CN112680476A

CN112680476A - Klhl22-depdc5蛋白相互作用筛选系统

Info

Publication number: CN112680476A
Application number: CN202011534849.9A
Authority: CN
Inventors: 高凯瑜; 夏培雪; 刘颖
Original assignee: Nanjing Jingruikang Molecular Medicine Technology Co ltd
Current assignee: Nanjing Jingruikang Molecular Medicine Technology Co ltd
Priority date: 2020-12-23
Filing date: 2020-12-23
Publication date: 2021-04-20

Abstract

本发明公开了一种KLHL22蛋白和DEPDC5蛋白相互作用筛选系统。该系统包括pHTC‑KLHL22质粒和pNLF1‑N‑DEP质粒；所述pHTC‑KLHL22质粒是将编码KLHL22蛋白的基因插入pHTC质粒的多克隆位点得到的重组质粒；所述pNLF1‑N‑DEP质粒是将编码DEPDC5蛋白DEP结构域的DNA分子插入pNLF1‑N质粒的多克隆位点得到的重组质粒。

Description

KLHL22-DEPDC5蛋白相互作用筛选系统

技术领域

本发明属于药物筛选领域，具体涉及一种KLHL22-DEPDC5蛋白相互作用筛选系统。

背景技术

目前，在药物筛选领域，已经有多种用于蛋白-蛋白相互作用的检测系统，主要分为基于蛋白的药物筛选系统和基于细胞的药物筛选系统，其中蛋白层面的药物筛选系统包括ALPHA系统，HTRF系统等，其特点为最终检测时为裂解状态或蛋白纯化状态。而另外基于细胞的药物筛选系统即在细胞存活的状态下检测蛋白质的相互作用，主要包括FRET和BRET等技术。

KLHL22是一个重要的E3泛素化连接酶，其底物包括PLK1，DEPDC5和PD-1等，在细胞生长、增殖以及癌症形成方面具有重要调控作用。在此前的报道中，KLHL22通过泛素化DEPDC5激活了mTOR信号通路进而促进三阴性乳腺癌的增殖。基于此，发明人希望能够开发指示DEPDC5-KLHL22相互作用的系统，进而开发三阴性乳腺癌相关的药物。

发明内容

本发明的目的是提供一种KLHL22蛋白和DEPDC5蛋白相互作用筛选系统。

本发明所提供的KLHL22蛋白和DEPDC5蛋白相互作用筛选系统，包括pHTC-KLHL22质粒和pNLF1-N-DEP质粒；

所述pHTC-KLHL22质粒是将编码KLHL22蛋白的基因插入pHTC质粒的多克隆位点得到的重组质粒；

所述pNLF1-N-DEP质粒是将编码DEPDC5蛋白DEP结构域的DNA分子插入pNLF1-N质粒的多克隆位点得到的重组质粒。

进一步的，所述pHTC-KLHL22质粒是将编码KLHL22蛋白的基因插入pHTC质粒的SacII酶切识别位点与XbaI酶切识别位点间，得到的重组质粒；

进一步的，所述pNLF1-N-DEP质粒是将编码DEPDC5蛋白DEP结构域的DNA分子插入pNLF1-N质粒的SacII酶切识别位点与XbaI酶切识别位点间，得到的重组质粒。

其中，所述KLHL22的蛋白氨基酸序列如序列表中序列1所示；所述DEPDC5蛋白DEP结构域的氨基酸序列如序列表中序列2所示；

所述编码KLHL22蛋白的基因的核苷酸序列如序列表中序列3所示；所述编码DEP结构域的DNA分子的核苷酸序列如序列表中序列4所示。

进一步的，所述pHTC-KLHL22质粒和pNLF1-N-DEP质粒的质量配比可为1：(0.001-1)，优选为1：(0.001-0.1)，更优选为1：(0.001-0.01)。

