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CN112543773A - SIRPα-4-1BBL变体融合蛋白及其使用方法 - Google Patents

SIRPα-4-1BBL变体融合蛋白及其使用方法 Download PDF

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CN112543773A
CN112543773A CN201980052845.6A CN201980052845A CN112543773A CN 112543773 A CN112543773 A CN 112543773A CN 201980052845 A CN201980052845 A CN 201980052845A CN 112543773 A CN112543773 A CN 112543773A
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acid sequence
sirpa
seq
fusion protein
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Abstract

本发明公开一种SIRPα‑4‑1BBL变体融合蛋白。本发明亦提供一种包括SIRPα变体的经分离的多肽。本发明亦提供一种编码SIRPα‑4‑1BBL融合蛋白或经分离的多肽的多核苷酸及核酸构建体、表达所述多核苷酸及所述核酸构建体的宿主细胞，及其使用的方法。

Description

SIRPα-4-1BBL变体融合蛋白及其使用方法
相关申请
本申请基于35 USC§119(e)要求于2018年7月11日提交美国临时专利申请案第62/696,362号的优先权，其全部内容通过引用结合在本申请中。
序列表声明
建立于2019年7月11日且标题为77794序列表.txt的包括192,512个字节的ASCII文件与本申请同时提交，其通过引用结合在本申请中。
技术领域及背景技术
在本发行的一些实施例中，本发明涉及一SIRPα-4-1BBL变体融合蛋白及其使用方法。
双信号蛋白(DSP)，亦称为信号转换蛋白(SCP)，目前在本领域中称为双功能融合蛋白，其将第I型膜蛋白的胞外部分(胞外氨基端)连接至第II型膜蛋白的胞外部分(胞外羧基端)，形成具有两个活性侧的融合蛋白(参见例如美国专利第7,569,663号及第8,039,437号)。
SIRPα(信号调节蛋白α)是免疫球蛋白超家族的细胞表面受体。SIRPα主要在来自诸如巨噬细胞及树突状细胞(DC)的吞噬细胞谱系的免疫细胞的表面表达。CD47是SIRPα的配体。CD47是免疫球蛋白超家族中的细胞表面分子。CD47通过在吞噬细胞上所表达的SIRPα的连接作为吞噬作用的抑制剂。CD47在大多数的正常组织中广泛地表达。以此方式，由于CD47的失去会导致衰老或受损细胞的稳态的吞噬作用，因此，CD47作为“不要吃我的信号”及自我的标记。已发现CD47在多种人类肿瘤类型中表达。肿瘤通过表达抗吞噬信号，包括CD47，以逃避巨噬细胞的吞噬作用。尽管CD47在正常细胞上普遍地低表达，然而相较于正常细胞，多种肿瘤所表达的CD47水平会增加，且过度表达CD47会使肿瘤能够通过逃避吞噬作用而逃脱先天免疫系统的监视。
4-1BBL是4-1BB受体(CD137)的活化配体，是TNF受体超家族的成员及有效的经诱导激活的T细胞共刺激分子。4-1BBL自然地形成同源三聚体，但通过4-1BB进行信号传导需要显着的4-1BBL的寡聚合。4-1BBL存在于多种抗原呈现细胞(APC)上，包括树突细胞(DC)、B细胞及巨噬细胞。在静止的T细胞或T细胞株中并未检测到4-1BB受体(<3％)，然而，当T细胞被激活时，4-1BB被稳定地上调。4-1BB的激活会上调生存的基因、增强细胞分裂、诱导细胞激素产生，以及在T细胞中防止经激活诱导的细胞的死亡。
其他背景技术包括：
维斯科普夫K.等人，Science，(2013)；341(6141)：88-91；
国际专利申请公开第WO 2017027422号；
国际专利申请公开第WO 2001086003号；
国际专利申请公开第WO 2001075067号；
国际专利申请公开第WO 2017194641号；
国际专利申请公开第WO 2014180288号；
国际专利申请公开第WO 2017059168号；
国际专利申请公开第WO 2001/049318号；
国际专利申请公开第WO 2016/139668号；
国际专利申请公开第WO 2014/106839号；
国际专利申请公开第WO 2012/042480号；
美国专利申请公开第20150183881号；
美国专利申请公开第20070110746号；
美国专利申请公开第20070036783号；以及
美国专利第9562087号。
发明内容
根据本发明的一些实施例的一方面，提供一种SIRPα-4-1BBL融合蛋白，包括一SIRPα氨基酸序列及一4-1BBL氨基酸序列，其中所述SIRPα氨基酸序列的长度为100至119个氨基酸且与一氨基酸序列具有至少95％的同一性，所述氨基酸序列是选自由SEQ ID NO：24及26所组成的群组，及/或其中所述4-1BBL氨基酸序列：
(a)长度为185至202个氨基酸且与一氨基酸序列具有至少95％的同一性，所述氨基酸序列是选自由SEQ ID NO：22、23、27及28所组成的群组；长度为170至197个氨基酸且与一氨基酸序列具有至少80％的同一性，所述氨基酸序列是选自由SEQ ID NO：74及76所组成的群组，且不包括对应于SEQ ID NO：3的氨基酸片段G198至E205；长度为170至182个氨基酸且与SEQ ID NO：72具有至少80％的同一性，且不包括对应于SEQ ID NO：3的氨基酸片段A1至E23；或长度为184个氨基酸且与SEQ ID NO：70具有至少80％的同一性；及/或
(b)包括4-1BBL氨基酸序列的三个重复；
且其中所述融合蛋白具有至少以下的能力之一：
(i)结合CD47及4-1BB；
(ii)在表达所述4-1BB的细胞中激活所述4-1BB的信号传导途径；
(iii)共刺激表达所述4-1BB的免疫细胞；及/或
(iv)相较于缺乏所述SIRPα-4-1BBL融合蛋白，增强通过吞噬细胞表达所述CD47的病理细胞的吞噬作用。
根据本发明的一些实施例的一方面，所述SIRPα-4-1BBL融合蛋白包括：一SIRPα氨基酸序列及一4-1BBL氨基酸序列，其中所述SIRPα氨基酸序列的长度为100至119个氨基酸且与一氨基酸序列具有至少95％的同一性，所述氨基酸序列是选自由SEQ ID NO：24及26所组成的群组；及/或其中所述4-1BBL氨基酸序列的长度为185至202个氨基酸且与一氨基酸序列具有至少95％的同一性，所述氨基酸序列是选自由SEQ ID NO：22、23、27及28所组成的群组；且其中所述多肽具有至少以下的能力之一：
(i)结合CD47及4-1BB；
(ii)在表达所述4-1BB的细胞中激活所述4-1BB的信号传导途径；
(iii)共刺激表达所述4-1BB的免疫细胞；及/或
(iv)相较于缺乏所述SIRPα-4-1BBL融合蛋白，增强通过吞噬细胞表达所述CD47的病理细胞的吞噬作用。
根据本发明的一些实施例的一方面，所述经分离的多肽包括：一SIRPα氨基酸序列，其中所述SIRPα氨基酸序列的长度为100至119个氨基酸且与一氨基酸序列具有至少95％的同一性，所述氨基酸序列是选自由SEQ ID NO：24至26所组成的群组；且其中所述多肽具有结合CD47的能力。
根据本发明的一些实施例的一方面，提供一种经分离的多肽，包括一4-1BBL氨基酸序列，其中所述4-1BBL氨基酸序列的长度为185至202个氨基酸且与一氨基酸序列具有至少95％的同一性，所述氨基酸序列是选自由SEQ ID NO：22、23、27及28所组成的群组；且其中所述多肽具有至少以下的能力之一：
(i)结合4-1BB；
(ii)在表达所述4-1BB的细胞中激活所述4-1BB的信号传导途径；及/或
(iii)共刺激表达所述4-1BB的免疫细胞。
根据本发明的一些实施例，所述SIRPα氨基酸序列的长度为至少115个氨基酸。
根据本发明的一些实施例，所述SIRPα氨基酸序列的长度为至少116个氨基酸。
根据本发明的一些实施例，所述SIRPα氨基酸序列包括在一氨基酸残基处的一突变，所述氨基酸残基是选自由对应于SEQ ID NO：2的L4、A27、E47及V92所组成的群组。
根据本发明的一些实施例，所述SIRPα氨基酸序列包括在一氨基酸残基处的一突体，所述突变是选自由对应于SEQ ID NO：2的L4I、A27I、E47V及V92I所组成的群组。
根据本发明的一些实施例，所述SIRPα氨基酸序列不包括对应于SEQ ID NO：2的氨基酸残基K117至Y343中的任一者。
根据本发明的一些实施例，所述SIRPα氨基酸序列包括所述SEQ ID NO：24或26。
根据本发明的一些实施例，所述SIRPα氨基酸序列是由所述SEQ ID NO：24或26所组成。
根据本发明的一些实施例，所述4-1BBL氨基酸序列与一氨基酸序列具有至少95％的同一性，所述氨基酸序列是选自由SEQ ID NO：22至23所组成的群组。
根据本发明的一些实施例，所述4-1BBL氨基酸序列不包括对应于SEQ ID NO：3的氨基酸残基A1至V6或A1至G14中的任一者。
根据本发明的一些实施例，所述4-1BBL氨基酸序列包括所述SEQ ID NO：22、23、27或28。
根据本发明的一些实施例，所述4-1BBL氨基酸序列是由所述SEQ ID NO：22、23、27或28所组成。
根据本发明的一些实施例：
(i)在所述SIRPα氨基酸序列是如SEQ ID NO：2或25所示，以及所述4-1BBL的氨基酸序列是如SEQ ID NO：22、23、27或28所示；或
(ii)在所述SIRPα氨基酸序列是如SEQ ID NO：24或26所示，以及所述4-1BBL的氨基酸序列是如SEQ ID NO：3、22、23、27或28所示。
根据本发明的一些实施例：
(i)在所述SIRPα氨基酸序列是如SEQ ID NO：2所示，以及所述4-1BBL的氨基酸序列是如SEQ ID NO：22或23所示；或
(ii)在所述SIRPα氨基酸序列是如SEQ ID NO：24所示，以及所述4-1BBL的氨基酸序列是如SEQ ID NO：22所示。
根据本发明的一些实施例，所述4-1BBL的氨基酸序列包括SEQ ID NO：72、74或76所示。
根据本发明的一些实施例，所述4-1BBL氨基酸序列是由所述SEQ ID NO：72、74或76所组成。
根据本发明的一些实施例，所述4-1BBL氨基酸序列包括所述SEQ ID NO：70。
根据本发明的一些实施例，所述4-1BBL氨基酸序列是由所述SEQ ID NO：70所组成。
根据本发明的一些实施例，在所述SIRPα与所述4-1BBL之间，所述SIRPα-4-1BBL融合蛋白包括一连接子。
根据本发明的一些实施例，在所述4-1BBL氨基酸序列的各个所述三个重复之间，所述SIRPα-4-1BBL融合蛋白包括一连接子。
根据本发明的一些实施例，所述连接子的长度为一至六个氨基酸。
根据本发明的一些实施例，所述连接子是一单一氨基酸连接子。
根据本发明的一些实施例，所述连接子是甘氨酸。
根据本发明的一些实施例，所述连接子并非为一抗体的一Fc结构域或其片段。
根据本发明的一些实施例，所述连接子是一抗体的一Fc结构域或其片段。
根据本发明的一些实施例，所述SIRPα-4-1BBL融合蛋白是至少为同源三聚体的形式。
根据本发明的一些实施例，通过SEC-MALS测定，所述至少为同源三聚体的分子量至少为100kD。
根据本发明的一些实施例，所述SIRPα-4-1BBL融合蛋白或所述经分离的多肽是可溶的。
根据本发明的一些实施例，在相同的生产条件下，所述融合蛋白的产量相较于SEQID NO：5的产量至少高1.5倍，所述生产条件包括在哺乳动物细胞中表达，以及在32至37℃、5至10％二氧化碳下培养5至13天。
根据本发明的一些实施例，在相同的生产条件下，所述融合蛋白的聚集体的量相较于SEQ ID NO：5的聚集体的量低至少20％，所述聚集体的分子量为至少300千道尔顿，且所述生产条件包括在哺乳动物细胞中表达，以及在32至37℃、5至10％二氧化碳下培养5至13天。
根据本发明的一些实施例，所述SIRPα-4-1BBL融合蛋白的氨基酸序列包括与一氨基酸序列具有至少95％的同一性，所述氨基酸序列是选自由SEQ ID NO：11、13、15、16、18至21及45至49所组成的群组。
根据本发明的一些实施例，所述SIRPα-4-1BBL融合蛋白的氨基酸序列包括与一氨基酸序列具有至少95％的同一性，所述氨基酸序列是选自由SEQ ID NO：11、13及16所组成的群组。
根据本发明的一些实施例，所述SIRPα-4-1BBL融合蛋白的氨基酸序列包括与一氨基酸序列，所述氨基酸序列是选自由SEQ ID NO：11、13、15、16、18至21及45至49所组成的群组。
根据本发明的一些实施例，所述SIRPα-4-1BBL融合蛋白的氨基酸序列包括与一氨基酸序列，所述氨基酸序列是选自由SEQ ID NO：11、13及16所组成的群组。
根据本发明的一些实施例，所述SIRPα-4-1BBL融合蛋白的氨基酸序列是由一氨基酸序列所组成，所述氨基酸序列是选自由SEQ ID NO：11、13、15、16、18至21及45至49所组成的群组。
根据本发明的一些实施例，所述SIRPα-4-1BBL融合蛋白的氨基酸序列是由一氨基酸序列所组成，所述氨基酸序列是由SEQ ID NO：11、13及16所组成。
根据本发明的一些实施例，提供一种多核苷酸，所述多核苷酸编码所述SIRPα-4-1BBL融合蛋白或所述经分离的多肽
根据本发明的一些实施例，提供一种核酸构建体，包括所述多核苷酸以及一调控组件，且所述调控组件在一宿主细胞中是用于指导所述多核苷酸的表达。
根据本发明的一些实施例，所述多核苷酸包括一核酸序列，所述核酸序列是选自由SEQ ID NO：55至66及68所组成的群组。
根据本发明的一些实施例，所述多核苷酸包括一核酸序列，所述核酸序列是选自由SEQ ID NO：55、56及58所组成的群组。
根据本发明的一些实施例，提供一种宿主细胞，包括所述SIRPα-4-1BBL融合蛋白或所述多肽；或所述多核苷酸或所述核酸构建体。
根据本发明的一些实施例，提供一种生产一SIRPα-4-1BBL融合蛋白或一多肽的方法，所述方法包括在一宿主细胞中表达所述多核苷酸或所述核酸构建体。
根据本发明的一些实施例，所述的方法包括：分离所述融合蛋白或所述多肽。
根据本发明的一些实施例的一方面，提供一种通过得益于激活免疫细胞而治疗一疾病的方法，所述方法包括：将所述SIRPα-4-1BBL融合蛋白或所述经分离的多肽、所述多核苷酸或所述核酸构建体，或所述宿主细胞，投予至有需要的一受试者。
根据本发明的一些实施例，所述方法进一步包括：将一治疗剂投予至所述受试者，以治疗所述疾病。
根据本发明的一些实施例的一方面，提供一种所述SIRPα-4-1BBL融合蛋白或所述经分离的多肽、所述多核苷酸或所述核酸构建体，或所述宿主细胞用于通过得益于激活免疫细胞而治疗一疾病之用途。
根据本发明的一些实施例，所述用途的成分进一步包括用于治疗所述疾病的一治疗剂。
根据本发明的一些实施例的一方面，提供一种制品，包括：一包装材料，所述包装材料是包装用于通过得益于激活免疫细胞而治疗一疾病的一治疗剂；以及所述SIRPα-4-1BBL融合蛋白或所述经分离的多肽、所述多核苷酸或所述核酸构建体，或所述宿主细胞。
根据本发明的一些实施例，所述疾病的细胞表达CD47。
根据本发明的一些实施例，所述疾病包括一过度增生性疾病。
根据本发明的一些实施例，所述过度增生性疾病包括硬化症或纤维症、特发性肺纤维化、牛皮癣、系统性硬化症/硬皮症、原发性胆道的胆管炎、原发性硬化性胆管炎、肝纤维化、预防放射性肺纤维化、骨髓纤维化或腹膜后纤维化。
根据本发明的一些实施例，所述过度增生性疾病包括癌症。
根据本发明的一些实施例，所述癌症是选自由淋巴瘤、白血病及恶性肿瘤所组成的群组。
根据本发明的一些实施例，所述疾病包括一与免疫抑制或经药物诱导的免疫抑制有关的疾病。
根据本发明的一些实施例，所述疾病包括HIV、麻疹、流感、LCCM、RSV、人类鼻病毒、EBV、CMV或细小病毒。
根据本发明的一些实施例，所述疾病包括感染。
根据本发明的一些实施例的一方面，提供一种激活免疫细胞的方法，包括：在体外激活免疫细胞，所述免疫细胞存在有所述SIRPα-4-1BBL融合蛋白或所述经分离的多肽、所述多核苷酸或所述核酸构建体，或所述宿主细胞。
根据本发明的一些实施例，所述激活是在表达CD47或外源性CD47的细胞的存在下进行的。
根据本发明的一些实施例，所述表达CD47的细胞包括病理细胞。
根据本发明的一些实施例，所述病理细胞包括癌细胞。
根据本发明的一些实施例，所述激活是在一抗癌剂的存在下进行的。
根据本发明的一些实施例，用于治疗所述疾病的所述治疗剂或所述抗癌剂包括一抗体。
根据本发明的一些实施例，所述抗体是选自由利妥昔单抗(rituximab)、西妥昔单抗(cetuximab)、曲妥珠单抗(trastuzumab)、埃德可洛单抗(edrecolomab)、阿美妥珠单抗(almetuzumab)、吉妥珠单抗(gemtuzumab)、伊布利妥单抗(ibritumomab)、帕尼单抗(panitumumab)、贝利单抗(Belimumab)、贝伐单抗(Bevacizumab)、比妥单抗美坦新(Bivatuzumab mertansine)、布尔妥珠单抗(Blinatumomab)、布隆妥维单抗(Blontuvetmab)、布伦妥昔单抗维多丁(Brentuximab vedotin)、卡妥索单抗(Catumaxomab)、西妥木单抗(Cixutumumab)、达克珠单抗(Daclizumab)、阿达木单抗(Adalimumab)，贝索洛单抗(Bezlotoxumab)、聚乙二醇赛妥珠单抗(Certolizumab pegol)、西他珠单抗(Citatuzumab bogatox)、达拉他珠单抗(Daratumumab)、地昔单抗(Dinutuximab)、依洛珠单抗(Elotuzumab)、曲妥单抗(Ertumaxomab)、依他西单抗(Etaracizumab)、吉妥单抗奥佐米星(Gemtuzumab ozogamicin)、吉瑞妥昔单抗(Girentuximab)、奈昔妥木单抗(Necitumumab)、奥比努珠单抗(Obinutuzumab)、奥法木单抗(Ofatumumab)、帕妥珠单抗(Pertuzumab)、雷米单抗(Ramucirumab)、塞妥昔单抗(Siltuximab)、托西莫单抗(Tositumomab)、曲妥珠单抗(Trastuzumab)、尼武单抗(Nivolumab)、派姆单抗(Pembrolizumab)、杜鲁伐单抗(Durvalumab)、阿妥昔单抗(Atezolizumab)、阿维鲁单抗(Avelumab)及伊匹单抗(ipilimumab)所组成的群组。
根据本发明的一些实施例，所述抗体是选自由利妥昔单抗、西妥昔单抗及阿美妥珠单抗(almetuzumab)所组成的群组。
根据本发明的一些实施例，用于治疗所述疾病的治疗剂或抗癌剂包括一IMiD(例如，沙利度胺、来那度胺、泊马度胺)。
根据本发明的一些实施例，所述方法包括：在激活之后将免疫细胞过继转移至有需要的一受试者。
根据本发明的一些实施例，所述免疫细胞包括T细胞。
根据本发明的一些实施例，所述免疫细胞包括吞噬细胞。
除非本文另有定义，否则本文中所使用的所有技术的术语及/或科学的术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。尽管与本文中所描述的彼等类似或等同的方法及材料可用于本发明的实施例的实施或测试中，不过以下面描述示例性的方法及/或材料。在有冲突的情况下，以专利说明书及其定义为准。此外，材料、方法及实施例仅是说明性的，并不意图必然是限制性的。
附图说明
本文仅通过示例的方式，并参考附图描述本发明的一些实施例。具体详细地参考附图，要强调的是，所示出的细节是通过实例显示且是出于对本发明的实施例的说明性讨论的目的。就这此方面，结合附图所进行的描述对于本领域技术人员而言显而易见的是能够如何实施本发明的实施例。
在图式中：
图1是一示意图，显示包括N端信号肽及C端带有His标签(SEQ ID NO：43)的SIRPα-4-1BBL融合蛋白，在本文中称为“DSP107”(SEQ ID NO：5)。显示信号肽(底线，SEQ ID NO：4)、SIRPα域(红色，SEQ ID NO：2)、甘氨酸连接子(黑色)、4-1BBL域(蓝色，SEQ ID NO：3)及C端带有His标签(黑色粗体)。
图2A至图2C证明DSP107的经预测的3D结构(SEQ ID NO：5)。图2A是一示意性3D模型。SIRPα是描绘为灰色带、CD47(SIRPα受体)是描绘为绿色带、4-1BBL是描绘为蓝色带及额外的2个拷贝的4-1BBL(形成三聚体)是描绘为浅蓝色。图2B是示意性的完整原子3D模型。图2C是示意性3D模型。X射线分辨域是由其表面表示，并通过一疏水性标度着色：蓝色(最亲水的)至棕色(疏水的)。4-1BBL显示较高水平的经暴露的疏水区域。
图3是在DSP107(SEQ ID NO：5)中所识别的结构域及区段的示意图。浅蓝色突显Ig样的V型域、黄色突显Ig样-C1第1型结构域、绿色突显Ig样-C1第2型结构域、X射线分辨的部分是以灰色突显，而侧面/非结构化区域标有红色框。
图4证明本文中称为“DSP107_var1”(SEQ ID NO：11)的SIRPα-4-1BBL变体融合蛋白的经预测的3D结构。上图显示在表面呈现的3D结构，且按疏水性等级着色：蓝色为亲水性，且棕色为疏水性表面。下图以色带显示3D结构，所述结构自N端(蓝色)至C端(红色)的序列位置上色。
图5证明在本文中称为“DSP107_var2”(SEQ ID NO：13)的SIRPα-4-1BBL变体融合蛋白的经预测的3D结构。上图显示在表面呈现的3D结构，且按疏水性等级着色：蓝色为亲水性，且棕色为疏水性表面。下图以色带显示3D结构，所述结构自N端(蓝色)至C端(红色)的序列位置上色。
图6证明在本文中称为“DSP107_var3.1”(SEQ ID NO：15)的SIRPα-4-1BBL变体融合蛋白的经预测的3D结构。上图显示在表面呈现的3D结构，且按疏水性等级着色：蓝色为亲水性，且棕色为疏水性表面。下图以色带显示3D结构，所述结构自N端(蓝色)至C端(红色)的序列位置上色。
图7A至7B显示SIRPα-1BBL融合蛋白的SDS-PAGE分析。N端带有His标签的DSP107[标记为(NH)，SEQ ID NO：44]、C端带有His标签的DSP107[标记为(CH)，SEQ ID NO：1]，以及C端带有His标签的DSP107变体[标记为(CH)-V1、(CH)-V2及(CH)-V3，分别为SEQ ID NO：12、14及17](2μg/孔)在还原的(图7A)及非还原的(图7B)条件下的4至20％SDS-PAGE上进行分离。通过e-染色以观察蛋白质在胶体上的移动。分子尺寸的蛋白质标记亦在同一片胶片上分离且尺寸如结果所示。
图8A至8C显示SIRPα-1BBL融合蛋白的西方印迹分析。N端带有His标签的DSP107[标记为(NH)，SEQ ID NO：44]、C端带有His标签的DSP107[标记为(CH)，SEQ ID NO：1、C端带有His标签的DSP107_V1[标记为(CH)-V1，SEQ ID NO：12]、C端带有His标签的DSP107_V2[标记为(CH)-V2，SEQ ID NO：14]，以及C端带有His标签的DSP107_V3.1[标记为(CH)-V3.1，SEQID NO：14](500ng/孔)在非还原的(图8A)及还原的(图8B)条件下的SDS-PAGE上进行分离，之后使用抗4-1BBL抗体进行免疫印迹。C端带有His标签的DSP107_V2[标记为(CH)-V2，SEQID NO：14](50ng/孔)在非还原的条件下的SDS-PAGE上进行分离，之后使用抗SIRPα抗体进行免疫印迹(图8A)。
图9是显示一图表，其是使用用于结合的抗4-1BBL及用于检测的SIRPα-生物素化抗体，通过夹心ELISA检测，显示N端带有His标签的DSP107[标记为(NH)，SEQ ID NO：44]、C端带有His标签的DSP107_V1[标记为(CH)-V1，SEQ ID NO：12]，以及C端带有His标签的DSP107_V2[标记为(CH)-V2，SEQ ID NO：14]以相似的剂量反应方式结合至SIRPα及4-1BBL。
图10是一条状表，其是通过流式细胞仪分析，显示C端带有His标签的DSP107[标记为(CH)，SEQ ID NO：1]、C端带有His标签的DSP107_V1[标记为(CH)-V1，SEQ ID NO：12]、C端带有His标签的DSP107_V2[标记为(CH)-V2，SEQ ID NO：14]，以及C端带有His标签的DSP107_V3.1[标记为(CH)-V3.1，SEQ ID NO：17]的SIRPα部分的结合。显示的是GMFI值。
图11显示图表，其证明经生产的SIRPα-4-1BBL融合蛋白会促进T细胞的增殖。如所示，其是在抗CD3的存在下且添加有IL-2或不添加IL-2的条件下，每毫升的PBMC与0.01μg的N端带有His标签的DSP107[标记为(NH)，SEQ ID NO：44]、C端带有His标签的DSP107_V1[标记为(CH)-V1，SEQ ID NO：12]，或C端带有His标签的DSP107_V2[标记为(CH)-V2，SEQ IDNO：17]一起培养；且在指定的时间点通过合流检测以确定增殖。
图12显示一条状图，其证明在指定时间点，相较于未经刺激的细胞(na)，在存在次优浓度的抗CD3及/或IL-2的刺激下，人类PBMC上的4-1BB的表达。显示的是GMFI值。
图13A至13C证明SIRPα-4-1BBL融合蛋白产生阻断SIRPα与4-1BBL的相互作用。图13A显示分析的设计：将重组人类CD47结合至ELISA盘上。将SIRPα-4-1BBL融合蛋白或阳性对照抗CD47抗体加入盘中。洗涤后，加入经生物素化的重组人类SIRPα，然后加入抗链霉亲和素HRP及TMB基质。通过在450nm处的吸亮度检测SIRPα与CD47的相互作用。图13B是一图表，其证明相较于阻断抗体阳性对照组，通过C端带有His标签的DSP107[标记为(CH)，SEQID NO：1]、C端带有His标签的DSP107_V1[标记为(CH)-V1，SEQ ID NO：12]、C端带有His标签的DSP107_V2[标记为(CH)-V2，SEQ ID NO：14]，以及C端带有His标签的DSP107_V3.1[标记为(CH)-V3.1，SEQ ID NO：17]，以阻断SIRPα的相互作用。图13C是一图表，显示计算出有限浓度范围内的EC50值。
图14A-B是柱状图，其证明经生产的SIRPα-4-1BBL融合蛋白增强经多形核(PMN)介导的人类癌细胞的吞噬作用。将PMN及Ramos或DLD1癌细胞与C端带有His标签的DSP107[标记为(CH)，SEQ ID NO：1)、C端带有His标签的DSP107_V1[标记为(CH)-V1，SEQ ID NO：12]、C端带有His标签的DSP107_V2[标记为(CH)-V2，SEQ ID NO：14]或C端带有His标签的DSP107_V3.1[标记为(CH)-V3.1，SEQ ID NO：17]一起培养2小时(图14A)或18小时(图14B)后所显示的吞噬百分比；如所示，单独使用或与利妥昔单抗(RTX)或西妥昔单抗(CTX)组合使用。
图15显示柱状图，其证明经生产的SIRPα-4-1BBL融合蛋白增强经巨噬细胞介导的人类淋巴瘤细胞的吞噬作用。在巨噬细胞及SUDHL5、SUDHL4及OCI-LY3癌细胞与C端带有His标记的DSP107[标记为(CH)，SEQ ID NO：1]、C端带有His标记的DSP107_V1[标记为(CH)-V1，SEQ ID NO：12]、C-端带有His标签的DSP107_V2[标记为(CH)-V2，SEQ ID NO：14]，或C端带His标签的DSP107_V3.1[标记为(CH)-V3.1，SEQ ID NO：17]一起培养2小时后所显示的吞噬百分比；如所示，单独使用或与利妥昔单抗(RTX)组合使用。
图16是一图表，其证明在培养2小时后，C端带有His标签的DSP107_V2[标记为(CH)-V2，SEQ ID NO：14]会以剂量依赖性的方式，增强经巨噬细胞介导的SUDHL4癌细胞的吞噬作用。
图17是一柱状图，其显示通过双侧ELISA检测，在第11天自进料培养物中提取小样品中DSP107_V2(SEQ ID NO：13)的浓度。
图18显示DSP107_V2(SEQ ID NO：13)的SDS-PAGE分析。在还原的条件下，在4至20％SDS-PAGE上分离经纯化的DSP107_V2(5mg)，以及在第11天自进料培养物中提取小样品中(5μl)，之后进行考马斯染色。
图19A至图19B显示直方图，通过流式细胞术分析检测，其证明在CHO-K1过度表达(OX)人类CD47细胞(图19A)及SUDHL4细胞(图19B)上CD47的膜表达，且未在CHO-K1细胞上表达(图19A)。
图20显示直方图，通过流式细胞术分析检测，其证明在HT1080细胞OX 4-1BB上的4-1BB及CD47的膜表达，且在HT1080亲代(WT)的细胞上未表达4-1BB。
图21A至图21B显示图表，通过流式细胞术分析检测，其证明DSP107_V2(SEQ IDNO：13)的SIRPα部分与CHO-K1-CD47细胞(图21A)及SUDHL4细胞(图21B)的结合，且未与CHO-K1亲代的细胞结合。显示的是阳性染色细胞的百分比或GMFI值。
图22A至图22F显示通过流式细胞术分析检测，证明DSP107_V2(SEQ ID NO：13)的两个臂与过度表达4-1BB的HT1080细胞的结合(图22A至图22B，E至F)，或SIRPα臂与在HT1080 WT细胞上的CD47的结合(图22C至图22D。如显示，添加抗CD47抗体及/或抗4-1BB抗体以用于确定特异性结合。显示的是阳性染色细胞的百分比及GMFI值。
图23A至图23B证明DSP107_V2(SEQ ID NO：13)同时结合至CHO K1-CD47及HT1080-4-1BB细胞。将DSP107_V2(SEQ ID NO：13)与经CFSE标记的HT1080 4-1BB OX细胞及经CytoLight红色(CytoLight Red)标记的CHO-K1 CD47 OX细胞一起培养，并通过流式细胞仪确定双峰的形成。图23A显示相较于培养基对照组，在经标记的细胞与DSP107_V2(SEQ IDNO：13)一起培养后，CFSE对CytoLight红色的代表性流式细胞术图。图23B是一图表，其显示来自三个独立实验的双峰形成的平均结果的图。
图24证明DSP107_V2(SEQ ID NO：13)同时结合至CHO K1-CD47及HT1080-4-1BB细胞。将DSP107_V2(SEQ ID NO：13)与带有或不带有抗4-1BB抗体或抗CD47抗体的经CFSE标记的HT1080 4-1BB OX细胞及经CytoLight红色标记的CHO-K1 CD47 OX细胞一起培养，通过流式细胞术确定双峰的形成。显示减去介质效应后来自两个独立实验的双峰形成的平均结果。
图25A至图25B证明通过DSP107_V2(SEQ ID NO：13)对4-1BB的激活，如通过在单培养分析中自HT1018-4-1BB细胞所分泌的IL8而检测的。
图26证明通过DSP107_V2(SEQ ID NO：13)对4-1BB的激活，如通过在共培养分析法中自HT1018-4-1BB细胞所分泌的IL8而检测的。
图27显示柱状图，其证明DSP107_V2(SEQ ID NO：13)以剂量依赖性的方式诱导T细胞活化，如通过活化标记CD25及4-1BB的表达而检测的。在经盘结合的抗CD3的存在下，将来自三个供体的PBMC与指定浓度的DSP107_V2(SEQ ID NO：13)一起培养；且在通过流式细胞仪培养48小时后检测CD25或4-1BB的表达。
图28显示代表性图像，其证明通过Inuccyte检测DSP107-V2(SEQ ID NO：13)对于PBMC增殖的影响。
图29显示柱状图，其证明由流式细胞术检测DSP107_V2(SEQ ID NO：13)对于获自三个人类供体的经CPD染色的T细胞的增殖的影响。
图30A至图30C证明通过Inuccyte检测DSP107-V2(SEQ ID NO：13)对于经T细胞介导的SNU387(图26A)、SNU423(图26B)及Ovcar8(图26C)癌细胞的杀伤力的影响。
图31A至图31B证明通过流式细胞术检测DSP107-V2(SEQ ID NO：13)对于经T细胞介导的MSTO(图31A)及H2052(图31B)间皮瘤细胞的杀伤力的影响。
图32A至图32E代表性图像(图32A)及图表(图32B至图32E)，其证明DSP107_V2(SEQID NO：13)增强经M1-巨噬细胞介导的不同淋巴瘤细胞株(图32B至图32D)及DLD-1结肠癌细胞株(图32E)的吞噬作用。
图33A至图33H证明相较于可溶性SIRPa、可溶性4-1BBL或二者的组合(图33D至图33F)，DSP107_V2(SEQ ID NO：13)作为单一疗法以及与利妥昔单抗组合，对于不同的淋巴瘤细胞株的经粒细胞介导的吞噬作用的影响(图33A至图33D)。通过单一疗法中的DSP107_V2以及与曲妥珠单抗组合，经由粒细胞吞噬DLD1结肠癌细胞株的吞噬作用(图33G至图33H)。
图34显示DSP107_V2(SEQ ID NO：13)与MC38(小鼠)及DLD1(人类)结肠癌细胞株的结合。
图35A至图35B证明DSP107_V2(SEQ ID NO：13)及抗小鼠PD-L1抗体对于在h4-1BB敲除小鼠中的hCD47 MC38肿瘤生长(图34A)及存活(图35B)的体内影响。
图36A至图36B证明DSP107_V2(SEQ ID NO：13)对于在人源化NSG小鼠中的SUDHL6DLBCL肿瘤的体内影响。图36A显示在第22天小鼠牺牲后所检测的平均肿瘤重量。图36B显示在第20天小鼠牺牲之前所检测的平均肿瘤体积。
图37A至图37B证明在SIRPα-4-1BBL变体融合体的结合对应物(CD47和4-1BB)存在的情况下，SIRPα-4-1BBL变体融合体的经预测3D结构包括SIRPα(SEQ ID NO：2)以及三个重复的4-1BBL氨基酸序列(SEQ ID NO：78)。图37A是示意性3D模型以及图37B是完整的原子3D模型。SIRPα是描绘为深灰色带(右上侧)。41BB-L是描绘为深灰色带(左侧)。间隔子/“连接子”段在SIRPα与41BB-L的结构组件之间是描绘为灰色带及白色带。CD47是描绘为灰色带(右上侧)，以及三个4-1BB受体与4-1BBL复合(左侧)是描绘为灰色带。
图38证明DSP107-V2(SEQ ID NO：13)的SEC-MALS分析。将蛋白质(150μg)负载至Superdex 200增加柱(Superdex 200Increase column)(GE医疗)上，以10mM KPO4 pH 8.0+150mM NaCl作为流动相，利用0.8ml/min的流速进行流动。使用AKTA Explorer(GE)+MiniDawn TREOS+OPTILAB T-reX(WYATT)通过UV、MALS及RI进行检测。
具体实施方式
在一些实施例中，本发明涉及SIRPα-4-1BBL变体融合蛋白及其使用方法。
在详细解释本发明的至少一实施例之前，应当理解，本发明的应用并非必然限于以下所描述或由实施例举例说明的细节。本发明能够具有其他实施例，或者能够以各种方式被实施或执行。
双信号蛋白(DSP)，亦称为信号转换蛋白(SCP)，目前在本领域中称为双功能融合蛋白，其将第I型膜蛋白的胞外部分(胞外氨基端)连接至第II型膜蛋白的胞外部分(胞外羧基端)，具有两个活性侧的融合蛋白。
利用结构功能工具，本发明的发明人能够生产SIRPα-4-1BBL融合蛋白，所述SIRPα-4-1BBL融合蛋白包括具有经改良的生产特性(例如，更高的产量)的SIRPα变体及/或4-1BBL变体，且其通常可有利地用于激活免疫细胞(通过共刺激)，以及特别地可治疗可得益于激活免疫细胞(例如癌症)的疾病。
不受理论的束缚，发明人建议以下作为本发明的一些实施例的SIRPα-4-1BBL融合蛋白在治疗癌症中的作用模式：
由于CD47在肿瘤细胞表面及肿瘤微环境中相对较高的表达，SIRPα-4-1BBL融合体的SIRPα部分将分子靶向肿瘤及转移部位，从而导致融合蛋白与CD47结合在肿瘤微环境内。
将融合蛋白靶向肿瘤细胞或/及肿瘤微环境可促进在肿瘤微环境中SIRPα-4-1BBL的协同作用的增加以及随后在肿瘤部位处的融合蛋白的4-1BBL部分的固定及寡聚合，从而提供一4-1BB共刺激信号，以促进T细胞、B细胞、NK细胞(尤其是肿瘤浸润淋巴细胞)的激活(TILs)，以及促进其他免疫细胞在肿瘤部位处杀死癌细胞。
除了4-1BBL-4-1BB共刺激信号之外，在肿瘤部位中，融合蛋白的SIRPα部分与CD47的结合会与巨噬细胞和树突状细胞上所表达的内源性SIRPα竞争。因此，移除对此等细胞的抑制作用，且进一步促进肿瘤微环境中肿瘤细胞的吞噬作用以及树突状细胞及T细胞的活化。
SIRPα-4-1BBL融合蛋白的上述活性预期在肿瘤微环境中对TILs、树突状细胞及巨噬细胞的激活产生协同作用，相较于各部分的个别的作用，预期产生更独特、强大的作用，以及当组合使用其两种不同的部分时。
因此，根据本发明的一方面，提供一种SIRPα-4-1BBL融合蛋白，包括一SIRPα氨基酸序列及一4-1BBL氨基酸序列，其中所述SIRPα氨基酸序列的长度为100至119个氨基酸且与一氨基酸序列具有至少95％的同一性，所述氨基酸序列是选自由SEQ ID NO：24及26所组成的群组，及/或其中所述4-1BBL氨基酸序列：
(a)长度为185至202个氨基酸且与一氨基酸序列具有至少95％的同一性，所述氨基酸序列是选自由SEQ ID NO：22、23、27及28所组成的群组；长度为170至197个氨基酸且与一氨基酸序列具有至少80％的同一性，所述氨基酸序列是选自由SEQ ID NO：74及76所组成的群组，且不包括对应于SEQ ID NO：3的氨基酸片段G198至E205；长度为170至182个氨基酸且与SEQ ID NO：72具有至少80％的同一性，且不包括对应于SEQ ID NO：3的氨基酸片段A1至E23；或长度为184个氨基酸且与SEQ ID NO：70具有至少80％的同一性；及/或
(b)包括4-1BBL氨基酸序列的三个重复；
且其中所述融合蛋白具有至少以下的能力之一：
(i)结合CD47及4-1BB；
(ii)在表达所述4-1BB的细胞中激活所述4-1BB的信号传导途径；
(iii)共刺激表达所述4-1BB的免疫细胞；及/或
(iv)相较于缺乏所述SIRPα-4-1BBL融合蛋白，增强通过吞噬细胞。
根据本发明的替代或额外的方面，提供一种SIRPα-4-1BBL融合蛋白，包括一SIRPα氨基酸序列及一4-1BBL氨基酸序列，其中所述SIRPα氨基酸序列的长度为100至119个氨基酸且与一氨基酸序列具有至少95％的同一性，所述氨基酸序列是选自由SEQ ID NO：24及26所组成的群组；及/或其中所述4-1BBL氨基酸序列的长度为185至202个氨基酸且与一氨基酸序列具有至少95％的同一性，所述氨基酸序列是选自由SEQ ID NO：22、23、27及28所组成的群组；且其中所述多肽具有至少以下的能力之一：
其中所述4-1BBL氨基酸序列的长度为185至202个氨基酸且与一氨基酸序列具有至少95％的同一性，所述氨基酸序列是选自由SEQ ID NO：22至25所组成的群组；且其中所述融合蛋白具有至少以下的能力之一：
(i)结合CD47及4-1BB；
(ii)在表达所述4-1BB的细胞中激活所述4-1BB的信号传导途径；
(iii)共刺激表达所述4-1BB的免疫细胞；及/或
(iv)相较于缺乏所述SIRPα-4-1BBL融合蛋白，增强通过吞噬细胞表达所述CD47的病理细胞的吞噬作用。
根据本发明的替代或额外的方面，提供一种经分离的多肽，包括一SIRPα氨基酸序列，其中所述SIRPα氨基酸序列的长度为100至119个氨基酸且与一氨基酸序列具有至少95％的同一性，所述氨基酸序列是选自由SEQ ID NO：24及26所组成的群组，且其中所述多肽能够结合CD47。
根据本发明的替代或额外的方面，提供一种经分离的多肽，包括一4-1BBL氨基酸序列，其中所述4-1BBL氨基酸序列的长度为185至202个氨基酸且与一氨基酸序列具有至少95％的同一性，所述氨基酸序列是选自由SEQ ID NO：22、23、27及28所组成的群组；长度为170至197个氨基酸且与一氨基酸序列具有至少80％的同一性，所述氨基酸序列是选自由SEQ ID NO：74及76所组成的群组，且不包括对应于SEQ ID NO：3的氨基酸片段G198至E205；或长度为170至182个氨基酸且与SEQ ID NO：72具有至少80％的同一性，且不包括对应于SEQ ID NO：3的氨基酸片段A1至E23；及可选地包括所述4-1BBL氨基酸序列的三个重复；且其中所述多肽具有至少以下的能力之一：
(i)结合4-1BB；
(ii)在表达所述4-1BB的细胞中激活所述4-1BB的信号传导途径；及/或
(iii)共刺激表达所述4-1BB的免疫细胞。
根据本发明的替代或额外的方面，提供一种经分离的多肽，包括一4-1BBL氨基酸序列，其中所述4-1BBL氨基酸序列的长度为185至202个氨基酸且与一氨基酸序列具有至少95％的同一性，所述氨基酸序列是选自由SEQ ID NO：22、23、27及28所组成的群组；且其中所述多肽具有至少以下的能力之一：
(i)结合4-1BB；
(ii)在表达所述4-1BB的细胞中激活所述4-1BB的信号传导途径；及/或
(iii)共刺激表达所述4-1BB的免疫细胞。
如本文中所使用，术语“SIRPα(信号调节蛋白α，亦称为CD172a)”是指SIRPA基因的多肽(基因ID 140885)或其功能同源物，例如其功能片段。根据具体实施例，术语“SIRPα”是指SIRPα多肽的功能同源物。根据具体实施例，SIRPα是人类SIRPα。根据一具体实施例，SIRPα蛋白是指例如提供于以下的人类蛋白：GenBank编号NP_001035111、NP_001035112、NP_001317657或NP_542970。
如本文中所使用，当短语“功能同源物”或“功能片段”与SIRPα相关时是指维持全长SIRPα的活性的多肽的一部分，例如CD47的结合。
根据具体实施例，CD47蛋白是指例如提供于以下的人类蛋白：GenBank编号NP_001768或NP_942088。
用于测试结合的分析是本领域众所周知的，包括，但不限于流式细胞术、BiaCore、生物层干涉
Figure BDA0002939073350000231
测定法、HPLC。
根据具体实施例，通过SPR确定SIRPα与CD47结合的Kd值是0.1至100μM、0.1至10μM、1至10μM、0.1至5μM或1至2μM，各种可能性代表本发明的个别的实施例。
根据具体实施例，SIRPα包括所述SIRPα的胞外结构域或其功能片段。
根据具体实施例，SIRPα氨基酸序列包括SEQ ID NO：29。
根据具体实施例，SIRPα氨基酸序列是由SEQ ID NO：29所组成。
根据具体实施例，SIRPα核酸序列包括SEQ ID NO：30。
根据具体实施例，SIRPα核酸序列是由SEQ ID NO：30所组成。
根据具体实施例，SIRPα氨基酸序列包括SEQ ID NO：2。
根据具体实施例，SIRPα氨基酸序列是由SEQ ID NO：2所组成。
根据具体实施例，SIRPα核酸序列包括SEQ ID NO：31或67。
根据具体实施例，SIRPα核酸序列是由SEQ ID NO：31或SEQ ID NO：67所组成。
术语“SIRPα”亦涵盖表现出所需活性(即，结合CD47)的功能同源物(天然存在的或经合成/重组产生的)。此种同源物可为与多肽SEQ ID NO：2或29例如具有至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性或同源性，或与编码相同的多肽的多核苷酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、98％、至少99％或100％的同一性(如下文所进一步描述)。
根据具体实施例，SIRPα功能同源物与多肽SEQ ID NO：2或29具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性或同源性，或与编码相同的多肽的多核苷酸序列具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性(如下文所进一步描述)。
如本文中所使用，“同一性”或“序列同一性”是指整体的同一性，即，在本文所公开的整个氨基酸或核酸序列上，而非在其部分上的同一性。
可使用任何的蛋白质或核酸序列的比对算法以确定序列同一性或同源性，例如Blast、ClustalW及MUSCLE。
同源性亦可指异种同源物、缺失、插入或取代变体，包括氨基酸取代，如下文所进一步描述。
根据具体实施例，SIRPα多肽可包括保留及非保留的氨基酸取代(在本文中亦称为突变)。此种取代在本领域中是已知的，且例如公开在维斯科普夫等人.Science.(2013)；341(6141)：88-91，其内容通过引用全部并入本文中。
当使用序列同一性的百分比来表示蛋白质时，不相同的残基位置通常因保留的氨基酸取代而有所不同，其中氨基酸残基被具有类似的化学特性(例如电荷或疏水性)的其他氨基酸残基取代，因此不会改变分子的功能特性。倘若序列在保留取代方面有所不同，则可向上调整序列同一性的百分比，以校正取代的保留性质。通过此种保留取代而有所不同的序列被认为是具有“序列相似性”或“相似性”。进行此调整的手段是本领域技术人员众所周知的。通常，其涉及将保留取代评分为部分错配而非全部错配，从而增加序列同一性的百分比。因此，例如，在具同一性的氨基酸的评分为1，及非保留取代的评分为0的情况下，保留取代的评分是介于0与1之间。计算保留取代的得分，例如，根据海尼科夫S及海尼科夫JG的算法[来自蛋白质区块的氨基酸替代矩阵.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1992，89(22)：10915-9]。
根据具体实施例，一或多个氨基酸的突变是位于选自以下的氨基酸残基处：对应于如SEQ ID NO：2所示的SIRPα氨基酸序列的L4、V6、A21、A27、I31、E47、K53、E54、H56、V63、L66、K68、V92及F96。
根据具体实施例，所述SIRPα氨基酸序列包括在一氨基酸残基处的一突变，所述氨基酸残基是选自由对应于如SEQ ID NO：2所示的SIRPα氨基酸序列的L4、A27、E47及V92所组成的群组。
根据具体实施例，所述一或多个氨基酸的突变是选自由对应于如SEQ ID NO：2所示的SIRPα氨基酸序列的L4V或L4I、V6I或V6L、A21V、A27I或A27L、I31F或I31T、E47V或E47L、K53R、E54Q、H56P或H56R、V63I、L66T或L66G、K68R、V92I及F94L或F94V所组成的群组。
根据具体实施例，所述SIRPα氨基酸序列包括一突变，所述突变是选自由对应于如SEQ ID NO：2所示的SIRPα氨基酸序列的L4V、A27I及V92I所组成的群组。
如本文中所使用，短语“对应于如SEQ ID NO：2所示的SIRPα氨基酸序列”或“对应于SEQ ID NO：2”意旨包括相对于任何其他的SIRPα氨基酸序列的相应的氨基酸残基。
根据具体实施例，SIRPα氨基酸序列包括SEQ ID NO：25。
根据具体实施例，SIRPα氨基酸序列是由SEQ ID NO：25所组成。
根据具体实施例，SIRPα核酸序列包括SEQ ID NO：35。
根据具体实施例，SIRPα核酸序列是由SEQ ID NO：35所组成。
下文进一步提供对于保留氨基酸及非保留氨基酸取代的额外的描述。
本发明的一些实施例的SIRPα与多肽SEQ ID NO：24或26具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性或同源性，或与编码相同的多肽的多核苷酸序列具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性(如下文所进一步描述)。
根据具体实施例，SIRPα氨基酸序列与一氨基酸序列具有至少95％的同一性，所述氨基酸序列是选自由SEQ ID NO：24或26所组成的群组。
根据具体实施例，SIRPα氨基酸序列SEQ ID NO：24或26具有至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性，各种可能性代表本发明的个别的实施例。
根据具体实施例，SIRPα氨基酸序列SEQ ID NO：24具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性。
根据具体实施例，SIRPα氨基酸序列SEQ ID NO：26具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性。
根据具体实施例，所述SIRPα氨基酸序列不包括对应于SEQ ID NO：2的氨基酸残基K117至Y343。
根据具体实施例，所述SIRPα氨基酸序列不包括对应于SEQ ID NO：2的氨基酸残基K117至Y343中的任一者。
根据具体实施例，所述SIRPα氨基酸序列不包括SEQ ID NO：32或其任何片段。
根据具体实施例，所述SIRPα氨基酸序列不包括SEQ ID NO：32。
根据具体实施例，所述SIRPα氨基酸序列的C端以SEQ ID NO：8作为结尾。
根据具体实施例，所述SIRPα氨基酸序列包括SEQ ID NO：24或26。
根据具体实施例，所述SIRPα氨基酸序列包括SEQ ID NO：24。
根据具体实施例，所述SIRPα氨基酸序列包括SEQ ID NO：26。
根据具体实施例，所述SIRPα氨基酸序列是由SEQ ID NO：24或26所组成。
根据具体实施例，所述SIRPα氨基酸序列是由SEQ ID NO：24所组成。
根据具体实施例，所述SIRPα氨基酸序列是由SEQ ID NO：26所组成。
根据具体实施例，所述SIRPα核酸序列与SEQ ID NO：33及/或34具有至少70％、至少75％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性，各种可能性代表本发明的个别的实施例。
根据具体实施例，所述SIRPα核酸序列与SEQ ID NO：33及/或34具有至少95％的同一性。
根据具体实施例，所述SIRPα核酸序列与SEQ ID NO：33及/或34具有至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性。
根据具体实施例，所述SIRPα核酸序列与SEQ ID NO：33具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性。
根据具体实施例，所述SIRPα核酸序列与SEQ ID NO：34具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性。
根据具体实施例，所述SIRPα核酸序列包括SEQ ID NO：33或34。
根据具体实施例，所述SIRPα核酸序列包括SEQ ID NO：33。
根据具体实施例，所述SIRPα核酸序列包括SEQ ID NO：34。
根据具体实施例，所述SIRPα核酸序列是由SEQ ID NO：33或34所组成。
根据具体实施例，所述SIRPα核酸序列是由SEQ ID NO：33所组成。
根据具体实施例，所述SIRPα核酸序列是由SEQ ID NO：34所组成。
根据具体实施例，所述SIRPα氨基酸序列包括100至500个氨基酸、150至450个氨基酸、200至400个氨基酸、250至400个氨基酸、300至400个氨基酸、320至420个氨基酸、340至350个氨基酸，各种可能性代表本发明的个别的实施例。
根据具体实施例，SIRPα氨基酸序列的长度为300至400个氨基酸。
根据具体实施例，SIRPα氨基酸序列的长度为340至450个氨基酸。
根据具体实施例，SIRPα氨基酸序列的长度为343个氨基酸。
根据具体实施例，所述SIRPα氨基酸序列包括100至200个氨基酸、100至150个氨基酸、100至125个氨基酸、100至120个氨基酸、100至119个氨基酸，各种可能性代表本发明的个别的实施例。
根据具体实施例，SIRPα氨基酸序列的长度为105至119个个氨基酸。
根据具体实施例，所述SIRPα氨基酸序列包括100至200个氨基酸、110至119个氨基酸、115至119个氨基酸、105至118个氨基酸、110至118个氨基酸、115至118个氨基酸、105至117个氨基酸、110至117个氨基酸、115至117个氨基酸，各种可能性代表本发明的个别的实施例。
根据具体实施例，SIRPα氨基酸序列的长度至少为115个氨基酸。
根据具体实施例，SIRPα氨基酸序列的长度为115至119个氨基酸。
根据具体实施例，SIRPα氨基酸序列的长度为116个氨基酸。
如本文中所使用，术语“4-1BBL(亦称为CD137L及TNFSF9)”是指TNFSF9基因的多肽(基因ID 8744)或其功能同源物，例如其功能片段。根据具体实施例，术语“4-1BBL”是指4-1BBL多肽的功能同源物。根据具体实施例，4-1BBL是人类4-1BBL。根据一具体实施例，4-1BBL蛋白是指人类蛋白，例如如提供于以下的GenBank编号NP_003802中的人类蛋白。
如本文中所使用，短语“功能同源物”或“功能片段”当与4-1BBL相关时，是指维持全长4-1BBL的活性的多肽的一部分，例如，(i)结合4-1BB、(ii)激活4-1BB信号通路、(iii)激活表达4-1BB的免疫细胞、(iv)形成同源三聚体。
根据具体实施例，当与4-1BBL相关时，功能同源物可为(i)、(ii)、(iii)、(i)+(ii)、(i)+(iii)、(ii)+(iii)。
根据具体实施例，当与4-1BBL相关时，功能同源物可为(i)+(ii)+(iii)。
根据具体实施例，当与4-1BBL相关时，功能同源物可为(iv)、(i)+(iv)、(ii)+(iv)、(iii)+(iv)、(i)+(ii)+(iv)、(i)+(iii)+(iv)、(ii)+(iii)+(iv)。
根据具体实施例，当与4-1BBL相关时，功能同源物可为(i)+(ii)+(iii)+(iv)。
根据一具体实施例，4-1BB蛋白是指人类蛋白，例如提供于以下的GenBank编号NP_001552中的人类蛋白。
用于测试结合的分析法是本领域众所周知的，且在上文中进一步描述。
根据具体实施例，通过SPR确定4-1BBL是以大约0.1至1000nM、0.1至100nM、1至100nM或55.2nM的Kd结合4-1BB，各可能性代表本发明所要求所保护的个别的实施例。
用于测试三聚作用的分析法是本领域众所周知的，包括，但不限于NATIVE-PAGE、SEC-HPLC 2D凝胶、凝胶过滤、SEC-MALS、分析超速离心(AUC)质谱(MS)、毛细管凝胶电泳(CGE))。
如本文中所使用，术语“激活(activating)”或“激活(activation)”是指刺激免疫细胞(例如T细胞、B细胞、NK细胞、吞噬细胞)的过程，其会造成细胞增生、成熟、细胞激素产生、吞噬作用及/或调节的诱导或作用功能。
根据具体实施例，激活包括共刺激。
如本文中所使用，术语“共刺激(co-stimulating)”或“共刺激(co-stimulation)”是指传导一不依赖于二级抗原的刺激信号(例如4-1BB信号)，所述刺激信号会导致免疫细胞的激活。
根据具体实施例，激活包括一抑制导致免疫细胞激活的抑制信号(例如CD47信号)。
确定刺激或抑制信号的信号传导的方法在本领域中是众所周知的，且亦在随后的实例部分中公开，包括，但不限于使用例如BiaCore、HPLC或流式细胞仪的结合分析法、诸如激酶的激活的分析法的激活分析法，以及使用例如PCR、北方印迹、免疫沉淀及免疫组化的在信号级联反应中所涉及的分子的表达。额外地或可替代地，可通过评估免疫细胞的激活或功能来确定信号的传导(共刺激或抑制)。评估免疫细胞激活或功能的方法是本领域众所周知的，包括，但不限于增生测定法，例如CFSE染色、MTS、阿拉玛蓝、BRDU及胸苷掺入、细胞毒性分析法，例如CFSE染色、铬释放、钙黄绿素(Calcin AM)、诸如细胞内的细胞激素染色的细胞激素分泌分析、ELISPOT及ELISA，使用流式细胞仪检测诸如CD25、CD69、CD137、CD107a、PD1及CD62L的激活标记的表达。
根据具体实施例，如下文进一步所描述，确定信号传导活性或激活是在体外或离体中进行是有效的，例如，在经混合的淋巴细胞反应(MLR)中。
针对相同的培养条件，相较于相同的物种但未与PF1-4-1BBL融合蛋白相接触的细胞中的信号传导、激活或功能，通常表达信号传导活性或免疫细胞的激活或功能、在相同的物种但未与SIRPα-4-1BBL融合蛋白接触的细胞中的激活或功能、编码相同的多肽的多核苷酸或编码相同的多肽的宿主细胞；或与一载体控件(亦称为控件)接触。
根据具体实施例，4-1BBL包括所述4-1BBL的胞外结构域或其功能片段。
根据具体实施例，4-1BBL氨基酸序列包括SEQ ID NO：36。
根据具体实施例，4-1BBL氨基酸序列是由SEQ ID NO：36所组成。
根据具体实施例，4-1BBL氨基酸序列包括SEQ ID NO：37。
根据具体实施例，4-1BBL氨基酸序列是由SEQ ID NO：37所组成。
根据具体实施例，4-1BBL氨基酸序列包括SEQ ID NO：3。
根据具体实施例，4-1BBL氨基酸序列是由SEQ ID NO：3所组成。
根据具体实施例，4-1BBL氨基酸序列包括SEQ ID NO：38。
根据具体实施例，4-1BBL氨基酸序列是由SEQ ID NO：38所组成。
术语“4-1BBL”亦涵盖功能同源物(天然存在或经合成/重组产生的)，其表现出期望的活性(如上文所定义)。此种同源物可为与多肽SEQ ID NO：3、36例如具有至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性或同源性，或与编码相同的多肽的多核苷酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性(如下文所进一步描述)。
根据具体实施例，所述4-1BBL可为与多肽SEQ ID NO：3、36例如具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性或同源性，或编码相同的多肽的多核苷酸序列具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性(如下文所进一步描述)。
根据具体实施例，如上文及下文所进一步描述，4-1BBL多肽可包括的氨基酸取代。
本发明的一些实施例的4-1BBL与多肽SEQ ID NO：22、23、27或28具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性或同源性，或与编码相同的多肽的多核苷酸序列具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性(如下文所进一步描述)。
根据具体实施例，4-1BBL氨基酸序列与一氨基酸序列具有至少95％的同一性，所述氨基酸序列是选自由SEQ ID NO：22、23、27及28所组成的群组，各种可能性代表本发明的个别的实施例。
根据具体实施例，4-1BBL氨基酸序列与SEQ ID NO：22、23、27及/或28具有至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性，各种可能性代表本发明的个别的实施例。
根据具体实施例，4-1BBL氨基酸序列与SEQ ID NO：22及/或23具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性。
根据具体实施例，4-1BBL氨基酸序列与SEQ ID NO：22具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性。
根据具体实施例，4-1BBL氨基酸序列与SEQ ID NO：23具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性。
根据具体实施例，4-1BBL氨基酸序列与SEQ ID NO：27具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性。
根据具体实施例，4-1BBL氨基酸序列与SEQ ID NO：28具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性。
根据具体实施例，4-1BBL氨基酸序列不包括对应于SEQ ID NO：3的氨基酸片段A1至V6。
根据具体实施例，4-1BBL氨基酸序列不包括对应于SEQ ID NO：3的氨基酸片段A1至G14。
根据具体实施例，4-1BBL氨基酸序列不包括对应于SEQ ID NO：3的氨基酸片段A1至V6或A1至G14中的任一者。
如本文中所使用，短语“对应于SEQ ID NO：3”旨在包括相对于任何其他的4-1BBL氨基酸序列的对应氨基酸残基。
根据具体实施例，4-1BBL氨基酸序列不包括SEQ ID NO：6或7或其任何片段。
根据具体实施例，4-1BBL氨基酸序列不包括SEQ ID NO：6或7。
根据具体实施例，4-1BBL氨基酸序列包括SEQ ID NO：22、23、27或28。
根据具体实施例，4-1BBL氨基酸序列包括SEQ ID NO：22或23。
根据具体实施例，4-1BBL氨基酸序列包括SEQ ID NO：22。
根据具体实施例，4-1BBL氨基酸序列包含SEQ ID NO：23。
根据具体实施例，4-1BBL氨基酸序列包含SEQ ID NO：27。
根据具体实施例，4-1BBL氨基酸序列包含SEQ ID NO：28。
根据具体实施例，4-1BBL氨基酸序列是由SEQ ID NO：22、23、28或28所组成。
根据具体实施例，4-1BBL氨基酸序列是由SEQ ID NO：22或23所组成。
根据具体实施例，4-1BBL氨基酸序列是由SEQ ID NO：22所组成。
根据具体实施例，4-1BBL氨基酸序列是由SEQ ID NO：23所组成。
根据具体实施例，4-1BBL氨基酸序列是由SEQ ID NO：27所组成。
根据具体实施例，4-1BBL氨基酸序列是由SEQ ID NO：28所组成。
根据具体实施例，4-1BBL氨基酸序列与一氨基酸序列具有至少80％的同一性，所述氨基酸序列是选自由SEQ ID NO：74及76所组成的群组，各种可能性代表本发明的个别的实施例。
根据具体实施例，4-1BBL氨基酸序列与一氨基酸序列具有至少85％的同一性，所述氨基酸序列是选自由SEQ ID NO：74及76所组成的群组，各种可能性代表本发明的个别的实施例。
根据具体实施例，4-1BBL氨基酸序列与一氨基酸序列具有至少90％的同一性，所述氨基酸序列是选自由SEQ ID NO：74及76所组成的群组，各种可能性代表本发明的个别的实施例。
根据具体实施例，4-1BBL氨基酸序列与一氨基酸序列具有至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性，所述氨基酸序列是选自由SEQ ID NO：74及76所组成的群组，各种可能性代表本发明的个别的实施例。
根据具体实施例，4-1BBL氨基酸序列与一氨基酸序列具有至少95％的同一性，所述氨基酸序列是选自由SEQ ID NO：74及76所组成的群组，各种可能性代表本发明的个别的实施例。
根据具体实施例，4-1BBL氨基酸序列与一氨基酸序列具有至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性，所述氨基酸序列是选自由SEQ ID NO：74及76所组成的群组，各种可能性代表本发明的个别的实施例。
根据具体实施例，4-1BBL氨基酸序列不包括对应于SEQ ID NO：3的氨基酸片段G198至E205。
根据具体实施例，4-1BBL氨基酸序列不包括对应于SEQ ID NO：3的任何的氨基酸残基G198至E205。
根据具体实施例，4-1BBL氨基酸序列不包括SEQ ID NO：97或其任何片段。
根据具体实施例，4-1BBL氨基酸序列不包括SEQ ID NO：97。
根据具体实施例，4-1BBL氨基酸序列包括SEQ ID NO：74或76。
根据具体实施例，4-1BBL氨基酸序列是由SEQ ID NO：74或76所组成。
根据具体实施例，4-1BBL氨基酸序列与SEQ ID NO：72具有至少80％的同一性。
根据具体实施例，4-1BBL氨基酸序列与SEQ ID NO：72具有至少85％的同一性。
根据具体实施例，4-1BBL氨基酸序列与SEQ ID NO：72具有至少90％的同一性。
根据具体实施例，4-1BBL氨基酸序列与SEQ ID NO：72具有至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性。
根据具体实施例，4-1BBL氨基酸序列与SEQ ID NO：72具有至少95％的同一性。
根据具体实施例，4-1BBL氨基酸序列与SEQ ID NO：72具有至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性。
根据具体实施例，4-1BBL氨基酸序列不包括对应于SEQ ID NO：3的氨基酸片段A1至E23。
根据具体实施例，4-1BBL氨基酸序列不包括对应于SEQ ID NO：3的任何的氨基酸残基A1至E23。
根据具体实施例，4-1BBL氨基酸序列不包括SEQ ID NO：98或其任何片段。
根据具体实施例，4-1BBL氨基酸序列不包括SEQ ID NO：98。
根据具体实施例，4-1BBL氨基酸序列包括SEQ ID NO：72。
根据具体实施例，4-1BBL氨基酸序列是由SEQ ID NO：72所组成。
根据具体实施例，4-1BBL氨基酸序列与SEQ ID NO：70具有至少80％的同一性。
根据具体实施例，4-1BBL氨基酸序列与SEQ ID NO：70具有至少85％的同一性。
根据具体实施例，4-1BBL氨基酸序列与SEQ ID NO：70具有至少90％的同一性。
根据具体实施例，4-1BBL氨基酸序列与SEQ ID NO：70具有至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性。
根据具体实施例，4-1BBL氨基酸序列与SEQ ID NO：70具有至少95％的同一性。
根据具体实施例，4-1BBL氨基酸序列与SEQ ID NO：70具有至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性。
根据具体实施例，4-1BBL氨基酸序列包括SEQ ID NO：70。
根据具体实施例，4-1BBL氨基酸序列是由SEQ ID NO：70所组成。
根据具体实施例，4-1BBL氨基酸序列与SEQ ID NO：39、40、41及/或42具有至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性，各种可能性代表本发明的个别的实施例。
根据具体实施例，4-1BBL氨基酸序列与SEQ ID NO：39、40、41及/或42具有至少95％的同一性，各种可能性代表本发明的个别的实施例。
根据具体实施例，4-1BBL氨基酸序列与SEQ ID NO：39、40、41及/或42具有至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性。
根据具体实施例，4-1BBL氨基酸序列与SEQ ID NO：39及/或40具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性。
根据具体实施例，4-1BBL氨基酸序列包括SEQ ID NO：39、40、41或42。
根据具体实施例，4-1BBL氨基酸序列包括SEQ ID NO：39或40。
根据具体实施例，4-1BBL氨基酸序列包括SEQ ID NO：39。
根据具体实施例，4-1BBL氨基酸序列包括SEQ ID NO：40。
根据具体实施例，4-1BBL氨基酸序列包括SEQ ID NO：41。
根据具体实施例，4-1BBL氨基酸序列包括SEQ ID NO：42。
根据具体实施例，4-1BBL氨基酸序列是由SEQ ID NO：39、40、41或42所组成。
根据具体实施例，4-1BBL氨基酸序列是由SEQ ID NO：39或40所组成。
根据具体实施例，4-1BBL氨基酸序列是由SEQ ID NO：39所组成。
根据具体实施例，4-1BBL氨基酸序列是由SEQ ID NO：40所组成。
根据具体实施例，4-1BBL氨基酸序列是由SEQ ID NO：41所组成。
根据具体实施例，4-1BBL氨基酸序列是由SEQ ID NO：42所组成。
根据具体实施例，4-1BBL氨基酸序列与SEQ ID NO：75及/或77具有至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性，各种可能性代表本发明的个别的实施例。
根据具体实施例，4-1BBL氨基酸序列与SEQ ID NO：75及/或77具有至少95％的同一性，各种可能性代表本发明的个别的实施例。
根据具体实施例，4-1BBL氨基酸序列与SEQ ID NO：75及/或77具有至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性。
根据具体实施例，4-1BBL氨基酸序列包括SEQ ID NO：75或77。
根据具体实施例，4-1BBL氨基酸序列是由SEQ ID NO：75或77所组成。
根据具体实施例，4-1BBL氨基酸序列与SEQ ID NO：73具有至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性。
根据具体实施例，4-1BBL氨基酸序列与SEQ ID NO：73具有至少95％的同一性，各种可能性代表本发明的个别的实施例。
根据具体实施例，4-1BBL氨基酸序列与SEQ ID NO：73具有至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性。
根据具体实施例，4-1BBL氨基酸序列包括SEQ ID NO：73。
根据具体实施例，4-1BBL氨基酸序列是由SEQ ID NO：73所组成。
根据具体实施例，4-1BBL氨基酸序列与SEQ ID NO：71具有至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性。
根据具体实施例，4-1BBL氨基酸序列与SEQ ID NO：71具有至少95％的同一性，各种可能性代表本发明的个别的实施例。
根据具体实施例，4-1BBL氨基酸序列与SEQ ID NO：71具有至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性。
根据具体实施例，4-1BBL氨基酸序列包括SEQ ID NO：71。
根据具体实施例，4-1BBL氨基酸序列是由SEQ ID NO：71所组成。
根据具体实施例，4-1BBL氨基酸序列包括100至300个氨基酸、150至250个氨基酸、100至250个氨基酸、150至220个氨基酸、180至220个氨基酸、180至210个氨基酸、185至205个氨基酸、190至210个氨基酸，各种可能性代表本发明的个别的实施例。
根据具体实施例，4-1BBL氨基酸序列的长度为190至210个氨基酸。
根据具体实施例，4-1BBL氨基酸序列的长度为204个氨基酸。
根据具体实施例，4-1BBL氨基酸序列的长度为185至202个氨基酸。
根据具体实施例，4-1BBL氨基酸序列的长度为185至200个氨基酸。
根据具体实施例，4-1BBL氨基酸序列的长度为185至199个氨基酸。
根据具体实施例，4-1BBL氨基酸序列的长度为170至197个氨基酸。
根据具体实施例，4-1BBL氨基酸序列的长度为170至182个氨基酸。
