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CN112533954B - 靶向cd47和her2的重组双功能蛋白 - Google Patents

靶向cd47和her2的重组双功能蛋白 Download PDF

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CN112533954B
CN112533954B CN201980051644.4A CN201980051644A CN112533954B CN 112533954 B CN112533954 B CN 112533954B CN 201980051644 A CN201980051644 A CN 201980051644A CN 112533954 B CN112533954 B CN 112533954B
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Abstract

本申请提供一种重组融合蛋白，其包含信号调节蛋白(SIRP)的胞外Ig样结构域，该结构域经由接头与Ig样HER2抗体的抗原结合互补位在构成该抗原结合互补位的重链或轻链的N端处连接。本申请还提供编码该重组融合蛋白的多核苷酸、包含该多核苷酸的表达载体、制备该重组蛋白的方法、以及治疗由CD47和/或HER2过表达引起的疾病的方法。

Description

靶向CD47和HER2的重组双功能蛋白
发明领域
本申请涉及一种靶向CD47和HER2的重组融合蛋白，及其制备和用途，特别使其在肿瘤治疗中的用途。
背景技术
抗体疗法已经在多个国家地区获批用于治疗多种癌症，且具有显著改善的病人结果(Komeev KV et al.，(2017)TLR-signaling and proinflammatory cytokines asdrivers of tumorigenesis.Cytokine 89：127-135)。一旦与癌抗原结合，抗体可以引发抗体依赖的细胞介导的细胞毒性，激活补体系统，或防止受体与其配体相互作用，所有这些都可能引起细胞死亡。美国FDA批准的抗体药物包括阿伦单抗(Alemtuzumab)、纳武单抗(Nivolumab)、利妥昔单抗(Rituximab)和度伐利尤单抗(Durvalumab)。
肿瘤逃避免疫监视
癌细胞已经发展出一些逃避宿主免疫监视的机制。例如，很多肿瘤或癌细胞在其表面表达大量CD47，CD47通过与巨噬细胞表面的SIRPα(信号调节蛋白α，还称为SHPS1和BIT)结合，抑制巨噬细胞对癌细胞的吞噬作用。
在患有急性髓细胞样白血病(AML)、慢性髓细胞样白血病(CML)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、多发性骨髓瘤(MM)、膀胱癌、卵巢癌、前列腺癌、肺癌、结肠癌、乳癌、和胰腺癌的病人中发现了过表达CD47的癌细胞。注射阻断CD47-SIRPα相互作用的CD47特异抗体可以显著地抑制带瘤小鼠中肿瘤的生长，且当将同一抗体注射到携带人白血病细胞的小鼠中时，肿瘤或癌细胞完全消除(Theocharides APA et al.，(2012)J.C.Y.J.Exp.Med.209：1883-1899)。
HER2相关肿瘤和治疗
HER2，又称为ErbB2，是人上皮生长因子受体家族的一员，由红细胞原癌基因2(ERBB2)编码。该原癌基因的过表达出现在大约15-30％乳腺癌中，并与增加的疾病复发和较差的预后有着很强的关联(Mitri Z et al.，(2012)Chemotherapy Research andPractice.Volume 2012，Article ID 743193，7pages；Burstein HJ，(2005)The NewEngland Journal of Medicine.353(16)：1652-4；Tan M，et al.，(2007)Advances inExperimental Medicine and Biology.608：119-29)。这样的过表达也出现在卵巢癌、胃癌、肺腺癌、和侵略型子宫癌中。
已经开发出或者正在开发靶向HER2的单克隆抗体。一个这类的抗体，曲妥珠单抗(Trastuzumab，)，于1998年在美国批准用于医疗用途，且已成功地用在HER2阳性乳癌的临床治疗中。
双特异或多特异治疗性融合蛋白/抗体
抗体已经大大地促进了我们治疗癌症的能力，然而临床研究表明，很多病人对单特异疗法的应答并不充分。例如，在乳癌治疗中，较高百分比的HER2阳性病人由于多种机制，包括FcgRIIIA基因的158F多样性，对曲妥珠单抗治疗没有应答。此外，在数个疗程后，经常发生获得性抗体耐性。
因而，开发出针对两种或多种分离的独特抗原、或者针对同一抗原的不同表位的双特异性或多特异性抗体。例如，一些双特异性抗体经改造成同时结合细胞毒性细胞和肿瘤细胞。这些抗体能够阻断多个肿瘤细胞生长和成活通路，和/或激活肿瘤细胞杀灭通路，因而具有更好抑制癌生长的潜在能力。
然而，双特异或多特异抗体呈现出较大的设计挑战性，因为需要考虑多种问题，包括分子的相容性，所得抗体的亲和性、稳定性和药学特征。已经意识到，简单地将抗体或蛋白连接在一起并不会必然地得到协同/有益效果。在本申请中公开的重组抗体，包含经由接头与爱必妥(西妥昔单抗，Cetuximab)连接的SIRPαD1，已经被证明在HT-29或NCI-H1975肿瘤模型中相比单独的爱必妥或SIRPαD1-Fc具有较差的抗肿瘤活性(参见实施例8)。
然而，经过潜心努力，当前的发明人成功地设计出了准确靶向CD47和HER2的重组双特异性蛋白，其比常见的单抗原靶向抗体显示出更好的抗肿瘤活性。
发明内容
本申请公开一种重组融合蛋白，其包含信号调节蛋白(SIRP)胞外Ig样结构域，该结构域经由接头与IgG样HER2抗体的抗原结合互补位在构成该抗原结合互补位的重链或轻链的N端处连接，其中该重组融合蛋白同时结合CD47、HER2和FcR。与癌细胞上CD47的结合阻断CD47与巨噬细胞上SIRP的相互作用，从而解除由SIRP介导的抑制信号对巨噬细胞的抑制；而与癌细胞上HER2的结合抑制不受控的肿瘤细胞生长；且同时，与NK细胞或巨噬细胞上FcR的结合激活NK细胞或巨噬细胞对癌细胞的靶向杀灭。
在一个实施方式中，Ig样HER2抗体的其中一个抗原结合互补位与信号调节蛋白(SIRP)胞外Ig样结构域在构成该抗原结合互补位的重链或轻链的N端处连接。在一个实施方式中，Ig样HER2抗体的各个抗原结合互补位与信号调节蛋白(SIRP)胞外Ig样结构域在构成该抗原结合互补位的重链或轻链的N端处连接。在一个实施方式中，Ig样HER2抗体的各个抗原结合互补位与信号调节蛋白(SIRP)胞外Ig样结构域在构成该抗原结合互补位的重链的N端处连接。在一个实施方式中，Ig样HER2抗体的各个抗原结合互补位与信号调节蛋白(SIRP)胞外Ig样结构域在构成该抗原结合互补位的轻链的N端处连接。在一个实施方式中，Ig样HER2抗体的一个抗原结合互补位与信号调节蛋白(SIRP)胞外Ig样结构域在构成该抗原结合互补位的重链的N端处连接，且另一个抗原结合互补位与信号调节蛋白(SIRP)胞外Ig样结构域在构成该抗原结合互补位的轻链的N端处连接。在一些实施方式中，HER2抗体的一个抗原结合互补位可以与两个拷贝的信号调节蛋白(SIRP)胞外Ig样结构域在构成该抗原结合互补位的重链和轻链的N端处连接。
在一个实施方式中，重组融合蛋白中的信号调节蛋白可以是SIRPα，且信号调节蛋白的胞外Ig样结构域可以是SIRPα的第一胞外Ig样结构域(SIRPαD1)。信号调节蛋白的胞外Ig样结构域，例如SIRPαD1，能够与癌细胞/肿瘤细胞的细胞表面的CD47结合，从而阻断CD47与巨噬细胞的细胞表面上的SIRP之间的相互作用。
在一个实施方式中，SIRPαD1具有分别如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的核酸序列和氨基酸序列。在一些实施方式中，SIRPaD1可以包含与SEQ ID NO：2具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性的氨基酸序列，其中SIRPαD1可以与癌细胞/肿瘤细胞的细胞表面上的CD47结合，阻断CD47与巨噬细胞的细胞表面上SIRP之间的相互作用。
重组融合蛋白中的接头可以是约5-30氨基酸残基的肽。在一个实施方式中，接头是10-30氨基酸残基的肽。在另一实施方式中，接头是15-30氨基酸残基的肽。在一些实施方式中，接头为-(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)3-(SEQ ID NO：4)，其可以由SEQ ID NO：3编码。
HER2抗体可以是分离的单克隆抗体，例如曲妥珠单抗、Margetuximab，以及与曲妥珠单抗或Margetuximab具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％氨基酸同一性而保留有结合亲和力的抗体。
HER2抗体可以是分离的单克隆抗体，包含两条重链和两条轻链，各条重链具有SEQID NO：6所示的氨基酸序列，各条轻链具有SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列，两个氨基酸序列可以分别由SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：7的核酸序列编码。HER2抗体的抗原结合(Fab)部分或抗原结合互补位可以与癌细胞/肿瘤细胞的细胞表面的HER2结合，从而防止不受控的肿瘤/癌细胞生长的发生，而HER2抗体的Fc部分可以与NK细胞或巨噬细胞的细胞表面上的FcR结合，以激活NK细胞或巨噬细胞对癌细胞的杀灭。在一些实施方式中，重链可以包含与SEQ ID NO：6具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性的氨基酸序列，其中HER2抗体能够与HER2结合，防止不受控的癌细胞/肿瘤细胞的生长，且也能够与NK细胞或巨噬细胞的细胞表面上的FcR结合，从而激活NK细胞或巨噬细胞对癌细胞的杀灭。在一些实施方式中，轻链可以包含与SEQ ID NO：8具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性的氨基酸序列，其中HER2抗体能够与HER2结合，防止不受控的癌细胞/肿瘤细胞生长的发生。