进一步的，所述筛选系统还包括HEK-293T细胞。

进一步的，所述系统还包括配基和荧光素底物。

所述配基具体可为

NanoBRET^TM 618Ligand，所述荧光素底物具体可为

萤光素酶底物。

本发明还提供上述KLHL22蛋白和DEPDC5蛋白相互作用筛选系统的应用。

本发明所提供的KLHL22蛋白和DEPDC5蛋白相互作用筛选系统的应用是其在制备药物筛选试剂盒中的应用。

所述药物可为预防和/或治疗乳腺癌(如三阴性乳腺癌)相关的药物。

本发明还提供了一种预防和/或治疗乳腺癌相关药物的体外筛选方法。

本发明所提供的预防和/或治疗乳腺癌相关的药物的体外筛选方法，包括下述步骤：

1)将所述筛选系统中的pHTC-KLHL22质粒和pNLF1-N-DEP质粒转染细胞系并表达；

2)向所述转染后的细胞中加入配基，并同时加入待筛选化合物，8小时后再加入荧光素酶底物混合均匀，利用酶标仪对450nm及620nm的生物发光信号进行检测，并将620nm信号/450nm信号*1000作为最终的蛋白相互作用强度。

3)将加入待筛选化合物体系中蛋白相互作用强度与未加入待筛选化合物的体系中的蛋白相互作用强度进行比较，若蛋白相互作用强度下降具有显著性差异(P＜0.05)，则判定该化合物对乳腺癌癌细胞的增殖具有抑制作用，即该化合物样品具有作为预防和/或治疗乳腺癌相关的药物的潜力；否则不具有作为预防和/或治疗乳腺癌相关的药物的潜力。

其中，所述细胞系为HEK-293T细胞。

所述配基具体可为

NanoBRET^TM 618Ligand，所述荧光素底物具体可为

萤光素酶底物。

所述乳腺癌具体可为三阴性乳腺癌。

为了构建KLHL22-DEPDC5相互作用的模型，发明人曾尝试了ALPHA，NanoBit等系统。发现在原核表达的KLHL22-DEPDC5无法在ALPHA系统下工作。由此推测原核表达的KLHL22及DEPDC5难以进行相互作用。同样，发明人利用了NanoBit系统进行KLHL22-DEPDC5系统的构建，同样无法工作。最终选择了NanoBRET筛选系统，在该系统中，我们选择了KLHL22与DEP结构域的相互作用，其中DEP是DEPDC5与KLHL22相互作用的结构域。

在构建KLHL22-DEP相互作用系统时，发明人将KLHL22和DEP构建到了NanoBRET的pHTC，pHTN，pNLF1-N和pNLF1-C上，由此得到了8个质粒。并且对不同的蛋白N，C端连接进行了测试，最终发现pHTC-KLHL22与pNLF1-N-DEP具有最好的相互作用效果(图2)。除了蛋白不同的连接方式，发明人同样测试了质粒的转染比例，发现当pHTC-KLHL22的质粒量为2ug，pNLF1-N-DEP的质粒量为0.02ug时具有较高的相互作用，该条件更适合用于药物筛选(图3)。除此之外，发明人还在pHTC-KLHL22和pNLF1-N-DEP过表达的同时，过表达了ha-DEP质粒。发现ha-DEP的过表达抑制了KLHL22-DEP的NanoBRET信号，说明本发明的系统真实反映了KLHL22-DEP的相互作用。

附图说明

图1为NanoBRET的方法检测蛋白相互作用原理图；NanoLuc产生460nm荧光，激活618ligand 600nm以上的荧光，600nm/460nm的强度即两个蛋白相互作用强度。

图2为对不同的KLHL22及DEP连接方式进行检测。

图3为对不同转染比例的KLHL-HT，NL-DEP进行相互作用的强度检测；KLHL-HT：NL-DEP：A 1μg+1μg，B 2μg+0.2μg，C 2μg+0.02μg，D 2μg+0.002μg，negative 2μg+0μg；positive 2μg P53-HT+0.2μg NL-MDM2。