根据具体实施例，4-1BBL氨基酸序列的长度为184个氨基酸。
根据具体实施例，4-1BBL氨基酸序列的长度为170至197个氨基酸。
根据具体实施例，4-1BBL氨基酸序列的长度为185、191、197或199个氨基酸，各种可能性代表本发明的个别的实施例。
根据具体实施例，4-1BBL氨基酸序列的长度为184个氨基酸。
根据具体实施例，4-1BBL氨基酸序列的长度为183个氨基酸。
根据具体实施例，4-1BBL氨基酸序列的长度为182个氨基酸。
根据具体实施例，4-1BBL氨基酸序列的长度为176个氨基酸。
根据具体实施例，4-1BBL氨基酸序列包括SIRPα-4-1BBL融合蛋白或本文中所公开的4-1BBL多肽包括4-1BBL氨基酸序列的三个重复。
根据具体实施例，所述三个重复中的各重复具有至少以下的能力之一：(i)结合4-1BB、(ii)激活所述4-1BB的信号传导途径、(iii)激活表达4-1BB的免疫细胞、(iv)形成同源三聚体。
根据具体实施例，4-1BBL氨基酸序列在所述4-1BBL氨基酸序列的所述三个重复中的各重复之间不包括一连接子。
根据具体实施例，4-1BBL氨基酸序列在所述4-1BBL氨基酸序列的所述三个重复中的各重复之间包括一连接子。本领域已知的任何连接子可与本发明的具体实施例一起使用。下文将详细描述可使用的连接子的非限制性实例。
根据具体实施例，连接子是一(GGGGS)x2+GGGG(SEQ ID NO：182)连接子。
根据具体实施例，重复的序列可为本文中所定义的任何4-1BBL。
根据具体实施例，三个重复具有相同的4-1BBL氨基酸序列。
根据其他的具体实施例，三个重复是不同的，即，具有不同的4-1BBL氨基酸序列。
根据其他的具体实施例，三个重复中的两个重复具有相同的4-1BBL氨基酸序列。
根据具体实施例，三个重复中的至少一重复包括本文中所公开的4-1BBL氨基酸序列。
根据具体实施例，三个重复中的至少一重复是由本文中所公开的4-1BBL氨基酸序列所组成。
根据具体实施例，4-1BBL氨基酸序列包括一氨基酸的三个重复，所述氨基酸包括SEQ ID NO：23。
根据具体实施例，4-1BBL氨基酸序列包括一氨基酸的三个重复，所述氨基酸是由SEQ ID NO：23所组成。
根据具体实施例，4-1BBL氨基酸序列包括一氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQID NO：178具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性。
根据具体实施例，4-1BBL氨基酸序列包括一氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQID NO：178具有至少80％的同一性。
根据具体实施例，4-1BBL氨基酸序列包括一氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQID NO：178具有至少85％的同一性。
根据具体实施例，4-1BBL氨基酸序列包括一氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQID NO：178具有至少90％的同一性。
根据具体实施例，4-1BBL氨基酸序列包括一氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQID NO：178具有至少95％的同一性。
根据具体实施例，4-1BBL氨基酸序列包括SEQ ID NO：178。
根据具体实施例，4-1BBL氨基酸序列是由SEQ ID NO：178所组成。
根据具体实施例，4-1BBL氨基酸序列与SEQ ID NO：79具有至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性。
根据具体实施例，4-1BBL氨基酸序列与SEQ ID NO：79具有至少95％的同一性。
根据具体实施例，4-1BBL氨基酸序列与SEQ ID NO：79具有至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性。
根据具体实施例，4-1BBL氨基酸序列包括SEQ ID NO：79。
根据具体实施例，4-1BBL氨基酸序列是由SEQ ID NO：79所组成。
术语“DSP”及“融合蛋白”、“嵌合蛋白”或“嵌合体”在本文中可互换使用，且是指具有两个或更多部分的氨基酸序列，所述两个或更多部分在自然界中并未一起存在于一氨基酸序列中。
本发明的一些实施例的融合蛋白包括一SIRPα氨基酸序列及一4-1BBL氨基酸序列(本文中亦称为SIRPα-4-1BBL融合蛋白)。
根据具体实施例，SIRPα是在4-1BBL的N端。
根据具体实施例，SIRPα是在4-1BBL的C端。
本发明的一些实施例的SIRPα-4-1BBL融合蛋白可包括本文中所定义的任何的SIRPα；及任何的4-1BBL氨基酸序列：
(a)长度为185至202个氨基酸且与一氨基酸序列具有至少95％的同一性，所述氨基酸序列是选自由SEQ ID NO：22、23、27及28所组成的群组；长度为170至197个氨基酸且与一氨基酸序列具有至少80％的同一性，所述氨基酸序列是选自由SEQ ID NO：74及76所组成的群组，且不包括对应于SEQ ID NO：3的氨基酸片段G198至E205；长度为170至182个氨基酸且与SEQ ID NO：72具有至少80％的同一性，且不包括对应于SEQ ID NO：3的氨基酸片段A1至E23；或长度为184个氨基酸且与SEQ ID NO：70具有至少80％的同一性；及/或
(b)包括4-1BBL氨基酸序列的三个重复；例如公开在本文中的例子，各种可能性代表本发明的个别的实施例。
本发明的一些实施例的SIRPα-4-1BBL融合蛋白可包括本文所定义的任何SIRPα；以及任何4-1BBL氨基酸序列，所述4-1BBL氨基酸序列的长度为185至202个氨基酸并且与一氨基酸序列具有至少95％的同一性，所述氨基酸序列是选自由SEQ ID NO：22、23、27及28所组成的群组，例如，在本文中所公开的内容中，各种可能性代表本发明的个别的实施例。
本发明的一些实施例的SIRPα-4-1BBL融合蛋白可包括任一SIRPα氨基酸序列，所述SIRPα氨基酸序列的长度为100至119个氨基酸且与SEQ ID NO：24及/或26具有至少95％的同一性，例如公开在本文中的例子；及在本文中所定义的任一4-1BBL，各种可能性代表本发明的个别的实施例。
本发明的一些实施例的SIRPα-4-1BBL融合蛋白可包括任一SIRPα氨基酸序列，所述SIRPα氨基酸序列的长度为100至119个氨基酸且与SEQ ID NO：24及/或26具有至少95％的同一性，例如公开在本文中的例子；
及任一4-1BBL：
(a)长度为185至202个氨基酸且与一氨基酸序列具有至少95％的同一性，所述氨基酸序列是选自由SEQ ID NO：22、23、27及28所组成的群组；长度为170至197个氨基酸且与一氨基酸序列具有至少80％的同一性，所述氨基酸序列是选自由SEQ ID NO：74及76所组成的群组，且不包括对应于SEQ ID NO：3的氨基酸片段G198至E205；长度为170至182个氨基酸且与SEQ ID NO：72具有至少80％的同一性，且不包括对应于SEQ ID NO：3的氨基酸片段A1至E23；或长度为184个氨基酸且与SEQ ID NO：70具有至少80％的同一性；及/或
(b)包括4-1BBL氨基酸序列的三个重复；例如公开在本文中的例子，各种可能性代表本发明的个别的实施例。
本发明的一些实施例的SIRPα-4-1BBL融合蛋白可包括任一SIRPα氨基酸序列，所述SIRPα氨基酸序列的长度为100至119个氨基酸且与SEQ ID NO：24及/或26具有至少95％的同一性，例如公开在本文中的例子；及任一4-1BBL氨基酸序列，所述4-1BBL氨基酸序列的长度为185至202个氨基酸，且与一氨基酸序列具有至少95％的同一性，所述氨基酸序列是选自由SEQ ID NO：22、23、27及28所组成的群组；例如公开在本文中的例子，各种可能性代表本发明的个别的实施例。
根据具体实施例，所述SIRPα氨基酸序列与SEQ ID NO：22、24至26及/或29具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性；以及所述4-1BBL氨基酸序列：
(a)长度为185至202个氨基酸且与一氨基酸序列具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性，所述氨基酸序列是选自由SEQ ID NO：22、23、27及28所组成的群组、长度为170至197个氨基酸且与一氨基酸序列具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性，所述氨基酸序列是选自由SEQ ID NO：74及76所组成的群组，且不包括对应于SEQ ID NO：3的氨基酸片段G198至E205的氨基酸片段、长度为170至182个氨基酸且与SEQ ID NO：72具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性，且不包括对应于SEQ ID NO：3的氨基酸片段A1至E23的氨基酸片段，或长度为184个氨基酸且与SEQID NO：70具有至少80％的同一性；及/或
(b)包括4-1BBL氨基酸序列的三个重复，各种可能性代表本发明的个别的实施例。
根据具体实施例，所述SIRPα氨基酸序列包括SEQ ID NO：2、24至26或29；以及所述4-1BBL氨基酸序列：
(a)长度为185至202个氨基酸且包括SEQ ID NO：22、23、27及28、长度为170至182个氨基酸且包括SEQ ID NO：72，或长度为184个氨基酸且包括SEQ ID NO：70；及/或
(b)包括4-1BBL氨基酸序列的三个重复，各种可能性代表本发明的个别的实施例。
根据具体实施例，所述SIRPα氨基酸序列是如SEQ ID NO：2、24至26或29所示；以及所述4-1BBL氨基酸序列是如SEQ ID NO：22、23、27及28、74、76、72或70所示，各种可能性代表本发明的个别的实施例。
根据具体实施例，SIRPα氨基酸序列与SEQ ID NO：2、24至26及/或29具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性；以及4-1BBL氨基酸序列的长度为185至202个氨基酸且与SEQ ID NO：22、23、27及/或28具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性，各种可能性代表本发明的个别的实施例。
根据具体实施例，所述SIRPα氨基酸序列包括SEQ ID NO：2、24至26或29；以及所述4-1BBL氨基酸序列的长度为185至202个氨基酸且包括SEQ ID NO：22、23、27或28，各种可能性代表本发明的个别的实施例。
根据具体实施例，所述SIRPα氨基酸序列包括SEQ ID NO：2、24至26或29；以及所述4-1BBL氨基酸序列是如SEQ ID NO：22、23、27或28所示，各种可能性代表本发明的个别的实施例。
根据具体实施例，所述SIRPα氨基酸序列与SEQ ID NO：2或25具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性；以及4-1BBL氨基酸序列的长度为185至202个氨基酸且与SEQ ID NO：22、23、27及/或28具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性。
根据具体实施例，所述SIRPα氨基酸序列包括SEQ ID NO：2或25；以及4-1BBL氨基酸序列的长度为185至202个氨基酸且包括SEQ ID NO：22、23、27或28。
根据具体实施例，所述SIRPα氨基酸序列是如SEQ ID NO：2或25所示；以及4-1BBL氨基酸序列是如SEQ ID NO：22、23、27或28所示。
根据具体实施例，所述SIRPα氨基酸序列与SEQ ID NO：2具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性；以及4-1BBL氨基酸序列的长度为185至202个氨基酸且与SEQID NO：22或23具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性。
根据具体实施例，所述SIRPα氨基酸序列包括SEQ ID NO：2；以及4-1BBL氨基酸序列的长度为185至202个氨基酸且包括SEQ ID NO：22或23。
根据具体实施例，所述SIRPα氨基酸序列是如SEQ ID NO：2所示；以及4-1BBL氨基酸序列是如SEQ ID NO：22或23所示。
根据具体实施例，SIRPα氨基酸序列的长度为100至119个氨基酸且与SEQ ID NO：24及/或26具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性；以及4-1BBL氨基酸序列与SEQ ID NO：3、22、23、27、28及/或36具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性，各种可能性代表本发明的个别的实施例。
根据具体实施例，SIRPα氨基酸序列的长度为100至119个氨基酸且包括SEQ IDNO：24及/或26；以及4-1BBL氨基酸序列包括SEQ ID NO：3、22、23、27、28及/或36，各种可能性代表本发明的个别的实施例。
根据具体实施例，SIRPα氨基酸序列是如SEQ ID NO：24及/或26所示；以及4-1BBL氨基酸序列是如SEQ ID NO：3、22、23、27、28及/或36所示，各种可能性代表本发明的个别的实施例。
根据具体实施例，SIRPα氨基酸序列的长度为100至119个氨基酸且与SEQ ID NO：24或26具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性；以及4-1BBL氨基酸序列与SEQ ID NO：3、22、23、27或28具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性。
根据具体实施例，SIRPα氨基酸序列的长度为100至119个氨基酸且包括SEQ IDNO：24及/或26；以及4-1BBL氨基酸序列包括SEQ ID NO：3、22、23、27或28。
根据具体实施例，SIRPα氨基酸序列是如SEQ ID NO：24或26所示；以及4-1BBL氨基酸序列是如SEQ ID NO：3、22、23、27或28所示。
根据具体实施例，SIRPα氨基酸序列的长度为100至119个氨基酸且与SEQ ID NO：24及/或26具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性；以及4-1BBL氨基酸序列的长度为185至202个氨基酸且与SEQ ID NO：22、23、27及/或28具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性，各种可能性代表本发明的个别的实施例。
根据具体实施例，SIRPα氨基酸序列的长度为100至119个氨基酸且包括SEQ IDNO：24及/或26；以及4-1BBL氨基酸序列的长度为185至202个氨基酸且包括SEQ ID NO：22、23、27及/或28。
根据具体实施例，SIRPα氨基酸序列是如SEQ ID NO：24及/或26所示；以及4-1BBL氨基酸序列是如SEQ ID NO：22、23、27及/或28所示。
根据具体实施例，SIRPα氨基酸序列的长度为100至119个氨基酸且与SEQ ID NO：24具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性；以及4-1BBL氨基酸序列的长度为185至202个氨基酸且与SEQ ID NO：22具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性。
根据具体实施例，SIRPα氨基酸序列的长度为100至119个氨基酸且包括SEQ IDNO：24；以及4-1BBL氨基酸序列的长度为185至202个氨基酸且包括SEQ ID NO：22。
根据具体实施例，SIRPα氨基酸序列是如SEQ ID NO：24所示；以及4-1BBL氨基酸序列是如SEQ ID NO：22所示。
可在本发明的具体实施例中使用的SIRPα氨基酸序列及4-1BBL氨基酸序列的特定组合的非限制性实例提供于以下的实施例部分的表4中，其作为本说明书的组成部分。
根据具体实施例，包括SIRPα氨基酸序列的经分离的多肽或包括4-1BBL氨基酸序列的经分离的多肽是可溶的(即，不固定在合成的或天然存在的表面上)。
根据具体实施例，将包括SIRPα氨基酸序列的经分离的多肽或包括4-1BBL氨基酸序列的经分离的多肽固定在合成的或天然存在的表面上。
根据具体实施例，SIRPα-4-1BBL融合蛋白是可溶的(即，不固定在合成或天然存在的表面上)。
根据具体实施例，SIRPα-4-1BBL融合蛋白是固定在合成或天然的表面上。
根据具体实施例，SIRPα-4-1BBL融合蛋白是至少为同源三聚体的形式。
根据具体实施例，至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％的SIRPα-4-1BBL融合蛋白是至少为同源三聚体的形式，各种可能性代表本发明的个别的实施例。
根据具体实施例，所述至少为同源三聚体包括一同源三聚体。
根据具体实施例，所述至少为同源三聚体包括一同源四聚体。
根据具体实施例，所述至少为同源三聚体包括一同源五聚体。
根据具体实施例，所述至少为同源三聚体包括一同源六聚体。
确定三聚体的方法是本领域众所周知的，包括，但不限于NATIVE-PAGE、SEC-HPLC2D凝胶、凝胶过滤、SEC-MALS、分析超速离心(AUC)质谱(MS)、毛细管凝胶电泳(CGE)。
根据具体实施例，通过SECMALS检测，所述至少为同源三聚体的分子量为至少100kD、至少140kD、至少160kD、至少180kD、至少200kD、至少220kD、至少240kD、至少250kD。
根据具体实施例，通过SECMALS检测，所述至少为同源三聚体的分子量为至少100kD。
根据具体实施例，通过SECMALS检测，所述至少为同源三聚体的分子量为至少240kD。
根据具体实施例，通过SECMALS检测，所述至少为同源三聚体的分子量约为250至270kD。
根据具体实施例，SIRPα-4-1BBL不包括在SIRPα与4-1BBL之间的连接子。
根据具体实施例，在所述SIRPα与所述4-1BBL之间，SIRPα-4-1BBL融合蛋白不包括一连接子。
在一些实施例中，SIRPα-4-1BBL包括可为任何长度的连接子。
因此，根据具体实施例，在所述SIRPα与所述4-1BBL之间，SIRPα-4-1BBL融合蛋白包括一连接子。
本领域已知的任何连接子可与本发明的具体实施例一起使用。
根据具体实施例，连接子可为源自天然存在的多结构域蛋白，或者为例如在文献奇奇里等人，(2013)Protein Sci.22(2)：153-167、陈等人，(2013)，Adv Drug DelivRev.65(10)：1357-1369中所描述的经验性连接子，其全部内容通过引用并入本文中。在一些实施例中，可使用诸如陈等人，(2013)，Adv Drug Deliv Rev.65(10)：1357-1369及克雷斯托等人，(2000)，Protein Eng.13(5)：309-312中所描述的连接子设计数据库及计算机程序来设计连接子，其全部内容通过引用并入本文中。
根据具体实施例，所述连接子是一合成的连接子，例如PEG。
根据具体实施例，连接子是一抗体(例如，IgG、IgA、IgD或IgE的抗体)的Fc结构域或铰链区或其片段。
根据其他的具体实施例，所述连接子并非为抗体的Fc结构域或铰链区或其片段。
根据具体实施例，连接子是人类IgG4的Fc结构域或铰链区。
根据具体实施例，Fc结构域连接子包括SEQ ID NO：95。
根据具体实施例，所述连接子是人类IgG1的Fc结构域或铰链区。
根据具体实施例，Fc结构域连接子包括SEQ ID NO：96。
根据具体实施例，Fc结构域或铰链区连接子可包括保留及非保留的氨基酸取代(在本文中亦称为突变)。此种取代是本领域已知的。
根据具体实施例，连接子可为功能性的。例如，但不限于，连接子可具有改善折叠及/或稳定性、改善表达、改善药代动力学及/或改善SIRPα-4-1BBL融合蛋白的生物活性的作用。在另一实例中，连接子可具有将SIRPα-4-1BBL融合蛋白靶向特定细胞类型或位置的作用。
根据具体实施例，连接子是一多肽。
多肽连接子的非限制性实例包括具有以下序列的连接子：LE、GGGGS(SEQ ID NO：85)、(GGGGS)n，n＝1至4，(SEQ ID NO：84)、GGGGSGGGG(SEQ ID NO：83)、(GGGGS)x2(SEQ IDNO：86)、(GGGGS)x2+GGGG(SEQ ID NO：82)、(Gly)8、(Gly)6、(EAAAK)n，n＝1至3，(SEQ ID NO：87)、A(EAAAK)nA，n＝2至5，(SEQ ID NO：88)、AEAAAKEAAAKA(SEQ ID NO：89)、A(EAAAK)4ALEA(EAAAK)4A(SEQ ID NO：90)、PAPAP(SEQ ID NO：91)、K ESGSVSS EQ LAQ FRS LD(SEQ IDNO：92)、EGKSSGSGSESKST(SEQ ID NO：93)、GSAGSAAGSGEF(SEQ ID NO：94)及(XP)n，X表示任何氨基酸，例如Ala、Lys或Glu。
根据具体实施例，所述连接子是选自由GGGGS(SEQ ID NO：85)、(GGGGS)n，n＝1至4，(SEQ ID NO：84)、GGGGSGGGG(SEQ ID NO：83)、(GGGGS)x2(SEQ ID NO：86)、(GGGGS)x2+GGGG(SEQ ID NO：82)所组成的群组。
根据具体实施例，所述连接子是(GGGGS)n，n＝1至4，(SEQ ID NO：84)连接子。
根据具体实施例，所述连接子是GGGGSx2(SEQ ID NO：186)连接子。
根据具体实施例，所述连接子是一GGGGSGGGG(SEQ ID NO：83)连接子。
根据具体实施例，所述连接子是一(GGGGS)x2+GGGG(SEQ ID NO：82)连接子。
在一些实施例中，SIRPα-4-1BBL包括长度为1-6个氨基酸的连接子。
根据具体实施例，所述连接物基本上是由甘氨酸及/或丝氨酸残基所组成(例如，约30％、或约40％、或约50％、或约60％、或约70％、或约80％、或约90％、或约95％、或约97％或100％的甘氨酸及丝氨酸。
根据具体实施例，所述连接子是单一氨基酸连接子。
在本发明的一些实施例中，连接SIRPα与4-1BBL的氨基酸是甘氨酸，在本文中亦称为SIRPα-G-4-1BBL融合蛋白。
根据具体实施例，SIRPα-4-1BBL融合蛋白的氨基酸序列包括与一氨基酸序列具有至少95％的同一性，所述氨基酸序列是选自由SEQ ID NO：11、13、15、16、18至21及45至49，各种可能性代表本发明的个别的实施例。
根据具体实施例，SIRPα-4-1BBL融合蛋白的氨基酸序列包括与一氨基酸序列具有至少96％、至少97％、至少98％、至少99％的同一性，所述氨基酸序列是选自由SEQ ID NO：11、13、15、16、18至21及45至49所组成的群组，各种可能性代表本发明的个别的实施例。
根据具体实施例，SIRPα-4-1BBL融合蛋白的氨基酸序列包括与一氨基酸序列具有至少95％的同一性，所述氨基酸序列是选自由SEQ ID NO：11、13、15、16及18至21所组成的群组。
根据具体实施例，SIRPα-4-1BBL融合蛋白的氨基酸序列包括与一氨基酸序列具有至少96％、至少97％、至少98％、至少99％的同一性，所述氨基酸序列是选自由SEQ ID NO：11、13、15、16及18至21所组成的群组。
根据具体实施例，SIRPα-4-1BBL融合蛋白的氨基酸序列包括与一氨基酸序列具有至少96％、至少97％、至少98％、至少99％的同一性，所述氨基酸序列是选自由SEQ ID NO：11、13、15、16及18至21所组成的群组。
根据具体实施例，SIRPα-4-1BBL融合蛋白的氨基酸序列包括与一氨基酸序列具有至少95％的同一性，所述氨基酸序列是选自由SEQ ID NO：11、13及16所组成的群组。
根据具体实施例，SIRPα-4-1BBL融合蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO：11具有至少95％的同一性。
根据具体实施例，SIRPα-4-1BBL融合蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO：13具有至少95％的同一性。
根据具体实施例，SIRPα-4-1BBL融合蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO：16具有至少95％的同一性。
根据具体实施例，SIRPα-4-1BBL融合蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO：11、13及16具有至少96％、至少97％、至少98％、至少99％的同一性。
根据具体实施例，SIRPα-4-1BBL融合蛋白的氨基酸序列包括与一氨基酸序列，所述氨基酸序列是选自由SEQ ID NO：11、13、15、16、18至21及45至49所组成的群组，各种可能性代表本发明的个别的实施例。
根据具体实施例，SIRPα-4-1BBL融合蛋白的氨基酸序列包括与一氨基酸序列，所述氨基酸序列是选自由SEQ ID NO：11、13、15、16及18至21所组成的群组。
根据具体实施例，SIRPα-4-1BBL融合蛋白的氨基酸序列包括与一氨基酸序列，所述氨基酸序列是选自由SEQ ID NO：11、13及16所组成的群组，各种可能性代表本发明的个别的实施例。
根据具体实施例，SIRPα-4-1BBL融合蛋白的氨基酸序列包括SEQ ID NO：11。
根据具体实施例，SIRPα-4-1BBL融合蛋白的氨基酸序列包括SEQ ID NO：13。
根据具体实施例，SIRPα-4-1BBL融合蛋白的氨基酸序列包括SEQ ID NO：16。
根据具体实施例，SIRPα-4-1BBL融合蛋白的氨基酸序列是由一氨基酸序列所组成，所述氨基酸序列是选自由SEQ ID NO：11、13、15、16、18至21及45至49所组成的群组，各种可能性代表本发明的个别的实施例。
根据具体实施例，SIRPα-4-1BBL融合蛋白的氨基酸序列是由一氨基酸序列所组成，所述氨基酸序列是选自由SEQ ID NO：11、13、15、16及18至21所组成的群组。
根据具体实施例，SIRPα-4-1BBL融合蛋白的氨基酸序列是由一氨基酸序列所组成，所述氨基酸序列是选自由SEQ ID NO：11、13及16所组成的群组。
根据具体实施例，SIRPα-4-1BBL融合蛋白的氨基酸序列是由SEQ ID NO：11所组成。
根据具体实施例，SIRPα-4-1BBL融合蛋白的氨基酸序列是由SEQ ID NO：13所组成。
根据具体实施例，SIRPα-4-1BBL融合蛋白的氨基酸序列是由SEQ ID NO：16所组成。
根据具体实施例，SIRPα-4-1BBL融合蛋白的氨基酸序列的长度为200至900个氨基酸、200至800个氨基酸、200至700个氨基酸、250至650个氨基酸、250至600个氨基酸、250至550个氨基酸，各种可能性代表本发明的个别的实施例。
根据一具体实施例，SIRPα-4-1BBL融合蛋白的氨基酸序列的长度为270至750个氨基酸。
根据一具体实施例，SIRPα-4-1BBL融合蛋白的氨基酸序列的长度为290至750个氨基酸。
根据一具体实施例，SIRPα-4-1BBL融合蛋白的氨基酸序列的长度为290至550个氨基酸。
根据一具体实施例，SIRPα-4-1BBL融合蛋白的氨基酸序列的长度为297至543个氨基酸。
根据一具体实施例，SIRPα-4-1BBL融合蛋白的氨基酸序列的长度为296至542个氨基酸。
在以下的实例部分的表4中提供可与本发明的具体实施例一起使用的特定SIRPα-4-1BBL融合蛋白的非限制性实例，其作为本说明书的组成部分。
根据具体实施例，在相同的生产条件下，本发明的一些实施例的SIRPα-4-1BBL融合蛋白的产量高于包括如SEQ ID NO：2所示的SIRPα氨基酸序列及如SEQ ID NO：3所示的4-1BBL氨基酸序列的SIRPα-4-1BBL融合蛋白的产量至少1.5倍、至少2倍、至少2.5倍、至少3倍、至少5倍，各种可能性代表本发明的个别的实施例。
根据具体实施例，在相同的生产条件下，本发明的一些实施例的SIRPα-4-1BBL融合蛋白的产量高于包括如SEQ ID NO：2所示的SIRPα氨基酸序列及如SEQ ID NO：3所示的4-1BBL氨基酸序列的SIRPα-4-1BBL融合蛋白的产量至少1.5倍。
根据具体实施例，在相同的生产条件下，本发明的一些实施例的SIRPα-4-1BBL融合蛋白的产量高于包括如SEQ ID NO：2所示的SIRPα氨基酸序列及如SEQ ID NO：3所示的4-1BBL氨基酸序列的SIRPα-4-1BBL融合蛋白的产量至少2倍。
根据具体实施例，在相同的生产条件下，本发明的一些实施例的SIRPα-4-1BBL融合蛋白的产量高于SEQ ID NO：5的产量至少1.5倍、至少2倍、至少2.5倍、至少3倍、至少5倍，各种可能性代表本发明的个别的实施例。
根据具体实施例，在相同的生产条件下，本发明的一些实施例的SIRPα-4-1BBL融合蛋白的产量高于SEQ ID NO：5的产量至少1.5倍。
根据具体实施例，在相同的生产条件下，本发明的一些实施例的SIRPα-4-1BBL融合蛋白的产量高于SEQ ID NO：5的产量至少2倍。
根据具体实施例，在相同的生产条件下，本发明的一些实施例的SIRPα-4-1BBL融合蛋白的产量高于SEQ ID NO：2的产量至少1.5倍、至少2倍、至少2.5倍、至少3倍、至少5倍，各种可能性代表本发明的个别的实施例。
根据具体实施例，在相同的生产条件下，本发明的一些实施例的包括4-1BBL氨基酸的经分离的多肽的产量高于SEQ ID NO：3的产量至少1.5倍、至少2倍、至少2.5倍、至少3倍、至少5倍，各种可能性代表本发明的个别的实施例。
根据具体实施例，在相同的生产条件下，本发明的一些实施例的SIRPα-4-1BBL融合蛋白的聚集体的数量低于包括如SEQ ID NO：2所示的SIRPα氨基酸序列及如SEQ ID NO：3所示的4-1BBL氨基酸序列的SIRPα-4-1BBL融合蛋白的聚集体的数量的至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％，各种可能性代表本发明的个别的实施例。
根据具体实施例，在相同的生产条件下，本发明的一些实施例的SIRPα-4-1BBL融合蛋白的聚集体的数量低于SEQ ID NO：5的聚集体的数量至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％，各种可能性代表本发明的个别的实施例。
根据具体实施例，在相同的生产条件下，本发明的一些实施例的SIRPα-4-1BBL融合蛋白的聚集体的数量低于SEQ ID NO：5的聚集体的数量至少20％，各种可能性代表本发明的个别的实施例。
根据具体实施例，在相同的生产条件下，本发明的一些实施例的SIRPα-4-1BBL融合蛋白的聚集体的数量低于SEQ ID NO：5的聚集体的数量至少50％，各种可能性代表本发明的个别的实施例。
根据具体实施例，例如在相同的生产条件下，本发明的一些实施例的SIRPα-4-1BBL融合蛋白的活性高于包括如SEQ ID NO：2所示的SIRPα氨基酸序列及如SEQ ID NO：3所示的4-1BBL氨基酸序列的SIRPα-4-1BBL融合蛋白的活性至少1.5倍、至少2倍、至少2.5倍、至少3倍、至少5倍，各种可能性代表本发明的个别的实施例。
根据具体实施例，例如在相同的生产条件下，本发明的一些实施例的SIRPα-4-1BBL融合蛋白的活性高于SEQ ID NO：5的活性至少1.5倍、至少2倍、至少2.5倍、至少3倍、至少5倍，各种可能性代表本发明的个别的实施例。
根据具体实施例，例如在相同的生产条件下，本发明的一些实施例的SIRPα-4-1BBL融合蛋白的活性高于SEQ ID NO：2的活性至少1.5倍、至少2倍、至少2.5倍、至少3倍、至少5倍，各种可能性代表本发明的个别的实施例。
根据具体实施例，例如在相同的生产条件下，本发明的一些实施例的SIRPα-4-1BBL融合蛋白的活性高于SEQ ID NO：3的活性至少1.5倍、至少2倍、至少2.5倍、至少3倍、至少5倍，各种可能性代表本发明的个别的实施例。
根据具体实施例，在相同的生产条件下，本发明的一些实施例的SIRPα-4-1BBL融合蛋白的稳定性高于包括如SEQ ID NO：2所示的SIRPα氨基酸序列及如SEQ ID NO：3所示的4-1BBL氨基酸序列的SIRPα-4-1BBL融合蛋白的稳定性至少1.5倍、至少2倍、至少2.5倍、至少3倍、至少5倍，各种可能性代表本发明的个别的实施例。
根据具体实施例，在相同的生产条件下，本发明的一些实施例的SIRPα-4-1BBL融合蛋白的稳定性高于SEQ ID NO：5的活性至少1.5倍、至少2倍、至少2.5倍、至少3倍、至少5倍，各种可能性代表本发明的个别的实施例。
根据具体实施例，在相同的生产条件下，本发明的一些实施例的SIRPα-4-1BBL融合蛋白的稳定性高于SEQ ID NO：2的活性至少1.5倍、至少2倍、至少2.5倍、至少3倍、至少5倍，各种可能性代表本发明的个别的实施例。
根据具体实施例，在相同的生产条件下，本发明的一些实施例的包括4-1BBL氨基酸序列的经分离的多肽的稳定性高于SEQ ID NO：3的稳定性至少1.5倍、至少2倍、至少2.5倍、至少3倍、至少5倍，各种可能性代表本发明的个别的实施例具体实施例。
根据具体实施例，在相同的生产条件下，本发明的一些实施例的SIRPα-4-1BBL融合蛋白的安全性高于包括如SEQ ID NO：2所示的SIRPα氨基酸序列及如SEQ ID NO：3所示的4-1BBL氨基酸序列的SIRPα-4-1BBL融合蛋白的安全性至少1.5倍、至少2倍、至少2.5倍、至少3倍、至少5倍，各种可能性代表本发明的个别的实施例具体实施例。
根据具体实施例，在相同的生产条件下，本发明的一些实施例的SIRPα-4-1BBL融合蛋白的安全性高于SEQ ID NO：5的安全性至少1.5倍、至少2倍、至少2.5倍、至少3倍、至少5倍，各种可能性代表本发明的个别的实施例具体实施例。
根据具体实施例，在相同的生产条件下，本发明的一些实施例的包括SIRPα氨基酸序列的经分离的多肽的安全性高于SEQ ID NO：2至少1.5倍、至少2倍、至少2.5倍、至少3倍、至少5倍，各种可能性代表本发明的个别的实施例。
根据具体实施例，在相同的生产条件下，本发明的一些实施例的包括4-1BBL氨基酸序列的经分离的多肽的安全性高于SEQ ID NO：3至少1.5倍、至少2倍、至少2.5倍、至少3倍、至少5倍，各种可能性代表本发明的个别的实施例。
根据具体实施例，所述生产条件包括在哺乳动物细胞中表达且在32至37℃、5％至10％CO2下培养5至13天。
可在本发明的具体实施例中使用的生产条件的非限制性实例在以下的实例部分中公开。
因此，例如，编码融合蛋白的表达载体，包括SIRPα氨基酸序列的经分离的多肽或包括4-1BBL氨基酸序列的经分离的多肽，所述4-1BBL氨基酸序列在N端包括人工信号肽(例如SEQ ID NO：4)及在C端包括His标签及终止密码子，是在哺乳动物细胞中表达，例如Expi293F或ExpiCHO细胞。之后根据Expi293F或ExpiCHO细胞制造商的说明书(Thermo)，经转导的细胞是在细胞特异性培养基中于32至37℃、5至10％CO2中进行培养，并在培养至少5天后自上清液中收集蛋白质并纯化。
根据具体实施例，以批次、分批，批次补料或灌注模式操作培养物。
根据具体实施例，培养物在批次补料的条件下操作。
根据具体实施例，在37℃下进行培养。
根据具体实施例，其在37℃下进行培养，温度转变为32℃。在达到固定相之前，可进行此种温度变化以减缓细胞的新陈代谢。
根据具体实施例，包括SIRPα氨基酸序列的经分离的多肽能够结合CD47。
根据具体实施例，相较于缺乏包括SIRPα氨基酸序列的经分离的多肽，SIRPα氨基酸序列能够通过吞噬细胞增强表达CD47的病理细胞的吞噬作用。
根据具体实施例，如本文中所公开，相较于SEQ ID NO：2，本发明的一些实施例的包括SIRPα氨基酸序列的经分离的多肽具有一经增强的活性。
根据具体实施例，包括4-1BBL氨基酸序列的经分离的多肽具有至少以下的能力之一：
(i)结合4-1BB；
(ii)在表达所述4-1BB的细胞中激活所述4-1BB的信号传导途径；及/或
(iii)共刺激表达所述4-1BB的免疫细胞。
根据具体实施例，相较于SEQ ID NO：3，本发明的一些实施例的包括4-1BBL氨基酸序列的经分离的多肽具有如本文中所公开的经增强的活性。
根据具体实施例，包括4-1BBL氨基酸序列的经分离的多肽可为(i)、(ii)、(iii)、(i)+(ii)、(i)+(iii)、(ii)+(iii)、(i)+(ii)+(iii)。
根据具体实施例，SIRPα-4-1BBL氨基酸序列具有至少以下的能力之一：
(i)结合CD47及4-1BB；
(ii)在表达所述4-1BB的免疫细胞(例如，T细胞)中激活4-1BB的信号传导途径；
(iii)激活表达所述4-1BB的免疫细胞(例如，T细胞)；及/或
(iv)相较于缺乏所述SIRPα-4-1BBL融合蛋白，增强通过吞噬细胞表达所述CD47的病理细胞的吞噬作用。
根据具体实施例，相较于包或如SEQ ID NO：2所示的SIRPα氨基酸序列及如SEQ IDNO：3所示的4-1BBL氨基酸序列的融合蛋白，本发明的一些实施例的SIRPα-4-1BBL融合蛋白具有如本文中所公开的经增强的活性。
根据具体实施例，相较于SEQ ID NO：5，本发明的一些实施例的SIRPα-4-1BBL融合蛋白具有如本文中所公开的经增强的活性。
根据具体实施例，SIRPα-4-1BBL氨基酸序列的经分离的多肽可为(i)、(ii)、(iii)、(iv)、(i)+(ii)、(i)+(iii)、(i)+(iv)、(ii)+(iii)、(ii)+(iv)、(i)+(ii)+(iii)、(i)+(ii)+(iv)、(ii)+(iii)+(iv)。
根据具体实施例，SIRPα-4-1BBL氨基酸序列的经分离的多肽可为(i)+(ii)+(iii)+(iv)。
确定结合、激活4-1BB信号传导途径及激活免疫细胞的方法是本领域众所周知的，且在上文、下文及以下的实例部分中进一步描述。
根据具体实施例，SIRPα-4-1BBL融合蛋白或包括SIRPα氨基酸序列的经分离的多肽通过吞噬细胞增强表达所述CD47的病理细胞的吞噬作用。
分析吞噬作用的方法在本领域中是众所周知的，且在以下实施例部分的实验4中亦有揭露；且包括例如杀伤力分析、流式细胞术及/或显微镜评估(活细胞成像、荧光显微镜共聚焦显微镜、电子显微镜)。
根据具体实施例，例如通过诸如流式细胞仪或显微镜评估的检测，相较于缺乏本发明的SIRPα-4-1BBL融合蛋白或包括SIRPα氨基酸序列的经分离的多肽、编码相同的多肽的多核苷酸或核酸构建体或表达相同的核酸构建体的宿主细胞，吞噬作用是增强至少1.5倍、至少2倍、至少3倍、至少5倍、至少10倍或至少20倍。
根据其他的具体实施例，例如通过诸如流式细胞仪或显微镜评估的检测，相较于缺乏本发明的SIRPα-4-1BBL融合蛋白或包括SIRPα氨基酸序列的经分离的多肽、编码相同的多肽的多核苷酸或核酸构建体或表达相同的核酸构建体的宿主细胞，存活率是增加至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少100％。
作为本发明的一些实施例的组合物(例如，包括SIRPα氨基酸序列的经分离的多肽、包括4-1BBL氨基酸序列的经分离的多肽、编码相同的多肽的多核苷酸或核酸或表达相同的多肽的宿主细胞)具有激活免疫细胞的能力，其可用于在体外、离体及/或体内激活免疫细胞的方法。
因此，根据本发明的一方面，提供激活免疫细胞的方法，所述方法包括在SIRPα-4-1BBL融合蛋白、经分离的多肽的存在下的体外或离体激活免疫细胞。包括本文所公开的SIRPα氨基酸序列及/或包括4-1BBL氨基酸序列的经分离的多肽，编码相同的多肽的多核苷酸、编码相同的多肽的核酸构建体或表达相同的多肽的宿主细胞。
根据本发明的另一方面，提供激活T细胞的方法，所述方法包括在本文中所公开的SIRPα-4-1BBL融合蛋白及表达CD47的细胞的存在下的体外或离体激活T细胞。
根据本发明的另一方面，本文中提供一种激活吞噬细胞的方法，所述方法包括在SIRPα-4-1BBL融合蛋白及/或包括本文所公开的SIRPα氨基酸序列的经分离的多肽的存在下的体外或离体激活吞噬细胞，以及表达CD47的细胞。
根据具体实施例，在SIRPα-4-1BBL融合蛋白、编码相同的融合蛋白的多核苷酸、编码相同的融合蛋白的核酸构建体或表达相同的融合蛋白的宿主细胞的存在下进行激活。
根据具体实施例，在包括SIRPα氨基酸序列的经分离的多肽、编码相同的多肽的多核苷酸、编码相同的多肽的核酸构建体或表达相同的多肽的宿主细胞的存在下进行激活。
根据具体实施例，在包括4-1BBL氨基酸序列的经分离的多肽、编码相同的多肽的多核苷酸、编码相同的多肽的核酸构建体或表达相同的多肽的宿主细胞的存在下进行激活。
根据具体实施例，在包括SIRPα氨基酸序列的经分离的多肽、编码相同的多肽的多核苷酸、编码相同的多肽的核酸构建体或表达相同的多肽的宿主细胞；以及4-1BBL氨基酸序列的经分离的多肽、编码相同的多肽的多核苷酸、编码相同的多肽的核酸构建体或表达相同的多肽的宿主细胞的存在下进行激活。
根据具体实施例，免疫细胞表达4-1BB。
根据具体实施例，免疫细胞包括外周血单核细胞(PBMC)。
如本文中所使用，术语“外周血单核细胞(PBMC)”是指具有单核的血细胞，且包括淋巴细胞、单核细胞及树突细胞(DC)。
根据具体实施例，PBMC是选自由树突细胞(DC)、T细胞、B细胞、NK细胞及NKT细胞所组成的群组。
根据具体实施例，PBMC包括T细胞、B细胞、NK细胞及NKT细胞。
获得PBMC的方法是本领域众所周知的，例如自受试者抽取全血并收集在装有抗凝剂(例如，肝素或柠檬酸盐)的容器中；以及使血球分离。之后，根据具体实施例，自外周血中纯化至少一种类型的PBMC。有多种本领域技术人员已知的用于自全血中纯化PBMC的方法及试剂，例如白血球分离术、沉降、密度梯度离心(例如，ficoll)、离心淘析、分级分离、例如红血细胞的化学裂解(例如通过ACK)、使用细胞表面标记物选择特定的细胞类型(使用例如FACS分选仪或磁性细胞分离技术，例如可从Invitrogen、Stemcell Technologies、Cellpro、Advanced Magnetics或Miltenyi Biotec商购而得)以及通过诸如使用特异性抗体根除(例如，杀死)的方法或基于阴性选择的亲和力基纯化(使用例如磁性细胞分离技术、FACS分选仪及/或捕获ELISA标记)来清除特定的细胞类型。此种方法例如在《实验免疫学手册》第1至第4卷(D.N.威尔，编辑者)及流式细胞术与细胞分选(A.拉德布鲁赫，编辑，Springer Verlag，2000)中有所描述。
根据具体实施例，免疫细胞包括肿瘤浸润淋巴细胞。
如本文中所使用，术语“肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)是指单核白血细胞，其具有最少的血流并迁移至肿瘤中。
根据具体实施例，TIL是选自由T细胞、B细胞、NK细胞及单核细胞所组成的群组。
获得TIL的方法在本领域中是众所周知的，例如自一受试者获得肿瘤样品，例如通过活组织切片或尸检剖验，并制备其单细胞悬液。可利用任何合适的方式获得单细胞悬液，例如，以机械方式(使用例如gentleMACS(TM)分离器‘Miltenyi Biotec，奥本，加利福尼亚州)或以分解酶方式(例如，胶原蛋白酶或脱氧核糖核酸酶)。之后，可利用细胞悬液中纯化至少一种类型的TIL。已存在多种本领域技术人员已知用于纯化所需类型的TIL的方法及试剂，例如使用细胞表面标记物选择特定的细胞类型(使用例如FACS分选仪或磁性细胞分离技术，例如可从Invitrogen、Stemcell Technologies、Cellpro、Advanced Magnetics或Miltenyi Biotec商购而得)以及通过诸如使用特异性抗体根除(例如，杀死)的方法或基于阴性选择的亲和力基纯化(使用例如磁性细胞分离技术、FACS分选仪及/或捕获ELISA标记)来清除特定的细胞类型。此种方法例如在《实验免疫学手册》第1至第4卷(D.N.威尔，编辑者)及流式细胞术与细胞分选(A.拉德布鲁赫，编辑，Springer Verlag，2000)中有所描述。
根据具体实施例，免疫细胞包括吞噬细胞。
如本文中所使用，术语“吞噬细胞”是指能够吞噬的细胞，且包括专业的吞噬细胞及非专业的吞噬细胞。分析吞噬作用的方法在本领域中是众所周知的，且进一步公开于上文及下文中。根据具体实施例，吞噬细胞是选自由单核细胞、树突细胞(DC)及粒细胞所组成的群组。
根据具体实施例，吞噬细胞包括粒细胞。
根据具体实施例，吞噬细胞包括单核细胞。
根据具体实施例，免疫细胞包括单核细胞。
根据具体实施例，术语“单核细胞”是指循环单核细胞以及组织中存在的巨噬细胞(亦称为单核吞噬细胞)。
根据具体实施例，单核细胞包括巨噬细胞。通常，巨噬细胞的细胞表面的表型包括CD14、CD40、CD11b、CD64、F4/80(小鼠)/EMR1(人类)、溶菌酶M、MAC-1/MAC-3及CD68。
根据具体实施例，单核细胞包括循环单核细胞。通常，循环单核细胞的细胞表面的表型包括CD14及CD16(例如CD14++CD16-、CD14+CD16++、CD14++CD16+)。
根据具体实施例，免疫细胞包括DC。
如本文中所使用，术语“树突细胞(DC)”是指在淋巴组织或非淋巴组织中所发现的形态相似的细胞类型的多样化群体中的任何成员。DC是一类专业的抗原呈现细胞，且具有高能力的敏感化HLA限制性T细胞。DC包括，例如，浆细胞样树突细胞、髓样树突细胞(包括未成熟的树突细胞及成熟的树突细胞)、朗格汉斯细胞、交错突细胞、滤泡树突细胞。树突细胞可通过功能或表型，尤其是通过细胞表面的表型来识别。此等细胞的特征在于其独特的形态，所述形态在细胞表面具有面纱样突起、中等至高水平的HLA-II类别的表面表达以及向T细胞，尤其是向初始T细胞呈现抗原的能力(参见斯坦曼R等人，Ann.Rev.Immunol.1991；9：271-196)。典型地，DC的细胞表面表型包括CD1a+、CD4+、CD86+或HLA-DR。术语DC包括未成熟的DC及成熟的DC。
根据具体实施例，免疫细胞包括粒细胞。
如本文中所使用，术语“粒细胞”是指多形核白血球，其特征在于在其细胞质中存在颗粒。
根据具体实施例，粒细胞包括嗜中性粒细胞。
根据具体实施例，粒细胞包括肥大细胞。
根据具体实施例，免疫细胞包括T细胞。
如本文中所使用，术语“T细胞”是指具有CD3+、具有CD4+或CD8+表型的T细胞受体(TCR)+的经分化的淋巴细胞。所述T细胞可为效应子或调节性T细胞。
如本文中所使用，术语“效应T细胞”是指激活或引导其他的免疫细胞，例如通过产生细胞激素或具有细胞毒活性的T细胞，例如CD4+、Th1/Th2、CD8+细胞毒T淋巴细胞。
如本文中所使用，术语“调节性T细胞”或“Treg”是指负调节其他的T细胞(包括效应子T细胞)的活性以及先天免疫系统的细胞的活性的T细胞。Treg细胞的特征在于持续抑制效应子T细胞的应答。根据一具体实施例，Treg是一CD4+CD25+Foxp3+T细胞。
根据具体实施例，T细胞是CD4+T细胞。
根据其他的具体实施例，T细胞是CD8+T细胞。
根据具体实施例，T细胞是记忆T细胞。记忆T细胞的非限制性例子包括具有CD3+/CD4+/CD45RA-/CCR7-表型的效应子记忆CD4+T细胞、具有CD3+/CD4+/CD45RA-/CCR7+表型的中央记忆CD4+T细胞、具有CD3+/CD8+CD45RA-/CCR7-表型的效应子记忆CD8+T细胞，及具有CD3+/CD8+CD45RA-/CCR7+表型的中央记忆CD8+T细胞。
根据具体实施例，T细胞包括使用编码一感兴趣的表达产物的核酸序列而转导的工程化T细胞。
根据具体实施例，所述感兴趣的表达产物是一T细胞受体(TCR)或一嵌合抗原受体(CAR)。
如本文中所使用，短语“使用编码TCR的核酸序列转导”或“使用编码TCR的核酸序列转导”是指从T细胞克隆可变的α-链及β-链，其对MHC中所呈现的所需抗原具有特异性。使用TCR进行转导的方法在本领域是已知的，且例如公开于尼科尔森等人.AdvHematol.2012；2012：404081；王及里维埃癌症基因疗法.2015三月.22(2)：85-94；以及拉默斯等人.《癌症基因疗法》(2002)9，613至623。
如本文中所使用，短语“使用编码CAR的核酸序列进行转导”或“使用编码CAR的核酸序列进行转导”是指将编码一嵌合抗原受体(CAR)的核酸序列进行克隆，其中CAR包括抗原识别部分及T细胞活化部分。嵌合抗原受体(CAR)是一人工构建的杂合蛋白或多肽，其包括与T细胞信号传导或T细胞活化结构域相连接的抗体的抗原结合结构域(例如，单链可变的片段(scFv))。使用CAR进行转导的方法在本领域中是已知的，且例如公开于达维拉等人.Oncoimmunology.2012年12月1日；1(9)：1577-1583；王及里维埃癌症基因疗法.2015年3月：22(2)：85-94：梅俄斯等人.Blood.2014年4月24日；123(17)：2625-35；波特DL新英格兰医学杂志.2011，365(8)：725-733；杰克逊HJ(Jackson HJ)，Nat Rev Clin Oncol.2016；13(6)：370-383；以及格洛伯森-列文等人.Mol Ther.2014；22(5)：1029-1038。
根据具体实施例，免疫细胞包括B细胞。
如本文中所使用，术语“B细胞”是指具有B细胞受体(BCR)+、CD19+及/或B220+表型的淋巴细胞。B细胞的特征在于其具有结合特异性抗原并引起体液应答的能力。
根据具体实施例，免疫细胞包括NK细胞。
如本文中所使用，术语“NK细胞”是指具有CD16+CD56+及/或CD57+TCR-表型的经分化的淋巴细胞。NK的特征在于其能够通过激活特定的溶细胞酶来结合并杀死无法表达“自身的”MHC/HLA抗原的细胞、具有杀死肿瘤细胞或表达NK激活受体的配体的其他患病细胞的能力，以及具有释放刺激免疫应答或抑制免疫应答的称为细胞激素的蛋白质分子的能力。
根据具体实施例，免疫细胞包括NKT细胞。
如本文中所使用，术语“NKT细胞”是指表达半不变的αβT细胞受体，但亦表达通常与NK细胞相关的多种分子标志物的特定T细胞群，例如NK1.1。NKT细胞包括NK1.1+及NK1.1-，以及CD4+、CD4-、CD8+及CD8-细胞。NKT细胞上的TCR是独特的，因为其可识别通过MHC I样分子CD1d所呈现的糖脂抗原。由于NKT细胞会产生促进炎症或免疫耐受的细胞激素的能力，因此其可能具有保护作用或有害作用。
根据具体实施例，免疫细胞是获自健康受试者。
根据具体实施例，免疫细胞是获自患有一病理(例如，癌症)的受试者。
根据具体实施例，所述激活是在表达CD47或外源性CD47的细胞的存在下进行。
根据具体实施例，所述激活是在外源性CD47的存在下进行。
根据具体实施例，外源性CD47是可溶的。
根据其他的具体实施例，将外源性CD47固定在一固体支持物上。
根据具体实施例，所述激活是在表达CD47的细胞存在下进行。
根据具体实施例，所述表达CD47的细胞包括病理性(患病的)细胞。
根据具体实施例，所述表达CD47的细胞包括癌细胞。
根据具体实施例，所述激活是在能够至少传输一初级激活信号的刺激剂的存在下进行，[例如，T细胞受体(TCR)与抗原呈现细胞(APC)上的主要组织兼容性复合物(MHC)/肽复合物的连接]，导致细胞增生、成熟、细胞激素产生、吞噬及/或诱导免疫细胞的调节性或效应子功能。根据具体实施例，刺激剂亦可传输一次级共刺激信号。
确定刺激剂的量以及刺激剂与免疫细胞之间的比例的方法完全是在本领域技术人员的能力范围内，因此在此不作具体说明。
刺激剂可为抗原依赖性或非依赖性(即，多克隆)的方式激活免疫细胞。
根据具体实施例，刺激剂包括一抗原非特异性刺激剂。
非特异性刺激剂是本领域技术人员已知的。因此，作为非限制性实例，当免疫细胞包括T细胞时，抗原非特异性刺激剂可为能够结合T细胞表面结构并诱导T细胞的多克隆刺激的试剂，例如，但不限于抗CD3抗体与诸如抗CD28抗体的共刺激蛋白组合使用。其他的非限制性实例包括抗-CD2、抗-CD137、抗-CD134、Notch-配体，例如单独或与抗CD3组合使用的Delta样1/4、Jaggedl/2。可诱导T细胞的多克隆刺激的其他试剂包括，但不限于促细胞分裂剂、PHA、PMA-离子霉素、CEB及细胞激活剂(Cytostim)(美天旎生物技术有限公司)。根据具体实施例，抗原非特异性刺激剂包括抗CD3及抗CD28抗体。根据具体实施例，T细胞刺激剂包括抗CD3包覆珠及抗CD28包覆珠，例如获自美天旎生物技术有限公司的CD3CD28MACSiBeads。
根据具体实施例，刺激剂包括一抗原特异性刺激剂。
抗原特异性T细胞刺激剂的非限制性实例包括载有抗原的抗原呈现细胞[APC，例如，树突细胞]以及载有肽的重组MHC。因此，例如，T细胞刺激剂可为预载有所需抗原(例如，肿瘤抗原)或经编码所需抗原的mRNA所转染的树突细胞。
根据具体实施例，抗原是一癌症抗原。
如本文中所使用，术语“癌症抗原”是指相较于非癌细胞，通过一癌细胞而过度表达或单独表达的抗原。癌症抗原可为已知的癌症抗原或在癌细胞中发展的新的特异性抗原(即新抗原)。
已知癌症抗原的非限制性实例包括MAGE-AI、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-AS、MAGE-A6、MAGE-A7、MAGE-AS、MAGE-A9、MAGE-AIO、MAGE-全部、MAGE-A12、GAGE-1、GAGE-2、GAGE-3、GAGE-4、GAGE-5、GAGE-6、GAGE-7、GAGE-8、BAGE-1、RAGE-1、LB33/MUM-1、PRAME、NAG、MAGE-Xp2(MAGE-B2)、MAGE-Xp3(MAGE-B3)、MAGE-Xp4(MAGE-B4)、MAGE-Cl/CT7、MAGE-C2、NY-ES0-1、LAGE-1、SSX-1、SSX-2(HOM-MEL-40)、SSX-3、SSX-4、SSX-5、SCP-1及XAGE、黑素细胞分化抗原、p53、ras、CEA、MUCI、PMSA、PSA、酪氨酸酶、Melan-A、MART-1、gp100、gp75、αactinin-4、Bcr-Abl融合蛋白、Casp-8、β-catenin、cdc27、cdk4、cdkn2a、coa-1、dek-can融合蛋白、EF2、ETV6-AML1融合蛋白、LDLR-岩藻糖基转移酶AS融合蛋白、HLA-A2、HLA-All、hsp70-2、KIAA0205、Mart2、Mum-2及3、neo-PAP、第I型肌球蛋白、OS-9、pml-RAR alpha融合蛋白、PTPRK、K-ras、N-ras、磷酸三糖异构酶、GnTV、Herv-K-mel、NA-88、SP17及TRP2-Int2(MART-1)、E2A-PRL、H4-RET、IGH-IGK、MYL-RAR、爱泼斯坦-巴尔病毒抗原、EBNA、人类乳头瘤病毒(HPV)抗原E6及E7、TSP-180、MAGE-4、MAGE-5、MAGE-6、p185erbB2、plSOerbB-3、c-met、nm-23Hl、PSA、TAG-72-4、CA 19-9、CA 72-4、CAM 17.1、NuMa、K-ras、甲胎蛋白、13HCG、BCA225、BTAA、CA 125、CA 15-3(CA 27.29\BCAA)、CA 195、CA 242、CA-50、CAM43、CD68\KP1、C0-029、FGF-5、0250、Ga733(EpCAM)、HTgp-175、M344、MA-50、MG7-Ag、MOV18、NB\170K、NYCO-I、RCASI、SDCCAG16、TA-90(Mac-2结合蛋白\亲环蛋白C相关的蛋白)、TAAL6、TAG72、TLP、TPS、酪氨酸酶相关的蛋白、TRP-1或TRP-2。
可表达的其他的肿瘤抗原是本领域众所周知的(参见例如，W000/20581；癌症疫苗及免疫疗法(2000)，史登、贝弗利及卡罗尔版本，剑桥大学出版社，剑桥)。此等肿瘤抗原的序列可容易地从公共的数据库获得，但亦可见于WO 1992/020356 AI、WO 1994/005304 AI、WO 1994/023031 AI、WO 1995/020974 AI、WO 1995/023874 AI及WO 1996/026214 AI。
替代地，或额外地，可使用自受试者所获得的癌细胞来鉴定肿瘤抗原，例如通过活组织切片。
因此，根据具体实施例，所述刺激剂包括一癌细胞。
根据具体实施例，所述激活是在一抗癌剂的存在下进行。
根据具体实施例，所述免疫细胞在激活之后被纯化。
因此，本发明亦考虑根据本发明的方法可获得的经分离的免疫细胞。
根据具体实施例，根据本发明所使用及/或所获得的免疫细胞可被新鲜地分离、储存，例如，在长时间(例如，数月、数年)的任何阶段的液氮温度下进行例如冷冻保存(即，冷冻)、以备将来使用；以及细胞株。
冷冻保存的方法是本领域技术人员通常已知的，且例如公开于国际专利申请公开第WO2007054160号及第WO 2001039594号，以及美国专利申请公开第US20120149108号中。
根据具体实施例，根据本发明所获得的细胞可被存储在一细胞库或保藏库或存储设施中。
因此，本教导进一步建议使用经分离的免疫细胞以及本发明的方法作为，但不限于，可用于激活免疫细胞的疾病的过继免疫细胞疗法的来源，所述疾病可自激活的免疫细胞而受益，例如，过度增生性疾病；与免疫抑制及感染相关的疾病。
因此，根据具体实施例，本发明的方法包括在所述激活之后将免疫细胞过继转移至有需要所述免疫细胞的受试者中。
根据具体实施例，提供根据本发明的方法可获得的用于过继细胞疗法的免疫细胞。
根据本发明的具体实施例所使用的细胞可为自体的或非自体的；其可为同基因的或非同基因的：对受试者是同种或异种的；各种可能性代表本发明的个别的实施例。
本教导亦考虑本发明的组合物的用途(例如融合蛋白，包括SIRPα氨基酸序列的经分离的多肽、包括4-1BBL氨基酸序列的经分离的多肽、编码相同的多肽的多核苷酸或核酸构建体或表达相同的多肽的宿主细胞)，通过得益于激活免疫细胞而治疗一疾病的方法。
因此，根据本发明的另一方面，提供一种通过得益于激活免疫细胞而治疗一疾病的方法，所述方法包括向有此需要的受试者施予所述SIRPα-4-1BBL融合蛋白、包含SIRPα氨基酸序列的所述经分离的多肽及/或包括本文中所公开的4-1BBL氨基酸序列的经分离的多肽、编码所述4-1BBL氨基酸的多核苷酸或核酸构建体或编码所述多肽的宿主细胞。
根据本发明的另一方面，提供本文中所公开的SIRPα-4-1BBL融合蛋白、包括SIRPα氨基酸序列的经分离的多肽及/或包括4-1BBL氨基酸序列的经分离的多肽、多核苷酸或编码所述多肽的核酸构建体或编码所述多肽的宿主细胞以用于通过得益于激活免疫细胞而治疗一疾病。
根据具体实施例，使用SIRPα-4-1BBL融合蛋白、编码所述融合蛋白的多核苷酸，编码所述融合蛋白的核酸构建体或表达所述融合蛋白的宿主细胞以进行治疗。
根据具体实施例，使用包括SIRPα氨基酸序列的经分离的多肽、编码相同的多肽的多核苷酸、编码相同的多肽的核酸构建体或表达相同的多肽的宿主细胞以进行治疗。
根据具体实施例，使用包括4-1BBL氨基酸序列的经分离的多肽、编码相同的多肽的多核苷酸，编码相同的多肽的核酸构建体或表达相同的多肽的宿主细胞以进行治疗。
根据具体实施例，使用所述SIRPα氨基酸序列、编码相同的SIRPα氨基酸序列的多核苷酸、编码相同的SIRPα氨基酸序列的核酸构建体或表达相同的SIRPα氨基酸序列的宿主细胞；以及所述4-1BBL氨基酸序列、编码相同的4-1BBL氨基酸序列的多核苷酸、编码相同的4-1BBL氨基酸序列的核酸构建体或表达相同的多肽的宿主细胞以进行治疗。
术语“治疗”是指抑制、预防或阻止病理(疾病、病症或医学状况)的发展及/或引起病理或病理症状的减轻、缓解或消退。本领域技术人员将理解，各种方法及分析可用于评估病理的发展，且类似地，各种方法及分析可用于评估病理的减轻、缓解或消退。
如本文中所使用，术语“受试者”包括哺乳动物，例如，任何年龄及任何性别的人类。根据具体实施例，术语“受试者”是指患有病理(疾病、病症或医学状况)的受试者。根据具体实施例，所述术语包括处于发展病理的危险中的个体。
根据具体实施例，所述受试者患有与表达CD47的细胞相关的疾病。
根据具体实施例，所述受试者的患病细胞表达CD47。
如本文中所使用，短语“可受益于激活免疫细胞的疾病”是指其中受试者的免疫应答活性可能足以至少减轻所述疾病的症状或延迟症状发作的疾病，然而，出于任何原因，受试者的免疫反应活动皆不尽人意。
可受益于激活免疫细胞的疾病的非限制性实例包括过度增生性疾病、与免疫抑制相关的疾病、由药物所引起的免疫抑制(例如，mTOR抑制剂、钙调神经磷酸酶抑制剂、类固醇)以及感染。
根据具体实施例，所述疾病包括过度增生性疾病。
根据具体实施例，所述过度增生性疾病包括硬化症、纤维症、特发性肺纤维化、牛皮癣、系统性硬化症/硬皮症、原发性胆道的胆管炎、原发性硬化性胆管炎、肝纤维化、预防放射性肺纤维化、骨髓纤维化或腹膜后纤维化。
根据其他的具体实施例，所述过度增生性疾病包括癌症。
因此，根据本发明的另一方面，提供一种治疗癌症的方法，所述方法包括将如本文中所公开的所述CD47-4-1BBL融合蛋白、包括CD47氨基酸序列的经分离的多肽及/或包括4-1BBL的经分离的多肽施予需要其的受试者。
如本文中所使用，术语癌症包括恶性癌症及恶变前癌症。
关于癌症的恶变前或良性形式，其组合物及方法可任选地用于阻止恶变前癌症发展为恶性形式。
可通过本发明的一些实施例的方法所治疗的癌症可为任何实体或非实体癌症及/或癌症转移。
根据具体实施例，所述癌症包括恶性癌症。
癌症的例子包括但不限于癌、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤及白血病。此类癌症的更具体的实例包括鳞状细胞癌、肺癌(包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌及肺鳞状癌)、腹膜癌、肝细胞癌、胃癌(gastric cancer)或胃癌(stomach cancer)(包括胃肠道癌)、胰腺癌、胶质母细胞瘤、子宫颈癌、卵巢癌、肝脏恶性肿瘤、膀胱癌、肝肿瘤、乳腺癌、结肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜或子宫癌、唾液腺癌、肾脏癌(kidney cancer)或肾脏癌(renal cancer)、肝脏恶性肿瘤、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌及各种类型的头颈癌，以及B细胞淋巴瘤(包括低度/滤泡性非霍奇金淋巴瘤(NHL)；伯基特淋巴瘤，弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)；小淋巴细胞(SL)NHL；中度/滤泡性NHL；中度弥漫性NHL；高度免疫母细胞性NHL；高度淋巴母细胞性NHL；高度小非裂解细胞NHL；大块体疾病NHL；套细胞淋巴瘤；AIDS相关的淋巴瘤；及Waldenstrom的巨球蛋白血症；T细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)；急性淋巴细胞白血病(ALL)；急性髓性白血病(AML)、急性早幼粒细胞白血病(APL)、毛细胞白血病；慢性粒细胞性白血病(CML)；以及移植后的淋巴增生性疾病(PTLD)，以及与吞噬、水肿(例如与脑肿瘤有关)，及梅格斯氏综合征(Meigs’s syndrome)相关的异常血管增生。优选地，所述癌症是选自由乳腺癌、结肠直肠癌、直肠癌、非小细胞肺癌、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、肾细胞癌、前列腺癌、肝脏恶性肿瘤、胰腺癌；软组织肉瘤、卡波济氏肉瘤、类癌、头颈癌、黑色素瘤、卵巢癌、间皮瘤及多发性骨髓瘤。适用于本发明的治疗的癌性疾病包括转移性癌症。
根据具体实施例，所述癌症包括恶变前癌症。
恶变前癌症(或癌症前期)具有充分的表征且在本领域中广为人知(例如，参见伯曼JJ.以及亨森DE.，2003.癌症前期的分类：元数据方法。BMC Med Inform Decis Mak。3：8)。适用于通过本发明的方法所治疗的恶变前癌症的类型包括后天性小或微观恶变前癌症，具有核非典型的后天性大病变、由遗传性增生综合征所发展而来的前体病变发展为癌症，以及后天性弥漫性增生及弥漫性化生。小或微观恶变前癌症的例子包括HGSIL(高度的子宫颈的鳞状上皮内病变)、AIN(膀胱上皮内瘤变)、声带发育不良、异常隐窝(结肠)、PIN(前列腺上皮内瘤变)。核非典型的后天性大病变的例子包括肾小管腺瘤、AILD(具有高蛋白血症的血管免疫母细胞淋巴结病)、非典型的脑膜瘤、胃息肉、大斑状寄生虫病、骨髓增生异常、原位乳头状移行细胞癌、难治性贫血伴过量胚泡及施耐德乳头状瘤(Schneiderianpapilloma)。因遗传性增生综合症而发展为癌症的前体病变的例子包括非典型痣综合症、C细胞腺腺瘤病及MEA。后天性弥漫性增生及弥漫性化生的例子包括AIDS、非典型的淋巴样增生、骨骼的佩吉特氏病、移植后的淋巴增生性疾病及溃疡性结肠炎。
根据具体实施例，所述癌症是白血病、慢性粒单核细胞性白血病(CMML)、慢性骨髓性白血病(CML)、急性髓性白血病(AML)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、B细胞慢性淋巴细胞性白血病(B-CLL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、滤泡性淋巴瘤(FL)、边缘区淋巴瘤(MZL)、B前急性淋巴细胞白血病(B前ALL)、平滑肌肉肉瘤、卵巢癌、乳腺癌、结肠癌、膀胱癌、胶质母细胞瘤、肝细胞癌、前列腺癌、急性淋巴细胞白血病(ALL)、多发性骨髓瘤、非小细胞肺癌(NSCLC)、结直肠癌、黑素瘤、头颈癌、边缘区B细胞淋巴瘤、胰管腺癌或脑癌。
根据一些实施例，所述癌症是急性髓性白血病、膀胱癌、乳腺癌、慢性淋巴细胞性白血病、慢性粒细胞性白血病、结肠直肠癌、弥漫性大B细胞淋巴瘤、上皮性卵巢癌、上皮性肿瘤、输卵管癌、滤泡性淋巴瘤、胶质母细胞瘤、肝细胞癌、头颈癌、白血病、淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、黑色素瘤、间皮瘤、多发性骨髓瘤、鼻咽癌、非霍奇金淋巴瘤、非小细胞肺癌、卵巢癌、前列腺癌或肾细胞癌。
根据具体实施例，所述癌症是选自由淋巴瘤、白血病及恶性肿瘤所组成的群组。
根据具体实施例，所述癌症是选自由淋巴瘤、白血病、结肠癌、胰腺癌、卵巢癌、肺癌及鳞状细胞癌。
根据具体实施例，所述癌症是结肠癌。
根据具体实施例，所述癌症是卵巢癌。
根据具体实施例，所述癌症是肺癌。
根据具体实施例，所述癌症是头颈癌。
根据具体实施例，癌症是白血病。
根据具体实施例，所述白血病选自由急性非淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、急性粒细胞性白血病、慢性粒性细胞性白血病、急性早幼粒细胞性白血病、成年T细胞白血病、白血球缺乏性白血病、白血性白血病、嗜碱性粒细胞白血病、牛白血病、慢性粒细胞白血病、皮肤性白血病、胚胎性白血病、嗜酸性粒细胞白血病、格罗斯白血病、毛细胞白血病、成血性白血病、成血性细胞性白血病、组织细胞性白血病、干细胞白血病、急性单核细胞性白血病、白血球减少性白血病、淋巴白血病、淋巴母细胞性白血病、淋巴细胞性白血病、淋巴生成的白血病、淋巴球增生白血病、淋巴肉瘤细胞白血病、肥大细胞白血病、巨核细胞白血病、微粒细胞白血病、单核细胞白血病、粒血球白血病、粒细胞性白血病、髓样粒细胞性白血病、粒单核细胞性白血病、Naegeli氏白血病、浆细胞性白血病、早幼粒细胞性白血病、里德细胞白血病、席林氏白血病、干细胞白血病、亚白血球缺乏性白血病及未分化细胞白血病。
根据具体实施例，所述白血病是早幼粒细胞白血病、急性髓样白血病或慢性粒细胞性白血病。
根据具体实施例，所述癌症是淋巴瘤。
根据具体实施例，所述淋巴瘤是B细胞淋巴瘤。
根据具体实施例，淋巴瘤是T细胞淋巴瘤。
根据其他具体实施方式，淋巴瘤是霍奇金淋巴瘤。
根据具体实施例，淋巴瘤是非霍奇金淋巴瘤。
根据具体实施例，非霍奇金淋巴瘤是选自由侵袭性NHL、转移的NHL、惰性NHL、复发性NHL、难治性NHL、低度非霍奇金淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、大细胞淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤，伯基特淋巴瘤、NK细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、急性淋巴母细胞淋巴瘤及皮肤T细胞癌，包括蕈样真菌病/塞扎里综合征(Sezry syndrome)。
根据具体实施例，所述癌症是多发性骨髓瘤。
根据至少一些实施例，所述多发性骨髓瘤是选自由产生kappa型轻链及/或lambda型轻链的多发性骨髓瘤癌症；侵袭性多发性骨髓瘤，包括原发性浆细胞白血病(PCL)；良性浆细胞疾病，例如MGUS(具有不确定性的单克隆性球蛋白症)、Waldenstrom巨球蛋白血症(WM，亦称为淋巴浆细胞性淋巴瘤)，可能会发展为多发性骨髓瘤；多发性骨髓瘤的焖燃型多发性骨髓瘤(SMM)、惰性多发性骨髓瘤、恶变形式，亦可能发展为多发性骨髓瘤；原发性淀粉样变性。
根据具体实施例，通过在肿瘤微环境中存在具有肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的肿瘤及/或在肿瘤微环境中具有相对高表达的CD47的肿瘤来定义癌症。
根据具体实施例，癌症细胞会表达CD47。
根据具体实施例，所述疾病包括与由药物所引起的免疫抑制或免疫抑制作用相关的疾病(例如mTOR抑制剂、钙调神经磷酸酶抑制剂、类固醇)。
根据具体实施例，所述疾病包括HIV、麻疹、流行性感冒、LCCM、RSV、人类鼻病毒、EBV、CMV、细小病毒。
根据具体实施例，所述疾病包括感染。
如本文中所使用，术语“传染病”的“感染”是指由病原体诱导的疾病。病原体的具体实例包括病毒病原体、细菌病原体，例如细胞内分枝杆菌病原体(例如，结核分枝杆菌)、细胞内细菌病原体(例如，单核细胞增生李斯特氏菌)或细胞内原生动物病原体(例如，诸如利什曼原虫及锥虫)。
根据本发明的教导可治疗引起感染性疾病的病毒病原体的具体类型包括，但不限于逆转录病毒、圆环病毒、细小病毒、乳头瘤病毒、腺病毒、疱疹病毒、虹膜病毒、痘病毒、肝炎病毒、小核糖核酸病毒、杯状病毒、披膜病毒、黄病毒、呼肠孤病毒、正粘病毒、副粘病毒、杆状病毒、布尼亚病毒、新冠病毒、鼻病毒及丝状病毒。
根据本发明的教导可治疗的病毒感染的具体实例包括，但不限于经人类免疫缺陷病毒(HIV)诱导的后天性免疫缺陷综合症(AIDS)、流行性感冒、鼻病毒感染、病毒性脑膜炎、爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)感染、A、B或C型肝炎病毒感染、麻疹、乳头瘤病毒感染/疣、巨细胞病毒(CMV)感染、单纯疱疹病毒感染、黄热病、埃博拉病毒感染、狂犬病等。
根据具体实施例，本文中所公开的组合物(例如，SIRPα-4-1BBL融合蛋白，包括SIRPα氨基酸序列的多肽、包括4-1BBL氨基酸序列的多肽、编码相同的多肽的多核苷酸或核酸构建体及/或表达相同的多肽的宿主细胞)可与其他既定的或实验性治疗方案组合施予受试者，以通过得益于激活免疫细胞(例如癌症)而治疗一疾病，包括但不限于止痛药、化学治疗剂、放射治疗剂、细胞毒疗法(调节)、激素疗法、抗体及其他本领域众所周知的治疗方案(例如，手术)。
