钠、0.2mg/mL聚山梨醇酯80和140mM氯化钠，pH为5.5。此外，包含抗体或其抗原结合片段的溶液除多种其他化合物外还可包含组氨酸、甘露糖醇、蔗糖、海藻糖、甘氨酸、聚(乙烯)二醇、EDTA、甲硫氨酸及其任何组合和相关领域中已知的多种其他化合物。
在一个实施方案中，本公开内容的药物组合物包含以下组分：50mg/mL本公开内容的抗αvβ8整合素抗体或抗原结合片段、20mM组氨酸、8.5％蔗糖和0.02％聚山梨醇酯80、0.005％EDTA，pH为5.8；在另一实施方案中，本公开内容的药物组合物包含以下组分：100mg/mL本公开内容的抗αvβ8整合素抗体或抗原结合片段、10mM组氨酸、5％蔗糖和0.01％聚山梨醇酯80，pH为5.8。该组合物可以液体配制物或冻干粉末形式提供。当粉末以完整体积重构时，组合物保持相同配方。可替代地，粉末可以一半体积重构，在此情况下组合物包含100mg本公开内容的抗αvβ8整合素抗体或其抗原结合片段、20mM组氨酸、10％蔗糖和0.02％聚山梨醇酯80，pH为5.8。
在一个实施方案中，部分剂量通过静脉内推注施用并且其余通过抗体配制物输注。例如，0.01mg/kg静脉内注射抗αvβ8整合素抗体或其抗原结合片段可以推注给出，并且其余抗体剂量可通过静脉内注射施用。可例如经1小时和半小时至两小时至五小时的时间段施用预定剂量的抗αvβ8整合素抗体或其抗原结合片段。
关于其中药剂是例如小分子的治疗剂，其可以生理学上可接受的酯或盐形式存在于药物组合物中，例如如本领域众所周知与生理学上可接受的阳离子或阴离子组合。
本文所述的药物组合物的配制物可通过药理学领域中已知或此后研发的任何方法制备。通常，这些制备型方法包括使活性成分与承载体或一种或多种其他附属成分结合，并且随后必要时或需要时将产物塑形或包装成所希望的单剂量单位或多剂量单位的步骤。
在一个实施方案中，本公开内容的组合物为实质上不含内毒素和/或相关制热物质的无热原配制物。内毒素包括限制于微生物内并且当微生物分解或死亡时经释放的毒素。制热物质还包括来自细菌和其他微生物外膜的致热、热稳定物质(糖蛋白)。如果向人类施用，则这两种物质均可导致发热、低血压和休克。由于潜在有害作用，因此从静脉内施用药物溶液中移除即使少量内毒素是有利的。美国食品与药物管理局(“FDA”)已设定在一小时内每剂量每千克体重用于静脉内药物应用的上限为5个内毒素单位(EU)(The UnitedStates Pharmacopeial Convention,Pharmacopeial Forum 26(1):223(2000))。当以每千克体重几百毫克或几千毫克的量施用治疗性蛋白质时，即使移除痕量内毒素也是有利的。在一个实施方案中，组合物中的内毒素和热原水平小于10EU/mg，或小于5EU/mg，或小于1EU/mg，或小于0.1EU/mg，或小于0.01EU/mg，或小于0.001EU/mg。在另一实施方案中，组合物中的内毒素和热原水平小于约10EU/mg，或小于约5EU/mg或，小于约1EU/mg，或小于约0.1EU/mg，或小于约0.01EU/mg，或小于约0.001EU/mg。
在一个实施方案中，本公开内容包括施用组合物，其中所述施用为口服、肠胃外、肌肉内、鼻内、阴道、经直肠、经舌、舌下、经颊、颊内、静脉内、皮肤、皮下或经皮施用。
在另一实施方案中，本公开内容进一步包含施用组合物，其与其他疗法组合，例如手术、化学疗法、激素疗法、生物疗法、免疫疗法或辐射疗法。
VI.给药/施用
为制备包含本公开内容的抗αvβ8整合素抗体或其抗原结合片段的药物或无菌组合物，将所述抗体与药学上可接受的承载体或赋形剂混合。治疗剂和诊断剂的配制物可通过与生理学上可接受的呈例如冻干粉末、浆料、水溶液、洗剂或悬浮液形式的承载体、赋形剂或稳定剂混合来制备(参见，例如，Hardman,等人,(2001)Goodman和Gilman’s ThePharmacological Basis of Therapeutics,McGraw-Hill,New York,N.Y.；Gennaro(2000)Remington:The Science and Practice of Pharmacy,Lippincott,Williams和Wilkins,New York,N.Y.；Avis等人,(编)(1993)Pharmaceutical Dosage Forms:ParenteralMedications,Marcel Dekker,NY；Lieberman等人,(编)(1990)Pharmaceutical DosageForms:Tablets,Marcel Dekker,NY；Lieberman等人,(编)(1990)Pharmaceutical DosageForms:Disperse Systems,Marcel Dekker,NY；Weiner和Kotkoskie(2000)ExcipientToxicity and Safety,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.)。
选择用于治疗的施用方案取决于几个因素，包括实体的血清或组织周转率、症状水平、实体的免疫原性和生物基质中的目标细胞的可接近性。在某些实施方案中，施用方案使递送给患者的治疗量最大化，其与可接受的副作用水平一致。因此，所递送的生物制剂的量部分取决于特定实体和所治疗的病况的严重程度。选择合适剂量的抗体，细胞因子和小分子的指导是可获得的(参见，例如，Wawrzynczak,1996,Antibody Therapy,BiosScientific Pub.Ltd,Oxfordshire,UK；Kresina(编),1991,Monoclonal Antibodies,Cytokines and Arthritis,Marcel Dekker,New York,N.Y.；Bach(编),1993,MonoclonalAntibodies and Peptide Therapy in Autoimmune Diseases,Marcel Dekker,New York,N.Y.；Baert等人,2003,New Engl.J.Med.348:601-608；Milgrom等人,1999,NewEngl.J.Med.341:1966-1973；Slamon等人,2001,New Engl.J.Med.344:783-792；Beniaminovitz等人,2000,New Engl.J.Med.342:613-619；Ghosh等人,2003,NewEngl.J.Med.348:24-32；Lipsky等人,2000,New Engl.J.Med.343:1594-1602)。
合适的剂量由临床医生例如使用本领域中已知或怀疑影响治疗或预测影响治疗的参数或因素来确定。通常，剂量以稍微小于最佳剂量的量开始，并且随后以较小增量递增，直至相对于任何负面的副作用而言实现所希望的或最佳效果。重要诊断测量包括例如炎症的症状或产生的炎性细胞因子的水平。
可改变本公开内容的药物组合物中的活性成分的实际剂量水平，以便获得在对患者无毒性的情况下有效实现特定患者、组合物和施用模式的所希望的治疗反应的量的活性成分。所选择的剂量水平将取决于多种药代动力学因素，包括本公开内容所用特定组合物或其酯、盐或酰胺的活性；施用途径；施用时间；所用特定化合物的排泄率；治疗持续时间；与所用特定组合物组合使用的其他药物、化合物和/或物质；所治疗患者的年龄、性别、体重、病况、一般健康状况和既往病史；和药物领域众所周知的类似因素。
包含本公开内容的抗αvβ8整合素抗体或其抗原结合片段的组合物可通过连续输注或以例如一天、一周的时间间隔或每周1-7次给药提供。可经静脉内、皮下、表面、经口、经鼻、经直肠、肌肉内、颅内或通过吸入提供剂量。特定剂量方案是涉及避免显著不良副作用的最大剂量或剂量频率的方案。总周剂量可为至少0.05μg/kg体重、至少0.2μg/kg、至少0.5μg/kg、至少1μg/kg、至少10μg/kg、至少100μg/kg、至少0.2mg/kg、至少1.0mg/kg、至少2.0mg/kg、至少10mg/kg、至少15mg/kg、至少20mg/kg、至少25mg/kg或至少50mg/kg(参见，例如Yang，等人，2003,New Engl.J.Med.349:427-434；Herold，等人，2002,NewEngl.J.Med.346:1692-1698；Liu，等人，1999,J.Neurol.Neurosurg.Psych.67:451-456；Portielji，等人，2003,Cancer.Immunol.Immunother.52:133-144)。剂量可为至少15μg、至少20μg、至少25μg、至少30μg、至少35μg、至少40μg、至少45μg、至少50μg、至少55μg、至少60μg、至少65μg、至少70μg、至少75μg、至少80μg、至少85μg、至少90μg、至少95μg或至少100μg。向受试者施用的剂量可共计至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12次或更多次。
对于本公开内容的抗αvβ8整合素抗体或其抗原结合片段，向患者施用的剂量可为患者的体重的0.0001mg/kg至100mg/kg。剂量可在患者的体重的0.0001mg/kg与20mg/kg之间、0.0001mg/kg与10mg/kg之间、0.0001mg/kg与5mg/kg之间、0.0001与2mg/kg之间、0.0001与1mg/kg之间、0.0001mg/kg与0.75mg/kg之间、0.0001mg/kg与0.5mg/kg之间、0.0001mg/kg至0.25mg/kg之间、0.0001至0.15mg/kg之间、0.0001至0.10mg/kg之间、0.001至0.5mg/kg之间、0.01至0.25mg/kg或0.01至0.10mg/kg。在一些实施方案中，向有此需要的患者施用的抗αvβ8整合素抗体或其抗原结合片段的剂量为患者的体重的约0.1mg/kg、约0.3mg/kg、约2mg/kg或约3.0mg/kg。在一些实施方案中，向有此需要的患者施用的抗αvβ8整合素抗体或其抗原结合片段的剂量为患者的体重的约0.4mg/kg、约4mg/kg、约40mg/kg或约100mg/kg。
在一些实施方案中，每14天向有此需要的患者施用的抗αvβ8整合素抗体或其抗原结合片段的剂量为患者的体重的约1mg/kg至约12mg/kg。在一些实施方案中，每14天向有此需要的患者施用的抗αvβ8整合素抗体或其抗原结合片段的剂量为患者的体重的约2mg/kg。在一些实施方案中，每14天向有此需要的患者施用的抗αvβ8整合素抗体或其抗原结合片段的剂量为患者的体重的约7mg/kg。
在一些实施方案中，每28天向有此需要的患者施用的抗αvβ8整合素抗体或其抗原结合片段的剂量为患者的体重的约1mg/kg至约20mg/kg。在一些实施方案中，每28天向有此需要的患者施用的抗αvβ8整合素抗体或其抗原结合片段的剂量为患者的体重的约4mg/kg。在一些实施方案中，每28天向有此需要的患者施用的抗αvβ8整合素抗体或其抗原结合片段的剂量为患者的体重的约12mg/kg。
抗αvβ8整合素抗体或其抗原结合片段的剂量可使用以千克(kg)为单位的患者体重乘以以mg/kg为单位的待施用剂量来计算。本公开内容的抗体剂量可为患者体重的150μg/kg或更低、125μg/kg或更低、100μg/kg或更低、95μg/kg或更低、90μg/kg或更低、85μ/kg或更低、80μ/kg或更低、75μ/kg或更低、70μ/kg或更低、65μ/kg或更低、60μ/kg或更低、55μ/kg或更低、50μ/kg或更低、45μ/kg或更低、40μ/kg或更低、35μ/kg或更低、30μ/kg或更低、25μ/kg或更低、20μ/kg或更低、15μ/kg或更低、10μ/kg或更低、5μ/kg或更低、2.5μ/kg或更低、2μ/kg或更低、1.5μ/kg或更低、1μ/kg或更低、0.5μ/kg或更低、或0.1μ/kg或更低。
本公开内容的抗αvβ8整合素抗体或其抗原结合片段的单位剂量可以是0.1mg至200mg、0.1mg至175mg、0.1mg至150mg、0.1mg至125mg、0.1mg至100mg、0.1mg至75mg、0.1mg至50mg、0.1mg至30mg、0.1mg至20mg、0.1mg至15mg、0.1mg至12mg、0.1mg至10mg、0.1mg至8mg、0.1mg至7mg、0.1mg至5mg、0.1至2.5mg、0.25mg至20mg、0.25至15mg、0.25至12mg、0.25至10mg、0.25至8mg、0.25mg至7mg、0.25mg至5mg、0.5mg至2.5mg、1mg至20mg、1mg至15mg、1mg至12mg、1mg至10mg、1mg至8mg、1mg至7mg、1mg至5mg或1mg至2.5mg。在一个实施方案中，本公开内容的抗αvβ8整合素抗体或其抗原结合片段以约100mg、约300mg、约500mg、约600mg、约800mg、约1200mg、约1400mg或约1600mg的单位剂量施用。
本公开内容的抗αvβ8整合素抗体或其抗原结合片段的剂量可在受试者中实现至少0.1μg/mL、至少0.5μg/mL、至少1μg/mL、至少2μg/mL、至少5μg/mL、至少6μg/mL、至少10μg/mL、至少15μg/mL、至少20μg/mL、至少25μg/mL、至少50μg/mL、至少100μg/mL、至少125μg/mL、至少150μg/mL、至少175μg/mL、至少200μg/mL、至少225μg/mL、至少250μg/mL、至少275μg/mL、至少300μg/mL、至少325μg/mL、至少350μg/mL、至少375μg/mL或至少400μg/mL的血清滴度。可替代地，本公开内容的抗体的剂量可在受试者中实现至少0.1μg/mL、至少0.5μg/mL、至少1μg/mL、至少2μg/mL、至少5μg/mL、至少6μg/mL、至少10μg/mL、至少15μg/mL、至少20μg/mL、至少25μg/mL、至少50μg/mL、至少100μg/mL、至少125μg/mL、至少150μg/mL、至少175μg/mL、至少200μg/mL、至少225μg/mL、至少250μg/mL、至少275μg/mL、至少300μg/mL、至少325μg/mL、至少350μg/mL、至少375μg/mL或至少400μg/mL的血清滴度。
可重复本公开内容的抗αvβ8整合素抗体或其抗原结合片段的剂量，并且可以将施用分开至少1天、2天、3天、5天、10天、15天、30天、45天、2个月、75天、3个月或至少6个月。
用于特定患者的有效量可以根据例如所治疗的病况、患者的整体健康状况、施用的方法途径和剂量和副作用的严重程度的因素而改变(参见，例如Maynard，等人，1996,AHandbook of SOPs for Good Clinical Practice,Interpharm Press,Boca Raton,FIa.；Dent,2001,Good Laboratory and Good Clinical Practice,Urch Publ,London,UK)。
施用途径可为经由例如表面或皮肤施加、经静脉内、腹膜内、脑内、肌肉内、眼内、动脉内、脑脊髓内、病灶内注射或输注或通过持续释放系统或植入物(参见，例如Sidman等人，1983,Biopolymers22:547-556；Langer，等人，1981,J.Biomed.Mater.Res.15:167-277；Langer,1982,Chem.Tech.12:98-105；Epstein，等人，1985,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:3688-3692；Hwang，等人，1980,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4030-4034；美国专利号6,350466和6,316,024)。在一个实施方案中，静脉内施用本公开内容的抗αvβ8整合素抗体或其抗原结合片段。在一个实施方案中，皮下施用本公开内容的抗αvβ8整合素抗体或其抗原结合片段。
必要时，组合物还可包括增溶剂和例如利多卡因(lidocaine)的局部麻醉剂以减轻注射位点的疼痛。另外，还可采用经肺施用，例如使用吸入器或雾化器，和具有气雾剂的配制物。参见例如美国专利号6,019,968、5,985,320、5,985,309、5,934,272、5,874,064、5,855,913、5,290,540和4,880,078；和PCT公开号WO 92/19244、WO 97/32572、WO 97/44013、WO 98/31346和WO 99/66903，其各自通过引用整体并入本文。在一个实施方案中，使用AlkermesAIRTM肺部药物递送技术(Alkermes,Inc.,Cambridge,Mass.)施用本公开内容的抗αvβ8抗体或其抗原结合片段或组合物。
本公开内容的组合物也可以使用本领域已知的多种方法中的一种或多种通过一种或多种施用途径来施用。如本领域技术人员所理解的，施用途径和/或模式将根据所希望的结果而变化。用于本公开内容的抗体的所选施用途径包括静脉内、肌肉内、皮内、腹膜内、皮下、脊髓或其他肠胃外施用途径，例如通过注射或输注。肠胃外施用可代表除经肠和表面施用以外的通常通过注射的施用模式，并且包括但不限于静脉内、肌肉内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊椎内、硬膜外和胸骨内注射和输注。可替代地，本公开内容的组合物可经由肠胃外途径施用，例如表面、表皮或经黏膜施用途径，例如鼻内、经口、经阴道、经直肠、舌下或表面。
如果本公开内容的抗αvβ8整合素抗体或其抗原结合片段在控制释放或持续释放系统中施用，则可以使用泵来实现控制或持续释放(参见Langer,前述；Sefton,1987,CRCCrit.Ref.Biomed.Eng.14:20；Buchwald等人,1980,Surgery 88:501；Saudek等人,1989,N.Engl.J.Med.321:514)。
聚合材料可用于实现本公开内容的疗法的控制或持续释放(参见例如，MedicalApplications of Controlled Release,Langer and Wise(编),CRC出版社,Boca Raton,FL.(1974)；Controlled Drug Bioavailability,Drug Product Design andPerformance,Smolen和Ball(编),Wiley,New York(1984)；Ranger and Peppas,1983,J.,Macromol.ScL Rev.Macromol.Chem.23:61；还参见Levy等人,1985,Science 11 225:190；During等人,19Z9,Ann.Neurol.25:351；Howard等人,1989,J.Neurosurg.71:105)；美国专利号5,679,377；美国专利号5,916,597；美国专利号5,912,015；美国专利号5,989,463；美国专利号5,128,326；PCT公开号WO 99/15154；和PCT公开号WO 99/20253。用于持续释放配制物的聚合物的实例包括但不限于聚(甲基丙烯酸2-羟基乙酯)、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸)、聚(乙烯-共-乙酸乙烯酯)、聚(甲基丙烯酸)、聚乙交酯(PLG)、聚酸酐、聚(N-乙烯吡咯啶酮)、聚(乙烯醇)、聚丙烯酰胺、聚(乙二醇)、聚乳酸(PLA)、聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)和聚原酸酯。在一个实施方案中，用于持续释放配制物的聚合物呈惰性，不含可浸出杂质，储存稳定，无菌并且可生物降解。控制或持续释放系统可置放在接近预防或治疗目标附近，因此仅需要全身剂量的一部分(参见，例如，Goodson,在Medical Applications ofControlled Release中,前述,第2卷,第115-138页(1984))。
控制释放系统在Langer,1990,Science 249:1527-1533的综述中讨论。本领域技术人员已知的任何技术可用于产生包含本公开内容的一种或多种抗体或其缀合物的持续释放配制物。参见，例如，美国专利号4,526,938；国际专利公开号WO 91/05548、WO 96/20698；Ning等人,1996,“Intratumoral Radioimmunotheraphy of a Human Colon CancerXenograft Using a Sustained-Release Gel,”Radiotherapy and Oncology 59:179-189；Song等人,1995,“Antibody Mediated Lung Targeting of Long-CirculatingEmulsions,“PDA Journal of Pharmaceutical Science and Technology 50:372-397；Cleek等人,1997,“Biodegradable Polymeric Carriers for a bFGF Antibody forCardiovascular Application,”Pro.Ml.Symp.Control.Rel.Bioact.Mater.24:853-854；和Lam等人,1997,“Microencapsulation of Recombinant Humanized MonoclonalAntibody for Local Delivery,”Proc.Ml.Symp.Control Rel.Bioact.Mater.24:759-160，其各自通过引用整体并入本文。
如果本公开内容的抗αvβ8整合素抗体或其抗原结合片段经表面施用，则其可配制成软膏、乳膏、经皮贴片、洗剂、凝胶、洗发剂、喷雾、气溶胶、溶液、乳液形式或本领域技术人员众所周知的其他形式。参见，例如Remington’s Pharmaceutical Sciences andIntroduction to Pharmaceutical Dosage Forms,第19版,Mack Pub.Co.,Easton,Pa.(1995)。对于非可喷雾表面剂型，通常使用包含与表面应用兼容的承载体或一种或多种赋形剂并且在一些情况下动态黏度大于水的粘性至半固体或固体形式。合适的配制物包括但不限于溶液、悬浮液、乳液、乳膏、软膏、粉末、擦剂、油膏等，必要时灭菌或与辅助剂(例如，防腐剂、稳定剂、湿润剂、缓冲液或盐)混合以影响各种特性，例如渗透压。其他合适的表面剂型包括可喷雾气溶胶制剂，其中在一些情况下，与固体或液体惰性承载体组合的活性成分封装于具有加压挥发物(例如气态推进剂，例如氟利昂(freon))的混合物或挤压瓶中。如果需要，还可将保湿剂或湿润剂添加至药物组合物和剂型中。这种额外成分的实例在本领域中是众所周知的。
如果包含抗αvβ8整合素抗体或其抗原结合片段的组合物经鼻内施用，则可配制成气溶胶形式、喷雾、薄雾或成滴剂形式。特别地，根据本公开内容使用的预防剂或治疗剂可以使用合适的推进剂(例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他合适的气体)以来自加压包装或雾化器的气溶胶喷雾呈现的形式方便地递送。在加压气溶胶的情况下，剂量单位可通过提供递送计量的量的阀来确定。可配制含有化合物与例如乳糖或淀粉的适合粉末基质的粉末混合物的胶囊和药筒(由例如明胶构成)用于吸入器或吹入器中。
用于共同施用或用另一种治疗剂，例如免疫检查点分子、细胞因子、类固醇、化学治疗剂、抗生素或辐射疗法治疗的方法是本领域众所周知的(参见，例如Hardman等人,(编)(2001)Goodman和Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics,第10版,McGraw-Hill,New York,N.Y.；Poole和Peterson(编)(2001)Pharmacotherapeutics forAdvanced Practice:A Practical Approach,Lippincott,Williams and Wilkins,Phila.,Pa.；Chabner和Longo(编)(2001)Cancer Chemotherapy and Biotherapy,Lippincott,Williams and Wilkins,Phila.,Pa.)。
有效量的治疗剂可将症状减少至少10％；至少20％；至少约30％；至少40％或至少50％。
可以与本公开内容的抗αvβ8整合素抗体或抗原结合片段组合施用的额外疗法(例如，预防剂或治疗剂)可与本公开内容的抗体相隔小于5分钟，相隔小于30分钟，相隔1小时，相隔约1小时，相隔约1至约2小时，相隔约2小时至约3小时，相隔约3小时至约4小时，相隔约4小时至约5小时，相隔约5小时至约6小时，相隔约6小时至约7小时，相隔约7小时至约8小时，相隔约8小时至约9小时，相隔约9小时至约10小时，相隔约10小时至约11小时，相隔约11小时至约12小时，相隔约12小时至18小时，相隔18小时至24小时，相隔24小时至36小时，相隔36小时至48小时，相隔48小时至52小时，相隔52小时至60小时，相隔60小时至72小时，相隔72小时至84小时，相隔84小时至96小时，或96小时至120小时施用。两种或更多种疗法可在同一患者问诊内施用。
施用抗体分子的方法在本领域中是已知的并且描述于下文中。所用分子的合适剂量将取决于受试者年龄和体重和所用特定药物。可由本领域技术人员确定抗αvβ8整合素抗体或其抗原结合片段、抗体分子的剂量和治疗方案。在某些实施方案中，通过以约1至30mg/kg，例如约5至25mg/kg、约10至20mg/kg、约10至约14mg/kg、约5至9mg/kg、约7mg/kg或约12mg/kg的剂量(例如，皮下或静脉内)注射施用抗αvβ8整合素抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，以约1mg/kg、约2mg/kg、约3mg/kg、约4mg/kg、约5mg/kg、约6mg/kg、约7mg/kg、约8mg/kg、约9mg/kg或10mg/kg、约11mg/kg、约12mg/kg、约13mg/kg、约14mg/kg、约15mg/kg、约16mg/kg、约17mg/kg、约18mg/kg、约19mg/kg、约20mg/kg、约30mg/kg或约40mg/kg的剂量施用抗αvβ8整合素抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，以约1-5mg/kg、约5-10mg/kg或约10-15mg/kg的剂量施用抗αvβ8整合素抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，以约0.5-2、2-4、2-5、2-6、2-7、2-8、2-9、2-10、2-15、5-15或5-20mg/kg的剂量施用抗αvβ8整合素抗体或其抗原结合片段。
给药时程可从例如一周一次至每2、3、4、5或6周一次变化。在一个实施方案中，每隔一周(例如，每两周或两周一次)以约10至20mg/kg(例如，约7mg/kg或约12mg/kg)的剂量施用抗αvβ8整合素抗体或其抗原结合片段。在一个实施方案中，每月一次(例如，每四周)以约10至20mg/kg(例如，约7mg/kg或约12mg/kg)的剂量施用抗αvβ8整合素抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，静脉内施用抗αvβ8整合素抗体或其抗原结合片段或包含其的药物组合物。在一些实施方案中，皮下施用抗αvβ8整合素抗体或其抗原结合片段或包含其的药物组合物。
在一些实施方案中，基于两周一次静脉内或皮下施用本公开内容的抗αvβ8整合素抗体或其抗原结合片段。在一个实施方案中，基于两周一次静脉内或皮下以约100mg、约300mg、约800mg、约1200mg或约1600mg的单位剂量施用本公开内容的抗αvβ8整合素抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，向受试者基于两周一次以约100mg、约300mg、约800mg、约1200mg或约1600mg的单位剂量静脉内施用本公开内容的抗αvβ8整合素抗体或其抗原结合片段并且每四周施用抗PD1抑制剂。在一些实施方案中，抗PD1抑制剂是以300mg的单位剂量皮下施用的抗体。在一些实施方案中，抗PD1抑制剂是PCT公开号WO2016/092419中所述的抗PD1抗体(例如mAb7，也称为RN888、PF-06801591或萨善利单抗)。
在一些实施方案中，抗αvβ8整合素抗体或其抗原结合片段或包含其的药物组合物约一周两次、一周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次、每五周一次、每六周一次、每七周一次、每八周一次、每九周一次、每十周一次、每月两次、每月一次、每两月一次、每三月一次、每四月一次、每五月一次、每六月一次、每七月一次、每八月一次、每九月一次、每十月一次、每十一月一次或每十二月一次进行施用。在一些实施方案中，每两周，例如多达12次(例如，多达10次、8次、6次、5次、4次或3次)施用抗αvβ8整合素抗体或其抗原结合片段或包含其的药物组合物。在一些实施方案中，每四周，例如多达12次(例如，多达10次、8次、6次、5次、4次或3次)施用抗αvβ8整合素抗体或其抗原结合片段或包含其的药物组合物。
在一些实施方案中，抗αvβ8整合素抗体或其抗原结合片段的每个施用包含5-10mg/kg(例如，5、6、7、8、9或10mg/kg)的所述抗体或其抗原结合片段，例如每个施用包含约7mg/kg。
在一些实施方案中，每四周，例如多达6次(例如，多达6次、5次、4次、3次、2次或1次)施用抗体或其抗原结合片段。
在其他实施方案中，抗αvβ8整合素抗体或其抗原结合片段的每个施用包含10-15mg/kg(例如，10、11、12、13、14或15mg/kg)的抗体或其抗原结合片段，例如每个施用包含约12mg/kg。
本公开内容的抗αvβ8抗体或其抗原结合片段和其他疗法可循环施用。循环疗法涉及施用第一疗法(例如，第一预防剂或治疗剂)一段时间，随后施用第二疗法(例如，第二预防剂或治疗剂)一段时间，任选地随后施用第三疗法(例如，预防剂或治疗剂)一段时间等，并且重复该顺序施用(即，循环)以便减小对疗法中的一种产生抗性，从而避免或减小疗法中的一种的副作用，和/或改善疗法的功效。
在某些实施方案中，本公开内容的抗αvβ8抗体或其抗原结合片段可经配制以确保在体内适当分布。例如，血脑屏障(BBB)排除多种高度亲水性化合物。为确保本公开内容的治疗化合物穿过BBB(如果需要)，其可例如配制在脂质体中。关于制备脂质体的方法，参见，例如美国专利号4,522,811；5,374,548；和5,399,331。脂质体可包含选择性运输至特定细胞或器官的一个或多个部分，从而增强靶向药物递送(参见，例如，V.V.Ranade,1989,J.Clin.Pharmacol.29:685)。示例性靶向部分包括叶酸或生物素(参见，例如，美国专利5,416,016)；甘露糖苷(Umezawa等人,Biochem.Biophys.Res.Commun.153:1038)；抗体(P.G.Bloeman等人,1995,FEBS Lett.357:140；M.Owais等人,1995,Antimicrob.AgentsChemother.39:180)；表面活性蛋白A受体(Briscoe等人.(1995)Am.J.Physiol.1233:134)；pl20(Schreier等人(1994)J.Biol.Chem.269:9090)；还参见K.Keinanen；M.L.Laukkanen,1994,FEBS Lett.346:123；Killion；Fidler,1994；Immunomethods 4:273。
本公开内容提供了单独或与其他疗法组合向有此需要的受试者施用药物组合物的方案，所述药物组合物包含本公开内容的抗αvβ8抗体或其抗原结合片段。本公开内容的组合疗法的疗法(例如，预防剂或治疗剂)可同时或顺序施用给受试者。本公开内容的组合疗法的疗法(例如，预防剂或治疗剂)还可循环施用。
本公开内容的组合疗法的疗法(例如，预防剂或治疗剂)可同时向受试者施用。术语“同时”不限于在恰好同一时间施用疗法(例如，预防剂或治疗剂)，而是指包含本公开内容的抗αvβ8整合素抗体或其抗原结合片段的药物组合物以一个顺序并且在一个时间间隔内向受试者施用，以使得本公开内容的抗体或其结合物可与一种或多种其他疗法一起起作用以提供比起其以其他方式施用时增加的益处。例如，各疗法可同时或按任何次序在不同时间点顺序向受试者施用；然而，如果未同时施用，则其应在时间充分接近时经施用以提供所希望的治疗性或预防性效果。各疗法可以任何适当形式并且通过任何合适的途径分别向受试者施用。在各种实施方案中，可相隔小于15分钟、小于30分钟、小于1小时，相隔约1小时、相隔约1小时至约2小时、相隔约2小时至约3小时、相隔约3小时至约4小时、相隔约4小时至约5小时、相隔约5小时至约6小时、相隔约6小时至约7小时、相隔约7小时至约8小时、相隔约8小时至约9小时、相隔约9小时至约10小时、相隔约10小时至约11小时、相隔约11小时至约12小时、相隔24小时、相隔48小时、相隔72小时或相隔1周向受试者施用疗法(例如，预防剂或治疗剂)。在其他实施方案中，两种或更多种疗法(例如，预防剂或治疗剂)可在同一患者问诊内施用。
组合疗法中的预防剂或治疗剂可在相同药物组合物中向受试者施用。可替代地，组合疗法的预防剂或治疗剂可在单独的药物组合物中同时施用给受试者。预防剂或治疗剂可通过相同或不同施用途径向受试者施用。
VII.试剂盒
本公开内容还提供了包含本文所述的任何或所有抗体的试剂盒。本公开内容的试剂盒包括包含本文所述的抗αvβ8整合素抗体或其抗原结合片段的一个或多个容器和根据本文所述的本公开内容方法中的任一项的使用说明书。通常，这些说明书包含用于上述治疗性治疗的抗体施用的说明。在一些实施方案中，提供试剂盒用于产生单剂量施用单位。在某些实施方案中，试剂盒可包括具有干燥蛋白质的第一容器和具有水性配制物的第二容器。在某些实施方案中，包括施料器(例如，单室和多室预填充注射器(例如，液体注射器和冷冻干燥物注射器)的试剂盒被包括在内。
与抗αvβ8整合素抗体或其抗原结合片段的用途有关的说明书一般包括关于用于预期治疗的剂量、给药时程和施用途径的信息。容器可呈单位剂型、散装封装(例如多剂量封装)或亚单位剂量。本公开内容的试剂盒中供应的说明书通常是在标签或包装说明书(例如试剂盒中包括的纸张)上的书面说明书，但机器可读说明书(例如磁化或光学储存盘上载有的说明书)也是可接受的。
本公开内容的试剂盒处于合适的包装中。合适的包装包括但不限于小瓶、瓶子、罐、软包装(例如密封的Mylar或塑料袋)等。还涵盖用于与特定装置，例如吸入器、经鼻施用装置(例如，雾化器)或输注装置(例如小型泵)组合的包装。试剂盒可具有无菌进入口(例如，容器可为静脉内溶液袋或具有可由皮下注射针刺穿的塞子的小瓶)。容器还可具有无菌进入口(例如，容器可为静脉内溶液袋或具有可通过皮下注射针刺穿的塞子的小瓶)。组合物中的至少一种活性剂为本公开内容的抗αvβ8整合素抗体。该容器可进一步包含如本文所述的另外的治疗剂。
试剂盒可进一步包含至少一种抗PD1抗体，例如但不限于纳武单抗、派姆单抗、斯帕塔利单抗、匹地利珠单抗、替雷利珠单抗、cemiplimab、萨善利单抗(mAb7、RN888、PD-06801591)、AMP-224、AMP-514。
试剂盒可任选地提供例如缓冲液的额外组分和说明性信息。通常，试剂盒包含容器和容器上或与容器相连的标签或一份或多份包装说明书。
本公开内容还提供了诊断试剂盒，其包含本文所述的抗体或其抗原结合片段的任一项或所有。诊断试剂盒适用于例如检测样品中αvβ8整合素的存在。在一些实施方案中，诊断试剂盒可用于鉴定患有潜在的疾病、病症或病况的个体，所述疾病、病症或病况使个体处于发展αvβ8整合素介导的疾病、病症或病况或αvβ8整合素缺乏疾病、病症或病况风险下。在一些实施方案中，诊断试剂盒可用于检测怀疑患有αvβ8整合素介导的疾病或αvβ8整合素缺乏疾病、病症或病况的个体中αvβ8整合素的存在和/或水平。
本公开内容的诊断试剂盒包括包含本文所述的抗αvβ8整合素抗体或其抗原结合片段的一个或多个容器和根据本文所述的本公开内容方法中的任一项的使用说明书。通常，这些说明书包含抗αvβ8整合素抗体或其抗原结合片段的使用描述，以检测处于αvβ8整合素介导的疾病或αvβ8整合素缺乏疾病、病症或病况的风险下或怀疑患有αvβ8整合素介导的疾病或αvβ8整合素缺乏疾病、病症或病况的个体中的αvβ8整合素的存在。在一些实施方案中，示例性诊断试剂盒可经改造以包括试剂(例如抗αvβ8整合素抗体或其抗原结合片段)、阴性对照样品、阳性对照样品和使用试剂盒的说明。
VIII.等效物
前述描述和以下实例详述本公开内容的某些具体实施方案，并且描述本发明人预期的最佳模式。然而，应该理解的是，无论以文字呈现的前述内容如何详细，本公开内容可以许多方式实践，并且本公开内容应根据所附权利要求和其任何等效物解释。
尽管已参考不同申请、方法、试剂盒和组合物描述了所公开教导，但将理解的是在不背离本文中的教导和以下所要求保护的本发明的情况下可进行不同变化和修改。提供前述实施例以更好地说明所公开的教导，并且不旨在限制本文提供的教导的范围。尽管已经根据这些示例性实施方案描述了本发明的教导，但本领域技术人员将容易理解这些示例性实施方案的许多变化和修改是可能的，而无需过度实验。所有这些变化和修改都在当前教导的范围内。
本文中所引用的全部参考文献(包括专利、专利申请、论文、教科书等)以及其中引用的参考文献，如果它们尚未全部引用，在此出于所有目的通过引用整体并入本文。在所并入文献和类似材料中的一种或多种(包括但不限于定义的术语、术语用法、所描述的技术等)与本申请不同或矛盾的情况下，以本申请为准。
IX.通用技术
应理解，本发明不限于特定合成制备方法，其当然可以变化。除非本文另外定义，否则结合本发明使用的科学与技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。此外，除非上下文另外需要，否则单数术语应包括复数并且复数术语应包括单数。通常，本文所述的与细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学和蛋白质与核酸化学和杂交结合使用的命名法和其技术是本领域众所周知且常用的那些。
除非另外指出，否则本发明的实践将采用分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术，其完全处于本领域技术的范围内。这样的技术在例如以下的文献中充分解释：Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第二版(Sambrook等人,1989)Cold Spring Harbor Press；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait编,1984)；Methods in Molecular Biology,Humana Press；Cell Biology:ALaboratory Notebook(J.E.Cellis编,1998)Academic Press；Animal Cell Culture(R.I.Freshney编,1987)；Introduction to Cell and Tissue Culture(J.P.Mather和P.E.Roberts,1998)Plenum Press；Cell and Tissue Culture:Laboratory Procedures(A.Doyle,J.B.Griffiths和D.G.Newell编,1993-1998)J.Wiley and Sons；Methods inEnzymology(Academic Press,Inc.)；Handbook of Experimental Immunology(D.M.Weir和C.C.Blackwell编)；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(J.M.Miller和M.P.Calos编,1987)；Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel等人,编,1987)；PCR:The Polymerase Chain Reaction,(Mullis等人,编,1994)；CurrentProtocols in Immunology(J.E.Coligan等人,编,1991)；Sambrook和Russell,MolecularCloning:A Laboratory Manual,第3版,Cold Spring Harbor Laboratory Press,ColdSpring Harbor,NY(2001)；Ausubel等人,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,NY(2002)；Harlow和Lane Using Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY(1998)；Coligan等人,Short Protocols in Protein Science,John Wiley&Sons,NY(2003)；Short Protocolsin Molecular Biology(Wiley and Sons,1999)；Immunobiology(C.A.Janeway和P.Travers,1997)；Antibodies(P.Finch,1997)；Antibodies:a practical approach(D.Catty.编,IRL Press,1988-1989)；Monoclonal antibodies:a practical approach(P.Shepherd和C.Dean,编,Oxford University Press,2000)；Using antibodies:alaboratory manual(E.Harlow和D.Lane(Cold Spring Harbor Laboratory Press,1999)；The Antibodies(M.Zanetti和J.D.Capra,编,Harwood Academic Publishers,1995)。
酶促反应和纯化技术是根据制造商的说明书如本领域中通常所实现或如本文中所述来进行的。本文所述的与分析化学、生物化学、免疫学、分子生物学、合成有机化学、和医学和药物化学结合使用的命名法、和其实验室程序和技术是本领域众所周知且常用的那些。标准技术用于化学合成、化学分析、药物制备、配制和递送以及患者治疗。
X.生物保藏
本发明的代表性材料于2018年2月13日保藏于美国典型培养物保藏中心，10801University Boulevard,Manassas,Va.20110-2209。具有ATCC保藏编号PTA-124917的载体ADWA11 VH05-02-VH包含编码抗体ADWA11 2.4(也称为VH05-2_VK01(2.4)和ADWA11 5-22.4)的重链可变区的DNA插入序列。具有ATCC保藏编号PTA-124918的载体ADWA11 VK2.4-VL包含编码抗体ADWA11 2.4(也称为VH05-2_VK01(2.4)和ADWA11 5-2 2.4)的轻链可变区的DNA插入序列。
按照国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约(Budapest Treaty onthe International Recognition of the Deposit of Microorganisms for thePurpose of Patent Procedure)(布达佩斯条约)和其下条例的规定进行保藏。这保证维持自保藏日起30年的保藏物的有生存力的培养。保藏将由ATCC在布达佩斯条约的条款下提供，并且受制于辉瑞公司与ATCC之间的协议，其保证在相关美国专利发布后或在任何美国或外国专利申请对公众公布后(不分先后)，公众可永久并且无限制地利用保藏培养物的子代，并且保证由美国专利和商标局委员根据35 U.S.C.第122节和依据其的委员规则(包括特定参考886 OG 638的37 C.F.R.第1.14节)经授权所确定者可利用子代。
本申请的所有人已同意，如果在适合条件下培养时，处于保藏的材料的培养物死亡或丢失或被破坏，则将通知以实时用另一相同材料取代所述材料。保藏材料的可用性不解释为许可在违反由任何政府部门根据其专利法律授予权利的情况下实践本发明。
实施例
参考以下实验性实施例来进一步详细描述本公开内容。除非另外指定，否则提供这些实施例仅出于说明的目的，并且不旨在限制。因此，本公开内容决不应解释为限于以下实施例，而应解释为涵盖由于本文提供的教导而变得明显的任何和所有变化形式。
实施例1：抗αvβ8整合素小鼠杂交瘤抗体的产生
根据如美国专利号9,969,804中一般描述的方法产生针对人类αvβ8整合素的小鼠杂交瘤抗体，所述专利通过引用整体并入本文。
简而言之，使杂交至远交CD1背景以允许出生后存活的整合素β8敲除小鼠以每两周50μg/小鼠的剂量用重组人类αvβ8整合素(R&D Systems，4135-AV-050)免疫，直至产生可接受的抗αvβ8抗体滴度。然后通过固相免疫测定筛选来自免疫小鼠的血清以鉴定用于杂交瘤产生的小鼠。
使用经转染以表达整合素αvβ8或αvβ3或αvβ6作为阴性对照的SW480细胞通过流式细胞术进一步表征来自所产生的杂交瘤的抗体。Sw480细胞除了αvβ5以外通常不表达任何αv整合素。鉴定小鼠杂交瘤抗体ADWA-11(也称为ADWA11)，并且为确认该抗体的特异性，使用经标记的ADWA-11或针对αvβ5(Alula)或αvβ3(Axum-2)或αvβ6(10D5)的抗体对各细胞系进行流式细胞术(Su等人,Am.J.Respir.Cell Mol.Biol.36:377-386,2007；Su等人,Am.J.Respir.Cell Mol.Biol.185:58-66,2012；Huang等人,J.Cell Sci.111(Pt 15):2189-2195)。
使用在用TGFβ1潜伏相关肽1μg/mL包被的培养皿上的表达整合素αvβ8的U251细胞进行细胞黏附测定(Kueng等人,Anal.Biochem.182:16-19,1989)。通过TMLC萤光素酶测定确定TGFβ活性的阻断，其利用表达驱动萤火虫萤光素酶表达的PAI-1启动子的TGFβ敏感部分的水貂肺上皮细胞(Abe等人,Anal.Biochem.216:276-284,1994)。基于通常如本文所述进行的杂交瘤筛选，选择小鼠杂交瘤抗体ADWA-11用于进一步评估。
实施例2：抗αvβ8整合素小鼠杂交瘤抗体的人源化
通过将鼠类CDR序列移植至如表1中列出的各种人类种系框架中来使如美国专利号9,969,804中所公开的和如例如本说明书的SEQ ID NO:20-33和71-76中所阐述的小鼠杂交瘤抗体ADWA-11人源化，所述框架包括轻链种系框架IGKV2-28、IGKV2-30、IGKV4-1、IGKV1-39(在本文中也称为DPK9)和IGKV3-11以及重链种系框架IGHV3-7(在本文中也称为DP54)、IGHV1-46、IGHV3-23、IGHV3-30、IGHV1-69和IGHV3-48(参见例如IMGT数据库)。
将包括一组如SEQ ID NO:20-33和71-76中所阐述的六个鼠类CDR序列的在本文中称为“人源化ADWA-11”的人源化抗体移植到IGKV1-39(例如，DPK9)轻链种系框架和IGHV3-7(例如，DP54)重链种系框架中。还尝试了其他种系框架变体，如下表1.1和1.2中所示。
表1.1
Figure BDA0002961224610002221
Figure BDA0002961224610002231
Figure BDA0002961224610002241
表1.2
Figure BDA0002961224610002251
比较小鼠杂交瘤抗体ADWA-11(称为“杂交瘤mADWA-11”和“mADWA11”)、人源化ADWA-11抗体(“huADWA11-2.4”)和IGHV3-07和IGKV1-39种系序列的重链可变区和轻链可变区氨基酸序列的序列比对显示在图1A和1B中。带下划线的氨基酸残基是根据Kabat的CDR序列，加粗氨基酸残基是根据Chothia的CDR序列。实施例3：将框架突变引入人源化抗αvβ8整合素抗体中
如表2中所示，为了与小鼠杂交瘤抗体ADWA11的结合亲和力相比，改善人源化ADWA-11抗体对αvβ8整合素的结合亲和力，产生了几种在重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)中具有框架置换的变体。该实施例中所述的重链残基根据SEQ ID NO:127编号。该实施例中所述的轻链残基根据SEQ ID NO:128编号。
表2.引入人源化ADWA11抗体中的框架置换
Figure BDA0002961224610002261
Figure BDA0002961224610002271
人源化ADWA11抗体变体由合并表2中列出的各组框架置换产生。这样的组合产生具有ADWA11 VH01、ADWA11 VH02、ADWA11 VH03、ADWA11 VH04或ADWA11 VH05的VH和ADWA11VK01或ADWA11 VK02的VL的抗体。
如本文一般所述产生和评估人源化ADWA11抗体变体ADWA11 VH01/VK01、ADWA11VH02/VK01、ADWA11 VH03/VK01、ADWA11 VH03/VK02和ADWA11 VH05/VK01。
人源化ADWA11抗体变体指定在VH(SEQ ID NO:88)中包括T28N和F29I置换和在VL(SEQ ID NO:47)中包括L46R置换的ADWA11 VH01/VK01。
人源化ADWA11抗体变体ADWA11 VH02/VK01在VH(SEQ ID NO:89)中包括T28N、F29I和R72A置换，和在VL(SEQ ID NO:47)中包括L46R置换。
人源化ADWA11抗体变体ADWA11 VH03/VK01在VH(SEQ ID NO:90)中包括T28N、F29I、R72A、A49G和L79A置换和在VL(SEQ ID NO:47)中包括L46R置换。
人源化ADWA11抗体变体ADWA11 VH03/VK02在VH(SEQ ID NO:90)中包括T28N、F29I、R72A、A49G和L79A置换，和在VL(SEQ ID NO:92)中包括L46R和Y36F置换。
人源化ADWA11抗体变体ADWA11 VH05/VK01在VH(SEQ ID NO:39)中包括T28N、F29I、R72A、A49G、L79A、N74T和A75S置换，和在VL(SEQ ID NO:47)中包括L46R置换。
测定αvβ8整合素的ADWA11 VH01/VK01、ADWA11 VH02/VK01、ADWA11 VH03/VK01、ADWA11 VH03/VK02和ADWA11 VH05/VK01的Fab结合亲和力并在表3中列出。另外，还测定了各抗体抑制TGF-β活化的IC50值，并且列于表3中。
表3.人源化ADWA11抗体变体的表征
Figure BDA0002961224610002281
Figure BDA0002961224610002291
如表3中所示，与小鼠杂交瘤抗体ADWA-11相比，ADWA11 VH03/VK01、ADWA11 VH03/VK02和ADWA11 VH05/VK01各自表现出改善的对αvβ8整合素的结合亲和力。ADWA11 VH03/VK01(GBT)和ADWA11 VH05/VK01各自以小于100pM的KD结合至αvβ8整合素，其代表比针对小鼠杂交瘤抗体ADWA-11测定的536pM的KD低至少5倍的KD值。此外，与小鼠杂交瘤抗体ADWA-11相比，ADWA11 VH03/VK01和ADWA11 VH05/VK01各自表现出较低的抑制TGF-β反式激活的IC50值。
如本文一般所述，进一步确定ADWA11 VH05/VK01还保留小鼠杂交瘤抗体ADWA-11的活性、特异性和物种交叉反应性。因此，与小鼠杂交瘤抗体ADWA11的结合亲和力相比，该实施例证明了人源化ADWA-11抗体对αvβ8整合素的结合亲和力得到改善。
实施例4：人源化ADWA11抗体变体的优化
评估如表4中列出的单个氨基酸置换改善人源化抗体ADWA11 VH05/VK01的稳定性和/或降低免疫原性的能力。该实施例中所述的重链残基根据ADWA11 VH05(SEQ ID NO:39)编号。该实施例中所述的轻链残基根据ADWA11 VK01(SEQ ID NO:47)编号。
表4.单个氨基酸置换
Figure BDA0002961224610002292
Figure BDA0002961224610002301
如本文中进一步所示，发现在重链的可变区中包括K30A、N55Q、N57Q、D61E或P62A和在轻链的可变区中包括L30S、M56A、N58S、M94Q、L97Y或Q105G的单个置换保留亲本分子的活性(图4A-4B)。另外，还评估了如表5中列出的不同单个氨基酸置换的组合，并且如本文中进一步描述的，发现含有双突变(包括N55Q和D61E)或三突变(包括N55Q、D61E和F64V)的重链序列保留了亲本分子的活性(图4C)。
更具体地，产生包括表5中列出的氨基酸置换的组合并被称为ADWA11 2.1(“2.1”)、ADWA11 2.2(“2.2”)、ADWA11 2.3(“2.3”)和ADWA11 2.4(“2.4”)的ADWA11 VH05/VK01变体。如本文进一步描述的，显示ADWA11 VH05-2/VK01变体ADWA11 2.1和ADWA11 2.4具有更有利的表达和活性特性。该实施例证明，单个氨基酸置换改善了人源化抗体ADWA11VH05/VK01的稳定性和/或降低了其免疫原性。
表5.氨基酸置换的组合
Figure BDA0002961224610002302
Figure BDA0002961224610002311
实施例5：无效应功能的抗αvβ8抗体的产生
通过将本发明的轻链可变区和重链可变区(如表1中所列)亚克隆至免疫球蛋白G(IgG)分子中来产生具有降低的Fcγ受体结合和降低的效应功能(例如，降低的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和/或降低的补体依赖性细胞毒性(CDC)功能)的抗αvβ8整合素抗体。
为了产生无效应功能的小鼠抗体，将来自小鼠杂交瘤抗体ADWA-11的可变区亚克隆至含有如美国公开号US2009/0155256中所概述的E233P、E318A、K320A和R322A单个氨基酸置换的小鼠IgG1Fc主链中。该抗体在本文中称为ADWA-11_4mut，并称为mIgG_4mut。使用C8-S小鼠星形胶质细胞(ATCC)评估ADWA-11_4mut与小鼠avB8的结合，并在共培养TMLC萤光素酶测定中使用C8-S细胞测定TGFB活化的阻断。
为了产生无效应功能的人类抗体，将来自人源化抗体ADWA11VH05VK01的可变区亚克隆至人类IgG1 Fc主链(例如，如本文所述)，其在铰链区中含有L234A、L235A和G237A单个氨基酸置换，使得铰链区包含氨基酸序列EPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGAP(SEQ ID NO:126)而不是野生型铰链区氨基酸序列EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGP(SEQ ID NO:125)。这种无效应功能的人类单克隆抗体在本文中称为hIgG_VH05VK01。
在下面的序列中鉴定了hIgG_VH05VK01的轻链(SEQ ID NO:123)和重链(SEQ IDNO:124)的各种特征。
ADWA11 VK01的轻链
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRSTKSLLHFNGNTYLFWYQQKPGKAPKRLIYYMSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCMQSLEYPFTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO:123)
ADWA11 VH05的重链
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDYYMNWVRQAPGKGLEWVGWIDPDNGNTIYDPKFQGRFTISADTSKNSAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRLLMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQID NO:124)
在上述人源化ADWA11VH05VK01的轻链和重链序列中，CDR序列带下划线；N-连接的糖基化共有序列位点在重链的氨基酸残基N295、S296和T297处；潜在切割位点在重链的氨基酸残基D52和P53处；潜在的脱酰胺位点在轻链的氨基酸残基N33、G34、N35和T36和重链的氨基酸残基N57、T58、N77、S78、N84和S85处；潜在异构化位点在重链的氨基酸残基D90和T91处；潜在甲硫氨酸氧化位点在轻链的氨基酸残基M4和M56和重链的M34、M102和M426处；三重丙氨酸突变在重链的氨基酸残基A232、A233和A235处；并且CDR外的非人类残基是轻链的氨基酸残基R51和重链的G49、A72、T74、S75和A79。该实施例中所述的重链和轻链中的残基分别根据SEQ ID NO:124和SEQ ID NO:123编号。