SIRPαD1-接头-HER2重链融合蛋白可以包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列，其可以由SEQ ID NO：9的核苷酸编码。在一些实施方式中，SIRPαD1-接头-HER2重链包含与SEQ IDNO：10具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性的氨基酸序列，其中SIRPαD1-接头-HER2重链与HER2抗体的轻链一起，能够与CD47、HER2以及FcR结合，i)阻断癌细胞上CD47与巨噬细胞上SIRP的相互作用；ii)阻断不受控的癌/肿瘤细胞生长；和(iii)激活NK细胞或巨噬细胞对癌细胞的杀灭。
在一个实施方式中，SIRPαD1-接头-HER2轻链融合蛋白包含SEQ ID NO：12的氨基酸序列，其可以由SEQ ID NO：11的核苷酸编码。在一些实施方式中，SIRPαD1-接头-HER2轻链包含与SEQ ID NO：10具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性的氨基酸序列，其中SIRPαD1-接头-HER2轻链与HER2抗体的重链一起，能够与CD47、HER2以及FcR结合，i)阻断癌细胞上CD47与巨噬细胞上SIRP的相互作用；ii)抑制不受控的癌/肿瘤细胞生长；和(iii)激活NK细胞或巨噬细胞对癌细胞的杀灭。
本申请还提供编码本申请重组融合蛋白的核酸分子，以及包含该核酸的表达载体、和包含该表达载体的宿主细胞。
本申请还提供一种使用含表达载体的宿主细胞制备重组融合蛋白的方法，包括(i)在宿主细胞中表达重组融合蛋白、以及(ii)从宿主细胞分离重组融合蛋白的步骤。
另一方面，本申请提供药物组合物，其包含本申请的重组融合蛋白、以及至少一种药学上可接受的载体。药物组合物还可以包含至少一种佐剂。
另一方面，本申请提供一种用于治疗由过表达CD47和/或HER2造成的疾病的方法，包括对有需求的患者或受试者施用治疗有效量的本申请药物组合物。
在一个实施方式中，本申请提供重组融合蛋白在制备药物组合物中的用途，其中该药物组合物用于治疗由过表达CD47和/或HER2引起的疾病。
在一个实施方式中，本申请的方法用于治疗选自急性髓细胞样白血病(AML)、慢性髓细胞样白血病(CML)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、多发性骨髓瘤(MM)、膀胱癌、卵巢癌、前列腺癌、肺癌、结肠癌、乳癌、胰腺癌和肾细胞癌中的疾病。在一个实施方式中，本申请提供用于治疗克罗恩病、过敏性哮喘或类风湿性关节炎的方法。
基于以下的详细描述和实施例，当前申请的其他特征和有利之处将是非常明晰可见的，详细描述和实施例不应当解读为限制性的。所有在本申请中引用的文献、Genbank登记号、专利和公开的专利申请均通过引用的方式明确并入本文。
附图说明
图1为本申请重组融合蛋白的结构示意图。
图2为IMM2901和IMM2902与CD47的结合活性。
图3为IMM2901和IMM2902与HER2的结合活性。
图4示出由IMM2902引起的对HL-60细胞的吞噬作用。
图5示出IMM2902的ADCC活性。
图6示出IMM2902引起HER2内化。
图7示出IMM2902在BT-474异种移植模型中的体内疗效。
图8示出IMM0404在HT-29异种移植模型中的体内疗效。
图9示出IMM0404在NCI-H1975异种移植模型中的体内疗效。
具体实施方式
主要有三种不同的途径来靶向两种或更多种肿瘤生长的药理机制。最常见的，可以给予患者两种或更多种不同药物的混合物。尽管这种选择使得对于可能的药物组合和不同剂量有着最大化的灵活度，其面临的问题是：a)由于药物负担增加且针对各个药物有不同的剂量安排，具有潜在的较差的患者依从性；b)由于药物-药物相互作用，可能存在不相容性；以及c)药物副作用风险增加。这些问题可能降低治疗的有效性并妨碍治疗目标的达成，尤其在慢性疾病例如癌症的管理中。
第二个途径是将多种药物的固定剂量组合融合在单剂型中。该途径减少药物负担，引起患者依从性的改善。固定剂量组合的不利之处主要在于，对于活性成分之间可能的剂量比的选择是有限的，这使得更加难以恰当地以最小的不利作用将各患者的剂量调整至最大功效。此外，组合中成分的不同药物代谢动力学特性可能在各目标患者中引起复杂的药效时间错位，从而使总的功效打折。
第三个途径是使用在单个实体中结合两种或更多种药理机制的多功能药物。这类多功能实体的设计和确认更加复杂，并需要大量对于靶向活性的最佳比率的研究。多功能分子也可以改造成与其他药物的固定剂量组合，从而在单一的药片中结合三种、甚至四种药理机制，以产生功效的进一步增长。
针对两个或更多个靶标的重组双特异或多特异蛋白是多功能药物，其与常见的单抗原靶向抗体相比，不一定会显示出较好的抗肿瘤活性。例如，如以下实施例8所示，包含SIRPαD1经由接头与爱必妥(西妥昔单抗，一种EGFR抗体)连接的重组抗体，在HT-29或NCI-H1975肿瘤模型中具有比爱必妥或SIRPαD1-Fc更低的抗肿瘤活性。重组蛋白需要更加巧妙的设计来提供协同效应。
经过大量实验，当前的发明者已经发明出一种新的重组融合蛋白，其能够通过三个作用机制来攻击肿瘤，一个是解除由SIRP介导的抑制信号对巨噬细胞的抑制，一个是控制HER2信号通路介导的肿瘤/癌细胞增殖，第三个是激活NK细胞和/或巨噬细胞对癌细胞的杀灭。
本申请的重组融合蛋白包含信号调节蛋白(SIRP)胞外Ig样结构域，该结构域经由接头与Ig样HER2抗体的抗原结合互补位在构成该抗原结合互补位的重链或轻链的N端处连接，其中该重组融合蛋白同时结合CD47、HER2和FcR，i)与癌细胞上CD47结合，以阻断CD47与巨噬细胞上SIRP的相互作用，从而解除由SIRP介导的抑制信号对巨噬细胞的抑制；ii)与癌症细胞上HER2结合，从而抑制不受控的肿瘤/癌细胞生长；和(iii)与NK细胞或巨噬细胞上FcR结合，激活NK细胞或巨噬细胞对癌细胞的杀灭。在一个实施方式中，Ig样HER2抗体的其中一个抗原结合互补位在构成该抗原结合互补位的重链或轻链的N端处与信号调节蛋白(SIRP)胞外Ig样结构域连接。在一个实施方式中，Ig样HER2抗体的各个抗原结合互补位在构成抗原结合互补位的重链或轻链的N端处与信号调节蛋白(SIRP)胞外Ig样结构域连接。在一个实施方式中，Ig样HER2抗体的各抗原结合互补位在构成该抗原结合部位的重链的N端处连接信号调节蛋白(SIRP)胞外Ig样结构域。在一个实施方式中，Ig样HER2抗体的各个抗原结合互补位在构成该抗原结合部位的轻链的N端处连接信号调节蛋白(SIRP)胞外Ig样结构域。在一个实施方式中，Ig样HER2抗体的一个抗原结合互补位在构成该抗原结合互补位的重链的N端处连接信号调节蛋白(SIRP)胞外Ig样结构域，且另一抗原结合互补位在构成该抗原结合互补位的轻链的N端处连接信号调节蛋白(SIRP)胞外Ig样结构域。在一些实施方式中，HER2抗体的一个抗原结合互补位可以与两个拷贝的信号调节蛋白(SIRP)胞外Ig样结构域在构成该抗原结合互补位的重链和轻链的N端处连接。
包含在本申请融合蛋白中的三个主要组成部分为信号调节蛋白(SIRP)的胞外Ig样结构域、接头、和HER2抗体。本领域技术人员将意识到，对于上述三个组成部分，存在很多种设计选择。优选地，在人癌症治疗中使用得自于人的序列，因为非人动物的蛋白或肽的强烈免疫原性可能会引起过敏反应和其他不良反应。然而，基于不同的应用目的，也可以在本申请中使用恰当人源化的其他动物蛋白或肽。
能够与CD47结合的任何SIRP(SIRPα、SIRPβ和SIRPγ)的任何胞外Ig样结构域均可以选择用于融合蛋白的构建。在一个实施方式中，重组融合蛋白中的信号调节蛋白是SIRPα，且信号调节蛋白的胞外Ig样结构域为SIRPα的第一胞外Ig样结构域(SIRPαD1)。
在一个实施方式中，重组融合蛋白包含核酸序列和氨基酸序列分别为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的SIRPαD1。在另一实施方式中，SIRPαD1可以包含与SEQ ID NO：2具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性的氨基酸序列，其中SIRPαD1能够与癌/肿瘤细胞表面的CD47结合并阻断CD47与巨噬细胞表面SIRP的相互作用。
接头主要起到SIRP的胞外Ig样结构域与HER2抗体重链或轻链N端之间的间隔物的作用。接头可以由肽键连接的氨基酸构成，优选由肽键连接的5-30个氨基酸，其中氨基酸选自20种天然存在的氨基酸。当两个拷贝的信号调节蛋白(SIRP)胞外Ig样结构域与HER2抗体的一个抗原结合互补位在构成该抗原结合互补位的重链和轻链的N端处结合时，可能需要相对较长的接头，大概10以上、或甚至15以上氨基酸残基的长度，以避免可能存在的空间位阻。这些氨基酸中的一个或多个可以糖基化，正如本领域技术人员所了解的。在一个实施方式中，5-30个氨基酸可以选自甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸和赖氨酸。在一个实施方式中，接头由大部分有空键位阻的氨基酸构成，例如甘氨酸和丙氨酸。示例性的接头为多聚甘氨酸(特别是(Gly、(Gly)8)、多聚(Gly-Ala)、以及多聚丙氨酸。以下实施例中的一个示例性合适接头为多聚(Gly-Ser)，例如-(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)3-。
接头也可以是非肽类接头。例如，可以使用烷基接头，例如-NH-、-(CH2)s-C(O)-，其中s＝2-20。这些烷基接头还可以经任何非空间位阻基团例如低级烷基(例如C1-6低级酰基)、卤素(例如Cl、Br)、CN、NH2、苯基等进行取代。
任何HER2抗体，特别是任何Ig样HER2抗体，可以用于本申请融合蛋白的形成中。HER2抗体可以是分离的单克隆抗体，例如曲妥珠单抗和Margetuximab。
在一些实施方式中，HER2抗体是包含两条重链和两条轻链的分离单抗，各重链具有SEQ ID NO：6的氨基酸序列，各轻链具有SEQ ID NO：8的氨基酸序列，这两个序列可以分别由SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：7的核酸序列编码。HER2抗体的Fab或抗原结合互补位能够与癌/肿瘤细胞表面的HER2结合，从而防止不受控癌细胞/肿瘤细胞生长的发生，而HER2抗体的Fc部分能够与NK细胞或巨噬细胞表面的FcR结合，以刺激NK细胞或巨噬细胞对癌细胞的杀灭。在一些实施方式中，重链可以包含与SEQ ID NO：6具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性的氨基酸序列，其中该HER2抗体能够与HER2结合，防止癌/肿瘤细胞的不受控生长的发生，且能够与NK细胞或巨噬细胞表面的FcR结合，从而激活NK细胞或巨噬细胞对癌细胞的杀灭。在一些实施方式中，轻链可以包含与SEQ ID NO：8具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性的氨基酸序列，其中该HER2抗体能够与HER2结合，防止癌/肿瘤细胞的不受控生长的发生。