根据具体实施例，本文中所公开的组合物(例如，SIRPα-4-1BBL融合蛋白、包括SIRPα氨基酸序列的多肽、包括4-1BBL氨基酸序列的多肽、编码相同的多肽的多核苷酸或核酸构建体及/或表达相同的多肽的宿主细胞)可与过继细胞移植组合施予受试者，所述过继细胞移植例如，但不限于骨髓细胞、造血干细胞、PBMC、脐带血干细胞及/或经诱导的多能干细胞的移植。
根据具体实施例，与本发明的一些实施例的组合物组合施用的治疗剂包括一抗癌剂。
因此，根据本发明的另一方面，提供一种治疗癌症的方法，所述方法包括向有此需要的受试者施予一抗癌剂；以及SIRPα-4-1BBL融合蛋白、包括SIRPα氨基酸序列的经分离的多肽及/或包括4-1BBL氨基酸序列的多肽、编码相同的多肽的多核苷酸、编码相同的多肽的核酸构建体或表达相同的多肽的宿主细胞。
可与本发明的具体实施例一起使用的抗癌剂包括，但不限于阿西维辛(Acivicin)抗癌药；阿克拉比星(Aclarubicin)；盐酸阿考达唑(Acodazole Hydrochloride)；阿克罗宁(Acronine)；阿霉素(Adriamycin)；阿多来新(Adozelesin)；阿地白介素(Aldesleukin)；奥曲胺(Altretamine)；安博霉素(Ambomycin)；乙酸阿美蒽醌(Ametantrone Acetate)；氨基谷氨酰胺；安沙吖啶(Amsacrine)；阿那曲唑(Anastrozole)；蒽霉素(Anthramycin)；天冬酰胺酶；阿斯佩林(Asperlin)；阿扎胞苷(Azacitidine)；阿扎替派(Azetepa)；阿佐霉素(Azotomycin)；巴马司他(Batimastat)；苯佐替派(Benzodepa)；比卡鲁胺(Bicalutamide)；盐酸比桑烯；比斯那非二甲磺酸酯(Bisnafide Dimesylate)；比塞莱辛(Bizelesin)；硫酸博来霉素(Bleomycin Sulfate)；布雷喹钠(Brequinar Sodium)；溴匹立明(Bropirimine)；白消安(Busulfan)；放线菌素(Cactinomycin)；卡鲁睾酮(Calusterone)；卡醋胺(Caracemide)；卡贝替姆(Carbetimer)；卡铂(Carboplatin)；卡莫斯汀(Carmustine)；盐酸卡柔比星(Carubicin Hydrochloride)；卡折来新(Carzelesin)；西地芬戈(Cedefingol)；苯丁酸氮芥(Chlorambucil)；西罗霉素(Cirolemycin)；顺铂(cisplatin)；克拉屈滨；甲磺酸克里斯奈托(Crisnatol Mesylate)；环磷酰胺；阿糖胞苷(Cytarabine)；达卡巴嗪(Dacarbazine)；放线菌素(Dactinomycin)；盐酸柔红霉素(DaunorubicinHydrochloride)；地西他滨(Decitabine)；右奥马钼(dexormaplatin)；地扎狐宁(Dezaguanine)；甲横酸地扎狐宁(Dezaguanine Mesylate)；地吖醌(Diaziquone)；多西他赛(Docetaxel)；多柔比星(Doxorubicin)；盐酸多柔比星(Doxorubicin Hydrochloride)；屈洛昔芬(Droloxifene)；屈洛昔芬柠檬酸盐(Droloxifene Citrate)；屈他雄酮丙酸(Dromostanolone Propionate)；达佐霉素(Duazomycin)；依达曲沙(Edatrexate)；盐酸依氟鸟氨酸(Eflornithine Hydrochloride)；依沙芦星(Elsamitrucin)；恩洛钼(Enloplatin)；恩普胺酯(Enpromate)；依匹哌啶(Epipropidine)；盐酸表柔比星(Epirubicin Hydrochloride)；厄布洛挫(Erbulozole)；盐酸依索比星(EsorubicinHydrochloride)；雌莫司汀(Estramustine)；磷酸钠雌莫司汀(Estramustine PhosphateSodium)；依他硝挫(Etanidazole)；依托泊苷(Etoposide)；磷酸依托泊苷(EtoposidePhosphate)；埃托宁(Etoprine)；盐酸法倔挫(Fadrozole Hydrochloride)；法扎拉滨(Fazarabine)；芬维A胺(Fenretinide)；氮尿苷(Floxuridine)；磷酸氟达拉滨(Fludarabine Phosphate)；氟尿喃啶(Fluorouracil)；氟西他滨(Flurocitabine)；磷喹酮(Fosquidone)；福司曲星(Fostriecin Sodium)；吉西他宾(Gemcitabine)；盐酸吉西他宾(Gemcitabine Hydrochloride)；羟基脲(Hydroxyurea)；盐酸伊达比星(IdarubicinHydrochloride)；异环磷酰胺(Ifosfamide)；伊莫福新(Ilmofosine)；干扰素α-2a(Interferon Alfa-2a)；干扰素α-2b(Interferon Alfa-2b)；干扰素α-n1(InterferonAlfa-n1)；干扰素α-n3(Interferon Alfa-n3)；干扰素β-Ia(Interferon Beta-Ia)；干扰素γ-Ib(Interferon Gamma-Ib)；异丙铂(Iproplatin)；盐酸伊立替康(IrinotecanHydrochloride)；乙酸兰瑞肽(Lanreotide Acetate)；来曲挫(Letrozole)；乙酸亮丙立德(Leuprolide Acetate)；盐酸利阿挫(Liarozole Hydrochloride)；洛美曲索钠(Lometrexol Sodium)；洛莫司汀(Lomustine)；盐酸洛索蒽醌(LosoxantroneHydrochloride)；马索罗酷(Masoprocol)；美登素(Maytansine)；盐酸氮芥(Mechlorethamine Hydrochloride)；乙酸孕甾醇(Megestrol Acetate)；乙酸美仑孕酮(Melengestrol Acetate)；梅法兰(Melphalan)；美诺立尔(Menogaril)；巯基嘌呤(Mercaptopurine)；甲氨蝶呤(Methotrexate)；甲氨蝶呤钠(Methotrexate Sodium)；氯苯氨啶(Metoprine)；美妥替哌(Meturedepa)；米丁度胺(Mitindomide)；米托卡西(Mitocarcin)；米托罗米(Mitocromin)；米托吉林(Mitogillin)；米托马星(Mitomalcin)；丝裂霉素(Mitomycin)；米托司培(Mitosper)；米托坦(Mitotane)；盐酸米托蒽醌(Mitoxantrone Hydrochloride)；麦考酚酸(Mycophenolic Acid)；诺考达唑(Nocodazole)；诺拉霉素(Nogalamycin)；奥马钼(Ormaplatin)；奥昔舒仑(Oxisuran)；紫杉醇(Paclitaxel)；培门冬酶(Pegaspargase)；培利霉素(Peliomycin)；萘莫司汀(Pentamustine)；硫酸培洛霉素(Peplomycin Sulfate)；培磷酰胺(Perfosfamide)；皮布罗曼(Pipobroman)；哌泊舒凡(Piposulfan)；盐酸吡罗蒽醌(Piroxantrone Hydrochloride)；普卡霉素(Plicamycin)；普洛美坦(Plomestane)；卟吩姆钠(Porfimer Sodium)；泊非霉素(Porfiromycin)；泼尼莫司汀(Prednimustine)；盐酸丙卡巴嗪(ProcarbazineHydrochloride)；嘌呤霉素(Puromycin)；盐酸嘌呤霉素(Puromycin Hydrochloride)；吡唑啉(Pyrazofurin)；利波腺苷(Riboprine)；罗谷亚胺(Rogletimide)；沙芬戈(Safingol)；盐酸沙芬戈(Safingol Hydrochloride)；司莫司汀(Semustine)；辛曲烯(Simtrazene)；磷乙酰天冬氨酸钠(Sparfosate Sodium)；司帕霉素(Sparsomycin)；盐酸错螺胺(Spirogermanium Hydrochloride)；螺莫司汀(Spiromustine)；螺铂(Spiroplatin)；链黑霉素(Streptonigrin)；链佐星(Streptozocin)；磺氯苯脲(Sulofenur)；他利霉素(Talisomycin)；紫杉醇(Taxol)；替可加兰钠(Tecogalan Sodium)；替加氟(Tegafur)；盐酸替洛蒽醌(Teloxantrone Hydrochloride)；替莫泊芬(Temoporfin)；替尼泊苷(Teniposide)；替罗昔隆(Teroxirone)；睾内酯(Testolactone)；硫咪嘌呤(Thiamiprine)；硫鸟嘌呤(thioguanine)；噻替哌(Thiotepa)；噻唑林(Tiazofuirin)；替拉扎明(Tirapazamine)；盐酸托泊替康(Topotecan Hydrochloride)；柠檬酸托瑞米芬(Toremifene Citrate)；醋酸曲托龙(Trestolone Acetate)；磷酸曲西立滨(TriciribinePhosphate)；三甲曲沙(Trimetrexate)；三甲曲沙葡萄糖醛酸(TrimetrexateGlucuronate)；曲普瑞林(Triptorelin)；盐酸妥布氯唑(Tubulozole Hydrochloride)；乌拉莫司汀(Uracil Mustard)；乌瑞替派(Uredepa)；伐普肽(Vapreotide)；维替泊芬(Verteporfin)；硫酸长春碱(Vinblastine Sulfate)；硫酸长春新碱(VincristineSulfate)；长春地辛(Vindesine)；硫酸长春地辛(Vindesine Sulfate)；硫酸长春吡啶(Vinepidine Sulfate)；硫酸长春甘酯(Vinglycinate Sulfate)；硫酸长春罗辛(Vinleurosine Sulfate)；酒石酸长春瑞滨(Vinorelbine Tartrate)；硫酸长春罗啶(Vinrosidine Sulfate)；硫酸长春利定(Vinzolidine Sulfate)；伏氯唑(Vorozole)；折尼泊(Zeniplatin)；净司他(Zinostatin)；盐酸佐柔比星(Zorubicin Hydrochloride)。其他的抗肿瘤剂包括在第52章，抗肿瘤剂(保罗·卡拉布瑞西及布鲁斯A.沙布纳)中所公开的药剂，以及在古德曼斯及吉尔曼“治疗学的药理基础”，第1202至1263页，第八版，1990，麦格劳-希尔公司.(健康专业部门)的介绍。
根据具体实施例，所述抗癌剂包括一抗体。
根据具体实施例，所述抗体是选自由利妥昔单抗(rituximab)、西妥昔单抗(cetuximab)、曲妥珠单抗(trastuzumab)、埃德考洛单抗(edrecolomab)、阿仑单抗(alemtuzumab)、吉妥珠单抗(gemtuzumab)、依法妥单抗(ibritumomab)、帕尼单抗(panitumumab)、贝利单抗(Belimumab)、贝伐单抗(Bevacizumab)、比伐单抗(Bivatuzumab)、美登单抗(mertansine)、布尔妥单抗(Blinatumomab)、布隆图维单抗(Blontuvetmab)、布伦妥昔单抗(Brentuximab vedotin)、卡妥昔单抗单抗(Catumaxomab)、西妥单抗(Cixutumumab)、达克珠单抗(Daclizumab)、阿达木单抗(Adalimumab)、贝索洛单抗(Bezlotoxumab)、赛妥珠单抗(Certolizumab pegol)、西他珠单抗(Citatuzumabbogatox)、达拉他珠单抗(Daratumumab)、地昔单抗(Dinutuximab)、依洛珠单抗(Elotuzumab)、曲妥单抗(Ertumaxomab)、依他西单抗(Etaracizumab)、吉妥单抗(Gemtuzumab ozogamicin)、吉瑞妥昔单抗(Girentuximab)、尼珠单抗(Necitumumab)、奥比努珠单抗(Obinutuzumab)、奥法木单抗(Ofatumumab)、帕妥珠单抗(Pertuzumab)、雷米单抗(Ramucirumab)、塞妥昔单抗(Siltuximab)、托西莫单抗(Tositumomab)、曲妥珠单抗(Trastuzumab)、尼武单抗(Nivolumab)、派姆单抗(Pembrolizumab)、杜鲁伐单抗(Durvalumab)、阿妥昔单抗(Atezolizumab)、阿维单抗(Avelumab)、及伊匹单抗(ipilimumab)所组成的群组。
根据具体实施例，所述抗体是选自由利妥昔单抗及西妥昔单抗所组成的群组。
根据具体实施例，所述治疗剂或所述抗癌剂包括IMiD(例如，沙利度胺、来那度胺、泊马度胺)。
根据具体实施例，所述IMiD是选自由沙利度胺、来那度胺及泊马度胺所组成的群组。
根据具体实施例，与本发明的一些实施例的组合物组合施用的治疗剂包括抗感染剂(例如，抗生素及抗病毒剂)。
根据具体实施例，与本发明的一些实施例的组合物组合施用的治疗剂包括一免疫抑制剂(例如，GCSF及其他的骨髓刺激剂、类固醇)。
根据具体实施例，组合疗法具有一加乘作用。
根据具体实施例，组合疗法具有一协同作用。
根据本发明的另一方面，提供一种制品，包括一包装材料，所述包装材料是包装用于通过得益于激活免疫细胞而治疗一疾病的一治疗剂；以及所述SIRPα-4-1BBL融合蛋白、包括所述SIRPα氨基酸序列的经分离的多肽及/或包括所述4-1BBL氨基酸序列的经分离的多肽、编码相同的多肽的多核苷酸、编码相同的多肽的核酸构建体或表达相同的多肽的宿主细胞。
根据具体实施例，鉴定相同制品以通过得益于激活免疫细胞而治疗一疾病。
根据具体实施例，用于治疗所述疾病的治疗剂；及SIRPα-4-1BBL融合蛋白、包括SIRPα氨基酸序列的经分离的多肽及/或包括4-1BBL氨基酸序列的经分离的多肽、编码相同的多肽的多核苷酸、编码相同的多肽的核酸构建体或表达相同的多肽的宿主细胞是分别包装在单独的容器中。
根据具体实施例，用于治疗所述疾病的治疗剂；及SIRPα-4-1BBL融合蛋白、包括SIRPα氨基酸序列的分离的多肽及/或包括4-1BBL氨基酸序列的分离的多肽、编码相同的多肽的多核苷酸、编码相同的多肽的核酸构建体或表达相同的多肽的宿主细胞是包装在共同的制剂中。
根据具体实施例，所述制品包括SIRPα-4-1BBL融合蛋白、编码相同的融合蛋白的多核苷酸、编码相同的融合蛋白的核酸构建体或表达相同的融合蛋白的宿主细胞。
根据具体实施例，所述制品包括包含SIRPα氨基酸序列的经分离的多肽、编码相同的多肽的多核苷酸、编码相同的多肽的核酸构建体或表达相同的多肽的宿主细胞。
根据具体实施例，所述制品包括包含4-1BBL氨基酸序列的经分离的多肽、编码相同的多肽的多核苷酸、编码相同的多肽的核酸构建体或表达相同的多肽的宿主细胞。
根据具体实施例，所述制品包括SIRPα氨基酸序列、编码相同的SIRPα氨基酸序列的多核苷酸、编码相同的SIRPα氨基酸序列的核酸构建体或表达相同的SIRPα氨基酸序列的宿主细胞；以及4-1BBL氨基酸序列、编码相同的4-1BBL氨基酸序列的多核苷酸、编码相同的4-1BBL氨基酸序列的核酸构建体或表达相同的4-1BBL氨基酸序列的宿主细胞。
因此，根据本发明的另一方面，提供一种制品，包括包装所述经分离的多肽的一包装材料，所述经分离的多肽包括本文中所公开的SIRPα氨基酸序列、编码相同的SIRPα氨基酸序列的多核苷酸、编码相同的SIRPα氨基酸序列的核酸构建体或表达相同的SIRPα氨基酸序列的宿主细胞；以及所述经分离的多肽包括本文中所公开的4-1BBL氨基酸序列、编码相同的4-1BBL氨基酸序列的多核苷酸、编码相同的4-1BBL氨基酸序列的核酸构建体或表达相同的4-1BBL氨基酸序列的宿主细胞。
根据具体实施例，所述经分离的多肽包括本文中所公开的SIRPα氨基酸序列、编码相同的SIRPα氨基酸序列的多核苷酸、编码相同的SIRPα氨基酸序列的核酸构建体或表达相同的SIRPα氨基酸序列的宿主细胞；；以及所述经分离的多肽包括本文中所公开的4-1BBL氨基酸序列、编码相同的4-1BBL氨基酸序列的多核苷酸、编码相同的4-1BBL氨基酸序列的核酸构建体或表达相同的4-1BBL氨基酸序列的宿主细胞是包装在单独的容器中。
根据具体实施例，所述经分离的多肽包括本文中所公开的SIRPα氨基酸序列、编码相同的SIRPα氨基酸序列的多核苷酸、编码相同的SIRPα氨基酸序列的核酸构建体或表达相同的SIRPα氨基酸序列的宿主细胞；；以及所述经分离的多肽包括本文中所公开的4-1BBL氨基酸序列、编码相同的4-1BBL氨基酸序列的多核苷酸、编码相同的4-1BBL氨基酸序列的核酸构建体或表达相同的4-1BBL氨基酸序列的宿主细胞是包装在共同的制剂中。
根据具体实施例，包括SIRPα氨基酸序列的经分离的多肽；及/或包括4-1BBL氨基酸序列的经分离的多肽是连接至一异源的治疗部分或包括一异源的治疗部分。所述治疗部分可为任何的分子，包括小分子化合物及多肽。
可与本发明的具体实施例一起使用的治疗部分的非限制性实例包括细胞毒性部分、毒性部分、细胞激素部分、免疫调节部分、多肽、抗体、药物、化学及/或放射性同位素。
根据本发明的一些实施例，通过将编码本发明的一些实施例的多肽的多核苷酸与编码治疗部分的核酸序列转译地融合以偶合为治疗部分。
额外地或可替代地，可使用本领域技术人员已知的任何偶合方法将治疗部分化学地偶合(偶联)至本发明的一些实施例的多肽。例如，可使用3-(2-吡啶基二硫代)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(亦称为N-琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯)(“SDPD”)将肽与感兴趣的试剂进行偶合。Sigma，目录编号：P-3415；参见例如，坎伯等人，1985，Methods ofEnzymology 112：207-224)、戊二醛偶合过程[参见例如，G.T.赫曼森，1996，抗体修饰及偶合，生物偶合物技术，Academic Press，圣地亚哥)或碳二亚胺结合程序[参见例如，J.马取，Advanced Organic Chemistry：反应的机理及结构，pp.349-50及372-74(第3版)，1985；B.内斯等人，1978，AngewChem.，Int。Ed.Engl.17：522；A.哈斯纳等人，1978，TetrahedronLett.4475；E.P.博登等人，1986，J.Org.Chem.50：2394和L.J.马蒂亚斯，1979，Synthesis561]。
使用本领域广泛实施的标准化学合成技术可将治疗部分连结至例如本发明的一些实施例的多肽[参见例如，http：//worldwideweb.chemistry.org/portal/Chemistry)]，例如通过一肽键(当功能部分为一多肽时)或通过共价键结至诸如一连接肽的中间连接组件或诸如一有机聚合物的其他化学部分的直接或间接使用任何合适的化学连接。嵌合肽可通过在肽的羧基(C)端或氨基(N)端的键结或通过键结至内部的化学基团，例如直链、支链或环状侧链、内部碳原子或内部氮原子等而进行连接。
如本文中所使用，术语“蛋白质”、“肽”及“多肽”在本文可互换使用，包括天然肽(降解产物、合成地经合成的肽或重组肽)及拟肽(通常合成地经合成的肽)，以及类似肽的类肽及半类肽，其可具有例如修饰，从而使肽在体内时更稳定，或者更能够穿透细胞。此种修饰包括，但不限于N端修饰、C端修饰、肽键修饰、骨架修饰及残基修饰。制备拟肽化合物的方法是本领域众所周知的，且例如在Quantitative Drug Design，C.A.拉姆斯登Gd.，第17.2章，F.卓别林佩加蒙出版社(1992)中有具体说明，其通过引用并入本文中，如同在本文中完整阐述。下文提供此方面的进一步细节。
肽内的肽键(-CO-NH-)可被下述所取代，例如N-甲基化的酰胺键(-N(CH3)-CO-)、酯键(-C(＝O)-O-)、酮亚甲基键(-CO-CH2-)、亚磺酰基亚甲基键(-S(＝O)-CH2-)、α-氮杂键(-NH-N(R)-CO-)，其中R为任何的烷基(例如甲基)、胺键(-CH2-NH-)、硫键(-CH2-S-)、乙烯键(-CH2-CH2-)、羟基乙烯键(-CH(OH)-CH2-)、硫酰胺键(-CS-NH-)、烯烃双键(-CH＝CH-)、氟化烯烃双键(-CF＝CH-)、反酰胺键(-NH-CO-)、肽衍生物(-N(R)-CH2-CO-)，其中R为“正常的”侧链、天然存在于碳原子上。
此等修饰可发生在肽链上的任何键上，甚至可同时出现在数个(2至3)键上。
天然芳香族氨基酸Trp、Tyr及Phe可被非天然芳香族氨基酸取代，例如1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酸(Tic)、萘丙氨酸、Phe的环甲基化衍生物、Phe或O-甲基-Tyr的卤代衍生物。
本发明的一些实施例的肽亦可包括一种或多种经修饰的氨基酸或一种或多种非氨基酸单体(例如，脂肪酸、复合碳水化合物等)。
术语“氨基酸”应理解为包括20种天然存在的氨基酸。通常在体内转译后修饰的那些氨基酸，包括，例如羟脯氨酸、磷酸丝氨酸及磷酸苏氨酸；以及其他不常见的氨基酸，包括，但不限于2-氨基己二酸、羟赖氨酸、异十二烷、正缬氨酸、正亮氨酸及鸟氨酸。此外，术语“氨基酸”包括D-氨基酸及L-氨基酸。
下表1及表2列出可与本发明的一些实施例一起使用的天然存在的氨基酸(表1)及非常规的或经修饰的氨基酸(例如，合成的，表2)。
表1
Figure BDA0002939073350000901
Figure BDA0002939073350000911
表2
Figure BDA0002939073350000912
Figure BDA0002939073350000921
Figure BDA0002939073350000931
本发明的一些实施例的肽优选以线性形式使用，尽管应当理解，在环化不严重地干扰肽特性的情况下，亦可利用环的形式的肽。
由于本发明的肽优选用于需要所述肽为可溶形式的治疗剂中，因此本发明的一些实施例的肽优选包括一种或多种非天然或天然极性氨基酸，包括但不限于丝氨酸及苏氨酸，其中由于其所含的羟基侧链，使得其能够增加肽的溶解度。
本发明的肽的氨基酸可保留地取代或非保留地取代。
如本文中所使用，术语“保留的取代”是指用天然或非天然存在的氨基或具有类似立体特性的拟肽以代替在肽的天然序列中所存在的氨基酸。倘若欲取代的天然氨基酸的侧链为极性或疏水性，则保留取代应使用天然存在的氨基酸、非天然存在的氨基酸或具有极性或疏水性的拟肽部分(除了具有与被取代的氨基酸的侧链相同的立体特性之外)。
由于天然存在的氨基酸通常根据其性质进行分组，因此考虑以下的事实，可容易地确定天然存在的氨基酸的保留取代：考虑根据本发明，可考虑使用立体相似的不带电荷的氨基酸来代替带电荷的氨基酸，以作为保留的替代物。
为了通过非天然存在的氨基酸产生保留取代，亦可使用本领域众所周知的氨基酸类似物(合成的氨基酸)。天然存在的氨基酸的拟肽在熟练技术人员已知的文献中有充分记载。
当影响保留取代时，取代的氨基酸在侧链上应具有与原始氨基酸相同或相似的官能团。
提供功能上相似的氨基酸的保留取代的表格在本领域是众所周知的。在鲍伊等人，1990，Science，247：1306 1310中，亦可找到有关其氨基酸变化可能在表型上沉默的指南。此种保留修饰的变体是多态变体、种间同系物及等位基因的补充，且不排除此等变体。典型的保留取代包括但不限于：1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G)；2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、蛋氨酸(M)、缬氨酸(V)；6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；7)丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；8)半胱氨酸(C)、蛋氨酸(M)(参见例如，克赖顿，Proteins(1984))。氨基酸可基于与侧链相关的性质而被取代，例如，具有极性侧链的氨基酸可被取代，例如丝氨酸(S)及苏氨酸(T)；基于侧链电荷的氨基酸，例如精氨酸(R)及组氨酸(H)；具有疏水性侧链的氨基酸，例如缬氨酸(V)及亮氨酸(L)。如所指出的，变化通常是次要的本质，例如不会显着影响蛋白质的折叠或活性的保留氨基酸取代。
本文中所使用的短语“非保留取代”是指由另一种天然或非天然存在的氨基酸替换亲本序列中所存在的氨基酸，所述天然或非天然存在的氨基酸具有不同的电化学及/或立体特性。因此，取代氨基酸的侧链可为显着大于(或小于)被取代的天然氨基酸的侧链及/或相较于取代的氨基酸可具有明显不同的电子特性的官能团。此种\类型的非保留取代的实例包括以苯丙氨酸或环己基甲基甘氨酸取代丙氨酸、以异亮氨酸取代甘氨酸，或以-NH-CH[(CH2)5-COOH]-CO-取代天冬氨酸。落入本发明的范围内的彼等的非保留取代是彼等仍构成具有抗菌特性的肽的非保留取代。
本发明的肽的N端及C端可被官能团保护。合适的官能团描述于Green及武特，“有机合成中的保护基团”，John Wiley and Sons，1991，第5章及第7章，其教导引入本文中作为参考。优选的保护基是例如通过降低化合物的亲水性及增加化合物的亲脂性而协助其上所附着的化合物向细胞内运输的保护基。
根据具体实施例，例如，一或多个氨基酸可通过添加官能团来修饰(概念上被视为“化学修饰”)。例如，天然序列中所出现的侧氨基酸残基可任选地被修饰，尽管如下所述，除了侧氨基酸残基之外或代替侧氨基酸残基，蛋白质的其他部分亦可任选地被修饰。倘若遵循化学的合成方法，例如通过添加化学修饰的氨基酸，则修饰可任选地在分子的合成过程中进行。然而，当氨基酸已经存在于分子中时，亦可对氨基酸进行化学修饰(“原位”修饰)。可藉由核酸外切酶缺失、藉由化学修饰或藉由编码诸如异源结构域或结合蛋白的多核苷酸序列的融合，通过基因合成、定点的突变(例如，PCR基)或随机的突变(例如，EMS)，以引入对肽或蛋白质的修饰。
如本文中所使用，当术语“化学修饰”是指肽时，是指其中其氨基酸残基中的至少一者通过自然的方法而被修饰的肽，例如加工或其他转译后修饰或通过本领域众所周知的化学修饰的技术。修饰的非限制性示例性类型包括羧甲基化、乙酰化、酰化、磷酸化、糖基化、酰胺化、ADP-核糖基化、脂肪酰化、添加法呢基团、异法呢基团、碳水化合物基团、脂肪酸基团、用于偶合的连接子、功能化、GPI锚形成、脂质或脂质衍生物的共价连接、甲基化、肉豆蔻化、聚乙二醇化、戊烯基化、磷酸化、泛素化或任何类似的方法及已知的保护/封闭基团。醚键可任选地用于将丝氨酸或苏氨酸羟基连接至糖的羟基。可任选地使用酰胺键将谷氨酸或天冬氨酸的羧基与糖上的氨基进行连接(加尔格及让洛兹，碳水化合物化学及生物化学进展，第43卷，Academic Press(1985)；昆兹、Ang.Chem.Int(编辑英文26：294-308(1987))。缩醛及缩酮键亦可任选地形成于氨基酸与碳水化合物之间。脂肪酸酰基衍生物可任选地例如通过将游离的氨基(例如赖氨酸)进行酰化而制得(托斯等人，肽：化学、结构及生物学，里维耶及马歇尔编辑，ESCOM出版，莱顿，1078-1079(1990))。
根据具体实施例，所述修饰包括向肽中添加环烷部分，如PCT申请案第WO 2006/050262号中所述，其通过引用并入本文中。此等部分被设计与生物分子一起使用，且可任选地用于赋予蛋白质各种特性。
此外，任选地，可修饰肽上的任何点。例如，可任选地进行蛋白质上糖基化部分的聚乙二醇化，如PCT申请案第WO 2006/050247号中所述，其通过引用并入本文中。可将一或多个聚乙二醇(PEG)基团任选地添加至O-连接的及/或N-连接的糖基化。所述PEG基团可任选是支链的或直链的。任选地，任何类型的水溶性聚合物可通过糖基连接子连接至一蛋白质上的糖基化位点。
“经聚乙二醇化的蛋白质”是指具有生物活性的蛋白质或其片段，其具有与所述蛋白质的氨基酸残基共价结合的聚乙二醇(PEG)部分。
“聚乙二醇”或“PEG”是指聚亚烷基二醇化合物或其衍生物，所述聚亚烷基二醇化合物或其衍生物具有或不具有偶联剂或与具有偶联部分或活化部分(例如，与硫醇、三氟甲磺酸、三苯甲酸酯、氮丙啶、环氧乙烷或优选与马来酰亚胺部分)一起衍生。诸如马来酰亚胺基单甲氧基PEG的化合物是本发明的示例性或活化的PEG化合物。在本发明中可使用其他的聚亚烷基二醇化合物，例如聚丙二醇。其他合适的聚亚烷基二醇化合物包括，但不限于以下类型的带电的或中性的聚合物：右旋糖酐、聚唾液酸或其他碳水化合物基的聚合物、氨基酸的聚合物及生物素衍生物。
根据具体实施例，将肽修饰使其具有一经改变的糖基化模式(即，自原始或天然糖基化模式改变)。如本文中所使用，“经改变的”是指具有一或多个碳水化合物部分的缺失，及/或具有添加至原始蛋白质的至少一糖基化位点。
蛋白质的糖基化通常是N-连接或O-连接。N-连接是指碳水化合物部分连接至天冬酰胺残基的侧链。三肽序列、天冬酰胺-X-丝氨酸及天冬酰胺-X-苏氨酸，其中X是除了脯氨酸外的任何的氨基酸，是将碳水化合物部分的酶促连接至天冬酰胺侧链的识别序列。因此，在多肽中的此等三肽序列中的任一者的存在产生一潜在的糖基化位点。O-连接糖基化是指糖N-乙酰基半乳糖胺、半乳糖或木糖中的一者与羟基氨基酸连接，所述羟基氨基酸最常为丝氨酸或苏氨酸)，尽管亦可使用5-羟基脯氨酸或5-羟基赖氨酸。
通过改变肽的氨基酸序列以使其含有一个或多个上述的三肽序列(针对N-连接的糖基化位点)，可方便地实现将糖基化位点添加至肽。亦可通过在原始肽的序列中(针对O-连接的糖基化位点)添加一或多个丝氨酸或苏氨酸残基或由其取代来进行改变。肽的氨基酸序列亦可通过在DNA水平引入改变以进行改变。
增加肽上碳水化合物部分的数量的另一种方法是通过糖苷与肽的氨基酸残基的化学或酶促偶联。取决于所使用的偶联方式，糖可连接至(a)精氨酸及组氨酸、(b)游离的羧基、(c)游离的巯基，例如半胱氨酸的游离的巯基、(d)游离的羟基，例如丝氨酸、苏氨酸或羟脯氨酸的游离的羟基、(e)芳香残基，例如苯丙氨酸，酪氨酸或色氨酸的芳香残基，或(f)谷氨酰胺的氨基。此等方法例如描述于WO 87/05330中，以及描述于阿普林及威斯顿.CRCCrit.Rev.Biochem.，22：259-306(1981)中。
可通过化学地、酶促地或通过在DNA水平上引入改变来实现存在于肽上的任何碳水化合物部分的移去。化学去糖基化需要使肽暴露于三氟甲磺酸或等效的化合物中。此处理导致除了连接糖(N-乙酰基葡糖胺或N-乙酰基半乳糖胺)之外的大多数或所有的糖的裂解，留下完整地氨基酸序列。
化学的去糖基化是描述于哈基穆丁等人，Arch.Biochem.Biophys.，259：52(1987)；及埃奇等人，Anal.Biochem.，118：131(1981)中。通过索塔仓等人，Meth.Enzymol.，138：350(1987)所描述的可通过使用多种内切糖苷酶及外切糖苷酶对肽上的碳水化合物部分进行酶促切割。
根据具体实施例，所述肽包括一可检测的标签。如本文中所使用，在一实施例中，术语“可检测的标签”是指可由技术人员使用本领域已知的技术进行检测的任何部分。可检测的标签可为肽序列。任选地，可检测的标签可通过化学试剂或通过诸如蛋白水解的酶促手段予以移除。本发明的一些实施例的可检测的标签可用于纯化肽。例如，术语“可检测的标签”包括几丁质结合蛋白(CBP)标签、麦芽糖结合蛋白(MBP)标签、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)标签、多(His)标签、FLAG标签、诸如V5标签、c-myc标签及HA标签的表位标签，以及诸如绿色荧光蛋白(GFP)、红色荧光蛋白(RFP)、黄色荧光蛋白(YFP)、蓝色荧光蛋白(BFP)及青色荧光蛋白(CFP)的荧光标签；以及此等标签的衍生物或本领域已知的任何标签。术语“可检测的标签”亦包括术语“可检测的标记”。
根据具体实施例，所述肽包括附着于其N端的可检测的标签(例如，多(His)标签)。
根据具体实施例，所述肽包括附着于其C端的可检测的标签(例如，多(His)标签)。
根据具体实施例，所述肽的N-端不包括一可检测的标签(例如，多(His)标签)。
根据具体实施例，肽的C-端不包括一可检测的标签(例如，多(His)标签)。
根据具体实施例，所述肽与一可切割的部分融合。因此，例如，为了协助恢复，可对经表达的编码序列进行改造工程，以编码本发明的一些实施例的肽及经融合的可裂解的部分。在一实施例中，设计所述肽以使其易于通过亲和色谱法而分离；例如，通过固定在具体针对可裂解的部分的柱上。在一实施例中，在肽与可切割的部分之间设计一切割位点，且可通过使用一合适的酶或在此位点上特异地切割所述融合蛋白的试剂进行处理，以将肽自色谱的柱上释放出来[例如，参见布斯等人，Immunol Lett.19：65-70(1988)；及加德拉等人，J.Biol.Chem.265：15854-15859(1990)]。根据具体实施例，所述肽是一经分离的肽。
可通过肽合成领域的技术人员已知的任何技术，例如，但不限于固相及重组技术，来合成并纯化本发明的一些实施例的肽。
针对固相肽的合成，许多技术的概述可参见J.M.斯图尔特及J.D.杨，固相肽的合成，W.H.弗里曼公司(旧金山)，1963年，以及J.梅恩霍夫，激素蛋白质及肽，第2卷，第46页，Academic Press(纽约)，1973年。针对标准溶液合成，参见G.施罗德及K.卢普克，《肽》，第1卷，Academic Press(纽约)，1965年。
通常，此等方法包括将一或多个氨基酸或适经当保护的氨基酸依序地添加至生长中的肽链。通常，第一个氨基酸的氨基或羧基被合适的保护基所保护。之后可在适合形成酰胺键的条件下，通过在具有被适当保护的互补(氨基或羧基)基团的序列中添加下一个氨基酸，以将经保护的或经衍生的氨基酸连接到惰性固体载体上将其用于溶液中。之后自所述新添加的氨基酸残基中移除保护基，之后添加下一个氨基酸(适当地保护)，依此类推。在所有所需的氨基酸以正确的顺序进行连接之后，依次或同时移除任何剩余的保护基团(及任何的固体载体)，以得到最终的肽化合物。通过此通用步骤的简单修饰，可一次性地在一增长的链中添加一个以上的氨基酸，例如，通过将经保护的三肽与经适当保护的二肽进行偶合(在不使用外消旋手性中心的条件下)，并于去保护之后，形成五肽等。肽合成的进一步描述公开于美国专利第6,472,505号中。
制备本发明的一些实施例的肽化合物的优选方法涉及固相肽的合成。
大规模的肽合成描述于Andersson Biopolymers 2000；55(3)：227-50中。
根据具体实施例，使用体外表达系统合成肽。此种体外合成的方法是本领域众所周知的，且所述系统的组件是可商购的。
根据具体实施例，所述肽是通过重组DNA技术产生的。一“重组”肽或蛋白质是指通过重组DNA技术所产生的肽或蛋白质；即，自通过编码所需肽或蛋白质的外源DNA构建体所转染的细胞产生的。
因此，根据本发明的另一方面，提供一种经分离的多核苷酸，其包括编码上述任何的融合蛋白的核酸序列。
根据具体实施例，多核苷酸与如SEQ ID NO：55至66或68所示的核酸序列具有至少70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同源性，各种可能性代表本发明的个别的实施例。
根据具体实施例，多核苷酸与如SEQ ID NO：55至66或68所示的核酸序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％的同源性，各种可能性代表本发明的个别的实施例。
根据具体实施例，多核苷酸包括一核酸序列，所述核酸序列是选自由SEQ ID NO：55至66及68所组成的群组，各种可能性代表本发明的个别的实施例。
根据具体实施例，多核苷酸是由一核酸序列所组成，所述核酸序列是选自由SEQID NO：55至66及68所组成的群组，各种可能性代表本发明的个别的实施例。
根据具体实施例，多核苷酸包括一核酸序列，所述核酸序列是选自由SEQ ID NO：55至66及68所组成的群组。
根据具体实施例，多核苷酸是由一核酸序列所组成，所述核酸序列是选自由SEQID NO：55至61及68所组成的群组，各种可能性代表本发明的个别的实施例。
根据具体实施例，多核苷酸包括一核酸序列，所述核酸序列是选自由SEQ ID NO：55、56及58所组成的群组。
根据具体实施例，多核苷酸是由一核酸序列所组成，所述核酸序列是选自由SEQID NO：55、56及58所组成的群组。
根据本发明的另一方面，提供一种经分离的多核苷酸，包括一核酸序列，所述核酸序列编码上述SIRPα氨基酸序列中的任一者，所述SIRPα氨基酸序列的长度为100至119个氨基酸，且与SEQ ID NO：24及/或26具有至少95％的同一性；或上述4-1BBL氨基酸序列中的任何一者，其长度为185至202个氨基酸，且与一氨基酸序列具有至少95％的同一性，所述氨基酸序列是选自由SEQ ID NO：22、23、27及28所组成的群组。
根据具体实施例，多核苷酸与如SEQ ID NO：33或34所示的核酸序列具有至少70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同源性，各种可能性代表本发明的个别的实施例。
根据具体实施例，多核苷酸与如SEQ ID NO：33或34所示的核酸序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％的同源性。
根据具体实施例，多核苷酸包括SEQ ID NO：33或34。
根据具体实施例，多核苷酸是由SEQ ID NO：33或34所组成。
根据具体实施例，多核苷酸与如SEQ ID NO：39、40、41、42、73、75、77或79所示的核酸序列具有至少70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同源性，各种可能性代表本发明的个别的实施例。
根据具体实施例，多核苷酸与如SEQ ID NO：39、40、41或42所示的核酸序列具有至少70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同源性，各种可能性代表本发明的个别的实施例。
根据具体实施例，多核苷酸与如SEQ ID NO：39、40、41、42、73、75、77或79所示的核酸序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％的同源性，各种可能性代表本发明的个别的实施例。
根据具体实施例，多核苷酸与如SEQ ID NO：39、40、41或42所示的核酸序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％的同源性，各种可能性代表本发明的个别的实施例。
根据具体实施例，多核苷酸包括SEQ ID NO：39、40、41、42、73、75、77或79。
根据具体实施例，多核苷酸包括SEQ ID NO：39、40、41或42。
根据具体实施例，多核苷酸是由SEQ ID NO：39、40、41、42、73、75、77或79所组成。
根据具体实施例，多核苷酸是由SEQ ID NO：39、40、41或42所组成。
如本文中所使用，术语“多核苷酸”是指经分离的或以RNA序列、互补多核苷酸序列(cDNA)、基因组多核苷酸序列及/或复合多核苷酸序列的形式所提供的单链核酸序列或双链的核酸序列(例如，上述各项的组合)。
为了在哺乳动物细胞中表达外源多肽，优选地将编码所述多肽的多核苷酸序列连接至适合哺乳动物细胞表达的核酸构建体中。此种核酸构建体包括一启动子序列，所述启动子序列用于以稳定型的方式或诱导型的方式操纵多核苷酸序列在细胞中进行转录。
因此，根据具体实施例，提供一核酸构建体，所述核酸构建体包括多核苷酸，以及用于操纵在宿主细胞中的所述多核苷酸的表达的调控组件。
根据具体实施例，所述调控组件是一异源的调控组件。
本发明的一些实施例的核酸构建体(本文中亦称为“表达载体”)包括使此载体适于在原核生物、真核生物或优选地二者中进行复制及整合的额外的序列(例如，穿梭载体)。此外，典型的克隆载体亦可包括一转录起始序列及一转译起始序列、转录终止子及转译终止子，以及多腺苷酸化信号。举例而言，此种构建体通常包括一5’LTR、一tRNA结合位点、一包装信号、一第二股DNA合成的起点，以及一3’LTR或其一部分。
本发明的一些实施例的核酸构建体通常包括一信号序列，所述信号序列用于自其所处的宿主细胞分泌肽。优选地，用于此目的的所述信号序列是哺乳动物信号序列或本发明的一些实施例的多肽变体的信号序列。
真核的启动子通常包括两种类型的识别序列、TATA盒及上游的启动子组件。位于转录起始位点的上游25至30个碱基对的TATA盒，被认为与操纵RNA聚合酶以起始RNA的合成有关。其他的上游的启动子组件决定转录起始的速率。
优选地，本发明的一些实施例的核酸构建体所使用的启动子在转殖特定细胞群中是具有活性的。细胞类型特异性及/或组织特异性启动子的实例包括诸如肝脏特异性的白蛋白的启动子[平克特等人，(1987)Genes Dev.1：268-277]、淋巴样特异性启动子[卡拉美等人，(1988)Adv.Immunol.43：235-275]；尤其是T细胞受体的启动子[维诺托等人，(1989)EMBO J.8：729-733]及免疫球蛋白；[巴内吉等人，(1983)Cell 33729-740]、神经元特异性启动子，例如神经丝启动子[拜恩等人，(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：5473-5477]、胰腺特异性启动子[埃德朗奇等人，Science 230：912-916]或乳腺特异性启动子，例如乳清启动子(美国专利第4,873,316号及欧洲专利申请公开第264,166号)。
增强子组件可自经连接的同源或异源启动子刺激多达1000倍的转录。当增强子置于转录起始位点下游或上游时，增强子是有活性的。许多衍生自病毒的增强子具有广泛的宿主范围，且在多种组织中具有活性。例如，SV40早期基因增强子是适用于许多的细胞类型。适用于本发明的一些实施例的其他增强子/启动子组合包括衍生自多瘤病毒、人类或鼠巨细胞病毒(CMV)，来自诸如鼠白血病病毒、鼠或劳斯肉瘤病毒及HIV的各种逆转录病毒的长期重复的增强子/启动子组合。参见，增强子及真核表达，冷泉港出版社，冷泉港，纽约，1983，其通过引用并入本文中。
在表达载体的构建中，优选将启动子定位于使其距离异源转录起始位点的距离与其在天然环境中距离转录起始位点的距离大致相同。然而，如本领域中已知的，在不损失启动子功能的情况下，可通融所述距离的一些变化。
亦可将多腺苷酸化序列添加至表达载体中，以提高SIRPα-4-1BBL、SIRPα或4-1BBLmRNA的转译效率。准确有效地进行多腺苷酸化需要两个不同的序列元素：位于多腺苷酸化位点下游的富含GU或U的序列，以及位于上游11至30个核苷酸的高度保留的6个核苷酸的序列AAUAAA。适用于本发明的一些实施例的终止信号及多腺苷酸化信号包括衍生自SV40的彼等。
除了已经描述的组件之外，本发明的一些实施例的表达载体通常可包括旨在增加经克隆的核酸的表达水平或协助鉴定携带重组DNA的细胞的其他特定的组件。例如，许多动物病毒包括DNA序列，所述DNA序列会在允许的容许病毒感染的细胞类型中促进病毒基因组的额外的染色体复制。只要通过携带于质粒上的基因或宿主细胞的基因组而提供适当的因子，即可复制带有此等病毒复制子的质粒。
载体可包括或可不包括真核复制子。倘若存在真核复制子，则可使用合适的选择标记，以在真核细胞中扩增载体。倘若载体不包括真核复制子，则无法进行游离的扩增。相反的，重组DNA整合至经工程化细胞的基因组中，其中启动子操纵所需核酸的表达。
本发明的一些实施例的表达载体可进一步包括额外的多核苷酸序列以及使用于启动子-嵌合的多肽的基因组整合的序列，例如，所述多核苷酸序列允许自诸如内部核糖体进入位点(IRES)的单一mRNA转译数种蛋白质。
应当理解，表达载体中所包括的各个组件可以多种构型进行排列。例如，可将增强子组件、启动子等，以及甚至编码SIRPα-4-1BBL的多核苷酸序列、包括SIRPα氨基酸序列的多肽或包括4-1BBL氨基酸序列的多肽可“头至尾”配置进行排列，其可以反向互补或以互补配置的形式存在。尽管表达载体的非编码组件更可能发生此种配置的变化，但亦可设想在表达载体内的编码序列的替代配置。
哺乳动物表达载体的实例包括，但不限于可自Invitrogene购得的pcDNA3、pcDNA3.1(+/-)、pGL3、pZeoSV2(+/-)、pSecTag2、pDisplay/pEF/myc/cyto、pCMV/myc/cyto、pCR3.1、pSinRep5、DH26S、DHBB、pNMT1、pNMT41、pNMT81、可自Promega购得的pCI、可自Strategene购得的pMbac、pPbac、pBK-RSV及pBK-CMV、可自Clontech购得的pTRES，以及其衍生物。
亦可使用含有来自诸如逆转录病毒的真核病毒的调控组件的表达载体。SV40载体包括pSVT7及pMT2。源自牛乳头瘤病毒的载体包括pBV-1MTHA，以及源自爱泼斯坦-巴尔病毒的载体包括pHEBO及p2O5。其他示例性载体包括pMSG、pAV009/A+、pMTO10/A+、pMAMneo-5、杆状病毒pDSVE，以及任何其他允许在SV-40早期启动子、SV-40后期启动子、金属硫蛋白启动子、鼠乳腺肿瘤病毒启动子、劳斯肉瘤病毒启动子、多角体蛋白启动子或其他在真核细胞中表达有效的启动子的操纵下表达蛋白质的载体。
如上所述，病毒是非常专门的感染因子，在许多情况下，其已经进化为逃避宿主防御机制。通常，病毒感染且在特定的细胞类型中进行传播。病毒载体的靶向特异性利用其天然的特异性特异地靶向预定的细胞类型，从而将重组基因引入经感染的细胞。因此，本发明的一些实施例所使用的载体的类型将取决于经转殖的细胞类型。根据经转殖的细胞类型选择合适的载体的能力完全在本领域普通技术人员的能力之内，因此在本文中不提供选择考虑的一般描述。例如，如梁CY等人，2004(Arch Virol.149：51-60)所述，可使用人类T细胞白血病病毒第I型(HTLV-I)靶向骨髓细胞，且可使用杆状病毒的苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcMNPV)中所存在的异源启动子靶向肾细胞。
由于重组病毒载体具有诸如横向感染及靶向特异性的优势，因此重组病毒载体可用于体内表达SIRPα-4-1BBL、SIRPα或4-1BBL。横向感染是例如逆转录病毒的生命周期中所固有的，且是单一感染细胞产生许多子代病毒体的过程，所述子代病毒体会萌芽并感染邻近的细胞。结果为大面积区域迅速被感染，其中大部分最初并未被原始的病毒颗粒感染。此与垂直型感染相反，在垂直型感染中，感染原仅通过子代进行传播。亦可产生未能横向扩散的病毒载体。倘若所需的目的为将一特定基因仅导入局部数量的靶细胞中，则此特性可能是很有用的。
可使用多种方法以将本发明的一些实施例的表达载体引入细胞中。此种方法在以下的文献中进行一般性的描述：桑布鲁克等人，分子克隆：实验室手册，纽约冷泉港实验室，纽约(1989、1992)、奥苏贝尔等人，分子生物学的当前方法，约翰威利及宋斯，巴尔的摩市，马里兰州(1989)、张等人，体细胞基因疗法，CRC出版社，安阿伯市，密歇根州(1995)、维加等人，基因靶向，CRC出版社，安阿伯市，密歇根州(1995)、载体：分子克隆载体及其用途的调查、巴特沃思、波士顿弥撒(1988)，以及吉尔伯等人[Biotechniques 4(6)：504-512，1986]，且包括例如稳定或暂时转染、脂质转染、电穿孔及重组病毒载体感染。另外，针对正负选择的方法，参见美国专利第5,464,764号及第5,487,992号。
相较于诸如脂质转染及电穿孔的其他方法，通过病毒感染而引入核酸更具优势，因为由于病毒的感染特性，可获得更高的转染效率。
当前优选的体内核酸转移技术包括使用病毒或非病毒构建体，例如腺病毒、慢病毒、单纯疱疹第I型病毒或腺伴随病毒(AAV)以及脂质基的系统的转染。用于脂质介导的基因转移的有用脂质为例如：DOTMA、DOPE及DC-Chol[汤金森等人，Cancer Investigation，14(1)：54-65(1996)]。用于基因治疗的最优选的构建体是病毒，最优选的是腺病毒、AAV、慢病毒或逆转录病毒。诸如逆转录病毒构建体的病毒构建体包括至少一转录启动子/增强子或基因座定义组件，或通过其他方式控制基因表达的其他组件，例如交互的剪接、核RNA输出或信号的转译后修饰等。此种载体构建体亦包括一包装信号、长末端重复序列(LTR)或其部分，以及适用于所使用病毒的正引物及负引物的结合位点，除非其已经存在于病毒构建体中。此外，此种构建体通常包括自其所处的宿主细胞用于分泌肽的信号序列。优选地，用于此目的的信号序列是哺乳动物信号序列或本发明的一些实施例的多肽变体的信号序列。任选地，所述构建体还可包括操纵多腺苷酸化的信号，以及一或多个限制位点及一转译终止序列。举例而言，此种构建体通常包括5’LTR、tRNA结合位点、包装信号、第二股DNA合成的起点，以及3’LTR或其一部分。可使用非病毒的其他载体，例如阳离子脂质、聚赖氨酸及树枝状聚合物。
如所提及的，除了包括用于插入的编码序列的转录及转译所必需的组件之外，本发明的一些实施例的表达构建体亦可包括经工程改造的序列，以增强经表达的肽的稳定性、生产、纯化、产率或毒性。例如，可工程改造包括SIRPα-4-1BBL蛋白或本发明的一些实施例的多肽以及异源蛋白的融合蛋白或可裂解的融合蛋白的表达。可设计此种融合蛋白，使得可通过亲和色谱法而容易地分离出融合蛋白。例如，通过固定在针对异源蛋白质具有特异性的柱上。当在本发明的一些实施例的SIRPα-4-1BBL蛋白或多肽与异源蛋白之间设计一切割的位点时，SIRPα-4-1BBL蛋白或多肽可通过使用破坏所述切割的位点的合适的酶或试剂[例如，参见布斯等人，(1988)Immunol.Lett.19：65-70；以及加德拉等人，(1990)J.Biol.Chem.265：15854-15859]。
本发明亦考虑包括本文中所述的组合物的细胞。
因此，根据具体实施例，提供一宿主细胞，所述宿主细胞包括本文中所公开的SIRPα-4-1BBL融合蛋白、包括SIRPα氨基酸序列的多肽及/或包括4-1BBL氨基酸序列的多肽、相同的多肽的多核苷酸编码或编码相同的多肽的核酸构建体。
如上所述，多种原核细胞或真核细胞可使用作为宿主表达系统以表达本发明的一些实施例的多肽。此等包括，但不限于微生物，例如具有包括编码序列的重组噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA表达载体的经转染的细菌；使用含有编码序列的重组酵母菌表达载体的经转染的酵母菌；被重组病毒表达载体(例如花椰菜花叶病毒，CaMV；烟草花叶病毒，TMV)感染的植物细胞株统，或使用含有编码序列的重组质粒表达载体的转染，例如Ti质粒。哺乳动物表达系统亦可用于表达本发明的一些实施例的多肽。
细菌构建体的例子包括pET系列的大肠杆菌表达载体(史达迪尔等人，(1990)Methods in Enzymol.185：60-89)。
可与本发明的教导一起使用的真核细胞的实例包括但不限于，哺乳动物细胞、真菌细胞、酵母菌细胞、昆虫细胞、藻类细胞或植物细胞。
在酵母菌中，可使用许多包含稳定型启动子或诱导型启动子的载体，如美国专利申请第5,932,447号中所述。或者，可使用促进外源DNA序列整合至酵母菌染色体的载体。
在使用植物表达载体的情况下，编码序列的表达可通过许多的启动子予以驱动。例如，可使用病毒启动子，例如CaMV的35S RNA启动子及19S RNA启动子[布里森等人，J.Biol.Chem.Soc.(1984)Nature 310：511-514]，或TMV的外壳蛋白启动子[高松等人，J.Biol.Chem.(1984)EMBO J.6：307-311]。可替代地，可使用诸如RUBISCO的小亚基[科鲁奇等人，(1984)EMBO J.3：1671-1680及布罗利等人，(1984)Science 224：838-843]的植物启动子或热休克启动子，例如大豆hsp17.5-E或hsp17.3-B[古利等人，(1986)Mol.Cell.Biol.6：559-565]。可使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转染、显微注射、电穿孔及本领域技术人员熟知的其他技术而将此等构建体引入植物细胞内。参见，例如，魏斯巴赫及魏斯巴赫，1988，植物分子生物学的方法，Academic Press，NY，VIII，pp421-463。
本领域熟知的其他表达系统，例如昆虫及哺乳动物宿主细胞株统，亦可用于本发明的一些实施例。
根据具体实施例，所述细胞是一哺乳动物细胞。
根据具体实施例，所述细胞是一人类细胞。
根据一具体实施例，所述细胞是一细胞株。
根据另一具体实施例，所述细胞是一原代细胞。
所述细胞可衍生自合适的组织，包括但不限于血液、肌肉、神经、脑、心脏、肺、肝、胰、脾、胸腺、食道、胃、肠、肾、睾丸、卵巢、头发、皮肤、骨骼、乳房、子宫、膀胱、脊髓或各种体液。所述细胞可衍生自任何发育阶段，包括胚胎、胎儿及成年阶段，以及发育起源，即，外胚层、中胚层及内胚层起源。
哺乳动物细胞的非限制性实例包括通过SV40(COS，例如COS-7，ATCC CRL 1651)转染的猴子肾CV1株；人类胚胎肾细胞株(亚克隆HEK293或HEK293细胞以在悬浮培养中生长、格雷厄姆等人，J.Gen Virol.，36：59 1977)；婴儿仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL 10)；小鼠史托力细胞(TM4，马瑟，Biol.Reprod.，23：243-251 1980)；猴子肾细胞(CV1 ATCC CCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人类子宫颈癌细胞(HeLa，ATCC CCL 2)；NIH3T3，Jurkat，犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL 34)；水牛大鼠肝细胞(BRL 3A，ATCC CRL1442)；人类肺细胞(W138，ATCC CCL 75)；人类肝细胞(Hep G2，HB 8065)；小鼠乳腺肿瘤(MMT060562，ATCC CCL51)；TRI细胞(马瑟等人，Annals N.Y.Acad.Sci.，383：44-68 1982)；MRC 5个细胞；FS4细胞；以及人类肝癌细胞株(Hep G2)、PER.C6、K562以及中国仓鼠卵巢细胞(CHO)。
根据本发明的一些实施例，哺乳动物细胞是选自由中国仓鼠卵巢(CHO)、HEK293、PER.C6、HT1080、NS0、Sp2/0、BHK、Namalwa、COS、HeLa以及Vero细胞所组成的群组。
根据本发明的一些实施例，所述宿主细胞包括中国仓鼠卵巢(CHO)、PER.C6以及293(例如，Expi293F)细胞。
根据本发明的另一方面，提供一种产生SIRPα-4-1BBL融合蛋白、包括SIRPα氨基酸序列的多肽或包括4-1BBL氨基酸序列的多肽的方法，所述方法包括在一宿主细胞内表达如本文中所述的多核苷酸或核酸构建体。
根据具体实施例，所述方法包括经分离的融合蛋白或多肽。
根据具体实施例，在适当的培养时间之后，回收重组多肽。短语“回收重组多肽”是指收集含有所述多肽的整个发酵培养基，且无需分离或纯化的额外的步骤。尽管如此，本发明的一些实施例的多肽可使用多种标准的蛋白质纯化技术以进行纯化。例如，但不限于，亲和色谱、离子交换色谱、过滤、电泳、疏水性相互作用色谱、凝胶过滤色谱、反相色谱、伴刀豆球蛋白A色谱、混合模式色谱、金属亲和色谱、凝集素亲和色谱以及不同的溶解度。
根据具体实施例，在合成与纯化之后，可在体内或体外分析所述肽的治疗功效。此种方法是本领域已知的，且包括例如细胞生存力、转基因小鼠的存活，以及激活标记的表达。
本发明的一些实施例的组合物(例如，SIRPα-4-1BBL融合蛋白、包括SIRPα氨基酸序列的多肽、包括4-1BBL氨基酸序列的多肽、编码相同的多肽的多核苷酸、编码相同的多肽的核酸构建体及/或细胞)可本身或以与合适的载体或赋形剂一起混合的药物组合物施用至一生物体。
因此，在一些实施例中，本发明的特征在于一药物组合物，所述药物组合物包括治疗有效量的本文中所公开的组合物。
如本文中所使用，“医药组合物”是指本文中所述的一或多种活性成分与其他的诸如生理上合适的载体及赋形剂的化学成分的制剂。医药组合物的目的是协助将一化合物施予至一生物体。
本文中的术语“活性成分”是指负责生物效应的组合物(例如，本文中所述的SIRPα-4-1BBL融合蛋白、包括SIRPα氨基酸序列的多肽、包括4-1BBL氨基酸序列的多肽、多核苷酸、核酸构建体及/或细胞)。
本文中的术语“赋形剂”是指添加至药物组合物中以进一步协助一活性成分给药的惰性物质。赋形剂的实例包括，但不限于，碳酸钙、磷酸钙、各种糖及各种类型的淀粉、纤维素衍生物、明胶、植物油及聚乙二醇。
在下文中，可互换使用的短语“生理上可接受的载体”以及“药学上可接受的载体”是指不会对生物造成明显刺激且不会消除所施用化合物的生物学活性及特性的载体或稀释剂。此等短语中包括佐剂。
如本文中所使用，“药学上可接受的载体”包括生理上兼容的任何以及所有的溶剂、分散介质、包衣、抗细菌及抗真菌剂、等渗及吸收延迟剂等。优选地，所述载体适合于静脉内、肌肉内、皮下、肠胃外、脊髓或表皮给药(例如，通过注射或输注)。根据给药途径，本文中所述的活性化合物，即，多肽、多核苷酸、核酸构建体及/或细胞可包括一或多种药学上可接受的盐。“药学上可接受的盐”是指一盐类，所述盐类保留母体化合物所需的生物学活性且不赋予任何不期望的毒理作用(参见例如，贝格，S.M.等人，(1977)J.Pharm.Sci.66：1-19)。此种盐的实例包括酸加成盐以及碱加成盐。酸加成盐包括衍生自无毒无机酸的酸加成盐，例如，盐酸、硝酸、磷酸、硫酸、氢溴酸、氢碘酸、亚磷酸等，以及衍生自无毒有机酸的酸加成盐，例如，脂肪族单-及二羧酸、经苯基取代的链烷酸、羟基链烷酸，芳香酸、脂肪族及芳香族磺酸等。碱加成盐包括衍生自碱土金属的碱加成盐，例如，钠、钾、镁、钙等)，以及衍生自无毒有机胺的碱加成盐，如N,N’-二苄基乙二胺、N-甲基葡糖胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、普鲁卡因等。
根据本发明的至少一些实施方式的药物组合物亦可包括一药学上可接受的抗氧化剂。药学上可接受的抗氧化剂的实例包括：(1)水溶性抗氧化剂，例如抗坏血酸、盐酸半胱氨酸、硫酸氢钠、偏亚硫酸氢钠、亚硫酸钠等；(2)油溶性抗氧化剂，例如棕榈酸抗坏血酸酯、丁基羟基茴香醚(BHA)、丁基羟基甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚等；以及(3)金属螯合剂，例如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨糖醇、酒石酸、磷酸等。根据本发明的至少一些实施例的药物组合物亦可包括添加剂，例如洗涤剂及增溶剂(例如，TWEEN 20(聚山梨酯-20)、TWEEN80(聚山梨酯-80))以及防腐剂(例如，硫柳汞、苄基酒精)以及填充物质(例如，乳糖、甘露醇)。
可用于根据本发明的至少一些实施例的药物组合物中的合适的水性及非水性载体的实例包括水、具有各种缓冲剂含量的缓冲盐水(例如，Tris-HCl、乙酸盐、磷酸盐)、pH及离子强度、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)，及其合适的混合物、诸如橄榄油的植物油，以及诸如油酸乙酯的可注射的有机酯。
例如，通过使用诸如卵磷脂的包衣材料，在分散液的情况下，通过保持所需的粒径，以及通过使用表面活性剂，可保持适当的流动性。
此等组合物亦可包括佐剂，例如防腐剂、湿润剂、乳化剂及分散剂。可通过灭菌程序，同上，以及通过包括各种抗菌剂及抗真菌剂，例如，对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚山梨酸等，以确保防止微生物的存在。亦可能需要在组合物中包括诸如糖、氯化钠等的等渗剂。此外，可通过包括延迟吸收的诸如单硬脂酸铝及明胶的试剂来延长可注射药物形式的吸收。
药学上可接受的载体包括无菌水溶液或分散液及用于临时制备无菌注射溶液或分散液的无菌粉末。此种介质及试剂用于药物活性物质的用途是本领域已知的。除非任何常规的介质或试剂与活性化合物不相容，否则考虑将其用于根据本发明的至少一些实施例的药物组合物中。亦可将补充的活性化合物掺入所述组合物中。
在制造及储存的条件下，治疗组合物通常必须是无菌且稳定的。可将组合物配制为溶液、微乳剂、脂质体或其他适合高药物浓度的有序结构。载体可为溶剂或分散介质，包括例如，水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇及液体聚乙二醇等)，以及其合适的混合物。可例如通过使用诸如卵磷脂的包衣，在分散液的情况下通过维持所需的粒径以及通过使用表面活性剂，以维持适当的流动性。在许多情况下，优选在组合物中包括诸如糖的等渗剂、诸如甘露醇、山梨糖醇或氯化钠的多元醇。通过在组合物中包括延迟吸收的试剂，例如单硬脂酸盐及明胶，则可实现可注射组合物的延长吸收。可通过将所需量的活性化合物与所需的一种或上述成分的组合掺入适当的溶剂中，之后进行灭菌微过滤，以制备无菌注射溶液。通常，通过将活性化合物掺入无菌载体中来制备分散体，所述无菌载体包括一基本的分散介质及所需的其他上文所列举的成分。针对用于制备无菌注射溶液的无菌粉末，优选的制备方法是真空干燥及冷冻干燥(冻干)，其自其先前无菌过滤的溶液中产生活性成分及任何其他所需成分的粉末。
可通过将所需量的活性化合物与所需的一种或上述成分的组合掺入适当的溶剂中，之后进行灭菌微过滤，以制备无菌注射溶液。通常，通过将活性化合物掺入无菌载体中来制备分散体，所述无菌载体包括一基本的分散介质及所需的其他上文所列举的成分。针对用于制备无菌注射溶液的无菌粉末，优选的制备方法是真空干燥及冷冻干燥(冻干)，其自其先前无菌过滤的溶液中产生活性成分及任何其他所需成分的粉末。
可与一载体材料组合以产生单一剂型的活性成分的量将取决于所治疗的受试者及特定的给药方式而有所变化。可与载体材料组合以产生单一剂型的活性成分的量通常将是产生治疗效果的组合物的量。通常，在百分之一百中，与一药物可接受的载体的组合的所述量为活性成分的约0.01％至约99％，优选地为约0.1％至约70％，最优选地为约1％至约30％。
调整剂量方案以提供最佳的所需反应(例如，治疗反应)。例如，可施予单次推注、可随时间施予数个分剂量，或者可根据治疗情况的紧急程度依比例减少或增加剂量。针对易于施用及剂量的均匀性，以剂量单位形式配制肠胃外的组合物是特别有益的。如本文中所使用，剂量单位形式是指适合作为待治疗的受试者的单位剂量的物理性离散的单位。各单元包括一预定量的活性化合物，所述活性化合物经计算可与所需的药物载体一起产生所需的治疗效果。根据本发明的至少一些实施例的剂量单位形式的规范是由以下因素决定且直接取决于：(a)活性化合物以及欲实现的特定治疗效果的独特的特征，以及(b)在本技术领域中配制此种活性化合物以治疗个体的敏感性的固有的局限。
药物的配制及给药的技术可在以下的文献中找到：“雷明顿药物科学”，马克出版公司，伊斯顿市，宾夕法尼亚州，其通过引用并入本文中。
本发明的一些实施例的药物组合物可通过本领域众所周知的方法予以制备，例如，通过常规的混合、溶解、制粒、糖衣制造、浸出、乳化、包囊、包埋或冻干的方法。
本发明的组合物可使用本领域已知的多种方法中的一种或多种经由一种或多种的施用途径来施予。如本领域技术人员能理解，施用途径及/或方式将取决于所需的结果而有所变化。根据本发明的至少一些实施例的治疗剂的优选给药途径包括血管内递送(例如，注射或输注)、静脉内、肌肉内、皮内、腹膜内、皮下、脊髓、口服、肠、直肠、肺(例如，吸入)、鼻腔、局部(包括经皮、颊及舌下)、膀胱内、玻璃体内、腹膜内、阴道、脑部递送(例如，脑室内、脑内及递送增强扩散)、中枢神经系统递送(例如，鞘内、脊柱周围及椎内)或肠胃外(包括，皮下、肌肉内、腹膜内、静脉内(IV)及皮内)、透皮(被动或使用离子电渗或电穿孔)、透粘膜(例如，舌下给药、经鼻、阴道、直肠或舌下)给药，或通过一植入物或其他的肠胃外给药途径进行给药，例如通过注射或输注，或本领域已知的其他的递送途径及/或给药形式。如本文中所使用，短语“肠胃外施用”是指除了肠内及局部施用之外的施用方式，通常通过注射，所述注射包括，但不限于静脉内、肌肉内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下腔、脊柱内、硬膜外及胸骨内注射及输注或使用可生物降解的插入物，且可配制成适合各种给药途径的剂型。在一具体实施例中，根据本发明的至少一些实施例的蛋白质、治疗剂或药物组合物可以腹膜内或静脉内施用。
根据具体实施例，本文中所公开的组合物是以水溶液形式通过肠胃外注射而予以施用。所述制剂亦可为悬浮液或乳液的形式。通常，提供用于肠胃外注射的药物组合物，包括有效量的如本文中所述的组合物，且任选地包括药学上可接受的稀释剂、防腐剂、增溶剂、乳化剂、佐剂及/或载体。此种组合物任选地包括以下一种或多种：稀释剂、无菌水、各种缓冲剂的内容物(例如，Tris-HCl、乙酸盐、磷酸盐)、pH及离子强度的缓冲盐水；以及添加剂，例如去污剂及增溶剂(例如，TWEEN 20(聚山梨酸酯20)、TWEEN 80(聚山梨酸酯80))、抗氧化剂(例如，诸如抗坏血酸、焦亚硫酸钠、半胱氨酸盐酸盐、硫酸氢钠、亚硫酸氢钠、亚硫酸钠的水溶性抗氧化剂；诸如抗坏血酸棕榈酸酯、丁基化羟基茴香醚(BHA)、丁基化羟基甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚的油溶性抗氧化剂；以及诸如柠檬酸、乙二胺四乙酸酸(EDTA)、山梨糖醇、酒石酸、磷酸的金属螯合剂)，以及防腐剂(例如，丁香酚、苯甲醇)及填充物质(例如，乳糖、甘露醇)。非水溶剂或媒介物的实例是乙醇、丙二醇、聚乙二醇、诸如橄榄油及玉米油的植物油、明胶以及诸如油酸乙酯的可注射的有机酯。使用前可将制剂进行冷冻干燥(冻干)或真空干燥，并重新溶解/重悬。可通过例如通过细菌保留过滤器进行过滤、通过将灭菌剂掺入组合物中、通过照射组合物或通过加热组合物以对制剂进行灭菌。
本文中所公开的各种组合物(例如，多肽)可局部施用。尽管局部给药对于肺、鼻、口腔(舌下、口颊)、阴道或直肠粘膜特别有效，然而局部给药对于大多数的肽制剂的效果并不理想。
当本发明的组合物以气雾剂或具有小于约5微米的空气动力学直径的喷雾干燥的颗粒形式递送时，可在吸入的同时递送至肺部，并横穿肺上皮内衬而到达血流。可使用设计用于肺部输送治疗产品的多种机械装置，包括但不限于雾化器、定量吸入器及粉末吸入器，此等皆为本领域技术人员所熟悉的。可商购的装置的一些具体实例是Ultravent雾化器(马林克罗特公司，圣刘易斯，密苏里州)；Acorn II雾化器(马奎斯医疗产品公司，科罗拉多州恩格尔伍德)；Ventolin计量吸入器(葛兰素公司，三角研究园，北卡罗莱纳州)；以及Spinhaler粉末吸入器(菲尼克斯公司，贝德福德，马萨诸塞州)。Nektar、Alkermes及Mannkind皆具有已被批准或已在临床试验中的可吸入的胰岛素粉制剂，其中所述技术可被应用于本文中所述的制剂。
用于粘膜给药的制剂通常是喷雾干燥的药物颗粒，可将其掺入片剂、凝胶、胶囊、悬浮液或乳液中。标准的药物赋形剂可自任何的配方商处取得。口服制剂可为口香糖、凝胶条、片剂或锭剂的形式。
亦可制备透皮制剂。此等通常为软膏、乳液、喷雾剂或贴剂，所有的此等皆可使用标准的技术予以制备。透皮制剂需要包括渗透促进剂。可改变本发明的药物组合物中活性成分的实际剂量水平，以获得一活性成分的量、组合物及给药方式，所述活性成分的量能有效达到对于特定的患者所需的治疗反应，且对患者无毒性。经选择的剂量水平将取决于多种药代动力学因子，包括所使用的本发明的特定组合物的活性、给药途径、给药时间、所使用的特定化合物的排出速率、治疗的持续时间、化合物及/或与所使用的特定组合物组合使用的其他的材料、年龄、性别、体重、状况、一般健康状况以及所治疗患者的既往病史，以及在医学领域中众所周知的类似因子。
根据具体实施例，以治疗有效量向受试者施用如本文中所公开的组合物。如本文中所使用，术语“有效量”或“治疗有效量”是指足以治疗、抑制或减轻所治疗的疾病的一种或多种症状，或以其他方式提供所需的药理及/或生理作用的剂量。精确地剂量是取决于多种因子而变化，例如取决于受试者的变数(例如，年龄、免疫系统健康等)、疾病及所进行的治疗。对于本文中所公开的多肽组合物、编码相同的多肽组合物的多核苷酸及核酸构建体以及本文中所述的细胞，随着进行进一步的研究，会出现关于用于治疗各种患者的各种病症的合适剂量水平的信息，且普通技术人员在考虑接受者的治疗背景、年龄及总体健康状况之后，将能够确定适当的剂量。所述经选择的剂量取决于所需的治疗效果、给药途径及所需的治疗时间。针对多肽组合物，通常每天向哺乳动物施予0.0001至100mg/kg体重的剂量水平，更通常为0.001至20mg/kg。例如，剂量可为0.3mg/kg体重、1mg/kg体重、3mg/kg体重、5mg/kg体重或10mg/kg体重或在1至10mg/kg的范围内。示例性的治疗方案需要每周给药5次、每周4次、每周3次、每周2次、每周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次、每月一次、每3个月一次或每3至6个月一次。通常，针对静脉内注射或输注，剂量可更低。剂量方案可被调整以提供最佳的所需反应(例如，治疗反应)。例如，可施用单次推注、可随时间施用数个分剂量，或者可根据治疗情况的紧急程度按比例减少或增加剂量。以剂量单位形式配制肠胃外组合物是特别有利的，以易于施用及剂量均匀。如本文中所使用，剂量单位形式是指适合作为待治疗的受试者的单位剂量的物理上离散的单位；各单位包括预定量的活性化合物，所述活性化合物经计算可与所需的药物载体一起产生所需的治疗效果。根据本发明的至少一些实施例的剂量单位形式的规范由以下因素决定且直接地取决于：(a)活性化合物的独特特征及欲实现的特定的治疗效果，以及(b)在本技术领域中配制此种活性化合物以治疗个体的敏感性的固有的局限。
任选地，根据任何合适的定时方案，可以0.0001至100mg/kg患者的重量/天，优选地0.001至20.0mg/kg/天的量的多肽制剂进行给药。根据本发明的至少一些实施例的治疗组合物可例如进行每天三次、每天两次、每天一次、每周三次、每周两次或每周一次、每两周或3、4、5、6、7或8周一次的施予。此外，可在短或长的时间段(例如，1周、1个月、1年、5年)内施予组合物。
或者，本文中所公开的组合物可以缓释制剂的形式给药，在此种情况下，需要较少的给药频率。剂量及频率是取决于患者中治疗剂的半衰期。通常，人类抗体显示最长的半衰期，其次是人源化抗体、嵌合抗体及非人类抗体。融合蛋白的半衰期的差异可能广泛。给药的剂量及频率可取决于治疗是预防性或是治疗性而变化。在预防性的应用中，在一长的时间段内以相对不频繁的间隔施予相对较低的剂量。一些患者终生持续接受治疗。在治疗性的应用中，有时需要以相对短的时间间隔使用相对高的剂量，直至疾病的进展减少或终止为止，且优选直至患者显示出疾病症状的部分或完全缓解。此后，可对患者进行预防性给药。
在某些实施例中，多肽、多核苷酸、核酸构建体或细胞组合物是局部施用的，例如，通过直接注射至待治疗的部位。通常，注射会引起组合物的局部浓度的增加，其大于全身给药所能达到的局部浓度。多肽组合物可与如上所述的基质组合，以通过减少多肽从待治疗位点的被动扩散而协助产生经增加的多肽组合物的局部浓度。