实施例6：通过ELISA评估抗αvβ8整合素抗体
ELISA方法
将生物素化的人类αvβ8整合素(50μl，0.6μg/ml)捕获到用链霉亲和素包被的ELISA板上。封闭和洗涤后，将感兴趣的抗体(例如，鼠类、嵌合或人源化变体)以各种稀释度添加至不同孔中，并在室温下温育1小时。洗涤后，添加检测抗体、抗人类IgG-HRP，并在室温下温育1小时。洗涤后，添加酶底物(TMB)以显色10分钟。通过添加0.16M硫酸淬灭酶反应，并在450nm处测量最终信号强度。
结果
针对密切相关的整合素人类αvβ3和人类αvβ6、针对结合对证实与人类αvβ8(hαvβ8)整合素结合的小鼠杂交瘤抗体进行反向筛选以选择特异性结合至hαvβ8的鼠类抗体。小鼠杂交瘤抗体ADWA11对hαvβ8整合素具有特异性，并且不与密切相关的整合素hαvβ3或hαvβ6结合(图2)。然而，与小鼠杂交瘤抗体ADWA11相比，人源化ADWA11抗体ADWA11 VH05/VK01显示出对αvβ8整合素的亲和力得到显著改善(图3A-3B)。
还通过ELISA评估具有如表4和表5中列出的单个氨基酸置换或氨基酸置换组合的ADWA11 VH05/VK01的抗αvβ8整合素Fab分子与hαvβ8整合素的结合(图4A-4C)。如图4A中所示，在重链可变区中具有K30A、N55Q、N57Q、D61E、P62A或K63A单个氨基酸置换的Fab保留对hαvβ8的结合亲和力。如图4B中所示，与亲本抗体相比，在轻链可变区中具有Y55A、A60Q、F101L或F101W单个氨基酸置换的Fab显示出对hαvβ8的结合亲和力降低。如图4C中所示，具有如表5中列出的氨基酸置换组合的Fab保留对hαvβ8的结合亲和力。
该实施例证明，与小鼠杂交瘤抗体ADWA11相比，人源化ADWA11抗体ADWA11 VH05/VK01显示出对αvβ8整合素的亲和力得到显著改善，并且一些具有单个氨基酸置换的Fab保留对hαvβ8的结合。
实施例7：通过BiacoreTM评估抗αvβ8整合素抗体
方法
在经链霉亲和素包被的BiacoreTM芯片(GE Healthcare Life Sciences)上捕获生物素化的重组αvβ8整合素，并且在一系列Fab浓度下测量Fab片段相对于时间的结合反应。获得了与动力学曲线拟合重叠的代表性背景减除BiacoreTM传感器图谱。
更具体地，重组αvβ8整合素(例如R&D Systems)通过伯胺进行生物素标记，并使用BiacoreTM T200仪器(GE Healthcare Life Sciences)固定在传感器芯片SA上。使用30μl/min流动速率在0.01M HEPES pH 7.4、0.15M NaCl、1-2mM MgCl2和0.005％v/v表面活性剂P20(HBS-P)缓冲液中在25℃下进行Fab结合实验。监测缔合5-10分钟，并且针对每种Fab浓度再解离15-20分钟。每次注射后所述芯片表面用IgG洗脱缓冲液(Thermo FisherScientific)再生。所有数据均使用BiacoreTM T200 Evaluation软件分析。使用与链霉亲和素偶联而无捕获的整合素的相邻流通池和仅缓冲液注射对数据进行双重背景减除。获得至少三次实验的动力学常数，并且报道为平均值。
结果
评估了来自各种物种的与αvβ8整合素结合的抗体。发现小鼠杂交瘤ADWA-11 Fab和人源化ADWA-11 VH05-2/VK01(2.4)Fab均与其他物种的αvβ8整合素交叉反应。小鼠杂交瘤ADWA-11 Fab与人类αvβ8整合素、食蟹猴αvβ8整合素和小鼠αvβ8整合素交叉反应。人源化ADWA-11 VH05-2/VK01(2.4)Fab与人类αvβ8整合素、食蟹猴αvβ8整合素和小鼠αvβ8整合素交叉反应。另外，评估这些抗体结合至相关整合素hαvβ3或hαvβ6的能力。如图5中所示，这些抗体对hαvβ8具有特异性，并且在Biacore测定中不与密切相关的整合素hαvβ3或hαvβ6结合。
表6中列出的亲和力测量的比较显示了与结合至人类αvβ8整合素和小鼠αvβ8整合素的小鼠杂交瘤ADWA-11 Fab的KD相比，结合至人类αvβ8整合素和小鼠αvβ8整合素两者的人源化ADWA-11 Fab具有较低KD。更具体地，与小鼠杂交瘤ADWA-11 Fab的相应KD值相比，人源化ADWA-11 Fab与人类αvβ8整合素结合的KD低约2.5倍，并且与小鼠αvβ8整合素结合的KD低约3.5倍。这些数据显示人源化抗αvβ8抗体相对于小鼠杂交瘤抗体的总体显著改善的亲和力(图6A-6B和表6)。
为评估Fab ADWA11 2.4(在本文中也称为ADWA-11 VH05-2/VK01(2.4)和ADWA115-2 2.4)和亲本小鼠IgG的单体KD，将重组人类、食蟹猴、小鼠和大鼠αvβ8固定在Biacore芯片上，并且Fab的ka和kd如本文一般所述进行测定(表6)。ADWA11 2.4表现出对人类、食蟹猴、小鼠和大鼠αvβ8相当的亲和力，其中KD＜200pM，然而，由于非常减缓的kd，不可能精确测定KD。亲本小鼠IgG表现出对人类、食蟹猴和小鼠αvβ8相当的亲和力KD(KD为489-536pM)(未测试大鼠)(图6C)。
额外Biacore实验将ADWA11 2.4对人类和食蟹猴αvβ8的KD估算值优化至KD＜100pM和对小鼠αvβ8的KD估算值优化至70.8±19.9pM(平均值±标准偏差)。
表6.如通过Biacore评估的αvβ8整合素物种亲和力(n≥3)
Figure BDA0002961224610002361
为了评估ADWA11 2.4的特异性，将重组人类αvβ6和αvβ3固定在Biacore芯片上，并测定ADWA11 2.4的亲本鼠类和人源化mAb变体的结合。亲本杂交瘤和人源化mAb不与αvβ3或αvβ6结合，而在单独的BIAcore实验中观察到与αvβ8的结合。泛整合素αV抗体用于证明αvβ3或αvβ6重组蛋白固定在Biacore芯片上。因此，该实施例还证明了人源化抗体对αvβ8的特异性。
实施例8：在细胞结合测定中评估抗αvβ8整合素抗体
方法
用在MEM 10％hiFBS中培养的人类胶质母细胞瘤U251(Sigma)或C8-S(ATCC)细胞进行细胞结合实验。用0.05％胰蛋白酶剥离生长至70-90％汇合的细胞，并用含有2％BSA的PBS洗涤两次。
用过表达人类αvβ3、αvβ5、αvβ6、αvβ8的HEK293-F细胞进行细胞结合实验。使用专用载体和供应商提供的方案制备短暂表达全长人类整合素β3(保藏编号NP_000203.2)、人类整合素β5(保藏编号NP_002204.2)、人类整合素β6(保藏编号NP_000879.2)或人类整合素β8(保藏编号NP_002205.1)的HEK293-F细胞。4天后收获细胞，并分析整合素表达。为表征整合素αvβ3、αvβ5、αvβ6、αvβ8表达，在指定可商购获得或直接缀合的专用抗体中以及活/死可固定细胞染色剂(Invitrogen)以1:2000温育100,000个细胞30分钟，以区分活细胞。将细胞在300g的力下离心五分钟。然后细胞用洗涤缓冲液(PBS+0.2％BSA)洗涤两次以去除过量未结合的抗体，并在BD biosciences Fortessa流式细胞仪上进行分析。
活细胞结合方案：将100,000个细胞与抗αvβ8或人类IgG1_3mut同型抗体的稀释系列在冰上温育三至四小时。将细胞在300g的力下离心五分钟。然后细胞用洗涤缓冲液(PBS+0.2％BSA)洗涤三次以去除过量未结合的抗体。充分洗涤后，将细胞与Fab’2抗人类Fc-PE(Invitrogen)或山羊Fab’2抗小鼠APC(Jackson Labs)以1:1000稀释度以及活/死可固定细胞染色剂(Invitrogen)以1:2000一起温育，以区分活细胞。将全部内容物在冰上温育30分钟。洗涤后，使用FlowJo分析软件在BD biosciences Fortessa流式细胞仪(针对活细胞进行门控)上分析经染色的细胞。针对各种抗体绘制不同抗体浓度下的平均荧光强度(MFI)。
固定细胞结合方案：在一些情况下，细胞结合实验用在MEM或10％hiFBS中培养的人类胶质母细胞瘤U251(Sigma)细胞进行。用0.05％胰蛋白酶剥离生长至70-90％汇合的细胞，并用含有2％BSA的PBS洗涤两次。U251(25,000个细胞)与以1:2000的活/死可固定细胞染色剂(Invitrogen)一起温育以区分活细胞。将细胞在300g的力下离心5分钟，并用洗涤缓冲液(PBS+0.2％BSA)洗涤，然后在室温下用2％多聚甲醛固定10分钟。经固定的细胞用洗涤缓冲液洗涤两次，然后添加感兴趣的抗αvβ8抗体的稀释系列在37度下持续1小时。将细胞用洗涤缓冲液洗涤三次以去除过量未结合的抗体。充分洗涤后，将1:1000稀释的Fab’2抗人类Fc-PE(Invitrogen)或抗人类κ轻链-APC(Invitrogen)检测抗体添加至细胞并在冰上温育30分钟。洗涤后，使用FlowJo分析软件在BD biosciences Fortessa流式细胞仪(针对活细胞进行门控)上分析经染色的细胞。针对各种抗体绘制不同抗体浓度下的平均荧光强度(MFI)。
结果
获得了重链可变区(包括F64V)或轻链可变区(包括L30S、M94Q、L97Y、F101L、F101W或Q105G)中具有单个氨基酸置换的ADWA11 VH05/VK01 Fab或表5中称为2.1、2.2、2.3、2.4、2.1(F64V)、2.2(F64V)、2.3(F64V)和2.4(F64V)的氨基酸置换组合的经固定的U251细胞的结合数据，并与亲本抗体进行比较(图7A-7C)。
还获得了抗体mIgG_4mut和hIgG_VH05VK01(也称为ADWA11 2.4并在实施例5中进一步描述)的U251细胞结合数据(图8)。U251细胞的mIgG_4mut和hIgG_3mut_VH05VK01的表观亲和力如下表7所示。这些数据证明，与mIgG_4mut相比，hIgG_3mut_VH05VK01经测定具有更高的亲和力。
表7.来自U251细胞结合测定的亲和力值
Figure BDA0002961224610002381
根据如本文一般所述的方法，还在细胞结合测定中评估ADWA11 2.4对U251(人类胶质母细胞瘤)或C8-S(小鼠星形胶质细胞)细胞的表观亲和力。简而言之，将细胞与连续稀释的ADWA11 2.4在冰上温育4小时，然后用抗人类PE二抗检测结合的抗体，并通过流式细胞术分析。ADWA11 2.4表现出与表达人类αvβ8和小鼠αvβ8的细胞的饱和结合，其中在U251(人类αvβ8)细胞结合测定中的平均EC50为126pm，标准偏差为加或减34pM(图9A；n＝3)。
在进一步的研究中，与人类U251细胞结合的ADWA11 VH05-2/VK01(2.4)的EC50经测定为256±115pM(在七个独立实验中的平均值±标准偏差)，以及与小鼠C8-S细胞结合的EC50经测定为145±23.7pM(在四个独立实验中的平均值±标准偏差)。
短暂过表达整合素β家族成员的HEK293F细胞结合实验证明ADWA11 2.4特异性结合至表达人类αvβ8而不表达αvβ3、αvβ5或αvβ6的细胞(图9B)。因此，与亲本小鼠抗体ADWA11相比，ADWA11 2.4表现出改善的特征，由此表明人源化ADWA11 2.4是潜在的改善的人类治疗剂。
实施例9：在αvβ8诱导的TGF-β活化测定中评估抗αvβ8整合素抗体方法
使用U251-MG(Sigma)和Mv1Lu-SMAD-萤光素酶报道分子细胞来测量抗αvβ8抗体对TGFβ途径反式激活的影响。在一些实验中，使用C8-S小鼠星形胶质细胞而不是U251细胞。简而言之，用Cignal SMAD报道分子(luc)慢病毒颗粒(SABioscience)以50的感染复数(MOI)转导水貂肺上皮细胞系MvLu1细胞(ATCC)。通过在补充有2μg/mL嘌呤霉素的完全生长培养基(MEM加上10％胎牛血清(FBS)和L-谷氨酰胺+青霉素/链霉素)中培养细胞产生表达SMAD萤火虫萤光素酶构建体的稳定细胞系。对于实验，将U251细胞(50μL含有2％炭剥除的FBS的MEM培养基中5000个细胞)添加至透明底部、白色侧壁的TC处理的96孔板的各孔中，并在37℃下温育1小时。在含有2％炭剥除的FBS的MEM培养基中制备系列稀释的抗αvβ8抗体(例如FAB抗体)，并以每孔25μl添加至接种的U251细胞。温育一小时后，将Mv1Lu-SMAD-萤光素酶报道分子细胞添加(5000个细胞/孔，25μL)至各孔中，并且在37℃下温育18小时后，根据制造商建议的方案使用Bright Glo试剂(Promega)来测量萤光素酶活性。使用Envision酶标仪用1s积分时间来测量发光。
结果
通过评估降低的萤光素酶活性来监测U251细胞的αvβ8诱导的TGF-β反式激活上的各种抗体的抑制活性(图10A-10F)。
图10Al了描绘如实施例3中所述产生的抗体的比较，并且包括ADWA11 VH05/VK01(也称为VH05-VK01 Fab)与亲本小鼠杂交瘤抗体ADWA11(mFab)之间的比较。通过TGF-β反式激活测定中表观亲和力测量的EC50值从亲本小鼠杂交瘤抗体ADWA11(mFab)的4.6nM改善为ADWA11 VH05/VK01(也称为VH05-VK01 Fab)的1.3nM。
还评估了在ADWA11 VH05/VK01的重链可变区或轻链可变区中进行的氨基酸置换对U251细胞的TGFβ反式激活的影响(图10B-10D)。与ADWA11 VH05/VK01 Fab相比，在轻链可变区中具有F101L或F101W单个氨基酸置换的Fab显示出降低的TGFβ反式激活。
还使用了萤光素酶活性测定监测人源化ADWA-11IgG分子对U251细胞的αvβ8诱导的TGF-β反式激活的影响的比较(图10E)。这些数据表明VH05/VK01-D61E和-N55Q-D61E突变体对TGFβ反式激活具有相当的影响。
为了评估ADWA11_VH05-2_VK01(2.4)(可替代地在本文中称为ADWA11 2.4)的效力，用内源性表达αvβ8的人类和小鼠细胞和TGFβ敏感萤光素酶报道分子细胞系统建立共培养系统。简而言之，将U251(人类胶质母细胞瘤)或C8-S(小鼠星形胶质细胞)细胞与水貂肺上皮细胞(Mv1Lu)接种，所述水貂肺上皮细胞用Cignal SMAD报道分子(luc)慢病毒颗粒(SABioscience)以50的感染复数(MOI)稳定转导(Mv1Lu-Smad细胞)。Mv1Lu-Smad细胞对U251或C8-S细胞产生的TGFβ起反应，并且可通过萤光素酶活性的降低来监测αvβ8功能的抑制。图10F显示与同型阴性对照抗体相比，ADWA11 2.4对U251细胞和C8-S的TGFβ反式激活的影响。
这些数据证明ADWA11 2.4与其他抗体(包括小鼠ADWA11单克隆抗体)相比是更有效的αvβ8诱导的TGF-β的反式激活的抑制剂。用U251细胞进行的TGFβ反式激活测定中ADWA11 VH05-2/VK01(2.4)的IC50经测定为199±93.6pM(在五个独立实验中平均值±标准偏差)。
实施例10：抗αvβ8整合素抗体的免疫原性的评估
通过T细胞增殖测定评估结合至主要组织相容性复合物(MHC)的肽的功能显著性。T辅助细胞上表达的跨膜糖蛋白CD4识别抗原呈递细胞(APC)表面上结合肽的II类MHC分子。这种相互作用导致引起免疫反应的T辅助细胞的增殖。通过含有羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE)染料的单个细胞的荧光强度的降低来监测T细胞增殖。ProImmune的
Figure BDA0002961224610002411
免疫原性系统T细胞测定使用流式细胞术方法以分析CFSE染料标记的细胞的分裂。将来自各种供体的PMBC与CFSE一起温育以形成细胞内荧光缀合物。通过每个连续细胞分裂，CFSE的荧光强度减半，从而允许测量细胞增殖。这种可靠且可再现的CFSE标记的T细胞测定可用于确定MHCII呈递的肽上的潜在的CD4-T细胞表位。衍生自流感/破伤风和结核菌素纯化的蛋白质衍生物(PPD)的肽对照用作细胞增殖的阳性对照。
针对T细胞增殖，用来源于51个供体的PBMC测试涵盖CDR的二十九个肽(表1，SEQID NO:94-122)。CFSE标记的PBMC与测试肽一起温育七天，并通过流式细胞术方法监测CD4+T细胞增殖的程度。将衍生自优化分子的肽的应答者的数目与相应种系序列肽的应答者的数目进行比较。
在该研究中使用包含已知II类MHC表位的参考抗原。结核菌素纯化蛋白质衍生物(PPD)是结核分支杆菌的衍生物，并且以5μg/ml的最终测定浓度使用。由于先前的疫苗接种，即通过记忆免疫反应，预期大约70-100％的PBMC供体对该蛋白质起反应。
钥孔虫戚血蓝蛋白(Keyhole Limpet Hemocyanin；KLH)是公认且有效的幼稚蛋白免疫原，在测定中以0.25mg/ml的最终浓度使用。通常可预期50-80％的供体对该蛋白质起反应，其可能由幼稚免疫反应驱动。
合成肽HA衍生自甲型流感血细胞凝集素(PKYVKQNTLKLAT，残基307-3192；SEQ IDNO:129)，并且以5μM的最终测定浓度使用。预期在多达50％的供体中引发反应。
合成肽TT(AQYIKANSKFIGITEL(SEQ ID NO:130)，来自破伤风类毒素的TET 830修饰/T辅助表位)是通用人类破伤风毒素T细胞表位，其诱导T细胞活化并且用作疫苗接种中的辅助肽。它以5uM的最终测定浓度使用，其中预期多达45％的供体起反应。
发现重链中的F64V置换(SEQ ID NO:105)提高了免疫原性。51个供体的PBMC中的11个在CD4+ T细胞增殖测定中有反应，并且没有供体对相应种系序列敏感。如表8中所示，发现包括Q105G(SEQ ID NO:111)、L30S(SEQ ID NO:106)、M94Q(SEQ ID NO:107)和N58S(SEQ ID NO:113)的其他置换各自使免疫原性降低至不同程度。与阳性对照肽相比，不同CDR肽的反应者百分比在图11中给出。
表8
Figure BDA0002961224610002421
#在CD4+ T细胞增殖测定中供体PBMC有反应的数目
这些数据证明，与小鼠亲本mAb ADWA11相比，包括ADWA11 2.4的本发明的某些抗体展现降低的T细胞反应。这些结果表明与其小鼠亲本抗体相比，ADWA11 2.4是改善的潜在的人类治疗剂。
实施例11：αvβ8的抑制改善EMT6肿瘤模型中抗PD-1疗法的功效方法
在该研究中，将3×105个EMT6(ATCC)细胞植入第四乳腺脂肪垫中或皮下植入Balb/c小鼠(Charles River Laboratory)中。当肿瘤达到50mm3的平均值时，将小鼠随机分为处理组，并且随后开始处理。对于处理，通过每四天静脉内注射，总计三次剂量施用，小鼠接受10mg/kg的剂量的指定抗体2A3_大鼠IgG(“2A3”；BioXcell)、抗PD-1抗体(“PD1”；克隆RMP1-14，BioXcell)、2B8_mIgG1_4mut(“2B8”)或ADWA11_mIgG1_4mut(ADWA11)。肿瘤在两个维度中测量以监测生长，其中体积(V)＝1/2L×W2，并且L(长度)定义为肿瘤的最长直径，并且W(宽度)垂直于L。每周2-3次记录肿瘤测量，直至结束研究。
结果
与抗PD1或抗αvβ8单一疗法处理组相比，抗αvβ8(ADWA11)组合抗PD1疗法(ADA11+PD1)协同和显著降低肿瘤生长，并改善存活率(图12A和12B)。
在10mg/kg单一疗法剂量组中，ADWA11处理在研究的第13天产生47.1％的肿瘤生长抑制(TGI)，然而，TGI是暂时的，并且没有小鼠达到研究结束(在第51天0％存活率)。抗PD1单一疗法处理在研究的第14天产生15％的TGI，并且没有小鼠达到研究结束(在第51天0％存活率)。通过比较，与抗PD-1抗体组合的ADWA11(10mg/kg剂量组)在研究的第14天产生90.0％的TGI，并且60％的小鼠达到研究结束(在第51天60％存活率)。
这些结果首次证明ADWA11抗体(包括ADWA11 2.4)与PD-1的抑制剂(例如抗PD-1抗体)组合时提供协同治疗效果。这些数据表明ADWA11 2.4是潜在的人类治疗剂，其与PD-1抑制剂组合时可提供协同治疗性抗肿瘤反应。
实施例12：αvβ8的抑制改善EMT6模型中4-1BB和抗CTLA4疗法的功效
方法
在该EMT6肿瘤功效研究中，将1×106个EMT6(ATCC)细胞植入Balb/c小鼠(CharlesRiver Laboratory)的第四乳腺脂肪垫中。当肿瘤达到100mm3的平均值时将小鼠随机分组，并开始处理。小鼠接受4-1BB(MAB9371 R&D Systems，1mg/kg，第0天和第4天)、抗CTLA4(克隆9D9 BioXcell，10mg/kg，第0天、第4天和第8天)、抗αvβ8(ADWA11，10mg/kg，第0天、第4天和第8天)、2B8_mIgG_4mut(10mg/kg，第0天、第4天和第8天)或2A3_rat IgG(BioXcell，10mg/kg，第0天、第4天和第8天)的i.v.给药。肿瘤在两个维度中测量以监测生长，其中体积(V)＝1/2L×W2，并且L(长度)定义为肿瘤的最长直径，并且W(宽度)垂直于L。每周2-3次记录肿瘤测量，直至结束研究。
免疫组织化学(IHC)分析：4mm厚的福尔马林固定的石蜡包埋(FFPE)的肿瘤组织切片使用定制方案和Leica Bond-max自动IHC染色机，针对CD8、CD45和颗粒酶B表达进行制备。使用20×放大倍数设置在Leica/Aperio AT2全滑动数字扫描仪上获得图像。图像使用Visiopharm 7.2软件中形成的定制算法分析，并且针对每种感兴趣的目标进行优化。对可行的组织进行细胞计数，并通过可行的组织面积标准化。使用以下等式计算细胞密度：细胞/μm2＝(#阳性细胞/可行的肿瘤面积(μm2))×1×106。使用以下等式计算目标密度百分比：染色面积(μm2)/活的肿瘤面积(μm2)。
结果
与抗4-1BB、抗CTLA4或抗αvβ8单一疗法处理组相比，抗αvβ8(ADWA11)组合抗4-1BB或抗CTLA4显著和协同降低肿瘤生长，并改善存活率(图13)。
评估用抗αvβ8抗体处理后肿瘤浸润性细胞密度的变化(图15)。通过CD45(总淋巴细胞和骨髓细胞)、CD3(总T细胞)、CD4 T细胞、CD8 T细胞和颗粒酶B(活化的CD8和NK细胞)染色的密度的IHC分析在EMT6肿瘤模型中定量淋巴细胞丰度。这些数据证明，抗αvβ8单一疗法增加总CD45+细胞、CD4+ T细胞和CD8+ T细胞的丰度，并导致表达颗粒酶B的细胞(各组n＝10)的密度中非常显著的增加。
在用同型对照或ADWA11(2.4)处理的小鼠的第11天(在第0天、第3天、第6天、第9天抗体处理)分析肿瘤组织中肿瘤淋巴细胞的丰度(图15)。ADWA11(2.4)处理增加肿瘤微环境中总白细胞(CD45+、1540±558对比2470±407)、CD8 T细胞(CD8+、76.3±62.7对比170±74.2)和细胞毒性细胞(颗粒酶B密度％，11.8±11.0对比106±35.1)的密度(在同型对比ADWA11(2.4)处理中，每mm2 CD45+细胞的平均数目、CD8+细胞的平均数目或颗粒酶B染色面积平均值％±标准偏差)。
这些结果首次证明ADWA11抗体(包括ADWA11 2.4)与4-1BB的激动剂(例如抗4-1BB抗体)组合时提供协同治疗效果。这些数据表明ADWA11 2.4是潜在的人类治疗剂，其在与4-1BB的激动剂组合时可提供协同治疗性抗肿瘤反应。
这些结果还首次证明ADWA11抗体(包括ADWA11 2.4)与CTLA4的抑制剂(例如抗CTLA4抗体)组合时提供协同治疗效果。这些数据表明ADWA11 2.4是潜在的人类治疗剂，其在与CTLA4的抑制剂组合时可提供协同治疗性抗肿瘤反应。
实施例13：αvβ8的抑制改善CT26肿瘤模型中辐射疗法的功效
方法
CT26肿瘤功效研究：将4×105个CT26(ATCC)细胞皮下植入Balb/c小鼠(CharlesRiver Laboratory))的侧腹中。当肿瘤达到100mm3的平均值时将小鼠随机分组，并开始处理。小鼠每4天，总共3次剂量接受2B8_mIgG1_4mut(内部)同型对照或ADWA11_mIgG1_4mut的10mg/kg i.v.剂量，并在第一次给药后第5天接受单剂量的5Gy肿瘤靶向辐射。肿瘤在两个维度中测量以监测生长，其中体积(V)＝1/2L×W2，并且L(长度)定义为肿瘤的最长直径，并且W(宽度)垂直于L。每周2-3次记录肿瘤测量，直至结束研究。
基因表达的qPCR分析：收集肿瘤组织，并使用Omin Bead Ruptor在900μL的RNeasyPlus Mini Kit中供应的裂解缓冲液中匀浆30mg的组织。使用RNeasy Plus Mini Kit和供应商建议的方案分离来自匀浆肿瘤样品的RNA。使用2μg总RNA和高容量cDNA逆转录试剂盒，使用供应商建议的方案合成cDNA。使用50ng的cDNA和基因特异性taqman引物TaqManUniversal Master Mix II和供应商建议的方案分析基因表达。ViiA7实时qPCR系统用于qPCR研究。使用建议的比较CT方法分析每个样品的阈值循环(CT)，并且目标基因的表达报道为与同型对照组相比处理组的倍数变化。双尾未配对Students T-test检验用于比较处理组与同型对照组，其中显著性报道为＜0.05。
免疫组织化学(IHC)分析：4mm厚的福尔马林固定的石蜡包埋(FFPE)的肿瘤组织切片使用定制方案和Leica Bond-max自动IHC染色机，针对CD8、CD45和颗粒酶B表达进行制备。使用20×放大倍数设置在Leica/Aperio AT2全滑动数字扫描仪上获得图像。图像使用Visiopharm 7.2软件中形成的定制算法分析，并且针对每种感兴趣的目标进行优化。对可行的组织进行细胞计数，并通过可行的组织面积标准化。使用以下等式计算细胞密度：细胞/μm2＝(#阳性细胞/可行的肿瘤面积(μm2))×1×106。
结果
与单独辐射疗法相比，与辐射疗法组合的抗αvβ8抗体(ADWA11)显著降低肿瘤生长，并改善存活率(图14A)。
在CT26研究中，ADWA11抗体(抗ITGαVβ8)单一疗法在研究的第19天产生64.3％的TGI，但反应是暂时的，并且10只小鼠中仅1只达到研究结束(第57天10％存活率)。单独辐射疗法(在第5天5格雷(Gy))产生57.7％的肿瘤生长抑制(第18天)，并且20只小鼠中1只达到研究结束(第57天5％存活率)。通过比较，ADWA11处理组合辐射疗法产生87.7％的肿瘤生长抑制(第19天，10mg/kg ADWA11和5Gy辐射疗法剂量组)，并且19只小鼠中9只达到研究结束(在第57天47.4％存活率)。
为研究CT26肿瘤模型中ADWA11对肿瘤淋巴细胞丰度的作用，肿瘤组织在第12天(在第0天、第4天、第8天抗体治疗)从用同型对照或ADWA11 VH05-2/VK01(抗ITGαVβ8)处理的小鼠中收集，并通过IHC针对淋巴细胞标志物进行分析(图14B，上图)。ADWA11 VH05-2/VK01处理增加了肿瘤微环境中总CD45+白细胞的密度；同型：367±128、ADWA11 VH05-2/VK01：695±94.8(每mm2细胞平均数目±标准偏差)。CD8+ T细胞；同型：173±79.3，ADWA11VH05-2/VK01：374±80.4(每mm2细胞平均数目±标准偏差)。表达颗粒酶B的细胞毒性细胞，同型：264±65.5，ADWA11 VH05-2/VK01：514±91.7(每mm2细胞平均数目±标准偏差)。另外，抗ADWA11处理组合辐射疗法增加了肿瘤微环境中(倍数变化±标准偏差对比同型处理组)CD45(3.86±0.979)、CD8a(5.45±3.53)、颗粒酶B(4.21±1.02)和IFNγ(5.53±2.13)的mRNA表达水平(图14B，下图)。
这些研究证明，抗ITGαVβ8(ADWA11_mIgG1_4mut)处理增加了肿瘤微环境中活化淋巴细胞的丰度，并且与肿瘤靶向辐射组合在引起肿瘤消退和长期存活方面有效。
这些结果还首次证明，ADWA11抗体(包括ADWA11 2.4)与辐射疗法组合时提供协同治疗效果。这些数据表明ADWA11 2.4是潜在的人类治疗剂，其在与辐射疗法组合时可提供协同治疗性抗肿瘤反应。实施例14：整合素αvβ8作为肿瘤免疫的新型抑制剂和肿瘤免疫疗法的目标的评估
在该研究中，通过用重组αvβ8免疫Itgb8敲除小鼠产生的有效αvβ8阻断单克隆抗体(ADWA-11)用于检查该整合素的抑制是否可以促进抗肿瘤免疫。
在非赘生性组织中，αvβ8整合素在神经上皮、成纤维细胞、树突状细胞和T细胞上表达，并且可活化潜伏转化生长因子β(TGFβ)，其为重要免疫调节剂。如本文中现在所示，在癌瘤内，骨髓细胞表达αvβ8整合素并且阻断αvβ8(ADWA-11)的有效单克隆抗体尤其在与其他免疫调节剂(抗PD1、抗CTLA-4或4-1BB)或放射疗法组合时在鳞状细胞癌、乳腺癌和结肠癌的同系模型中引起生长抑制或完全肿瘤消退。用ADWA-11处理增加肿瘤浸润和CD8+ T细胞的颗粒酶B表达，并增大促炎性与抑制性肿瘤相关巨噬细胞的比率。大多数人类肿瘤表达ITGB8 mRNA，并且如本文所示，在人类卵巢和肾细胞癌的活组织检查中，单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞亚组上存在高水平的表面αvβ8表达。这些发现将αvβ8整合素鉴定为癌症免疫疗法的有希望的新目标。
在鳞状细胞癌模型中的ADWA-11和抗PD-1的有效协同组合免疫疗法
在已建立的鳞状细胞癌(CCK168细胞)的同系肿瘤模型中检查单独或与抗PD-1抗体组合的ADWA11的作用(图16A和图28)。将CCK168细胞(衍生自FVB小鼠的化学诱导的鳞状细胞癌细胞系)以1.5×104个细胞/小鼠的剂量皮下注射至同系野生型FVB小鼠的背外侧右侧腹中。
使肿瘤生长超过14天。选择用于实验的小鼠具有直径为至少5mm的肿瘤尺寸，并且基于肿瘤大小，在不同处理组中使用studylog软件最佳分布。称重小鼠，并且使用可跟踪数显卡尺(Fisher Scientific，型号#14-648-17)在研究期间每隔一天测量肿瘤尺寸。当肿瘤尺寸达到或超过2000mm3或在肿瘤部位产生大的溃烂时处死小鼠。
在第0天和第7天用杂交瘤抗体ADWA11或同型匹配的对照抗体处理小鼠，并在第0天、第4天和第8天(第0天为处理的第一天)用小鼠抗PD-1抗体(RMP1-14，BioXcell)或其同型匹配的对照抗体处理。各组的适当抗体和同型对照抗体以各抗体、ADWA11、抗PD-1抗体(RMP1-14，BioXcell)、对照抗体ADWA-21(对于ADWA11)和对照2A3(BioXcell)10mg/Kg的剂量腹膜内注射。对照ADWA-21结合人类而非小鼠整合素-β8。
CCK168肿瘤表现出对抗PD1抗体的最小反应，但用ADWA11单一疗法处理的十只小鼠中的五只显示肿瘤消退(图16B-16C)。用ADWA11和抗PD1抗体的组合疗法诱导十种肿瘤中的八种完全消退，并且在用杂交瘤ADWA11和抗PD1抗体(图16B)或ADWA11_4mut_mIgG1和抗PD1抗体(图28)处理小鼠时显著增加总存活率。
在肿瘤消退后观察存活的小鼠长达两年，没有显示后续肿瘤再生的迹象。来自组合疗法后完全消退的两次重复实验的十三只小鼠和ADWA11的单一疗法后完全消退的3只小鼠用CCK168细胞再攻击一次或两次，并且没有任何肿瘤生长，证明长期肿瘤免疫的发展。
这些结果首次证明ADWA11抗体(包括ADWA11 2.4)与PD-1的抑制剂(例如抗PD-1抗体)组合时提供协同治疗效果。这些数据表明ADWA11 2.4是潜在的人类治疗剂，其在与PD-1抑制剂组合时可提供协同治疗性抗肿瘤反应。
表面整合素αvβ8存在于肿瘤微环境内的骨髓细胞上
利用流式细胞术鉴定肿瘤的哪些细胞类型表达整合素β8，假定其表达为αvβ8异二聚体(图17A和图17B)。在CCK168肿瘤内，在大于80％的CD45+CD11b+F4/80+CD64+巨噬细胞上和低于20％的CD45+CD11b+F4/80-CD64-CD11c+MHCII高树突状细胞上容易检测到αvβ8表达(图17B)。αvβ8在所检查的巨噬细胞亚群，包括早期浸润性(促炎性)Ly6C+细胞和免疫抑制性CD206+细胞中的每一种中以相似水平表达(图17B)。αvβ8还表达于在体外的CCK168肿瘤细胞上(图18B)。还发现体内CD45-肿瘤和基质细胞上的αvβ8的低水平表达(图18A)。在瘤内T细胞上未发现αvβ8的表达(图20)。
动物
所有动物研究根据经美国加利福尼亚大学旧金山分校、辉瑞公司的机构动物管理和使用委员会、机构动物管理和使用委员会批准的方案进行。所用野生型FVB/N小鼠购自Jackson Laboratories(The Jackson Laboratories，库存号#001800)或来源于我们自己的衍生自该库存的繁殖群体。野生型Balb/c小鼠购自Charles River Laboratories(Charles River Laboratories，品系代码028)。
人类肿瘤处理
对于所有人类样品，从所有受试者获得知情同意，并且根据机构审查委员会(IRB)批准进行工作。新鲜组织经收集，并通过UCSF免疫分析器工作流(为分析癌症内的免疫亚群而开发和优化的转化平台)进行处理。简而言之，从手术室获得组织并在切除4小时内运送到实验室。基于开发的标准操作程序，将组织剧烈绞碎(＜1mm块)并且酶促消化(3mg/ml胶原酶A，50U/ml DNA酶I)。对免疫群体进行多重流式细胞术(＞60种颜色)以分析已知亚组的比例和平均荧光强度以及αvβ8的表达。所有抗体均购自BD Pharmingen、eBioscience、Invitrogen或BioLegend。如先前所述产生抗αvβ8抗体。在特殊次序BD FACSAria融合流式细胞仪上进行包括细胞分选在内的所有流式细胞术。使用FlowJo进行流式细胞术数据的分析。
流式细胞术方案
使用剪刀和钝性解剖从小鼠分离皮下肿瘤。将肿瘤放置在具有在C10培养基(RPMI1640，Hepes 1％，青霉素/链霉素1X，胎牛血清10％，丙酮酸钠1mM，非必需氨基酸1X和β-巯基乙醇0.45％)中制备的胶原酶XI(Sigma C9407)2mg/mL、玻尿酸酶(Sigma H3506)0.5mg/ML和DNA酶(Sigma DN25)0.1mg/mL的消化混合液的皮氏培养皿中。使用无菌剪刀绞碎肿瘤。将所得细胞浆液转移至50mL锥形管(Fisher Scientific#14-432-22)中并且用2mL的C10培养基润洗用于绞碎肿瘤的皮氏培养皿以捕获剩余细胞。将细胞在振荡器中以255rpm于37℃温育45分钟。温育后，将15mL的C10培养基添加至经消化的肿瘤细胞并轻轻振荡涡旋15秒。使细胞浆液通过100μm滤网(
Figure BDA0002961224610002511
#352360)进入干净的50mL锥形管中。通过在4℃下以200g离心5分钟沉淀细胞，并在PBS中重构。使用Countless II FL血细胞计数器(LifeTechnologies)进行细胞计数。
经分离的单细胞制备物用于细胞表面和细胞内染色。计数后，将10×106个细胞转移至v形96孔板的各孔中进行染色。在4℃下用Ghost DyeTM Violet 510(TONBObioscience#13-0870)以1:1000进行活死染色20分钟。在4℃下用抗CD16/30(eBioscience#14061)阻断Fc受体和非特异性结合10分钟。在4℃下进行表面染色20分钟。对于细胞内染色，将细胞在室温下在Fix/Perm缓冲液(eBioscience#88-8824)中温育20分钟，随后在4℃下用抗体混合液进行细胞内细胞因子染色20分钟。染色完成后，将细胞转移至流式细胞术缓冲液(具有2％FBS、青霉素/链霉素/谷氨酰胺、EDTA 2mM的PBS)中用于分析。
用于T细胞染色实验的抗体：ICOS FITC(eBioscience#11-9949-80)、CD25 AF780(eBioscience#47-0251-82)、CD45.1 AF700(BioLegend#110723)、CD8 BV605(BioLegend#100743)、CD4 BV650(BioLegend#100546)、Ki-67 PE-Cy7(BD Biosciences#561283)、CTLA4PE(BD Biosciences#553720)和FoxP3 PB-e450(eBiosciences#48-5773-82)。
用于细胞内细胞因子染色实验的抗体：CD3 APC(eBioscience#17-0032-82)、NK1.1 APC-AF780(eBioscience#47-5941-80)、CD45.1 AF700(BioLegend#110723)、CD4BV650(BioLegend#104729)、CD8 BV605(BioLegend#100546)、IFN-γFITC(eBioscience#11-7311-82)、IL-17A PE-Cy7(BioLegend#506921)、Granzyme-B PE(eBioscience#12-8898-82)、FasL PerCP-eFluor710(eBioscience#46-5911-82)和FoxP3 PB-e450(eBioscience#48-5773-82)。
用于骨髓细胞染色实验的抗体：Ly6G BV785(BioLegend#127645)、SiglecF BV785(BD Biosciences#740956)、CD90.2 BV785(BioLegend#10533)、B220 BV785(BioLegend#103246)、CD45.1 AF700(BioLegend#110724)、CD11b AF780(eBioscience#47-0112-82)、CD206 PerCP-Cy5.5(BioLegend#141716)、F4/80 PE(BioLegend#123109)、CD11c BV650(BioLegend#117339)、Ly6C BV605(BioLegend#128035)、MHC-II PB-e450(eBioscience#48-5321)、CD24 PE-Cy7(BioLegend#101822)、CD103 FITC(eBioscience#11-1031-82)、ADWA11 APC(在我们实验室中定制缀合)和CD64 FITC(BioLegend#139316)。
用于NK细胞染色实验的抗体：CD45.1 AF700(BioLegend#110724)、CD3 APC(eBioscience#17-0032-82)、NK1.1 APC-AF780(eBioscience#47-5941-80)、CD314-NKG2DPE(eBioscience#12-5882-82)、CD226-DNAM-1PerCP-Cy5.5(BioLegend#128814)、CD335-NKp46 FITC(eBioscience#11-3351-82)、CD107a-LAMP-1PE-Cy7(BioLegend#121620)和CD49b eFluor450(eBioscience#48-5971-82)。
对于细胞刺激，在细胞表面和细胞内染色之前刺激细胞。将每孔200μl的C10培养基中的大约3×106个细胞在圆底96孔板中在组织培养箱中在5％CO2下于37℃温育过夜。将刺激混合液(Inomycin，PMA，Brefeldin-A和莫能菌素(Monensin)500×刺激混合液Tombo#TNB4975-UL100)添加至细胞，所述细胞在组织培养箱中在5％CO2下于37℃温育4小时。如上文所概述的，将细胞转移至v-底部孔进行染色。使用BD LSRFortessaTM(BD Biosciences)进行流式细胞术并使用FlowJoTM(Tree Star Inc.)进行分析。
ADWA11增加肿瘤浸润并增强细胞毒性CD8+T细胞的分化，并且升高炎性单核细胞与抑制性巨噬细胞的比率
还表征了ADWA11(有或无抗PD1)对免疫浸润的性质的影响(Thomas等人,CancerCell 8:369-380,2005；Wu等人,Cancer Immunol.Res.2:487-500,2014)。尽管在该模型中用抗PD1处理对肿瘤CD8+ T细胞的总数目无影响，但用ADWA11处理显著增加了CD8 T细胞浸润，这一作用通过免疫染色切除的肿瘤最为明显(图19A-19B)。ADWA11还显著增加了表达颗粒酶B的CD8+ T细胞的百分比(图19C)，而用抗PD1处理没有影响。炎性单核细胞还促进宿主免疫反应的肿瘤逃避。Ly6C在炎性单核细胞上表达，并且在肿瘤微环境中，在具有抑制特性的肿瘤相关巨噬细胞中，Ly6C的表达减弱(Franklin等人,Science 344:921-925,2014；Movahedi等人,Cancer Res.70:5728-5739)。骨髓群体的进一步分类显示ADWA11处理特异性地增加了CD45+CD11b+CD11c-Ly6G-Ly6C高CD206低的聚集(图19D)(Ostuni等人,TrendsImmunol.36:229-239,2015；Noy等人,Immunity 41:49-61,2014)。在所分析的时间点，没有一种处理对CD4+ T细胞数目、CD4+FoxP3+调节性T细胞或T细胞亚组表达的干扰素-γ有显著影响，并且我们无法鉴定IL-17在任何T细胞亚组中的显著表达(数据未显示)。
对于免疫染色，收获肿瘤并在4℃下于4％多聚甲醛中固定过夜。将固定的肿瘤浸没于30％蔗糖溶液中在4℃下过夜并包埋于O.C.T.化合物(Tissue
Figure BDA0002961224610002531
#4583)中，并且在15μm下冷冻切片。冷冻部分通过先前所描述的方案染色(Henderson等人,Nat.Med.19:1617-1624,2013；Rock等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA108:E1475-1483,2011)。简而言之，冷冻切片经渗透并用含0.3％Triton X-100和3％BSA的PBS封闭。将切片与一抗在室温下温育过夜，然后与荧光团缀合的一抗和二抗温育，以及然后用Prolong Gold(Invitrogen)封固。
用于免疫染色的抗体：大鼠抗F4/80(Alexa Fluor 647缀合，Serotec，克隆C1，1:100)、兔抗磷酸化Smad3(Epitomics，1880-1；1:100)、大鼠抗CD8(Alexa Fluor 488缀合或594缀合，Biolegend，克隆53-6.7,1:100)。Alexa Fluor 488缀合、555缀合、647缀合的驴抗兔和抗大鼠(Invitrogen)。在Zeiss LSM780和LSM5 Pascal显微镜上进行共聚焦显微法。
所有定量均使用表示样品的薄(1airy单位；约1μm)光学切片高分辨率共聚焦图像进行。使用ImageJ软件分析图像。每组含有来自至少5个对照组和5个处理(ADWA11)小鼠的样品。使用相同的共聚焦设置随机获取来自每个组织切片的四个图像(视野大小设定为425.10×425.10μm)。将图像放置在相同阈值下，随后计算肌成纤维细胞染色或磷酸化Smad3覆盖的面积。
组合ADWA11和抗PD1疗法的有益协同作用被CD8+T细胞耗竭消除
由于ADWA11疗法对CD8+ T细胞观测到最显著的作用，因此在本文中试图确定这些细胞是否驱动ADWA11的抗肿瘤作用。使用抗CD-8a(Bio X
Figure BDA0002961224610002541
BE0004-1克隆53-6.72)抗体使荷CCK168肿瘤的小鼠耗竭细胞毒性T细胞，或从第0天开始，在每个施用治疗药物之前24小时腹膜内注射10mg/Kg的剂量的对照抗体。在第1天、第5天和第9天注射ADWA11(10mg/Kg)和抗PD1(10mg/Kg)组合。根据本文所述的方法的免疫染色显示有效的CD8耗竭(图21A)，其完全消除ADWA11和抗PD1的组合疗法的有益效果(例如，存活率和肿瘤消退)(图21B-21C)。
这些数据表明CD8+ T细胞在抗avb8(例如ADWA11)介导的抗肿瘤作用中很重要。
活性TGFβ信号传导的标志物pSmad3存在在于CCK168肿瘤细胞和肿瘤微环境的细胞中，并且通过用ADWA11处理广泛抑制信号传导
因为αvβ8整合素的体内功能中的最佳特征为局部活化潜伏TGFβ，所有试图确定未处理的肿瘤中哪些细胞显示TGFβ信号传导的迹象，以及该信号传导是否会被ADWA11疗法抑制或阻止。为鉴定从TGFβ受体主动信号传导的CCK168肿瘤内的细胞类型，使用免疫染色与针对磷酸化SMAD3(TGFβ信号传导中的近端步骤)的抗体，证据表明细胞(CD8+ T细胞，F4/80巨噬细胞和树突状细胞)对活性TGFβ有反应。所检查的CCK168肿瘤在整个肿瘤中具有丰富的巨噬细胞网络(图22A)和仅少量插入的DC。在肿瘤内容易检测到pSMAD3，其通常在与F4/80+巨噬细胞相邻的细胞中，但在巨噬细胞本身中并未检测到。CD8+ T细胞在未经处理的小鼠中稀少而在来自用AWDA-11处理的小鼠的肿瘤中显著更丰富。在这些细胞中未观测到pSMAD3染色。在未处理的肿瘤中，在整个肿瘤微环境中观察到高水平的pSMAD3；然而，通过用ADWA11处理广泛抑制pSMAD3染色(图22A)。因此，不希望受任何特定理论束缚，这些数据表明，在一些实施方案中，αvβ8活性对这些肿瘤中的TGFβ活化是必需的，但TGFβ(在由αvβ8活化时)对CD8+ T细胞聚集、颗粒酶B表达和巨噬细胞亚组分布的作用是间接的或发生在肿瘤微环境外部。
无效应ADWA11在CCK168鳞状细胞癌模型和CT-26癌瘤中抑制肿瘤生长，改善总存活率并且诱导持续性抗肿瘤免疫
使用可与Fc受体相互作用的天然鼠类抗体进行初始研究。因此，有可能ADWA11的抗肿瘤效果可归因于肿瘤细胞或肿瘤浸润性巨噬细胞或树突状细胞的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。为确定ADCC对ADWA11活性的影响，通过将4个置换引入小鼠抗体的IgG1 Fc结构域中以消除效应功能，产生重组Fc“无效应”形式的ADWA11，称为ADWA11_4mut。先前已显示这些置换完全消除了抗体与Fc受体的结合(Alegre等人,J.Immunol.148:3461-3468,1992；Hezareh等人,J.Virol.75:12161-12168,2001)。在CCK168模型中ADWA11_4mut与野生型抗体一样有效(图28)。另外，在两个同系肿瘤模型(即，CT26和EMT6肿瘤模型)中测试ADWA11_4mut抗体的功效。
除CCK168之外，选择CT-26细胞，因为CT-26细胞完全缺乏可检测到的αvβ8表达(图18B)。CT-26小鼠结肠癌细胞(ATCC@CRL-2638TM)以4×105个细胞/小鼠的剂量注射到雌性Balb/c小鼠(Charles River Labs)的皮下侧腹中。使肿瘤生长至50-100mm3的大小以包括在研究中。对于这些研究，在第0天、第4天、第8天、第12天注射ADWA11_4mut或同型对照2B8_mIgG_4mut，在第0天、第4天、第8天静脉内注射抗PD1抗体(RMP1-14，BioXcell)或同型对照2A3_rat IgG(BioXcell)。所有抗体均以10mg/Kg给药。在第5天，除无放射疗法对照组之外，所有小鼠暴露于靶向肿瘤的5Gy剂量的辐射。每周两次使用数显卡尺来测量肿瘤生长，并且报道为体积(长度×宽度×宽度×0.5)。对于再攻击实验，在第51天(第一抗体处理后)将在PBS中的2.5×105个CT26细胞植入具有完全应答的小鼠和幼稚小鼠的对侧侧腹，并且如上所述监测肿瘤生长。
在两种模型中，ADWA11_mut4在驱动抗肿瘤反应中有效(图28)，证明ADCC功能不是ADWA11介导的抗肿瘤作用所需要的。
ADWA11在多个癌瘤模型中有效，并且增强辐射疗法和抗PD-1、抗CTLA-4和4-1BB疗法的效果
确定ADWA11在其他实体瘤模型中的功效和ADWA11是否可更广泛地增强额外免疫调节疗法的有益效果。还检查了ADWA11增强辐射疗法对CT-26癌瘤的效果的能力，因为该肿瘤先前已被证明是辐射敏感的，在体外或体内不表达αvβ8，并且先前已被证明对TGFB受体小分子抑制剂有反应(Young等人,PloS One 11:e0157164,2016)。使用作为治疗仅最低限度有效的辐射剂量，添加ADWA11_4mut或抗PD-1显著提高小鼠的肿瘤消退和总存活率，其中分别具有5/9和3/10的完全反应者(图29A和29B)。有趣的是，在该模型中添加抗PD1至ADWA11几乎没有额外的益处，进一步证明即使在没有检查点抑制剂存在的情况下αvβ8的抑制也是有效的。在初始疗法之后至少51天用相同CT-26肿瘤细胞在对侧上再攻击显示原发肿瘤完全消退并且接受单一疗法或组合疗法的存活小鼠。在少数小鼠中，在对侧肿瘤观测到最小肿瘤生长。最初生长的小肿瘤随后全部显示完全消退，表明在一些实施方案中，用ADWA11成功处理可导致长期抗肿瘤免疫，如先前针对其他免疫调节剂所述(Ascierto等人,J.Transl.Med.15:205,2017)(图29C)。消退的原发肿瘤中均未显示再生长。
ADWA11_4mut在EMT6乳腺癌模型中有效并且增强抗CTLA-4和抗4-1BB的效果。
使用具有免疫排除的肿瘤微环境和低水平的αvβ8表达的乳腺癌的EMT-6模型来检查与ADWA11_4mut组合的抗PD-1、抗CTLA4-4(其最近已被证明通过与抗PD1(Wei等人,Cell170:1120-1133,2017)、或4-1BB的激动剂(在CD8+ T细胞上表达的共刺激受体(Kang等人,Cancer Res.2017)不同的分子机制起作用)的效果。
还在EMT-6肿瘤模型中测试了ADWA11_4mut。将1×106个EMT6细胞(小鼠上皮乳腺癌细胞系；
Figure BDA0002961224610002571
CRL2755TM)注入雌性Balb/c小鼠(Charles River Labs)的第四乳腺脂肪垫中。使肿瘤生长至50-100mm3的大小。将小鼠随机分为抗体处理组，并且操作者对处理组不知情。在第0天、第4天和第8天注射ADWA11_4mut 10mg/kg或对照2B8_mIgG4mut 10mg/kg、抗CTLA4(9D9 BioXcell)或同型对照柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)-mIgG2b 10mg/kg，并且通过静脉内途径在第0天和第4天注射抗4-1BB(MAB9371，R&D systems)1mg/kg。每周两次使用数显卡尺来测量肿瘤生长，并且报道为体积(长度×宽度×宽度×0.5)。
抗PD1、抗CTLA4或抗41-BB单一疗法显示显著的初始肿瘤消退，然而，仅一只用抗4-1BB处理的小鼠以及一只用抗PD1处理的小鼠具有完全消退(图30A-D)。相比之下，大约70％的用ADWA11组合抗PD-1、抗CTLA4或抗4-1BB处理的小鼠具有完全消退、长期存活和对EMT6肿瘤细胞再攻击的抗性，提示长期肿瘤免疫(图30E)。对于再攻击实验，在第51天(第一抗体处理后)，将1×106个EMT-6细胞植入具有完全反应的小鼠和幼稚小鼠的对侧脂肪垫上，并且如上所述监测肿瘤生长。
这些数据首次证明ADWA11抗体(包括ADWA11 2.4)与PD-1或CTLA4的抑制剂(例如，与PD-1或CTLA-4结合从而分别抑制PD-1或CTLA-4的作用的拮抗剂抗体)和/或4-1BB的激动剂(例如，增加4-1BB的生物活性的激动剂抗体)组合时提供协同治疗效果。这些数据表明ADWA11 2.4是潜在的人类治疗剂，其在与例如PD-1或CTLA4的抑制剂或例如4-1BB的激动剂组合时可提供协同治疗性抗肿瘤反应。
人类肿瘤中整合素αvβ8的基因表达和染色
用于ITGB8 mRNA表达的癌症基因组图谱(TCGA)的询问显示，在所检查的三十种肿瘤类型中，几乎所有人类肿瘤都表达可检测到的强烈水平的ITGB8 mRNA，其中在卵巢癌和肾细胞癌中检测到最高水平的表达(图23A)。ITGB8在全肿瘤裂解物中的表达可能反映了αvβ8在浸润性免疫细胞上的表达。为测试这一点，进行多组流式细胞术以评估新鲜收获和解聚的人类肿瘤切除和活组织检查的样本中单细胞中的αvβ8蛋白质表达。对两种人类卵巢癌和两种肾细胞癌的分析显示αvβ8显著表达于CD16+单核细胞、CD14+肿瘤相关巨噬细胞和BCD A1+和BCDA3+单核细胞衍生的树突状细胞上(图23B)。
讨论
如本领域普通技术人员将理解的，ADWA11是对阻断αvβ8整合素具有特异性的单克隆抗体，并且在单独使用时是有效的抗肿瘤免疫疗法。例如，ADWA11在CCK168皮肤鳞状细胞癌中表现出抗肿瘤活性。另外地或可替代地，与免疫调节剂(例如，抗PD-1、抗CTLA-4和抗4-1BB)或与放射疗法组合的ADWA11在三种不同小鼠品系背景的上皮癌瘤的三种同系同种异体移植模型中表现出强大且协同增强的抗肿瘤活性。在一些实施方案中，如通过颗粒酶B在这些细胞中的表达所评估的，αvβ8的抑制增加肿瘤中CD8+ T细胞的数目及其细胞毒性分化。CD8+ T细胞的耗竭消除了ADWA11和抗PD1处理的抗肿瘤效果，表明在一些实施方案中，CD8 T细胞增强的肿瘤细胞杀伤对于ADWA11的功效是关键的。除了对CD8+ T细胞的影响之外，ADWA11增加了肿瘤微环境中免疫刺激性单核细胞的数目(Franklin等人,Science 344:921-925,2014；Movahedi等人,CancerRes.70:5728-5739,2010；Ostuni,TrendsImmunol.36:229-239,2015；Noy等人,Immunity 41:49-61,2014)。尽管免疫抑制性巨噬细胞的数目无差异，但这些巨噬细胞以及树突状细胞表达高水平的可检测到的αvβ8。尽管测试的第一个肿瘤细胞系CCK168细胞在体外表达显著的αvβ8表面水平，但通过流式细胞术在来自所收获的肿瘤的非造血细胞上发现极少αvβ8表达，表明在一些实施方案中，当这些恶性细胞体内形成肿瘤时表达消失。尽管如此，通过重复在不表达任何可检测到的αvβ8的细胞(即CT-26结肠癌细胞)中使用重组无效应的ADWA11抗体的发现，排除了ADWA11的抗肿瘤作用归因于直接经由ADCC靶向恶性细胞的可能性。无效应抗体能够在三种肿瘤模型CCK168、CT-26和EMT-6中抑制肿瘤生长，其中CT-26具有不可检测到的αvβ8表达。此外，用ADWA11进行短期治疗导致长期肿瘤抑制和对后续再攻击的抗性，表明在一些实施方案中，诱导长期抗肿瘤免疫性。总之，这些数据指表明一些实施方案中整合素αvβ8阻断通过阻断先天性免疫细胞或调节性T细胞上的αvβ8来增强对肿瘤的适应性免疫而引起肿瘤抑制。
先前已显示通过树突状细胞、调节性T细胞、成纤维细胞、呼吸道上皮细胞和神经上皮上表达的αvβ8活化TGFβ(Travis等人,Nature 449:361-365,2007；Melton等人,J.Clin.Invest.120:4436-4444,2010；Arnold等人,J.Neurosci.32(4):1197-1206,2012；Fenton等人,Mucosal Immunol.10:624-634,2017；Mu等人,J.Cell Biol.157:493-507,2002；Proctor等人,J.Neurosci.25:9940-9948,2005；Edwards等人,J.Immunol.193:2843-2849,2014)，但由于缺乏可靠的用于组织染色的试剂，定义整合素αvβ8表达的完整范围受到限制。在本文所阐述的实施例中，使用能够通过流式细胞术检测整合素αvβ8的新开发的抗体来证明肿瘤相关巨噬细胞和树突状细胞是在鼠类癌瘤中显示高的αvβ8的细胞表面染色的主要细胞类型。这表明在一些实施方案中，这些细胞类型中的一种或多种上的表达对于αvβ8介导的局部抗肿瘤免疫的抑制很重要。
在本文所阐述的实施例中，未检测到T细胞(包括调节性T细胞(Treg))上的αvβ8表达。
整合素(包括αvβ8)对TGFβ的活化在空间上受到严格限制，使得表达αvβ8的细胞将TGFβ局部呈递给它们直接接触的细胞(Travis等人,Nature 449:361-365,2007；Munger等人,Cell 96:319-328,1999)。已描述TGFβ抑制效应T细胞的活性。如本文所阐述的实施例中所证明的，CD8+ T细胞在ADWA11处理的肿瘤中增加，更可能表达颗粒酶B，并且对于介导ADWA11的保护作用很重要。在一些实施方案中，αvβ8对先天免疫细胞的抑制作用是由于引导活性TGFβ呈递给CD8 T细胞。然而，pSMAD3的免疫染色未显示CD8+ T细胞中TGFβ信号传导的证据，但在非造血细胞(例如，肿瘤细胞)中显示强烈的信号传导。因此，在一些实施方案中，肿瘤细胞和一些其他肿瘤相关非造血细胞(例如，成纤维细胞)是功能上重要的细胞，其响应由αvβ8活化的TGFβ，并且抑制局部肿瘤免疫。
如本文所阐述的实施例中所述的，αvβ8整合素在多种鼠类和人类肿瘤中的单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞上广泛表达，并且是抗肿瘤免疫反应的有效调节剂。靶向该整合素的单一疗法(例如，ADWA11)在一些肿瘤中是有效的。此外，功效通过组合αvβ8(例如，用ADWA11处理)与检查点抑制剂(例如，抗PD1或抗CTLA4)或免疫活化剂(例如，抗4-1BB)的抑制或通过组合αvβ8单一疗法与放射疗法得到协同增强。总之，这些结果将αvβ8整合素鉴定为肿瘤免疫疗法的新型目标。
实施例15：ADWA112.4的进一步体内评估
抗αvβ8评估的肿瘤模型的概述
使用具有免疫活性的小鼠的同系肿瘤模型评估体内功效。由于强烈的抗物种药物反应限制了人源化ADWA11 2.4的暴露，用亲本小鼠杂交瘤抗体ADWA11_4mut的无效应形式进行功效研究。
表9.抗αvβ8评估的肿瘤模型
Figure BDA0002961224610002611
EMT6模型中的功效
原位地(第4乳腺脂肪垫)进行EMT6肿瘤模型研究，并且同时进行有或无检查点抑制剂的抗αvβ8处理。