如上所述，一个或两个拷贝的SIRP胞外Ig样结构域，特别是SIRPαD1，可以与HER2的其中之一或各个抗原结合互补位在构成该特定抗原结合互补位的重链和/或轻链的N端处连接。
同时，本申请提供编码重组融合蛋白的多核苷酸分子、和表达重组融合蛋白的表达载体。载体的例子包括但不限于质粒、病毒载体、酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)、可转化人工染色体(TAC)、哺乳动物人工染色体(MAC)和人工附加染色体(HAEC)。
本申请提供包含上述表达载体的宿主细胞。宿主细胞可以用表达载体进行转化或转染。合适的宿主细胞包括大肠杆菌(Escherichia coli)、酵母和其他真核细胞。优选地，使用大肠杆菌、酵母或哺乳动物细胞系(例如COS或CHO)。
另一方面，本申请提供一种药物组合物，其包含本申请的与药学上可接受佐剂配制在一起的融合蛋白。组合物可以任选地包含一种或多种其他药学活性成分，例如另一种抗体或药物。本申请的药物组合物也可以与例如另一种免疫刺激剂、抗癌剂或疫苗一起在联合疗法中进行施用。
药物组合物可以包含任何数量的赋形剂。可以使用的赋形剂包括载体、表面活性剂、增稠或乳化剂、固体粘合剂、分散或混悬助剂、稳定剂、着色剂、矫味剂、包衣、崩解剂、润滑剂、甜味剂、防腐剂、等渗剂、及其组合。合适赋形剂的选择和使用在Gennaro，ed.，Remington：The Science and Practice of Pharmacy，20th Ed.(Lippincott Williams&Wilkins 2003)中有过教导，其公开内容通过引用的方式并入本文。
药物组合物中的主要媒介物或载体可以是水性或非水性的。例如，合适的媒介物或载体可以是注射用水、生理盐水或人工脑脊液，其可能补充有注射中常见的其他材料。例如，媒介物或载体可以是中性缓冲盐溶液或混有血清白蛋白的盐溶液。其他示例性的药物组合物包含Tris缓冲液、或醋酸盐缓冲液，其还可以包含山梨醇或其合适的替代物。在本发明的一个实施方式中，组合物可以通过混合具有所需纯度的所选组分与任意的配制剂(Remington’s Pharmaceutical Sciences，同上)以冻干或水溶液形式制备而用于储存。此外，药物组合物可以使用合适的赋形剂例如蔗糖配制为冻干型产品。
优选地，药物组合物适用于静脉、肌内、皮下、非肠道、脊柱、表皮给药(例如，通过注射或推注)。取决于给药途径的不同，活性分子可以包裹在某些材料中以保护其免受可能使其失活的酸和其他自然条件的作用。本文所用的术语“非肠道给药”是指除通常通过注射进行的肠道和局部给药外的给药模式，且包括而不限于，静脉、肌内、动脉内、膜内、囊内、眶内、心脏内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬脑膜、和胸骨内注射和输注。或者，本发明的抗体可以通过非注射途径给药，例如局部的、表皮的或粘膜的给药模式，例如，鼻内、经口、阴道、直肠、舌下、或局部给药。
药物组合物可以是无菌水溶液或混悬液的形式。它们也可以配制成微乳剂、脂质体、或其他适用于高浓度药物的有序结构。
可以与载体材料结合来制备单剂型的活性成分的量，取决于待治疗的受试者和特定的给药途径而各异，且通常是产生疗效的组合物的量。通常而言，以百分比计，该量为约0.01％-约99％的活性成分，优选为约0.1％-约70％，更优选为约1％-约30％的活性成分，其余为药学上可接受的载体。
给药方案可以调整以给出最优的所需反应(例如，治疗反应)。例如，随时间推进施用多个分剂量，或者根据治疗情况的危急程度而成比例地减少或增加剂量。特别有利的是，以剂量单位配制非肠道组合物，以方便给药且有利于剂量的均一性。本文所用的剂量单位型是指适用于待治疗受试者的单次给药的物理上分离的单元；各单元包含事先计算出的与药物载体一起产生所需的疗效的活性化合物的量。或者，融合蛋白可以以持续释放剂型进行给药，在这种情况下，给药的频率降低。
对于融合蛋白的给药，剂量范围为0.0001-100mg/kg宿主体重，更常见的为0.01-10mg/kg。例如，剂量可以为0.3mg/kg体重、1mg/kg体重、3mg/kg体重、5mg/kg体重、或10mg/kg体重，或在1-10mg/kg的范围内。示例性的治疗方案为，给药频率为每周两次、每周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次、每月一次、每三个月一次、或每三至六个月一次。本发明融合蛋白的优选给药方案包括腹膜内给药，3mg/kg体重或6mg/kg体重，使用如下的一种给药时间表：(i)每四周给药六次，之后每三月给药一次；(ii)每三周给药一次；(iii)3mg/kg体重一次，之后为1mg/kg体重，每三周一次；(vi)6mg/kg体重，每周一次。在一些方法中，调整剂量以达到约1-1000μg/ml的血浆抗体浓度，在一些方法中为约25-300μg/ml。
“治疗有效量”的本发明融合蛋白优选地引起疾病症状的严重程度的降低、无疾病症状时期的频率和持续时间的上升、或防止由感病性引起的损伤和无能。例如，对于荷肿瘤受试者的治疗，“治疗有效量”是指，相对于未治疗的受试者，肿瘤生长抑制至少约40％，更优选抑制至少约99％。治疗有效量的本发明融合蛋白可以在受试者(通常为人，或者可以为另一种哺乳动物)中减小肿瘤大小、或者减轻症状。
药物组合物可以是受控释放制剂，包括植入物、透皮贴剂、和微囊化递送系统。可以使用可生物降解的生物相容性多聚物，例如乙烯-醋酸乙烯共聚物、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原蛋白、聚原酸酯、和聚乳酸。参见，例如Sustained and Controlled Release DrugDelivery Systems，J.R.Robinson，ed.，Marcel Dekker，Inc.，New York，1978。
药物组合物可以通过以下医疗装置进行施用，例如(1)无针皮下注射装置(例如，美国专利5,399,163、5,383,851、5,312,335、5,064,413、4,941,880、4,790,824、和4,596,556)；(2)微输注泵(美国专利4,487,603)；(3)透皮装置(美国专利4,486,194)；(4)输注装置(美国专利4,447,233和4,447,224)；和渗透装置(美国专利4,439,196和4,475,196)，其公开内容通过引用的方式并入本文。
在某些实施方式中，本发明的融合蛋白可以配制成保证合适的体内分布。例如，为保证本发明的治疗融合蛋白跨过血脑屏障，将融合蛋白配制成脂质体，其还可以额外地包含靶向基团以加强对特定细胞或器官的选择性传输。参见，例如，美国专利4,522,811、5,374,548、5,416,016、和5,399,331。
本申请还涉及体内基因疗法，其中将编码本发明融合蛋白或其衍生蛋白的核酸分子直接引入受试者中。例如，将编码本发明重组融合蛋白的核酸序列经由带有或不带有合适递送载体例如腺相关病毒载体的核酸构建体经局部注射而引入目标细胞。可供选择的病毒载体包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、单纯疱疹病毒、和乳头状瘤病毒载体。病毒载体的物理转移可以通过所需核酸构建体的局部注射、或包含所需核酸序列的其他合适递送载体、脂质体介导的转移、直接注射(裸露的DNA)、或微粒轰击(基因枪)而在体内实现。
本公开的组合物可以单独使用，或者与其他用于增强其疗效或降低潜在副作用的治疗剂联合使用。
本发明的另一目的是提供制备上述重组融合蛋白以及包含该蛋白的药物组合物的方法。在一个实施方式中，制备方法包括以下步骤：(1)提供编码蛋白的多核苷酸；(2)构建包含(1)的多核苷酸的表达载体；(3)用(2)中的表达载体转染或转化合适的宿主细胞并进行培养以在宿主细胞中表达蛋白；以及(4)纯化蛋白。该制备可以由普通技术人员以熟知的技术执行。
本发明的另一目标是提供使用本发明药物组合物来治疗癌症的方法，包括向有该需求的患者或受试者施用有效量的上述药物组合物。在一个实施方式中，药物组合物用于治疗过表达CD47和/或HER2的肿瘤或癌症，包括但不限于急性髓细胞样白血病(AML)、慢性髓细胞样白血病(CML)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、多发性骨髓瘤(MM)、膀胱癌、卵巢癌、前列腺癌、肺癌、结肠癌、乳癌、胰腺癌和肾癌。
在一个实施方式中，与过表达CD47和/或HER2相关的疾病包括但不限于克罗恩病、过敏性哮喘和类风湿性关节炎。
本申请将参照以下非限制性实施例进行进一步说明。
实施例
在以下的实施例中，IMM29是HER2特异抗体。该抗体具有两条重链和两条轻链，各重链具有SEQ ID NO：6的氨基酸序列，各轻链具有SEQ ID NO：8的氨基酸序列，这两个氨基酸序列可以分别由核酸序列SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：7编码。
IMM2901是能够与CD47和HER2结合的重组融合蛋白，包含两个SIRPαD1，各个SIRPαD1经由GS接头与IMM29在各重链的N端处结合，其中SIRPαD1具有分别如SEQ ID NO：1和SEQID NO：2所示的核酸序列和氨基酸序列，接头具有SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列，其可以由SEQ ID NO：3所示的核酸序列编码。
IMM2902也是能够与CD47和HER2结合的重组融合蛋白，其与IMM2901的不同之处在于各个SIRPαD1经由GS-接头与IMM29在各轻链的N端处连接。
IMM01是能够与CD47结合的融合蛋白，由连接Fc片段的SIRPαD1构成，其在WO2016169261中有过记载。该融合蛋白的核酸序列和氨基酸序列分别如SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14所示。
IMM0404是重组融合蛋白，包含两个SIRPαD1，各个SIRPαD1经由GS-接头与EGFR抗体在各重链的N端处连接。SIRPαD1-GS接头-EGFR重链具有分别如SEQ ID NO：15和SEQ IDNO：16所示的核酸序列和氨基酸序列。EGFR抗体的轻链具有SEQ ID NO：18所示的氨基酸序列，其可以由SEQ ID NO：17所示的核酸序列所编码。