本发明的药物组合物可与本领域已知的医疗装置一起施用。例如，在一任选的实施例中，根据本发明的至少一些实施例的药物组合物可与一针头皮下注射装置一起施用，例如，在美国专利第5,399,163号、第5,383,851号、第5,312,335号、第5,064,413号、第4,941,880号、第4,790,824号或第4,596,556号中所公开的装置。可用于本发明的众所周知的植入物及模式的实例包括：美国专利第4,487,603号公开一种用于以受控的速率分配药物的植入式微输液泵；美国专利第4,486,194号公开一种通过皮肤给药的治疗装置；美国专利第4,447,233号公开一种用于以精确的输注速率输送药物的药物输注泵；美国专利第4,447,224号公开一种用于连续药物递送的可变流量植入式输液设备；美国专利第4,439,196公开一种具有多腔室的渗透药物输送系统；以及美国专利第4,475,196公开一种渗透药物输送系统。此等专利通过引用并入本文中。许多其他此类的植入物、递送系统及模式是本领域技术人员已知的。
可使用能够保护化合物免于快速释放的载体来制备活性化合物，例如控释制剂，包括植入物、透皮贴剂及微囊递送系统。可使用可生物降解的生物兼容性聚合物，例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原蛋白、聚原酸酯及聚乳酸。制备此类制剂的许多方法已获准专利或为本领域技术人员通常已知的。参见，例如，维持缓释药物及控释药物的递送系统，J.R.鲁宾逊编辑，马塞尔德克公司，纽约，1978。
可在植入聚合物装置(棒、圆柱、薄膜、圆盘)或注射剂(微粒)之后，将控释聚合物装置制成系统性的长期释放装置。基质可为微粒的形式，例如微球，其中肽是分散在固体聚合物基质或微胶囊中，其中核的材料与聚合物壳的材料不同，且肽是分散或悬浮在核中，其本质上可为液体或固体。除非本文特别定义，否则微粒、微球及微胶囊可互换使用。或者，可将聚合物浇铸为自纳米至四厘米的范围的薄平板或薄膜、通过研磨或其他标准的技术所生产的粉末，或甚至是诸如水凝胶的凝胶。
尽管优选为可生物降解的基质，然而非生物降解的基质或可生物降解的基质皆可用于递送本文中所公开的活性剂。尽管由于降解及释放特性的更好表征而优选合成的聚合物，然而非生物降解的基质或可生物降解的基质可为天然的或合成的聚合物。聚合物是基于需要释放的时间段而进行筛选。尽管在其他情况下，脉冲释放或“批量释放”可能会提供更有效的结果，然而在某些情况下，线性释放可能是最有用的。所述聚合物可为水凝胶的形式(以水的重量计，通常吸收高达约90％)，且可任选地与多价离子或聚合物进行交联。
基质可通过本领域技术人员已知的溶剂蒸发、喷雾干燥、溶剂萃取及其他方法而形成。可生物降解的微球可使用开发用于制备针对药物递送的微球的任何方法而予以制备，例如，如以下文献所述：马乔维茨及朗格，J.Controlled Release，5：13-22(1987)；马乔维茨等人，Reactive Polymers，6：275-283(1987)；以及马乔维茨等人，J.Appl PolymerScL，35：755-774(1988)。
所述设备可配制为局部释放以治疗植入或注射区域-其通常递送一剂量，所述剂量是远低于治疗全身或系统性递送的治疗剂量。此等可为皮下植入或皮下注射至肌肉、脂肪或吞咽中。
在某些实施例中，为了确保根据本发明的至少一些实施例的治疗性化合物穿过BBB(倘若需要的话)，可将其配制为例如脂质体的形式。对于制备脂质体的方法，参见，例如，美国专利第4,522,811号；第5,374,548号；以及第5,399,331号。脂质体可包括一或多个部分，所述一或多个部分被选择性地输送至特定细胞或器官中，从而增强靶向药物的递送(参见，例如，V.V.Ranade(1989)J.Clin.Pharmacol.29：685)。示例性的靶向部分包括叶酸或生物素(参见，例如，刘等人的美国专利第5,416,016号)；甘露糖苷(梅泽等人，(1988)Biochem.Biophys.Res.Commun.153：1038)；抗体(P.G.布洛曼等人，(1995)FEBS Lett.357：140；M.奥怀斯等人，(1995)Antimicrob.Agents Chemother.39：180)；表面活性剂蛋白A受体(布里斯科等人，(1995)Am.J Physiol.1233：134)；p120(施雷尔等人，(1994)J.Biol.Chem.269：9090)；亦参见K.凯南嫩；M.L.劳卡宁(1994)FEBS Lett.346：123；J.J.基利昂；I.J.菲德勒(1994)Immunomethods 4：273。
倘若需要，本发明的一些实施例的组合物可存在于一包装或分配器装置中，例如FDA批准的试剂盒，其可包括一或多种含有活性成分的单位剂型。例如，所述包装可包括金属或塑料箔，诸如泡罩包装。包装或分配器设备可随附给药说明。包装或分配器亦可通过依照由规范药物的生产、使用或销售的政府机构所规定的与容器相关的公告的形式而予以存放，其通知反映所述机构对于所述组合物的形式或人类或家畜给药的批准。例如，此种通知可为经由美国食品及药物监督管理局所批准的用于处方药或经批准的产品说明书。如上文所进一步详述，亦可制备包含在相容的药物载体中所配制的本发明的制剂的组合物，将其置放在适当的容器中，并贴上标签以治疗指定的病症。
如本文中所使用，术语“约”是指±10％。
术语“包括(comprises)”、“包括(comprises)”、“包括(includes)”、“包括(including)”、“具有”及其共轭词表示“包括但不限于”。
术语“由...所组成”是指“包括并限于”。
术语“基本上由...所组成”是指所述组合物、方法或结构可包括额外的成分、步骤及/或部分，但前提是所述额外的成分、步骤及/或部分不会实质性地改变所要求保护的组成物、方法或结构的基础特征及新颖特征。
除非上下文另有明确指出，否则如本文所使用，单数形式“一(a)”、“一(an)”及“所述”包括复数引用。例如，术语“一化合物”或“至少一化合物”可包括多种化合物，包括其混合物。
在整个本申请中，本发明的各种实施例可以一范围格式呈现。应当理解，范围格式的描述仅是为了方便及简洁，而不应被解释为对本发明范围的不灵活的限制。据此，应将范围的描述视为已具体公开所有可能的子范围以及所述范围内的各个数值。例如，范围自1至6的描述应被视为已明确公开自1至3、自1至4、自1至5、自2至4、自2至6、自3至6的子范围等，以及所述范围内的个别的数字，例如1、2、3、4、5及6。此与范围的广度无关。
每当在本文中指示数值范围时，其意在包括所指示范围内的任何引用数字(分数或整数)。短语“在第一指示数字及第二指示数字之间的范围”与“自第一指示数字至第二指示数字的范围”在本文中是可互换使用的，且意在包括第一指示数字及第二指示数字以及其之间的所有小数及整数。
如本文中所使用，术语“方法”是指用于完成一给定任务的方式、手段、技术及过程，包括，但不限于已知的方式、手段、技术及过程，或容易地由化学、药理、生物学、生化及医学领域的从业人员从已知的方式、手段、技术及过程开发。
当提到参照序列表时，应理解为此参照亦包括基本上对应于其互补序列的序列，包括微小的序列变化，所述微小的序列变化是由于例如测序错误、克隆错误或导致碱基取代、碱基缺失或碱基添加的其他改变而所引起的。前提是此种变异的频率是小于50个核苷酸中的1个、或者小于100个核苷酸中的1个、或者小于200个核苷酸中的1个、或者小于500个核苷酸中的1个、或者小于1000个核苷酸中的1个、或者小于5,000个核苷酸中的1个、或者小于10,000个核苷酸中的1个。
实例
现在参考以下的实例，此等实例与以上的描述一起以非限制性方式示出本发明的一些实施例。
通常，本文中所使用的命名法及本发明中所使用的实验室方法包括分子、生化、微生物及重组DNA技术。此种技术在文献中有详尽的解释。参见，例如，“分子克隆：实验室手册”，桑布鲁克等人，(1989)；“分子生物学的当前方法”，第I至III卷，奥苏贝尔，R.M.，编辑(1994)；奥苏贝尔等人，“分子生物学的当前方法”，约翰威利及宋斯，巴尔的摩市，马里兰州(1989)；珀巴尔，“分子克隆的实用指南”，约翰威利及宋斯，纽约(1988)；沃森等人，“重组的DNA”，Scientific American Books，纽约；比伦等人(编辑)“基因组分析：实验室手册系列”，第1至4卷，冷泉港实验室出版社，纽约(1998)；如美国专利第4,666,828号；第4,683,202号；第4,801,531号；第5,192,659号以及第5,272,057号所示；“细胞生物学：实验室手册”，第I至III卷，赛利斯，J.E.，编辑(1994)；法瑞雪尼，威利-利斯，纽约(1994)，第三版，“动物细胞的培养-基础技术的手册”；“免疫学的当前方案”，第I至III卷，科利根J.E.，编辑(1994)；斯蒂茨等人(编辑)，“基础及临床的免疫学”(第8版)，阿普尔顿及朗格，诺沃克，康涅狄格州(1994)；米雪儿及志吉(编辑)，“细胞免疫学的筛选方法”，W.H.弗里曼公司，纽约(1980)；可利用的免疫测定法在专利及科学文献中有广泛的描述，例如，参见美国专利第3,791,932号；第3,839,153号；第3,850,752号；第3,850,578号；第3,853,987号；第3,867,517号；第3,879,262号；第3,901,654号；第3,935,074号；第3,984,533号；第3,996,345号；第4,034,074号；第4,098,876号；第4,879,219号；第5,011,771号以及第5,281,521号；“寡核苷酸合成”给特，M.J.编辑，(1984)；“核酸杂交”，海姆斯，B.D.，及希金斯S.J.，编辑(1985)；“转录及翻译”，海姆斯，B.D.，及希金斯S.J.，编辑(1984)；“动物细胞培养”，法瑞雪尼R.I.，编辑(1986)；“固定化的细胞及酶”，IRL出版社(1986)；“分子克隆的实用指南”，珀巴尔，B.，(1984)及“酶学的方法”，第1至317卷，Academic Press；“PCR方案：方法及应用的指南”，Academic Press，加利福尼亚，圣地亚哥(1990)；马沙克等人，“蛋白质纯化及表征的策略-实验室课程手册”CSHL Press(1996)；所有此等文献皆并入本文中，如同在本文中完整阐述。其中的过程被认为是本领域众所周知的，且为读者的方便而提供。其中包含的所有信息皆通过引用并入本文中。
实例1
SIRPα-4-1BBL变体的筛选
为了优化以下的参数，针对SIRPα-4-1BBL融合蛋白的结构进行分析，所述SIRPα-4-1BBL融合蛋白在本文中称为“DSP107”，包括N端信号肽以及C端带有His标签(SEQ ID NO：43，图1)：
·折叠-适当的折叠以允许与靶标结合，最大程度地减少潜在的二硫键干扰
·完整性-未暴露的蛋白水解位点；
·多聚化-探究两个结构域的潜在多聚化。具体而言，优化C端域形成的三聚化；
·在哺乳动物表达系统中高度表达；以及
·低的免疫原性。
具体地，针对SIRPα结构域(对应于UniProt ID P78324 EM结构域的氨基酸31至373，SEQ ID NO：2)：
1.基于PDB结构产生一SIRPα综合模型：2JJS、2JJT、2UV3、2WNG、4CMM、4KJY。由于在此等PDB结构中所缺失的SIRPα的C端部分(自VAL338开始，即，VSAHPKEQGSNTAAENTGSNERNIY，SEQ ID NO：9)，因此，建模及同源建模技术被用以提出一个合理的预测模型。
2.结构分析-进行结构分析是为了突出融合蛋白中可能影响所需图谱的潜在元素。此等分析包括：
-通过使用Delphi及CHARMM基的算法进行静电势表面的计算，以识别可能会引起蛋白质聚集及非天然寡聚的疏水性片段。
-基于公开的X射线结构以对融合蛋白进行同源性建模。
-未确定高分辨率结构的区域的结构预测(使用结构预测服务器：robetta、TASSER及PEP-FOLD3)。
-根据PROSPER服务器预测在融合蛋白(或建议的变体)的序列上潜在的切割位点，以预测蛋白水解位点。
3.产生潜在的错误折叠形式的粗略模型，以评估具有4-1BBL的经SIRPα表达的结构域的DSP107对接。
针对4-1BBL(对应于UniProt ID P41273 EM域的氨基酸50至254，SEQ ID NO：3)：
1.基于PDB结构：2X29，产生4-1BBL细胞外(EC)域模型。由于4-1BBL的N端部分的缺失且并未在X射线中解析，因此似乎片段(ACPWAVSGARASPGSAASPRLREGPELSPD，SEQ ID NO：10)使疏水性残基暴露于溶剂，并尝试预测其表明存在非结构化区域的结构。其可能会降低融合DSP107的稳定性，且亦可能会干扰经由4-1BBL进行三聚化的正确方向。
2.使用PROSPER服务器分析融合蛋白的蛋白水解位点。
3.检测到4-1BBL解析域内的一个环，所述环朝向外面且面对溶剂，表明其可能是正在进行的一区域。
以下的图2A-3及表3证明在分析DSP107融合蛋白时所产生的3D模型、所确定的结构域及片段，以及所预测的蛋白水解位点。
总体而言，结构的分析表明如下：
1.预期移除4-1BBL结构域的N端片段(ACPWAVSGARASPG，SEQ ID NO：6/ACPWAV，SEQID NO：7)以降低DSP107的柔韧性及疏水性。
2.移除Ig样C1-第1型及Ig样C1-第2型将减小蛋白质的尺寸，同时保留其CD47相互作用域的活性。因此，SIRPα的C端应以：连接至4-1BBL的TELSVRAKPS(SEQ ID NO：8)作为结尾。
3.在4-1BBL结构域的N端片段(ACPWAVSGARASPG,SEQ ID NO：6/ACPWAV,SEQ IDNO：7)中，由于不正确的二硫键，有一游离的Cys残基可能会阻止正确的折叠/重排。
4.预期在SIRPα的N端的6-His标签会与SIRPα的最起始的3个谷氨酸相互作用，并导致此区域被掩盖。
5.似乎在侧翼/非结构化区域的切割位点很少。
表3：在DSP107 SIRPα-4-1BBL融合蛋白(SEQ ID NO：5)中的经预测的蛋白水解位点
Figure BDA0002939073350001271
基于结构的分析，设计数种SIRPα变体，其具有SEQ ID NO：24或26的氨基酸序列，其可与4-1BBL或其变体的任一者进行融合。
此外，基于结构的分析，设计数种4-1BBL变体，其具有SEQ ID NO：22、23、27、28、70、72、74或76的氨基酸序列，其可与SIRPα或其变体的任一者进行融合。
此外，为了避免需要融合蛋白的三聚化以诱导4-1BBL部分的活性，设计包括3个4-1BBL氨基酸序列的重复的4-1BBL变体，其可与SIRPα或其变体的任一者进行融合。此种4-1BBL变体的示例性序列包括三个SEQ ID NO：23的重复序列，且在重复序列之间具有(GGGGS)x2+GGGG(SEQ ID NO：82)连接子，其氨基酸序列为SEQ ID NO：78。
作为包括此种3个重复的4-1BBL氨基酸序列的SIRPα-4-1BBL融合蛋白的例子，使用同源建模，随后进行侧链及环修饰，以产生经预测的3D模型。此等模型分析预测可能与配体的结合，且在不同域之间并无干扰(图37A至图38B)。
接着，设计数种SIRPα-4-1BBL变体。包括针对序列的选择及3D模型的合理性的序列证明于下表4及图4至图6及图37中。
表4：经设计的SIRPα-4-1BBL变体的描述
Figure BDA0002939073350001281
Figure BDA0002939073350001291
Figure BDA0002939073350001301
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Figure BDA0002939073350001331
Figure BDA0002939073350001341
Figure BDA0002939073350001351
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Figure BDA0002939073350001371
Figure BDA0002939073350001381
Figure BDA0002939073350001391
Figure BDA0002939073350001401
实例2
SIRPα-4-1BBL变体的制备
为了比较功能分析及生产评估，生产数种经组氨酸标签的SIRPα-4-1BBL融合蛋白。
生产在本文中称为“DSP107”(SEQ ID NO：1)的C端带有His标签的SIRPα-4-1BBL融合蛋白及3种在本文中分别称为“DSP107_V1”、“DSP107_V2”及“DSP107_V3.1”的C端带有His标签的SIRPα-4-1BBL变体(分别为SEQ ID NO：12、14及17)在ExpiCHO细胞中起作用。
生产N端带有His标签的“DSP107”(SEQ ID NO：44)在Expi293F细胞中起作用。
将pcDNA3.4表达载体转染至细胞，所述pcDNA3.4表达载体克隆有完整的融合蛋白及3个变体的编码序列。使用EcoRI及HindIII限制酶将所述序列克隆至载体中，并在N端添加添加Kozak序列、人工信号肽(MGWSCIILFLVATATGVH，SEQ ID NO：4)、在N端添加或不添加6个His-标签，以及在C端的一停止密码子。自细胞培养的上清液中收集蛋白质，并通过HisTrapTM FF Crude柱进行一步的纯化。
在这些生产条件下，每1升培养物的C端带有His标签的DSP107(SEQ ID NO：1)的产量约为67mg。相较之下，每1升培养物的C端带有His标签的DSP107_V1(SEQ ID NO：12)及DSP107_V2(SEQ ID NO：14)的产量约为150mg；以及每1升培养物的C端带有His标记的DSP107_V3.1(SEQ ID NO：17)产量约为212mg。通过最终产物的BCA蛋白测量来检测产率。
随后，通过尺寸排阻色谱法纯化经His-标记的蛋白质，以收集经纯化的三聚体的级分。将10mg经His标记的DSP107_V1及DSP107_V2(SEQ ID NO：12及14)以PBS作为流动相，并以1ml/min的流速负载至Superdex200色谱柱(60+100x1.6 cm)上。收集对应于蛋白质三聚体的主峰。
生产在本文中称为“DSP107_V1”及“DSP107_V2”(分别为SEQ ID NO：11及13)的SIRPα-4-1BBL融合蛋白的两个变体在CHO-K1及CHO-S细胞(仅为DSP107-V2)中起作用。
将克隆有针对DSP107_V1及DSP107_V2的编码序列的pGenHT1.0表达载体转染至CHO-K1细胞。克隆至载体中的序列为在N端添加Kozak序列及人工信号肽(MGWSCIILFLVATATGVH，SEQ ID NO：4)。将pMAXX1表达载体转染至CHO-S细胞，所述pMAXX1表达载体克隆有针对DSP107_V2变体的编码序列。克隆至载体的序列添加有5’非翻译DNA序列、Kozak序列及利妥昔单抗重链的信号肽(MGWSLILLFLVAVATRVLS，SEQ ID NO：99)。选择经转染的细胞作为小池，并在批次或批次补料培养物中评估DSP107变体的表达。自细胞培养物的上清液中收集蛋白质，并通过ELISA(图17)及SDS-PAGE(图18)进行评估。
经CHO-K1衍生的选定小池进行5天批次培养的产量，DSP107_V1的产量最高可达75mg/L，且DSP107_V2的产量最高可达327mg/L。以经CHO-S衍生的选定小池的11天批次补料的产量高达1200mg/L。
实例3
SIRPα-4-1BBL变体的低聚合状态的检测
材料-生产如上实例2中所述的N端带有His标签(SEQ ID NO：44)的DSP107；及C端带有His标签的DSP107(SEQ ID NO：1)、DSP107_V1(SEQ ID NO：12)、DSP107_V2(SEQ ID NO：14)及DSP107_V3.1(SEQ ID NO：17)。Spectra BR蛋白质分子量标记(Thermo FisherScientific，目录第26634号)、4至20％聚丙烯酰胺凝胶(BioRad，目录第556-8094号)、e-Stain peds(GenScript，目录第L02011号)、Laemmeli负载缓冲液(BioRad，目录第161-0747号)。
方法-
SDS-PAGE分析-将各样品中的2μg蛋白与加β-巯基乙醇或不加β-巯基乙醇(分别在还原及非还原的条件下)与负载缓冲液混合，在95℃加热5分钟，并在4至20％梯度的聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS-PAGE上进行分离。蛋白质在凝胶上的迁移是通过含有e-Stain peds的考马斯亮蓝染色以及根据制造商的说明书所使用的e-Stain机器(GenScript)进行洗涤予以显现。
质谱(MS)分析-在未还原的IAA cys的修饰后或在还原性二甲基化还原及IAA cys的修饰后，利用胰蛋白酶以将5μg的各蛋白质样品进行分解。使用HFX质谱仪(Thermo)对样品进行分析，并通过Discoverer软件版本1.4与人类的uniprot数据库及诱饵数据库进行比较(以确定假发现率-FDR)，并使用Sequest搜索引擎对特定的序列进行鉴定。此外，使用massmatrix及starvoX软件以检测s-s键。
SEC-MALS分析-将蛋白质负载至Superdex 200增加色谱柱上(GE医疗)上，以0.8ml/min的流速进行流动，并以10mM KPO4 pH 8.0+150mM NaCl作为流动相。使用AKTAExplorer(GE)+MiniDawn TREOS+OPTILAB T-reX(WYATT)通过UV、MALS及RI进行检测。
结果-经生产的SIRPα-4-1BBL变体的SDS-PAGE分析表明，N端带有His标签的DSP107及C端带有His标签的DSP107(SEQ ID NO：44及1)，以及C端带有His标签的C107DSP107_V1及DSP107_V2在还原条件下的迁移较70kDa分子量标记慢(图7A)。如所预期的，在相似的条件下，C端带有His标签的DSP107-V3.1(SEQ ID NO：17)的迁移与在40kDa标记的相似位置处所出现的其他变体的迁移不同。在非还原条件下，N端带有His标签的DSP107及C端带有His标签的DSP107(SEQ ID NO：44及1)主要表现为高分子量蛋白(～210kDa)(图7B)。此等蛋白质的一小部分，以及C端带有His标签的DSP107_V1及DSP107_V2的迁移与其在还原条件(即，～75kDa)下的迁移相似。其可能表明DSP107融合蛋白包括经S-S连接的多聚体。C端带有His标签的DSP107-V3.1在还原及非还原条件下的迁移情况类似，例如C端带有His标签的DSP107-V1及DSP107-V2，其表明在DSP107蛋白中的S-S预测的键是通过游离的半胱氨酸残基(Cys346)所介导的，所述半胱氨酸残基已自所有的三个变体的序列中删除。
针对经还原的及未经还原的N端带有His标签的DSP107及C端带有His标签的DSP107所进行的质谱分析(MS)表明Cys346是部分经S-S键合。此发现与在N-端带有His标签的DSP107及C端带有His标签的DSP107(SEQ ID NO：44及1)的未经还原的SDS-PAGE分析中的二聚体的存在是相关的。另一方面，将Cys346自C端带有His标签的DSP_V1、DSP107_V2及DSP107-V3.1上移除，据此，在此三种变异的未经还原的SDS-PAGE分析中并未检测到高阶低聚物。
经生产的SIRPα-4-1BBL蛋白的SEC-MALS分析显示，所有的3个带有His标签的SIRPα-4-1BBL变体(SEQ ID NO：12、14及17)及未带有标签的DSP107_V2(SEQ ID NO：13)形成三聚体。针对C端带有His标签的DSP107_V1(SEQ ID NO：12)所计算出的总蛋白质量约为258kDa、针对带有His标签的DSP107_V2(SEQ ID NO：14)所计算出的总蛋白质量约为269kDa、针对带有His标签的DSP107_V3.1(SEQ ID NO：17)所计算出的总蛋白质量约为107kDa，以及针对DSP107_V2(SEQ ID NO：13)所计算出的总蛋白质量约为210±20kDa(图38)。
实施例4
包括两个结构域的SIRPα-4-1BBL变体
材料-如上文实例2所述所生产的N端带有His标签的DSP107(SEQ ID NO：44)；及C端带有His标签的DSP107(SEQ ID NO：1)、DSP107_V1(SEQ ID NO：12)、DSP107_V2(SEQ IDNO：14)以及DSP107_V3.1(SEQ ID NO：17)。
针对西方墨点分析法：Spectra BR蛋白标记物(Thermo Fisher Scientific，目录第26634号)，Laemmeli负载缓冲液(BioRad，目录第161-0747号)、4至20％聚丙烯酰胺凝胶(BioRad，目录第556-8094号)、抗4-1BBL(BioVision，5369-100)、抗SIRPα-biotinylated(#LS-C370337,LsBio)、二级山羊抗兔IgG(H+L)-HRP结合蛋白(R&D，目录第170-6515号)、链霉亲和素蛋白,HRP(#21126,Thermoscientific)、ECL加上西方墨点基质(皮尔斯，目录第32132号)。
针对夹心ELISA：抗4-1BBL抗体(来自经配对的捕获抗体；Abnova#H00008744-AP41)、抗经SIRPα生物素化抗体(LsBio#LS-C370337)、链霉亲和素蛋白，HRP(#21126，Thermo Scientific)、TMB基质(1-StepTM Ultra TMB-ELISA基质溶液，Thermo Scientific#34028)。
方法-
蛋白质印迹分析-蛋白质(各泳道500ng或50ng)在还原或非还原的条件下处理(分别在含有β-巯基乙醇的负载缓冲液中，于95℃煮沸5分钟，或者在无β-巯基乙醇的样品缓冲液中且不加热)，并在4至20％的梯度SDS-PAGE凝胶上进行分离。将蛋白质转移至PVDF膜上，并与抗4-1BBL(1：10000)或经生物素化的抗SIRPα的初级抗体一起培养过夜，之后与经HRP结合蛋白的二级抗体(1：10000)或链霉亲和素-HRP基质一起培养1小时。在进行ECL之后检测信号。
夹心ELISA-使用抗4-1BBL抗体(PBS中的2.5μg/ml)涂布盘，并在阻断溶液(PBS、1％BSA、0.005％Tween)中进行阻断。将产生的SIRPα-4-1BBL融合蛋白在阻断溶液中进行连续稀释，加入经涂布的盘中培养2小时，之后与检测抗SIRPα生物素化抗体(1：100)一起培养，然后根据制造商的建议与链霉亲和素-HRP及TMB基质一起检测。使用Plate读取仪(Thermo Scientific，Multiscan FC)在450nm对盘进行分析，并以620nm作为参考。
结果-在非还原及还原的条件下的SDS-PAGE凝胶上分离N端带有His标签的DSP107(SEQ ID NO：44)、C端带有His标签的DSP107(SEQ ID NO：1)及3个C端带有His标签的DSP107变体(DSP107_V1、DSP107_V2及DSP107_V3.1(SEQ ID NO：12、14及17)，之后使用抗4-1BBL抗体(图8A至图8B)或抗SIRPα抗体(图8C)进行免疫印迹，表明所述分子的N端及所述分子的C端二者皆存在。根据SDS-PAGE分析(上文的实例3)，蛋白质印迹分析表明N端带有His标签的DSP107及C端带有His标签的DSP107、DSP107_V1及DSP107_V2蛋白质在还原的条件下迁移至大约75kDa的大小，其与所预期的DSP107单体尺寸相对应。N端带有His标记的DSP107及C端带有His标记的4-1BBL抗体在非还原条件下，显示DSP107融合蛋白形成S-S连接的多聚体。
接着，设计夹心ELISA方法，以使用结合4-1BBL结构域的捕获抗体及结合SIRPα结构域的检测抗体来检测经生产的SIRPα-4-1BBL融合蛋白。如图9所示，使用双面ELISA并以相似的剂量反应的方式检测并定量N端带有His标签的DSP107及C端带有His标签的DSP107_V1及DSP107_V2，表明所有经测试的融合蛋白皆包括N端结构域及C端结构域。
实施例5
SIRPα-4-1BBL变体结合CD47及4-1BB
SIRPα-4-1BBL蛋白的SIRPα部分与CD47的结合分析
使用过度表达CD47的CHO-K1细胞株或内源性表达CD47的SUDHL4人类B细胞淋巴瘤细胞株，以检测SIRPα-4-1BBL的SIRPα结构域与人类CD47的结合。CHO—K1 WT细胞作为阴性对照。
使用过量表达4-1BB的人类纤维肉瘤细胞株HT1080检测SIRPα-4-1BBL的4-1BBL结构域与人类4-1BB的结合(唯枸A.等人,J Immunol.2009 183：1851-61)。野生型HT1080细胞株作为阴性对照。将细胞与所生产的SIRPα-4-1BBL融合蛋白的不同稀释液一起培养，之后使用抗4-1BBL的二级抗体进行免疫染色，以检测与CD47的结合。或者，将DSP107_V2进行生物素化以检测分子的总结合能力。使用抗CD47阻断抗体或抗4-1BB阻断抗体或两者抗体的组合以评估特异性结合。通过流式细胞术(FACS)分析结合能力。
材料-如以上实例2所生产所述生产：C端带有His标签的DSP107(SEQ ID NO：1)、DSP107_V1(SEQ ID NO：12)、DSP107_V2(SEQ ID NO：14)及DSP107_V3.1(SEQ ID NO：17)，以及DSP107_V2(SEQ ID NO：13)。
CHO-K1-WT及CHO-K1-CD47细胞株(波梅尔等人，2017，Oncoimmunology 7(2)：e1386361)、SUDHL4细胞(ATCC CRL-2957)、HT1080细胞(ATCC CCL-121)、过度表达4-1BB的HT1080细胞(唯枸A.等人，J Immunol.2009 183：1851-61)、固定性染料(BD Biosciences，目录号562247)、人类Fc阻滞剂、真染色剂FCX(Biolegend，目录号422302)、EZ-Link NHS-PEG4-生物素试剂盒(Thermo Scientific，目录号A39259)以及以下的抗体：抗4-1BBL(Biolegend，目录号311506)、抗CD47(根据KAHR Medical指导并通过GenScript所生产的“Inhibrix-样”；Biolegend，cat#323124)、抗4-1BB(BD，cat#552532Biolegend，cat#309810)、同种型IgG1，k(Biolegend，cat#400112)、APC链霉亲和素(SA)(Biolegend，cat#405207)、CFSE(Thermo Fisher，目录号C34554)、CytoLight红色(Incucyte，目录号4706)。
方法-通过分别使用经藻蓝蛋白(APC)偶联的抗CD47抗体及抗4-1BB抗体以及相应的同型对照，通过流式细胞术评估CD47或4-1BB的膜表达。为了检测SIRPα-4-1BBL与CD47的结合，将细胞与人类Fc阻断剂进行预培养，之后再与不同的浓度(如所示，0.01至50μg/ml或0.156至80μg/mL或0.05至25μg/mL)的经生产的SIRPα-4-1BBL蛋白在冰上置放30分钟或1小时，以进行培养，之后使用抗4-1BBL抗体进行免疫染色、固定并通过流式细胞仪进行分析。为了确定SIRPα-4-1BBL与4-1BB的结合，根据制造商的方案，使用EZ-Link NHS-PEG4-Biotin试剂盒，以将SIRPα-4-1BBL进行生物素化。随后，将细胞洗涤并在37℃下与抗CD47阻断抗体一起培养1小时，以防止SIRPα臂结合至CD47，或未阻断的进行结合，以证明分子(通过其两个配体)与细胞的总结合。陪养后，将经生物素化的SIRPα-4-1BBL添加至细胞中(系列稀释：0.05至50μg/mL；0.238至238nM)，并在4℃培养20分钟。培养后，洗涤细胞，并使用检测抗体：APC-链霉亲和素(SA)进行染色，并在4℃下培养30分钟，洗涤并通过流式细胞术分析。CHO-K1-CD47细胞依照制造商的说明书使用CFSE进行染色，而HT1080细胞过度表达的细胞则使用CytoLight红色进行染色。将两个经染色的细胞株以1：1的比例混合(各细胞株具有30000个细胞)。在一些实验中，加入阻断抗体(αCD47、α41BB-10μg/ml)，且在4℃下培养30分钟。加入5μg/ml的DSP107_V2(seq ID：13)，并在室温下培养30分钟。通过使用流式细胞仪分析两种染料的细胞。
结果-在过度表达CHO-K1-CD47的细胞、SUDHL4细胞及HT1018细胞上，而非在CHO-K1细胞上观察到CD47的高膜表达(图19A至B及图20)。与CHO-K1-CD47及DSP107_V2(SEQ IDNO：13)上的CD47结合的所有经测试的融合蛋白皆以剂量依赖的方式与SUDHL4细胞结合，并在过表达4-1BB的HT1080细胞上与4-1BB和CD47结合(图10、图21A至图21D及图22)。结果显示，相较于结合至HT1080亲本细胞，经生物素化的DSP107_V2与HT1080 4-1BB OX细胞的总结合度更高(图22)。此外，在CD47阻断后，特异性阻断抗体Ab完全消除与HT1080 WT细胞的结合。与HT1080 4-1BB OX细胞的结合仅被部分地降低。类似地，抗4-1BB抗体仅诱导对HT1080 4-1BB OX细胞的部分阻断。通过同时使用两个抗体对CD47及4-1BB对应物进行双重阻断，可完全消除DSP107_V2的结合(图22)。所述蛋白质并未与CHO-K1-WT细胞结合(图21A_B)。用最高浓度的蛋白质培养的同型对照并未显示背景染色。
随后，评估DSP107_V2(SEQ ID NO：13)与经CFSE标记的HT1080 4-1BB OX细胞及经CytoLight红色标记的CHO-K1 CD47 OX细胞的同时结合。培养后，观察到DSP107_V2与CD47及4-1BB OX细胞的共染色复合物的双峰形成(图23A)，表明通过免疫原性突触使邻近细胞的近似。来自3个独立实验的平均结果，将DSP107_V2与培养基对照进行比较，结果显示双峰显着增加，自～10％增加至>30％(图23B及图24)。重要的是，在与抗CD47或抗4-1BB阻断抗体一起培养后，由DSP107_V2所形成的双峰被强烈地抑制。此发现与SIRPα-4-1BBL的作用模式一致，其同时结合至CD47及4-1BB。
SIRPα-4-1BBL与人类、小鼠及食蟹猴CD47及4-1BB对应物的结合
通过表面等离子体共振(SPR)分析检测经生产的SIRPα-4-1BBL融合蛋白与CD47及4-1BB对应物的结合。
材料-如上文实例2所述所生产的N端带有His标签的DSP107(SEQ ID NO：44)；以及C端带有His标签的DSP107_V1(SEQ ID NO：12)、DSP107_V2(SEQ ID NO：14)及DSP107_V2(SEQ ID NO：13)。
S系列传感器芯片CM5(GE，目录第BR100530号)、人类抗体捕获试剂盒(GE，目录号BR100839)、人类PDL1-hFc(R&D，目录号156-B7-100)，、人类CD47-hFc(R&D，目录号4670-CD-050)、小鼠CD47-hFc(R&D，目录号#1866-CD-050)、食蟹猴CD47-hFc(ACROBiosystems，目录号CD7-C5252)、人类4-1BB-hFc(LsBio，目录号LS-G4041-100)、小鼠4-1BB-hFc(R&D，目录号937-4B-050)、食蟹猴4-1BB-hFc(R&D，目录号9324-4B-100)。
方法-使用Biacore T100生物传感器(GE医疗)进行SPR分析。使用标准的胺偶联方案，依照制造商的建议，将来自人类抗体捕获试剂盒的25μg/mL抗人类IgG(anti-Fc)抗体与芯片(Fc1-4)的所有四个流道进行偶联。在HBS-EP+流动缓冲液(10mM HEPES pH 7.3、150mMNaCl、3mM EDTA、0.05％Tween 20)中进行CD47及4-1BB与芯片的结合：将人类PDL1(阴性对照)负载至通道Fc1(在第一次实验中为10μg/mL、第二次实验中为5μg/mL，以20μl/min的速度持续10秒)，而Fc2-4负载有人类、小鼠及食蟹猴CD47-hFc蛋白(在第一次实验中为10μg/mL、第二次实验中为5μg/mL，以20μl/min的速度持续5秒)。在芯片自动再生之后，将其在通道Fc1上重新负载人类PDL1-hFc，以及在通道Fc2-4上负载人类、小鼠及食蟹猴4-1BB-hFc蛋白(在第一次实验中分别为10、5及7.5μg/mL；在第二次实验中分别为5、2.5及3.75μg/mL，以20μL/min的速度持续5秒)。芯片充满所有的对应物(平均固定的配体量为150RU)。随后，使N端带有His标签的DSP107(SEQ ID NO：44)、C端带有His标签的DSP107_V1(SEQ ID NO：12)及DSP107_V2(SEQ ID NO：14)通过所有4个通道。使用各种浓度的SIRPα-4-1BBL融合蛋白(500至0.1 2nM，以1：2系列稀释)重复此过程，流速为50μL/min(缔合时间：120秒；针对CD47蛋白，解离时间：300秒，以及针对4-1BB蛋白为600sec)。在各个循环结束时注入3M MgCl2溶液(以20μl/min的速度进行45秒)，通过去负载经捕获的分子以再生活性表面。使用BiaEvaluation软件3.0.2版(GE医疗)中的Kinetic 1：1结合模型评估结合的参数。
结果-动力学分析表明N端带有His标签的DSP107及两个C端带有His标签的SIRPα-4-1BBL变体DSP107_V1及DSP107_V2，与人类及食蟹猴CD47相似且具有较高的亲和力，且对鼠类CD47的亲和力较低(下文表5A)。DSP107_V2(SEQ ID NO：13)的动力学分析显示与人类及食蟹猴CD47相似且具有高亲和力，且对鼠类CD47无亲和力(表5B至表5C)。经测试的所有四种SIRPα-4-1BBL融合蛋白皆显示与人类及食蟹猴4-1BB相似且具有高度亲和力，且并未与鼠类4-1BB结合。经测试的SIRPα-4-1BBL融合蛋白皆未结合人类PDL1阴性对照。
表5A：N端带有His标记的DSP107(SEQ ID NO：44)；以及C端带有His标签的DSP107_V1(SEQ ID NO：12)及DSP107_V2(SEQ ID NO：14)的动态SPR分析
Figure BDA0002939073350001511
表5B：DSP107_V2(SEQ ID NO：13)的动力学SPR分析
Figure BDA0002939073350001512
Figure BDA0002939073350001521
*N.D＝未被检测到
表5C：DSP_V2(SEQ ID NO：13)对人类、小鼠及食蟹猴CD47和4-1BB的平均亲和常数
Figure BDA0002939073350001522
实施例6
通过SIRPα-4-1BBL变体激活4-1BB
使用过度表达4-1BB受体的HT1080细胞或测试所生产的SIRPα-4-1BBL融合蛋白对于4-1BB受体的激活作用。具体而言，HT1080-4-1BB细胞株会过度表达4-1BB，并已知在结合4-1BBL时会分泌IL8(威芶等人，2009，J Immunol.183(3)：1851-61)。此处，预期4-1BBL与此等细胞表面上的4-1BB受体的结合可导致激活信号通路，随后分泌IL8。为此，将细胞在不同浓度的带有His标记的SIRPα-4-1BBL的存在下进行培养，并通过ELISA检测分泌至培养基的IL8。
材料-如上文实例2所述所生产的N端带有His标签的DSP107(SEQ ID NO：44)；以及C端带有His标签的DSP107(SEQ ID NO：1)、DSP107_V1(SEQ ID NO：12)、DSP107_V2(SEQ IDNO：14)及DSP107_V3.1(SEQ ID NO：17)，及DSP107_V2(SEQ ID NO：13)。
HT1080-4-1BB细胞(唯枸等人，2009，The Journal of Immunology)、重组人类经His标记的CD47蛋白(ACRO Biosystem，目录号CD7-H5227)、重组人类经His标记的4-1BBL蛋白(Cell Signaling，cat#8460LF)、IL8ELISA试剂盒(cat#D8000C，R&D)、DMEM(cat#01-055-1A，Biological industries)、FBS(cat#10270106，Rhenium)、AIM V(无血清培养基)(ThermoScientific)、抗CD47 Ab(Invitrogen，目录号16-0479-85，克隆B6H12)。
方法-单次培养分析：在平底96孔板上涂布5μg/mL重组人类经His标记的CD47蛋白。在洗涤步骤之后，添加SIRPα-4-1BBL融合蛋白(0至5μg/mL)，并在37℃下培养1小时。将WT HT1080细胞或HT1018-4-1BB细胞添加至孔中(10,000个细胞/孔)，并在37℃的无血清培养基中培养24小时。培养后，根据制造商的方案，通过IL-8ELISA试剂盒检测上清液中的IL8浓度。使用盘读取器(Thermo Scientific，Multiscan FC)在450nm处对盘进行分析，并以540nm作为参考。亦比较SIRPα-4-1BBL的功效及其单个可溶性成分、人类SIRPα、人类4-1BBL或两者的组合的功效。为了确定结的合特异性，在加入SIRPα-4-1BBL融合蛋白之前的1小时，将抗CD47阻断抗体竞争剂添加至培养物中，以通过SIRPα臂阻断其结合。
共培养分析：将CHO-K1 WT或CHO-K1-CD47细胞接种在平底96孔板(10,000个细胞/孔)中，并在37℃下培养过夜。第二天，去除上清液、添加SIRPα-4-1BBL融合蛋白(0-10μg/mL)，并在37℃下培养1小时，之后进行洗涤步骤。之后添加HT1080 WT或HT1080-4-1BB细胞(10,000个细胞/孔)，并在37℃下培养24小时。培养后，根据制造商的方案，通过IL-8ELISA试剂盒确定上清液中的IL8浓度。使用盘读取器(Thermo Scientific，Multiscan FC)在450nm处对盘进行分析，并以540nm作为参考。
结果-在单培养分析中，在存在经盘结合的CD47的情况下，DSP107-V2(SEQ ID NO：13)诱导HT1080-4-1BB细胞分泌IL-8，而在缺乏CD47的情况下，激活作用会明显地降低(图25A，p<0.003；降低约3倍)。抗CD47抗体完全消除经盘结合的DSP107_V2及可溶性DSP107_V2的活性。可溶性DSP107_V2的阻滞可能归因于其与在HT1080细胞上所表达的与内源性CD47的低结合力的消除。
此外，相较于可溶性4-1BBL或可溶性SIRPα及4-1BBL的组合，DSP107_V2更有效地激活4-1BB信号(增加约3倍)(图25B)。如所预期的，由于与4-1BB受体无相互作用，因此可溶性SIRPα并无作用。
此外，相较于CHO-K1 WT细胞，在存在有CHO-K1-CD47细胞的情况下，使用DSP107_V2处理后，会显着增强HT1080-4-1BB细胞分泌IL-8(p<0.0032)(～3.5倍)。IL-8分泌被抗CD47抗体完全阻断，进一步表明交叉呈现对于通过4-1BB受体传输4-1BBL臂的共刺激信号是必要的(图26)。
实施例7
SIRPα-4-1BBL变体激活T细胞
T细胞的激活需要两个信号：T细胞受体(TCR)与抗原呈现细胞(APC)上的主要的组织兼容性复合物(MHC)/肽复合物的连接以及在T细胞上的共刺激受体与APC上的相应配体的交联。4-1BB是一种T细胞共刺激受体，其与4-1BBL连接之后可促进CD8+及CD4+T细胞二主的扩增、存活、分化及细胞激素的表达。
本领域已知许多检测T细胞活化的方法，包括但不限于：
-在T细胞表面上的激活标记的表达(例如：CD25、CD69、CD62L、CD137、CD107a、PD1等)。激活标记的表达通过使用特异性抗体对细胞染色及流式细胞仪分析(FACS)进行测试。
-发炎性细胞激素的分泌(例如：IL2、IL6、IL8、INFγ等)。通过ELISA测试发炎性细胞激素的分泌。
-增殖，通过使用CFSE(羧基荧光素琥珀酰亚胺酯)对T细胞进行预染色，并通过由FACS所检测CFSE稀释来检测细胞的偏差。
-杀死靶细胞，例如通过使用Calcine-AM试剂以预先标记癌细胞，并使用发光盘读取仪检测释放至培养基中的Calcine来测量癌细胞。
为此，如下评估经生产的SIRPα-4-1BBL融合蛋白对于人类外周血单核细胞(PBMC)的增殖：
材料-如上文实例2所述所生产的N端带有His标签的DSP107(SEQ ID NO：44)；C端带有His标签的DSP107_V1(SEQ ID NO：12)及DSP107_V2(SEQ ID NO：14)。Ficoll-Paque(目录号17-1440-03，GE医疗)、RPMI 1640(目录号01-100-1A，Biological industries)、FBS(目录号12657-029，Gibco)、L-谷氨酰胺(目录号25030-024，Gibco)、Pen Strep(cat#15140-122，Gibco)、经叶纯化的抗人类CD3(cat#BLG-317315，BioLegend)、重组人类IL-2(cat#589106，Biolegend)、抗4-1BB抗体(cat#BLG-106109)、抗IgG抗体(cat#BLG-402012)。
方法-使用Ficoll-Paque方法(格林维奇等人，2016，Biopreserv Biobank.14(5)：410-415)自健康的供体的外周血中分离人类PBMC。之后，在存在次优浓度的抗CD3(30ng/ml)或IL-2(1000U/ml)或抗CD3加IL-2，且在添加不同浓度的各种经His标记的SIRPα-4-1BBL蛋白的情况下，将细胞培养7天。通过
Figure BDA0002939073350001561
S3活细胞分析系统(IncuCyte)并根据制造商的协议确定PBMC的增殖。通过流式细胞术在实验的第0天及第3天测试细胞的4-1BB表面表达。
结果-在添加或未添加IL-2下，将PBMC与N端带有His标签的DSP107、C端带有His标签的DSP107_V1及C端带有His标签的DSP107_V2一起培养，可提高经利用抗CD3抗体刺激的细胞的细胞融合率，其表明增殖率更高(图11)。所有经测试的SIRPα-4-1BBL融合蛋白的浓度为0.01μg/ml时，可获得最佳的诱导效果。因此，结合N端带有His标记及C端带有His标记的DSP107、C端带有His标记的DSP107_V1及C端带有His标记的DSP107_V2可实现经4-1BBL/4-1BB介导的共刺激及T细胞增殖的诱导。此等结果与在存在或缺乏IL-2的抗CD3刺激后所诱导的4-1BB表达是相关的(图12)。
在以下的设置中，评估DSP107_V2(SEQ ID NO：13)对人类PBMC及T细胞增殖的影响如下：
材料-如上文实例2所述所生产的DSP107_V2(SEQ ID NO：13)。
Ficoll-Paque(目录编号17-1440-03，GE医疗)、RPMI 1640(目录编号01-100-1A，Biological industries)、FBS(目录编号12657-029，Gibco)、L-谷氨酰胺(目录编号25030-024，Gibco)、Pen Strep(cat#15140-122，Gibco)、重组人类IL-2(cat#589106，Biolegend)、抗CD3/CD28激活的Dynabeads、EasySep直接人类T细胞分离试剂盒(STEMCELLTechnologies)、细胞增殖染料(CPD，e-Biosciences，目录号65-0842-85)、经His标记的CD47重组蛋白(ACRO Biosystem，目录号CD7-H5227)。
方法-使用Ficoll-Paque方法自健康的供体的外周血中分离人类PBMC(格里恩维奇等人，2016，Biopreserv Biobank.14(5)：410-415)。接下来，针对Incucyte分析，将96孔平底盘涂布Poly-L-鸟氨酸(0.01％、50μL，在37℃下培养1小时)，以使PBMC细胞进行贴附。在rhIL-2(1000U/mL)及DSP107_V2(0.33μg/mL)的存在下接种PBMC(50,000/孔)。将盘在IncuCyte机器中于37℃培养5天。每3小时拍摄一次相筛图像，并使用IncuCyte活细胞分析系统(Sartorius)分析细胞密度。对于流式细胞仪分析，通过负选择磁珠(EasySep直接人类T细胞分离试剂盒，STEMCELL Technologies)自PBMC中分离出T细胞，并根据制造商的说明书，使用细胞增殖染料(CPD)进行染色。在次优浓度的人类抗CD3/CD28 Dynabeads T细胞激活剂(每个T细胞与磁珠的比例为1：10)及DSP107_V2(0.3至3μg/mL)的存在下，将经染色的T细胞在96孔盘中培养3或5天，或之后使用经His标记的CD47重组蛋白进行预涂布盘(2μg/mL，在37℃下3小时)。随后，通过流式细胞术分析CD3+T细胞的CPD水平。
结果-通过Incucyte软件所捕获的相位图像分析确定，DSP107_V2(SEQ ID NO：13)增强经IL-2所诱导的新鲜分离的人类PBMC的增殖。具体而言，相较于仅使用IL-2所处理的PBMC，将PBMC与IL-2(1000U/mL)及1.6nM(0.33μg/mL)DSP107_V2培养5天后，细胞密度急剧地增加。代表性图像如图28所示。同样地，在盘结合有CD47的情况下，DSP107_V2(SEQ IDNO：13)通过次优水平的抗CD3/CD28 Dynabeads所诱导的经CPD染色的T细胞的增殖显着提高16％至35％，p<0.0025(图29)。
以下显示评估经生产的SIRPα-4-1BBL融合蛋白对于T细胞活化标记表达的影响：
材料-如上文实例2所述所生产的DSP107_V2(SEQ ID NO：13)。
Ficoll-Paque(目录编号17-1440-03，GE医疗)、RPMI 1640(目录编号01-100-1A，Biological industries)、FBS(目录编号12657-029，Gibco)、L-谷氨酰胺(目录编号25030-024，Gibco)、Pen Strep(目录号15140-122，Gibco)、经叶纯化的抗人CD3(目录号BLG-317315，BioLegend)、抗4-1BB抗体(目录号BLG-106109)、PE抗CD25抗体(Biolegend，目录号302606)、FITC抗人CD3 Ab(Biolegend，目录号317310)。
方法-根据制造商的说明书，使用标准的Ficoll梯度法自健康供体的外周血中分离人PBMC。通过在37℃下培养3小时，将96孔盘预涂布抗人类CD3抗体(0.5μg/mL)。将来自三个供体的PBMC在抗CD3预涂布的盘中(100,000个细胞/孔)中与不同浓度的DSP107_V2(SEQID NO：13，0至5μg/mL)进行培养，在37℃、5％CO2下培养48小时。培养后，通过流式细胞仪分析CD3+T细胞群中激活标记CD25及4-1BB的表达。
结果-在所有三个经测试的供体中，抗CD3在T细胞上诱导CD25及4-1BB激活标记的表达，且所述表达以剂量依赖性方式通过DSP107_V2(SEQ ID NO：13)显着地增强(图27，针对4-1BB表达：0.0012<p<0.041；针对CD25表达：0.0039<p<0.047)。
以下评估经生产的SIRPα-4-1BBL融合蛋白对经T细胞介导的靶癌细胞杀伤力的影响：
材料及方法-针对Incucyte分析，使用适用于转导具有不受干扰的核限制性红色荧光标记的细胞的试剂的IncuCyte NucLight红色慢病毒试剂(EF1α，Puro；3TU/Cell)以转导四种ATCC癌细胞株SNU423、SNU387及SNU423肝细胞癌(HCC)以及Ovcar8卵巢癌细胞株。选择嘌呤霉素(2μg/mL)可获得稳定的细胞株。在分析之前通过流式细胞术验证癌细胞株表面上的核红色荧光及CD47表达(数据未显示)。使用阴性选择磁珠，自两位健康供体的外周血样本中分离出T细胞。将经分离的T细胞与不同的癌细胞株以效应子与肿瘤的比率(E：T)为5：1进行共培养，并以次优浓度的抗CD3/CD28 dynabeads(每个T细胞与磁珠的比例为1：10)及如上述实例2(0.11、0.33和1μg/mL)所述所制备的DSP107_V2(SEQ ID NO：13)。将IncuCyte绿色荧光Caspase 3/7基质试剂添加至共培养物中以标记凋亡细胞。将细胞在Incucyte机器中培养5天。每1.5小时记录相、绿色及红色荧光图像，并将重叠的绿色及红色荧光(“黄色”)信号量化为凋亡的癌细胞信号。
针对凋亡的经CFSE标记的肿瘤细胞进行流式细胞术分析，自健康供体的外周血中分离PBMC，并使用抗CD3及IL-2扩增11天。根据方案，使用CFSE对间皮瘤癌细胞株MSTO及H2052(ATCC)进行染色。如上文实例2所述，在0.1μg/mL或1μg/mL的DSP107_V2(SEQ ID NO：13)存在下，以数种E∶T比率共培养经扩增的PBMC及经染色的癌细胞。使用胰蛋白酶分离后，通过流式细胞术分析经CFSE标记的活癌细胞。
结果-DSP107_V2增强由T细胞所介导的肝细胞、卵巢及间皮瘤癌细胞株的杀伤作用(图30A至图30D及图31A至图31B)。
具体而言，Incucyte分析证实在经次优浓度的抗CD3/CD28 Dynabeads激活的T细胞的存在，肝细胞与卵巢癌细胞株的共培养会导致癌细胞的杀伤；以及，添加DSP107_V2可将经T细胞介导的SNU387、SNU423及Ovcar8细胞杀伤作用分别提高49％、27％及23％(图30A至图30C)。此等癌细胞株仅与DSP107_V2一起培养后，并未观察到杀伤作用(图30A至图30C)，在缺乏T细胞的情况下，对癌细胞株并无直接的细胞毒性作用。
流式细胞仪分析证实经CFSE标记的间皮瘤癌细胞株与T细胞以不同的E：T比例进行共同培养，导致在DSP107_V2的存在下增强杀死癌细胞(在E：T比例为1：1至1：5的情况下，DSP107_V2诱导高达52％的细胞死亡，而在缺乏DSP107_V2的情况下则无死亡，图31A-B)。相似于肝细胞及卵巢癌细胞株，在缺乏T细胞的情况下，与DSP107_V2一起培养后，并未观察到经CFSE标记的间皮瘤癌细胞株被杀死。
实施例8
SIRPα-4-1BBL变体对阻断CD47结合的影响
SIRPα-4-1BBL的SIRPα部分是设计为在通过阻断抗原呈现细胞(APC)上所表达的内源性SIRPα与肿瘤细胞上所表达的CD47的相互作用来阻止“不要吃我的信号”。
为此，评估经生产的SIRPα-4-1BBL融合蛋白作为阻断剂对于此相互作用的影响。
材料-如上文实例2所述所生产的N端带有His标签的DSP107(SEQ ID NO：44)；C端带有His标签的DSP107(SEQ ID NO：1)、DSP107_V1(SEQ ID NO：12、DSP107_V2(SEQ ID NO：14)及DSP107_V3.1(SEQ ID NO：17)及DSP107_V2(SEQ ID NO：13)。
重组人类CD47(Acrobiosystems，CD7-H5227)、抗hCD47中和抗体(Novus，AF4670)、经生物素化的SIRPα(Acrobiosystems，CDA-H82F2)。
方法-将ELISA盘涂布重组人类CD47过夜。将盘洗涤并与不同浓度的经生产的SIRPα-4-1BBL融合蛋白或阳性对照的抗CD47抗体一起培养1小时。随后，添加经生物素化的SIRPα；培养1小时后，依照标准的ELISA方案洗涤盘，并使用链霉亲和素-HRP及TMB基质进行印迹(图13A)。使用盘读取仪(Thermo Scientific，Multiscan FC)在450nm处对盘进行分析，并以620nm作为参考。
结果-类似于阳性对照的阻断抗体，所有经测试的SIRPα-4-1BBL融合蛋白皆有效地阻断SIRPα与CD47的相互作用(图13B)。EC50值在0.075至0.238μg/ml的范围内(图13C)。
实施例9
SIRPα-4-1BBL变体对于巨噬细胞及多聚核细胞的影响
如前所述，SIRPα-4-1BBL融合蛋白的SIRPα部分是设计为阻断通过表达CD47的肿瘤细胞所诱导的“不要吃我”信号，使得通过竞争及阻断肿瘤细胞上的CD47与内源性的相互作用，从而使内源性SIRPα在诸如巨噬细胞及粒细胞的APC上表达。“不要吃我”信号的此种障碍会诱导肿瘤细胞的吞噬作用。
为此，使用流式细胞术基的分析或荧光显微镜评价经声生产的SIRPα-4-1BBL融合蛋白对于人类巨噬细胞或多形核细胞(PMN)在吞噬肿瘤细胞的功效。
材料-如上文实例2所述所生产的N端带有His标签的DSP107(SEQ ID NO：1)；C端带有His标签的DSP107_V1(SEQ ID NO：12)、DSP107_V2(SEQ ID NO：14)及DSP107_V3.1(SEQID NO：17)；及DSP107_V2(SEQ ID NO：13)。
人类癌细胞株Ramos(淋巴瘤)、DLD-1(结肠癌)、Daudi，SUDHL5、SUDHL4、U2932、SUDHL2、SUDHL6、SUDHL10、DUDHL4和OCI-LY3(淋巴瘤)。
方法-通过密度梯度离心，从健康的志愿者的血液样本中分离出多形核细胞(PMN)及PBMC，之后通过氯化铵以裂解红血球。
针对PMN分析，使用Vybrant DiD以标记Ramos及DLD-1癌细胞，并以效应子与靶标为1：1的比率与经分离的PMN进行混合。经混合的培养物单独与经生产的SIRPα-4-1BBL融合蛋白处理2小时，或与治疗性抗体利妥昔单抗(RTX；抗CD20)或西妥昔单抗(CTX；抗EGFR)组合使用，并与经生产的SIRPα-4-1BBL融合蛋白处理2小时；或仅与经生产的SIRPα-4-1BBL融合蛋白处理18小时。接着，通过流式细胞术分析PMN对于癌细胞的吞噬作用。
针对巨噬细胞分析，使用CD14磁性MicroBeads(Miltenyi Biotec)通过MACS分选，自经分离的PBMC中进一步富集单核细胞。在补充有GM-CSF(50ng/ml)及M-CSF(50ng/ml)的RPMI 1640培养基+10％FCS中，单核细胞持续7天分化为巨噬细胞(M0)。为了生产第1型巨噬细胞(M1)，通过LPS及IFN-γ将M0细胞再灌注24小时。或者，为了生产第2型巨噬细胞(M2)，将M0细胞与100ng/mL IL-4一起培养24小时。将SUDHL5、SUDHL4、OCI-LY3、SUDHL2、SUDHL6、SUDHL10、SC-1、Ramos及Daudi癌细胞使用V450细胞质染料标记，并以效应子与靶标为1：1或1：5的比率与经分离的且体外分化的第I型巨噬细胞(M1)进行混合。经混合的培养物单独或与RTX、曲妥珠单抗或CTX组合使用，并与经生产的SIRPα-4-1BBL融合蛋白一起处理2至2.5小时。培养后，将未被吞噬的肿瘤细胞洗掉，并使用抗CD11b AF 594Ab染色巨噬细胞。通过荧光显微镜分析巨噬细胞对于癌细胞的吞噬作用。在其他的实验中，通过Incucyte对于吞噬作用的评估如下：根据制造商的方案，使用CFSE以将不同的淋巴瘤细胞株的肿瘤细胞预先染色，并使用IncuCyte Cytolight红色细胞质染料以将巨噬细胞预先染色。以巨噬细胞与肿瘤细胞为1：5的比例，将经染色的肿瘤细胞与巨噬细胞进行共培养，并通过Incucyte拍摄红色及绿色相图像。吞噬作用被量化为占总巨噬细胞(红色信号)中肿瘤细胞吞噬阳性的巨噬细胞(“黄色”信号)的比例。
结果-与治疗性抗体利妥昔单抗(RTX)或西妥昔单抗(CTX)组合培养2小时后，所有经测试的带有His标签的SIRPα-4-1BBL融合蛋白皆增强了经PMNs介导的Ramos及DLD1癌细胞的吞噬作用(图14A)。在培养18小时后，进一步证实增强了经PMN介导的Ramos及DLD1癌细胞的吞噬作用(图14B)。
此外，所有经测试的带有His标记的SIRPα-4-1BBL融合蛋白在培养2小时后皆能增强经巨噬细胞介导的SUDHL4、SUDHL5及Oci-Ly3淋巴瘤细胞株的吞噬作用，其为与利妥昔单抗(RTX)组合使用后而进一步增强的(图15)。此外，培养2小时后，C端带有His标签的DSP107_V2(SEQ ID NO：14)以剂量依赖性的方式增强经巨噬细胞介导的SUDHL4的吞噬作用(图16)。
此外，在与2.5μg/ml DSP107_V2(SEQ ID NO：13)培养后，增强了经利妥昔单抗诱导的M1巨噬细胞对于肿瘤细胞的吞噬作用(图32A)。DSP107_V2亦增加各巨噬细胞所吞噬的Ramos细胞的数量(图32B)。
之后使用Incucyte成像系统测试各种淋巴瘤细胞株。在将M1巨噬细胞与癌细胞及以2.1μg/ml DSP107_V2作为单一试剂进行培养后，观察到经M1巨噬细胞介导的癌细胞株的吞噬作用(图32C)。相较于以利妥昔单抗作为单一药剂进行诱导的效果，当将DSP107_V2与利妥昔单抗组合使用时，亦观察到吞噬作用的加乘效果(图32D)。
有趣的是，DSP107_V2(SEQ ID NO：13)亦增强通过M0及M2巨噬细胞所诱导的吞噬作用，无论是作为单一药剂抑或与利妥昔单抗阻合使用，然而其扩展程度较M1巨噬细胞所观察到的为小(数据未显示)。
在与DLD-1结肠癌细胞相似的实验中，相较于培养基对照组，采用DSP107_V2单一药剂处理(2.1μg/mL)的巨噬细胞吞噬更多的DLD-1细胞(图32E)。此外，相较于曲妥珠单抗作为单一药剂的治疗，DSP107_V2及曲妥珠单抗(抗-Her2抗体)的组合治疗明确证明增强肿瘤细胞吞噬作用。
实施例10
SIRPα-4-1BBL变体对于粒细胞的影响
材料及方法-使用标准的方法，自健康供体的外周血中分离白血球。根据制造商的方案，使用CFSE(Thermo Fisher)或Vybrant DiD细胞标记溶液(Thermo Fisher)以将肿瘤细胞进行预染色。将经分离的白血球及经染色的肿瘤细胞以1：1的白血球与肿瘤细胞的比例进行混合，并在DSP107_V2(SEQ ID NO：13)的存在下与存在或缺乏治疗性抗体利妥昔单抗(1μg/mL)一起培养。随后通过流式细胞术评估粒细胞对于肿瘤细胞的摄取，从而量化Vybrant DiD阳性粒细胞的数量。为了评估癌细胞株的吞噬作用，在存在DSP107_V2(SEQ IDNO：13)或曲妥珠单抗(抗人类表皮生长因子受体2(HER2)Ab；0.1μg/mL)或DSP107_V2与曲妥珠单抗的组合下，使用CFSE以将DLD-1结肠癌细胞进行染色，并以巨噬细胞：肿瘤细胞为1：5的比例与巨噬细胞共培养2小时。培养后，使用胰蛋白酶/EDTA溶液以将细胞自盘上分离，使用CD11b-APC Ab以对巨噬细胞进行染色，并通过FACS分析样品。亦将DSP107_V2(SEQ IDNO：13)对于粒细胞摄取肿瘤细胞的影响与带有His标记的SIRPα或可溶性4-1BBL或两者的组合进行比较。
结果-在多个淋巴瘤细胞株上，进一步评估DSP107_V2以及可溶性带有His标记的SIRPα与可溶性4-1BBL的组合对于经粒细胞介导的肿瘤细胞的吞噬作用的影响。将与DSP107_V2或其可溶性成分的组合一起培养后的吞噬作用作为单一试剂进行测试，并与培养基进行比较。亦使用利妥昔单抗作为单一试剂，并与DSP107_V2或其可溶成分组合，以测了肿瘤细胞的吞噬作用。与2.1μg/ml DSP107_V2一起培养2.5小时后，通过DSP107_V2而非通过可溶性SIRPα及可溶性4-1BBL的组合，刺激经粒细胞介导的淋巴瘤细胞的吞噬作用(图33B)。利妥昔单抗亦证明强的单一试剂刺激经粒细胞介导的肿瘤细胞的吞噬作用。与DSP107_V2组合可增强此效果，然而与可溶性SIRPα及可溶姓4-1BBL的混合物的组合则不会增强此效果(图33B至图33F)。
实施例11
SIRPα-4-1BBL变体的体内抗肿瘤的作用
使用4种不同的体内小鼠模型以测试经生产的SIRPα-4-1BBL融合蛋白在治疗癌症中的功效：
1.接种人类肿瘤细胞的裸SCID小鼠。在此模型中，SIRPα-4-1BBL融合蛋白与小鼠及人类CD47(在肿瘤细胞上表达)相互作用，并测试融合蛋白对于小鼠巨噬细胞活性的影响。
2.使用人类干细胞及人类肿瘤细胞所接种的NSG小鼠。在此模型中，SIRPα-4-1BBL会与人类CD47(在肿瘤及免疫细胞上表达)以及与人类T细胞上的4-1BB相互作用。测试融合蛋白对于小鼠及人类巨噬细胞以及人类T细胞的影响。
3.C57BL/6-人类4-1BB敲入小鼠-其是接种有MC38小鼠结肠癌或其他的癌细胞株或过度表达人类CD47的癌细胞株。在此模型中，小鼠4-1BB的细胞外结构域被人类4-1BB的细胞外结构域取代。因此，SIRPα-4-1BBL融合蛋白可与在小鼠T细胞上所表达的人类4-1BB相互作用。所述融合蛋白会与在肿瘤细胞上的小鼠及人类CD47相互作用。测试融合蛋白对于小鼠巨噬细胞以及小鼠T细胞的影响。
4.表达小鼠CD47的同系小鼠肿瘤模型。在此等模型中，SIRPα-4-1BBL会与肿瘤细胞上的小鼠CD47相互作用。测试融合蛋白对于小鼠巨噬细胞的影响。
方法-在所有的4种模型中，小鼠皆通过静脉地(IV)、腹膜内地(IP)、皮下地(SC)或原位地接种肿瘤细胞。一旦可触知肿瘤(～80mm3)，即以不同的剂量及不同的方案的SIRPα-4-1BBL融合蛋白；例如，如上述实例1所述生产的N端带有His标记的(SEQ ID NO：44)、C端带有His标记的DSP107(SEQ ID NO：1)、C端带有His标记的DSP107_V1(SEQ ID NO：12)、C端带有His标记的DSP107_V2(SEQ ID NO：14)及C端带有His标签的DSP107_V3.1(SEQ ID NO：17)。
追踪小鼠的体重及临床征状。每周使用卡尺测量肿瘤数次。根据以下的公式计算肿瘤的体积：V＝长度x宽度2/2。通过整个实验监控肿瘤的生长及存活。
通过切除肿瘤或引流淋巴结，使用特异性抗体染色及流式细胞仪分析消化及免疫的表型，以测试免疫细胞向肿瘤的浸润测试肿瘤中免疫细胞的浸润及亚型。额外地，或可替代地，通过切除肿瘤、石蜡包埋及切片以用特异性抗体进行免疫组织化学染色来确定免疫细胞的浸润或肿瘤的坏死等级。
牺牲小鼠时，收集小鼠的器官，并将其包埋在石蜡块中，以进行H&E及IHC染色。
根据通用的方法，在不同的时间点自小鼠采集血液样本，以用于以下的测试：PK分析、血浆中细胞激素的检测、循环中血细胞亚群的FACS分析、血液学测试、血清化学测试、抗药物-抗体(ADA)分析及中和抗体分析(NAB)。
实施例12
使用人类4-1BB敲入的小鼠模型，SIRPα-4-1BBL变体的体内抗肿瘤功效
为了测试SIRPα-4-1BBL变体融合蛋白在小鼠中的功效，使用人类4-1BB(h4-1BB)敲入的小鼠(C57BL/6背景)。选择表达人类CD47的MC38(hCD47 MC38)细胞作为肿瘤模型。值得注意的是，已显示在C57BL/6小鼠中的SIRPα不与人类CD47相互作用[山内，T.等人，(2013)Blood，121(8)：p.1316-25]，因此在此模型中并不会发生天然的吞噬细胞对于hCD47MC38细胞的吞噬作用。此外，使用流式细胞术分析将DSP107与鼠类WT MC38结肠癌细胞的结合以及与人类DLD1结肠癌细胞的结合进行比较(图34)。基于DSP107与鼠类MC38的低结合力，选择hCD47MC38细胞以研究在体内的功效。因此，预期SIRPα-4-1BBL变体融合蛋白的SIRPα臂靶向表达人类CD47的肿瘤细胞，但在此模型中对于促进肿瘤细胞的吞噬作用并无任何的作用。
材料及方法-将8至9周大的雌性h4-1BB敲入的C57BL/6只小鼠(CrownBioscience)皮下接种1x106个hCD47 MC38细胞(Crown Bioscience)。一旦肿瘤达到60至100mm3的尺寸即开始治疗。随机分配后，各组的六只动物接受腹膜内(IP)注射DSP107_V2(SEQ ID NO：13；250μg/注射；12.5mg/kg)，在第0、1、2、3及4天每天给药一次，或者注射抗鼠PD-L1 Ab(克隆10F.9G2，Bioxcell；60μg/注射)，每两周施予一次IP并给药3周，或者与DSP107_V2(SEQ ID NO：13)及抗鼠PD-L1 Ab组合使用。对照组小鼠则注射200μl磷酸盐缓冲盐水(PBS)。仅在实验的第一周才使用DSP107_V2，以避免潜在的小鼠抗人类抗体发展。使用卡尺每周三次检测肿瘤体积，并通过以下的公式计算各别的体积：V＝(宽度2×长度)/2。一旦肿瘤达到3000mm3的体积，牺牲各个小鼠。
结果-使用抗PD-L1或DSP107_V2(SEQ ID NO：13)作为单一药剂进行治疗可抑制肿瘤的生长(分别为50.4％及29.5％，图35A)。当组合PD-L1或DSP107_V2时，可进一步提高肿瘤生长抑制(TGI)的百分比(相较于经媒液处理的对照组为83％，p＝0.02)。此外，基于心理考克斯分析(Metal cox)analysis，相较于经媒液治疗的对照组小鼠，DSP107_V2及抗PD-L1的组合治疗可显着的提高存活率(p＝0.01；35B)。
实施例13
使用NSG小鼠模型，SIRPα-4-1BBL变体的体内抗-DLBCL功效
使用接种SUDHL6人类DLBCL细胞及人类PBMC的NSG小鼠，评估SIRPα-4-1BBL变体融合蛋白在人类免疫系统中于体内治疗人类DLBCL肿瘤中的作用。使用SIRPα-4-1BBL变体融合蛋白作为单一药剂以进一步治疗此等小鼠。追踪小鼠的肿瘤生长。
材料及方法-在第0天使14周大的雌性NSG小鼠皮下接种1x106个SUDHL6细胞，在第7天，将小鼠随机分为以下两组：
1.五只小鼠-PBMC
2.六只小鼠-PBMC+DSP107_V2(SEQ ID NO：13)
根据制造商的说明书，使用标准的Ficoll梯度法自健康供体的外周血中分离PBMC。在第7天，将小鼠以I.V.方式接种经分离的PBMC，每只小鼠接种1x106个细胞。在第13天，将来自相同供体的冷冻的PBMC重新注射至小鼠(每只小鼠接种1×106个细胞)。自第7天开始持续2周使用250μg/小鼠DSP107_V2(SEQ ID NO：13)并以I.P.方式治疗DSP107_V2组的小鼠，期间治疗一天并休息一天。使用微量卡尺检测肿瘤。通过以下的方程式计算肿瘤的体积：长×长×宽/2。在第22天牺牲小鼠，取出肿瘤并称重。
结果-相较于仅注射PBMC的对照组，于第20天时，使用PBMC及DSP107_V2所进行的治疗可抑制肿瘤生长约3.7倍(图36A)。如在第22天小鼠牺牲后所确定的，使用PBMC+DSP107_V2治疗显着降低肿瘤的重量(图36B)。重要的是，并未有任何治疗方法能影响小鼠的体重，表明对于小鼠的健康并无重大的副作用(数据未显示)。
表6：第13天、第15天及第20天的平均肿瘤体积
Figure BDA0002939073350001681
Figure BDA0002939073350001691
*在第13天、第15天及第20天通过微量卡尺检测肿瘤。计算肿瘤的体积，并据此计算组的平均值。
尽管已经结合本发明的特定实施例而描述本发明，然而显然许多替代、修改及变化对于本领域技术人员将是显而易见的。因此，旨在涵盖落入所附权利要求书的精神及广的泛范围内的所有此种的替代、修改及变化。
本说明书中提及的所有发表、专利及专利申请案皆通过引用而整体并入本文终，其如同各个单独的发表、专利或专利申请案被具体地及单独地指示通过引用并入本文中的程度相同。此外，在本申请中对于任何参考文献的引用或标识皆不应解释为承认所述参考文献可用作本发明的现有技术。就使用本节的标题而言，不应将其解释为必然的限制。
此外，本申请的任何优先权文件在此全文以引用的方式并入本文中。
序列表
<110> 卡尔医学有限公司
艾莉丝·佩克
伊泰·布洛奇
<120> SIRPalpha-4-1BBL变异融合蛋白及其使用方法
THEREOF
<130> 77794
<150> US 62/696,362
<151> 2018-07-11
<160> 99
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 555
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C端带有His标签的原始SIRPa-4-1BBL
<400> 1
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Gly Ser Pro Asp Asp Val Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu
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<211> 343
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 原始SIRPa域
<400> 2
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180 185 190
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260 265 270
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275 280 285
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290 295 300
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 原始4-1BBL域
<400> 3
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Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala
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Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu
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<210> 4
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 信号肽
<400> 4
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1 5 10 15
Val His Ser
<210> 5
<211> 549
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 不带有His标签的原始SIRPa-4-1BBL
<400> 5
Glu Glu Glu Leu Gln Val Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Leu Val Ala
1 5 10 15
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Leu Ser Asp Phe Gln Thr Asn Val Asp Pro Val Gly Glu Ser Val Ser
165 170 175
Tyr Ser Ile His Ser Thr Ala Lys Val Val Leu Thr Arg Glu Asp Val
180 185 190
His Ser Gln Val Ile Cys Glu Val Ala His Val Thr Leu Gln Gly Asp
195 200 205
Pro Leu Arg Gly Thr Ala Asn Leu Ser Glu Thr Ile Arg Val Pro Pro
210 215 220
Thr Leu Glu Val Thr Gln Gln Pro Val Arg Ala Glu Asn Gln Val Asn
225 230 235 240
Val Thr Cys Gln Val Arg Lys Phe Tyr Pro Gln Arg Leu Gln Leu Thr
245 250 255
Trp Leu Glu Asn Gly Asn Val Ser Arg Thr Glu Thr Ala Ser Thr Val
260 265 270
Thr Glu Asn Lys Asp Gly Thr Tyr Asn Trp Met Ser Trp Leu Leu Val
275 280 285
Asn Val Ser Ala His Arg Asp Asp Val Lys Leu Thr Cys Gln Val Glu
290 295 300
His Asp Gly Gln Pro Ala Val Ser Lys Ser His Asp Leu Lys Val Ser
305 310 315 320
Ala His Pro Lys Glu Gln Gly Ser Asn Thr Ala Ala Glu Asn Thr Gly
325 330 335
Ser Asn Glu Arg Asn Ile Tyr Gly Ala Cys Pro Trp Ala Val Ser Gly
340 345 350
Ala Arg Ala Ser Pro Gly Ser Ala Ala Ser Pro Arg Leu Arg Glu Gly
355 360 365
Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln
370 375 380
Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly
385 390 395 400
Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr
405 410 415
Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys
420 425 430
Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val
435 440 445
Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro
450 455 460
Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu
465 470 475 480
Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly
485 490 495
Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu His
500 505 510
Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr
515 520 525
Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu Pro
530 535 540
Ser Pro Arg Ser Glu
545
<210> 6
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 4-1BBL域的N端的部份序列
<400> 6
Ala Cys Pro Trp Ala Val Ser Gly Ala Arg Ala Ser Pro Gly
1 5 10
<210> 7
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 4-1BBL域的N端的部份序列
<400> 7
Ala Cys Pro Trp Ala Val
1 5
<210> 8
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SIRP-alpha的C端的部份序列
<400> 8
Thr Glu Leu Ser Val Arg Ala Lys Pro Ser
1 5 10
<210> 9
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SIRP-alpha的部份序列
<400> 9
Val Ser Ala His Pro Lys Glu Gln Gly Ser Asn Thr Ala Ala Glu Asn
1 5 10 15
Thr Gly Ser Asn Glu Arg Asn Ile Tyr
20 25
<210> 10
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 4-1BB-L的部份序列
<400> 10
Ala Cys Pro Trp Ala Val Ser Gly Ala Arg Ala Ser Pro Gly Ser Ala
1 5 10 15
Ala Ser Pro Arg Leu Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp
20 25 30
<210> 11
<211> 543
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 不带有His标签的DSP107_var1
<400> 11
Glu Glu Glu Leu Gln Val Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Leu Val Ala
1 5 10 15
Ala Gly Glu Thr Ala Thr Leu Arg Cys Thr Ala Thr Ser Leu Ile Pro
20 25 30
Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Gly Arg Glu Leu
35 40 45
Ile Tyr Asn Gln Lys Glu Gly His Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser
50 55 60
Asp Leu Thr Lys Arg Asn Asn Met Asp Phe Ser Ile Arg Ile Gly Asn
65 70 75 80
Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys Phe Arg Lys
85 90 95
Gly Ser Pro Asp Asp Val Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu
100 105 110
Ser Val Arg Ala Lys Pro Ser Ala Pro Val Val Ser Gly Pro Ala Ala
115 120 125
Arg Ala Thr Pro Gln His Thr Val Ser Phe Thr Cys Glu Ser His Gly
130 135 140
Phe Ser Pro Arg Asp Ile Thr Leu Lys Trp Phe Lys Asn Gly Asn Glu
145 150 155 160
Leu Ser Asp Phe Gln Thr Asn Val Asp Pro Val Gly Glu Ser Val Ser
165 170 175
Tyr Ser Ile His Ser Thr Ala Lys Val Val Leu Thr Arg Glu Asp Val
180 185 190
His Ser Gln Val Ile Cys Glu Val Ala His Val Thr Leu Gln Gly Asp
195 200 205
Pro Leu Arg Gly Thr Ala Asn Leu Ser Glu Thr Ile Arg Val Pro Pro
210 215 220
Thr Leu Glu Val Thr Gln Gln Pro Val Arg Ala Glu Asn Gln Val Asn
225 230 235 240
Val Thr Cys Gln Val Arg Lys Phe Tyr Pro Gln Arg Leu Gln Leu Thr
245 250 255
Trp Leu Glu Asn Gly Asn Val Ser Arg Thr Glu Thr Ala Ser Thr Val
260 265 270
Thr Glu Asn Lys Asp Gly Thr Tyr Asn Trp Met Ser Trp Leu Leu Val
275 280 285
Asn Val Ser Ala His Arg Asp Asp Val Lys Leu Thr Cys Gln Val Glu
290 295 300
His Asp Gly Gln Pro Ala Val Ser Lys Ser His Asp Leu Lys Val Ser
305 310 315 320
Ala His Pro Lys Glu Gln Gly Ser Asn Thr Ala Ala Glu Asn Thr Gly
325 330 335
Ser Asn Glu Arg Asn Ile Tyr Gly Ser Gly Ala Arg Ala Ser Pro Gly
340 345 350
Ser Ala Ala Ser Pro Arg Leu Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp
355 360 365
Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu
370 375 380
Val Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser
385 390 395 400
Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys
405 410 415
Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val
420 425 430
Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly
435 440 445
Ser Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly
450 455 460
Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu
465 470 475 480
Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser
485 490 495
Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg
500 505 510
His Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg
515 520 525
Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu
530 535 540
<210> 12
<211> 549
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 带有His标签的DSP107_var1
<400> 12
Glu Glu Glu Leu Gln Val Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Leu Val Ala
1 5 10 15
Ala Gly Glu Thr Ala Thr Leu Arg Cys Thr Ala Thr Ser Leu Ile Pro
20 25 30
Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Gly Arg Glu Leu
35 40 45
Ile Tyr Asn Gln Lys Glu Gly His Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser
50 55 60
Asp Leu Thr Lys Arg Asn Asn Met Asp Phe Ser Ile Arg Ile Gly Asn
65 70 75 80
Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys Phe Arg Lys
85 90 95
Gly Ser Pro Asp Asp Val Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu
100 105 110
Ser Val Arg Ala Lys Pro Ser Ala Pro Val Val Ser Gly Pro Ala Ala
115 120 125
Arg Ala Thr Pro Gln His Thr Val Ser Phe Thr Cys Glu Ser His Gly
130 135 140
Phe Ser Pro Arg Asp Ile Thr Leu Lys Trp Phe Lys Asn Gly Asn Glu
145 150 155 160
Leu Ser Asp Phe Gln Thr Asn Val Asp Pro Val Gly Glu Ser Val Ser
165 170 175
Tyr Ser Ile His Ser Thr Ala Lys Val Val Leu Thr Arg Glu Asp Val
180 185 190
His Ser Gln Val Ile Cys Glu Val Ala His Val Thr Leu Gln Gly Asp
195 200 205
Pro Leu Arg Gly Thr Ala Asn Leu Ser Glu Thr Ile Arg Val Pro Pro
210 215 220
Thr Leu Glu Val Thr Gln Gln Pro Val Arg Ala Glu Asn Gln Val Asn
225 230 235 240
Val Thr Cys Gln Val Arg Lys Phe Tyr Pro Gln Arg Leu Gln Leu Thr
245 250 255
Trp Leu Glu Asn Gly Asn Val Ser Arg Thr Glu Thr Ala Ser Thr Val
260 265 270
Thr Glu Asn Lys Asp Gly Thr Tyr Asn Trp Met Ser Trp Leu Leu Val
275 280 285
Asn Val Ser Ala His Arg Asp Asp Val Lys Leu Thr Cys Gln Val Glu
290 295 300
His Asp Gly Gln Pro Ala Val Ser Lys Ser His Asp Leu Lys Val Ser
305 310 315 320
Ala His Pro Lys Glu Gln Gly Ser Asn Thr Ala Ala Glu Asn Thr Gly
325 330 335
Ser Asn Glu Arg Asn Ile Tyr Gly Ser Gly Ala Arg Ala Ser Pro Gly
340 345 350
Ser Ala Ala Ser Pro Arg Leu Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp
355 360 365
Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu
370 375 380
Val Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser
385 390 395 400
Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys
405 410 415
Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val
420 425 430
Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly
435 440 445
Ser Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly
450 455 460
Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu
465 470 475 480
Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser
485 490 495
Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg
500 505 510
His Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg
515 520 525
Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu His
530 535 540
His His His His His
545
<210> 13
<211> 535
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 不带有His标签的DSP107_var2
<400> 13
Glu Glu Glu Leu Gln Val Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Leu Val Ala
1 5 10 15
Ala Gly Glu Thr Ala Thr Leu Arg Cys Thr Ala Thr Ser Leu Ile Pro
20 25 30
Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Gly Arg Glu Leu
35 40 45
Ile Tyr Asn Gln Lys Glu Gly His Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser
50 55 60
Asp Leu Thr Lys Arg Asn Asn Met Asp Phe Ser Ile Arg Ile Gly Asn
65 70 75 80
Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys Phe Arg Lys
85 90 95
Gly Ser Pro Asp Asp Val Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu
100 105 110
Ser Val Arg Ala Lys Pro Ser Ala Pro Val Val Ser Gly Pro Ala Ala
115 120 125
Arg Ala Thr Pro Gln His Thr Val Ser Phe Thr Cys Glu Ser His Gly
130 135 140
Phe Ser Pro Arg Asp Ile Thr Leu Lys Trp Phe Lys Asn Gly Asn Glu
145 150 155 160
Leu Ser Asp Phe Gln Thr Asn Val Asp Pro Val Gly Glu Ser Val Ser
165 170 175
Tyr Ser Ile His Ser Thr Ala Lys Val Val Leu Thr Arg Glu Asp Val
180 185 190
His Ser Gln Val Ile Cys Glu Val Ala His Val Thr Leu Gln Gly Asp
195 200 205
Pro Leu Arg Gly Thr Ala Asn Leu Ser Glu Thr Ile Arg Val Pro Pro
210 215 220
Thr Leu Glu Val Thr Gln Gln Pro Val Arg Ala Glu Asn Gln Val Asn
225 230 235 240
Val Thr Cys Gln Val Arg Lys Phe Tyr Pro Gln Arg Leu Gln Leu Thr
245 250 255
Trp Leu Glu Asn Gly Asn Val Ser Arg Thr Glu Thr Ala Ser Thr Val
260 265 270
Thr Glu Asn Lys Asp Gly Thr Tyr Asn Trp Met Ser Trp Leu Leu Val
275 280 285
Asn Val Ser Ala His Arg Asp Asp Val Lys Leu Thr Cys Gln Val Glu
290 295 300
His Asp Gly Gln Pro Ala Val Ser Lys Ser His Asp Leu Lys Val Ser
305 310 315 320
Ala His Pro Lys Glu Gln Gly Ser Asn Thr Ala Ala Glu Asn Thr Gly
325 330 335
Ser Asn Glu Arg Asn Ile Tyr Gly Ser Ala Ala Ser Pro Arg Leu Arg
340 345 350
Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu
355 360 365
Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile
370 375 380
Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser
385 390 395 400
Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val Val
405 410 415
Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg
420 425 430
Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His Leu
435 440 445
Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val
450 455 460
Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe
465 470 475 480
Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val His
485 490 495
Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly
500 505 510
Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala Gly
515 520 525
Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu
530 535
<210> 14
<211> 541
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 带有His标签的DSP107_var2
<400> 14
Glu Glu Glu Leu Gln Val Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Leu Val Ala
1 5 10 15
Ala Gly Glu Thr Ala Thr Leu Arg Cys Thr Ala Thr Ser Leu Ile Pro
20 25 30
Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Gly Arg Glu Leu
35 40 45
Ile Tyr Asn Gln Lys Glu Gly His Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser
50 55 60
Asp Leu Thr Lys Arg Asn Asn Met Asp Phe Ser Ile Arg Ile Gly Asn
65 70 75 80
Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys Phe Arg Lys
85 90 95
Gly Ser Pro Asp Asp Val Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu
100 105 110
Ser Val Arg Ala Lys Pro Ser Ala Pro Val Val Ser Gly Pro Ala Ala
115 120 125
Arg Ala Thr Pro Gln His Thr Val Ser Phe Thr Cys Glu Ser His Gly
130 135 140
Phe Ser Pro Arg Asp Ile Thr Leu Lys Trp Phe Lys Asn Gly Asn Glu
145 150 155 160
Leu Ser Asp Phe Gln Thr Asn Val Asp Pro Val Gly Glu Ser Val Ser
165 170 175
Tyr Ser Ile His Ser Thr Ala Lys Val Val Leu Thr Arg Glu Asp Val
180 185 190
His Ser Gln Val Ile Cys Glu Val Ala His Val Thr Leu Gln Gly Asp
195 200 205
Pro Leu Arg Gly Thr Ala Asn Leu Ser Glu Thr Ile Arg Val Pro Pro
210 215 220
Thr Leu Glu Val Thr Gln Gln Pro Val Arg Ala Glu Asn Gln Val Asn
225 230 235 240
Val Thr Cys Gln Val Arg Lys Phe Tyr Pro Gln Arg Leu Gln Leu Thr
245 250 255
Trp Leu Glu Asn Gly Asn Val Ser Arg Thr Glu Thr Ala Ser Thr Val
260 265 270
Thr Glu Asn Lys Asp Gly Thr Tyr Asn Trp Met Ser Trp Leu Leu Val
275 280 285
Asn Val Ser Ala His Arg Asp Asp Val Lys Leu Thr Cys Gln Val Glu
290 295 300
His Asp Gly Gln Pro Ala Val Ser Lys Ser His Asp Leu Lys Val Ser
305 310 315 320
Ala His Pro Lys Glu Gln Gly Ser Asn Thr Ala Ala Glu Asn Thr Gly
325 330 335
Ser Asn Glu Arg Asn Ile Tyr Gly Ser Ala Ala Ser Pro Arg Leu Arg
340 345 350
Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu
355 360 365
Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile
370 375 380
Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser
385 390 395 400
Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val Val
405 410 415
Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg
420 425 430
Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His Leu
435 440 445
Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val
450 455 460
Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe
465 470 475 480
Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val His
485 490 495
Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly
500 505 510
Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala Gly
515 520 525
Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu His His His His His His
530 535 540
<210> 15
<211> 322
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 不带有His标签的DSP107_var3
<400> 15
Glu Glu Glu Leu Gln Val Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Leu Val Ala
1 5 10 15
Ala Gly Glu Thr Ala Thr Leu Arg Cys Thr Ala Thr Ser Leu Ile Pro
20 25 30
Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Gly Arg Glu Leu
35 40 45
Ile Tyr Asn Gln Lys Glu Gly His Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser
50 55 60
Asp Leu Thr Lys Arg Asn Asn Met Asp Phe Ser Ile Arg Ile Gly Asn
65 70 75 80
Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys Phe Arg Lys
85 90 95
Gly Ser Pro Asp Asp Val Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu
100 105 110
Ser Val Arg Ala Gly Ala Cys Pro Trp Ala Val Ser Gly Ala Arg Ala
115 120 125
Ser Pro Gly Ser Ala Ala Ser Pro Arg Leu Arg Glu Gly Pro Glu Leu
130 135 140
Ser Pro Asp Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe
145 150 155 160
Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser
165 170 175
Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu
180 185 190
Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val
195 200 205
Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu
210 215 220
Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser
225 230 235 240
Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala
245 250 255
Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu
260 265 270
His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala
275 280 285
Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly
290 295 300
Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg
305 310 315 320
Ser Glu
<210> 16
<211> 316
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 不带有His标签的DSP107_var3.1
<400> 16
Glu Glu Glu Leu Gln Val Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Leu Val Ala
1 5 10 15
Ala Gly Glu Thr Ala Thr Leu Arg Cys Thr Ala Thr Ser Leu Ile Pro
20 25 30
Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Gly Arg Glu Leu
35 40 45
Ile Tyr Asn Gln Lys Glu Gly His Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser
50 55 60
Asp Leu Thr Lys Arg Asn Asn Met Asp Phe Ser Ile Arg Ile Gly Asn
65 70 75 80
Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys Phe Arg Lys
85 90 95
Gly Ser Pro Asp Asp Val Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu
100 105 110
Ser Val Arg Ala Gly Ser Gly Ala Arg Ala Ser Pro Gly Ser Ala Ala
115 120 125
Ser Pro Arg Leu Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro Ala
130 135 140
Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln
145 150 155 160
Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly
165 170 175
Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr
180 185 190
Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln
195 200 205
Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser
210 215 220
Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala
225 230 235 240
Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn
245 250 255
Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln
260 265 270
Arg Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp
275 280 285
Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro
290 295 300
Glu Ile Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu
305 310 315
<210> 17
<211> 322
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 带有His标签的DSP107_var3.1
<400> 17
Glu Glu Glu Leu Gln Val Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Leu Val Ala
1 5 10 15
Ala Gly Glu Thr Ala Thr Leu Arg Cys Thr Ala Thr Ser Leu Ile Pro
20 25 30
Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Gly Arg Glu Leu
35 40 45
Ile Tyr Asn Gln Lys Glu Gly His Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser
50 55 60
Asp Leu Thr Lys Arg Asn Asn Met Asp Phe Ser Ile Arg Ile Gly Asn
65 70 75 80
Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys Phe Arg Lys
85 90 95
Gly Ser Pro Asp Asp Val Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu
100 105 110
Ser Val Arg Ala Gly Ser Gly Ala Arg Ala Ser Pro Gly Ser Ala Ala
115 120 125
Ser Pro Arg Leu Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro Ala
130 135 140
Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln
145 150 155 160
Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly
165 170 175
Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr
180 185 190
Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln
195 200 205
Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser
210 215 220
Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala
225 230 235 240
Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn
245 250 255
Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln
260 265 270
Arg Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp
275 280 285
Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro
290 295 300
Glu Ile Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu His His His His
305 310 315 320
His His
<210> 18
<211> 543
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 不带有His标签的DSP107_Var1Mut
<400> 18
Glu Glu Glu Ile Gln Val Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Leu Val Ala
1 5 10 15
Ala Gly Glu Thr Ala Thr Leu Arg Cys Thr Ile Thr Ser Leu Ile Pro
20 25 30
Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Gly Arg Val Leu
35 40 45
Ile Tyr Asn Gln Lys Glu Gly His Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser
50 55 60
Asp Leu Thr Lys Arg Asn Asn Met Asp Phe Ser Ile Arg Ile Gly Asn
65 70 75 80
Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Ile Lys Phe Arg Lys
85 90 95
Gly Ser Pro Asp Asp Val Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu
100 105 110
Ser Val Arg Ala Lys Pro Ser Ala Pro Val Val Ser Gly Pro Ala Ala
115 120 125
Arg Ala Thr Pro Gln His Thr Val Ser Phe Thr Cys Glu Ser His Gly
130 135 140
Phe Ser Pro Arg Asp Ile Thr Leu Lys Trp Phe Lys Asn Gly Asn Glu
145 150 155 160
Leu Ser Asp Phe Gln Thr Asn Val Asp Pro Val Gly Glu Ser Val Ser
165 170 175
Tyr Ser Ile His Ser Thr Ala Lys Val Val Leu Thr Arg Glu Asp Val
180 185 190
His Ser Gln Val Ile Cys Glu Val Ala His Val Thr Leu Gln Gly Asp
195 200 205
Pro Leu Arg Gly Thr Ala Asn Leu Ser Glu Thr Ile Arg Val Pro Pro
210 215 220
Thr Leu Glu Val Thr Gln Gln Pro Val Arg Ala Glu Asn Gln Val Asn
225 230 235 240
Val Thr Cys Gln Val Arg Lys Phe Tyr Pro Gln Arg Leu Gln Leu Thr
245 250 255
Trp Leu Glu Asn Gly Asn Val Ser Arg Thr Glu Thr Ala Ser Thr Val
260 265 270
Thr Glu Asn Lys Asp Gly Thr Tyr Asn Trp Met Ser Trp Leu Leu Val
275 280 285
Asn Val Ser Ala His Arg Asp Asp Val Lys Leu Thr Cys Gln Val Glu
290 295 300
His Asp Gly Gln Pro Ala Val Ser Lys Ser His Asp Leu Lys Val Ser
305 310 315 320
Ala His Pro Lys Glu Gln Gly Ser Asn Thr Ala Ala Glu Asn Thr Gly
325 330 335
Ser Asn Glu Arg Asn Ile Tyr Gly Ser Gly Ala Arg Ala Ser Pro Gly
340 345 350
Ser Ala Ala Ser Pro Arg Leu Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp
355 360 365
Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu
370 375 380
Val Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser
385 390 395 400
Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys
405 410 415
Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val
420 425 430
Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly
435 440 445
Ser Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly
450 455 460
Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu
465 470 475 480
Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser
485 490 495
Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg
500 505 510
His Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg
515 520 525
Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu
530 535 540
<210> 19
<211> 535
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 不带有His标签的DSP107_Var2Mut
<400> 19
Glu Glu Glu Ile Gln Val Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Leu Val Ala
1 5 10 15
Ala Gly Glu Thr Ala Thr Leu Arg Cys Thr Ile Thr Ser Leu Ile Pro
20 25 30
Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Gly Arg Val Leu
35 40 45
Ile Tyr Asn Gln Lys Glu Gly His Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser
50 55 60
Asp Leu Thr Lys Arg Asn Asn Met Asp Phe Ser Ile Arg Ile Gly Asn
65 70 75 80
Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Ile Lys Phe Arg Lys
85 90 95
Gly Ser Pro Asp Asp Val Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu
100 105 110
Ser Val Arg Ala Lys Pro Ser Ala Pro Val Val Ser Gly Pro Ala Ala
115 120 125
Arg Ala Thr Pro Gln His Thr Val Ser Phe Thr Cys Glu Ser His Gly
130 135 140
Phe Ser Pro Arg Asp Ile Thr Leu Lys Trp Phe Lys Asn Gly Asn Glu
145 150 155 160
Leu Ser Asp Phe Gln Thr Asn Val Asp Pro Val Gly Glu Ser Val Ser
165 170 175
Tyr Ser Ile His Ser Thr Ala Lys Val Val Leu Thr Arg Glu Asp Val
180 185 190
His Ser Gln Val Ile Cys Glu Val Ala His Val Thr Leu Gln Gly Asp
195 200 205
Pro Leu Arg Gly Thr Ala Asn Leu Ser Glu Thr Ile Arg Val Pro Pro
210 215 220
Thr Leu Glu Val Thr Gln Gln Pro Val Arg Ala Glu Asn Gln Val Asn
225 230 235 240
Val Thr Cys Gln Val Arg Lys Phe Tyr Pro Gln Arg Leu Gln Leu Thr
245 250 255
Trp Leu Glu Asn Gly Asn Val Ser Arg Thr Glu Thr Ala Ser Thr Val
260 265 270
Thr Glu Asn Lys Asp Gly Thr Tyr Asn Trp Met Ser Trp Leu Leu Val
275 280 285
Asn Val Ser Ala His Arg Asp Asp Val Lys Leu Thr Cys Gln Val Glu
290 295 300
His Asp Gly Gln Pro Ala Val Ser Lys Ser His Asp Leu Lys Val Ser
305 310 315 320
Ala His Pro Lys Glu Gln Gly Ser Asn Thr Ala Ala Glu Asn Thr Gly
325 330 335
Ser Asn Glu Arg Asn Ile Tyr Gly Ser Ala Ala Ser Pro Arg Leu Arg
340 345 350
Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu
355 360 365
Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile
370 375 380
Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser
385 390 395 400
Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val Val
405 410 415
Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg
420 425 430
Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His Leu
435 440 445
Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val
450 455 460
Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe
465 470 475 480
Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val His
485 490 495
Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly
500 505 510
Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala Gly
515 520 525
Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu
530 535
<210> 20
<211> 322
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 不带有His标签的DSP107_Var3Mut
<400> 20
Glu Glu Glu Ile Gln Val Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Leu Val Ala
1 5 10 15
Ala Gly Glu Thr Ala Thr Leu Arg Cys Thr Ile Thr Ser Leu Ile Pro
20 25 30
Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Gly Arg Val Leu
35 40 45
Ile Tyr Asn Gln Lys Glu Gly His Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser
50 55 60
Asp Leu Thr Lys Arg Asn Asn Met Asp Phe Ser Ile Arg Ile Gly Asn
65 70 75 80
Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Ile Lys Phe Arg Lys
85 90 95
Gly Ser Pro Asp Asp Val Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu
100 105 110
Ser Val Arg Ala Gly Ala Cys Pro Trp Ala Val Ser Gly Ala Arg Ala
115 120 125
Ser Pro Gly Ser Ala Ala Ser Pro Arg Leu Arg Glu Gly Pro Glu Leu
130 135 140
Ser Pro Asp Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe
145 150 155 160
Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser
165 170 175
Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu
180 185 190
Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val
195 200 205
Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu
210 215 220
Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser
225 230 235 240
Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala
245 250 255
Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu
260 265 270
His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala
275 280 285
Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly
290 295 300
Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg
305 310 315 320
Ser Glu
<210> 21
<211> 315
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 不带有His标签的DSP170_Var3.1Mut
<400> 21
Glu Glu Glu Ile Gln Val Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Leu Val Ala
1 5 10 15
Ala Gly Glu Thr Ala Thr Leu Arg Cys Thr Ile Thr Ser Leu Ile Pro
20 25 30
Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Gly Arg Val Leu
35 40 45
Ile Tyr Asn Gln Lys Glu Gly His Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser
50 55 60
Asp Leu Thr Lys Arg Asn Asn Met Asp Phe Ser Ile Arg Ile Gly Asn
65 70 75 80
Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Ile Lys Phe Arg Lys
85 90 95
Gly Ser Pro Asp Asp Val Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu
100 105 110
Ser Val Arg Ala Ser Gly Ala Arg Ala Ser Pro Gly Ser Ala Ala Ser
115 120 125
Pro Arg Leu Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro Ala Gly
130 135 140
Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn
145 150 155 160
Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu
165 170 175
Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys
180 185 190
Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu
195 200 205
Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu
210 215 220
Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu
225 230 235 240
Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser
245 250 255
Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg
260 265 270
Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln
275 280 285
Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu
290 295 300
Ile Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu
305 310 315
<210> 22
<211> 199
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 4-1BBL片段的199个氨基酸序列
<400> 22
Ser Gly Ala Arg Ala Ser Pro Gly Ser Ala Ala Ser Pro Arg Leu Arg
1 5 10 15
Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu
20 25 30
Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile
35 40 45
Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser
50 55 60
Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val Val
65 70 75 80
Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg
85 90 95
Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His Leu
100 105 110
Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val
115 120 125
Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe
130 135 140
Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val His
145 150 155 160
Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly
165 170 175
Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala Gly
180 185 190
Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu
195
<210> 23
<211> 191
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 4-1BBL片段的191个氨基酸序列
<400> 23
Ser Ala Ala Ser Pro Arg Leu Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp
1 5 10 15
Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu
20 25 30
Val Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser
35 40 45
Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys
50 55 60
Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val
65 70 75 80
Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly
85 90 95
Ser Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly
100 105 110
Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu
115 120 125
Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser
130 135 140
Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg
145 150 155 160
His Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg
165 170 175
Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu
180 185 190
<210> 24
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SIRPa片段的116个氨基酸序列
<400> 24
Glu Glu Glu Leu Gln Val Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Leu Val Ala
1 5 10 15
Ala Gly Glu Thr Ala Thr Leu Arg Cys Thr Ala Thr Ser Leu Ile Pro
20 25 30
Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Gly Arg Glu Leu
35 40 45
Ile Tyr Asn Gln Lys Glu Gly His Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser
50 55 60
Asp Leu Thr Lys Arg Asn Asn Met Asp Phe Ser Ile Arg Ile Gly Asn
65 70 75 80
Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys Phe Arg Lys
85 90 95
Gly Ser Pro Asp Asp Val Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu
100 105 110
Ser Val Arg Ala
115
<210> 25
<211> 343
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 带有四个点突变的SIRPa的343个氨基酸序列
<400> 25
Glu Glu Glu Ile Gln Val Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Leu Val Ala
1 5 10 15
Ala Gly Glu Thr Ala Thr Leu Arg Cys Thr Ile Thr Ser Leu Ile Pro
20 25 30
Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Gly Arg Val Leu
35 40 45
Ile Tyr Asn Gln Lys Glu Gly His Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser
50 55 60
Asp Leu Thr Lys Arg Asn Asn Met Asp Phe Ser Ile Arg Ile Gly Asn
65 70 75 80
Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Ile Lys Phe Arg Lys
85 90 95