将3×105或1×106个EMT6细胞/小鼠植入Charles River Balb/c小鼠(每组n＝10)。在平均肿瘤体积为50mm3或100mm3时开始处理。
在所有研究中，鼠类亲本抗αvβ8抗体ADWA11_4mut以10mg/kg每四天给药一次，总共三次剂量。抗PD1抗体(克隆RMP1-14,BioXcell)以10mg/kg每四天给药一次，总共三次剂量，4-1BB激动剂mAb(克隆MAB9371，R&D systems)以1mg/kg每四天给药一次，总共两次剂量，并且抗CTLA4(克隆9D9，BioXcell)以10mg/kg每四天给药一次，总共三次剂量。
当植入3×105个细胞并且以50mm3开始处理时，观测到～50％的肿瘤生长抑制(TGI)(第10-20天)的抗αvβ8单一疗法功效。然而，当植入1×106个细胞并且以100mm3开始处理时，未观测到抗αvβ8单一疗法TGI。两项研究之间的抗αvβ8单一疗法TGI的差异尚不明确；然而，不希望受任何特定理论束缚，在植入1×106个细胞时此模型的快速肿瘤生长率可能限制了αvβ8阻断的反应，或胜过抗肿瘤反应。重要地，抗αvβ8与抗PD1(7/10完全反应)、4-1BB激动剂(5个完全反应)和抗CTLA4(6个完全反应)表现出显著协同治疗效果，并且与单一疗法和同型对照组相比产生增加的存活率。因此，这些数据表明在EMT-6肿瘤模型中ADWA11抗体可提供抗肿瘤反应。
抗CTLA4或4-1BB激动剂单一疗法表现出显著反应(～50％的TGI，第8-20天；然而，该反应是暂时的并且肿瘤最终超过反应。为了证明与抗血管生成或抗增殖反应相比，组合处理导致EMT6肿瘤产生细胞反应，第51天(第1剂后)用第二EMT6肿瘤植入物再攻击具有完全反应的小鼠但无额外药物处理。EMT6肿瘤在幼稚小鼠中快速生长，但在完全反应小鼠中被快速清除，表明在一些实施方案中，针对肿瘤细胞的细胞免疫的发展，例如直接肿瘤细胞死亡，不是由抗血管生成或抗增殖介导。
EMT6肿瘤模型中的淋巴细胞丰度的定量
为研究抗αvβ8处理对EMT6肿瘤微环境的影响，通过IHC定量淋巴细胞亚组的丰度。简而言之，将1×106个EMT6细胞植入Charles River Balb/c小鼠(n＝10只/组)并且在100mm3的平均肿瘤体积时开始处理(第0天)。抗αvβ8ADWA11 2.4抗体以10mg/kg每三天(例如第0天、第3天、第6天和第9天)给药，总共四次剂量，并且在第11天(第4剂后48小时)收获肿瘤。
CD45(总淋巴细胞和骨髓细胞)、CD3(总T细胞)、CD4 T细胞、CD8 T细胞和颗粒酶B(活化的CD8和NK细胞)染色的密度的免疫组织化学(IHC)分析证明，抗αvβ8单一疗法增加总CD45、CD4 T细胞、CD8 T细胞的丰度，并且非常显著地增加表达颗粒酶B的细胞(各组n＝10)的密度(图15)。IHC数据表明，在一些实施方案中，ADWA11 2.4单一疗法足以改变肿瘤微环境，这与αvβ8的预期作用机制(MOA)一致。
CT26模型中的功效
基于αvβ8表达的缺乏、抗PD1疗法的部分反应和文献中关于TGFβ小分子抑制剂与次优剂量的辐射的协同TGI的证据选择CT26模型。辐射疗法(RT)由于其诱导免疫学细胞死亡和从头DC-T细胞引发的能力而备受关注，其中αvβ8可能在成形T细胞分化和活化中起重要作用。简而言之，将4e5细胞皮下植入Charles River Balb/c小鼠(n＝10各组)，并且在100mm3的平均肿瘤体积时开始处理。
以10mg/kg Q4D×4给药鼠类抗αvβ8效应无效抗体ADWA11_4mut，以10mg/kg Q4D×3给药抗PD1(克隆RMP1-14，BioXcell)，并且在第一次给药mAb后进行5天的5Gy剂量的肿瘤靶向辐射。包括抗αvβ8与RT导致TGI显著增加，其中5/9的小鼠显示完全反应。与抗αvβ8相比，包括抗PD1与RT导致TGI较不显著，其中3/10的小鼠表现出完全反应。RT、抗αvβ8和抗PD1的三重组合导致TGI非常显著，其中7/10的小鼠具有完全反应。与EMT6研究类似，具有完全反应的小鼠对CT26细胞的再攻击免疫。
CT26肿瘤浸润性细胞群的免疫表型
为研究抗αvβ8处理对CT26肿瘤微环境的影响，通过流式细胞术定量淋巴细胞亚组的丰度。简而言之，将4e5细胞皮下植入Charles River Balb/c小鼠(n＝6各组)，并且在100mm3的平均肿瘤体积时开始处理。以10mg/kg或1mg/kg Q3D×3给药抗αvβ8ADWA11 2.4，并且在第8天(第3剂后48小时)收获肿瘤。解离肿瘤并通过CyTOF细胞术定量淋巴细胞群。抗αvβ8(10和1mg/kg)增加CD3 T细胞门中的CD8 T细胞的丰度。另外，CD8细胞更频繁地表达颗粒酶B，其是活化表型的标志物。
总结
总之，EMT6和CT26功效和PD研究证明：(1)抗αvβ8协同增加对多种检查点抑制剂的反应；(2)抗αvβ8功效不依赖于肿瘤细胞αvβ8的表达；和(3)抗αvβ8 ADWA11 2.4单一疗法足以增加肿瘤微环境中的CD8+GzmB+ T细胞的丰度。
实施例16：人类FcRn转基因(TG32)小鼠中的ADWA112.4药代动力学
已证明TG32小鼠模型与用于预测呈现线性药代动力学的IgG1和IgG2 mAb的人类药代动力学的猴模型一样好。在以0.1、0.3或3mg/kg单次IV推注剂量施用后，在TG32小鼠中评估ADWA11 2.4的药代动力学。然后测量血清药物浓度。如图25A和图25B中所示，观测到抗体清除中剂量依赖性降低的明显趋势。这对于与细胞表面目标相互作用的单克隆抗体是典型的并且指示该目标受体αvβ8可充当清除机制。因此，两个独立药代动力学模型用于描述线性(典型FcRn介导的抗体清除机制)相对于非线性(αvβ8介导的)清除途径。为估算线性清除率的参数，使用双室群体药代动力学模型仅拟合3mg/kg数据(图25A)。为估算在多个剂量中非线性清除的药代动力学参数，使用双室饱和模型(Michaelis Menten)拟合所有数据(0.1、0.3、3mg/kg)(图25B)。所估算的线性和非线性药代动力学参数分别显示于表10和表11中。线性药代动力学参数在针对TG32小鼠中的典型mAb所观察到的范围内。
表10.TG32小鼠(在3mg/kg下IV)中的双室药代动力学参数
参数 估算值 ％CV
CL(mL/h/kg) 0.33 9.2
CLD(mL/h/kg) 2.3 13
V1(mL/kg) 49 2.4
V2(mL/kg) 38 9.6
t<sub>1/2</sub>(day) 7.6
CL：中央室的清除率；CLD：室间分布清除率；V1：中央室的分布容积；V2：周边室的分布容积；t1/2，基于估算的参数计算的终末半衰期。
表11.TG32小鼠(在0.1、0.3和3mg/kg下IV)中的双室非线性药代动力学参数
参数 估算值 ％CV
Km(ng/mL) 1659 25
Vmax(ng/h/kg) 6596 5
CLD(mL/h/kg) 3.4 20
V1(mL/kg) 49 4
V2(mL/kg) 48 8
Vmax：最大速率；Km：用于实现半最大速率的底物浓度；CLD：室间分布清除率；V1：中央室的分布容积；V2：周边室的分布容积。
与基于血清药代动力学的观测到的目标介导的药物处置(TMDD)一致，在组织分布研究中也观察到药物分布到多个组织(由于饱和目标结合)，尤其是肾脏中的剂量依赖性降低。
实施例17：非人类灵长类动物(NHP)中的药代动力学
在4、40或100mg/k g的第一剂多剂量给药研究后，在NHP探索性毒理学研究中评估ADWA11 2.4的药代动力学。如图26中所示，由于高于目标介导的药物处置(TMDD)的饱和范围，ADWA11 2.4的暴露在该剂量范围内似乎是线性的。使用双室线性模型拟合数据(图26)，并且估算的药代动力学参数显示在表12中。尽管观察到的CL和分布容积在典型mAb的范围内，但末端t1/2似乎在该范围的短端上。不希望受任何特定理论束缚，这可能是由于终末期没有很好地定义为仅在给药后7天内取样(ETS研究设计的限制)。
表12.NHP(在4、40和100mg/kg第一次给药下的IV)中的双室药代动力学参数
参数 估算值 ％CV
CL(mL/h/kg) 0.41 8.7
CLD(mL/h/kg) 15.9 25
V1(mL/kg) 35.6 12
V2(mL/kg) 25.1 25
t<sub>1/2</sub>(day) 4.3
CL：中央室的清除率；CLD：室间分布清除率；V1：中央室的分布容积；V2：周边室的分布容积；t1/2，基于估算参数计算的终末半衰期。
实施例18：作为单一疗法以及在与抗PD-1共同给药时鼠类替代物抗体的药代动力学
亲本(小鼠IgG)的单剂量药代动力学数据不可用，但在几项功效研究中在多达四个时间点测量暴露并且在这些研究中似乎是一致的。亲本(小鼠IgG)的暴露似乎在所研究的剂量范围内(1、3和10mg/kg)是线性的，与在人源化抗体ADWA11 2.4的TG32小鼠中所估算的饱和TMDD同一。将双室药代动力学模型拟合至剂量-反应EMT6肿瘤模型研究中的暴露数据，仅估算CL，同时固定上文针对TG32小鼠中的人源化抗体报道的值的其他参数。这些荷瘤小鼠中亲本(小鼠IgG)的估算CL为0.74mL/hr/kg。
与用单独鼠类替代抗体给药或用对照大鼠IgG 2A3给药的那些相比，在用抗PD-1抗体重复共同给药研究之后，亲本(小鼠IgG)的暴露似乎低～5-50×。这种现象在使用两种不同肿瘤模型(CT26和EMT6)的两项独立研究中观察到。较低暴露可能是由于在抗PD-1存在的情况下ADA形成增加，如在PD-1敲除小鼠中已报道的(Nishimura H等人,1998,International Immunol.10(10):1563-72)。临床上也报道了抗PD-1抗体(派姆单抗)处理之后ADA形成增加。
实施例19：人类PK/暴露预测
通过按比例调整来自TG32小鼠的线性药代动力学参数来预测在饱和目标介导的药物处置(TMDD)剂量下的ADW11 2.4的人类药代动力学概况(表13)。所预计的线性人类药代动力学参数在表13中给出。另外，基于所测量的AC-SINS结合(评分＝2，第2.4节)，使用平台PBPK模型预测0.12mL/hr/kg的线性人类CL。通过NHP的类比预测0.086mL/hr/kg的线性人类CL。这些CL值在基于TG32类比预测的2×范围(0.15mL/hr/kg)内，进一步支持在剂量饱和TMDD下，ADW11 2.4将具有对于单克隆抗体典型的药代动力学概况。
这些结果指示ADWA11 2.4是潜在有用的人类治疗性抗体。
表13.ADWA112.4的所预计的人类线性药代动力学参数
参数 比例因子 预计值
CL(mL/h/kg) 0.9 0.15
CLD(mL/h/kg) 0.67 0.15
V1(mL/kg) 0.97 39
V2(mL/kg) 0.93 21
t<sub>1/2</sub>(天数) NA 12
CL：中央室的清除率；CLD：室间分布清除率；V1：中央室的分布容积；V2：周边室的分布容积；t1/2，基于估算参数计算的终末半衰期。
在雄性hFcRn TG32小鼠(n＝4或8/剂量组和雄性食蟹猴(n＝1/剂量组)中表征额外单剂量ADWA11(2.4)IV和SC PK和/或TK，并且修正本文先前所阐述的人类药代动力学参数。更具体地，在单次IV给药(TG32小鼠和食蟹猴中的0.1、0.3和3mg/kg)之后，ADWA11(2.4)的PK在两个物种中都是非线性的，具有剂量依赖性CL降低趋势，与可饱和目标介导的药物处置一致。在高于饱和清除的剂量下，ADWA11(2.4)的PK是线性的并且与典型人类IgG1 mAb一致。在给药后240小时观察到在以10mg/kg单次SC给药后的平均PK和TK参数Tmax，并且基于与单次IV给药后3mg/kg的剂量标准化的AUCinf的比较，生物利用度估算为大约100％。
与本文中先前其他地方所阐述的相比，ADWA11(2.4)预期在更低剂量下是剂量依赖性的。即，基于包括线性和非线性清除率两者的食蟹猴PK模型的类比来预测ADWA11(2.4)的人类PK。经修正的预测人类PK参数如下：中央室的分布容积为36mL/kg；周边室的分布容积为33mL/kg；中央室(线性CL)的清除率为0.12mL/kg/h；室间清除率为0.51mL/kg/h；和最大非线性消除率为0.46μg/mL/h并且非线性清除率的Km为0.42μg/mL。模型预测ADWA11(2.4)的非线性清除率可能在14μg/mL血浆浓度以上饱和，其中预测t1/2为大约15至17天。
实施例20：药代动力学-药效学关系和有效人类剂量的预测
在同系小鼠肿瘤模型中不存在明显的暴露-TGI反应的情况下，认为10mg/kg剂量是用于评估有效浓度的有效剂量。使用亲本(小鼠IgG)的药代动力学模型，在第12天(在研究中最后一次给药后4天，以10mg/kg Q4D×3给药)估算平均浓度(Cavg)为107μg/mL。类似地，虽然略高，通过使用来自可用暴露数据的线性梯形法计算AUC来估算Cavg值。
由于在这些有效浓度水平下预期ADWA11 2.4的典型抗体药代动力学，具有按比例调整的TG32小鼠参数的双室药代动力学模型(表13)用于人类剂量预测(Betts等人,MABS(2018)1-14)。另外，使用按比例调整的NHP药代动力学参数预测的人类剂量与使用TG32小鼠预测的人类剂量仅相差约20％。为匹配Cavg，预测Q14D×3给药的有效人类IV剂量为7mg/kg，而预测Q28D×3给药的IV剂量为12mg/kg(图27A-27B)。剂量还可针对特定患者群体、临床适应症和/或临床体征和症状进行调整。
基于来自食蟹猴的类比和额外临床前功效研究的结果来优化ADWA11 2.4的人类PK预测。将有效剂量预测(Ceff)被确定为血浆浓度，其等于在使用以上2种小鼠肿瘤模型的不同研究中对肿瘤生长抑制的半数最大效应的10倍。在所有研究中，估算Ceff在10-98nM范围内；因此，使用保守方法将100nM(范围的高端)定义为目标Ceff。ADWA11 2.4的人类有效剂量预测是大约2mg/kg IV Q14D或4mg/kg IV Q28D，预测其在估算的低谷药物浓度(100nM)下提供＞IC90肿瘤生长抑制覆盖范围。在2mg/kg Q14D(IV)和4mg/kg Q28D(IV)之后，在预测有效剂量下在稳定状态下的预计Cmax、Cave和Cmin分别为84、44和29μg/mL和132、45和21μg/mL。在预测有效剂量下预测人类t1/2为大约15至17天。
这些结果支持ADWA11 2.4是潜在有用的人类治疗性抗体，因为其可以在商业上可行并且可合理产生的量给药。
实施例21：CD-1小鼠中的重复剂量毒物代谢动力学
在以10(IV)、100(SC)或200(IV)mg/kg/周，总计4次剂量每周静脉内(IV)或皮下(SC)给药ADWA11 4至CD-1小鼠(n＝3/性别/剂量组)作为GLP重复-剂量毒性研究的一部分之后进行毒物代谢动力学和抗药物抗体评估。
在研究期间的任何时间点，从媒介物对照组收集和分析的样品中没有可定量浓度的ADWA11 2.4。基于数据的定性评述，全身性暴露中不存在一致的性别相关差异(如通过Cmax和AUC168所评估的)，使用来自雄性和雌性CD-1小鼠两者的组合数据来呈现组平均毒物代谢动力学参数(表18)。
表18.CD-1小鼠中ADWA112.4的总平均毒物代谢动力学参数
Figure BDA0002961224610002691
Figure BDA0002961224610002701
AUC168＝从时间0至168小时的浓度-时间曲线下的面积；Cmax＝观察到的浓度最大值；Tmax＝第一次观察到Cmax的时间。
IV给药之后，全身性暴露在第1天以近似剂量成比例的方式随着剂量的增加而增加，并且在第22天以低于剂量成比例的方式增加。对于10mg/kg/周(IV)、100mg/kg/周(SC)和200mg/kg/周(IV)，平均积聚比率(AUC168，第22天/第1天)分别为3.0、0.6和1.0。在以100mg/kg/周(SC)和200mg/kg/周(IV)重复给药之后，缺乏积聚可能与这些剂量组中动物中ADA的存在相关。
针对ADWA11 2.4的ADA诱导的总发生率为28％(5/18动物)。在以10(IV)、100(SC)或200(IV)mg/kg/周用ADWA11 2.4给药的CD-1小鼠中，针对ADWA11 2.4的ADA诱导的发生率分别为0％(0/6动物)、67％(4/6动物)和17％(1/6动物)。通常，与ADA阴性动物相比，ADA阳性动物中的暴露类似或低于ADA阴性动物。实施例22：食蟹猴中的重复剂量毒物代谢动力学
在以8(IV)、100(SC)或200(IV)mg/kg/周，总计5次剂量每周静脉内(IV)或皮下(SC)给药ADWA11 2.4至作为GLP重复剂量毒性研究的一部分的食蟹猴后进行毒物代谢动力学和抗药物抗体评估。
在研究期间的任何时间点，从媒介物对照组收集和分析的样品中或在第1天给药之前的任何测试制品给药组中没有可定量浓度的ADWA11 2.4。在各剂量组中全身性暴露没有明显的性别相关差异(如通过Cmax和AUC168所评估的)；因此，使用来自雄性和雌性食蟹猴两者的组合数据来讨论并呈现组平均TK参数(表19)。
表19.食蟹猴中ADWA112.4的总平均毒物代谢动力学参数
Figure BDA0002961224610002711
AUC168＝从时间0至168小时的浓度-时间曲线下的面积；Cmax＝观察到的浓度最大值；Tmax＝第一次观察到Cmax的时间。
在以8(IV)、100(SC)和200(IV)mg/kg每周给药之后，全身性暴露在第1天和第22天大致以剂量成比例的方式增加，其中积聚比率(第22天的研究/第1天的研究)为大约2.3至2.6。
在所有剂量组中，针对ADWA11 2.4的ADA诱导的总发生率为39％(7/18动物)。对于用ADAW11 2.4分别以8(IV)、100(SC)或200(IV)mg/kg/周剂量给药的动物，针对ADAW11 2.4的ADA诱导的发生率为17％(1/6)、33％(2/6)和67％(4/6)。通常，与ADA阴性动物相比，ADA阳性动物中的暴露通常类似。
实施例23：小鼠和食蟹猴中的非临床毒理学
在长达1个月的静脉内(IV)和皮下(SC)研究中将AWA11 2.4施用至小鼠和食蟹猴。在这些研究中鉴定的目标器官包括骨骼、脾脏和临床化学变化，但变化不视为是不良的。1个月研究中的无不良反应水平(NOAEL)分别对于小鼠(Cmax和AUC168 6510μg/mL和267000μg·h/mL)和食蟹猴(Cmax和AUC168 11,400μg/mL和1,100,000μg·h/mL)为200mg/kg/周IV。
单剂量毒性
雌性CD-1小鼠在10、30或100mg/kg的单次SC剂量之后、在2周观察期后对ADWA112.4耐受。在研究期间没有与测试制品相关的发现，并且平均全身性暴露在各剂量下以与剂量成比例的方式增加，如通过曲线下面积(AUC)所测量的。在100mg/kg下，平均Cmax和AUC336分别为795μg/mL和148,000μg*h/mL。
重复剂量毒性
研究1：在研究1中，通过在第1天、第4天、第8天、第11天和第14天以0、1、10或100mg/kg/剂量的剂量IV推注向雌性CD-1小鼠施用ADWA11 2.4。所有小鼠在研究期间存活并且对所有剂量都是耐受的。在100mg/kg/剂量下，与对照平均值相比，在临床化学参数中存在测试制品相关差异，其包括较低葡萄糖(0.75x)和较高磷(1.35x)、球蛋白(1.09x)和血尿素氮(1.18x)而无任何相关的显微结果或明显的剂量关系(葡萄糖和磷)。在≤10mg/kg/剂量下，与对照平均值相比，临床化学参数中的测试制品相关差异包括较低葡萄糖(在10mg/kg/剂量下仅0.77x)和较高磷(1.26x)。在第1天和第11天，平均全身性暴露以近似剂量成比例的方式随剂量的增加而增加。在100mg/kg/剂量下，最高施用剂量、平均Cmax和AUC48在第11天为4510μg/mL和124,000μg·h/mL。
研究2：在研究2中，通过在第1天、第8天和第14天以0、4、40或100mg/kg/剂量的剂量每周一次IV推注向食蟹猴施用ADWA112.4。所有猴在研究期间存活并且对所有剂量都是耐受的。在100mg/kg/剂量组中，在雌性(0.21×基线)与雄性(0.44×基线)猴中，唯一与测试制品相关的结果是CD8+初始T细胞降低，但在4或40mg/kg/剂量组中未观测到变化。在第1天，平均全身性暴露以近似剂量成比例的方式随剂量的增加而增加。在100mg/kg/剂量下，最高施用剂量、平均Cmax和AUC168在第1天为3550μg/mL和162,000μg/mL。
研究3：在研究3中，通过在第1天以0.1、0.3或3mg/kg的剂量IV推注，或通过以10mg/kg SC注射向雄性食蟹猴施用ADWA11 2.4。随后，在第1天施用0.1或0.3mg/kg(IV)的动物还分别在第8天通过SC注射施用30或100mg/kg。所有施用剂量/施用途径均耐受。在剂量施用之后的22天或29天观察期内，没有与测试制品相关的生命观测结果(即临床体征，或体重或食物消耗的变化)。在注射部位没有红斑或水肿的迹象。
在第1天以0.1、0.3和3mg/kg单次IV施用之后，在0.1与0.3mg/kg之间全身性药物暴露随剂量成比例增加，并且在0.3与3mg/kg之间超过该随剂量增加比例。在第1天以10mg/kg或在第8天以30mg/kg和100mg/kg单次SC施用之后，全身性药物暴露随剂量成比例增加。相对于3mg/kg IV剂量的SC生物利用度在10、30和100mg/kg下分别为103％、79％和100％。对食蟹猴施用0.1、0.3或3mg/kg(IV)或10、30或100mg/kg(SC)的ADWA11 2.4是耐受的并且全身性暴露随剂量增加。
研究4：在研究4中，通过0(IV和SC)、10(IV)、100(SC)或200(IV)mg/kg/周的IV和/或SC剂量每周一次向雄性和雌性CD-1小鼠施用ADWA11 2.4持续1个月(总共5次剂量)。测试制品相关结果受限于临床化学中的非不良改变、脾脏中的免疫表型参数和脾脏重量。
除了在第5天发现死亡的一只100(SC)mg/kg/周雄性动物之外，所有动物存活至预定尸检；然而，该动物的死亡不被认为与测试制品相关。在各种器官中观测到死后自溶和200(IV)mg/kg/周组中的死亡，并且与同期对照相比，在两种性别中均包括较高的珠蛋白(1.15×至1.16×)，在雌性中包括较低AG比率(0.85×)，并且在雄性中包括较高总蛋白(1.11×)。mAb测试制品的施用增加全身性γ球蛋白浓度，并且可能促进血清蛋白的这些变化。由于其幅度小且缺乏相关的微观或宏观发现，这些在临床化学参数中的观测结果为非不良的。在脾脏中，在第30天，在10(IV)、100(SC)和200(IV)mg/kg/周下，分别注意到雌性中的测试制品相关的较低数目的CD8+ T细胞(0.52x、0.65x和0.60x对照平均值)和雄性中的较高百分比的表达活化标志物CD25的CD4+ T细胞(1.62x、1.90x和1.52x对照平均值)。在200(IV)mg/kg/周的雌性中，平均绝对和相对(相对于身体和脑重量)脾脏重量较低(0.86x至0.88x对照)。对于较低脾脏重量，没有相关的宏观或微观发现。基于数据的定性评估，如通过Cmax和AUC168所评估的，在全身暴露中没有一致的性别相关差异。全身暴露随着IV或SC剂量的增加而增加。在重复给药之后，在10mg/kg/周(IV)下暴露增加，在100(SC)mg/kg/周下降低，并且在200(IV)mg/kg/周时保持相同。针对ADWA11 2.4的抗药物抗体(ADA)诱导的发生率在10(IV)、100(SC)或200(IV)mg/kg/周下分别为0％(0/6)、67％(4/6)和17％(1/6)。在施用ADWA11 2.4一个月后，在心脏或皮肤中没有ADWA11 2.4相关的显微发现的证据。
在重复剂量施用之后，与ADA阴性动物相比时，ADA阳性动物中的暴露类似或略微较低。基于在任何剂量下缺乏不良发现，将所施用的最高剂量(200(IV)mg/kg/周)鉴定为未观测到不良反应水平(NOAEL)，并且与在第22天为6,510μg/mL的Cmax和267,000μg·h/mL的AUC168相关。
研究5：在研究5中，以0(IV和SC)、8(IV)、200(IV)或100(SC)mg/kg/周的IV和/或SC剂量持续1个月(总共5次剂量)向食蟹猴施用ADWA11 2.4。在该研究中没有不良的测试制品相关的发现。非不良测试制品相关的发现包括雄性的肋软骨连结处的单侧长骨体生长部的发育不良和在100(SC)mg/kg/周下在雌性中以及在200(IV)mg/kg/周下在两种性别中血清蛋白(球蛋白增加(多达1.29×)、总蛋白(多达1.10×)和/或的白蛋白球蛋白比率降低(降至0.75×))改变。在各剂量组，雄性和雌性中的全身性暴露(如通过Cmax和AUC168评估的)相似，并且在第1天和第22天，IV剂量组中的平均全身性暴露以近似成比例的方式随剂量的增加而增加。在对各组重复给药之后，暴露较高。在施用ADWA11 2.4一个月后，在心脏或皮肤中没有ADWA11 2.4相关的显微发现的证据。
对于以8(IV)、100(SC)或200(IV)mg/kg/周剂量用ADWA11 2.4给药的动物，ADA诱导的发生率分别为17％(1/6动物)、33％(2/6动物)和67％(4/6动物)；对于所有剂量组，针对ADWA11 2.4的ADA诱导的发生率为39％。与ADA阴性动物相比，ADA阳性动物中的血清暴露通常类似。在每周一次IV或SC施用ADWA11 2.4之后，基于任何存活或死后评估中缺乏不良发现，在猴子中的这项1个月毒性研究中将200(IV)mg/kg/周鉴定为NOAEL。在200(IV)mg/kg/周下，在第22天平均Cmax为11,400μg/mL并且平均AUC168为1,100,000μg·h/mL。
1个月研究中的NOAEL分别对于小鼠(Cmax和AUClast6510μg/mL和267000μg·h/mL)和对于食蟹猴(Cmax和AUClast11,400μg/mL和100,000μg·h/mL)为200mg/kg IV。
实施例24：体外补体蛋白C1q和FcR结合
在体外筛选测定中分别经由C1q和Fcγ(FcγR)的结合研究ADWA11 2.4引起补体依赖性细胞毒性(CDC)和抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)的潜能。ADWA11 2.4在所测试的浓度(多达30μg/mL)下未结合至C1q，并因此被认为具有诱导CDC的低潜能。与结合至阴性对照抗体相比，结合至所有所测试的FcγR的ADWA11 2.4类似或较低，并且与结合至阳性对照抗体相比较低。因此，ADWA11 2.4被认为具有引发ADCC活性的低潜能。
实施例25：体外细胞因子释放测定
使用来自8个人类供体的样品，以全血和PBMC形式进行体外细胞因子释放测定。与ADWA11 2.4温育之后未观察到与测试制品相关的TNF、IL-6或INF-γ释放。这些数据与在上文所述的小鼠和猴研究中施用ADWA11 2.4后缺乏血清细胞因子概况的变化一致。
实施例26：αvβ8的抑制改善MC38肿瘤模型中抗PD-1疗法的功效
方法：
在该研究中，将MC38鼠类结肠癌细胞系维持在含有10％胎牛血清、2mM谷氨酰胺、100单位/mL青霉素G钠、100μg/mL硫酸链霉素和25μg/mL庆大霉素的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)中。将细胞在37℃下在5％CO2和95％空气的气氛中培养于含湿气培养箱中的组织培养瓶中。在肿瘤植入当天，在指数生长期间收获MC38肿瘤细胞并且重悬浮于磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)中。每只小鼠在右侧腹中皮下(sc)接受0.1mL悬浮液中的5×105个细胞。在平均体积接近80至120mm3范围时在两个维度中测量肿瘤以监测生长。体积(V)＝1/2L×W2，并且L(长度)定义为肿瘤的最长直径，并且W(宽度)垂直于L。在研究的第1天，将动物分成七组(n＝10只/组)，其中组平均肿瘤体积为100mm3并且如下文所描述的进行处理。每周记录肿瘤测量2至3次，直至肿瘤体积达到大于1200mm3。
对使用Omin Bead Ruptor在RNeasy Plus Mini Kit中提供的900μL裂解缓冲液中匀浆的30mg收获的肿瘤组织进行基因表达的定量PCR(qPCR)分析。使用RNeasy Plus MiniKit和供应商建议的方案分离来自匀浆肿瘤样品的RNA。使用Epoch BioTek分光光度计定量RNA浓度并用ddH20重悬浮至200ng/μL。使用供应商建议的方案，使用2μg总RNA和高容量cDNA逆转录试剂盒合成cDNA。使用50ng cDNA和基因特异性taqman引物、TaqMan UniversalMaster Mix II和供应商建议的方案分析基因表达。ViiA7实时qPCR系统用于qPCR研究。使用建议的比较CT方法分析各样品的阈值循环(CT)，并且目标基因的表达报道为与同型对照组相比处理组的倍数变化。使用双尾未配对Students T-test检验将处理组与同型对照组进行比较，其中显著性报道为＜0.05。
结果：
为研究αvβ8-阻断对肿瘤淋巴细胞丰度的影响，从用同型对照或ADWA11 VH05-2/VK01(ADWA 2.4)处理的小鼠在第12天收集肿瘤组织(在第1天、第5天、第9天抗体处理)并通过定量PCR分析淋巴细胞标志物mRNA表达。ADWA11 VH05-2/VK01(ADWA 2.4)处理增加了肿瘤微环境中CD8a(2.62±0.763)和颗粒酶B(5.79±1.55)的表达水平(倍数变化±标准偏差对比同型组10mg/kg处理组)(图31A)。这些数据证明用ADWA11 2.4抗体处理增加肿瘤微环境的活化淋巴细胞(其在肿瘤消退中起作用)的丰度。
ADWA11 2.4处理在研究的第15天产生18％的TGI，而抗PDl1抗体(RMP1-14)处理在研究的第16天产生10.3％的TGI并且没有小鼠达到研究结束(第30天存活率0％)。相比之下，ADWA11 2.4组合抗PDl1在研究的第16天产生35.8％的TGI并且60％的小鼠达到研究结束(第30天存活率％)(图31B上图)。
这些结果证明，如由本文所用的抗体所例示的，抗PD1与抗αvβ8的组合疗法提供出乎意料的协同抗肿瘤作用。这些数据表明本文公开的新型抗αvβ8(例如ADWA11 2.4)抗体与本领域众所周知的抗PDI抗体的组合疗法为治疗肿瘤提供了潜在的新型疗法。
尽管已参考不同申请、方法、试剂盒和组合物描述了所公开教导，但将理解的是在不背离本文中的教导和以下所要求保护的本发明的情况下可进行不同变化和修改。提供前述实施例以更好地说明所公开的教导，并且不旨在限制本文提供的教导的范围。尽管已经根据这些示例性实施方案描述了本发明的教导，但本领域技术人员将容易理解这些示例性实施方案的许多变化和修改是可能的，而无需过度实验。所有这些变化和修改都在当前教导的范围内。
本文中所引用的全部参考文献(包括专利、专利申请、论文、教科书等)以及其中引用的参考文献，如果它们尚未全部引用，在此出于所有目的通过引用整体并入本文。在所并入文献和类似材料中的一种或多种(包括但不限于定义的术语、术语用法、所描述的技术等)与本申请不同或矛盾的情况下，以本申请为准。
对本领域技术人员将显而易见的是，在不背离本发明的范围或精神的情况下，可在本发明中进行各种修改和变化。考虑到本文公开的本发明的说明书和实践，本发明的其他实施方案对于本领域技术人员将是显而易见的。说明书和实施例仅认为是示例性的，而本发明的真实范围和精神由下列权利要求指示。
序列表
<110> 辉瑞公司
加利福尼亚大学董事会
<120> 抗-αvβ8抗体和组合物及其用途
<130> PC72413A
<140>
<141>
<150> 62/728,688
<151> 2018-09-07
<150> 62/890,945
<151> 2019-08-23
<160> 197
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1392
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 1
atgggatgga gctgtatcat cctcttcttg gtagcaacag ctacaggcgt gcactccgag 60
gtgcagctgg tggaaagcgg aggaggcctg gtgcagcctg gaggaagcct gaggctgagc 120
tgtgccgcca gcggcttcaa catcaaggac tactacatga actgggtgag gcaggcccct 180
ggcaaaggac tggagtgggt gggctggatc gaccccgacc agggcaacac catctacgag 240
cccaagttcc agggcaggtt caccatcagc gccgacacca gcaagaacag cgcctacctg 300
cagatgaact ccctgagggc cgaggacacc gccgtgtact actgcgccag gaggctgctg 360
atggactact ggggccaggg cacactggtc accgtctcct cagcctccac caagggccca 420
tcggtcttcc ccctggcacc ctcctccaag agcacctctg ggggcacagc ggccctgggc 480
tgcctggtca aggactactt ccccgaaccg gtgacggtgt cgtggaactc aggcgccctg 540
accagcggcg tgcacacctt cccggctgtc ctacagtcct caggactcta ctccctcagc 600
agcgtggtga ccgtgccctc cagcagcttg ggcacccaga cctacatctg caacgtgaat 660
cacaagccca gcaacaccaa ggtggacaag aaagttgagc ccaaatcttg tgacaaaact 720
cacacatgcc caccgtgccc agcacctgaa gccgctgggg caccgtcagt cttcctcttc 780
cccccaaaac ccaaggacac cctcatgatc tcccggaccc ctgaggtcac atgcgtggtg 840
gtggacgtga gccacgaaga ccctgaggtc aagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag 900
gtgcataatg ccaagacaaa gccgcgggag gagcagtaca acagcacgta ccgtgtggtc 960
agcgtcctca ccgtcctgca ccaggactgg ctgaatggca aggagtacaa gtgcaaggtc 1020
tccaacaaag ccctcccagc ccccatcgag aaaaccatct ccaaagccaa agggcagccc 1080
cgagaaccac aggtgtacac cctgccccca tcccgggagg agatgaccaa gaaccaggtc 1140
agcctgacct gcctggtcaa aggcttctat cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc 1200
aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc acgcctcccg tgctggactc cgacggctcc 1260
ttcttcctct atagcaagct caccgtggac aagagcaggt ggcagcaggg gaacgtcttc 1320
tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac aaccactaca cgcagaagag cctctccctg 1380
tcccccggaa aa 1392
<210> 2
<211> 445
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 2
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Trp Ile Asp Pro Asp Gln Gly Asn Thr Ile Tyr Glu Pro Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Ser Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Leu Leu Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro
115 120 125
Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val
130 135 140
Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala
145 150 155 160
Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly
165 170 175
Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly
180 185 190
Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys
195 200 205
Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys
210 215 220
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu
225 230 235 240
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
245 250 255
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys
260 265 270
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
275 280 285
Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
290 295 300
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
305 310 315 320
Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
325 330 335
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
340 345 350
Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
355 360 365
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
370 375 380
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
385 390 395 400
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
405 410 415
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
420 425 430
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 3
<211> 444
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 3
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Trp Ile Asp Pro Asp Gln Gly Asn Thr Ile Tyr Glu Pro Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Ser Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Leu Leu Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro
115 120 125
Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val
130 135 140
Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala
145 150 155 160
Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly
165 170 175
Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly
180 185 190
Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys
195 200 205
Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys
210 215 220
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu
225 230 235 240
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
245 250 255
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys
260 265 270
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
275 280 285
Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
290 295 300
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
305 310 315 320
Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
325 330 335
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
340 345 350
Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
355 360 365
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
370 375 380
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
385 390 395 400
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
405 410 415
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
420 425 430
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440
<210> 4
<211> 714
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 4
atgggatgga gctgtatcat cctcttcttg gtagcaacag ctacaggcgt gcactccgac 60
atccagatga cccagtcccc ttccagcctg agcgcttccg tgggcgacag ggtgaccatc 120
acctgcaggt ccaccaagtc cctgtcccac ttcaacggca acacctacct gttctggtac 180
cagcagaagc ccggcaaggc ccccaagagg ctgatctact acatgtcctc cctggcctcc 240
ggagtgccct ccaggttctc cggatccggc tccggcaccg acttcaccct gaccatctcc 300
tccctgcagc ccgaggattt cgccacctac tactgccagc agtccctgga gtaccccttc 360
accttcggcg gcggcaccaa ggtggagatc aaacgaactg tggctgcacc atctgtcttc 420
atcttcccgc catctgatga gcagttgaaa tctggaactg cctctgttgt gtgcctgctg 480
aataacttct atcccagaga ggccaaagta cagtggaagg tggataacgc cctccaatcg 540
ggtaactccc aggagagtgt cacagagcag gacagcaagg acagcaccta cagcctcagc 600
agcaccctga cgctgagcaa agcagactac gagaaacaca aagtctacgc ctgcgaagtc 660
acccatcagg gcctgagctc gcccgtcaca aagagcttca acaggggaga gtgt 714
<210> 5
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 5
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Thr Lys Ser Leu Ser His Phe
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Phe Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala
35 40 45
Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Tyr Met Ser Ser Leu Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
65 70 75 80
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser
85 90 95
Leu Glu Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 6
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 6
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Trp Ile Asp Pro Asp Gln Gly Asn Thr Ile Tyr Glu Pro Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Ser Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Leu Leu Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 7
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 7
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Thr Lys Ser Leu Ser His Phe
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Phe Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala
35 40 45
Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Tyr Met Ser Ser Leu Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
65 70 75 80
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser
85 90 95
Leu Glu Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 8
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 8
Asp Tyr Tyr Met Asn
1 5
<210> 9
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 9
Trp Ile Asp Pro Asp Gln Gly Asn Thr Ile Tyr Glu Pro Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 10
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 10
Arg Leu Leu Met Asp Tyr
1 5
<210> 11
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 11
Arg Ser Thr Lys Ser Leu Ser His Phe Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Phe
1 5 10 15
<210> 12
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 12
Tyr Tyr Met Ser Ser Leu Ala Ser
1 5
<210> 13
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 13
Gln Gln Ser Leu Glu Tyr Pro Phe Thr
1 5
<210> 14
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 14
Gly Phe Asn Ile Lys Asp Tyr Tyr Met Asn
1 5 10
<210> 15
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 15
Trp Ile Asp Pro Asp Gln Gly Asn
1 5
<210> 16
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 16
Arg Leu Leu Met Asp Tyr
1 5
<210> 17
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 17
Ser Thr Lys Ser Leu Ser His Phe Asn Gly Asn Thr Tyr Leu
1 5 10
<210> 18
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 18
Tyr Tyr Met Ser Ser
1 5
<210> 19
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 19
Gln Ser Leu Glu Tyr Pro Phe Thr
1 5
<210> 20
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 20
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Phe Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Asn Trp Val Leu Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Trp Ile Asp Pro Asp Asn Gly Asn Thr Ile Tyr Asp Pro Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Lys Ala Ser Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Leu Leu Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 21
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 21
Asp Ile Val Met Thr Gln Ala Ala Pro Ser Val Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Ser Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Thr Lys Ser Leu Leu His Phe
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Phe Trp Phe Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Arg Leu Ile Tyr Tyr Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Arg Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ser
85 90 95
Leu Glu Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 22
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 22
Asp Tyr Tyr Met Asn
1 5
<210> 23
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 23
Trp Ile Asp Pro Asp Asn Gly Asn Thr Ile Tyr Asp Pro Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 24
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 24
Arg Leu Leu Met Asp Tyr
1 5
<210> 25
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 25
Arg Ser Thr Lys Ser Leu Leu His Phe Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Phe
1 5 10 15
<210> 26
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 26
Tyr Tyr Met Ser Asn Leu Ala Ser
1 5
<210> 27
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 27
Met Gln Ser Leu Glu Tyr Pro Phe Thr
1 5
<210> 28
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 28
Gly Phe Asn Ile Lys Asp Tyr Tyr Met Asn
1 5 10
<210> 29
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 29
Trp Ile Asp Pro Asp Asn Gly Asn
1 5
<210> 30
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 30
Arg Leu Leu Met Asp Tyr
1 5
<210> 31
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 31
Ser Thr Lys Ser Leu Leu His Phe Asn Gly Asn Thr Tyr Leu
1 5 10
<210> 32
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 32
Tyr Tyr Met Ser Asn
1 5
<210> 33
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 33
Gln Ser Leu Glu Tyr Pro Phe Thr
1 5
<210> 34