这些蛋白的结构示于图1。
实施例1.表达IMM29、IMM2901、IMM2902、IMM01和IMM0404的载体的构建
1.1 IMM29
人工设计IMM29的全长编码序列。具体地，重链和轻链可变区的编码序列得自赫赛汀(曲妥珠单抗)。将编码小鼠IgG1重链的信号肽的57个核苷酸(SEQ ID NO：19)加至重链编码序列(SEQ ID NO：5)或轻链编码序列(SEQ ID NO：7)的5’端，并将Kozak序列(SEQ IDNO.：20)加至信号肽序列的5’端。之后，将HindIII和NheI限制性酶切位点加至所得重链序列的5’和3’端，并将HindIII和XbaI限制性酶切位点加至所得轻链序列的5’和3’端。经金斯瑞分别合成两条所得的序列(ID#：T84300(重链)；T85555(轻链))，并亚克隆到pMac-H和pMac-L载体中。
1.2 IMM2901
IMM2901轻链的表达载体与IMM29的轻链表达载体相同。对于重链载体的构建，信号调节蛋白(SIRP)第一胞外结构域(SIRPαD1)的编码序列(SEQ ID NO：1)经GS-接头(SEQID NO：3)与IMM29的重链编码序列(SEQ ID NO：5)的N端连接(全部为SEQ ID NO：9)。将编码小鼠IgG1重链的信号肽的57个核苷酸(SEQ ID NO：19)加至SIRPαD1编码序列的5’端，并将Kozak序列(SEQ ID NO.：20)加至信号肽序列的5’端。最后，将HindIII和NheI限制性酶切位点加至所得序列的5’和3’端。经Convenience Biology合成所得序列(ID#：Y0000506-1-A10863)，并亚克隆到pMac-H载体中。
1.3 IMM2902
IMM2902重链的表达载体与IMM29的重链表达载体相同。对于轻链载体的构建，信号调节蛋白(SIRP)第一胞外结构域(SIRPαD1)的编码序列(SEQ ID NO：1)经GS-接头(SEQID NO：3)与IMM29的轻链编码序列(SEQ ID NO：7)的N端连接(全部为SEQ ID NO：11)。将编码小鼠IgG1重链的信号肽的57个核苷酸(SEQ ID NO：19)加至SIRPαD1编码序列的5’端，并将Kozak序列(SEQ ID NO.：20)加至信号肽序列的5’端。最后，将HindIII和XbaI限制性酶切位点分别加至所得序列的5’和3’端。经Convenience Biology(ID#：Y0000506-2-A10868)合成所得序列，并亚克隆到pMac-L载体中。
1.4 IMM01
SIRPαD1-Fc的表达盒设计成按序连接Kozak序列(SEQ ID NO.：20)、信号肽的编码序列(SEQ ID NO：19)和SIRPαD1-Fc(SEQ ID NO.：13)。将HindIII和EcoRI限制性酶切位点分别加至所得序列的5’和3’端，经Convenience Biology(ID#：CN1418-F9043)合成，并亚克隆到pMac-Fc载体中。
1.5 IMM0404
IMM0404轻链的表达盒设计成按序连接Kozak序列(SEQ ID NO.：20)、信号肽的编码序列(SEQ ID NO：19)和EGFR抗体(爱必妥(西妥昔单抗))的轻链(SEQ ID NO.：17)。将HindIII和XbaI限制性酶切位点分别加至所得序列的5’和3’端，经Convenience Biology(ID#：NJ0719028J_A6315)合成，并亚克隆到pMac-L载体中。对于重链载体的构建，信号调节蛋白(SIRP)第一胞外结构域(SIRPαD1)的编码序列经GS-接头与EGFR特异抗体重链编码序列的N端连接，SIRPαD1-GS接头-重链由SEQ ID NO.：15编码。将编码小鼠IgG1重链的信号肽的57个核苷酸(SEQ ID NO：19)加至SIRPαD1-GS接头-重链(SEQ ID NO：15)的5’端，并将Kozak序列(SEQ ID NO.：20)加至信号肽序列的5’端。最后，将HindIII和NheI限制性酶切位点加至所得序列的5’和3’端，经金斯瑞合成所得序列(ID#：M17025)，并亚克隆到pMac-H载体中。
实施例2.蛋白表达和纯化
为制备所需的蛋白，将实施例1的表达载体经电穿孔导入中国仓鼠卵巢(CHO)细胞(ATCC，Cat#CCL-61)中，使这些细胞接受几轮的新霉素压力选择。选出的稳定细胞在无血清Balan CD CHO生长A培养基(Irvine Scientific，Cat#94120)中适应。对于蛋白表达，将细胞接种到3L生物反应器中并以流加培养法培养。当细胞活力降到～80％时，终止反应器中的反应，收取细胞培养上清液并通过亲和色谱法进行蛋白纯化。重组蛋白的纯度高于95％，且内毒素的量低于0.5U/g。
实施例3.IMM2901和IMM2902与CD47或HER2结合
重组蛋白的CD47或HER2结合能力通过酶联免疫吸附检定(ELISA)测定。重组人CD47(Lot#LC10DE2004，义翘神州)和ErbB2(Lot#LC11MC0201，义翘神州)分别制备在包被缓冲液中(产品代码：1001329288C3041-100CAP，Sigma-Aldrich Co.)，并转移到ELISA板(Cat#442404，NuncTM)，50ng/孔。将板放置在4℃冰箱中过夜。进行检测时，在加入滴定用蛋白前，将板用含有0.05％吐温20的PBS(PBS-T)洗三遍，将板室温孵育1小时。将板用PBS-T再洗5遍，向板加入HRP-兔抗人IgG Fc(Cat#：309-036-008，Jackson ImmunoResearch Lab)并于室温孵育1小时。在板用PBS-T洗5遍后，向板加入底物，并在用IN H2SO4停止显色后在酶标仪中读板。
IMM2901和IMM2902分别以0.1903nM和0.3894nM的EC5o值与CD47结合(图2)，并分别以0.7435nM和0.5931nM的EC50值与HER2结合(图3)，比传统单抗原结合抗体略差。
实施例4.IMM2902激活对HL-60的吞噬
将小鼠巨噬细胞细胞系Aha-1在96孔细胞培养板中铺板，每孔1x105个细胞，并于37℃和5％CO2培养16-18小时。用CFSE标记靶细胞(HL-60)，之后与梯度稀释的IMM2902或对照蛋白孵育45分钟。将含有待测蛋白的靶细胞溶液转移到含有Aha-1细胞的板中，Aha-1细胞与HL-60细胞的数量比为1∶3。将混合物在细胞培养孵育器中培养2小时，之后经FACS分析Ana-1细胞中的CFSE密度。
如图4所示，IMM2902激活大量的肿瘤细胞吞噬。
实施例5.IMM2902具有较高的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)
CFSE标记的BT-474细胞(用作靶细胞)与稳定表达FcγRIIIa的NK92MI细胞(效应细胞)以1∶2的比混合，且混合的细胞于5％CO2在梯度稀释的IMM2902或对照蛋白的存在下于37℃培养4小时。之后向细胞培养液中加入5g/ml碘化丙啶(PI)(Sigma，Cat#P4170)，浓度5μg/ml，细胞培养液经FACS分析PI信号。由ADCC介导的细胞裂解百分比基于以下公式计算：
裂解％＝(带有IMM2902或对照蛋白的PI阳性细胞％-带有阴性对照蛋白的PI阳性细胞％)/(100-带有阴性对照蛋白的PI阳性细胞％)*100
如图5所示，IMM2902与IMM29和赫赛汀相比，具有相当或更高的ADCC活性。
实施例6.IMM2902引起HER2内化
将200L含有5％FBS的DMEM培养基中的1x106BT-474细胞在96孔细胞培养板中铺板，并于37℃、5％CO2孵育过夜。第二天，将板从孵育器中拿出，并将培养基用含有滴定用蛋白的新鲜培养基替换。将板在细胞培养孵育器中再孵育4小时，之后清洗细胞，并用FITC耦合的对人IgG Fc部分特异的抗体进行染色。内化的HER2受体的百分比基于以下公式计算：
内化率＝(1-MFI/MFIt＝0)*100％
MFI：平均荧光强度
根据图6，IMM2902能够引起与IMM29或赫赛汀相当水平的HER2内化。
实施例7.IMM2902具有良好的杭肿瘤效果
BT-474人乳癌细胞(号：HTB-20，批号：63087043)在含有10％FBS的DMEM培养基中于37℃、5％CO2培养。
收集细胞，并将其重悬于无血清DMEM培养基中，1×108/mL。以1∶1的体积比在培养基中加入基质胶，并混合，然后放置在冰上，待用。
55只裸鼠在右侧皮下注射BT-474细胞，每只小鼠1x107个细胞。从肿瘤细胞注射前一周至测试结束，对这些小鼠进行肌内注射雌激素，一周三次(每个周一、周三和周五)，以保持激素依赖性肿瘤的生长。
当肿瘤体积达到100-150mm3时，36只小鼠随机分成6组，每组6只小鼠。小鼠分别经腹膜注射PBS、IMM01(3.0mg/kg)、赫赛汀(5.0mg/kg)、IMM29(5.0mg/kg)、IMM2909(6.0mg/kg)、和IMM01+IMM29(3.0mg/kg+5.0mg/kg)进行处理，持续三周，每周两次。总共给予6次处理。第一次给药的那天定义为第0天。一周两次测量肿瘤体积和体重。
在处理过程中，如果小鼠体重减轻15％以上，则停止给药，直至体重减轻变为10％以下。当任何组的平均肿瘤体积超过2000mm3或实验完成时，处死动物。
肿瘤体积(V)计算为(长×宽2)/2。肿瘤生长抑制率(TGI)用以下公式计算：肿瘤生长抑制率＝(1-给药组肿瘤体积变化/对照组肿瘤体积变化)×100％。使用Dunnett's多重比较来计算组间差异。
表1.IMM2902和其他抗体的抗肿瘤效果
组别 药物 动物# 剂量(mg/kg) 处理 TGI*
1 PBS 6 N/A i.p，b.i.w×3
2 IMM01 6 3.0 i.p，b.i.w×3 25.46％
3 赫赛汀 6 5.0 i.p，b.i.w×3 86.95％
4 IMM29 6 5.0 i.p，b.i.w×3 104.23％
5 IMM2902 6 6.0 i.p，b.i.w×3 115.28％
6 IMM01+IMM29 6 3.0+5.0 i.p，b.i.w×3 110.88％
第5组的肿瘤生长抑制率(TGI)为115.28％，高于其他组，如以上表1和图7所示，表明IMM2902的效力比单抗原靶向抗体要好。特别地，第5组的TGI甚至比IMM01和IMM29联用组的TGI更高。
实施例8.IMM0404在HT-29或NCI-H1975异种移植模型中的抗肿瘤适性
8.1 HT-28异种移植模型
HT-29人结肠癌细胞在含有10％FBS的McCoy's 5A培养基中于37℃、5％CO2培养。
在对数生长期收集细胞，并重悬于1×PBS。以1∶1的体积比在混悬液中加入基质胶，并混合，混合物包含3×107个细胞每毫升。