图4为在过表达NanoBRET相关质粒的基础上再过表达空载体或ha-DEP，检测NanoBRET系统的信号强度，两者之间有显著性差异，p＝0.0062。

图5为化合物1A8对KLHL22-DEP蛋白相互作用的抑制。

图6为化合物1A8对MD A-MB-231的抑制作用。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但本发明并不限于以下实施例。所述方法如无特别说明均为常规方法。所述原材料如无特别说明均能从公开商业途径获得。

下述实施例中：人类KLHL22(uniprot：Q53GT1)，DEP(DEPDC5 DEP结构域)

KLHL-HT代表pHTC-KLHL22；HT-KLHL代表pHTN-KLHL22；

KLHL-NL代表pNLF1-C-KLHL22；NL-KLHL代表pNLF1-N-KLHL22；

DEP-NL代表pNLF1-C-DEP；NL-DEP代表pNLF1-N-DEP；

DEP-HT代表pHTC-DEP；HT-DEP代表pHTN-DEP.

下述实施例采用的方法：nanoBRET(promega，https://www.promega.com.cn/Products/Protein-Interactions/Live-Cell-Protein-Interactions/NanoBRET-PPI-Starter-Systems/)

下述实施例中使用的化合物1A8，其SMILE编码：

OC＝1/C＝C(/O)C(＝CC＝1[C@]3([H])NC＝2C＝CC＝CC＝2C4＝CC(C)＝NN34)C(C)(C)C其结构式如式I所示：

化合物1A8购自ChemDiv化合物库，尚无CAS号，ChenDiv化合物库编号为：7210-1961。

实施例1、构建KLHL22-DEPDC5蛋白相互作用筛选系统

实验方法：

首先我们利用传统的质粒构建方法构建了KLHL22及DEP过表达的相关质粒(promega，N1811)，具体为将KLHL22和DEP构建到了NanoBRET的pHTC，pHTN，pNLF1-N和pNLF1-C上，由此得到了8个质粒。在获得质粒后，利用PEI试剂(1mg/mL，polysciences，24765)对质粒进行转染。

KLHL22的蛋白氨基酸序列如序列表中序列1所示；DEPDC5蛋白DEP结构域的氨基酸序列如序列表中序列2所示；

编码KLHL22蛋白的基因的核苷酸序列如序列表中序列3所示；所述编码DEP结构域的DNA分子的核苷酸序列如序列表中序列4所示。

在构建上述8个重组质粒时，所采用的酶切位点均为SacII与XbaI。

pCDNA3.1-HA：购自addgene，128034。

pCDNA3.1-HA-DEP：利用传统方法将编码DEP结构域的DNA序列(如序列表中序列4所示)用BamHI和XhoI连接进入到pCDNA3.1-HA质粒中。

首先，将HEK-293T细胞养到了合适的生长状态，并按照30％细胞密度铺到6孔板中。一天后，对0.8-1.2*10⁶个细胞数量进行了质粒转染1ug(KLHL22过表达的相关质粒)+1ug(DEP过表达的相关质粒)。转染后一天，将细胞消化后用计数仪(Thermofisher)计数，并用含有4％血清(Gibco)的Opti-MEM(Gibco)将细胞密度调整为2*10⁶个/mL，并加入

NanoBRET^TM 618Ligand(1000倍稀释，promega，N1662)。24小时后，给细胞加入25uL荧光素底物(

萤光素酶底物)(100倍稀释，promega，N1662)，混合均匀后加入到96孔板的孔中。并利用酶标仪(perkin elmer Envision)对450nm及620nm的生物发光信号进行检测。并将620nm信号/450nm信号*1000作为最终的蛋白相互作用强度。结果见图2。由图2可知，相比于其他7组条件，pHTC-KLHL22与pNLF1-N-DEP组(KLHL-HT+NL-DEP)具有最强的生物发光信号。