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 34
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Trp Ile Asp Pro Asp Asn Gly Asn Thr Ile Tyr Asp Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Leu Leu Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 35
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 35
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Trp Ile Asp Pro Asp Asn Gly Asn Thr Ile Tyr Asp Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Leu Leu Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 36
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 36
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Trp Ile Asp Pro Asp Asn Gly Asn Thr Ile Tyr Asp Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Leu Leu Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 37
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 37
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Trp Ile Asp Pro Asp Asn Gly Asn Thr Ile Tyr Asp Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Leu Leu Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 38
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 38
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Trp Ile Asp Pro Asp Asn Gly Asn Thr Ile Tyr Asp Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Leu Leu Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 39
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 39
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Trp Ile Asp Pro Asp Asn Gly Asn Thr Ile Tyr Asp Pro Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Ser Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Leu Leu Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 40
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 40
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Trp Ile Asp Pro Asp Asn Gly Asn Thr Ile Tyr Glu Pro Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Ser Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Leu Leu Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 41
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 41
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Trp Ile Asp Pro Asp Gln Gly Asn Thr Ile Tyr Asp Pro Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Ser Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Leu Leu Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 42
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 42
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Gln Ile Lys Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Trp Ile Asp Pro Asp Gln Gly Asn Thr Ile Tyr Asp Pro Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Ser Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Leu Leu Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 43
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 43
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Ala Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Trp Ile Asp Pro Asp Asn Gly Asn Thr Ile Tyr Asp Pro Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Ser Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Leu Leu Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 44
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 44
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Trp Ile Asp Pro Asp Asn Gly Gln Thr Ile Tyr Asp Pro Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Ser Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Leu Leu Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 45
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 45
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Trp Ile Asp Pro Asp Asn Gly Asn Thr Ile Tyr Asp Ala Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Ser Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Leu Leu Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 46
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 46
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Trp Ile Asp Pro Asp Asn Gly Asn Thr Ile Tyr Asp Pro Ala Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Ser Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Leu Leu Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 47
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 47
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Thr Lys Ser Leu Leu His Phe
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Phe Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala
35 40 45
Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Tyr Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
65 70 75 80
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Met Gln Ser
85 90 95
Leu Glu Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 48
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 48
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Thr Lys Ser Ile Leu His Phe
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Phe Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala
35 40 45
Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Tyr Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
65 70 75 80
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Met Gln Ser
85 90 95
Leu Glu Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 49
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 49
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Thr Lys Ser Leu Ser His Phe
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Phe Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala
35 40 45
Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Tyr Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
65 70 75 80
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Met Gln Ser
85 90 95
Leu Glu Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 50
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 50
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Thr Lys Ser Leu Leu His Phe
20 25 30
Asn Gly Asn Ser Tyr Leu Phe Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala
35 40 45
Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Tyr Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
65 70 75 80
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Met Gln Ser
85 90 95
Leu Glu Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 51
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 51
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Thr Lys Ser Leu Leu His Phe
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Phe Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala
35 40 45
Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Ala Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
65 70 75 80
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Met Gln Ser
85 90 95
Leu Glu Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 52
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 52
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Thr Lys Ser Leu Leu His Phe
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Phe Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala
35 40 45
Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Tyr Ala Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
65 70 75 80
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Met Gln Ser
85 90 95
Leu Glu Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 53
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 53
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Thr Lys Ser Leu Leu His Phe
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Phe Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala
35 40 45
Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Tyr Met Ser Ser Leu Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
65 70 75 80
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Met Gln Ser
85 90 95
Leu Glu Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 54
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 54
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Thr Lys Ser Leu Leu His Phe
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Phe Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala
35 40 45
Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Tyr Met Ser Asn Leu Gln Ser Gly Val Pro
50 55 60
Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
65 70 75 80
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Met Gln Ser
85 90 95
Leu Glu Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 55
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 55
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Thr Lys Ser Leu Leu His Phe
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Phe Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala
35 40 45
Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Tyr Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
65 70 75 80
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser
85 90 95
Leu Glu Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 56
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 56
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Thr Lys Ser Leu Leu His Phe
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Phe Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala
35 40 45
Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Tyr Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
65 70 75 80
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Met Gln Ser
85 90 95
Tyr Glu Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 57
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 57
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Thr Lys Ser Leu Leu His Phe
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Phe Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala
35 40 45
Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Tyr Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
65 70 75 80
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Met Gln Ser
85 90 95
Leu Ser Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 58
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 58
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Thr Lys Ser Leu Leu His Phe
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Phe Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala
35 40 45
Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Tyr Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
65 70 75 80
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Met Gln Ser
85 90 95
Leu Glu Thr Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 59
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 59
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Thr Lys Ser Leu Leu His Phe
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Phe Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala
35 40 45
Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Tyr Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
65 70 75 80
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Met Gln Ser
85 90 95
Leu Glu Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 60
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 60
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Thr Lys Ser Leu Leu His Phe
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Phe Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala
35 40 45
Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Tyr Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
65 70 75 80
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Met Gln Ser
85 90 95
Leu Glu Tyr Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 61
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 61
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Thr Lys Ser Leu Leu His Phe
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Phe Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala
35 40 45
Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Tyr Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
65 70 75 80
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Met Gln Ser
85 90 95
Leu Glu Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 62
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 62
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Thr Lys Ser Leu Leu His Phe
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Phe Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Tyr Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ser
85 90 95
Leu Glu Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 63
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 63
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Thr Lys Ser Leu Leu His Phe
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Phe Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Tyr Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ser
85 90 95
Leu Glu Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 64
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 64
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ser Thr Lys Ser Leu Leu His Phe
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Phe Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
65 70 75 80
Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ser
85 90 95
Leu Glu Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 65
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 65
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Thr Lys Ser Leu Leu His Phe
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Phe Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
65 70 75 80
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Met Gln Ser
85 90 95
Leu Glu Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 66
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 66
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ser Thr Lys Ser Leu Leu His Phe
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Phe Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala
35 40 45
Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Tyr Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro
50 55 60
Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
65 70 75 80
Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ser
85 90 95
Leu Glu Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 67
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 67
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Thr Lys Ser Leu Ser His Phe
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Phe Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala
35 40 45
Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Tyr Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
65 70 75 80
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser
85 90 95
Leu Glu Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 68
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 68
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Thr Lys Ser Leu Ser His Phe
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Phe Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala
35 40 45
Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Tyr Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
65 70 75 80
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Met Gln Ser
85 90 95
Tyr Glu Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 69
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 69
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Thr Lys Ser Leu Ser His Phe
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Phe Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala
35 40 45
Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Tyr Ala Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
65 70 75 80
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser
85 90 95
Leu Glu Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 70
<211> 325
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 70
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Thr Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro
100 105 110
Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
115 120 125
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
130 135 140
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
145 150 155 160
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser
165 170 175
Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu
180 185 190
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala
195 200 205
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
210 215 220
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
225 230 235 240
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
245 250 255
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
260 265 270
Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
275 280 285
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
290 295 300
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
305 310 315 320
Leu Ser Pro Gly Lys
325
<210> 71
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 71
Arg Ser Thr Lys Ser Leu Leu His Phe Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Phe
1 5 10 15
<210> 72
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 72
Tyr Tyr Met Ser Asn Leu Ala Ser
1 5
<210> 73
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 73
Met Gln Ser Leu Glu Tyr Pro Phe Thr
1 5
<210> 74
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 74
Ser Thr Lys Ser Leu Leu His Phe Asn Gly Asn Thr Tyr Leu
1 5 10
<210> 75
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 75
Tyr Tyr Met Ser Asn
1 5
<210> 76
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 76
Gln Ser Leu Glu Tyr Pro Phe Thr
1 5
<210> 77
<211> 1002
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 77
Met Leu Leu Gly Thr Leu Leu Leu Ile Leu Tyr Ile Leu Met Leu Cys
1 5 10 15
Arg Met Phe Leu Leu Val Gly Ala Pro Lys Ala Asn Thr Thr Gln Pro
20 25 30
Gly Ile Val Glu Gly Gly Gln Val Leu Lys Cys Asp Trp Ser Ser Thr
35 40 45
Arg Arg Cys Gln Pro Ile Glu Phe Asp Ala Thr Gly Asn Arg Asp Tyr
50 55 60
Ala Lys Asp Asp Pro Leu Glu Phe Lys Ser His Gln Trp Phe Gly Ala
65 70 75 80
Ser Val Arg Ser Lys Gln Asp Lys Ile Leu Ala Cys Ala Pro Leu Tyr
85 90 95
His Trp Arg Thr Glu Met Lys Gln Glu Arg Glu Pro Val Gly Thr Cys
100 105 110
Phe Leu Gln Asp Gly Thr Lys Thr Val Glu Tyr Ala Pro Cys Arg Ser
115 120 125
Gln Asp Ile Asp Ala Asp Gly Gln Gly Phe Cys Gln Gly Gly Phe Ser
130 135 140
Ile Asp Phe Thr Lys Ala Asp Arg Val Leu Leu Gly Gly Pro Gly Ser
145 150 155 160
Phe Tyr Trp Gln Gly Gln Leu Ile Ser Asp Gln Val Ala Glu Ile Val
165 170 175
Ser Lys Tyr Asp Pro Asn Val Tyr Ser Ile Lys Tyr Asn Asn Gln Leu
180 185 190
Ala Thr Arg Thr Ala Gln Ala Ile Phe Asp Asp Ser Tyr Leu Gly Tyr
195 200 205
Ser Val Ala Val Gly Asp Phe Asn Gly Asp Gly Ile Asp Asp Phe Val
210 215 220
Ser Gly Val Pro Arg Ala Ala Arg Thr Leu Gly Met Val Tyr Ile Tyr
225 230 235 240
Asp Gly Lys Asn Met Ser Ser Leu Tyr Asn Phe Thr Gly Glu Gln Met
245 250 255
Ala Ala Tyr Phe Gly Phe Ser Val Ala Ala Thr Asp Ile Asn Gly Asp
260 265 270
Asp Tyr Ala Asp Val Phe Ile Gly Ala Pro Leu Phe Met Asp Arg Gly
275 280 285
Ser Asp Gly Lys Leu Gln Glu Val Gly Gln Val Ser Val Ser Leu Gln
290 295 300
Arg Ala Ser Gly Asp Phe Gln Thr Thr Lys Leu Asn Gly Phe Glu Val
305 310 315 320
Phe Ala Arg Phe Gly Ser Ala Ile Ala Pro Leu Gly Asp Leu Asp Gln
325 330 335
Asp Gly Phe Asn Asp Ile Ala Ile Ala Ala Pro Tyr Gly Gly Glu Asp
340 345 350
Lys Lys Gly Ile Val Tyr Ile Phe Asn Gly Arg Ser Thr Gly Leu Asn
355 360 365
Ala Val Pro Ser Gln Ile Leu Glu Gly Gln Trp Ala Ala Arg Ser Met
370 375 380
Pro Pro Ser Phe Gly Tyr Ser Met Lys Gly Ala Thr Asp Ile Asp Lys
385 390 395 400
Asn Gly Tyr Pro Asp Leu Ile Val Gly Ala Phe Gly Val Asp Arg Ala
405 410 415
Ile Leu Tyr Arg Ala Arg Pro Val Ile Thr Val Asn Ala Gly Leu Glu
420 425 430
Val Tyr Pro Ser Ile Leu Asn Gln Asp Asn Lys Thr Cys Ser Leu Pro
435 440 445
Gly Thr Ala Leu Lys Val Ser Cys Phe Asn Val Arg Phe Cys Leu Lys
450 455 460
Ala Asp Gly Lys Gly Val Leu Pro Arg Lys Leu Asn Phe Gln Val Glu
465 470 475 480
Leu Leu Leu Asp Lys Leu Lys Gln Lys Gly Ala Ile Arg Arg Ala Leu
485 490 495
Phe Leu Tyr Ser Arg Ser Pro Ser His Ser Lys Asn Met Thr Ile Ser
500 505 510
Arg Gly Gly Leu Met Gln Cys Glu Glu Leu Ile Ala Tyr Leu Arg Asp
515 520 525
Glu Ser Glu Phe Arg Asp Lys Leu Thr Pro Ile Thr Ile Phe Met Glu
530 535 540
Tyr Arg Leu Asp Tyr Arg Thr Ala Ala Asp Thr Thr Gly Leu Gln Pro
545 550 555 560
Ile Leu Asn Gln Phe Thr Pro Ala Asn Ile Ser Arg Gln Ala His Ile
565 570 575
Leu Leu Asp Cys Gly Glu Asp Asn Val Cys Lys Pro Lys Leu Glu Val
580 585 590
Ser Val Asp Ser Asp Gln Lys Lys Ile Tyr Ile Gly Asp Asp Asn Pro
595 600 605
Leu Thr Leu Ile Val Lys Ala Gln Asn Gln Gly Glu Gly Ala Tyr Glu
610 615 620
Ala Glu Leu Ile Val Ser Ile Pro Leu Gln Ala Asp Phe Ile Gly Val
625 630 635 640
Val Arg Asn Asn Glu Ala Leu Ala Arg Leu Ser Cys Ala Phe Lys Thr
645 650 655
Glu Asn Gln Thr Arg Gln Val Val Cys Asp Leu Gly Asn Pro Met Lys
660 665 670
Ala Gly Thr Gln Leu Leu Ala Gly Leu Arg Phe Ser Val His Gln Gln
675 680 685
Ser Glu Met Asp Thr Ser Val Lys Phe Asp Leu Gln Ile Gln Ser Ser
690 695 700
Asn Leu Phe Asp Lys Val Ser Pro Val Val Ser His Lys Val Asp Leu
705 710 715 720
Ala Val Leu Ala Ala Val Glu Ile Arg Gly Val Ser Ser Pro Asp His
725 730 735
Ile Phe Leu Pro Ile Pro Asn Trp Glu His Lys Glu Asn Pro Glu Thr
740 745 750
Glu Glu Asp Val Gly Pro Val Val Gln His Ile Tyr Glu Leu Arg Asn
755 760 765
Asn Gly Pro Ser Ser Phe Ser Lys Ala Met Leu His Leu Gln Trp Pro
770 775 780
Tyr Lys Tyr Asn Asn Asn Thr Leu Leu Tyr Ile Leu His Tyr Asp Ile
785 790 795 800
Asp Gly Pro Met Asn Cys Thr Ser Asp Met Glu Ile Asn Pro Leu Arg
805 810 815
Ile Lys Ile Ser Ser Leu Gln Thr Thr Glu Lys Asn Asp Thr Val Ala
820 825 830
Gly Gln Gly Glu Arg Asp His Leu Ile Thr Lys Arg Asp Leu Ala Leu
835 840 845
Ser Glu Gly Asp Ile His Thr Leu Gly Cys Gly Val Ala Gln Cys Leu
850 855 860
Lys Ile Val Cys Gln Val Gly Arg Leu Asp Arg Gly Lys Ser Ala Ile
865 870 875 880
Leu Tyr Val Lys Ser Leu Leu Trp Thr Glu Thr Phe Met Asn Lys Glu
885 890 895
Asn Gln Asn His Ser Tyr Ser Leu Lys Ser Ser Ala Ser Phe Asn Val
900 905 910
Ile Glu Phe Pro Tyr Lys Asn Leu Pro Ile Glu Asp Ile Thr Asn Ser
915 920 925
Thr Leu Val Thr Thr Asn Val Thr Trp Gly Ile Gln Pro Ala Pro Met
930 935 940
Pro Val Pro Val Trp Val Ile Ile Leu Ala Val Leu Ala Gly Leu Leu
945 950 955 960
Leu Leu Ala Val Leu Val Phe Val Met Tyr Arg Met Gly Phe Phe Lys
965 970 975
Arg Val Arg Pro Pro Gln Glu Glu Gln Glu Arg Glu Gln Leu Gln Pro
980 985 990
His Glu Asn Gly Glu Gly Asn Ser Glu Thr
995 1000
<210> 78
<211> 769
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 78
Met Cys Gly Ser Ala Leu Ala Phe Phe Thr Ala Ala Phe Val Cys Leu
1 5 10 15
Gln Asn Asp Arg Arg Gly Pro Ala Ser Phe Leu Trp Ala Ala Trp Val
20 25 30
Phe Ser Leu Val Leu Gly Leu Gly Gln Gly Glu Asp Asn Arg Cys Ala
35 40 45
Ser Ser Asn Ala Ala Ser Cys Ala Arg Cys Leu Ala Leu Gly Pro Glu
50 55 60
Cys Gly Trp Cys Val Gln Glu Asp Phe Ile Ser Gly Gly Ser Arg Ser
65 70 75 80
Glu Arg Cys Asp Ile Val Ser Asn Leu Ile Ser Lys Gly Cys Ser Val
85 90 95
Asp Ser Ile Glu Tyr Pro Ser Val His Val Ile Ile Pro Thr Glu Asn
100 105 110
Glu Ile Asn Thr Gln Val Thr Pro Gly Glu Val Ser Ile Gln Leu Arg
115 120 125
Pro Gly Ala Glu Ala Asn Phe Met Leu Lys Val His Pro Leu Lys Lys
130 135 140
Tyr Pro Val Asp Leu Tyr Tyr Leu Val Asp Val Ser Ala Ser Met His
145 150 155 160
Asn Asn Ile Glu Lys Leu Asn Ser Val Gly Asn Asp Leu Ser Arg Lys
165 170 175
Met Ala Phe Phe Ser Arg Asp Phe Arg Leu Gly Phe Gly Ser Tyr Val
180 185 190
Asp Lys Thr Val Ser Pro Tyr Ile Ser Ile His Pro Glu Arg Ile His
195 200 205
Asn Gln Cys Ser Asp Tyr Asn Leu Asp Cys Met Pro Pro His Gly Tyr
210 215 220
Ile His Val Leu Ser Leu Thr Glu Asn Ile Thr Glu Phe Glu Lys Ala
225 230 235 240
Val His Arg Gln Lys Ile Ser Gly Asn Ile Asp Thr Pro Glu Gly Gly
245 250 255
Phe Asp Ala Met Leu Gln Ala Ala Val Cys Glu Ser His Ile Gly Trp
260 265 270
Arg Lys Glu Ala Lys Arg Leu Leu Leu Val Met Thr Asp Gln Thr Ser
275 280 285
His Leu Ala Leu Asp Ser Lys Leu Ala Gly Ile Val Val Pro Asn Asp
290 295 300
Gly Asn Cys His Leu Lys Asn Asn Val Tyr Val Lys Ser Thr Thr Met
305 310 315 320
Glu His Pro Ser Leu Gly Gln Leu Ser Glu Lys Leu Ile Asp Asn Asn
325 330 335
Ile Asn Val Ile Phe Ala Val Gln Gly Lys Gln Phe His Trp Tyr Lys
340 345 350
Asp Leu Leu Pro Leu Leu Pro Gly Thr Ile Ala Gly Glu Ile Glu Ser
355 360 365
Lys Ala Ala Asn Leu Asn Asn Leu Val Val Glu Ala Tyr Gln Lys Leu
370 375 380
Ile Ser Glu Val Lys Val Gln Val Glu Asn Gln Val Gln Gly Ile Tyr
385 390 395 400
Phe Asn Ile Thr Ala Ile Cys Pro Asp Gly Ser Arg Lys Pro Gly Met
405 410 415
Glu Gly Cys Arg Asn Val Thr Ser Asn Asp Glu Val Leu Phe Asn Val
420 425 430
Thr Val Thr Met Lys Lys Cys Asp Val Thr Gly Gly Lys Asn Tyr Ala
435 440 445
Ile Ile Lys Pro Ile Gly Phe Asn Glu Thr Ala Lys Ile His Ile His
450 455 460
Arg Asn Cys Ser Cys Gln Cys Glu Asp Asn Arg Gly Pro Lys Gly Lys
465 470 475 480
Cys Val Asp Glu Thr Phe Leu Asp Ser Lys Cys Phe Gln Cys Asp Glu
485 490 495
Asn Lys Cys His Phe Asp Glu Asp Gln Phe Ser Ser Glu Ser Cys Lys
500 505 510
Ser His Lys Asp Gln Pro Val Cys Ser Gly Arg Gly Val Cys Val Cys
515 520 525
Gly Lys Cys Ser Cys His Lys Ile Lys Leu Gly Lys Val Tyr Gly Lys
530 535 540
Tyr Cys Glu Lys Asp Asp Phe Ser Cys Pro Tyr His His Gly Asn Leu
545 550 555 560
Cys Ala Gly His Gly Glu Cys Glu Ala Gly Arg Cys Gln Cys Phe Ser