40只小鼠在右侧皮下注射HT-29细胞，每只小鼠3x106个细胞。当肿瘤体积达到100-200mm3时，动物随机分成5组，每组8只小鼠。小鼠分别经腹膜注射PBS、IMM01(1.2mg/kg)、爱必妥(2.0mg/kg)、IMM0404(2.7mg/kg)、和IMM01+爱必妥(1.2mg/kg+2.0mg/kg)进行处理，持续四周，每周一次。总共给予4次处理。第一次给药的那天定义为第0天。一周两次测量肿瘤体积和体重。
肿瘤体积(V)计算为(长×宽2)/2。肿瘤生长抑制率(TGI)用以下公式计算：肿瘤生长抑制率＝(1-给药组肿瘤体积变化/对照组肿瘤体积变化)×100％。使用student测试来计算组间差异。
表2.IMM0404和其他抗体的抗肿瘤效果
组别 药物 动物# 剂量(mg/kg) 处理 TGI*
1 PBS 8 N/A i.p，q.w.×4
2 IMM01 8 1.2 i.p，q.w.×4 32.79％
3 爱必妥 8 2.0 i.p，q.w.×4 40.00％
4 IMM0404 8 2.7 i.p，q.w.×4 18.48％
5 IMM01+爱必妥 8 1.2+2.0 i.p，q.w.×4 33.04％
从表2和图8可以看出，在该异种移植模型中，IMM0404相比其他蛋白没有显示出更好的抗肿瘤活性。
8.2 NCI-H1975异种移植模型
NCI-H1975非小细胞肺癌细胞在含有10％FBS(GIBCO，US)的RPMI-1640培养基中于37℃、5％CO2培养。
在对数生长期收集细胞，并重悬于1×PBS，每毫升1×107个细胞。
40只SCID小鼠在右侧皮下注射NCI-H1975细胞，每只小鼠1x106个细胞。当肿瘤体积达到100-200mm3时，这些动物随机分成5组，每组8只小鼠。小鼠分别经腹膜注射PBS、IMM01(2.7mg/kg)、爱必妥(5.0mg/kg)、IMM0404(6.0mg/kg)、和IMM01+爱必妥(2.7mg/kg+5.0mg/kg)进行处理，持续三周，每周一次。总共给予3次处理。第一次给药的那天定义为第0天。一周两次测量肿瘤体积和体重。
肿瘤体积(V)计算为(长×宽2)/2。肿瘤生长抑制率(TGI)用以下公式计算：肿瘤生长抑制率＝(1-给药组肿瘤体积变化/对照组肿瘤体积变化)×100％。使用student测试来计算组间差异。
表3.IMM0404和其他抗体的抗肿瘤效果
组别 药物 动物# 剂量(mg/kg) 处理 TGI*
1 PBS 8 N/A i.p，q.w.×3
2 IMM01 8 2.7 i.p，q.w.×3 49.49％
3 爱必妥 8 5.0 i.p，q.w.×3 85.69％
4 IMM0404 8 6.0 i.p，q.w.×3 68.77％
5 IMM01+爱必妥 8 2.7+5.0 i.p，q.w.×3 76.03％
从表3和图9可以看出，IMM0404的抗肿瘤活性好于IMM01，但是略差于爱必妥以及IMM01+爱必妥。
这个实施例中的数据表明，双特异抗性并不一定示出比单抗原靶向抗体更优的效力。
尽管本发明已经在以上连同一个或多个实施方式进行了描述，应当理解的是，本发明不限于那些实施方式，且说明意在涵盖可能包括在所附权利要求的宗旨和范围内的所有可变方式、修改方式和等同方式。所有在本文中引用的文献通过引用的方式进一步全部并入本文。
本申请中的序列总结如下。
SEQ ID NO：1 SIRPα的第一胞外Ig样结构域
SEQ ID NO：2 SIRPα的第一胞外Ig样结构域
SEQ ID NO：3接头
SEQ ID NO：4接头
SEQ ID NO：5 HER2抗体的重链
SEQ ID NO：6 HER2抗体的重链
SEQ ID NO：7 HER2抗体的轻链
SEQ ID NO：8 HER2抗体的轻链
SEQ ID NO：9SIRPαD1-接头-HER2抗体重链
SEQ ID NO：10 SIRPaD1-接头-HER2抗体重链
SEQ ID NO：11 SIRPaD1-接头-HER2抗体轻链
SEQ ID NO：12 SIRPαD1-接头-HER2抗体轻链
SEQ ID NO：13 SIRPαD1-Fc
SEQ ID NO：14SIRPαD1-Fc
SEQ ID NO：15SIRPaD1-接头-EGFR抗体轻链
SEQ ID NO：16SIRPaD1-接头-EGFR抗体轻链
SEQ ID NO：17 EGFR抗体轻链
SEQ ID NO：18 EGFR抗体轻链
SEQ ID NO：19小鼠IgG1重链信号肽
SEQ ID NO：20Kozak
序列表
<110> 宜明昂科生物医药技术（上海）有限公司
<120> 靶向CD47和HER2的重组双功能蛋白
<130> 55525 00015
<150> US 62/716,356
<151> 2018-08-08
<160> 20
<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
<211> 375
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码SIRPα的第一胞外Ig样结构域的核苷酸
<400> 1
gaggaggagc tgcaggtgat tcagcctgac aagtccgtat cagttgcagc tggagagtcg 60
gccattctgc actgcactgt gacctccctg atccctgtgg ggcccatcca gtggttcaga 120
ggagctggac cagcccggga attaatctac aatcaaaaag aaggccactt cccccgggta 180
acaactgttt cagagtccac aaagagagaa aacatggact tttccatcag catcagtgcc 240
atcaccccag cagatgccgg cacctactac tgtgtgaagt tccggaaagg gagccctgac 300
acggagttta agtctggagc aggcactgag ctgtctgtgc gtgccaaacc ctctgccccc 360
gtggtatcgg gccct 375
<210> 2
<211> 125
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 2
Glu Glu Glu Leu Gln Val Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Ser Val Ala
1 5 10 15
Ala Gly Glu Ser Ala Ile Leu His Cys Thr Val Thr Ser Leu Ile Pro
20 25 30
Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Ala Arg Glu Leu
35 40 45
Ile Tyr Asn Gln Lys Glu Gly His Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser
50 55 60
Glu Ser Thr Lys Arg Glu Asn Met Asp Phe Ser Ile Ser Ile Ser Ala
65 70 75 80
Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys Phe Arg Lys
85 90 95
Gly Ser Pro Asp Thr Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu Ser
100 105 110
Val Arg Ala Lys Pro Ser Ala Pro Val Val Ser Gly Pro
115 120 125
<210> 3
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码接头的核苷酸
<400> 3
ggcggcggtg ggagcggcgg cggtgggagc ggcggcgggg gctcg 45
<210> 4
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 4
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 5
<211> 1353
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码HER2抗体重链的核苷酸
<400> 5
gaggtgcagc tggtcgagag cggcgggggc ctcgtgcagc cgggcgggtc gctgcggctg 60
agctgcgccg cgagcgggtt caacatcaag gacacctaca tccactgggt gcgccaggcc 120
cccggcaagg gcctcgagtg ggtcgcccgg atctacccca cgaacgggta cacccgctac 180
gccgacagcg tgaagggccg gttcaccatc agcgcggaca cctcgaagaa cacggcctac 240
ctgcagatga acagcctgcg cgccgaggac accgccgtgt actactgcag ccggtggggc 300
ggcgacgggt tctacgccat ggactactgg gggcagggca ccctcgtcac cgtgagcagc 360
gctagcacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 420
ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 480
tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 540
ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 600
tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagag agttgagccc 660
aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 720
ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 780
gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 840
tatgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 900
gccacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aagactggct gaatggcaag 960
gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgccgc aaccatctcc 1020
aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggaggag 1080
atgaccaaga accaagtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 1140
gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 1200
ctggactccg acggctcctt cttcctctat tccaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 1260
cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 1320
cagaagagcc tctccctgtc tccgggcaaa tga 1353
<210> 6
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HER2抗体重链
<400> 6
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ala Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Ala
325 330 335
Ala Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys
450
<210> 7
<211> 645
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码HER2抗体轻链的核苷酸
<400> 7
gacatccaga tgacccagag cccgtcgagc ctgagcgcca gcgtgggcga ccgggtcacg 60
atcacctgcc gcgcgagcca ggacgtgaac accgccgtgg cctggtacca gcagaagccc 120
gggaaggccc ccaagctcct gatctactcg gcgagcttcc tgtacagcgg cgtccccagc 180
cggttcagcg ggtcgcgcag cggcaccgac ttcacgctca ccatcagcag cctgcagccg 240
gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag cactacacca cgccccccac cttcgggcag 300
ggcaccaagg tggagatcaa gcgaactgtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 360
tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 420
cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480
gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540
ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600
ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gttag 645
<210> 8
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HER2抗体轻链
<400> 8
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 9
<211> 1773
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码SIRPαD1-接头-HER2抗体重链的核苷酸
<400> 9
gaggaggagc tgcaggtgat tcagcctgac aagtccgtat cagttgcagc tggagagtcg 60
gccattctgc actgcactgt gacctccctg atccctgtgg ggcccatcca gtggttcaga 120
ggagctggac cagcccggga attaatctac aatcaaaaag aaggccactt cccccgggta 180
acaactgttt cagagtccac aaagagagaa aacatggact tttccatcag catcagtgcc 240
atcaccccag cagatgccgg cacctactac tgtgtgaagt tccggaaagg gagccctgac 300
acggagttta agtctggagc aggcactgag ctgtctgtgc gtgccaaacc ctctgccccc 360
gtggtatcgg gccctggcgg cggtgggagc ggcggcggtg ggagcggcgg cgggggctcg 420
gaggtgcagc tggtcgagag cggcgggggc ctcgtgcagc cgggcgggtc gctgcggctg 480
agctgcgccg cgagcgggtt caacatcaag gacacctaca tccactgggt gcgccaggcc 540
cccggcaagg gcctcgagtg ggtcgcccgg atctacccca cgaacgggta cacccgctac 600
gccgacagcg tgaagggccg gttcaccatc agcgcggaca cctcgaagaa cacggcctac 660
ctgcagatga acagcctgcg cgccgaggac accgccgtgt actactgcag ccggtggggc 720
ggcgacgggt tctacgccat ggactactgg gggcagggca ccctcgtcac cgtgagcagc 780
gctagcacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 840
ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 900
tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 960
ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 1020
tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagag agttgagccc 1080
aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 1140
ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 1200
gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 1260
tatgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 1320
gccacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aagactggct gaatggcaag 1380
gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgccgc aaccatctcc 1440
aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggaggag 1500
atgaccaaga accaagtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 1560
gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 1620
ctggactccg acggctcctt cttcctctat tccaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 1680
cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 1740
cagaagagcc tctccctgtc tccgggcaaa tga 1773
<210> 10
<211> 590
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SIRPαD1-接头-HER2抗体重链
<400> 10
Glu Glu Glu Leu Gln Val Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Ser Val Ala
1 5 10 15
Ala Gly Glu Ser Ala Ile Leu His Cys Thr Val Thr Ser Leu Ile Pro
20 25 30
Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Ala Arg Glu Leu
35 40 45
Ile Tyr Asn Gln Lys Glu Gly His Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser
50 55 60
Glu Ser Thr Lys Arg Glu Asn Met Asp Phe Ser Ile Ser Ile Ser Ala
65 70 75 80
Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys Phe Arg Lys
85 90 95