除了蛋白不同的连接方式，发明人进一步对质粒的转染比例进行了考察。将pHTC-KLHL22与pNFL1-N-DEP组按照A:1μg+1μg，B:2μg+0.2μg，C:2μg+0.02μg，D:2μg+0.002μg，negative 2μg+0μg，或者positive 2μg pHTC-TP53+0.2μg pNLF1-N-MDM2进行转染。首先，将HEK-293T细胞养到了合适的生长状态，并按照30％细胞密度铺到6孔板中。一天后，对细胞按照上述分组进行质粒转染。转染后一天，将细胞消化后用计数仪(Thermofisher)计数，并用含有4％血清(Gibco)的Opti-MEM(Gibco)将细胞密度调整为2*10⁶个/mL，并加入

萤光素酶底物)(100倍稀释，promega，N1662)，混合均匀后加入到96孔板的孔中。并利用酶标仪(perkin elmer Envision)对450nm及620nm的生物发光信号进行检测。并将620nm信号/450nm信号*1000作为最终的蛋白相互作用强度。并将A组的强度均一化调整为1，对其他实验组进行相应调整。结果见图3。在A-D四组中，2μg：0.02μg组(C组)以及2μg：0.002μg组(D组)具有较高的相互作用强度，且高于试剂盒给出的阳性对照组(positive)。

在图4中，将pHTC-KLHL22与pNFL1-N-DEP组按照1μg+0.01μg+1ug pCDNA3.1-HA或1μg+0.01μg+1ug pCDNA3.1-HA-DEP进行转染。转染后一天，将细胞消化后用计数仪(Thermofisher)计数，并用含有4％血清(Gibco)的Opti-MEM(Gibco)将细胞密度调整为2*10⁶个/mL，并加入618ligand(1000倍稀释，promega，N1662)。24小时后，给细胞加入25uL荧光素底物(100倍稀释，promega，N1662)，混合均匀后加入到96孔板的孔中。并利用酶标仪(perkin elmer)对450nm及620nm的生物发光信号进行检测。并将620nm信号/450nm信号*1000作为最终的蛋白相互作用强度。并将对照(control)的强度均一化调整为1，对其他实验组进行相应调整。图4结果表明，过表达ha-DEP组(o.v.ha-DEP)能够竞争性抑制KLHL22与DEP的相互作用。

实施例2、化合物1A8对KLHL22-DEP蛋白相互作用的抑制

将HEK-293T细胞培养到合适的生长状态，并按照30％细胞密度铺到6孔板中。采用pHTC-KLHL22与pNFL1-N-DEP质粒按照2μg+0.02μg进行转染(1*10⁶个细胞)。转染后一天，将细胞消化后用计数仪(Thermofisher)计数，并用含有4％血清(Gibco)的Opti-MEM(Gibco)将细胞密度调整为2*10⁶个/mL，并加入

NanoBRET^TM 618Ligand(1000倍稀释，promega，N1662)。16小时后，对细胞加入10μM浓度的化合物1A8化合物(compound)或者DMSO溶剂(ctrl)。8小时后，给细胞加入25uL荧光素底物(

萤光素酶底物)(100倍稀释，promega，N1662)，混合均匀后加入到96孔板的孔中。并利用酶标仪(perkin elmerEnvision)对450nm及620nm的生物发光信号进行检测。并将620nm信号/450nm信号*1000作为最终的蛋白相互作用强度。并将对照(ctrl)的强度均一化调整为1，对其他实验组进行相应调整。结果见图5。由图5可知，加入化合物组(compound)的细胞中，KLHL22-DEP的相互作用强度要明显低于对照组(ctrl)强度。说明化合物具有抑制KLHL22-DEP相互作用的功能。

实施例3、化合物1A8对三阴性乳腺癌细胞MD A-MB-231的抑制作用

将典型的三阴性乳腺癌细胞MD A-MB-231以每个孔100μL，5000个细胞的数量接种到96孔板中，待细胞贴壁后，每孔加入1uL 10mM(终浓度为100μM)的化合物(compound)或DMSO溶剂(ctrl)。48小时后，对细胞的数量进行计数，加入药物组的细胞数量(compound)远低于对照组(ctrl)数量，说明化合物具有抑制癌细胞生长的作用。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