Gly Ser Pro Asp Asp Val Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu
100 105 110
Ser Val Arg Ala Lys Pro Ser Ala Pro Val Val Ser Gly Pro Ala Ala
115 120 125
Arg Ala Thr Pro Gln His Thr Val Ser Phe Thr Cys Glu Ser His Gly
130 135 140
Phe Ser Pro Arg Asp Ile Thr Leu Lys Trp Phe Lys Asn Gly Asn Glu
145 150 155 160
Leu Ser Asp Phe Gln Thr Asn Val Asp Pro Val Gly Glu Ser Val Ser
165 170 175
Tyr Ser Ile His Ser Thr Ala Lys Val Val Leu Thr Arg Glu Asp Val
180 185 190
His Ser Gln Val Ile Cys Glu Val Ala His Val Thr Leu Gln Gly Asp
195 200 205
Pro Leu Arg Gly Thr Ala Asn Leu Ser Glu Thr Ile Arg Val Pro Pro
210 215 220
Thr Leu Glu Val Thr Gln Gln Pro Val Arg Ala Glu Asn Gln Val Asn
225 230 235 240
Val Thr Cys Gln Val Arg Lys Phe Tyr Pro Gln Arg Leu Gln Leu Thr
245 250 255
Trp Leu Glu Asn Gly Asn Val Ser Arg Thr Glu Thr Ala Ser Thr Val
260 265 270
Thr Glu Asn Lys Asp Gly Thr Tyr Asn Trp Met Ser Trp Leu Leu Val
275 280 285
Asn Val Ser Ala His Arg Asp Asp Val Lys Leu Thr Cys Gln Val Glu
290 295 300
His Asp Gly Gln Pro Ala Val Ser Lys Ser His Asp Leu Lys Val Ser
305 310 315 320
Ala His Pro Lys Glu Gln Gly Ser Asn Thr Ala Ala Glu Asn Thr Gly
325 330 335
Ser Asn Glu Arg Asn Ile Tyr
340
<210> 26
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 带有四个点突变的SIRPa的116个氨基酸序列
<400> 26
Glu Glu Glu Ile Gln Val Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Leu Val Ala
1 5 10 15
Ala Gly Glu Thr Ala Thr Leu Arg Cys Thr Ile Thr Ser Leu Ile Pro
20 25 30
Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Gly Arg Val Leu
35 40 45
Ile Tyr Asn Gln Lys Glu Gly His Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser
50 55 60
Asp Leu Thr Lys Arg Asn Asn Met Asp Phe Ser Ile Arg Ile Gly Asn
65 70 75 80
Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Ile Lys Phe Arg Lys
85 90 95
Gly Ser Pro Asp Asp Val Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu
100 105 110
Ser Val Arg Ala
115
<210> 27
<211> 197
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 4-1BBL片段的197个氨基酸序列
<400> 27
Ala Arg Ala Ser Pro Gly Ser Ala Ala Ser Pro Arg Leu Arg Glu Gly
1 5 10 15
Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln
20 25 30
Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly
35 40 45
Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr
50 55 60
Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys
65 70 75 80
Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val
85 90 95
Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro
100 105 110
Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu
115 120 125
Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly
130 135 140
Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu His
145 150 155 160
Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr
165 170 175
Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu Pro
180 185 190
Ser Pro Arg Ser Glu
195
<210> 28
<211> 185
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 4-1BBL片段的185个氨基酸序列
<400> 28
Leu Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro Ala Gly Leu Leu
1 5 10 15
Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val Leu
20 25 30
Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly
35 40 45
Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu
50 55 60
Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu
65 70 75 80
Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu
85 90 95
His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu
100 105 110
Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe
115 120 125
Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly
130 135 140
Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu Thr
145 150 155 160
Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu Ile Pro
165 170 175
Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu
180 185
<210> 29
<211> 504
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SIRP的全长的氨基酸序列
<400> 29
Met Glu Pro Ala Gly Pro Ala Pro Gly Arg Leu Gly Pro Leu Leu Cys
1 5 10 15
Leu Leu Leu Ala Ala Ser Cys Ala Trp Ser Gly Val Ala Gly Glu Glu
20 25 30
Glu Leu Gln Val Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Leu Val Ala Ala Gly
35 40 45
Glu Thr Ala Thr Leu Arg Cys Thr Ala Thr Ser Leu Ile Pro Val Gly
50 55 60
Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Gly Arg Glu Leu Ile Tyr
65 70 75 80
Asn Gln Lys Glu Gly His Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser Asp Leu
85 90 95
Thr Lys Arg Asn Asn Met Asp Phe Ser Ile Arg Ile Gly Asn Ile Thr
100 105 110
Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys Phe Arg Lys Gly Ser
115 120 125
Pro Asp Asp Val Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu Ser Val
130 135 140
Arg Ala Lys Pro Ser Ala Pro Val Val Ser Gly Pro Ala Ala Arg Ala
145 150 155 160
Thr Pro Gln His Thr Val Ser Phe Thr Cys Glu Ser His Gly Phe Ser
165 170 175
Pro Arg Asp Ile Thr Leu Lys Trp Phe Lys Asn Gly Asn Glu Leu Ser
180 185 190
Asp Phe Gln Thr Asn Val Asp Pro Val Gly Glu Ser Val Ser Tyr Ser
195 200 205
Ile His Ser Thr Ala Lys Val Val Leu Thr Arg Glu Asp Val His Ser
210 215 220
Gln Val Ile Cys Glu Val Ala His Val Thr Leu Gln Gly Asp Pro Leu
225 230 235 240
Arg Gly Thr Ala Asn Leu Ser Glu Thr Ile Arg Val Pro Pro Thr Leu
245 250 255
Glu Val Thr Gln Gln Pro Val Arg Ala Glu Asn Gln Val Asn Val Thr
260 265 270
Cys Gln Val Arg Lys Phe Tyr Pro Gln Arg Leu Gln Leu Thr Trp Leu
275 280 285
Glu Asn Gly Asn Val Ser Arg Thr Glu Thr Ala Ser Thr Val Thr Glu
290 295 300
Asn Lys Asp Gly Thr Tyr Asn Trp Met Ser Trp Leu Leu Val Asn Val
305 310 315 320
Ser Ala His Arg Asp Asp Val Lys Leu Thr Cys Gln Val Glu His Asp
325 330 335
Gly Gln Pro Ala Val Ser Lys Ser His Asp Leu Lys Val Ser Ala His
340 345 350
Pro Lys Glu Gln Gly Ser Asn Thr Ala Ala Glu Asn Thr Gly Ser Asn
355 360 365
Glu Arg Asn Ile Tyr Ile Val Val Gly Val Val Cys Thr Leu Leu Val
370 375 380
Ala Leu Leu Met Ala Ala Leu Tyr Leu Val Arg Ile Arg Gln Lys Lys
385 390 395 400
Ala Gln Gly Ser Thr Ser Ser Thr Arg Leu His Glu Pro Glu Lys Asn
405 410 415
Ala Arg Glu Ile Thr Gln Asp Thr Asn Asp Ile Thr Tyr Ala Asp Leu
420 425 430
Asn Leu Pro Lys Gly Lys Lys Pro Ala Pro Gln Ala Ala Glu Pro Asn
435 440 445
Asn His Thr Glu Tyr Ala Ser Ile Gln Thr Ser Pro Gln Pro Ala Ser
450 455 460
Glu Asp Thr Leu Thr Tyr Ala Asp Leu Asp Met Val His Leu Asn Arg
465 470 475 480
Thr Pro Lys Gln Pro Ala Pro Lys Pro Glu Pro Ser Phe Ser Glu Tyr
485 490 495
Ala Ser Val Gln Val Pro Arg Lys
500
<210> 30
<211> 1512
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SIRP的全长的核酸序列
<400> 30
atggagcccg ccggcccggc ccccggccgc ctcgggccgc tgctctgcct gctgctcgcc 60
gcgtcctgcg cctggtcagg agtggcgggt gaggaggagc tgcaggtgat tcagcctgac 120
aagtccgtat cagttgcagc tggagagtcg gccattctgc actgcactgt gacctccctg 180
atccctgtgg ggcccatcca gtggttcaga ggagctggac cagcccggga attaatctac 240
aatcaaaaag aaggccactt cccccgggta acaactgttt cagagtccac aaagagagaa 300
aacatggact tttccatcag catcagtaac atcaccccag cagatgccgg cacctactac 360
tgtgtgaagt tccggaaagg gagccctgac acggagttta agtctggagc aggcactgag 420
ctgtctgtgc gtgccaaacc ctctgccccc gtggtatcgg gccctgcggc gagggccaca 480
cctcagcaca cagtgagctt cacctgcgag tcccacggct tctcacccag agacatcacc 540
ctgaaatggt tcaaaaatgg gaatgagctc tcagacttcc agaccaacgt ggaccccgta 600
ggagagagcg tgtcctacag catccacagc acagccaagg tggtgctgac ccgcgaggac 660
gttcactctc aagtcatctg cgaggtggcc cacgtcacct tgcaggggga ccctcttcgt 720
gggactgcca acttgtctga gaccatccga gttccaccca ccttggaggt tactcaacag 780
cccgtgaggg cagagaacca ggtgaatgtc acctgccagg tgaggaagtt ctacccccag 840
agactacagc tgacctggtt ggagaatgga aacgtgtccc ggacagaaac ggcctcaacc 900
gttacagaga acaaggatgg tacctacaac tggatgagct ggctcctggt gaatgtatct 960
gcccacaggg atgatgtgaa gctcacctgc caggtggagc atgacgggca gccagcggtc 1020
agcaaaagcc atgacctgaa ggtctcagcc cacccgaagg agcagggctc aaataccgcc 1080
gctgagaaca ctggatctaa tgaacggaac atctatattg tggtgggtgt ggtgtgcacc 1140
ttgctggtgg ccctactgat ggcggccctc tacctcgtcc gaatcagaca gaagaaagcc 1200
cagggctcca cttcttctac aaggttgcat gagcccgaga agaatgccag agaaataaca 1260
caggacacaa atgatatcac atatgcagac ctgaacctgc ccaaggggaa gaagcctgct 1320
ccccaggctg cggagcccaa caaccacacg gagtatgcca gcattcagac cagcccgcag 1380
cccgcgtcgg aggacaccct cacctatgct gacctggaca tggtccacct caaccggacc 1440
cccaagcagc cggcccccaa gcctgagccg tccttctcag agtacgccag cgtccaggtc 1500
ccgaggaagt ga 1512
<210> 31
<211> 1029
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码SEQ ID NO: 2的核酸序列
<400> 31
gaggaggagc tgcaggtgat tcagcctgac aagtccgtat cagttgcagc tggagagtcg 60
gccattctgc actgcactgt gacctccctg atccctgtgg ggcccatcca gtggttcaga 120
ggagctggac cagcccggga attaatctac aatcaaaaag aaggccactt cccccgggta 180
acaactgttt cagagtccac aaagagagaa aacatggact tttccatcag catcagtaac 240
atcaccccag cagatgccgg cacctactac tgtgtgaagt tccggaaagg gagccctgac 300
acggagttta agtctggagc aggcactgag ctgtctgtgc gtgccaaacc ctctgccccc 360
gtggtatcgg gccctgcggc gagggccaca cctcagcaca cagtgagctt cacctgcgag 420
tcccacggct tctcacccag agacatcacc ctgaaatggt tcaaaaatgg gaatgagctc 480
tcagacttcc agaccaacgt ggaccccgta ggagagagcg tgtcctacag catccacagc 540
acagccaagg tggtgctgac ccgcgaggac gttcactctc aagtcatctg cgaggtggcc 600
cacgtcacct tgcaggggga ccctcttcgt gggactgcca acttgtctga gaccatccga 660
gttccaccca ccttggaggt tactcaacag cccgtgaggg cagagaacca ggtgaatgtc 720
acctgccagg tgaggaagtt ctacccccag agactacagc tgacctggtt ggagaatgga 780
aacgtgtccc ggacagaaac ggcctcaacc gttacagaga acaaggatgg tacctacaac 840
tggatgagct ggctcctggt gaatgtatct gcccacaggg atgatgtgaa gctcacctgc 900
caggtggagc atgacgggca gccagcggtc agcaaaagcc atgacctgaa ggtctcagcc 960
cacccgaagg agcagggctc aaataccgcc gctgagaaca ctggatctaa tgaacggaac 1020
atctatatt 1029
<210> 32
<211> 227
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO: 2的删除部份以生成116个氨基酸变异
<400> 32
Lys Pro Ser Ala Pro Val Val Ser Gly Pro Ala Ala Arg Ala Thr Pro
1 5 10 15
Gln His Thr Val Ser Phe Thr Cys Glu Ser His Gly Phe Ser Pro Arg
20 25 30
Asp Ile Thr Leu Lys Trp Phe Lys Asn Gly Asn Glu Leu Ser Asp Phe
35 40 45
Gln Thr Asn Val Asp Pro Val Gly Glu Ser Val Ser Tyr Ser Ile His
50 55 60
Ser Thr Ala Lys Val Val Leu Thr Arg Glu Asp Val His Ser Gln Val
65 70 75 80
Ile Cys Glu Val Ala His Val Thr Leu Gln Gly Asp Pro Leu Arg Gly
85 90 95
Thr Ala Asn Leu Ser Glu Thr Ile Arg Val Pro Pro Thr Leu Glu Val
100 105 110
Thr Gln Gln Pro Val Arg Ala Glu Asn Gln Val Asn Val Thr Cys Gln
115 120 125
Val Arg Lys Phe Tyr Pro Gln Arg Leu Gln Leu Thr Trp Leu Glu Asn
130 135 140
Gly Asn Val Ser Arg Thr Glu Thr Ala Ser Thr Val Thr Glu Asn Lys
145 150 155 160
Asp Gly Thr Tyr Asn Trp Met Ser Trp Leu Leu Val Asn Val Ser Ala
165 170 175
His Arg Asp Asp Val Lys Leu Thr Cys Gln Val Glu His Asp Gly Gln
180 185 190
Pro Ala Val Ser Lys Ser His Asp Leu Lys Val Ser Ala His Pro Lys
195 200 205
Glu Gln Gly Ser Asn Thr Ala Ala Glu Asn Thr Gly Ser Asn Glu Arg
210 215 220
Asn Ile Tyr
225
<210> 33
<211> 348
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码SEQ ID NO: 24的核酸序列
<400> 33
gaagaggaac tgcaagtgat ccagcctgac aagtccgtgc tggtggctgc tggcgaaacc 60
gccacactga gatgtaccgc cacctctctg atccctgtgg gccctatcca gtggtttaga 120
ggcgctggac ctggcagaga gctgatctac aaccagaaag agggccactt tcctagagtg 180
accaccgtgt ccgacctgac caagcggaac aacatggact tctccatccg gatcggcaac 240
atcacccctg ctgatgccgg cacctactac tgcgtgaagt tccggaaggg ctcccctgac 300
gacgtcgagt ttaaatccgg cgctggcacc gaactgtccg tgcgagct 348
<210> 34
<211> 348
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码SEQ ID NO: 26的核酸序列
<400> 34
gaagaggaaa tccaagtgat ccagcctgac aagtccgtgc tggtggctgc tggcgaaacc 60
gccacactga gatgtaccat cacctctctg atccctgtgg gccctatcca gtggtttaga 120
ggcgctggac ctggcagagt gctgatctac aaccagaaag agggccactt tcctagagtg 180
accaccgtgt ccgacctgac caagcggaac aacatggact tctccatccg gatcggcaac 240
atcacccctg ctgatgccgg cacctactac tgcatcaagt tccggaaggg ctcccctgac 300
gacgtcgagt ttaaatccgg cgctggcacc gaactgtccg tgcgagct 348
<210> 35
<211> 1029
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码SEQ ID NO: 25的核酸序列
<400> 35
gaagaggaaa tccaagtgat ccagcctgac aagtccgtgc tggtggctgc tggcgaaacc 60
gccacactga gatgtaccat cacctctctg atccctgtgg gccctatcca gtggtttaga 120
ggcgctggac ctggcagagt gctgatctac aaccagaaag agggccactt tcctagagtg 180
accaccgtgt ccgacctgac caagcggaac aacatggact tctccatccg gatcggcaac 240
atcacccctg ctgatgccgg cacctactac tgcatcaagt tccggaaggg ctcccctgac 300
gacgtcgagt ttaaatccgg cgctggcacc gaactgtccg tgcgagctaa accttctgct 360
cccgtggtgt ctggccctgc cgctagagct acacctcagc acaccgtgtc ttttacctgc 420
gagtcccacg gcttcagccc tagagacatc accctgaagt ggttcaagaa cggcaacgag 480
ctgtccgact tccagaccaa cgtggaccct gtgggagagt ccgtgtccta ctccatccac 540
tctaccgcca aggtggtgct gacccgagag gacgtgcaca gccaagtgat ctgtgaagtg 600
gcccacgtga ccctccaggg cgatcctttg agaggcaccg ccaacctgtc cgagacaatc 660
agagtgcctc ctacactgga agtgacccag cagcctgtgc gggccgagaa tcaagtgaac 720
gtgacctgcc aagtgcggaa gttctaccct cagagactgc agctgacctg gctggaaaac 780
ggcaatgtgt ccagaaccga gacagcctcc accgtgaccg agaacaagga tggcacctac 840
aattggatgt cctggctgct cgtgaacgtg tccgctcaca gagatgacgt gaagctgaca 900
tgccaggtgg aacacgatgg ccagcctgcc gtgtctaagt cccacgacct gaaagtgtct 960
gctcacccca aagagcaggg ctccaatacc gccgctgaga acaccggctc caacgagaga 1020
aacatctac 1029
<210> 36
<211> 254
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 4-1BBL的全长的氨基酸序列
<400> 36
Met Glu Tyr Ala Ser Asp Ala Ser Leu Asp Pro Glu Ala Pro Trp Pro
1 5 10 15
Pro Ala Pro Arg Ala Arg Ala Cys Arg Val Leu Pro Trp Ala Leu Val
20 25 30
Ala Gly Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ala Ala Ala Cys Ala Val Phe
35 40 45
Leu Ala Cys Pro Trp Ala Val Ser Gly Ala Arg Ala Ser Pro Gly Ser
50 55 60
Ala Ala Ser Pro Arg Leu Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp
65 70 75 80
Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val
85 90 95
Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp
100 105 110
Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu
115 120 125
Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe
130 135 140
Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser
145 150 155 160
Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala
165 170 175
Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala
180 185 190
Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala
195 200 205
Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His
210 215 220
Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val
225 230 235 240
Thr Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu
245 250
<210> 37
<211> 765
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 4-1BBL的全长的核酸序列
<400> 37
atggaatacg cctctgacgc ttcactggac cccgaagccc cgtggcctcc cgcgccccgc 60
gctcgcgcct gccgcgtact gccttgggcc ctggtcgcgg ggctgctgct gctgctgctg 120
ctcgctgccg cctgcgccgt cttcctcgcc tgcccctggg ccgtgtccgg ggctcgcgcc 180
tcgcccggct ccgcggccag cccgagactc cgcgagggtc ccgagctttc gcccgacgat 240
cccgccggcc tcttggacct gcggcagggc atgtttgcgc agctggtggc ccaaaatgtt 300
ctgctgatcg atgggcccct gagctggtac agtgacccag gcctggcagg cgtgtccctg 360
acggggggcc tgagctacaa agaggacacg aaggagctgg tggtggccaa ggctggagtc 420
tactatgtct tctttcaact agagctgcgg cgcgtggtgg ccggcgaggg ctcaggctcc 480
gtttcacttg cgctgcacct gcagccactg cgctctgctg ctggggccgc cgccctggct 540
ttgaccgtgg acctgccacc cgcctcctcc gaggctcgga actcggcctt cggtttccag 600
ggccgcttgc tgcacctgag tgccggccag cgcctgggcg tccatcttca cactgaggcc 660
agggcacgcc atgcctggca gcttacccag ggcgccacag tcttgggact cttccgggtg 720
acccccgaaa tcccagccgg actcccttca ccgaggtcgg aataa 765
<210> 38
<211> 615
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码SEQ ID NO: 3的核酸序列
<400> 38
gcctgcccct gggccgtgtc cggggctcgc gcctcgcccg gctccgcggc cagcccgaga 60
ctccgcgagg gtcccgagct ttcgcccgac gatcccgccg gcctcttgga cctgcggcag 120
ggcatgtttg cgcagctggt ggcccaaaat gttctgctga tcgatgggcc cctgagctgg 180
tacagtgacc caggcctggc aggcgtgtcc ctgacggggg gcctgagcta caaagaggac 240
acgaaggagc tggtggtggc caaggctgga gtctactatg tcttctttca actagagctg 300
cggcgcgtgg tggccggcga gggctcaggc tccgtttcac ttgcgctgca cctgcagcca 360
ctgcgctctg ctgctggggc cgccgccctg gctttgaccg tggacctgcc acccgcctcc 420
tccgaggctc ggaactcggc cttcggtttc cagggccgct tgctgcacct gagtgccggc 480
cagcgcctgg gcgtccatct tcacactgag gccagggcac gccatgcctg gcagcttacc 540
cagggcgcca cagtcttggg actcttccgg gtgacccccg aaatcccagc cggactccct 600
tcaccgaggt cggaa 615
<210> 39
<211> 624
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码SEQ ID NO: 22的核酸序列
<400> 39
atctacggcg cctgtccttg ggctgtgtct ggcgctagag catctcctgg ctctgctgcc 60
tctcctagac tgagagaggg acctgagctg tctcctgatg atcctgctgg cctgctggat 120
ctgagacagg gcatgtttgc tcagctggtg gcccagaacg tgctgctgat tgatggccct 180
ctgtcctggt actctgatcc tggattggct ggcgtgtccc tgactggcgg cctgtcttac 240
aaagaggaca ccaaagaact ggtggtggcc aaggccggcg tgtactacgt gttctttcag 300
ctggaactgc ggagagtggt ggccggcgaa ggatctggat ctgtgtctct ggcactgcat 360
ctgcagcccc tgagatctgc tgcaggcgct gctgctctgg ctctgacagt tgatctgcct 420
cctgcctcct ccgaggccag aaactccgcc tttggcttcc aaggcagact gctgcatctg 480
tctgccggcc agagactggg agtccatctg catacagagg ctagagccag gcacgcctgg 540
cagttgacac aaggtgctac agtgctgggc ctgttcagag tgaccccaga gattccagcc 600
ggcctgcctt ctccaagatc cgag 624
<210> 40
<211> 573
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码SEQ ID NO: 23的核酸序列
<400> 40
tctgctgcct ctcctagact gagagaggga cctgagctgt ctcctgatga tcctgctggc 60
ctgctggatc tgagacaggg catgtttgct cagctggtgg cccagaacgt gctgctgatt 120
gatggccctc tgtcctggta ctctgatcct ggattggctg gcgtgtccct gactggcggc 180
ctgtcttaca aagaggacac caaagaactg gtggtggcca aggccggcgt gtactacgtg 240
ttctttcagc tggaactgcg gagagtggtg gccggcgaag gatctggatc tgtgtctctg 300
gcactgcatc tgcagcccct gagatctgct gcaggcgctg ctgctctggc tctgacagtt 360
gatctgcctc ctgcctcctc cgaggccaga aactccgcct ttggcttcca aggcagactg 420
ctgcatctgt ctgccggcca gagactggga gtccatctgc atacagaggc tagagccagg 480
cacgcctggc agttgacaca aggtgctaca gtgctgggcc tgttcagagt gaccccagag 540
attccagccg gcctgccttc tccaagatcc gag 573
<210> 41
<211> 591
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码SEQ ID NO: 27的核酸序列
<400> 41
gctagagcat ctcctggctc tgctgcctct cctagactga gagagggacc tgagctgtct 60
cctgatgatc ctgctggcct gctggatctg agacagggca tgtttgctca gctggtggcc 120
cagaacgtgc tgctgattga tggccctctg tcctggtact ctgatcctgg attggctggc 180
gtgtccctga ctggcggcct gtcttacaaa gaggacacca aagaactggt ggtggccaag 240
gccggcgtgt actacgtgtt ctttcagctg gaactgcgga gagtggtggc cggcgaagga 300
tctggatctg tgtctctggc actgcatctg cagcccctga gatctgctgc aggcgctgct 360
gctctggctc tgacagttga tctgcctcct gcctcctccg aggccagaaa ctccgccttt 420
ggcttccaag gcagactgct gcatctgtct gccggccaga gactgggagt ccatctgcat 480
acagaggcta gagccaggca cgcctggcag ttgacacaag gtgctacagt gctgggcctg 540
ttcagagtga ccccagagat tccagccggc ctgccttctc caagatccga g 591
<210> 42
<211> 555
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码SEQ ID NO: 28的核酸序列
<400> 42
ctgagagagg gacctgagct gtctcctgat gatcctgctg gcctgctgga tctgagacag 60
ggcatgtttg ctcagctggt ggcccagaac gtgctgctga ttgatggccc tctgtcctgg 120
tactctgatc ctggattggc tggcgtgtcc ctgactggcg gcctgtctta caaagaggac 180
accaaagaac tggtggtggc caaggccggc gtgtactacg tgttctttca gctggaactg 240
cggagagtgg tggccggcga aggatctgga tctgtgtctc tggcactgca tctgcagccc 300
ctgagatctg ctgcaggcgc tgctgctctg gctctgacag ttgatctgcc tcctgcctcc 360
tccgaggcca gaaactccgc ctttggcttc caaggcagac tgctgcatct gtctgccggc 420
cagagactgg gagtccatct gcatacagag gctagagcca ggcacgcctg gcagttgaca 480
caaggtgcta cagtgctggg cctgttcaga gtgaccccag agattccagc cggcctgcct 540
tctccaagat ccgag 555
<210> 43
<211> 574
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 带有信号肽及C端带有His标签的原始SIRPa-4-1BBL
<400> 43
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser Glu Glu Glu Leu Gln Val Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val
20 25 30
Leu Val Ala Ala Gly Glu Thr Ala Thr Leu Arg Cys Thr Ala Thr Ser
35 40 45
Leu Ile Pro Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Gly
50 55 60
Arg Glu Leu Ile Tyr Asn Gln Lys Glu Gly His Phe Pro Arg Val Thr
65 70 75 80
Thr Val Ser Asp Leu Thr Lys Arg Asn Asn Met Asp Phe Ser Ile Arg
85 90 95
Ile Gly Asn Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys
100 105 110
Phe Arg Lys Gly Ser Pro Asp Asp Val Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly
115 120 125
Thr Glu Leu Ser Val Arg Ala Lys Pro Ser Ala Pro Val Val Ser Gly
130 135 140
Pro Ala Ala Arg Ala Thr Pro Gln His Thr Val Ser Phe Thr Cys Glu
145 150 155 160
Ser His Gly Phe Ser Pro Arg Asp Ile Thr Leu Lys Trp Phe Lys Asn
165 170 175
Gly Asn Glu Leu Ser Asp Phe Gln Thr Asn Val Asp Pro Val Gly Glu
180 185 190
Ser Val Ser Tyr Ser Ile His Ser Thr Ala Lys Val Val Leu Thr Arg
195 200 205
Glu Asp Val His Ser Gln Val Ile Cys Glu Val Ala His Val Thr Leu
210 215 220
Gln Gly Asp Pro Leu Arg Gly Thr Ala Asn Leu Ser Glu Thr Ile Arg
225 230 235 240
Val Pro Pro Thr Leu Glu Val Thr Gln Gln Pro Val Arg Ala Glu Asn
245 250 255
Gln Val Asn Val Thr Cys Gln Val Arg Lys Phe Tyr Pro Gln Arg Leu
260 265 270
Gln Leu Thr Trp Leu Glu Asn Gly Asn Val Ser Arg Thr Glu Thr Ala
275 280 285
Ser Thr Val Thr Glu Asn Lys Asp Gly Thr Tyr Asn Trp Met Ser Trp
290 295 300
Leu Leu Val Asn Val Ser Ala His Arg Asp Asp Val Lys Leu Thr Cys
305 310 315 320
Gln Val Glu His Asp Gly Gln Pro Ala Val Ser Lys Ser His Asp Leu
325 330 335
Lys Val Ser Ala His Pro Lys Glu Gln Gly Ser Asn Thr Ala Ala Glu
340 345 350
Asn Thr Gly Ser Asn Glu Arg Asn Ile Tyr Gly Ala Cys Pro Trp Ala
355 360 365
Val Ser Gly Ala Arg Ala Ser Pro Gly Ser Ala Ala Ser Pro Arg Leu
370 375 380
Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp
385 390 395 400
Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu
405 410 415
Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val
420 425 430
Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val
435 440 445
Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg
450 455 460
Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His
465 470 475 480
Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr
485 490 495
Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly
500 505 510
Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val
515 520 525
His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu Thr Gln
530 535 540
Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala
545 550 555 560
Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu His His His His His His
565 570
<210> 44
<211> 555
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 带有信号肽及N端带有His标签的原始SIRPa-4-1BBL
<400> 44
His His His His His His Glu Glu Glu Leu Gln Val Ile Gln Pro Asp
1 5 10 15
Lys Ser Val Leu Val Ala Ala Gly Glu Thr Ala Thr Leu Arg Cys Thr
20 25 30
Ala Thr Ser Leu Ile Pro Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala
35 40 45
Gly Pro Gly Arg Glu Leu Ile Tyr Asn Gln Lys Glu Gly His Phe Pro
50 55 60
Arg Val Thr Thr Val Ser Asp Leu Thr Lys Arg Asn Asn Met Asp Phe
65 70 75 80
Ser Ile Arg Ile Gly Asn Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr
85 90 95
Cys Val Lys Phe Arg Lys Gly Ser Pro Asp Asp Val Glu Phe Lys Ser
100 105 110
Gly Ala Gly Thr Glu Leu Ser Val Arg Ala Lys Pro Ser Ala Pro Val
115 120 125
Val Ser Gly Pro Ala Ala Arg Ala Thr Pro Gln His Thr Val Ser Phe
130 135 140
Thr Cys Glu Ser His Gly Phe Ser Pro Arg Asp Ile Thr Leu Lys Trp
145 150 155 160
Phe Lys Asn Gly Asn Glu Leu Ser Asp Phe Gln Thr Asn Val Asp Pro
165 170 175
Val Gly Glu Ser Val Ser Tyr Ser Ile His Ser Thr Ala Lys Val Val
180 185 190
Leu Thr Arg Glu Asp Val His Ser Gln Val Ile Cys Glu Val Ala His
195 200 205
Val Thr Leu Gln Gly Asp Pro Leu Arg Gly Thr Ala Asn Leu Ser Glu
210 215 220
Thr Ile Arg Val Pro Pro Thr Leu Glu Val Thr Gln Gln Pro Val Arg
225 230 235 240
Ala Glu Asn Gln Val Asn Val Thr Cys Gln Val Arg Lys Phe Tyr Pro
245 250 255
Gln Arg Leu Gln Leu Thr Trp Leu Glu Asn Gly Asn Val Ser Arg Thr
260 265 270
Glu Thr Ala Ser Thr Val Thr Glu Asn Lys Asp Gly Thr Tyr Asn Trp
275 280 285
Met Ser Trp Leu Leu Val Asn Val Ser Ala His Arg Asp Asp Val Lys
290 295 300
Leu Thr Cys Gln Val Glu His Asp Gly Gln Pro Ala Val Ser Lys Ser
305 310 315 320
His Asp Leu Lys Val Ser Ala His Pro Lys Glu Gln Gly Ser Asn Thr
325 330 335
Ala Ala Glu Asn Thr Gly Ser Asn Glu Arg Asn Ile Tyr Gly Ala Cys
340 345 350
Pro Trp Ala Val Ser Gly Ala Arg Ala Ser Pro Gly Ser Ala Ala Ser
355 360 365
Pro Arg Leu Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro Ala Gly
370 375 380
Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn
385 390 395 400
Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu
405 410 415
Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys
420 425 430
Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu
435 440 445
Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu
450 455 460
Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu
465 470 475 480
Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser
485 490 495
Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg
500 505 510
Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln
515 520 525
Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu
530 535 540
Ile Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu
545 550 555
<210> 45
<211> 541
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DSP107 Var. 4 [SIRP SEQ ID NO: 2 (343氨基酸), 甘氨酸
连接子, 4-1BBL SEQ ID NO: 27 (197 aa)]
<400> 45
Glu Glu Glu Leu Gln Val Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Leu Val Ala
1 5 10 15
Ala Gly Glu Thr Ala Thr Leu Arg Cys Thr Ala Thr Ser Leu Ile Pro
20 25 30
Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Gly Arg Glu Leu
35 40 45
Ile Tyr Asn Gln Lys Glu Gly His Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser
50 55 60
Asp Leu Thr Lys Arg Asn Asn Met Asp Phe Ser Ile Arg Ile Gly Asn
65 70 75 80
Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys Phe Arg Lys
85 90 95
Gly Ser Pro Asp Asp Val Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu
100 105 110
Ser Val Arg Ala Lys Pro Ser Ala Pro Val Val Ser Gly Pro Ala Ala
115 120 125
Arg Ala Thr Pro Gln His Thr Val Ser Phe Thr Cys Glu Ser His Gly
130 135 140
Phe Ser Pro Arg Asp Ile Thr Leu Lys Trp Phe Lys Asn Gly Asn Glu
145 150 155 160
Leu Ser Asp Phe Gln Thr Asn Val Asp Pro Val Gly Glu Ser Val Ser
165 170 175
Tyr Ser Ile His Ser Thr Ala Lys Val Val Leu Thr Arg Glu Asp Val
180 185 190
His Ser Gln Val Ile Cys Glu Val Ala His Val Thr Leu Gln Gly Asp
195 200 205
Pro Leu Arg Gly Thr Ala Asn Leu Ser Glu Thr Ile Arg Val Pro Pro
210 215 220
Thr Leu Glu Val Thr Gln Gln Pro Val Arg Ala Glu Asn Gln Val Asn
225 230 235 240
Val Thr Cys Gln Val Arg Lys Phe Tyr Pro Gln Arg Leu Gln Leu Thr
245 250 255
Trp Leu Glu Asn Gly Asn Val Ser Arg Thr Glu Thr Ala Ser Thr Val
260 265 270
Thr Glu Asn Lys Asp Gly Thr Tyr Asn Trp Met Ser Trp Leu Leu Val
275 280 285
Asn Val Ser Ala His Arg Asp Asp Val Lys Leu Thr Cys Gln Val Glu
290 295 300
His Asp Gly Gln Pro Ala Val Ser Lys Ser His Asp Leu Lys Val Ser
305 310 315 320
Ala His Pro Lys Glu Gln Gly Ser Asn Thr Ala Ala Glu Asn Thr Gly
325 330 335
Ser Asn Glu Arg Asn Ile Tyr Gly Ala Arg Ala Ser Pro Gly Ser Ala
340 345 350
Ala Ser Pro Arg Leu Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro
355 360 365
Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala
370 375 380
Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro
385 390 395 400
Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp
405 410 415
Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe
420 425 430
Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val
435 440 445
Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala
450 455 460
Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg
465 470 475 480
Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly
485 490 495
Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala
500 505 510
Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr
515 520 525
Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu
530 535 540
<210> 46
<211> 529
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DSP107 Var. 5: SIRP SEQ ID NO: 2 (343个氨基酸), 甘氨酸
连接子, 4-1BBL SEQ ID NO: 28 (185 aa)
<400> 46
Glu Glu Glu Leu Gln Val Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Leu Val Ala
1 5 10 15
Ala Gly Glu Thr Ala Thr Leu Arg Cys Thr Ala Thr Ser Leu Ile Pro
20 25 30
Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Gly Arg Glu Leu
35 40 45
Ile Tyr Asn Gln Lys Glu Gly His Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser
50 55 60
Asp Leu Thr Lys Arg Asn Asn Met Asp Phe Ser Ile Arg Ile Gly Asn
65 70 75 80
Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys Phe Arg Lys
85 90 95
Gly Ser Pro Asp Asp Val Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu
100 105 110
Ser Val Arg Ala Lys Pro Ser Ala Pro Val Val Ser Gly Pro Ala Ala
115 120 125
Arg Ala Thr Pro Gln His Thr Val Ser Phe Thr Cys Glu Ser His Gly
130 135 140
Phe Ser Pro Arg Asp Ile Thr Leu Lys Trp Phe Lys Asn Gly Asn Glu
145 150 155 160
Leu Ser Asp Phe Gln Thr Asn Val Asp Pro Val Gly Glu Ser Val Ser
165 170 175
Tyr Ser Ile His Ser Thr Ala Lys Val Val Leu Thr Arg Glu Asp Val
180 185 190
His Ser Gln Val Ile Cys Glu Val Ala His Val Thr Leu Gln Gly Asp
195 200 205
Pro Leu Arg Gly Thr Ala Asn Leu Ser Glu Thr Ile Arg Val Pro Pro
210 215 220
Thr Leu Glu Val Thr Gln Gln Pro Val Arg Ala Glu Asn Gln Val Asn
225 230 235 240
Val Thr Cys Gln Val Arg Lys Phe Tyr Pro Gln Arg Leu Gln Leu Thr
245 250 255
Trp Leu Glu Asn Gly Asn Val Ser Arg Thr Glu Thr Ala Ser Thr Val
260 265 270
Thr Glu Asn Lys Asp Gly Thr Tyr Asn Trp Met Ser Trp Leu Leu Val
275 280 285
Asn Val Ser Ala His Arg Asp Asp Val Lys Leu Thr Cys Gln Val Glu
290 295 300
His Asp Gly Gln Pro Ala Val Ser Lys Ser His Asp Leu Lys Val Ser
305 310 315 320
Ala His Pro Lys Glu Gln Gly Ser Asn Thr Ala Ala Glu Asn Thr Gly
325 330 335
Ser Asn Glu Arg Asn Ile Tyr Gly Leu Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser
340 345 350
Pro Asp Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala
355 360 365
Gln Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp
370 375 380
Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser
385 390 395 400
Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr
405 410 415
Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly
420 425 430
Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala
435 440 445
Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser
450 455 460
Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His
465 470 475 480
Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg
485 490 495
Ala Arg His Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu
500 505 510
Phe Arg Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser
515 520 525
Glu
<210> 47
<211> 308
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DSP107 Var 6: SIRP SEQ ID NO: 24 (116个氨基酸), 甘氨酸
连接子, 4-1BBL SEQ ID NO: 23 (191个氨基酸):]
<400> 47
Glu Glu Glu Leu Gln Val Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Leu Val Ala
1 5 10 15
Ala Gly Glu Thr Ala Thr Leu Arg Cys Thr Ala Thr Ser Leu Ile Pro
20 25 30
Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Gly Arg Glu Leu
35 40 45
Ile Tyr Asn Gln Lys Glu Gly His Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser
50 55 60
Asp Leu Thr Lys Arg Asn Asn Met Asp Phe Ser Ile Arg Ile Gly Asn
65 70 75 80
Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys Phe Arg Lys
85 90 95
Gly Ser Pro Asp Asp Val Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu
100 105 110
Ser Val Arg Ala Gly Ser Ala Ala Ser Pro Arg Leu Arg Glu Gly Pro
115 120 125
Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly
130 135 140
Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro
145 150 155 160
Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly
165 170 175
Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala
180 185 190
Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala
195 200 205
Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu
210 215 220
Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro
225 230 235 240
Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg
245 250 255
Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr
260 265 270
Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val
275 280 285
Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu Pro Ser
290 295 300
Pro Arg Ser Glu
305
<210> 48
<211> 314
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Var 7: SIRP SEQ ID NO: 24 (116个氨基酸), 甘氨酸连接子,
4-1BBL SEQ ID NO: 27 (197 aa)
<400> 48
Glu Glu Glu Leu Gln Val Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Leu Val Ala
1 5 10 15
Ala Gly Glu Thr Ala Thr Leu Arg Cys Thr Ala Thr Ser Leu Ile Pro
20 25 30
Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Gly Arg Glu Leu
35 40 45
Ile Tyr Asn Gln Lys Glu Gly His Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser
50 55 60
Asp Leu Thr Lys Arg Asn Asn Met Asp Phe Ser Ile Arg Ile Gly Asn
65 70 75 80
Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys Phe Arg Lys
85 90 95
Gly Ser Pro Asp Asp Val Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu
100 105 110
Ser Val Arg Ala Gly Ala Arg Ala Ser Pro Gly Ser Ala Ala Ser Pro
115 120 125
Arg Leu Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro Ala Gly Leu
130 135 140
Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val
145 150 155 160
Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala
165 170 175
Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu
180 185 190
Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu
195 200 205
Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala
210 215 220
Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala
225 230 235 240
Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala
245 250 255
Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu
260 265 270
Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu
275 280 285
Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu Ile
290 295 300
Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu
305 310
<210> 49
<211> 302
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DSP107 Var 8: SIRP SEQ ID NO: 24 (116个氨基酸), 甘氨酸
连接子, 4-1BBL SEQ ID NO: 28 (185 aa)
<400> 49
Glu Glu Glu Leu Gln Val Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Leu Val Ala
1 5 10 15
Ala Gly Glu Thr Ala Thr Leu Arg Cys Thr Ala Thr Ser Leu Ile Pro
20 25 30
Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Gly Arg Glu Leu
35 40 45
Ile Tyr Asn Gln Lys Glu Gly His Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser
50 55 60
Asp Leu Thr Lys Arg Asn Asn Met Asp Phe Ser Ile Arg Ile Gly Asn
65 70 75 80
Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys Phe Arg Lys
85 90 95
Gly Ser Pro Asp Asp Val Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu
100 105 110
Ser Val Arg Ala Gly Leu Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp
115 120 125
Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val
130 135 140
Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp
145 150 155 160
Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu
165 170 175
Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe
180 185 190
Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser
195 200 205
Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala
210 215 220
Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala
225 230 235 240
Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala
245 250 255
Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His
260 265 270
Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val
275 280 285
Thr Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu
290 295 300
<210> 50
<211> 1722
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码SEQ ID NO: 44的核酸序列
<400> 50
atgggctggt cctgcatcat cctgtttctg gtggctaccg ctaccggcgt gcactcccac 60
caccaccatc accacgaaga ggaactgcaa gtgatccagc ctgacaagtc cgtgctggtg 120
gctgctggcg aaaccgccac actgagatgt accgccacct ctctgatccc tgtgggccct 180
atccagtggt ttagaggcgc tggacctggc agagagctga tctacaacca gaaagagggc 240
cactttccta gagtgaccac cgtgtccgac ctgaccaagc ggaacaacat ggacttctcc 300
atccggatcg gcaacatcac ccctgctgat gccggcacct actactgcgt gaagttccgg 360
aagggctccc ctgacgacgt cgagtttaaa tccggcgctg gcaccgaact gtccgtgcga 420
gctaaacctt ctgctcccgt ggtgtctggc cctgccgcta gagctacacc tcagcacacc 480
gtgtctttta cctgcgagtc ccacggcttc agccctagag acatcaccct gaagtggttc 540
aagaacggca acgagctgtc cgacttccag accaacgtgg accctgtggg agagtccgtg 600
tcctactcca tccactctac cgccaaggtg gtgctgaccc gagaggacgt gcacagccaa 660
gtgatctgtg aagtggccca cgtgaccctc cagggcgatc ctttgagagg caccgccaac 720
ctgtccgaga caatcagagt gcctcctaca ctggaagtga cccagcagcc tgtgcgggcc 780
gagaatcaag tgaacgtgac ctgccaagtg cggaagttct accctcagag actgcagctg 840
acctggctgg aaaacggcaa tgtgtccaga accgagacag cctccaccgt gaccgagaac 900
aaggatggca cctacaattg gatgtcctgg ctgctcgtga acgtgtccgc tcacagagat 960
gacgtgaagc tgacatgcca ggtggaacac gatggccagc ctgccgtgtc taagtcccac 1020
gacctgaaag tgtctgctca ccccaaagag cagggctcca ataccgccgc tgagaacacc 1080
ggctccaacg agagaaacat ctacggcgcc tgtccttggg ctgtgtctgg cgctagagca 1140
tctcctggct ctgctgcctc tcctagactg agagagggac ctgagctgtc tcctgatgat 1200
cctgctggcc tgctggatct gagacagggc atgtttgctc agctggtggc ccagaacgtg 1260
ctgctgattg atggccctct gtcctggtac tctgatcctg gattggctgg cgtgtccctg 1320
actggcggcc tgtcttacaa agaggacacc aaagaactgg tggtggccaa ggccggcgtg 1380
tactacgtgt tctttcagct ggaactgcgg agagtggtgg ccggcgaagg atctggatct 1440
gtgtctctgg cactgcatct gcagcccctg agatctgctg caggcgctgc tgctctggct 1500
ctgacagttg atctgcctcc tgcctcctcc gaggccagaa actccgcctt tggcttccaa 1560
ggcagactgc tgcatctgtc tgccggccag agactgggag tccatctgca tacagaggct 1620
agagccaggc acgcctggca gttgacacaa ggtgctacag tgctgggcct gttcagagtg 1680
accccagaga ttccagccgg cctgccttct ccaagatccg ag 1722
<210> 51
<211> 1749
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> C端His标签（CH）的DSP-107的克隆序列
<400> 51
gaattcccgc cgccaccatg ggctggtcct gcatcatcct gtttctggtg gctaccgcta 60
ccggcgtgca ctccgaagag gaactgcaag tgatccagcc tgacaagtcc gtgctggtgg 120
ctgctggcga aaccgccaca ctgagatgta ccgccacctc tctgatccct gtgggcccta 180
tccagtggtt tagaggcgct ggacctggca gagagctgat ctacaaccag aaagagggcc 240
actttcctag agtgaccacc gtgtccgacc tgaccaagcg gaacaacatg gacttctcca 300
tccggatcgg caacatcacc cctgctgatg ccggcaccta ctactgcgtg aagttccgga 360
agggctcccc tgacgacgtc gagtttaaat ccggcgctgg caccgaactg tccgtgcgag 420
ctaaaccttc tgctcccgtg gtgtctggcc ctgccgctag agctacacct cagcacaccg 480
tgtcttttac ctgcgagtcc cacggcttca gccctagaga catcaccctg aagtggttca 540
agaacggcaa cgagctgtcc gacttccaga ccaacgtgga ccctgtggga gagtccgtgt 600
cctactccat ccactctacc gccaaggtgg tgctgacccg agaggacgtg cacagccaag 660
tgatctgtga agtggcccac gtgaccctcc agggcgatcc tttgagaggc accgccaacc 720
tgtccgagac aatcagagtg cctcctacac tggaagtgac ccagcagcct gtgcgggccg 780
agaatcaagt gaacgtgacc tgccaagtgc ggaagttcta ccctcagaga ctgcagctga 840
cctggctgga aaacggcaat gtgtccagaa ccgagacagc ctccaccgtg accgagaaca 900
aggatggcac ctacaattgg atgtcctggc tgctcgtgaa cgtgtccgct cacagagatg 960
acgtgaagct gacatgccag gtggaacacg atggccagcc tgccgtgtct aagtcccacg 1020
acctgaaagt gtctgctcac cccaaagagc agggctccaa taccgccgct gagaacaccg 1080
gctccaacga gagaaacatc tacggcgcct gtccttgggc tgtgtctggc gctagagcat 1140
ctcctggctc tgctgcctct cctagactga gagagggacc tgagctgtct cctgatgatc 1200
ctgctggcct gctggatctg agacagggca tgtttgctca gctggtggcc cagaacgtgc 1260
tgctgattga tggccctctg tcctggtact ctgatcctgg attggctggc gtgtccctga 1320
ctggcggcct gtcttacaaa gaggacacca aagaactggt ggtggccaag gccggcgtgt 1380
actacgtgtt ctttcagctg gaactgcgga gagtggtggc cggcgaagga tctggatctg 1440
tgtctctggc actgcatctg cagcccctga gatctgctgc aggcgctgct gctctggctc 1500
tgacagttga tctgcctcct gcctcctccg aggccagaaa ctccgccttt ggcttccaag 1560
gcagactgct gcatctgtct gccggccaga gactgggagt ccatctgcat acagaggcta 1620
gagccaggca cgcctggcag ttgacacaag gtgctacagt gctgggcctg ttcagagtga 1680
ccccagagat tccagccggc ctgccttctc caagatccga gcaccaccac catcaccact 1740
gataagctt 1749
<210> 52
<211> 1731
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> C端His标签（CH）的V1 DSP-107的克隆序列
<400> 52
gaattcccgc cgccaccatg ggctggtcct gcatcatcct gtttctggtg gctaccgcta 60
ccggcgtgca ctccgaagag gaactgcaag tgatccagcc tgacaagtcc gtgctggtgg 120
ctgctggcga aaccgccaca ctgagatgta ccgccacctc tctgatccct gtgggcccta 180
tccagtggtt tagaggcgct ggacctggca gagagctgat ctacaaccag aaagagggcc 240
actttcctag agtgaccacc gtgtccgacc tgaccaagcg gaacaacatg gacttctcca 300
tccggatcgg caacatcacc cctgctgatg ccggcaccta ctactgcgtg aagttccgga 360
agggctcccc tgacgacgtc gagtttaaat ccggcgctgg caccgaactg tccgtgcgag 420
ctaaaccttc tgctcccgtg gtgtctggcc ctgccgctag agctacacct cagcacaccg 480
tgtcttttac ctgcgagtcc cacggcttca gccctagaga catcaccctg aagtggttca 540
agaacggcaa cgagctgtcc gacttccaga ccaacgtgga ccctgtggga gagtccgtgt 600
cctactccat ccactctacc gccaaggtgg tgctgacccg agaggacgtg cacagccaag 660
tgatctgtga agtggcccac gtgaccctcc agggcgatcc tttgagaggc accgccaacc 720
tgtccgagac aatcagagtg cctcctacac tggaagtgac ccagcagcct gtgcgggccg 780
agaatcaagt gaacgtgacc tgccaagtgc ggaagttcta ccctcagaga ctgcagctga 840
cctggctgga aaacggcaat gtgtccagaa ccgagacagc ctccaccgtg accgagaaca 900
aggatggcac ctacaattgg atgtcctggc tgctcgtgaa cgtgtccgct cacagagatg 960
acgtgaagct gacatgccag gtggaacacg atggccagcc tgccgtgtct aagtcccacg 1020
acctgaaagt gtctgctcac cccaaagagc agggctccaa taccgccgct gagaacaccg 1080
gctccaacga gagaaacatc tacggctctg gcgctagggc ctctcctgga tctgctgctt 1140
ctcccagact gagagagggc cctgagctgt ctcctgatga tcctgctgga ctgctggatc 1200
tgagacaggg catgtttgct cagctggtgg cccagaacgt gctgctgatt gatggccctc 1260
tgtcctggta ctctgatcct ggattggctg gcgtgtccct gactggcggc ctgtcttaca 1320
aagaggacac caaagaactg gtggtggcca aggccggcgt gtactacgtg ttctttcagc 1380
tggaactgcg gagagtggtg gccggcgaag gatctggatc tgtgtctctg gctctgcatc 1440
tgcagcccct gagatctgca gcaggcgctg cagctctggc actgacagtt gatctgcctc 1500
ctgcctcctc cgaggccaga aactccgcct ttggcttcca aggcagactg ctgcacctgt 1560
ctgctggaca gagactggga gtgcacctcc acacagaggc cagagctaga catgcctggc 1620
agttgacaca gggcgctaca gtgctgggcc tgttcagagt gacacctgag attccagccg 1680
gcctgccttc tccaagatcc gagcaccacc accatcacca ctgataagct t 1731
<210> 53
<211> 1707
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> C端His标签（CH）的V2 DSP-107的克隆序列
<400> 53
gaattcccgc cgccaccatg ggctggtcct gcatcatcct gtttctggtg gctaccgcta 60
ccggcgtgca ctccgaagag gaactgcaag tgatccagcc tgacaagtcc gtgctggtgg 120
ctgctggcga aaccgccaca ctgagatgta ccgccacctc tctgatccct gtgggcccta 180
tccagtggtt tagaggcgct ggacctggca gagagctgat ctacaaccag aaagagggcc 240
actttcctag agtgaccacc gtgtccgacc tgaccaagcg gaacaacatg gacttctcca 300
tccggatcgg caacatcacc cctgctgatg ccggcaccta ctactgcgtg aagttccgga 360
agggctcccc tgacgacgtc gagtttaaat ccggcgctgg caccgaactg tccgtgcgag 420
ctaaaccttc tgctcccgtg gtgtctggcc ctgccgctag agctacacct cagcacaccg 480
tgtcttttac ctgcgagtcc cacggcttca gccctagaga catcaccctg aagtggttca 540
agaacggcaa cgagctgtcc gacttccaga ccaacgtgga ccctgtggga gagtccgtgt 600
cctactccat ccactctacc gccaaggtgg tgctgacccg agaggacgtg cacagccaag 660
tgatctgtga agtggcccac gtgaccctcc agggcgatcc tttgagaggc accgccaacc 720
tgtccgagac aatcagagtg cctcctacac tggaagtgac ccagcagcct gtgcgggccg 780
agaatcaagt gaacgtgacc tgccaagtgc ggaagttcta ccctcagaga ctgcagctga 840
cctggctgga aaacggcaat gtgtccagaa ccgagacagc ctccaccgtg accgagaaca 900
aggatggcac ctacaattgg atgtcctggc tgctcgtgaa cgtgtccgct cacagagatg 960
acgtgaagct gacatgccag gtggaacacg atggccagcc tgccgtgtct aagtcccacg 1020
acctgaaagt gtctgctcac cccaaagagc agggctccaa taccgccgct gagaacaccg 1080
gctccaacga gagaaacatc tacggctctg ccgcctctcc tagactgaga gagggacctg 1140
agctgtctcc tgatgatcct gctggcctgc tggatctgag acagggcatg tttgctcagc 1200
tggtggccca gaacgtgctg ctgattgatg gccctctgtc ctggtactct gatcctggat 1260
tggctggcgt gtccctgact ggcggcctgt cttacaaaga ggacaccaaa gaactggtgg 1320
tggccaaggc cggcgtgtac tacgtgttct ttcagctgga actgcggaga gtggtggccg 1380
gcgaaggatc tggatctgtg tctctggctc tgcatctgca gcccctgaga tctgctgcag 1440
gcgctgctgc tctggcactg acagttgatc tgcctcctgc ctcctccgag gccagaaact 1500
ccgcctttgg cttccaaggc agactgctgc atctgtctgc cggccagaga ctgggagtcc 1560
atctgcatac agaggccaga gctagacacg cttggcagtt gacacagggc gctacagtgc 1620
tgggcctgtt cagagtgaca cctgagatcc cagccggcct gccttctcca agatctgagc 1680
accaccacca tcaccactga taagctt 1707
<210> 54
<211> 1047
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> C端His标签（CH）的V3.1 DSP-107的克隆序列
<400> 54
gaattcccgc cgccaccatg ggctggtcct gcatcatcct gtttctggtg gctaccgcta 60
ccggcgtgca ctccgaagag gaactgcaag tgatccagcc tgacaagtcc gtgctggtgg 120
ctgctggcga aaccgccaca ctgagatgta ccgccacctc tctgatccct gtgggcccta 180
tccagtggtt tagaggcgct ggacctggca gagagctgat ctacaaccag aaagagggcc 240
actttcctag agtgaccacc gtgtccgacc tgaccaagcg gaacaacatg gacttctcca 300
tccggatcgg caacatcacc cctgctgatg ccggcaccta ctactgcgtg aagttccgga 360
agggctcccc tgacgacgtc gagtttaaat ccggcgctgg caccgagctg tccgtcagag 420
cttctggtgc tagagcctct cctggctctg ccgcttctcc tagactgaga gagggacctg 480
agctgtctcc tgatgatcct gctggcctgc tggatctgag acagggcatg tttgctcagc 540
tggtggccca gaacgtgctg ctgattgatg gccctctgtc ctggtactct gatcctggat 600
tggctggcgt gtccctgact ggcggcctgt cttacaaaga ggacaccaaa gaactggtgg 660
tggccaaggc cggcgtgtac tacgtgttct ttcagctgga actgcggaga gtggtggccg 720
gcgaaggatc tggatctgtg tctctggcac tgcatctgca gcctctgaga tctgctgcag 780
gcgctgctgc tctggctctg acagttgatc tgcctcctgc ctcctccgag gccagaaact 840
ccgcctttgg cttccaaggc agactgctgc atctgtctgc cggccagaga ctgggagtcc 900
atctgcatac agaggccaga gctagacacg cttggcagtt gacacagggc gctacagtgc 960
tgggcctgtt cagagtgaca cctgagatcc cagccggcct gccttctcca agatctgagc 1020
accaccacca tcaccactga taagctt 1047
<210> 55
<211> 1629
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码SEQ ID NO: 11的核酸序列(不带有His标签的DSP107_var1
<400> 55
gaagaggaac tgcaagtgat ccagcctgac aagtccgtgc tggtggctgc tggcgaaacc 60
gccacactga gatgtaccgc cacctctctg atccctgtgg gccctatcca gtggtttaga 120
ggcgctggac ctggcagaga gctgatctac aaccagaaag agggccactt tcctagagtg 180
accaccgtgt ccgacctgac caagcggaac aacatggact tctccatccg gatcggcaac 240
atcacccctg ctgatgccgg cacctactac tgcgtgaagt tccggaaggg ctcccctgac 300
gacgtcgagt ttaaatccgg cgctggcacc gaactgtccg tgcgagctaa accttctgct 360
cccgtggtgt ctggccctgc cgctagagct acacctcagc acaccgtgtc ttttacctgc 420
gagtcccacg gcttcagccc tagagacatc accctgaagt ggttcaagaa cggcaacgag 480
ctgtccgact tccagaccaa cgtggaccct gtgggagagt ccgtgtccta ctccatccac 540
tctaccgcca aggtggtgct gacccgagag gacgtgcaca gccaagtgat ctgtgaagtg 600
gcccacgtga ccctccaggg cgatcctttg agaggcaccg ccaacctgtc cgagacaatc 660
agagtgcctc ctacactgga agtgacccag cagcctgtgc gggccgagaa tcaagtgaac 720
gtgacctgcc aagtgcggaa gttctaccct cagagactgc agctgacctg gctggaaaac 780
ggcaatgtgt ccagaaccga gacagcctcc accgtgaccg agaacaagga tggcacctac 840
aattggatgt cctggctgct cgtgaacgtg tccgctcaca gagatgacgt gaagctgaca 900
tgccaggtgg aacacgatgg ccagcctgcc gtgtctaagt cccacgacct gaaagtgtct 960
gctcacccca aagagcaggg ctccaatacc gccgctgaga acaccggctc caacgagaga 1020
aacatctacg gctctggcgc tagggcctct cctggatctg ctgcttctcc cagactgaga 1080
gagggccctg agctgtctcc tgatgatcct gctggactgc tggatctgag acagggcatg 1140
tttgctcagc tggtggccca gaacgtgctg ctgattgatg gccctctgtc ctggtactct 1200
gatcctggat tggctggcgt gtccctgact ggcggcctgt cttacaaaga ggacaccaaa 1260
gaactggtgg tggccaaggc cggcgtgtac tacgtgttct ttcagctgga actgcggaga 1320
gtggtggccg gcgaaggatc tggatctgtg tctctggctc tgcatctgca gcccctgaga 1380
tctgcagcag gcgctgcagc tctggcactg acagttgatc tgcctcctgc ctcctccgag 1440
gccagaaact ccgcctttgg cttccaaggc agactgctgc acctgtctgc tggacagaga 1500
ctgggagtgc acctccacac agaggccaga gctagacatg cctggcagtt gacacagggc 1560
gctacagtgc tgggcctgtt cagagtgaca cctgagattc cagccggcct gccttctcca 1620
agatccgag 1629
<210> 56
<211> 1605
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码SEQ ID NO: 13的核酸序列(不带有His标签的DSP107_var2)
<400> 56
gaagaggaac tgcaagtgat ccagcctgac aagtccgtgc tggtggctgc tggcgaaacc 60
gccacactga gatgtaccgc cacctctctg atccctgtgg gccctatcca gtggtttaga 120
ggcgctggac ctggcagaga gctgatctac aaccagaaag agggccactt tcctagagtg 180
accaccgtgt ccgacctgac caagcggaac aacatggact tctccatccg gatcggcaac 240
atcacccctg ctgatgccgg cacctactac tgcgtgaagt tccggaaggg ctcccctgac 300
gacgtcgagt ttaaatccgg cgctggcacc gaactgtccg tgcgagctaa accttctgct 360
cccgtggtgt ctggccctgc cgctagagct acacctcagc acaccgtgtc ttttacctgc 420
gagtcccacg gcttcagccc tagagacatc accctgaagt ggttcaagaa cggcaacgag 480
ctgtccgact tccagaccaa cgtggaccct gtgggagagt ccgtgtccta ctccatccac 540
tctaccgcca aggtggtgct gacccgagag gacgtgcaca gccaagtgat ctgtgaagtg 600
gcccacgtga ccctccaggg cgatcctttg agaggcaccg ccaacctgtc cgagacaatc 660
agagtgcctc ctacactgga agtgacccag cagcctgtgc gggccgagaa tcaagtgaac 720
gtgacctgcc aagtgcggaa gttctaccct cagagactgc agctgacctg gctggaaaac 780
ggcaatgtgt ccagaaccga gacagcctcc accgtgaccg agaacaagga tggcacctac 840
aattggatgt cctggctgct cgtgaacgtg tccgctcaca gagatgacgt gaagctgaca 900
tgccaggtgg aacacgatgg ccagcctgcc gtgtctaagt cccacgacct gaaagtgtct 960
gctcacccca aagagcaggg ctccaatacc gccgctgaga acaccggctc caacgagaga 1020
aacatctacg gctctgccgc ctctcctaga ctgagagagg gacctgagct gtctcctgat 1080
gatcctgctg gcctgctgga tctgagacag ggcatgtttg ctcagctggt ggcccagaac 1140
gtgctgctga ttgatggccc tctgtcctgg tactctgatc ctggattggc tggcgtgtcc 1200
ctgactggcg gcctgtctta caaagaggac accaaagaac tggtggtggc caaggccggc 1260
gtgtactacg tgttctttca gctggaactg cggagagtgg tggccggcga aggatctgga 1320
tctgtgtctc tggctctgca tctgcagccc ctgagatctg ctgcaggcgc tgctgctctg 1380
gcactgacag ttgatctgcc tcctgcctcc tccgaggcca gaaactccgc ctttggcttc 1440
caaggcagac tgctgcatct gtctgccggc cagagactgg gagtccatct gcatacagag 1500
gccagagcta gacacgcttg gcagttgaca cagggcgcta cagtgctggg cctgttcaga 1560
gtgacacctg agatcccagc cggcctgcct tctccaagat ctgag 1605
<210> 57
<211> 966
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码SEQ ID NO: 15的核酸序列(不带有His标签的DSP107_var3)
<400> 57
gaagaggaac tgcaagtgat ccagcctgac aagtccgtgc tggtggctgc tggcgaaacc 60
gccacactga gatgtaccgc cacctctctg atccctgtgg gccctatcca gtggtttaga 120
ggcgctggac ctggcagaga gctgatctac aaccagaaag agggccactt tcctagagtg 180
accaccgtgt ccgacctgac caagcggaac aacatggact tctccatccg gatcggcaac 240
atcacccctg ctgatgccgg cacctactac tgcgtgaagt tccggaaggg ctcccctgac 300
gacgtcgagt ttaaatccgg cgctggcacc gaactgtccg tgcgagctgg cgcctgtcct 360
tgggctgtgt ctggcgctag agcatctcct ggctctgctg cctctcctag actgagagag 420
ggacctgagc tgtctcctga tgatcctgct ggcctgctgg atctgagaca gggcatgttt 480
gctcagctgg tggcccagaa cgtgctgctg attgatggcc ctctgtcctg gtactctgat 540
cctggattgg ctggcgtgtc cctgactggc ggcctgtctt acaaagagga caccaaagaa 600
ctggtggtgg ccaaggccgg cgtgtactac gtgttctttc agctggaact gcggagagtg 660
gtggccggcg aaggatctgg atctgtgtct ctggcactgc atctgcagcc cctgagatct 720
gctgcaggcg ctgctgctct ggctctgaca gttgatctgc ctcctgcctc ctccgaggcc 780
agaaactccg cctttggctt ccaaggcaga ctgctgcatc tgtctgccgg ccagagactg 840
ggagtccatc tgcatacaga ggctagagcc aggcacgcct ggcagttgac acaaggtgct 900
acagtgctgg gcctgttcag agtgacccca gagattccag ccggcctgcc ttctccaaga 960
tccgag 966
<210> 58
<211> 945
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码SEQ ID NO: 16的核酸序列(不带有His标签的DSP107_var3.1)
<400> 58
gaagaggaac tgcaagtgat ccagcctgac aagtccgtgc tggtggctgc tggcgaaacc 60
gccacactga gatgtaccgc cacctctctg atccctgtgg gccctatcca gtggtttaga 120
ggcgctggac ctggcagaga gctgatctac aaccagaaag agggccactt tcctagagtg 180
accaccgtgt ccgacctgac caagcggaac aacatggact tctccatccg gatcggcaac 240
atcacccctg ctgatgccgg cacctactac tgcgtgaagt tccggaaggg ctcccctgac 300
gacgtcgagt ttaaatccgg cgctggcacc gagctgtccg tcagagcttc tggtgctaga 360
gcctctcctg gctctgccgc ttctcctaga ctgagagagg gacctgagct gtctcctgat 420
gatcctgctg gcctgctgga tctgagacag ggcatgtttg ctcagctggt ggcccagaac 480
gtgctgctga ttgatggccc tctgtcctgg tactctgatc ctggattggc tggcgtgtcc 540
ctgactggcg gcctgtctta caaagaggac accaaagaac tggtggtggc caaggccggc 600
gtgtactacg tgttctttca gctggaactg cggagagtgg tggccggcga aggatctgga 660
tctgtgtctc tggcactgca tctgcagcct ctgagatctg ctgcaggcgc tgctgctctg 720
gctctgacag ttgatctgcc tcctgcctcc tccgaggcca gaaactccgc ctttggcttc 780
caaggcagac tgctgcatct gtctgccggc cagagactgg gagtccatct gcatacagag 840
gccagagcta gacacgcttg gcagttgaca cagggcgcta cagtgctggg cctgttcaga 900
gtgacacctg agatcccagc cggcctgcct tctccaagat ctgag 945
<210> 59
<211> 1629
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码SEQ ID NO: 18的核酸序列(不带有His标签的DSP107_Var1Mut)
<400> 59
gaagaggaaa tccaagtgat ccagcctgac aagtccgtgc tggtggctgc tggcgaaacc 60
gccacactga gatgtaccat cacctctctg atccctgtgg gccctatcca gtggtttaga 120
ggcgctggac ctggcagaat gctgatctac aaccagaaag agggccactt tcctagagtg 180
accaccgtgt ccgacctgac caagcggaac aacatcgact tctccatccg gatcggcaac 240
atcacccctg ctgatgccgg cacctactac tgcgtgaagt tccggaaggg ctcccctgac 300
gacgtcgagt ttaaatccgg cgctggcacc gaactgtccg tgcgagctaa accttctgct 360
cccgtggtgt ctggccctgc cgctagagct acacctcagc acaccgtgtc ttttacctgc 420
gagtcccacg gcttcagccc tagagacatc accctgaagt ggttcaagaa cggcaacgag 480
ctgtccgact tccagaccaa cgtggaccct gtgggagagt ccgtgtccta ctccatccac 540
tctaccgcca aggtggtgct gacccgagag gacgtgcaca gccaagtgat ctgtgaagtg 600
gcccacgtga ccctccaggg cgatcctttg agaggcaccg ccaacctgtc cgagacaatc 660
agagtgcctc ctacactgga agtgacccag cagcctgtgc gggccgagaa tcaagtgaac 720
gtgacctgcc aagtgcggaa gttctaccct cagagactgc agctgacctg gctggaaaac 780
ggcaatgtgt ccagaaccga gacagcctcc accgtgaccg agaacaagga tggcacctac 840
aattggatgt cctggctgct cgtgaacgtg tccgctcaca gagatgacgt gaagctgaca 900
tgccaggtgg aacacgatgg ccagcctgcc gtgtctaagt cccacgacct gaaagtgtct 960
gctcacccca aagagcaggg ctccaatacc gccgctgaga acaccggctc caacgagaga 1020
aacatctacg gctctggcgc tagggcctct cctggatctg ctgcttctcc cagactgaga 1080
gagggccctg agctgtctcc tgatgatcct gctggactgc tggatctgag acagggcatg 1140
tttgctcagc tggtggccca gaacgtgctg ctgattgatg gccctctgtc ctggtactct 1200
gatcctggat tggctggcgt gtccctgact ggcggcctgt cttacaaaga ggacaccaaa 1260
gaactggtgg tggccaaggc cggcgtgtac tacgtgttct ttcagctgga actgcggaga 1320
gtggtggccg gcgaaggatc tggatctgtg tctctggctc tgcatctgca gcccctgaga 1380
tctgcagcag gcgctgcagc tctggcactg acagttgatc tgcctcctgc ctcctccgag 1440
gccagaaact ccgcctttgg cttccaaggc agactgctgc acctgtctgc tggacagaga 1500
ctgggagtgc acctccacac agaggccaga gctagacatg cctggcagtt gacacagggc 1560
gctacagtgc tgggcctgtt cagagtgaca cctgagattc cagccggcct gccttctcca 1620
agatccgag 1629
<210> 60
<211> 1605
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码SEQ ID NO: 19的核酸序列(不带有His标签的DSP107_Var2Mut)
<400> 60
gaagaggaaa tccaagtgat ccagcctgac aagtccgtgc tggtggctgc tggcgaaacc 60
gccacactga gatgtaccat cacctctctg atccctgtgg gccctatcca gtggtttaga 120
ggcgctggac ctggcagaat gctgatctac aaccagaaag agggccactt tcctagagtg 180
accaccgtgt ccgacctgac caagcggaac aacatcgact tctccatccg gatcggcaac 240
atcacccctg ctgatgccgg cacctactac tgcgtgaagt tccggaaggg ctcccctgac 300
gacgtcgagt ttaaatccgg cgctggcacc gaactgtccg tgcgagctaa accttctgct 360
cccgtggtgt ctggccctgc cgctagagct acacctcagc acaccgtgtc ttttacctgc 420
gagtcccacg gcttcagccc tagagacatc accctgaagt ggttcaagaa cggcaacgag 480
ctgtccgact tccagaccaa cgtggaccct gtgggagagt ccgtgtccta ctccatccac 540
tctaccgcca aggtggtgct gacccgagag gacgtgcaca gccaagtgat ctgtgaagtg 600
gcccacgtga ccctccaggg cgatcctttg agaggcaccg ccaacctgtc cgagacaatc 660
agagtgcctc ctacactgga agtgacccag cagcctgtgc gggccgagaa tcaagtgaac 720
gtgacctgcc aagtgcggaa gttctaccct cagagactgc agctgacctg gctggaaaac 780
ggcaatgtgt ccagaaccga gacagcctcc accgtgaccg agaacaagga tggcacctac 840
aattggatgt cctggctgct cgtgaacgtg tccgctcaca gagatgacgt gaagctgaca 900
tgccaggtgg aacacgatgg ccagcctgcc gtgtctaagt cccacgacct gaaagtgtct 960
gctcacccca aagagcaggg ctccaatacc gccgctgaga acaccggctc caacgagaga 1020
aacatctacg gctctgccgc ctctcctaga ctgagagagg gacctgagct gtctcctgat 1080
gatcctgctg gcctgctgga tctgagacag ggcatgtttg ctcagctggt ggcccagaac 1140
gtgctgctga ttgatggccc tctgtcctgg tactctgatc ctggattggc tggcgtgtcc 1200
ctgactggcg gcctgtctta caaagaggac accaaagaac tggtggtggc caaggccggc 1260
gtgtactacg tgttctttca gctggaactg cggagagtgg tggccggcga aggatctgga 1320
tctgtgtctc tggctctgca tctgcagccc ctgagatctg ctgcaggcgc tgctgctctg 1380
gcactgacag ttgatctgcc tcctgcctcc tccgaggcca gaaactccgc ctttggcttc 1440
caaggcagac tgctgcatct gtctgccggc cagagactgg gagtccatct gcatacagag 1500
gccagagcta gacacgcttg gcagttgaca cagggcgcta cagtgctggg cctgttcaga 1560
gtgacacctg agatcccagc cggcctgcct tctccaagat ctgag 1605
<210> 61
<211> 966
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码SEQ ID NO: 20的核酸序列(不带有His标签的DSP107_Var3Mut)
<400> 61
gaagaggaaa tccaagtgat ccagcctgac aagtccgtgc tggtggctgc tggcgaaacc 60
gccacactga gatgtaccat cacctctctg atccctgtgg gccctatcca gtggtttaga 120
ggcgctggac ctggcagagt gctgatctac aaccagaaag agggccactt tcctagagtg 180
accaccgtgt ccgacctgac caagcggaac aacatggact tctccatccg gatcggcaac 240
atcacccctg ctgatgccgg cacctactac tgcatcaagt tccggaaggg ctcccctgac 300
gacgtcgagt ttaaatccgg cgctggcacc gaactgtccg tgcgagctgg cgcctgtcct 360
tgggctgtgt ctggcgctag agcatctcct ggctctgctg cctctcctag actgagagag 420
ggacctgagc tgtctcctga tgatcctgct ggcctgctgg atctgagaca gggcatgttt 480
gctcagctgg tggcccagaa cgtgctgctg attgatggcc ctctgtcctg gtactctgat 540
cctggattgg ctggcgtgtc cctgactggc ggcctgtctt acaaagagga caccaaagaa 600
ctggtggtgg ccaaggccgg cgtgtactac gtgttctttc agctggaact gcggagagtg 660
gtggccggcg aaggatctgg atctgtgtct ctggcactgc atctgcagcc cctgagatct 720
gctgcaggcg ctgctgctct ggctctgaca gttgatctgc ctcctgcctc ctccgaggcc 780
agaaactccg cctttggctt ccaaggcaga ctgctgcatc tgtctgccgg ccagagactg 840
ggagtccatc tgcatacaga ggctagagcc aggcacgcct ggcagttgac acaaggtgct 900
acagtgctgg gcctgttcag agtgacccca gagattccag ccggcctgcc ttctccaaga 960
tccgag 966
<210> 62
<211> 1623
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码SEQ ID NO: 45的核酸序列(Var 4)
<400> 62
gaagaggaac tgcaagtgat ccagcctgac aagtccgtgc tggtggctgc tggcgaaacc 60
gccacactga gatgtaccgc cacctctctg atccctgtgg gccctatcca gtggtttaga 120
ggcgctggac ctggcagaga gctgatctac aaccagaaag agggccactt tcctagagtg 180
accaccgtgt ccgacctgac caagcggaac aacatggact tctccatccg gatcggcaac 240
atcacccctg ctgatgccgg cacctactac tgcgtgaagt tccggaaggg ctcccctgac 300
gacgtcgagt ttaaatccgg cgctggcacc gaactgtccg tgcgagctaa accttctgct 360
cccgtggtgt ctggccctgc cgctagagct acacctcagc acaccgtgtc ttttacctgc 420
gagtcccacg gcttcagccc tagagacatc accctgaagt ggttcaagaa cggcaacgag 480
ctgtccgact tccagaccaa cgtggaccct gtgggagagt ccgtgtccta ctccatccac 540
tctaccgcca aggtggtgct gacccgagag gacgtgcaca gccaagtgat ctgtgaagtg 600
gcccacgtga ccctccaggg cgatcctttg agaggcaccg ccaacctgtc cgagacaatc 660
agagtgcctc ctacactgga agtgacccag cagcctgtgc gggccgagaa tcaagtgaac 720
gtgacctgcc aagtgcggaa gttctaccct cagagactgc agctgacctg gctggaaaac 780
ggcaatgtgt ccagaaccga gacagcctcc accgtgaccg agaacaagga tggcacctac 840
aattggatgt cctggctgct cgtgaacgtg tccgctcaca gagatgacgt gaagctgaca 900
tgccaggtgg aacacgatgg ccagcctgcc gtgtctaagt cccacgacct gaaagtgtct 960
gctcacccca aagagcaggg ctccaatacc gccgctgaga acaccggctc caacgagaga 1020
aacatctacg gagctagagc atctcctggc tctgctgcct ctcctagact gagagaggga 1080
cctgagctgt ctcctgatga tcctgctggc ctgctggatc tgagacaggg catgtttgct 1140
cagctggtgg cccagaacgt gctgctgatt gatggccctc tgtcctggta ctctgatcct 1200
ggattggctg gcgtgtccct gactggcggc ctgtcttaca aagaggacac caaagaactg 1260
gtggtggcca aggccggcgt gtactacgtg ttctttcagc tggaactgcg gagagtggtg 1320
gccggcgaag gatctggatc tgtgtctctg gcactgcatc tgcagcccct gagatctgct 1380
gcaggcgctg ctgctctggc tctgacagtt gatctgcctc ctgcctcctc cgaggccaga 1440
aactccgcct ttggcttcca aggcagactg ctgcatctgt ctgccggcca gagactggga 1500
gtccatctgc atacagaggc tagagccagg cacgcctggc agttgacaca aggtgctaca 1560
gtgctgggcc tgttcagagt gaccccagag attccagccg gcctgccttc tccaagatcc 1620
gag 1623
<210> 63
<211> 1587
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码SEQ ID NO: 46的核酸序列(Var 5)
<400> 63
gaagaggaac tgcaagtgat ccagcctgac aagtccgtgc tggtggctgc tggcgaaacc 60
gccacactga gatgtaccgc cacctctctg atccctgtgg gccctatcca gtggtttaga 120
ggcgctggac ctggcagaga gctgatctac aaccagaaag agggccactt tcctagagtg 180
accaccgtgt ccgacctgac caagcggaac aacatggact tctccatccg gatcggcaac 240
atcacccctg ctgatgccgg cacctactac tgcgtgaagt tccggaaggg ctcccctgac 300
gacgtcgagt ttaaatccgg cgctggcacc gaactgtccg tgcgagctaa accttctgct 360
cccgtggtgt ctggccctgc cgctagagct acacctcagc acaccgtgtc ttttacctgc 420
gagtcccacg gcttcagccc tagagacatc accctgaagt ggttcaagaa cggcaacgag 480
ctgtccgact tccagaccaa cgtggaccct gtgggagagt ccgtgtccta ctccatccac 540
tctaccgcca aggtggtgct gacccgagag gacgtgcaca gccaagtgat ctgtgaagtg 600
gcccacgtga ccctccaggg cgatcctttg agaggcaccg ccaacctgtc cgagacaatc 660
agagtgcctc ctacactgga agtgacccag cagcctgtgc gggccgagaa tcaagtgaac 720
gtgacctgcc aagtgcggaa gttctaccct cagagactgc agctgacctg gctggaaaac 780
ggcaatgtgt ccagaaccga gacagcctcc accgtgaccg agaacaagga tggcacctac 840
aattggatgt cctggctgct cgtgaacgtg tccgctcaca gagatgacgt gaagctgaca 900
tgccaggtgg aacacgatgg ccagcctgcc gtgtctaagt cccacgacct gaaagtgtct 960
gctcacccca aagagcaggg ctccaatacc gccgctgaga acaccggctc caacgagaga 1020
aacatctacg gactgagaga gggacctgag ctgtctcctg atgatcctgc tggcctgctg 1080
gatctgagac agggcatgtt tgctcagctg gtggcccaga acgtgctgct gattgatggc 1140
cctctgtcct ggtactctga tcctggattg gctggcgtgt ccctgactgg cggcctgtct 1200
tacaaagagg acaccaaaga actggtggtg gccaaggccg gcgtgtacta cgtgttcttt 1260
cagctggaac tgcggagagt ggtggccggc gaaggatctg gatctgtgtc tctggcactg 1320
catctgcagc ccctgagatc tgctgcaggc gctgctgctc tggctctgac agttgatctg 1380
cctcctgcct cctccgaggc cagaaactcc gcctttggct tccaaggcag actgctgcat 1440
ctgtctgccg gccagagact gggagtccat ctgcatacag aggctagagc caggcacgcc 1500
tggcagttga cacaaggtgc tacagtgctg ggcctgttca gagtgacccc agagattcca 1560
gccggcctgc cttctccaag atccgag 1587
<210> 64
<211> 924
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码SEQ ID NO: 47的核酸序列(Var 6)
<400> 64
gaagaggaac tgcaagtgat ccagcctgac aagtccgtgc tggtggctgc tggcgaaacc 60
gccacactga gatgtaccgc cacctctctg atccctgtgg gccctatcca gtggtttaga 120
ggcgctggac ctggcagaga gctgatctac aaccagaaag agggccactt tcctagagtg 180
accaccgtgt ccgacctgac caagcggaac aacatggact tctccatccg gatcggcaac 240
atcacccctg ctgatgccgg cacctactac tgcgtgaagt tccggaaggg ctcccctgac 300
gacgtcgagt ttaaatccgg cgctggcacc gaactgtccg tgcgagctgg atctgctgcc 360
tctcctagac tgagagaggg acctgagctg tctcctgatg atcctgctgg cctgctggat 420
ctgagacagg gcatgtttgc tcagctggtg gcccagaacg tgctgctgat tgatggccct 480
ctgtcctggt actctgatcc tggattggct ggcgtgtccc tgactggcgg cctgtcttac 540
aaagaggaca ccaaagaact ggtggtggcc aaggccggcg tgtactacgt gttctttcag 600
ctggaactgc ggagagtggt ggccggcgaa ggatctggat ctgtgtctct ggcactgcat 660
ctgcagcccc tgagatctgc tgcaggcgct gctgctctgg ctctgacagt tgatctgcct 720
cctgcctcct ccgaggccag aaactccgcc tttggcttcc aaggcagact gctgcatctg 780
tctgccggcc agagactggg agtccatctg catacagagg ctagagccag gcacgcctgg 840
cagttgacac aaggtgctac agtgctgggc ctgttcagag tgaccccaga gattccagcc 900
ggcctgcctt ctccaagatc cgag 924
<210> 65
<211> 942
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码SEQ ID NO: 48的核酸序列(Var 7)
<400> 65
gaagaggaac tgcaagtgat ccagcctgac aagtccgtgc tggtggctgc tggcgaaacc 60
gccacactga gatgtaccgc cacctctctg atccctgtgg gccctatcca gtggtttaga 120
ggcgctggac ctggcagaga gctgatctac aaccagaaag agggccactt tcctagagtg 180
accaccgtgt ccgacctgac caagcggaac aacatggact tctccatccg gatcggcaac 240
atcacccctg ctgatgccgg cacctactac tgcgtgaagt tccggaaggg ctcccctgac 300
gacgtcgagt ttaaatccgg cgctggcacc gaactgtccg tgcgagctgg agctagagca 360
tctcctggct ctgctgcctc tcctagactg agagagggac ctgagctgtc tcctgatgat 420
cctgctggcc tgctggatct gagacagggc atgtttgctc agctggtggc ccagaacgtg 480
ctgctgattg atggccctct gtcctggtac tctgatcctg gattggctgg cgtgtccctg 540
actggcggcc tgtcttacaa agaggacacc aaagaactgg tggtggccaa ggccggcgtg 600