565 570 575
Gly Trp Glu Gly Asp Arg Cys Gln Cys Pro Ser Ala Ala Ala Gln His
580 585 590
Cys Val Asn Ser Lys Gly Gln Val Cys Ser Gly Arg Gly Thr Cys Val
595 600 605
Cys Gly Arg Cys Glu Cys Thr Asp Pro Arg Ser Ile Gly Arg Phe Cys
610 615 620
Glu His Cys Pro Thr Cys Tyr Thr Ala Cys Lys Glu Asn Trp Asn Cys
625 630 635 640
Met Gln Cys Leu His Pro His Asn Leu Ser Gln Ala Ile Leu Asp Gln
645 650 655
Cys Lys Thr Ser Cys Ala Leu Met Glu Gln Gln His Tyr Val Asp Gln
660 665 670
Thr Ser Glu Cys Phe Ser Ser Pro Ser Tyr Leu Arg Ile Phe Phe Ile
675 680 685
Ile Phe Ile Val Thr Phe Leu Ile Gly Leu Leu Lys Val Leu Ile Ile
690 695 700
Arg Gln Val Ile Leu Gln Trp Asn Ser Asn Lys Ile Lys Ser Ser Ser
705 710 715 720
Asp Tyr Arg Val Ser Ala Ser Lys Lys Asp Lys Leu Ile Leu Gln Ser
725 730 735
Val Cys Thr Arg Ala Val Thr Tyr Arg Arg Glu Lys Pro Glu Glu Ile
740 745 750
Lys Met Asp Ile Ser Lys Leu Asn Ala His Glu Thr Phe Arg Cys Asn
755 760 765
Phe
<210> 79
<211> 1044
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 79
Met Ala Ala Pro Gly Arg Leu Leu Leu Arg Pro Arg Pro Gly Gly Leu
1 5 10 15
Leu Leu Leu Leu Pro Gly Leu Leu Leu Pro Leu Ala Asp Ala Phe Asn
20 25 30
Leu Asp Val Glu Ser Pro Ala Glu Tyr Ala Gly Pro Glu Gly Ser Tyr
35 40 45
Phe Gly Phe Ala Val Asp Phe Phe Glu Pro Ser Thr Ser Ser Arg Met
50 55 60
Phe Leu Leu Val Gly Ala Pro Lys Ala Asn Thr Thr Gln Pro Gly Ile
65 70 75 80
Val Glu Gly Gly Gln Val Leu Lys Cys Glu Cys Ser Ser Ser Arg Arg
85 90 95
Cys Gln Pro Ile Glu Phe Asp Ser Thr Gly Asn Arg Asp Tyr Ala Lys
100 105 110
Asp Asp Pro Leu Glu Phe Lys Ser His Gln Trp Phe Gly Ala Ser Val
115 120 125
Arg Ser Lys Gln Asp Lys Ile Leu Ala Cys Ala Pro Leu Tyr His Trp
130 135 140
Arg Thr Glu Met Lys Gln Glu Arg Glu Pro Val Gly Thr Cys Phe Leu
145 150 155 160
Gln Asp Gly Thr Lys Thr Val Glu Tyr Ala Pro Cys Arg Ser Lys Asn
165 170 175
Ile Asp Ala Asp Gly Gln Gly Phe Cys Gln Gly Gly Phe Ser Ile Asp
180 185 190
Phe Thr Lys Ala Asp Arg Val Leu Leu Gly Gly Pro Gly Ser Phe Tyr
195 200 205
Trp Gln Gly Gln Leu Ile Ser Asp Gln Val Ala Glu Ile Ile Ser Lys
210 215 220
Tyr Asp Pro Asn Val Tyr Ser Ile Lys Tyr Asn Asn Gln Leu Ala Thr
225 230 235 240
Arg Thr Ala Gln Ala Ile Phe Asp Asp Ser Tyr Leu Gly Tyr Ser Val
245 250 255
Ala Val Gly Asp Phe Asn Gly Asp Gly Ile Glu Asp Phe Val Ser Gly
260 265 270
Val Pro Arg Ala Ala Arg Thr Leu Gly Met Val Tyr Ile Tyr Asp Gly
275 280 285
Lys Asn Met Ser Ser Leu His Asn Phe Thr Gly Glu Gln Met Ala Ala
290 295 300
Tyr Phe Gly Phe Ser Val Ala Ala Thr Asp Ile Asn Gly Asp Asp Tyr
305 310 315 320
Ala Asp Val Phe Ile Gly Ala Pro Leu Phe Met Asp Arg Gly Ser Asp
325 330 335
Gly Lys Leu Gln Glu Val Gly Gln Val Ser Val Ser Leu Gln Arg Ala
340 345 350
Val Gly Asp Phe Gln Thr Thr Lys Leu Asn Gly Phe Glu Val Phe Ala
355 360 365
Arg Phe Gly Ser Ala Ile Ala Pro Leu Gly Asp Leu Asp Gln Asp Gly
370 375 380
Phe Asn Asp Ile Ala Ile Ala Ala Pro Tyr Gly Gly Glu Asp Lys Lys
385 390 395 400
Gly Leu Val Tyr Ile Phe Asn Gly Arg Ser Thr Gly Leu Asn Ser Val
405 410 415
Pro Ser Gln Ile Leu Glu Gly Gln Trp Ala Ala Gln Ser Met Pro Pro
420 425 430
Ser Phe Gly Tyr Ser Met Lys Gly Ala Thr Asp Val Asp Arg Asn Gly
435 440 445
Tyr Pro Asp Leu Val Val Gly Ala Phe Gly Val Asp Arg Ala Val Leu
450 455 460
Tyr Arg Ala Arg Pro Val Val Thr Val Asn Ala Gly Leu Glu Val Tyr
465 470 475 480
Pro Ser Ile Leu Asn Gln Asp Asn Lys Ile Cys Pro Leu Pro Gly Thr
485 490 495
Ala Leu Lys Val Ser Cys Phe Asn Val Arg Phe Cys Leu Lys Ala Asp
500 505 510
Gly Lys Gly Thr Leu Pro Arg Lys Leu His Phe Gln Val Glu Leu Leu
515 520 525
Leu Asp Lys Leu Lys Gln Lys Gly Ala Ile Arg Arg Ala Leu Phe Leu
530 535 540
His Asn Arg Ser Pro Val His Ser Lys Thr Met Thr Val Phe Arg Gly
545 550 555 560
Gly Gln Met Gln Cys Glu Glu Leu Val Ala Tyr Leu Arg Asp Glu Ser
565 570 575
Glu Phe Arg Asp Lys Leu Thr Pro Ile Thr Ile Phe Met Glu Tyr Arg
580 585 590
Leu Asp Gln Arg Thr Ala Ala Asp Ala Thr Gly Leu Gln Pro Ile Leu
595 600 605
Asn Gln Phe Thr Pro Ala Asn Val Ser Arg Gln Ala His Ile Leu Leu
610 615 620
Asp Cys Gly Glu Asp Asn Val Cys Lys Pro Lys Leu Glu Val Ser Val
625 630 635 640
Asn Ser Asp Gln Lys Lys Ile Tyr Ile Gly Asp Asp Asn Pro Leu Thr
645 650 655
Leu Thr Val Lys Ala Gln Asn Gln Gly Glu Gly Ala Tyr Glu Ala Glu
660 665 670
Leu Ile Val Ser Ile Pro Pro Gln Ala Asp Phe Ile Gly Val Val Arg
675 680 685
Asn Asn Glu Ala Leu Ala Arg Leu Ser Cys Ala Phe Lys Thr Glu Asn
690 695 700
Gln Thr Arg Gln Val Val Cys Asp Leu Gly Asn Pro Met Lys Ala Gly
705 710 715 720
Thr Gln Leu Leu Ala Gly Leu Arg Phe Ser Val His Gln Gln Ser Glu
725 730 735
Met Asp Thr Ser Val Lys Phe Asp Leu Lys Ile Gln Ser Ser Asn Ser
740 745 750
Phe Asp Asn Val Ser Pro Val Val Ser Tyr Lys Val Asp Leu Ala Val
755 760 765
Leu Ala Ala Val Glu Ile Arg Gly Val Ser Ser Pro Asp His Ile Phe
770 775 780
Leu Pro Ile Pro Asn Trp Glu Tyr Lys Glu Asn Pro Glu Thr Glu Glu
785 790 795 800
Asp Val Gly Pro Ile Val Gln His Ile Tyr Glu Leu Arg Asn Asn Gly
805 810 815
Pro Ser Ser Phe Ser Lys Ala Ile Leu Asn Leu Gln Trp Pro Tyr Lys
820 825 830
Tyr Asn Asn Asn Thr Leu Leu Tyr Ile Leu His Tyr Asp Ile Asp Gly
835 840 845
Pro Met Asn Cys Thr Ala Asp Thr Glu Ile Asn Pro Leu Arg Ile Lys
850 855 860
Thr Pro Glu Lys Asn Asp Thr Ala Ala Ala Gly Gln Gly Glu Arg Asn
865 870 875 880
His Leu Ile Thr Lys Arg Asp Leu Thr Leu Arg Glu Gly Asp Val His
885 890 895
Thr Leu Gly Cys Gly Ile Ala Lys Cys Leu Gln Ile Thr Cys Gln Val
900 905 910
Gly Arg Leu Asp Arg Gly Lys Ser Ala Ile Leu Tyr Val Lys Ser Leu
915 920 925
Leu Trp Thr Glu Thr Phe Met Asn Lys Glu Asn Gln Asn His Ser Tyr
930 935 940
Ser Leu Lys Ser Ser Ala Ser Phe Asn Ile Ile Glu Phe Pro Tyr Lys
945 950 955 960
Asn Leu Pro Ile Glu Asp Leu Phe Asn Ser Thr Leu Val Thr Thr Asn
965 970 975
Ile Thr Trp Gly Ile Gln Pro Ala Pro Met Pro Val Pro Val Trp Val
980 985 990
Ile Ile Leu Ala Val Leu Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala Val Leu Val
995 1000 1005
Phe Val Met Tyr Arg Met Gly Phe Phe Lys Arg Val Arg Pro Pro
1010 1015 1020
Gln Glu Glu Gln Glu Arg Glu Gln Leu Gln Pro His Glu Asn Gly
1025 1030 1035
Glu Gly Asn Ser Glu Thr
1040
<210> 80
<211> 767
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 80
Met Cys Gly Ser Ala Leu Ala Phe Leu Thr Ala Ala Leu Leu Ser Leu
1 5 10 15
His Asn Cys Gln Arg Gly Pro Ala Leu Val Leu Gly Ala Ala Trp Val
20 25 30
Phe Ser Leu Val Leu Gly Leu Gly Gln Ser Glu His Asn Arg Cys Gly
35 40 45
Ser Ala Asn Val Val Ser Cys Ala Arg Cys Leu Gln Leu Gly Pro Glu
50 55 60
Cys Gly Trp Cys Val Gln Glu Asp Phe Val Ser Gly Gly Ser Gly Ser
65 70 75 80
Glu Arg Cys Asp Thr Val Ser Ser Leu Ile Ser Lys Gly Cys Pro Val
85 90 95
Asp Ser Ile Glu Tyr Leu Ser Val His Val Val Thr Ser Ser Glu Asn
100 105 110
Glu Ile Asn Thr Gln Val Thr Pro Gly Glu Val Ser Val Gln Leu His
115 120 125
Pro Gly Ala Glu Ala Asn Phe Met Leu Lys Val Arg Pro Leu Lys Lys
130 135 140
Tyr Pro Val Asp Leu Tyr Tyr Leu Val Asp Val Ser Ala Ser Met His
145 150 155 160
Asn Asn Ile Glu Lys Leu Asn Ser Val Gly Asn Asp Leu Ser Lys Lys
165 170 175
Met Ala Leu Tyr Ser Arg Asp Phe Arg Leu Gly Phe Gly Ser Tyr Val
180 185 190
Asp Lys Thr Val Ser Pro Tyr Ile Ser Ile His Pro Glu Arg Ile His
195 200 205
Asn Gln Cys Ser Asp Tyr Asn Leu Asp Cys Met Pro Pro His Gly Tyr
210 215 220
Ile His Val Leu Ser Leu Thr Glu Asn Ile Thr Glu Phe Glu Lys Ala
225 230 235 240
Val His Arg Gln Lys Ile Ser Gly Asn Ile Asp Thr Pro Glu Gly Gly
245 250 255
Phe Asp Ala Met Leu Gln Ala Ala Val Cys Glu Ser His Ile Gly Trp
260 265 270
Arg Lys Glu Ala Lys Arg Leu Leu Leu Val Met Thr Asp Gln Thr Ser
275 280 285
His Leu Ala Leu Asp Ser Lys Leu Ala Gly Ile Val Val Pro Asn Asp
290 295 300
Gly Asn Cys His Leu Lys Asn Asn Val Tyr Val Lys Ser Thr Thr Met
305 310 315 320
Glu His Pro Ser Leu Gly Gln Leu Ser Glu Lys Leu Ile Asp Asn Asn
325 330 335
Ile Asn Val Ile Phe Ala Val Gln Gly Lys Gln Phe His Trp Tyr Lys
340 345 350
Asp Leu Leu Pro Leu Leu Pro Gly Ala Ile Ala Gly Glu Ile Glu Ser
355 360 365
Lys Ala Ala Asn Leu Asn Asn Leu Val Val Glu Ala Tyr Lys Lys Ile
370 375 380
Ile Ser Glu Val Lys Val Gln Leu Glu Asn Gln Val His Gly Val His
385 390 395 400
Phe Asn Ile Thr Ala Ile Cys Pro Asp Gly Ala Arg Lys Pro Gly Ile
405 410 415
Ser Gly Cys Gly Asn Val Thr Ser Asn Asp Glu Val Leu Phe Asn Val
420 425 430
Thr Val Val Met Lys Thr Cys Asp Ile Met Gly Gly Lys Asn Tyr Ala
435 440 445
Ile Ile Lys Pro Ile Gly Phe Asn Glu Thr Thr Lys Val His Ile His
450 455 460
Arg Ser Cys Ser Cys Gln Cys Glu Asn His Arg Gly Leu Lys Gly Gln
465 470 475 480
Cys Ala Glu Ala Ala Pro Asp Pro Lys Cys Pro Gln Cys Asp Asp Ser
485 490 495
Arg Cys His Phe Asp Glu Asp Gln Phe Pro Ser Glu Thr Cys Lys Pro
500 505 510
Gln Glu Asp Gln Pro Val Cys Ser Gly Arg Gly Val Cys Ile Cys Gly
515 520 525
Lys Cys Leu Cys His Lys Thr Lys Leu Gly Arg Val Tyr Gly Gln Tyr
530 535 540
Cys Glu Lys Asp Asp Phe Ser Cys Pro Tyr Leu His Gly Asp Val Cys
545 550 555 560
Ala Gly His Gly Glu Cys Glu Gly Gly Arg Cys Gln Cys Phe Ser Gly
565 570 575
Trp Glu Gly Asp Arg Cys Gln Cys Pro Ser Ala Ser Ala Gln His Cys
580 585 590
Val Asn Ser Lys Gly Gln Val Cys Ser Gly Arg Gly Thr Cys Val Cys
595 600 605
Gly Arg Cys Glu Cys Thr Asp Pro Arg Ser Ile Gly Arg Leu Cys Glu
610 615 620
His Cys Pro Thr Cys His Leu Ser Cys Ser Glu Asn Trp Asn Cys Leu
625 630 635 640
Gln Cys Leu His Pro His Asn Leu Ser Gln Ala Ala Leu Asp Gln Cys
645 650 655
Lys Ser Ser Cys Ala Val Met Glu Gln His Arg Met Asp Gln Thr Ser
660 665 670
Glu Cys Leu Ser Gly Pro Ser Tyr Leu Arg Ile Phe Phe Ile Ile Phe
675 680 685
Ile Val Thr Phe Leu Ile Gly Leu Leu Lys Val Leu Ile Ile Arg Gln
690 695 700
Val Ile Leu Gln Trp Asn Asn Asn Lys Ile Lys Ser Ser Ser Asp Tyr
705 710 715 720
Arg Met Ser Ala Ser Lys Lys Asp Lys Leu Ile Leu Gln Ser Val Cys
725 730 735
Thr Arg Ala Val Thr Tyr Arg Arg Glu Lys Pro Glu Glu Ile Lys Met
740 745 750
Asp Ile Ser Lys Leu Asn Ala Gln Glu Ala Phe Arg Cys Asn Phe
755 760 765
<210> 81
<211> 329
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 81
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
325
<210> 82
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 82
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 83
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 83
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 84
<211> 1048
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 84
Met Ala Ser Pro Pro Arg Arg Arg Leu Arg Leu Gly Pro Arg Gly Leu
1 5 10 15
Pro Leu Leu Leu Ser Gly Leu Leu Leu Pro Leu Cys Arg Ala Phe Asn
20 25 30
Leu Asp Val Asp Ser Pro Ala Glu Tyr Ser Gly Pro Glu Gly Ser Tyr
35 40 45
Phe Gly Phe Ala Val Asp Phe Phe Val Pro Ser Ala Ser Ser Arg Met
50 55 60
Phe Leu Leu Val Gly Ala Pro Lys Ala Asn Thr Thr Gln Pro Gly Ile
65 70 75 80
Val Glu Gly Gly Gln Val Leu Lys Cys Asp Trp Ser Ser Thr Arg Arg
85 90 95
Cys Gln Pro Ile Glu Phe Asp Ala Thr Gly Asn Arg Asp Tyr Ala Lys
100 105 110
Asp Asp Pro Leu Glu Phe Lys Ser His Gln Trp Phe Gly Ala Ser Val
115 120 125
Arg Ser Lys Gln Asp Lys Ile Leu Ala Cys Ala Pro Leu Tyr His Trp
130 135 140
Arg Thr Glu Leu Lys Gln Glu Arg Glu Pro Val Gly Thr Cys Phe Leu
145 150 155 160
Gln Asp Gly Thr Lys Thr Val Glu Tyr Ala Pro Cys Arg Ser Gln Asp
165 170 175
Ile Asp Ala Asp Gly Gln Gly Phe Cys Gln Gly Gly Phe Ser Ile Asp
180 185 190
Phe Thr Lys Ala Asp Arg Val Leu Leu Gly Gly Pro Gly Ser Phe Tyr
195 200 205
Trp Gln Gly Gln Leu Ile Ser Asp Gln Val Ala Glu Ile Val Ser Lys
210 215 220
Tyr Asp Pro Asn Val Tyr Ser Ile Lys Tyr Asn Asn Gln Leu Ala Thr
225 230 235 240
Arg Thr Ala Gln Ala Ile Phe Asp Asp Ser Tyr Leu Gly Tyr Ser Val
245 250 255
Ala Val Gly Asp Phe Asn Gly Asp Gly Ile Asp Asp Phe Val Ser Gly
260 265 270
Val Pro Arg Ala Ala Arg Thr Leu Gly Met Val Tyr Ile Tyr Asp Gly
275 280 285
Lys Asn Met Ser Ser Ile Tyr Asn Phe Thr Gly Asp Gln Met Ala Ala
290 295 300
Tyr Phe Gly Phe Ser Val Ala Ala Thr Asp Ile Asn Gly Asp Asp Tyr
305 310 315 320
Ala Asp Val Phe Ile Gly Ala Pro Leu Phe Met Asp Arg Gly Ser Asp
325 330 335
Gly Lys Leu Gln Glu Val Gly Gln Val Ser Val Ser Leu Gln Arg Ala
340 345 350
Ser Gly Asp Phe Gln Thr Thr Lys Leu Asn Gly Phe Glu Val Phe Ala
355 360 365
Arg Phe Gly Ser Ala Ile Ala Pro Leu Gly Asp Leu Asp Gln Asp Gly
370 375 380
Phe Asn Asp Ile Ala Ile Ala Ala Pro Tyr Gly Gly Glu Asp Lys Lys
385 390 395 400
Gly Ile Val Tyr Ile Phe Asn Gly Arg Ser Thr Gly Leu Asn Ala Val
405 410 415
Pro Ser Gln Ile Leu Glu Gly Gln Trp Ala Ala Arg Ser Met Pro Pro
420 425 430
Ser Phe Gly Tyr Ser Met Lys Gly Ala Thr Asp Ile Asp Lys Asn Gly
435 440 445
Tyr Pro Asp Leu Ile Val Gly Ala Phe Gly Val Asp Arg Ala Ile Leu
450 455 460
Tyr Arg Ala Arg Pro Val Ile Thr Val Asn Ala Gly Leu Glu Val Tyr
465 470 475 480
Pro Ser Ile Leu Asn Gln Asp Asn Lys Thr Cys Ser Leu Pro Gly Thr
485 490 495
Ala Leu Lys Val Ser Cys Phe Asn Val Arg Phe Cys Leu Lys Ala Asp
500 505 510
Gly Lys Gly Val Leu Pro Arg Lys Leu Asn Phe Gln Val Glu Leu Leu
515 520 525
Leu Asp Lys Leu Lys Gln Lys Gly Ala Ile Arg Arg Ala Leu Phe Leu
530 535 540
Tyr Ser Arg Ser Pro Ser His Ser Lys Asn Met Thr Ile Ser Arg Gly
545 550 555 560
Gly Leu Met Gln Cys Glu Glu Leu Ile Ala Tyr Leu Arg Asp Glu Ser
565 570 575
Glu Phe Arg Asp Lys Leu Thr Pro Ile Thr Ile Phe Met Glu Tyr Trp
580 585 590
Leu Asp Tyr Arg Thr Ala Ala Asp Thr Thr Gly Leu Gln Pro Ile Leu
595 600 605
Asn Gln Phe Thr Pro Ala Asn Ile Ser Arg Gln Ala His Ile Leu Leu
610 615 620
Asp Cys Gly Glu Asp Asn Val Cys Lys Pro Lys Leu Glu Val Phe Val
625 630 635 640
Asp Ser Asp Gln Lys Lys Ile Tyr Ile Gly Asp Asp Asn Pro Leu Thr
645 650 655
Leu Ile Val Lys Ala Gln Asn Gln Gly Glu Gly Ala Tyr Glu Ala Glu
660 665 670
Leu Ile Val Ser Ile Pro Leu Gln Ala Asp Phe Ile Gly Val Val Arg
675 680 685
Asn Ser Glu Ala Leu Ala Arg Leu Ser Cys Ala Phe Lys Thr Glu Asn
690 695 700
Gln Thr Arg Gln Val Val Cys Asp Leu Gly Asn Pro Met Lys Ala Gly
705 710 715 720
Thr Gln Leu Leu Ala Gly Leu Arg Phe Ser Val His Gln Gln Ser Glu
725 730 735
Met Asp Thr Ser Val Lys Phe Asp Leu Gln Ile Gln Ser Ser Asn Leu
740 745 750
Phe Asp Lys Val Ser Pro Val Val Ser His Lys Val Asp Leu Ala Val
755 760 765
Leu Ala Ala Val Glu Ile Arg Gly Val Ser Ser Pro Asp His Ile Phe
770 775 780
Leu Pro Ile Pro Asn Trp Glu His Lys Glu Asn Pro Glu Thr Glu Glu
785 790 795 800
Asp Val Gly Pro Val Val Gln His Ile Tyr Glu Leu Arg Asn Asn Gly
805 810 815
Pro Ser Ser Phe Ser Lys Ala Met Leu His Leu Gln Trp Pro Tyr Lys
820 825 830
Tyr Asn Asn Asn Thr Leu Leu Tyr Ile Leu His Tyr Asp Ile Asp Gly
835 840 845
Pro Met Asn Cys Thr Ser Asp Met Glu Ile Asn Pro Leu Arg Ile Lys
850 855 860
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Thr Glu Lys Asn Asp Thr Val Ala Gly Gln
865 870 875 880
Gly Glu Arg Asp His Leu Ile Thr Lys Arg Asp Leu Ala Leu Ser Glu
885 890 895
Gly Asp Ile His Thr Leu Gly Cys Gly Val Ala Gln Cys Leu Lys Ile
900 905 910
Val Cys Gln Val Gly Arg Leu Asp Arg Gly Lys Ser Ala Ile Leu Tyr
915 920 925
Val Lys Ser Leu Leu Trp Thr Glu Thr Phe Met Asn Lys Glu Asn Gln
930 935 940
Asn His Ser Tyr Ser Leu Lys Ser Ser Ala Ser Phe Asn Val Ile Glu
945 950 955 960
Phe Pro Tyr Lys Asn Leu Pro Ile Glu Asp Ile Thr Asn Ser Thr Leu
965 970 975
Val Thr Thr Asn Val Thr Trp Gly Ile Gln Pro Ala Pro Met Pro Val
980 985 990
Pro Val Trp Val Ile Ile Leu Ala Val Leu Ala Gly Leu Leu Leu Leu
995 1000 1005
Ala Val Leu Val Phe Val Met Tyr Arg Met Gly Phe Phe Lys Arg
1010 1015 1020
Val Arg Pro Pro Gln Glu Glu Gln Glu Arg Glu Gln Leu Gln Pro
1025 1030 1035
His Glu Asn Gly Glu Gly Asn Ser Glu Thr
1040 1045
<210> 85
<211> 769
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 85
Met Cys Gly Ser Ala Leu Ala Phe Phe Thr Ala Ala Phe Val Cys Leu
1 5 10 15
Gln Asn Asp Arg Arg Gly Pro Ala Ser Phe Leu Trp Ala Ala Trp Val
20 25 30
Leu Ser Leu Val Leu Gly Leu Gly Gln Gly Glu Asp Asn Ile Cys Ala
35 40 45
Ser Ser Asn Ala Ala Ser Cys Ala Arg Cys Leu Ala Leu Gly Pro Glu
50 55 60
Cys Gly Trp Cys Val Gln Glu Asp Phe Ile Ser Gly Gly Ser Arg Ser
65 70 75 80
Glu Arg Cys Asp Ile Val Ser Asn Leu Ile Ser Lys Gly Cys Ser Val
85 90 95
Asp Ser Ile Glu Tyr Pro Ser Val His Val Ile Ile Pro Thr Glu Asn
100 105 110
Glu Ile Asn Thr Gln Val Thr Pro Gly Glu Val Ser Ile Gln Leu Arg
115 120 125
Pro Gly Ala Glu Ala Asn Phe Met Leu Lys Ile His Pro Leu Lys Lys
130 135 140
Tyr Pro Val Asp Leu Tyr Tyr Leu Val Asp Val Ser Ala Ser Met His
145 150 155 160
Asn Asn Ile Glu Lys Leu Asn Ser Val Gly Asn Asp Leu Ser Arg Lys
165 170 175
Met Ala Phe Phe Ser Arg Asp Phe Arg Leu Gly Phe Gly Ser Tyr Val
180 185 190
Asp Lys Thr Val Ser Pro Tyr Ile Ser Ile His Pro Glu Arg Ile His
195 200 205
Asn Gln Cys Ser Asp Tyr Asn Leu Asp Cys Met Pro Pro His Gly Tyr
210 215 220
Ile His Val Leu Ser Leu Thr Glu Asn Ile Thr Glu Phe Glu Lys Ala
225 230 235 240
Val His Arg Gln Lys Ile Ser Gly Asn Ile Asp Thr Pro Glu Gly Gly
245 250 255
Phe Asp Ala Met Leu Gln Ala Ala Val Cys Glu Ser His Ile Gly Trp
260 265 270
Arg Lys Glu Ala Lys Arg Leu Leu Leu Val Met Thr Asp Gln Thr Ser
275 280 285
His Leu Ala Leu Asp Ser Lys Leu Ala Gly Ile Val Val Pro Asn Asp
290 295 300
Gly Asn Cys His Leu Lys Asn Asn Val Tyr Val Lys Ser Thr Thr Met
305 310 315 320
Glu His Pro Ser Leu Gly Gln Leu Ser Glu Lys Leu Ile Asp Asn Asn
325 330 335
Ile Asn Val Ile Phe Ala Val Gln Gly Lys Gln Phe His Trp Tyr Lys
340 345 350
Asp Leu Leu Pro Leu Leu Pro Gly Thr Ile Ala Gly Glu Ile Glu Ser
355 360 365
Lys Ala Ala Asn Leu Asn Asn Leu Val Val Glu Ala Tyr Gln Lys Leu
370 375 380
Ile Ser Glu Val Lys Val His Val Glu Asn Gln Val Gln Gly Val Tyr
385 390 395 400
Phe Asn Ile Thr Ala Ile Cys Pro Asp Gly Ser Arg Lys Pro Gly Met
405 410 415
Glu Gly Cys Arg Asn Val Thr Ser Asn His Glu Val Leu Phe Asn Val
420 425 430
Thr Val Thr Met Lys Lys Cys Asp Val Thr Gly Gly Lys Asn Tyr Ala
435 440 445
Ile Ile Lys Pro Ile Gly Phe Asn Glu Thr Ala Lys Ile His Ile His
450 455 460
Arg Asn Cys Ser Cys Gln Cys Glu Asp Asn Arg Gly Pro Lys Gly Lys
465 470 475 480
Cys Val Asp Glu Thr Phe Leu Asp Ser Lys Cys Phe Gln Cys Asp Glu
485 490 495
Asn Lys Cys His Phe Asp Glu Asp Gln Phe Ser Ser Glu Ser Cys Lys
500 505 510
Ser His Lys Asp Gln Pro Val Cys Ser Gly Arg Gly Val Cys Val Cys
515 520 525
Gly Lys Cys Ser Cys His Lys Ile Lys Leu Gly Lys Val Tyr Gly Lys
530 535 540
Tyr Cys Glu Lys Asp Asp Phe Ser Cys Pro Tyr His His Gly Asn Leu
545 550 555 560
Cys Ala Gly His Gly Glu Cys Glu Ala Gly Arg Cys Gln Cys Phe Ser
565 570 575
Gly Trp Glu Gly Asp Arg Cys Gln Cys Pro Ser Ala Ala Ala Gln His
580 585 590
Cys Val Asn Ser Lys Gly Gln Val Cys Ser Gly Arg Gly Thr Cys Val
595 600 605
Cys Gly Arg Cys Glu Cys Thr Asp Pro Arg Ser Ile Gly Arg Phe Cys
610 615 620
Glu His Cys Pro Thr Cys His Thr Ala Cys Lys Glu Asn Trp Asn Cys
625 630 635 640
Val Gln Cys Leu His Pro His Asn Leu Ser Gln Ala Ile Leu Asp Gln
645 650 655
Cys Lys Thr Ser Cys Ala Leu Met Glu Gln Gln His Tyr Val Asp Gln
660 665 670
Thr Ser Glu Cys Phe Ser Ser Pro Ser Tyr Leu Arg Ile Phe Phe Ile
675 680 685
Ile Phe Ile Val Thr Phe Leu Ile Gly Leu Leu Lys Val Leu Ile Ile
690 695 700
Arg Gln Val Ile Leu Gln Trp Asn Ser Asn Lys Ile Lys Ser Ser Ser
705 710 715 720
Asp Tyr Arg Val Ser Ala Ser Lys Lys Asp Lys Leu Ile Leu Gln Ser
725 730 735
Val Cys Thr Arg Ala Val Thr Tyr Arg Arg Glu Lys Pro Glu Glu Ile
740 745 750
Lys Met Asp Ile Ser Lys Leu Asn Ala His Glu Thr Phe Arg Cys Asn
755 760 765
Phe
<210> 86
<211> 324
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 86
Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala
1 5 10 15
Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu
50 55 60
Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val
65 70 75 80
Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys
85 90 95
Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro
100 105 110
Pro Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu
115 120 125
Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser
130 135 140
Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu
145 150 155 160
Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr
165 170 175
Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn
180 185 190
Gly Lys Ala Phe Ala Cys Ala Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro
195 200 205
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln
210 215 220
Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val
225 230 235 240
Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val
245 250 255
Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln
260 265 270
Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn
275 280 285
Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val
290 295 300
Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His
305 310 315 320
Ser Pro Gly Lys
<210> 87
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 87
Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu
1 5 10 15
Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg
35 40 45
Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu
65 70 75 80
Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser
85 90 95
Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys
100 105
<210> 88
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 88
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Trp Ile Asp Pro Asp Asn Gly Asn Thr Ile Tyr Asp Pro Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Leu Leu Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 89
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 89
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Trp Ile Asp Pro Asp Asn Gly Asn Thr Ile Tyr Asp Pro Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Leu Leu Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 90
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 90
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Trp Ile Asp Pro Asp Asn Gly Asn Thr Ile Tyr Asp Pro Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Asn Ala Lys Asn Ser Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Leu Leu Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 91
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 91
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Trp Ile Asp Pro Asp Asn Gly Asn Thr Ile Tyr Asp Pro Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Leu Leu Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 92
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 92
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Thr Lys Ser Leu Leu His Phe
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Phe Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala
35 40 45
Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Tyr Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
65 70 75 80
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Met Gln Ser
85 90 95
Leu Glu Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 93
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 93
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Trp Ile Asp Pro Asp Gln Gly Asn Thr Ile Tyr Glu Pro Lys Val
50 55 60
Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Ser Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Leu Leu Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 94
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 94
Glu Pro Lys Phe Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser
1 5 10 15
<210> 95
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 95
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Leu Leu Met Asp Tyr Trp
1 5 10 15
<210> 96
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> misc_feature
<222> (12)..(12)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<400> 96
Thr Ala Val Tyr Tyr Ser Ala Arg Arg Leu Leu Xaa Asp Tyr Trp
1 5 10 15
<210> 97
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 97
Lys Ser Leu Leu His Phe Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Phe Trp Tyr
1 5 10 15
<210> 98
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 98
Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Tyr Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val
1 5 10 15
<210> 99
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<400> 99
Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Tyr Xaa Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val
1 5 10 15
<210> 100
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 100
Leu Ile Tyr Tyr Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg
1 5 10 15
<210> 101
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(5)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<400> 101
Leu Ile Tyr Tyr Xaa Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg
1 5 10 15
<210> 102
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 102
Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Met Gln Ser Leu Glu Tyr Pro Phe Thr
1 5 10 15
<210> 103
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<400> 103
Phe Ala Thr Tyr Tyr Ser Xaa Gln Ser Leu Glu Tyr Pro Phe Thr
1 5 10 15
<210> 104
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 104
Glu Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
1 5 10 15
<210> 105
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 105
Glu Pro Lys Val Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser
1 5 10 15
<210> 106
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 106
Lys Ser Leu Ser His Phe Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Phe Trp Tyr
1 5 10 15
<210> 107
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 107
Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Leu Glu Tyr Pro Phe Thr
1 5 10 15
<210> 108
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 108
Phe Ala Thr Tyr Tyr Ser Gln Gln Ser Leu Glu Tyr Pro Phe Thr
1 5 10 15
<210> 109
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 109
Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Met Gln Ser Tyr Glu Tyr Pro Phe Thr
1 5 10 15
<210> 110
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<400> 110
Phe Ala Thr Tyr Tyr Ser Xaa Gln Ser Tyr Glu Tyr Pro Phe Thr
1 5 10 15
<210> 111
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 111
Glu Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
1 5 10 15
<210> 112
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 112
Lys Arg Leu Ile Tyr Tyr Ala Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro
1 5 10 15
<210> 113
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 113
Lys Arg Leu Ile Tyr Tyr Met Ser Ser Leu Ala Ser Gly Val Pro
1 5 10 15
<210> 114
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<400> 114
Lys Arg Leu Ile Tyr Tyr Xaa Ser Ser Leu Ala Ser Gly Val Pro
1 5 10 15
<210> 115
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 115
Gln Gly Asp Ser Leu Arg Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Tyr Gln Gln
1 5 10 15
<210> 116
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 116
Val Leu Val Ile Tyr Gly Lys His Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro
1 5 10 15
<210> 117
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 117
Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Met Ser Arg Ser Ile Trp Gly Asn Pro
1 5 10 15
<210> 118
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<400> 118
Glu Ala Asp Tyr Tyr Ser Xaa Ser Arg Ser Ile Trp Gly Asn Pro
1 5 10 15
<210> 119
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 119
Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Tyr Ser Thr
1 5 10 15
<210> 120
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 120
Gly Leu Glu Trp Ile Gly Ser Ile Ser His Thr Gly Asn Thr Tyr
1 5 10 15
<210> 121
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 121
Asn Pro Pro Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser
1 5 10 15
<210> 122
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 122
Asp Thr Ala Val Val Tyr Cys Ala Arg Gly Gly Gly Ile Ser Arg
1 5 10 15
<210> 123
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 123
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Thr Lys Ser Leu Leu His Phe
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Phe Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala
35 40 45
Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Tyr Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
65 70 75 80
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Met Gln Ser
85 90 95
Leu Glu Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 124
<211> 445
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 124
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Trp Ile Asp Pro Asp Asn Gly Asn Thr Ile Tyr Asp Pro Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Ser Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Leu Leu Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro
115 120 125
Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val
130 135 140
Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala
145 150 155 160
Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly
165 170 175
Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly
180 185 190
Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys
195 200 205
Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys
210 215 220
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu
225 230 235 240
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
245 250 255
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys
260 265 270
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
275 280 285
Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
290 295 300
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
305 310 315 320
Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
325 330 335
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
340 345 350
Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
355 360 365
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
370 375 380
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
385 390 395 400
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
405 410 415
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
420 425 430
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 125
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 125
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1 5 10 15
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
20
<210> 126
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 126
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1 5 10 15
Pro Glu Ala Ala Gly Ala Pro
20
<210> 127
<211> 98
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 127
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Asn Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg
<210> 128
<211> 95
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 128
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro
85 90 95
<210> 129
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 129
Pro Lys Tyr Val Lys Gln Asn Thr Leu Lys Leu Ala Thr
1 5 10
<210> 130
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 130
Ala Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu
1 5 10 15
<210> 131
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (12)..(12)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<400> 131
Trp Ile Asp Pro Asp Xaa Gly Asn Thr Ile Tyr Xaa Pro Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 132
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<400> 132
Arg Ser Thr Lys Ser Leu Xaa His Phe Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Phe
1 5 10 15
<210> 133
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(5)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<400> 133
Tyr Tyr Met Ser Xaa Leu Ala Ser
1 5
<210> 134
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<400> 134
Xaa Gln Ser Leu Glu Tyr Pro Phe Thr
1 5
<210> 135
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<400> 135
Trp Ile Asp Pro Asp Xaa Gly Asn
1 5
<210> 136
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<400> 136
Ser Thr Lys Ser Leu Xaa His Phe Asn Gly Asn Thr Tyr Leu
1 5 10
<210> 137
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(5)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<400> 137
Tyr Tyr Met Ser Xaa
1 5
<210> 138
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 138
Arg Ser Thr Lys Ser Ile Leu His Phe Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Phe
1 5 10 15
<210> 139
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 139
Ser Thr Lys Ser Ile Leu His Phe Asn Gly Asn Thr Tyr Leu
1 5 10
<210> 140
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 140
Arg Ser Thr Lys Ser Leu Leu His Phe Asn Gly Asn Ser Tyr Leu Phe
1 5 10 15
<210> 141
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 141
Ser Thr Lys Ser Leu Leu His Phe Asn Gly Asn Ser Tyr Leu
1 5 10
<210> 142
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 142
Tyr Ala Met Ser Asn Leu Ala Ser
1 5
<210> 143
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 143
Tyr Ala Met Ser Asn
1 5
<210> 144
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 144
Tyr Tyr Ala Ser Asn Leu Ala Ser
1 5
<210> 145
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 145
Tyr Tyr Ala Ser Asn
1 5
<210> 146
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 146
Tyr Tyr Met Ser Asn Leu Gln Ser
1 5
<210> 147
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 147
Met Gln Ser Tyr Glu Tyr Pro Phe Thr
1 5
<210> 148
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 148
Gln Ser Tyr Glu Tyr Pro Phe Thr
1 5
<210> 149
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 149
Met Gln Ser Leu Ser Tyr Pro Phe Thr
1 5
<210> 150
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 150
Gln Ser Leu Ser Tyr Pro Phe Thr
1 5
<210> 151
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 151
Met Gln Ser Leu Glu Thr Pro Phe Thr
1 5
<210> 152
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 152
Gln Ser Leu Glu Thr Pro Phe Thr
1 5
<210> 153
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 153
Met Gln Ser Leu Glu Tyr Pro Leu Thr
1 5
<210> 154
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 154
Gln Ser Leu Glu Tyr Pro Leu Thr
1 5
<210> 155
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 155
Met Gln Ser Leu Glu Tyr Pro Trp Thr
1 5
<210> 156
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 156
Gln Ser Leu Glu Tyr Pro Trp Thr
1 5
<210> 157
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 157
Trp Ile Asp Pro Asp Asn Gly Asn Thr Ile Tyr Asp Gln Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 158
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 158
Trp Ile Asp Pro Asp Asn Gly Asn Thr Ile Tyr Asp Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 159
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 159
Gly Phe Asn Ile Ala Asp Tyr Tyr Met Asn
1 5 10
<210> 160
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 160
Trp Ile Asp Pro Asp Asn Gly Asn Thr Ile Tyr Glu Pro Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 161
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 161
Trp Ile Asp Pro Asp Gln Gly Asn Thr Ile Tyr Asp Pro Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 162
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 162
Trp Ile Asp Pro Asp Asn Gly Gln Thr Ile Tyr Asp Pro Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 163
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 163
Trp Ile Asp Pro Asp Asn Gly Asn Thr Ile Tyr Asp Ala Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 164
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 164
Trp Ile Asp Pro Asp Asn Gly Gln
1 5
<210> 165
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 165
Trp Ile Asp Pro Asp Asn Gly Asn Thr Ile Tyr Asp Pro Ala Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 166
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 166
Trp Ile Asp Pro Asp Gln Gly Asn Thr Ile Tyr Glu Pro Lys Val Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 167
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (12)..(16)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<400> 167
Trp Ile Asp Pro Asp Xaa Gly Xaa Thr Ile Tyr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5 10 15
Gly
<210> 168
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(7)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(13)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<400> 168
Arg Ser Thr Lys Ser Xaa Xaa His Phe Asn Gly Asn Xaa Tyr Leu Phe
1 5 10 15
<210> 169
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(3)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(5)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<400> 169
Tyr Xaa Xaa Ser Xaa Leu Xaa Ser
1 5
<210> 170
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(6)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<400> 170
Xaa Gln Ser Xaa Xaa Xaa Pro Xaa Thr
1 5
<210> 171
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (12)..(12)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<400> 171
Trp Ile Asp Pro Asp Xaa Gly Asn Thr Ile Tyr Xaa Pro Lys Xaa Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 172
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<400> 172
Arg Ser Thr Lys Ser Leu Xaa His Phe Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Phe
1 5 10 15
<210> 173
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(5)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<400> 173
Tyr Tyr Xaa Ser Xaa Leu Ala Ser
1 5
<210> 174
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<400> 174
Xaa Gln Ser Xaa Glu Tyr Pro Phe Thr
1 5
<210> 175
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(5)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<400> 175
Gly Phe Asn Ile Xaa Asp Tyr Tyr Met Asn
1 5 10
<210> 176
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<400> 176
Trp Ile Asp Pro Asp Xaa Gly Xaa
1 5
<210> 177
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(6)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (12)..(12)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<400> 177
Ser Thr Lys Ser Xaa Xaa His Phe Asn Gly Asn Xaa Tyr Leu
1 5 10
<210> 178
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(3)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(5)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<400> 178
Tyr Xaa Xaa Ser Xaa
1 5
<210> 179
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(5)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<400> 179
Tyr Tyr Xaa Ser Xaa
1 5
<210> 180
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<400> 180
Gln Ser Xaa Glu Tyr Pro Phe Thr
1 5
<210> 181
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 181
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 182
<211> 444
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 182
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Trp Ile Asp Pro Asp Asn Gly Asn Thr Ile Tyr Asp Pro Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Ser Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Leu Leu Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro
115 120 125
Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val
130 135 140
Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala
145 150 155 160
Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly
165 170 175
Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly
180 185 190
Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys
195 200 205
Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys
210 215 220
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu
225 230 235 240
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
245 250 255
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys
260 265 270
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
275 280 285
Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
290 295 300
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
305 310 315 320
Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
325 330 335
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
340 345 350
Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
355 360 365
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
370 375 380
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
385 390 395 400
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
405 410 415
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
420 425 430
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440
<210> 183
<211> 1389
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 183
atgggatgga gctgtatcat cctcttcttg gtagcaacag ctacaggcgt gcactccgag 60
gtgcagctgg tggaaagcgg aggaggcctg gtgcagcctg gaggaagcct gaggctgagc 120
tgtgccgcca gcggcttcaa catcaaggac tactacatga actgggtgag gcaggcccct 180
ggcaaaggac tggagtgggt gggctggatc gaccccgacc agggcaacac catctacgag 240
cccaagttcc agggcaggtt caccatcagc gccgacacca gcaagaacag cgcctacctg 300
cagatgaact ccctgagggc cgaggacacc gccgtgtact actgcgccag gaggctgctg 360
atggactact ggggccaggg cacactggtc accgtctcct cagcctccac caagggccca 420
tcggtcttcc ccctggcacc ctcctccaag agcacctctg ggggcacagc ggccctgggc 480
tgcctggtca aggactactt ccccgaaccg gtgacggtgt cgtggaactc aggcgccctg 540
accagcggcg tgcacacctt cccggctgtc ctacagtcct caggactcta ctccctcagc 600
agcgtggtga ccgtgccctc cagcagcttg ggcacccaga cctacatctg caacgtgaat 660
cacaagccca gcaacaccaa ggtggacaag aaagttgagc ccaaatcttg tgacaaaact 720
cacacatgcc caccgtgccc agcacctgaa gccgctgggg caccgtcagt cttcctcttc 780
cccccaaaac ccaaggacac cctcatgatc tcccggaccc ctgaggtcac atgcgtggtg 840
gtggacgtga gccacgaaga ccctgaggtc aagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag 900
gtgcataatg ccaagacaaa gccgcgggag gagcagtaca acagcacgta ccgtgtggtc 960
agcgtcctca ccgtcctgca ccaggactgg ctgaatggca aggagtacaa gtgcaaggtc 1020
tccaacaaag ccctcccagc ccccatcgag aaaaccatct ccaaagccaa agggcagccc 1080
cgagaaccac aggtgtacac cctgccccca tcccgggagg agatgaccaa gaaccaggtc 1140
agcctgacct gcctggtcaa aggcttctat cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc 1200
aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc acgcctcccg tgctggactc cgacggctcc 1260
ttcttcctct atagcaagct caccgtggac aagagcaggt ggcagcaggg gaacgtcttc 1320
tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac aaccactaca cgcagaagag cctctccctg 1380
tcccccgga 1389
<210> 184
<211> 329
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 184
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
325
<210> 185
<211> 657
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 185
gacatccaga tgacccagtc cccttccagc ctgagcgctt ccgtgggcga cagggtgacc 60
atcacctgca ggtccaccaa gtccctgtcc cacttcaacg gcaacaccta cctgttctgg 120
taccagcaga agcccggcaa ggcccccaag aggctgatct actacatgtc ctccctggcc 180
tccggagtgc cctccaggtt ctccggatcc ggctccggca ccgacttcac cctgaccatc 240
tcctccctgc agcccgagga tttcgccacc tactactgcc agcagtccct ggagtacccc 300
ttcaccttcg gcggcggcac caaggtggag atcaaacgaa ctgtggctgc accatctgtc 360
ttcatcttcc cgccatctga tgagcagttg aaatctggaa ctgcctctgt tgtgtgcctg 420
ctgaataact tctatcccag agaggccaaa gtacagtgga aggtggataa cgccctccaa 480
tcgggtaact cccaggagag tgtcacagag caggacagca aggacagcac ctacagcctc 540
agcagcaccc tgacgctgag caaagcagac tacgagaaac acaaagtcta cgcctgcgaa 600
gtcacccatc agggcctgag ctcgcccgtc acaaagagct tcaacagggg agagtgt 657
<210> 186
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 186
gacatccaga tgacccagtc cccttccagc ctgagcgctt ccgtgggcga cagggtgacc 60
atcacctgca ggtccaccaa gtccctgtcc cacttcaacg gcaacaccta cctgttctgg 120
taccagcaga agcccggcaa ggcccccaag aggctgatct actacatgtc ctccctggcc 180
tccggagtgc cctccaggtt ctccggatcc ggctccggca ccgacttcac cctgaccatc 240
tcctccctgc agcccgagga tttcgccacc tactactgcc agcagtccct ggagtacccc 300
ttcaccttcg gcggcggcac caaggtggag atcaaa 336
<210> 187
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 187
atgggatgga gctgtatcat cctcttcttg gtagcaacag ctacaggcgt gcactcc 57
<210> 188
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 188
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser
<210> 189
<211> 1335
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 189
gaggtgcagc tggtggaaag cggaggaggc ctggtgcagc ctggaggaag cctgaggctg 60
agctgtgccg ccagcggctt caacatcaag gactactaca tgaactgggt gaggcaggcc 120
cctggcaaag gactggagtg ggtgggctgg atcgaccccg accagggcaa caccatctac 180
gagcccaagt tccagggcag gttcaccatc agcgccgaca ccagcaagaa cagcgcctac 240
ctgcagatga actccctgag ggccgaggac accgccgtgt actactgcgc caggaggctg 300
ctgatggact actggggcca gggcacactg gtcaccgtct cctcagcctc caccaagggc 360
ccatcggtct tccccctggc accctcctcc aagagcacct ctgggggcac agcggccctg 420
ggctgcctgg tcaaggacta cttccccgaa ccggtgacgg tgtcgtggaa ctcaggcgcc 480
ctgaccagcg gcgtgcacac cttcccggct gtcctacagt cctcaggact ctactccctc 540
agcagcgtgg tgaccgtgcc ctccagcagc ttgggcaccc agacctacat ctgcaacgtg 600
aatcacaagc ccagcaacac caaggtggac aagaaagttg agcccaaatc ttgtgacaaa 660
actcacacat gcccaccgtg cccagcacct gaagccgctg gggcaccgtc agtcttcctc 720
ttccccccaa aacccaagga caccctcatg atctcccgga cccctgaggt cacatgcgtg 780
gtggtggacg tgagccacga agaccctgag gtcaagttca actggtacgt ggacggcgtg 840
gaggtgcata atgccaagac aaagccgcgg gaggagcagt acaacagcac gtaccgtgtg 900
gtcagcgtcc tcaccgtcct gcaccaggac tggctgaatg gcaaggagta caagtgcaag 960
gtctccaaca aagccctccc agcccccatc gagaaaacca tctccaaagc caaagggcag 1020
ccccgagaac cacaggtgta caccctgccc ccatcccggg aggagatgac caagaaccag 1080
gtcagcctga cctgcctggt caaaggcttc tatcccagcg acatcgccgt ggagtgggag 1140
agcaatgggc agccggagaa caactacaag accacgcctc ccgtgctgga ctccgacggc 1200
tccttcttcc tctatagcaa gctcaccgtg gacaagagca ggtggcagca ggggaacgtc 1260
ttctcatgct ccgtgatgca tgaggctctg cacaaccact acacgcagaa gagcctctcc 1320
ctgtcccccg gaaaa 1335
<210> 190
<211> 345
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 190
gaggtgcagc tggtggaaag cggaggaggc ctggtgcagc ctggaggaag cctgaggctg 60
agctgtgccg ccagcggctt caacatcaag gactactaca tgaactgggt gaggcaggcc 120
cctggcaaag gactggagtg ggtgggctgg atcgaccccg accagggcaa caccatctac 180
gagcccaagt tccagggcag gttcaccatc agcgccgaca ccagcaagaa cagcgcctac 240
ctgcagatga actccctgag ggccgaggac accgccgtgt actactgcgc caggaggctg 300
ctgatggact actggggcca gggcacactg gtcaccgtct cctca 345
<210> 191
<211> 1332
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 191
gaggtgcagc tggtggaaag cggaggaggc ctggtgcagc ctggaggaag cctgaggctg 60
agctgtgccg ccagcggctt caacatcaag gactactaca tgaactgggt gaggcaggcc 120
cctggcaaag gactggagtg ggtgggctgg atcgaccccg accagggcaa caccatctac 180
gagcccaagt tccagggcag gttcaccatc agcgccgaca ccagcaagaa cagcgcctac 240
ctgcagatga actccctgag ggccgaggac accgccgtgt actactgcgc caggaggctg 300
ctgatggact actggggcca gggcacactg gtcaccgtct cctcagcctc caccaagggc 360
ccatcggtct tccccctggc accctcctcc aagagcacct ctgggggcac agcggccctg 420
ggctgcctgg tcaaggacta cttccccgaa ccggtgacgg tgtcgtggaa ctcaggcgcc 480
ctgaccagcg gcgtgcacac cttcccggct gtcctacagt cctcaggact ctactccctc 540
agcagcgtgg tgaccgtgcc ctccagcagc ttgggcaccc agacctacat ctgcaacgtg 600
aatcacaagc ccagcaacac caaggtggac aagaaagttg agcccaaatc ttgtgacaaa 660
actcacacat gcccaccgtg cccagcacct gaagccgctg gggcaccgtc agtcttcctc 720
ttccccccaa aacccaagga caccctcatg atctcccgga cccctgaggt cacatgcgtg 780
gtggtggacg tgagccacga agaccctgag gtcaagttca actggtacgt ggacggcgtg 840
gaggtgcata atgccaagac aaagccgcgg gaggagcagt acaacagcac gtaccgtgtg 900
gtcagcgtcc tcaccgtcct gcaccaggac tggctgaatg gcaaggagta caagtgcaag 960
gtctccaaca aagccctccc agcccccatc gagaaaacca tctccaaagc caaagggcag 1020
ccccgagaac cacaggtgta caccctgccc ccatcccggg aggagatgac caagaaccag 1080
gtcagcctga cctgcctggt caaaggcttc tatcccagcg acatcgccgt ggagtgggag 1140
agcaatgggc agccggagaa caactacaag accacgcctc ccgtgctgga ctccgacggc 1200
tccttcttcc tctatagcaa gctcaccgtg gacaagagca ggtggcagca ggggaacgtc 1260
ttctcatgct ccgtgatgca tgaggctctg cacaaccact acacgcagaa gagcctctcc 1320
ctgtcccccg ga 1332
<210> 192
<211> 987
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 192
gcctccacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 60
ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 120
tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 180
ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 240
tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 300
aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaagc cgctggggca 360
ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 420
gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 480
tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 540
agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 600
gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 660
aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggaggag 720
atgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 780
gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 840
ctggactccg acggctcctt cttcctctat agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 900
cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 960
cagaagagcc tctccctgtc ccccgga 987
<210> 193
<211> 990
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 193
gcctccacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 60
ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 120
tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 180
ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 240
tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 300
aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaagc cgctggggca 360
ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 420
gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 480
tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 540
agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 600
gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 660
aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggaggag 720
atgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 780
gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 840
ctggactccg acggctcctt cttcctctat agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 900
cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 960
cagaagagcc tctccctgtc ccccggaaaa 990
<210> 194
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 194
cgaactgtgg ctgcaccatc tgtcttcatc ttcccgccat ctgatgagca gttgaaatct 60
ggaactgcct ctgttgtgtg cctgctgaat aacttctatc ccagagaggc caaagtacag 120
tggaaggtgg ataacgccct ccaatcgggt aactcccagg agagtgtcac agagcaggac 180
agcaaggaca gcacctacag cctcagcagc accctgacgc tgagcaaagc agactacgag 240
aaacacaaag tctacgcctg cgaagtcacc catcagggcc tgagctcgcc cgtcacaaag 300
agcttcaaca ggggagagtg t 321
<210> 195
<211> 98
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 195
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Asn Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg
<210> 196
<211> 95
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 196
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro
85 90 95
<210> 197
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(5)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<400> 197
Gln Ser Xaa Xaa Xaa Pro Xaa Thr
1 5