SEQUENCE LISTING

<110> 南京景瑞康分子医药科技有限公司

<120> KLHL22-DEPDC5蛋白相互作用筛选系统

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 634

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 1

Met Ala Glu Glu Gln Glu Phe Thr Gln Leu Cys Lys Leu Pro Ala Gln

1 5 10 15

Pro Ser His Pro His Cys Val Asn Asn Thr Tyr Arg Ser Ala Gln His

20 25 30

Ser Gln Ala Leu Leu Arg Gly Leu Leu Ala Leu Arg Asp Ser Gly Ile

35 40 45

Leu Phe Asp Val Val Leu Val Val Glu Gly Arg His Ile Glu Ala His

50 55 60

Arg Ile Leu Leu Ala Ala Ser Cys Asp Tyr Phe Arg Gly Met Phe Ala

65 70 75 80

Gly Gly Leu Lys Glu Met Glu Gln Glu Glu Val Leu Ile His Gly Val

85 90 95

Ser Tyr Asn Ala Met Cys Gln Ile Leu His Phe Ile Tyr Thr Ser Glu

100 105 110

Leu Glu Leu Ser Leu Ser Asn Val Gln Glu Thr Leu Val Ala Ala Cys

115 120 125

Gln Leu Gln Ile Pro Glu Ile Ile His Phe Cys Cys Asp Phe Leu Met

130 135 140

Ser Trp Val Asp Glu Glu Asn Ile Leu Asp Val Tyr Arg Leu Ala Glu

145 150 155 160

Leu Phe Asp Leu Ser Arg Leu Thr Glu Gln Leu Asp Thr Tyr Ile Leu

165 170 175

Lys Asn Phe Val Ala Phe Ser Arg Thr Asp Lys Tyr Arg Gln Leu Pro

180 185 190

Leu Glu Lys Val Tyr Ser Leu Leu Ser Ser Asn Arg Leu Glu Val Ser

195 200 205

Cys Glu Thr Glu Val Tyr Glu Gly Ala Leu Leu Tyr His Tyr Ser Leu

210 215 220

Glu Gln Val Gln Ala Asp Gln Ile Ser Leu His Glu Pro Pro Lys Leu

225 230 235 240

Leu Glu Thr Val Arg Phe Pro Leu Met Glu Ala Glu Val Leu Gln Arg

245 250 255

Leu His Asp Lys Leu Asp Pro Ser Pro Leu Arg Asp Thr Val Ala Ser

260 265 270

Ala Leu Met Tyr His Arg Asn Glu Ser Leu Gln Pro Ser Leu Gln Ser

275 280 285

Pro Gln Thr Glu Leu Arg Ser Asp Phe Gln Cys Val Val Gly Phe Gly

290 295 300

Gly Ile His Ser Thr Pro Ser Thr Val Leu Ser Asp Gln Ala Lys Tyr

305 310 315 320

Leu Asn Pro Leu Leu Gly Glu Trp Lys His Phe Thr Ala Ser Leu Ala

325 330 335

Pro Arg Met Ser Asn Gln Gly Ile Ala Val Leu Asn Asn Phe Val Tyr

340 345 350

Leu Ile Gly Gly Asp Asn Asn Val Gln Gly Phe Arg Ala Glu Ser Arg

355 360 365

Cys Trp Arg Tyr Asp Pro Arg His Asn Arg Trp Phe Gln Ile Gln Ser

370 375 380

Leu Gln Gln Glu His Ala Asp Leu Ser Val Cys Val Val Gly Arg Tyr

385 390 395 400

Ile Tyr Ala Val Ala Gly Arg Asp Tyr His Asn Asp Leu Asn Ala Val

405 410 415

Glu Arg Tyr Asp Pro Ala Thr Asn Ser Trp Ala Tyr Val Ala Pro Leu

420 425 430

Lys Arg Glu Val Tyr Ala His Ala Gly Ala Thr Leu Glu Gly Lys Met