tactacgtgt tctttcagct ggaactgcgg agagtggtgg ccggcgaagg atctggatct 660
gtgtctctgg cactgcatct gcagcccctg agatctgctg caggcgctgc tgctctggct 720
ctgacagttg atctgcctcc tgcctcctcc gaggccagaa actccgcctt tggcttccaa 780
ggcagactgc tgcatctgtc tgccggccag agactgggag tccatctgca tacagaggct 840
agagccaggc acgcctggca gttgacacaa ggtgctacag tgctgggcct gttcagagtg 900
accccagaga ttccagccgg cctgccttct ccaagatccg ag 942
<210> 66
<211> 906
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码SEQ ID NO: 49的核酸序列(Var 8)
<400> 66
gaagaggaac tgcaagtgat ccagcctgac aagtccgtgc tggtggctgc tggcgaaacc 60
gccacactga gatgtaccgc cacctctctg atccctgtgg gccctatcca gtggtttaga 120
ggcgctggac ctggcagaga gctgatctac aaccagaaag agggccactt tcctagagtg 180
accaccgtgt ccgacctgac caagcggaac aacatggact tctccatccg gatcggcaac 240
atcacccctg ctgatgccgg cacctactac tgcgtgaagt tccggaaggg ctcccctgac 300
gacgtcgagt ttaaatccgg cgctggcacc gaactgtccg tgcgagctgg actgagagag 360
ggacctgagc tgtctcctga tgatcctgct ggcctgctgg atctgagaca gggcatgttt 420
gctcagctgg tggcccagaa cgtgctgctg attgatggcc ctctgtcctg gtactctgat 480
cctggattgg ctggcgtgtc cctgactggc ggcctgtctt acaaagagga caccaaagaa 540
ctggtggtgg ccaaggccgg cgtgtactac gtgttctttc agctggaact gcggagagtg 600
gtggccggcg aaggatctgg atctgtgtct ctggcactgc atctgcagcc cctgagatct 660
gctgcaggcg ctgctgctct ggctctgaca gttgatctgc ctcctgcctc ctccgaggcc 720
agaaactccg cctttggctt ccaaggcaga ctgctgcatc tgtctgccgg ccagagactg 780
ggagtccatc tgcatacaga ggctagagcc aggcacgcct ggcagttgac acaaggtgct 840
acagtgctgg gcctgttcag agtgacccca gagattccag ccggcctgcc ttctccaaga 900
tccgag 906
<210> 67
<211> 1029
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码SEQ ID NO: 2的替代核酸序列(原始SIRP片段)
<400> 67
gaagaggaac tgcaagtgat ccagcctgac aagtccgtgc tggtggctgc tggcgaaacc 60
gccacactga gatgtaccgc cacctctctg atccctgtgg gccctatcca gtggtttaga 120
ggcgctggac ctggcagaga gctgatctac aaccagaaag agggccactt tcctagagtg 180
accaccgtgt ccgacctgac caagcggaac aacatggact tctccatccg gatcggcaac 240
atcacccctg ctgatgccgg cacctactac tgcgtgaagt tccggaaggg ctcccctgac 300
gacgtcgagt ttaaatccgg cgctggcacc gaactgtccg tgcgagctaa accttctgct 360
cccgtggtgt ctggccctgc cgctagagct acacctcagc acaccgtgtc ttttacctgc 420
gagtcccacg gcttcagccc tagagacatc accctgaagt ggttcaagaa cggcaacgag 480
ctgtccgact tccagaccaa cgtggaccct gtgggagagt ccgtgtccta ctccatccac 540
tctaccgcca aggtggtgct gacccgagag gacgtgcaca gccaagtgat ctgtgaagtg 600
gcccacgtga ccctccaggg cgatcctttg agaggcaccg ccaacctgtc cgagacaatc 660
agagtgcctc ctacactgga agtgacccag cagcctgtgc gggccgagaa tcaagtgaac 720
gtgacctgcc aagtgcggaa gttctaccct cagagactgc agctgacctg gctggaaaac 780
ggcaatgtgt ccagaaccga gacagcctcc accgtgaccg agaacaagga tggcacctac 840
aattggatgt cctggctgct cgtgaacgtg tccgctcaca gagatgacgt gaagctgaca 900
tgccaggtgg aacacgatgg ccagcctgcc gtgtctaagt cccacgacct gaaagtgtct 960
gctcacccca aagagcaggg ctccaatacc gccgctgaga acaccggctc caacgagaga 1020
aacatctac 1029
<210> 68
<211> 945
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO: 21的核酸序列
<400> 68
gaagaggaaa tccaagtgat ccagcctgac aagtccgtgc tggtggctgc tggcgaaacc 60
gccacactga gatgtaccat cacctctctg atccctgtgg gccctatcca gtggtttaga 120
ggcgctggac ctggcagagt gctgatctac aaccagaaag agggccactt tcctagagtg 180
accaccgtgt ccgacctgac caagcggaac aacatggact tctccatccg gatcggcaac 240
atcacccctg ctgatgccgg cacctactac tgcatcaagt tccggaaggg ctcccctgac 300
gacgtcgagt ttaaatccgg cgctggcacc gagctgtccg tcagagcttc tggtgctaga 360
gcctctcctg gctctgccgc ttctcctaga ctgagagagg gacctgagct gtctcctgat 420
gatcctgctg gcctgctgga tctgagacag ggcatgtttg ctcagctggt ggcccagaac 480
gtgctgctga ttgatggccc tctgtcctgg tactctgatc ctggattggc tggcgtgtcc 540
ctgactggcg gcctgtctta caaagaggac accaaagaac tggtggtggc caaggccggc 600
gtgtactacg tgttctttca gctggaactg cggagagtgg tggccggcga aggatctgga 660
tctgtgtctc tggcactgca tctgcagcct ctgagatctg ctgcaggcgc tgctgctctg 720
gctctgacag ttgatctgcc tcctgcctcc tccgaggcca gaaactccgc ctttggcttc 780
caaggcagac tgctgcatct gtctgccggc cagagactgg gagtccatct gcatacagag 840
gccagagcta gacacgcttg gcagttgaca cagggcgcta cagtgctggg cctgttcaga 900
gtgacacctg agatcccagc cggcctgcct tctccaagat ctgag 945
<210> 69
<211> 1749
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> N端带有His标签的(NH)-DSP-107的克隆序列
<400> 69
gaattcccgc cgccaccatg ggctggtcct gcatcattct gtttctggtg gccacagcca 60
ccggcgtgca ctctcaccat catcaccacc atgaagagga actgcaagtg atccagcctg 120
acaagagcgt gctggtggct gctggcgaaa cagccacact gagatgtacc gccacctctc 180
tgatccctgt gggccctatc cagtggttta gaggcgctgg acctggcaga gagctgatct 240
acaaccagaa agagggacac ttccccagag tgaccaccgt gtccgacctg accaagcgga 300
acaacatgga cttcagcatc cggatcggca acatcacccc tgccgatgcc ggcacctact 360
actgcgtgaa gttcagaaag ggcagccccg acgacgtcga gtttaaaagc ggagccggca 420
cagagctgag cgtgcgggct aaaccttctg ctcctgtggt gtctggacct gccgctagag 480
ctacacctca gcacaccgtg tcttttacct gcgagagcca cggcttcagc cccagagata 540
tcaccctgaa gtggttcaag aacggcaacg agctgtccga cttccagacc aacgtggacc 600
ctgtgggaga gagcgtgtcc tacagcatcc acagcacagc caaggtggtg ctgacccggg 660
aagatgtgca ctcccaagtg atttgcgagg tggcccacgt taccctgcaa ggcgatcctc 720
tgagaggcac cgccaatctg agcgagacaa tccgggtgcc acctacactg gaagtgaccc 780
agcagcctgt gcgggccgag aatcaagtga acgtgacctg ccaagtgcgg aagttctacc 840
ctcagagact gcagctgacc tggctggaaa acggcaatgt gtccagaacc gagacagcca 900
gcaccgtgac cgagaacaag gatggcacct acaattggat gagctggctg ctcgtgaatg 960
tgtctgccca ccgggacgat gtgaagctga catgccaggt ggaacacgat ggccagcctg 1020
ccgtgtctaa gagccacgac ctgaaggtgt ccgctcatcc caaagagcag ggctctaata 1080
ctgccgccga gaacaccggc agcaacgaga gaaatatcta cggcgcttgt ccttgggccg 1140
tttctggcgc tagagcctct cctggatctg ccgcttctcc cagactgaga gagggacctg 1200
agctgagccc tgatgatcct gctggactgc tggatctgag acagggcatg tttgcccagc 1260
tggtggccca gaatgtgctg ctgattgatg gccctctgtc ctggtacagc gatcctggac 1320
ttgctggcgt tagcctgact ggcggcctga gctacaaaga ggacaccaaa gaactggtgg 1380
tggccaaggc cggcgtgtac tacgtgttct ttcagctgga actgcggaga gtggtggccg 1440
gcgaaggatc tggatctgtg tctctggctc tgcatctgca gcctctgaga tctgctgctg 1500
gtgctgctgc tctggccctg acagttgatc tgcctcctgc ctctagcgag gccagaaact 1560
ccgcctttgg cttccaaggc agactgctgc acctgagcgc tggacagaga ctgggagtcc 1620
atctgcacac agaagccaga gctagacacg cctggcagct gacacaaggc gctacagtgc 1680
tgggcctgtt cagagtgacc cctgagattc cagccggcct gccatctcct agatctgagt 1740
gataagctt 1749
<210> 70
<211> 184
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 4-1BBL -21-0 184 aa
<400> 70
Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp
1 5 10 15
Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu
20 25 30
Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val
35 40 45
Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val
50 55 60
Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg
65 70 75 80
Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His
85 90 95
Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr
100 105 110
Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly
115 120 125
Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val
130 135 140
His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu Thr Gln
145 150 155 160
Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala
165 170 175
Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu
180
<210> 71
<211> 552
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码SEQ ID NO: 70的na序列
<400> 71
agagagggcc ctgagctgtc tcctgatgat cctgctggac tgctggacct gagacagggc 60
atgtttgctc agctggtggc ccagaacgtg ctgctgattg atggccctct gtcctggtac 120
tctgatcctg gattggctgg cgtgtccctg actggcggcc tgtcttacaa agaggacacc 180
aaagaactgg tggtcgccaa ggccggcgtg tactacgtgt tctttcagct ggaactgcgg 240
agagtggtgg ctggcgaagg atctggatct gtgtctctgg ccctgcatct gcagcctctg 300
agaagtgctg caggcgctgc tgcactggct ctgacagttg atctgcctcc tgcctcctcc 360
gaggccagaa actccgcctt tggcttccaa ggcagactgc tgcatctgtc tgccggacag 420
agactgggag tgcacctcca tacagaggcc agagctagac acgcttggca gttgacacag 480
ggcgctacag tgctgggcct gtttagagtg acacctgaga tcccagccgg cctgccatct 540
ccaagatctg aa 552
<210> 72
<211> 182
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 4-1BBL -23-0 182 aa
<400> 72
Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg
1 5 10 15
Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp
20 25 30
Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu
35 40 45
Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala
50 55 60
Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val
65 70 75 80
Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln
85 90 95
Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp
100 105 110
Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln
115 120 125
Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu
130 135 140
His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala
145 150 155 160
Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu
165 170 175
Pro Ser Pro Arg Ser Glu
180
<210> 73
<211> 546
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码SEQ ID NO: 72的na序列
<400> 73
ggccctgagc tgtctcctga tgatcctgct ggactgctgg acctgagaca gggcatgttt 60
gctcagctgg tggcccagaa cgtgctgctg attgatggcc ctctgtcctg gtactctgat 120
cctggattgg ctggcgtgtc cctgactggc ggcctgtctt acaaagagga caccaaagaa 180
ctggtggtcg ccaaggccgg cgtgtactac gtgttctttc agctggaact gcggagagtg 240
gtggctggcg aaggatctgg atctgtgtct ctggccctgc atctgcagcc tctgagaagt 300
gctgcaggcg ctgctgcact ggctctgaca gttgatctgc ctcctgcctc ctccgaggcc 360
agaaactccg cctttggctt ccaaggcaga ctgctgcatc tgtctgccgg acagagactg 420
ggagtgcacc tccatacaga ggccagagct agacacgctt ggcagttgac acagggcgct 480
acagtgctgg gcctgtttag agtgacacct gagatcccag ccggcctgcc atctccaaga 540
tctgaa 546
<210> 74
<211> 183
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 4-1BBL -14-8 183 aa
<400> 74
Ser Ala Ala Ser Pro Arg Leu Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp
1 5 10 15
Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu
20 25 30
Val Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser
35 40 45
Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys
50 55 60
Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val
65 70 75 80
Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly
85 90 95
Ser Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly
100 105 110
Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu
115 120 125
Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser
130 135 140
Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg
145 150 155 160
His Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg
165 170 175
Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala
180
<210> 75
<211> 551
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码SEQ ID NO: 74的na序列
<400> 75
gatctgccgc ttctcctaga ctgagagagg gccctgagct gtctcctgat gatcctgctg 60
gactgctgga cctgagacag ggcatgtttg ctcagctggt ggcccagaac gtgctgctga 120
ttgatggccc tctgtcctgg tactctgatc ctggattggc tggcgtgtcc ctgactggcg 180
gcctgtctta caaagaggac accaaagaac tggtggtcgc caaggccggc gtgtactacg 240
tgttctttca gctggaactg cggagagtgg tggctggcga aggatctgga tctgtgtctc 300
tggccctgca tctgcagcct ctgagaagtg ctgcaggcgc tgctgcactg gctctgacag 360
ttgatctgcc tcctgcctcc tccgaggcca gaaactccgc ctttggcttc caaggcagac 420
tgctgcatct gtctgccgga cagagactgg gagtgcacct ccatacagag gccagagcta 480
gacacgcttg gcagttgaca cagggcgcta cagtgctggg cctgtttaga gtgacacctg 540
agatcccagc c 551
<210> 76
<211> 176
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 4-1BBL -21-8 176 aa
<400> 76
Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp
1 5 10 15
Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu
20 25 30
Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val
35 40 45
Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val
50 55 60
Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg
65 70 75 80
Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His
85 90 95
Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr
100 105 110
Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly
115 120 125
Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val
130 135 140
His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu Thr Gln
145 150 155 160
Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala
165 170 175
<210> 77
<211> 528
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码SEQ ID NO: 76的na序列 528 bp
<400> 77
agagagggcc ctgagctgtc tcctgatgat cctgctggac tgctggacct gagacagggc 60
atgtttgctc agctggtggc ccagaacgtg ctgctgattg atggccctct gtcctggtac 120
tctgatcctg gattggctgg cgtgtccctg actggcggcc tgtcttacaa agaggacacc 180
aaagaactgg tggtcgccaa ggccggcgtg tactacgtgt tctttcagct ggaactgcgg 240
agagtggtgg ctggcgaagg atctggatct gtgtctctgg ccctgcatct gcagcctctg 300
agaagtgctg caggcgctgc tgcactggct ctgacagttg atctgcctcc tgcctcctcc 360
gaggccagaa actccgcctt tggcttccaa ggcagactgc tgcatctgtc tgccggacag 420
agactgggag tgcacctcca tacagaggcc agagctagac acgcttggca gttgacacag 480
ggcgctacag tgctgggcct gtttagagtg acacctgaga tcccagcc 528
<210> 78
<211> 601
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> sc3x4-1BBL -14-0 601 aa
<400> 78
Ser Ala Ala Ser Pro Arg Leu Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp
1 5 10 15
Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu
20 25 30
Val Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser
35 40 45
Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys
50 55 60
Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val
65 70 75 80
Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly
85 90 95
Ser Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly
100 105 110
Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu
115 120 125
Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser
130 135 140
Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg
145 150 155 160
His Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg
165 170 175
Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu Gly
180 185 190
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Ala
195 200 205
Ser Pro Arg Leu Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro Ala
210 215 220
Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln
225 230 235 240
Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly
245 250 255
Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr
260 265 270
Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln
275 280 285
Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser
290 295 300
Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala
305 310 315 320
Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn
325 330 335
Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln
340 345 350
Arg Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp
355 360 365
Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro
370 375 380
Glu Ile Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu Gly Gly Gly Gly
385 390 395 400
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Ala Ser Pro Arg
405 410 415
Leu Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro Ala Gly Leu Leu
420 425 430
Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val Leu
435 440 445
Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly
450 455 460
Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu
465 470 475 480
Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu
485 490 495
Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu
500 505 510
His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu
515 520 525
Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe
530 535 540
Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly
545 550 555 560
Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu Thr
565 570 575
Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu Ile Pro
580 585 590
Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu
595 600
<210> 79
<211> 1803
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码SEQ ID NO: 78的na序列
<400> 79
tctgccgcca gccctaggct gcgcgaggga cccgagctga gcccagacga tcccgccggc 60
ctgctggacc tgaggcaggg aatgttcgca cagctggtgg cccagaacgt gctgctgatc 120
gacggccctc tgtcctggta ctctgatcca ggcctggccg gcgtgtccct gacaggaggc 180
ctgtcttata aggaggatac caaggagctg gtggtggcaa aggcaggcgt gtactacgtg 240
ttcttccagc tggagctgag gagagtggtg gcaggagagg gcagcggctc cgtgtctctg 300
gccctgcacc tccagcctct gcggagcgcc gccggcgccg ccgccctggc cctgaccgtg 360
gatctgcctc cagccagctc cgaggccagg aatagcgcct tcggctttca gggccgcctg 420
ctgcacctgt ccgccggcca gcggctggga gtgcacctgc acacagaggc cagagcccgg 480
cacgcatggc agctgacaca gggagcaacc gtgctgggcc tgttccgcgt gacccctgag 540
atcccagccg gcctgccaag cccccggtcc gagggcggcg gcggctctgg cggaggaggc 600
agcggaggcg gcggctctgc cgccagcccc aggctgcgcg agggacccga gctgtcccca 660
gacgatcctg ccggcctgct ggacctgcgc cagggaatgt ttgcccagct ggtggctcaa 720
aacgtgctgt taatcgacgg ccctctgagc tggtactctg atcctggcct ggccggcgtg 780
agcctgaccg gcggcctgtc ctacaaagag gatactaaag agctggtggt cgccaaagcc 840
ggcgtgtact acgtgttctt ccaactggag ctgaggaggg tcgtcgccgg cgaaggcagc 900
ggctccgtgt ctctggccct gcacctccag ccgctgagga gcgccgccgg cgccgccgcc 960
ctggccctga cggtggacct gccacctgcc tctagcgagg caagaaattc tgccttcggc 1020
ttccagggca ggctgctgca cctgagcgcc ggccagcgcc tgggcgtcca cctgcatacc 1080
gaagccagag cccggcatgc ctggcagctg acccagggcg ccaccgtgct gggcctgttc 1140
agagtgaccc cagagatccc cgccggcctg cctagcccaa ggtccgaagg cggcggcggc 1200
tccggcggcg gaggctctgg aggagggggc tctgccgcca gcccaaggct gcgcgaggga 1260
cccgagctgt cgcctgacga tccagccggc ctgctggacc tgcgtcaggg catgttcgcc 1320
cagctggtgg ctcagaacgt gctgttaatc gacggcccac tgtcttggta ttctgatccc 1380
ggcctggccg gcgtgtctct gacaggaggc ctgagctaca aagaggatac aaaagagctg 1440
gtggtcgcta aagctggcgt gtactacgtg ttcttccaac tggagctgcg cagggtcgtc 1500
gccggcgagg gcagcggctc cgtgtctctg gccctgcacc tccagccatt acggagcgcc 1560
gccggcgccg ccgccctggc cctgactgtg gacctgccac cagcctcctc tgaggcacgg 1620
aacagcgcct tcggcttcca aggcagactg ctgcacctgt ctgccggcca gaggctgggc 1680
gtccacctgc acaccgaagc cagagcccgg cacgcctggc agctgactca gggcgctacc 1740
gtgctgggcc tgttccgcgt aaccccagag atccctgccg gcctgcccag ccctcggtcc 1800
gag 1803
<210> 80
<211> 535
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DSP107_Var2
<400> 80
Ser Ala Ala Ser Pro Arg Leu Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp
1 5 10 15
Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu
20 25 30
Val Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser
35 40 45
Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys
50 55 60
Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val
65 70 75 80
Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly
85 90 95
Ser Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly
100 105 110
Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu
115 120 125
Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser
130 135 140
Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg
145 150 155 160
His Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg
165 170 175
Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu Gly
180 185 190
Glu Glu Glu Leu Gln Val Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Leu Val Ala
195 200 205
Ala Gly Glu Thr Ala Thr Leu Arg Cys Thr Ala Thr Ser Leu Ile Pro
210 215 220
Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Gly Arg Glu Leu
225 230 235 240
Ile Tyr Asn Gln Lys Glu Gly His Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser
245 250 255
Asp Leu Thr Lys Arg Asn Asn Met Asp Phe Ser Ile Arg Ile Gly Asn
260 265 270
Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys Phe Arg Lys
275 280 285
Gly Ser Pro Asp Asp Val Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu
290 295 300
Ser Val Arg Ala Lys Pro Ser Ala Pro Val Val Ser Gly Pro Ala Ala
305 310 315 320
Arg Ala Thr Pro Gln His Thr Val Ser Phe Thr Cys Glu Ser His Gly
325 330 335
Phe Ser Pro Arg Asp Ile Thr Leu Lys Trp Phe Lys Asn Gly Asn Glu
340 345 350
Leu Ser Asp Phe Gln Thr Asn Val Asp Pro Val Gly Glu Ser Val Ser
355 360 365
Tyr Ser Ile His Ser Thr Ala Lys Val Val Leu Thr Arg Glu Asp Val
370 375 380
His Ser Gln Val Ile Cys Glu Val Ala His Val Thr Leu Gln Gly Asp
385 390 395 400
Pro Leu Arg Gly Thr Ala Asn Leu Ser Glu Thr Ile Arg Val Pro Pro
405 410 415
Thr Leu Glu Val Thr Gln Gln Pro Val Arg Ala Glu Asn Gln Val Asn
420 425 430
Val Thr Cys Gln Val Arg Lys Phe Tyr Pro Gln Arg Leu Gln Leu Thr
435 440 445
Trp Leu Glu Asn Gly Asn Val Ser Arg Thr Glu Thr Ala Ser Thr Val
450 455 460
Thr Glu Asn Lys Asp Gly Thr Tyr Asn Trp Met Ser Trp Leu Leu Val
465 470 475 480
Asn Val Ser Ala His Arg Asp Asp Val Lys Leu Thr Cys Gln Val Glu
485 490 495
His Asp Gly Gln Pro Ala Val Ser Lys Ser His Asp Leu Lys Val Ser
500 505 510
Ala His Pro Lys Glu Gln Gly Ser Asn Thr Ala Ala Glu Asn Thr Gly
515 520 525
Ser Asn Glu Arg Asn Ile Tyr
530 535
<210> 81
<211> 699
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO: 80的NA序列
<400> 81
tctgctgcct ctcctagact gagagaggga cctgagctgt ctcctgatga tcctgctggc 60
ctgctggatc tgagacaggg catgtttgct cagctggtgg cccagaacgt gctgctgatt 120
gatggccctc tgtcctggta ctctgatcct ggattggctg gcgtgtccct gactggcggc 180
ctgtcttaca aagaggacac caaagaactg gtggtggcca aggccggcgt gtactacgtg 240
ttctttcagc tggaactgcg gagagtggtg gccggcgaag gatctggatc tgtgtctctg 300
gcactgcatc tgcagcccct gagatctgct gcaggcgctg ctgctctggc tctgacagtt 360
gatctgcctc ctgcctcctc cgaggccaga aactccgcct ttggcttcca aggcagactg 420
ctgcatctgt ctgccggcca gagactggga gtccatctgc atacagaggc tagagccagg 480
cacgcctggc agttgacaca aggtgctaca gtgctgggcc tgttcagagt gaccccagag 540
attccagccg gcctgccttc tccaagatcc gagggcgaag aggaactgca agtgatccag 600
cctgacaagt ccgtgctggt ggctgctggc gaaaccgcca cactgagatg taccgccacc 660
tctctgatcc ctgtgggccc tatccagtgg tttagaggc 699
<210> 82
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 多肽连接子
<400> 82
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
1 5 10
<210> 83
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 多肽连接子
<400> 83
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
1 5
<210> 84
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 多肽连接子
<220>
<221> REPEAT
<222> (1)..(5)
<223> 可重复1-4次
<400> 84
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 85
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 多肽连接子
<400> 85
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 86
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 多肽连接子
<400> 86
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 87
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 多肽连接子
<220>
<221> REPEAT
<222> (1)..(5)
<223> 可重复1-3次
<400> 87
Glu Ala Ala Ala Lys
1 5
<210> 88
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 多肽连接子
<220>
<221> REPEAT
<222> (2)..(6)
<223> 重复2-5次
<400> 88
Ala Glu Ala Ala Ala Lys Ala
1 5
<210> 89
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 多肽连接子
<400> 89
Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Ala
1 5 10
<210> 90
<211> 46
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 多肽连接子
<400> 90
Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys
1 5 10 15
Glu Ala Ala Ala Lys Ala Leu Glu Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala
20 25 30
Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Ala
35 40 45
<210> 91
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 多肽连接子
<400> 91
Pro Ala Pro Ala Pro
1 5
<210> 92
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 多肽连接子
<400> 92
Lys Glu Ser Gly Ser Val Ser Ser Glu Gln Leu Ala Gln Phe Arg Ser
1 5 10 15
Leu Asp
<210> 93
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 多肽连接子
<400> 93
Glu Gly Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Ser Thr
1 5 10
<210> 94
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 多肽连接子
<400> 94
Gly Ser Ala Gly Ser Ala Ala Gly Ser Gly Glu Phe
1 5 10
<210> 95
<211> 229
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 多肽连接子
<400> 95
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe
1 5 10 15
Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
20 25 30
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
35 40 45
Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
50 55 60
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser
65 70 75 80
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
85 90 95
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser
100 105 110
Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
115 120 125
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
130 135 140
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
145 150 155 160
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
165 170 175
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu
180 185 190
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
195 200 205
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
210 215 220
Leu Ser Leu Gly Lys
225
<210> 96
<211> 232
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 多肽连接子
<400> 96
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1 5 10 15
Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
20 25 30
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
35 40 45
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
50 55 60
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
65 70 75 80
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
85 90 95
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
100 105 110
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
115 120 125
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr
130 135 140
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
145 150 155 160
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
165 170 175
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
180 185 190
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
195 200 205
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
210 215 220
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
225 230
<210> 97
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 多肽连接子
<400> 97
Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu
1 5
<210> 98
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 多肽连接子
<400> 98
Ala Cys Pro Trp Ala Val Ser Gly Ala Arg Ala Ser Pro Gly Ser Ala
1 5 10 15
Ala Ser Pro Arg Leu Arg Glu
20
<210> 99
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 多肽连接子
<400> 99
Met Gly Trp Ser Leu Ile Leu Leu Phe Leu Val Ala Val Ala Thr Arg
1 5 10 15
Val Leu Ser

Claims (47)

1.一种SIRPα-4-1BBL融合蛋白，其特征在于：所述SIRPα-4-1BBL融合蛋白包括：一SIRPα氨基酸序列及一4-1BBL氨基酸序列，其中所述SIRPα氨基酸序列的长度为100至119个氨基酸且与一氨基酸序列具有至少95％的同一性，所述氨基酸序列是选自由SEQ ID NO：24及26所组成的群组，及/或其中所述4-1BBL氨基酸序列：
(a)长度为185至202个氨基酸且与一氨基酸序列具有至少95％的同一性，所述氨基酸序列是选自由SEQ ID NO：22、23、27及28所组成的群组；长度为170至197个氨基酸且与一氨基酸序列具有至少80％的同一性，所述氨基酸序列是选自由SEQ ID NO：74及76所组成的群组，且不包括对应于SEQ ID NO：3的氨基酸片段G198至E205；长度为170至182个氨基酸且与SEQ ID NO：72具有至少80％的同一性，且不包括对应于SEQ ID NO：3的氨基酸片段A1至E23；或长度为184个氨基酸且与SEQ ID NO：70具有至少80％的同一性；及/或
(b)包括4-1BBL氨基酸序列的三个重复；
且其中所述融合蛋白具有至少以下的能力之一：
(i)结合CD47及4-1BB；
(ii)在表达所述4-1BB的细胞中激活所述4-1BB的信号传导途径；
(iii)共刺激表达所述4-1BB的免疫细胞；及/或
(iv)相较于缺乏所述SIRPα-4-1BBL融合蛋白，增强通过吞噬细胞表达所述CD47的病理细胞的吞噬作用。
2.一种SIRPα-4-1BBL融合蛋白，其特征在于：所述SIRPα-4-1BBL融合蛋白包括：一SIRPα氨基酸序列及一4-1BBL氨基酸序列，其中所述SIRPα氨基酸序列的长度为100至119个氨基酸且与一氨基酸序列具有至少95％的同一性，所述氨基酸序列是选自由SEQ ID NO：24及26所组成的群组；及/或其中所述4-1BBL氨基酸序列的长度为185至202个氨基酸且与一氨基酸序列具有至少95％的同一性，所述氨基酸序列是选自由SEQ ID NO：22、23、27及28所组成的群组；且其中所述多肽具有至少以下的能力之一：
(i)结合CD47及4-1BB；
(ii)在表达所述4-1BB的细胞中激活所述4-1BB的信号传导途径；
(iii)共刺激表达所述4-1BB的免疫细胞；及/或
(iv)相较于缺乏所述SIRPα-4-1BBL融合蛋白，增强通过吞噬细胞表达所述CD47的病理细胞的吞噬作用。
3.一种经分离的多肽，其特征在于：所述经分离的多肽包括：一SIRPα氨基酸序列，其中所述SIRPα氨基酸序列的长度为100至119个氨基酸且与一氨基酸序列具有至少95％的同一性，所述氨基酸序列是选自由SEQ ID NO：24至26所组成的群组；且其中所述多肽具有结合CD47的能力。
4.如权利要求1至2中任一项所述的SIRPα-4-1BBL融合蛋白或如权利要求3所述的经分离的多肽，其特征在于：所述SIRPα氨基酸序列的长度为至少115个氨基酸。
5.如权利要求1至3及4中任一项所述的SIRPα-4-1BBL融合蛋白或经分离的多肽，其特征在于：所述SIRPα氨基酸序列的长度为至少116个氨基酸。
6.如权利要求3及4至5中任一项所述的SIRPα-4-1BBL融合蛋白或经分离的多肽，其特征在于：所述SIRPα氨基酸序列包括在一氨基酸残基处的一突变，所述氨基酸残基是选自由对应于SEQ ID NO：2的L4、A27、E47及V92所组成的群组。
7.如权利要求6所述的SIRPα-4-1BBL融合蛋白或经分离的多肽，其特征在于：所述SIRPα氨基酸序列包括在一氨基酸残基处的一突体，所述突变是选自由对应于SEQ ID NO：2的L4I、A27I、E47V及V92I所组成的群组。
8.如权利要求1至3及4至7中任一项所述的SIRPα-4-1BBL融合蛋白或经分离的多肽，其特征在于：所述SIRPα氨基酸序列不包括对应于SEQ ID NO：2的氨基酸残基K117至Y343中的任一者。
9.如权利要求1至3、4及8中任一项所述的SIRPα-1BBL融合蛋白或经分离的多肽，其特征在于：所述SIRPα氨基酸序列包括所述SEQ ID NO：24或26。
10.如权利要求1至3、4至5及8中任一项所述的SIRPα-4-1BBL融合蛋白或经分离的多肽，其特征在于：所述SIRPα氨基酸序列是由所述SEQ ID NO：24或26所组成。
11.如权利要求1至2及4至10中任一项所述的SIRPα-4-1BBL融合蛋白，其特征在于：所述4-1BBL氨基酸序列不包括对应于SEQ ID NO：3的氨基酸残基A1至V6或A1至G14中的任一者。
12.如权利要求1至2、4至10及11中任一项所述的SIRPα-4-1BBL融合蛋白，其特征在于：所述4-1BBL氨基酸序列包括所述SEQ ID NO：22、23、27或28。
13.如权利要求1至2及4至10及11中任一项所述的SIRPα-4-1BBL融合蛋白，其特征在于：所述4-1BBL氨基酸序列是由所述SEQ ID NO：22、23、27或28所组成。
14.如权利要求1至2中任一项所述的SIRPα-4-1BBL融合蛋白，其特征在于：
(i)在所述SIRPα氨基酸序列是如SEQ ID NO：2或25所示，以及所述4-1BBL的氨基酸序列是如SEQ ID NO：22、23、27或28所示；或
(ii)在所述SIRPα氨基酸序列是如SEQ ID NO：24或26所示，以及所述4-1BBL的氨基酸序列是如SEQ ID NO：3、22、23、27或28所示。
15.如权利要求1至2中任一项所述的SIRPα-4-1BBL融合蛋白，其特征在于：
(i)在所述SIRPα氨基酸序列是如SEQ ID NO：2所示，以及所述4-1BBL的氨基酸序列是如SEQ ID NO：22或23所示；或
(ii)在所述SIRPα氨基酸序列是如SEQ ID NO：24所示，以及所述4-1BBL的氨基酸序列是如SEQ ID NO：22所示。
16.如权利要求1至2及4至15中任一项所述的SIRPα-4-1BBL融合蛋白，其特征在于：在所述SIRPα与所述4-1BBL之间，所述SIRPα-4-1BBL融合蛋白包括一连接子。
17.如权利要求1及4至15中任一项所述的SIRPα-4-1BBL融合蛋白，其特征在于：在所述4-1BBL氨基酸序列的各个所述三个重复之间，所述SIRPα-4-1BBL融合蛋白包括一连接子。
18.如权利要求16至17中任一项所述的SIRPα-4-1BBL融合蛋白，其特征在于：所述连接子是一单一氨基酸连接子。
19.如权利要求18所述的SIRPα-4-1BBL融合蛋白，其特征在于：所述连接子是甘氨酸。
20.如权利要求1至19中任一项所述的SIRPα-4-1BBL融合蛋白，其特征在于：所述SIRPα-4-1BBL融合蛋白是可溶的。
21.如权利要求1至2及4至20中任一项所述的SIRPα-4-1BBL融合蛋白，其特征在于：在相同的生产条件下，所述融合蛋白的聚集体的量相较于SEQ ID NO：5的聚集体的量高至少1.5倍，且所述生产条件包括在哺乳动物细胞中表达，以及在32至37℃、5至10％二氧化碳下培养5至13天。
22.如权利要求1至2及16至21中任一项所述的SIRPα-4-1BBL融合蛋白，其特征在于：所述SIRPα-4-1BBL融合蛋白的氨基酸序列与一氨基酸序列具有至少95％的同一性，所述氨基酸序列是选自由SEQ ID NO：11、13、15、16、18至21及45至49所组成的群组。
23.如权利要求1及16至21中任一项所述的SIRPα-4-1BBL融合蛋白，其特征在于：所述SIRPα-4-1BBL融合蛋白与一氨基酸序列具有至少95％的同一性，所述氨基酸序列是选自由SEQ ID NO：11、13及16所组成的群组。
24.如权利要求1及16至21中任一项所述的SIRPα-4-1BBL融合蛋白，其特征在于：所述SIRPα-4-1BBL融合蛋白的氨基酸序列包括一氨基酸序列，所述氨基酸序列是选自由SEQ IDNO：11、13、15、16、18至21及45至49所组成的群组。
25.如权利要求1及16至21中任一项所述的SIRPα-4-1BBL融合蛋白，其特征在于：所述SIRPα-4-1BBL融合蛋白的氨基酸序列包括一氨基酸序列，所述氨基酸序列是由SEQ ID NO：11、13及16所组成。
26.如权利要求1及16至21中任一项所述的SIRPα-4-1BBL融合蛋白，其特征在于：所述SIRPα-4-1BBL融合蛋白的氨基酸序列是由一氨基酸序列所组成，所述氨基酸序列是由SEQID NO：11、13、15、16、18至21及45至49所组成。
27.如权利要求1及16至21中任一项所述的SIRPα-4-1BBL融合蛋白，其特征在于：所述SIRPα-4-1BBL融合蛋白的氨基酸序列是由一氨基酸序列所组成，所述氨基酸序列是由SEQID NO：11、13及16所组成。
28.一种多核苷酸，其特征在于：所述多核苷酸编码如权利要求1至27中任一项所述的SIRPα-4-1BBL融合蛋白或多肽。
29.一种核酸构建体，其特征在于：所述核酸构建体包括：如权利要求28所述的多核苷酸；以及一调控组件，所述调控组件在一宿主细胞中是用于指导所述多核苷酸的表达。
30.一种宿主细胞，其特征在于：所述宿主细胞包括：如权利要求1至27中任一项所述的SIRPα-4-1BBL融合蛋白或多肽；或如权利要求28至29中任一项所述的多核苷酸或核酸构建体。
31.一种生产一SIRPα-4-1BBL融合蛋白或一多肽的方法，其特征在于：所述方法包括：在一宿主细胞中表达如权利要求28至29中任一项所述的多核苷酸或核酸构建体。
32.如权利要求31所述的方法，其特征在于：所述方法包括：分离所述融合蛋白或所述多肽。
33.一种通过得益于激活免疫细胞而治疗一疾病的方法，其特征在于：所述方法包括：将如权利要求1至27中任一项所述的SIRPα-4-1BBL融合蛋白或经分离的多肽、如权利要求28至29中任一项所述的多核苷酸或核酸构建体，或如权利要求30所述的宿主细胞，投予至有需要的一受试者。
34.如权利要求33所述的方法，其特征在于：所述方法进一步包括：将一治疗剂投予至所述受试者，以治疗所述疾病。
35.一种将如权利要求1至27中任一项所述的SIRPα-4-1BBL融合蛋白或经分离的多肽、如权利要求28至29中任一项所述的多核苷酸或核酸构建体，或如权利要求30所述的宿主细胞用于通过得益于激活免疫细胞而治疗一疾病之用途。
36.如权利要求35所述的用途的成分，其特征在于：所述用途的成分进一步包括用于治疗所述疾病的一治疗剂。
37.一种制品，其特征在于：所述制品包括：
一包装材料，所述包装材料包装一治疗剂，所述治疗剂是通过得益于激活免疫细胞而治疗一疾病；以及
如权利要求1至27中任一项所述的SIRPα-4-1BBL融合蛋白或经分离的多肽，或如权利要求28至29中任一项所述的多核苷酸或核酸构建体，或如权利要求30所述的宿主细胞。
38.如权利要求33至34中任一项所述的方法、如权利要求35至36中任一项所述的用途的成分，或如权利要求37所述的制品，其特征在于：所述疾病的细胞表达CD47。
39.如权利要求33至38中任一项所述的方法、用途的成分或制品，其特征在于：所述疾病包括一过度增生性疾病。
40.如权利要求39所述的方法、用途的成分或制品，其特征在于：所述过度增生性疾病包括癌症。
41.如权利要求33至38中任一项所述的方法、用途的成分或制品，其特征在于：所述疾病包括：一与免疫抑制或经药物诱导的免疫抑制有关的疾病，或一感染。
42.一种激活免疫细胞的方法，其特征在于：所述方法包括：在体外激活免疫细胞，所述免疫细胞存在有：如权利要求1至27中任一项所述的SIRPα-4-1BBL融合蛋白或经分离的多肽、如权利要求28至29中任一项所述的多核苷酸或核酸构建体，或如权利要求30所述的宿主细胞。
43.如权利要求42所述的方法，其特征在于：所述激活是在表达CD47的细胞的存在下或在外源性CD47的存在下进行的。
44.如权利要求42至43中任一项所述的方法，其特征在于：所述激活是在一抗癌剂的存在下进行的。
45.如权利要求34、36、37至41及44中任一项所述的方法、用途的成分或制品，其特征在于：用于治疗所述疾病的所述治疗剂或所述抗癌剂包括一抗体。
46.如权利要求45所述的方法、用途的成分或制品，其特征在于：所述抗体是选自由利妥昔单抗、西妥昔单抗及阿美妥珠单抗所组成的群组。
47.如权利要求34、36、37至41及44中任一项所述的方法、用途的成分或制品，其特征在于：用于治疗所述疾病的所述治疗剂或所述抗癌剂包括一IMiD(例如，沙利度胺、来那度胺、泊马度胺)。
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