Claims (47)

1.一种经分离的抗体或其抗原结合片段，其特异性结合αvβ8整合素，其中所述抗体或片段为至少一种选自由以下各项组成的组的抗体或片段：
(a)包含以下的抗体或其抗原结合片段：包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的轻链互补决定区1(CDR-L1)；包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的CDR-L2；包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR-L3；包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的重链CDR1(CDR-H1)；包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的CDR-H2；以及包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的CDR-H3；
(b)包含以下的抗体或其抗原结合片段：包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的CDR-L1；包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的CDR-L2；包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的CDR-L3；包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CDR-H1；包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDR-H2；以及包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR-H3；
(c)包含可变轻链(VL)区和可变重链(VH)区的抗体或其抗原结合片段，所述VL区包含由保藏于ATCC并且具有保藏编号PTA-124918的质粒的插入序列编码的氨基酸序列，所述VH区包含由保藏于ATCC、具有保藏编号PTA-124917的质粒的插入序列编码的氨基酸序列；
(d)包含VL区和VH区的抗体或其抗原结合片段，所述VL区包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列，所述VH区包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列；
(e)包含VL区和VH区的抗体或其抗原结合片段，所述VL区包含选自由SEQ ID NO:62-66组成的组的氨基酸序列，所述VH区包含选自由SEQ ID NO:34-38组成的组的氨基酸序列；
(f)包含VL区和VH区的抗体或其抗原结合片段，所述VL区包含选自由SEQ ID NO:47和92组成的组的氨基酸序列，所述VH区包含选自由SEQ ID NO:39和88-91组成的组的氨基酸序列；
(g)包含VL区和VH区的抗体或其抗原结合片段，所述VL区包含选自由SEQ ID NO:7和67-69组成的组的氨基酸序列，所述VH区包含选自由SEQ ID NO:6和93组成的组的氨基酸序列；
(h)包含VL区和VH区的抗体或其抗原结合片段，所述VL区包含选自由SEQ ID NO:7、47-69和92组成的组的氨基酸序列，所述VH区包含选自由SEQ ID NO:6、34-46、88-91和93组成的组的氨基酸序列；
(i)包含轻链(LC)区和重链(HC)区的抗体或其抗原结合片段，所述LC区包含SEQ IDNO:5的氨基酸序列，所述HC区包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列；
(j)包含LC区和HC区的抗体或其抗原结合片段，所述LC区包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列，所述HC区包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列；
(k)包含LC区和HC区的抗体或其抗原结合片段，所述LC区包含SEQ ID NO:123的氨基酸序列，所述HC区包含SEQ ID NO:124或182的氨基酸序列；
(l)包含VL区和VH区的抗体或其抗原结合片段，所述VL区由SEQ ID NO:186的核酸序列编码，所述VH区由SEQ ID NO:190的核酸序列编码；和
(m)包含LC区和HC区的抗体或其抗原结合片段，所述LC区由SEQ ID NO:185的核酸序列编码，所述HC区由SEQ ID NO:189或191的核酸序列编码。
2.权利要求1所述的经分离的抗体或其抗原结合片段，其包含VL区和VH区，所述VL区包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列，所述VH区包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列。
3.权利要求1或2所述的经分离的抗体或其抗原结合片段，其包含VL区和VH区，所述VL区包含与SEQ ID NO:7至少95％同一的氨基酸序列，所述VH区包含与SEQ ID NO:6至少95％同一的氨基酸序列。
4.权利要求1所述的经分离的抗体或其抗原结合片段，其包含LC区和HC区，所述LC区包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列，所述HC区包含SEQ ID NO:2或3的氨基酸序列。
5.权利要求1或4所述的经分离的抗体或其抗原结合片段，其包含LC区和HC区，所述LC区包含与SEQ ID NO:5至少95％同一的氨基酸序列，所述HC区包含与SEQ ID NO:2或3至少95％同一的氨基酸序列。
6.一种经分离的抗体或其抗原结合片段，其特异性结合αvβ8整合素，其中所述抗体或片段包含VH区和/或VL区，所述VH区包含与选自由SEQ ID NO:6、34-46、88-91和93组成的组的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列，所述VL区包含与选自由SEQ ID NO:7、47-69和92组成的组的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。
7.一种经分离的抗体或其抗原结合片段，其特异性结合αvβ8整合素，其中所述抗体或片段包含：
(i)抗体HC，其包含与SEQ ID NO:2或3具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列；和/或
(ii)抗体LC，其包含与SEQ ID NO:5具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。
8.一种特异性结合αvβ8整合素的经分离的抗体，其包含LC和HC，所述LC由SEQ ID NO:5的氨基酸序列组成，所述HC由SEQ ID NO:2或3的氨基酸序列组成。
9.一种特异性结合αvβ8整合素的经分离的抗体，其包含：
抗体VL区，其包含来自包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的所述VL区的所述CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；和
抗体VH区，其包含来自包含SED ID NO:6的氨基酸序列的所述VH区的所述CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3。
10.权利要求9所述的经分离的抗体，其包含抗体重链恒定区和抗体轻链恒定区，所述抗体重链恒定区包含SEQ ID NO:181或184的氨基酸序列，所述抗体轻链恒定区包含SEQ IDNO:83的氨基酸序列。
11.一种特异性结合αvβ8整合素的经分离的抗体，其包含：
a)抗体VL区，其包含来自包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的所述VL区的第一、第二和第三CDR；
抗体VH区，其包含来自包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的所述VH区的第一、第二和第三CDR；
抗体轻链恒定(CL)区，其包含SEQ ID NO:83的氨基酸序列；和
抗体重链(CH)恒定区，其包含SEQ ID NO:181或184的氨基酸序列；
b)抗体VL区，其包含与SEQ ID NO:7至少95％同一的氨基酸序列；和抗体VH区，其包含与SEQ ID NO:6至少95％同一的氨基酸序列；或
c)抗体LC区，其包含与SEQ ID NO:5至少95％同一的氨基酸序列；和抗体HC，其包含与SEQ ID NO:2或3至少95％同一的氨基酸序列。
12.一种经分离的抗体或其抗原结合片段，其特异性结合αvβ8整合素，其包含抗体VH和抗体VL，所述抗体VH包含由保藏于ATCC并且具有保藏编号PTA-124917的所述插入序列编码的氨基酸序列，所述抗体VL包含由保藏于ATCC并且具有保藏编号PTA-124918的所述插入序列编码的氨基酸序列。
13.一种经分离的抗体或其抗原结合片段，其特异性结合αvβ8整合素，其中所述抗体或片段具有以下特性中的至少一种：
m.表示为KD的对人类αvβ8整合素的结合亲和力，其低于鼠类抗体ADWA11的KD，例如低于约536pM；
n.对人类αvβ8整合素的KD，其低于或等于约100pM；
o.对小鼠αvβ8整合素的KD，其低于鼠类抗体ADWA11的KD，例如低于约489pM；
p.对小鼠αvβ8整合素的KD，其低于约100pM；
q.对食蟹猴αvβ8整合素的KD，其低于鼠类抗体ADWA11的KD，例如低于约507pM；
r.对食蟹猴αvβ8整合素的KD，其低于或等于约100pM；
s.对大鼠αvβ8整合素的KD，其为约160pM；
t.对人类、食蟹猴、小鼠和大鼠αvβ8整合素中的至少两种、三种或所有大致相等的亲和力，例如如使用Biacore亲和力测定法所确定的，低于约100pM的KD；
u.抑制TGFβ反式激活的IC50，其为约100pM至约300pM；
v.U251细胞的EC30，其为约100pM至约400pM；
w.对C8-S细胞的EC50，其为约110pM至约180pM；和
x.至少一个预测的人类药代动力学(PK)参数，其选自：
vii.中央室的清除率(CL)，其为约0.12mL/h/kg；
viii.室间分布清除率(CLF)，其为约0.51mL/h/kg；
ix.中央室的分布容积(V1)，其为约36mL/kg；
x.周边室的分布容积(V2)，其为约33mL/kg；
xi.终末半衰期(t1/2)，其为约15至17天；和
xii.没有与人类Fcγ受体或C1q的可检测到的结合。
14.前述权利要求中任一项所述的经分离的抗体或其抗原结合片段，其包含人类IgG1Fc区，如根据Kabat的EU编号进行编号，所述人类IgG1 Fc区包含选自位置L234、L235和G237的一个或多个置换(例如，L234A、L235A和G237A中的一个或多个)。
15.前述权利要求中任一项所述的经分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体为人源化抗体、人类抗体、鼠类抗体、嵌合抗体或骆驼抗体。
16.前述权利要求中任一项所述的经分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体重链同型选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其任何变体；和/或其中所述轻链恒定区选自κ或λ。
17.前述权利要求中任一项所述的经分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体重链同型为IgG1和/或其中所述轻链恒定区为κ轻链。
18.一种抗体或其抗原结合片段，其与权利要求4所述的抗体或其抗原结合片段竞争结合αvβ8整合素。
19.一种药物组合物，其包含前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段和药学上可接受的承载体或赋形剂。
20.权利要求19所述的药物组合物，其包含：i)包含抗体重链和抗体轻链的抗体或其抗原结合片段，所述抗体重链由SEQ ID NO:2的氨基酸序列编码，所述抗体轻链由SEQ ID NO:5的氨基酸序列编码，ii)包含抗体重链和抗体轻链的抗体或其抗原结合片段，所述抗体重链由SEQ ID NO:3的氨基酸序列编码，所述抗体轻链由SEQ ID NO:5的氨基酸序列编码，或iii)两者。
21.一种经分离的核酸分子，其编码权利要求1至18中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
22.权利要求21所述的经分离的核酸，其中所述经分离的核酸编码所述抗体或其抗原结合片段的所述VH区、VL区或两者，并且其中所述核酸包含：SEQ ID NO:190的核酸序列、SEQ ID NO:186的核酸序列或两者。
23.权利要求21所述的经分离的核酸，其中所述经分离的核酸编码所述抗体或其抗原结合片段的所述重链恒定区、所述轻链恒定区或两者，并且其中所述核酸包含SEQ ID NO:192或193的核酸序列；SEQ ID NO:194的核酸序列；或两者。
24.权利要求21所述的经分离的核酸，其中所述经分离的核酸编码所述抗体或其抗原结合片段的所述HC、LC或两者，并且其中所述核酸包含：SEQ ID NO:189或190的核酸序列；SEQ ID NO:185的核酸序列；或两者。
25.权利要求21所述的经分离的核酸，其中所述经分离的核酸包含保藏于ATCC并且具有保藏编号PTA-124917的质粒的插入序列的核酸序列、保藏于ATCC并且具有保藏编号PTA-124918的质粒的插入序列的核酸序列或两者。
26.权利要求21所述的经分离的核酸，其中所述经分离的核酸包含与SEQ ID NO:189或SEQ ID NO:191具有至少80％、85％、87％、90％、92％、93％、95％、97％、98％或100％序列同一性的核酸序列；与SEQ ID NO:185具有至少80％、85％、87％、90％、92％、93％、95％、97％、98％或100％序列同一性的核酸序列；或两者。
27.一种载体，其包含权利要求21至26中任一项所述的核酸。
28.一种宿主细胞，其包含权利要求21至26中任一项所述的核酸或权利要求27所述的载体。
29.权利要求27所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是选自由以下各项组成的组的哺乳动物细胞：CHO细胞、COS细胞、HEK-293细胞、NS0细胞、PER.
Figure FDA0002961224600000081
细胞和Sp2.0细胞。
30.一种制备经分离的抗体或其抗原结合片段的方法，其包含在其中所述抗体或片段由权利要求28所述的宿主细胞表达的条件下培养所述宿主细胞和分离所述抗体或片段。
31.一种降低有此需要的受试者中的αvβ8整合素活性的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的权利要求1至18中任一项所述的抗体或其抗原结合片段或权利要求19或20所述的药物组合物。
32.一种治疗癌症的方法，其包括向有此需要的受试者施用治疗有效量的权利要求1至18中任一项所述的抗体或其抗原结合片段或权利要求19或20所述的药物组合物。
33.权利要求32所述的方法，其进一步施用细胞毒性剂、细胞生长抑制剂、化学治疗剂、激素治疗、疫苗、免疫疗法、手术、辐射、冷冻手术、热疗法或其组合。
34.权利要求33所述的方法，其中所述进一步施用与治疗有效量的所述抗体或其抗原结合片段或药物组合同时、顺序或分开施用。
35.权利要求33所述的方法，其中所述免疫疗法包含选自由以下各项组成的组的免疫检查点分子的调节剂：抗PD1抗体、抗PD-L1抗体、抗PD-L2抗体、抗CTLA-4抗体、可溶性CTLA-4融合蛋白及其组合，并且其中所述抗PD-L1抗体不是阿维鲁单抗。
36.权利要求32至35中任一项所述的方法，其中所述癌症选自由以下各项组成的组：头颈部鳞状细胞癌、透明细胞型或乳头状细胞型的肾细胞癌、卵巢癌、输卵管癌、原发性腹膜癌、胃癌、胃食道接合处癌、食道癌、肺鳞状细胞癌、胰腺导管腺癌、胆管癌、子宫癌、黑素瘤、尿道上皮癌及其组合。
37.一种使用权利要求1至18所述的抗体或其抗原结合片段检测样品、组织或细胞中的αvβ8整合素的方法，其包括使所述样品、组织或细胞与所述抗体或其抗原结合片段接触和检测所述抗体或其抗原结合片段。
38.一种试剂盒，其包含权利要求1至18中任一项所述的抗体或片段或权利要求19或20所述的药物组合物并且任选地包含权利要求35所述的调节剂。
39.权利要求1至18中任一项所述的抗体或其抗原结合片段或权利要求19或20所述的药物组合物，其用于降低有此需要的受试者中的αvβ8整合素活性以治疗癌症。
40.权利要求1至18中任一项所述的抗体或其抗原结合片段或权利要求19或20所述的药物组合物，其用于治疗癌症，任选地其中所述抗体或其抗原结合片段或所述药物组合物用于与免疫疗法组合同时、顺序或分开施用，其中所述组合任选地提供协同治疗效果。
41.权利要求40所述的抗体或其抗原结合片段或药物组合物，其中所述癌症选自由以下各项组成的组：头颈部鳞状细胞癌、透明细胞型或乳头状细胞型的肾细胞癌、卵巢癌、输卵管癌、原发性腹膜癌、胃癌、胃食道接合处癌、食道癌、肺鳞状细胞癌、胰腺导管腺癌、胆管癌、子宫癌、黑素瘤、尿道上皮癌及其组合，任选地其中所述抗体或其抗原结合片段或所述药物组合物或组合用于与施用免疫疗法或辐射疗法一起使用。
42.权利要求1至18中任一项所述的抗体或其抗原结合片段或权利要求19或20所述的药物组合物用于治疗癌症的用途。
43.权利要求1至18中任一项所述的抗体或其抗原结合片段在制备药物中的用途，所述药物用于治疗癌症。
44.一种治疗癌症的方法，其包括向有此需要的受试者施用治疗有效量的(i)特异性结合αvβ8整合素的抗体或其抗原结合片段，和(ii)抗PD1、抗PD-L1或抗PD-L2免疫检查点分子的调节剂。
45.权利要求44所述的方法，其中所述癌症为鳞状细胞癌。
46.权利要求44所述的方法，其中所述癌症为乳腺癌或结肠癌。
47.权利要求44所述的方法，其中所述调节剂选自由以下各项组成的组：抗PD1抗体、抗PD-L1抗体和抗PD-L2抗体。
CN201980057769.8A 2018-09-07 2019-09-05 抗-αvβ8抗体和组合物及其用途 Pending CN112823167A (zh)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201862728688P 2018-09-07 2018-09-07
US62/728,688 2018-09-07
US201962890945P 2019-08-23 2019-08-23
US62/890,945 2019-08-23
PCT/US2019/049748 WO2020051333A1 (en) 2018-09-07 2019-09-05 Anti-avb8 antibodies and compositions and uses thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN112823167A true CN112823167A (zh) 2021-05-18