435 440 445

Tyr Ile Thr Cys Gly Arg Arg Gly Glu Asp Tyr Leu Lys Glu Thr His

450 455 460

Cys Tyr Asp Pro Gly Ser Asn Thr Trp His Thr Leu Ala Asp Gly Pro

465 470 475 480

Val Arg Arg Ala Trp His Gly Met Ala Thr Leu Leu Asn Lys Leu Tyr

485 490 495

Val Ile Gly Gly Ser Asn Asn Asp Ala Gly Tyr Arg Arg Asp Val His

500 505 510

Gln Val Ala Cys Tyr Ser Cys Thr Ser Gly Gln Trp Ser Ser Val Cys

515 520 525

Pro Leu Pro Ala Gly His Gly Glu Pro Gly Ile Ala Val Leu Asp Asn

530 535 540

Arg Ile Tyr Val Leu Gly Gly Arg Ser His Asn Arg Gly Ser Arg Thr

545 550 555 560

Gly Tyr Val His Ile Tyr Asp Val Glu Lys Asp Cys Trp Glu Glu Gly

565 570 575

Pro Gln Leu Asp Asn Ser Ile Ser Gly Leu Ala Ala Cys Val Leu Thr

580 585 590

Leu Pro Arg Ser Leu Leu Leu Glu Pro Pro Arg Gly Thr Pro Asp Arg

595 600 605

Ser Gln Ala Asp Pro Asp Phe Ala Ser Glu Val Met Ser Val Ser Asp

610 615 620

Trp Glu Glu Phe Asp Asn Ser Ser Glu Asp

625 630

<210> 2

<211> 75

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 2

Ser Thr Gly Val Gln Leu Leu Ser Glu Gln Lys Gly Leu Ser Pro Tyr

1 5 10 15

Cys Phe Ile Ser Ala Glu Val Val His Trp Leu Val Asn His Val Glu

20 25 30

Gly Ile Gln Thr Gln Ala Met Ala Ile Asp Ile Met Gln Lys Met Leu

35 40 45

Glu Glu Gln Leu Ile Thr His Ala Ser Gly Glu Ala Trp Arg Thr Phe

50 55 60

Ile Tyr Gly Phe Tyr Phe Tyr Lys Ile Val Thr

65 70 75

<210> 3

<211> 1905

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 3

atggcagagg agcaggagtt cacccagctc tgcaagttgc ctgcacagcc ctcacaccca 60

cactgcgtga acaacaccta ccgcagcgca cagcactccc aggctctgct ccgagggctg 120

ctggctctcc gggacagcgg aatcctcttc gatgttgtgc tggtggtgga gggcagacac 180

atcgaggccc atcgcatcct gctggctgcg tcctgcgatt acttcagagg aatgtttgct 240

gggggattga aggagatgga acaggaagag gtcctgatcc acggtgtgtc ctacaatgct 300

atgtgccaaa tcctacattt catatacacc tccgagctgg agctcagcct gagcaatgta 360

caagagacac tggtggctgc ctgccagctt cagatcccag aaattatcca tttctgctgt 420

gatttcctca tgtcctgggt ggacgaagag aacattctcg atgtctaccg gctggcagag 480

ctgtttgact tgagccgcct gactgagcaa ctggacacct atatcctcaa aaactttgtg 540

gccttctctc ggactgacaa gtaccgccag cttccattgg agaaggtcta ctccctcctc 600

agcagcaatc gcctggaggt ctcctgcgag accgaggtat atgagggggc ccttctctac 660

cattatagcc tggagcaggt gcaggctgac cagatctcgc tgcacgagcc cccaaagctc 720

cttgagacag tgcggtttcc gctgatggaa gctgaggtcc tgcagcggct gcatgacaag 780

ctggacccca gccctttgag ggacacagtg gccagcgccc tcatgtacca ccggaacgag 840

agcctacagc ccagcctgca gagcccgcaa acggagctgc ggtcggactt ccagtgcgtt 900

gtgggcttcg ggggcattca ctccacgccg tccactgtcc tcagcgacca ggccaagtat 960

ctaaacccct tactgggaga gtggaagcac ttcactgcct ccctggcccc ccgcatgtcc 1020

aaccagggca tcgcggtgct caacaacttc gtatacttga ttggagggga caacaatgtc 1080

caaggatttc gagcagagtc ccgatgctgg aggtatgacc cacggcacaa ccgctggttc 1140

cagatccagt ccctgcagca ggagcacgcc gacctgtccg tgtgtgttgt aggcaggtac 1200

atctacgctg tggcgggccg tgactaccac aatgacctga atgctgtgga gcgctacgac 1260

cctgccacca actcctgggc atacgtggcc ccactcaaga gggaggtgta tgcccacgca 1320

ggcgcgacgc tggaggggaa gatgtatatc acctgcggcc gcagagggga ggattacctg 1380

aaagagacac actgctacga tccaggcagc aacacttggc acacactggc tgatgggcct 1440

gtgcggcgcg cctggcacgg catggcaacc ctcctcaaca agctgtatgt gatcgggggc 1500

agcaacaacg atgccggata caggagggac gtgcaccagg tggcctgcta cagctgcacg 1560

tctggacagt ggtcatctgt ctgcccactc cctgctgggc acggtgagcc tggcattgct 1620

gtgctggaca acaggatcta tgtgttaggt ggccgctcac acaaccgcgg cagccgcaca 1680

ggctacgtgc acatttacga tgtggagaag gactgctggg aggaagggcc ccagctggac 1740

aactccatct caggcctggc ggcctgtgtg ctcaccctgc cccgctccct gctccttgag 1800

ccgccccgcg ggacccctga ccgcagccag gccgacccgg actttgcctc tgaggtgatg 1860

agtgtgtctg actgggagga gtttgacaac tccagtgagg actag 1905

<210> 4

<211> 225

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 4

tcgacaggag tccagctgct ctctgaacag aagggcctct caccgtactg cttcatcagc 60

gcggaggtgg tacactggtt ggtgaaccac gtggagggga tccagacaca ggcgatggcc 120

attgacatca tgcagaaaat gctggaagag cagctcatca cacatgcatc tggcgaagcc 180

tggcggacct tcatctacgg cttctatttc tacaagatag taacg 225

Claims

1.一种KLHL22蛋白和DEPDC5蛋白相互作用筛选系统，包括pHTC-KLHL22质粒和pNLF1-N-DEP质粒；

2.如权利要求1所述的系统，其特征在于：所述KLHL22的蛋白氨基酸序列如序列表中序列1所示；所述DEPDC5蛋白DEP结构域的氨基酸序列如序列表中序列2所示。

3.如权利要求2所述的系统，其特征在于：所述编码KLHL22蛋白的基因的核苷酸序列如序列表中序列3所示；所述编码DEP结构域的DNA分子的核苷酸序列如序列表中序列4所示。

4.如权利要求1至3中任一所述的系统，其特征在于：所述pHTC-KLHL22质粒和pNLF1-N-DEP质粒的质量配比为1：(0.001-1)，优选为1：(0.001-0.1)，更优选为1：(0.001-0.01)。

5.如权利要求4所述的系统，其特征在于：所述pHTC-KLHL22质粒和pNLF1-N-DEP质粒的质量配比为1:0.01或1：0.001。

6.如权利要求1至5中任一所述的系统，其特征在于：所述系统还包括HEK-293T细胞。

7.如权利要求1至6中任一所述的系统，其特征在于：所述系统还包括配基和荧光素底物。

8.如权利要求6所述的系统，其特征在于：所述配基为

NanoBRET^TM618Ligand，所述荧光素酶底物为

萤光素酶底物。

9.权利要求1-8中任一项所述的系统在制备药物筛选试剂盒中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述药物为预防和/或治疗三阴性乳腺癌相关的药物。