Family

ID=67998735

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201980057769.8A Pending CN112823167A (zh) 2018-09-07 2019-09-05 抗-αvβ8抗体和组合物及其用途

Country Status (16)

Country Link
US (2) US11359024B2 (zh)
EP (1) EP3847194A1 (zh)
JP (1) JP2022508015A (zh)
KR (1) KR20210057726A (zh)
CN (1) CN112823167A (zh)
AU (1) AU2019336197A1 (zh)
BR (1) BR112021004287A2 (zh)
CA (1) CA3107137A1 (zh)
CO (1) CO2021002954A2 (zh)
IL (1) IL280317A (zh)
MX (1) MX2021002690A (zh)
PE (1) PE20211605A1 (zh)
PH (1) PH12021550361A1 (zh)
SG (1) SG11202100888WA (zh)
TW (1) TW202024131A (zh)
WO (1) WO2020051333A1 (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117126282A (zh) * 2023-10-26 2023-11-28 迈威(上海)生物科技股份有限公司 抗体及其在制备阻断αvβ8与Latent TGF-β的结合的药物中的应用
CN117143241A (zh) * 2023-10-26 2023-12-01 迈威(上海)生物科技股份有限公司 与人整合素蛋白itgav/itgb8特异性结合的单克隆抗体
WO2024174744A1 (zh) * 2023-02-24 2024-08-29 恒翼生物医药(上海)股份有限公司 抗αvβ3抗体和抗PD-1抗体的联合药物

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2021142427A1 (en) 2020-01-11 2021-07-15 Scholar Rock, Inc. TGFβ INHIBITORS AND USE THEREOF
JP2023511255A (ja) 2020-01-11 2023-03-17 スカラー ロック インコーポレイテッド ＴＧＦ－β阻害剤及びその使用
EP4090683A4 (en) * 2020-01-15 2024-01-10 The Regents of the University of California Antibodies that bind integrin avb8 and uses thereof
CN114195893A (zh) * 2020-09-17 2022-03-18 百奥泰生物制药股份有限公司 抗整联蛋白抗体或抗原结合片段及其应用
WO2022204581A2 (en) 2021-03-26 2022-09-29 Scholar Rock, Inc. Tgf-beta inhibitors and use thereof
EP4348260A2 (en) 2021-06-03 2024-04-10 Scholar Rock, Inc. Tgf-beta inhibitors and therapeutic use thereof
WO2024187051A1 (en) 2023-03-07 2024-09-12 Scholar Rock, Inc. Tgf-beta inhibitors for use for treating resistant or unresponsive cancer in patients
US20240327522A1 (en) * 2023-03-31 2024-10-03 Genentech, Inc. Anti-alpha v beta 8 integrin antibodies and methods of use

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1753912A (zh) * 2002-12-23 2006-03-29 惠氏公司 抗pd－1抗体及其用途
CN101287841A (zh) * 2005-07-08 2008-10-15 拜奥根Idec马萨诸塞公司 抗－αvβ6抗体及其用途
CN103857696A (zh) * 2011-08-17 2014-06-11 加利福尼亚大学董事会 结合整合素αVβ8的抗体
CN106661121A (zh) * 2015-04-28 2017-05-10 酵活有限公司 经修饰的抗原结合多肽构建体及其用途

Family Cites Families (88)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3381783D1 (de) 1982-03-03 1990-09-13 Genentech Inc Menschliches antithrombin iii, dns sequenzen dafuer, expressions- und klonierungsvektoren die solche sequenzen enthalten und damit transformierte zellkulturen, verfahren zur expression von menschlichem antithrombin iii und diese enthaltende pharmazeutische zusammensetzungen.
ATE37983T1 (de) 1982-04-22 1988-11-15 Ici Plc Mittel mit verzoegerter freigabe.
US4522811A (en) 1982-07-08 1985-06-11 Syntex (U.S.A.) Inc. Serial injection of muramyldipeptides and liposomes enhances the anti-infective activity of muramyldipeptides
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US5128326A (en) 1984-12-06 1992-07-07 Biomatrix, Inc. Drug delivery systems based on hyaluronans derivatives thereof and their salts and methods of producing same
US4754065A (en) 1984-12-18 1988-06-28 Cetus Corporation Precursor to nucleic acid probe
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US5374548A (en) 1986-05-02 1994-12-20 Genentech, Inc. Methods and compositions for the attachment of proteins to liposomes using a glycophospholipid anchor
MX9203291A (es) 1985-06-26 1992-08-01 Liposome Co Inc Metodo para acoplamiento de liposomas.
GB8601597D0 (en) 1986-01-23 1986-02-26 Wilson R H Nucleotide sequences
US4800159A (en) 1986-02-07 1989-01-24 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
DE3883899T3 (de) 1987-03-18 1999-04-22 Sb2, Inc., Danville, Calif. Geänderte antikörper.
US4880078A (en) 1987-06-29 1989-11-14 Honda Giken Kogyo Kabushiki Kaisha Exhaust muffler
GB8905669D0 (en) 1989-03-13 1989-04-26 Celltech Ltd Modified antibodies
US5108921A (en) 1989-04-03 1992-04-28 Purdue Research Foundation Method for enhanced transmembrane transport of exogenous molecules
WO1991005548A1 (en) 1989-10-10 1991-05-02 Pitman-Moore, Inc. Sustained release composition for macromolecular proteins
WO1991006287A1 (en) 1989-11-06 1991-05-16 Enzytech, Inc. Protein microspheres and methods of using them
ATE221379T1 (de) 1991-05-01 2002-08-15 Jackson H M Found Military Med Verfahren zur behandlung infektiöser respiratorischer erkrankungen
DE69233254T2 (de) 1991-06-14 2004-09-16 Genentech, Inc., South San Francisco Humanisierter Heregulin Antikörper
US5912015A (en) 1992-03-12 1999-06-15 Alkermes Controlled Therapeutics, Inc. Modulated release from biocompatible polymers
US5934272A (en) 1993-01-29 1999-08-10 Aradigm Corporation Device and method of creating aerosolized mist of respiratory drug
US6132764A (en) 1994-08-05 2000-10-17 Targesome, Inc. Targeted polymerized liposome diagnostic and treatment agents
DE69630514D1 (de) 1995-01-05 2003-12-04 Univ Michigan Oberflächen-modifizierte nanopartikel und verfahren für ihre herstellung und verwendung
US6019968A (en) 1995-04-14 2000-02-01 Inhale Therapeutic Systems, Inc. Dispersible antibody compositions and methods for their preparation and use
US5811097A (en) 1995-07-25 1998-09-22 The Regents Of The University Of California Blockade of T lymphocyte down-regulation associated with CTLA-4 signaling
EP0850051A2 (en) 1995-08-31 1998-07-01 Alkermes Controlled Therapeutics, Inc. Composition for sustained release of an agent
US5985320A (en) 1996-03-04 1999-11-16 The Penn State Research Foundation Materials and methods for enhancing cellular internalization
US5855913A (en) 1997-01-16 1999-01-05 Massachusetts Instite Of Technology Particles incorporating surfactants for pulmonary drug delivery
US5985309A (en) 1996-05-24 1999-11-16 Massachusetts Institute Of Technology Preparation of particles for inhalation
US5874064A (en) 1996-05-24 1999-02-23 Massachusetts Institute Of Technology Aerodynamically light particles for pulmonary drug delivery
ES2308787T3 (es) 1996-08-16 2008-12-01 Schering Corporation Antigenos de superficie de celular de mamiferos; reactivos relacionados.
US6111090A (en) 1996-08-16 2000-08-29 Schering Corporation Mammalian cell surface antigens; related reagents
US6056973A (en) 1996-10-11 2000-05-02 Sequus Pharmaceuticals, Inc. Therapeutic liposome composition and method of preparation
ES2236832T3 (es) 1997-01-16 2005-07-16 Massachusetts Institute Of Technology Preparacion de particulas para inhalacion.
US5989463A (en) 1997-09-24 1999-11-23 Alkermes Controlled Therapeutics, Inc. Methods for fabricating polymer-based controlled release devices
CA2308114A1 (en) 1997-10-21 1999-04-29 Human Genome Sciences, Inc. Human tumor necrosis factor receptor-like proteins tr11, tr11sv1, and tr11sv2
SE512663C2 (sv) 1997-10-23 2000-04-17 Biogram Ab Inkapslingsförfarande för aktiv substans i en bionedbrytbar polymer
JP2001521909A (ja) 1997-10-31 2001-11-13 ジェネンテク・インコーポレイテッド 糖タンパク質グリコフォームを含む方法及び組成物
CA2319236A1 (en) 1998-02-09 1999-08-12 Genentech, Inc. Novel tumor necrosis factor receptor homolog and nucleic acids encoding the same
US6194551B1 (en) 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
ES2532910T3 (es) 1998-04-02 2015-04-01 Genentech, Inc. Variantes de anticuerpos y fragmentos de los mismos
AU747231B2 (en) 1998-06-24 2002-05-09 Alkermes, Inc. Large porous particles emitted from an inhaler
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
CA2378179A1 (en) 1999-07-12 2001-01-18 Genentech, Inc. Promotion or inhibition of angiogenesis and cardiovascularization by tumor necrosis factor ligand/receptor homologs
WO2003048731A2 (en) 2001-12-03 2003-06-12 Abgenix, Inc. Antibody categorization based on binding characteristics
US7217797B2 (en) 2002-10-15 2007-05-15 Pdl Biopharma, Inc. Alteration of FcRn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis
ES2697876T3 (es) 2002-12-24 2019-01-29 Rinat Neuroscience Corp Anticuerpos anti-NGF y procedimientos de uso de los mismos
WO2004107618A2 (en) 2003-05-23 2004-12-09 Wyeth Gitr ligand and gitr ligand-related molecules and antibodies and uses thereof
EP1660126A1 (en) 2003-07-11 2006-05-31 Schering Corporation Agonists or antagonists of the clucocorticoid-induced tumour necrosis factor receptor (gitr) or its ligand for the treatment of immune disorders, infections and cancer
WO2005040395A1 (en) 2003-10-22 2005-05-06 Keck Graduate Institute Methods of synthesizing heteromultimeric polypeptides in yeast using a haploid mating strategy
EP1692318A4 (en) 2003-12-02 2008-04-02 Genzyme Corp COMPOSITIONS AND METHODS FOR DIAGNOSIS AND TREATMENT OF LUNG CANCER
GB0409799D0 (en) 2004-04-30 2004-06-09 Isis Innovation Method of generating improved immune response
WO2006083289A2 (en) 2004-06-04 2006-08-10 Duke University Methods and compositions for enhancement of immunity by in vivo depletion of immunosuppressive cell activity
US7501121B2 (en) * 2004-06-17 2009-03-10 Wyeth IL-13 binding agents
WO2006105021A2 (en) 2005-03-25 2006-10-05 Tolerrx, Inc. Gitr binding molecules and uses therefor
EP2418278A3 (en) 2005-05-09 2012-07-04 Ono Pharmaceutical Co., Ltd. Human monoclonal antibodies to programmed death 1(PD-1) and methods for treating cancer using anti-PD-1 antibodies alone or in combination with other immunotherapeutics
EP2982379A1 (en) 2005-07-01 2016-02-10 E. R. Squibb & Sons, L.L.C. Human monoclonal antibodies to programmed death ligand 1 (pd-l1)
US7923538B2 (en) 2005-07-22 2011-04-12 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd Recombinant antibody composition
EP1981969A4 (en) 2006-01-19 2009-06-03 Genzyme Corp ANTI-GITRANT ANTIBODIES FOR THE TREATMENT OF CANCER
CA2676529C (en) 2007-01-24 2014-03-25 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Genetically recombinant antibody composition having enhanced effector activity
PT2170959E (pt) 2007-06-18 2014-01-07 Merck Sharp & Dohme Anticorpos para o receptor humano de morte programada pd-1
CA2693677C (en) 2007-07-12 2018-02-13 Tolerx, Inc. Combination therapies employing gitr binding molecules
JO3076B1 (ar) 2007-10-17 2017-03-15 Janssen Alzheimer Immunotherap نظم العلاج المناعي المعتمد على حالة apoe
PL2242773T3 (pl) 2008-02-11 2017-11-30 Cure Tech Ltd. Przeciwciała monoklonalne do leczenia nowotworu
WO2009114335A2 (en) 2008-03-12 2009-09-17 Merck & Co., Inc. Pd-1 binding proteins
KR20110044992A (ko) 2008-07-02 2011-05-03 이머전트 프로덕트 디벨롭먼트 시애틀, 엘엘씨 ＴＧＦ-β 길항제 다중-표적 결합 단백질
EP2328920A2 (en) 2008-08-25 2011-06-08 Amplimmune, Inc. Targeted costimulatory polypeptides and methods of use to treat cancer
EA201500417A1 (ru) 2008-08-25 2015-11-30 Эмплиммьюн, Инк. Композиции антагонистов pd-1 и способы применения
JPWO2010030002A1 (ja) 2008-09-12 2012-02-02 国立大学法人三重大学 外来性ｇｉｔｒリガンド発現細胞
PT2376535T (pt) 2008-12-09 2017-06-23 Hoffmann La Roche Anticorpos anti-pd-l1 e a sua utilização para a melhoria do funcionamento das células t
JP5844159B2 (ja) 2009-02-09 2016-01-13 ユニヴェルシテ デクス−マルセイユＵｎｉｖｅｒｓｉｔｅ Ｄ’Ａｉｘ−Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ Ｐｄ−１抗体およびｐｄ−ｌ１抗体ならびにその使用
CA2771441C (en) * 2009-08-19 2016-10-11 Merck Patent Gmbh Antibodies for the detection of integrin complexes in ffpe material
US8709424B2 (en) 2009-09-03 2014-04-29 Merck Sharp & Dohme Corp. Anti-GITR antibodies
GB0919054D0 (en) 2009-10-30 2009-12-16 Isis Innovation Treatment of obesity
JP2013512251A (ja) 2009-11-24 2013-04-11 アンプリミューン、インコーポレーテッド Ｐｄ−ｌ１／ｐｄ−ｌ２の同時阻害
ME02505B (me) 2009-12-29 2017-02-20 Aptevo Res & Development Llc Heterodimerni vezujući proteini i njihove upotrebe
EP2536762A4 (en) * 2010-02-18 2014-01-01 Univ California INTEGRIN ALPHA V BETA 8 NEUTRALIZING ANTIBODY
EP2635605B1 (en) * 2010-11-01 2018-07-25 Symphogen A/S Anti-her3 antibodies and compositions
WO2013039954A1 (en) 2011-09-14 2013-03-21 Sanofi Anti-gitr antibodies
EP3747907A3 (en) * 2013-04-01 2021-02-24 The Regents of the University of California Methods and compositions for treating and preventing disease associated with avb8 integrin
ES2779412T3 (es) * 2014-06-17 2020-08-17 Medimmune Ltd Anticuerpos Alfa-V Beta-8 mejorados
TWI595006B (zh) 2014-12-09 2017-08-11 禮納特神經系統科學公司 抗ｐｄ－１抗體類和使用彼等之方法
EP3277716B1 (en) 2015-04-03 2020-06-24 XOMA Technology Ltd. Treatment of cancer using inhibitors of tgf-beta and pd-1
US10647756B2 (en) 2015-05-18 2020-05-12 Pfizer Inc. Humanized antibodies
JP7034914B2 (ja) * 2015-11-23 2022-03-14 メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング 線維症および／または線維性疾患の治療のための抗α－ｖインテグリン抗体
CA3036232A1 (en) * 2016-09-29 2018-04-05 The Regents Of The University Of California Neutralizing antibodies to the .alpha.v.beta.8 integrin complex for immunotherapy

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1753912A (zh) * 2002-12-23 2006-03-29 惠氏公司 抗pd－1抗体及其用途
CN101287841A (zh) * 2005-07-08 2008-10-15 拜奥根Idec马萨诸塞公司 抗－αvβ6抗体及其用途
CN103857696A (zh) * 2011-08-17 2014-06-11 加利福尼亚大学董事会 结合整合素αVβ8的抗体
CN106661121A (zh) * 2015-04-28 2017-05-10 酵活有限公司 经修饰的抗原结合多肽构建体及其用途

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2024174744A1 (zh) * 2023-02-24 2024-08-29 恒翼生物医药(上海)股份有限公司 抗αvβ3抗体和抗PD-1抗体的联合药物
CN117126282A (zh) * 2023-10-26 2023-11-28 迈威(上海)生物科技股份有限公司 抗体及其在制备阻断αvβ8与Latent TGF-β的结合的药物中的应用
CN117143241A (zh) * 2023-10-26 2023-12-01 迈威(上海)生物科技股份有限公司 与人整合素蛋白itgav/itgb8特异性结合的单克隆抗体
CN117126282B (zh) * 2023-10-26 2024-01-12 迈威(上海)生物科技股份有限公司 抗体及其在制备阻断αvβ8与Latent TGF-β的结合的药物中的应用
CN117143241B (zh) * 2023-10-26 2024-02-23 迈威(上海)生物科技股份有限公司 与人整合素蛋白itgav/itgb8特异性结合的单克隆抗体

Also Published As

Publication number Publication date
PE20211605A1 (es) 2021-08-23
SG11202100888WA (en) 2021-02-25
MX2021002690A (es) 2021-05-12
CA3107137A1 (en) 2020-03-12
PH12021550361A1 (en) 2021-10-25
US20200079855A1 (en) 2020-03-12
IL280317A (en) 2021-03-01
KR20210057726A (ko) 2021-05-21
CO2021002954A2 (es) 2021-03-19
WO2020051333A8 (en) 2020-06-25
AU2019336197A1 (en) 2021-02-18
BR112021004287A2 (pt) 2021-08-03
JP2022508015A (ja) 2022-01-19
US11359024B2 (en) 2022-06-14
EP3847194A1 (en) 2021-07-14
US20220289850A1 (en) 2022-09-15
TW202024131A (zh) 2020-07-01
WO2020051333A1 (en) 2020-03-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN112823167A (zh) 抗-αvβ8抗体和组合物及其用途
CN108137687B (zh) 抗ox40抗体及其用途
KR102665542B1 (ko) T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자 CD3 ABD 엽산 수용체 1(FolR1) 및 PD-1 축 결합 길항물질의 조합 요법
KR102366076B1 (ko) 종양 괴사 인자-유사 리간드 1a 특이적 항체 및 그의 조성물 및 용도
KR102536303B1 (ko) 조직 인자 경로 억제제 항체 및 그의 용도
AU2016340989A1 (en) Anti-IL-2 antibodies and compositions and uses thereof
KR20180082563A (ko) 글루코코르티코이드-유도된 종양 괴사 인자 수용체 (gitr)에 대한 항체 및 그의 용도
KR20090029231A (ko) 항―ｎｋｇ2ａ 항체 및 이들의 용도
KR20150093744A (ko) Bcma 항원 결합 단백질
CA3025536A1 (en) Anti-cxcr5 antibodies and compositions and uses thereof
KR20220091490A (ko) Pd1 및 vegfr2 이중 결합제
WO2023220663A1 (en) Anti-tl1a antibodies and methods of use thereof
CN107922501A (zh) 抗cd40抗体用于治疗狼疮性肾炎的用途
KR20160072268A (ko) 항-efna4 항체-약물 접합체
JP7449390B2 (ja) 抗ｅ－セレクチン抗体、組成物および使用の方法
RU2812478C2 (ru) АНТИ-αvβ8 АНТИТЕЛА И КОМПОЗИЦИИ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ
CN117337306A (zh) 靶向pd-l1和cd73的特异性结合蛋白
US20240117030A1 (en) Multispecific antibodies and uses thereof

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: DE

Ref document number: 40042102

Country of ref document: HK