Gly Ser Pro Asp Thr Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu Ser
100 105 110
Val Arg Ala Lys Pro Ser Ala Pro Val Val Ser Gly Pro Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu
130 135 140
Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu
145 150 155 160
Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr Ile His Trp
165 170 175
Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Arg Ile Tyr
180 185 190
Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe
195 200 205
Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn
210 215 220
Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser Arg Trp Gly
225 230 235 240
Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
245 250 255
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
260 265 270
Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
275 280 285
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
290 295 300
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
305 310 315 320
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
325 330 335
Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr
340 345 350
Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr
355 360 365
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
370 375 380
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
385 390 395 400
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
405 410 415
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
420 425 430
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ala Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
435 440 445
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
450 455 460
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Ala Ala Thr Ile Ser
465 470 475 480
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
485 490 495
Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
500 505 510
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
515 520 525
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
530 535 540
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
545 550 555 560
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
565 570 575
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
580 585 590
<210> 11
<211> 1065
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码SIRPαD1-接头-HER2抗体轻链的核苷酸
<400> 11
gaggaggagc tgcaggtgat tcagcctgac aagtccgtat cagttgcagc tggagagtcg 60
gccattctgc actgcactgt gacctccctg atccctgtgg ggcccatcca gtggttcaga 120
ggagctggac cagcccggga attaatctac aatcaaaaag aaggccactt cccccgggta 180
acaactgttt cagagtccac aaagagagaa aacatggact tttccatcag catcagtgcc 240
atcaccccag cagatgccgg cacctactac tgtgtgaagt tccggaaagg gagccctgac 300
acggagttta agtctggagc aggcactgag ctgtctgtgc gtgccaaacc ctctgccccc 360
gtggtatcgg gccctggcgg cggtgggagc ggcggcggtg ggagcggcgg cgggggctcg 420
gacatccaga tgacccagag cccgtcgagc ctgagcgcca gcgtgggcga ccgggtcacg 480
atcacctgcc gcgcgagcca ggacgtgaac accgccgtgg cctggtacca gcagaagccc 540
gggaaggccc ccaagctcct gatctactcg gcgagcttcc tgtacagcgg cgtccccagc 600
cggttcagcg ggtcgcgcag cggcaccgac ttcacgctca ccatcagcag cctgcagccg 660
gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag cactacacca cgccccccac cttcgggcag 720
ggcaccaagg tggagatcaa gcgaactgtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 780
tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 840
cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 900
gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 960
ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 1020
ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gttag 1065
<210> 12
<211> 354
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SIRPαD1-接头-HER2抗体轻链
<400> 12
Glu Glu Glu Leu Gln Val Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Ser Val Ala
1 5 10 15
Ala Gly Glu Ser Ala Ile Leu His Cys Thr Val Thr Ser Leu Ile Pro
20 25 30
Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Ala Arg Glu Leu
35 40 45
Ile Tyr Asn Gln Lys Glu Gly His Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser
50 55 60
Glu Ser Thr Lys Arg Glu Asn Met Asp Phe Ser Ile Ser Ile Ser Ala
65 70 75 80
Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys Phe Arg Lys
85 90 95
Gly Ser Pro Asp Thr Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu Ser
100 105 110
Val Arg Ala Lys Pro Ser Ala Pro Val Val Ser Gly Pro Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met
130 135 140
Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr
145 150 155 160
Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala Val Ala Trp Tyr
165 170 175
Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser
180 185 190
Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly
195 200 205
Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala
210 215 220
Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln
225 230 235 240
Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe
245 250 255
Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val
260 265 270
Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp
275 280 285
Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr
290 295 300
Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr
305 310 315 320
Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val
325 330 335
Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly
340 345 350
Glu Cys
<210> 13
<211> 1101
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码SIRPαD1-Fc的核苷酸
<400> 13
gaggaggagc tgcaggtgat tcagcctgac aagtccgtat cagttgcagc tggagagtcg 60
gccattctgc actgcactgt gacctccctg atccctgtgg ggcccatcca gtggttcaga 120
ggagctggac cagcccggga attaatctac aatcaaaaag aaggccactt cccccgggta 180
acaactgttt cagagtccac aaagagagaa aacatggact tttccatcag catcagtgcc 240
atcaccccag cagatgccgg cacctactac tgtgtgaagt tccggaaagg gagccctgac 300
acggagttta agtctggagc aggcactgag ctgtctgtgc gtgccaaacc ctctgccccc 360
gtggtatcgg gccctgcggc gagggccaca cctcagcacg aattcgagcc caaatcttgt 420
gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc 480
ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 540
tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 600
ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 660
cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 720
tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 780
gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggatga gctgaccaag 840
aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 900
tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 960
gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 1020
aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 1080
ctctccctgt ctccgggttg a 1101
<210> 14
<211> 366
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SIRPαD1-Fc
<400> 14
Glu Glu Glu Leu Gln Val Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Ser Val Ala
1 5 10 15
Ala Gly Glu Ser Ala Ile Leu His Cys Thr Val Thr Ser Leu Ile Pro
20 25 30
Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Ala Arg Glu Leu
35 40 45
Ile Tyr Asn Gln Lys Glu Gly His Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser
50 55 60
Glu Ser Thr Lys Arg Glu Asn Met Asp Phe Ser Ile Ser Ile Ser Ala
65 70 75 80
Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys Phe Arg Lys
85 90 95
Gly Ser Pro Asp Thr Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu Ser
100 105 110
Val Arg Ala Lys Pro Ser Ala Pro Val Val Ser Gly Pro Ala Ala Arg
115 120 125
Ala Thr Pro Gln His Glu Phe Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His
130 135 140
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val
145 150 155 160
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
165 170 175
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
180 185 190
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
195 200 205
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
210 215 220
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
225 230 235 240
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
245 250 255
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
260 265 270
Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
275 280 285
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
290 295 300
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
305 310 315 320
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
325 330 335
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
340 345 350
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
355 360 365
<210> 15
<211> 1749
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码SIRPαD1-接头-EGFR抗体轻链的核苷酸
<400> 15
gaggaggagc tgcaggtgat tcagcctgac aagtccgtat cagttgcagc tggagagtcg 60
gccattctgc actgcactgt gacctccctg atccctgtgg ggcccatcca gtggttcaga 120
ggagctggac cagcccggga attaatctac aatcaaaaag aaggccactt cccccgggta 180
acaactgttt cagagtccac aaagagagaa aacatggact tttccatcag catcagtgcc 240
atcaccccag cagatgccgg cacctactac tgtgtgaagt tccggaaagg gagccctgac 300
acggagttta agtctggagc aggcactgag ctgtctgtgc gtgccaaacc ctctggcggc 360
ggtgggagcg gcggcggtgg gagcggcggc gggggctcgc aggtgcagct gaagcagtca 420
ggacctggcc tagtgcagcc ctcacagagc ctgtccatca cctgcacagt ctctggtttc 480
tcattaacta actatggtgt acactgggtt cgccagtctc caggaaaggg tctggagtgg 540
ctgggagtga tatggagtgg tggaaacaca gactataata cacctttcac atccagactg 600
agcatcaaca aggacaattc caagagccaa gttttcttta aaatgaacag tctgcaatct 660
caggacacag ccatatatta ctgtgccaga gccctcacct actatgatta cgagtttgct 720
tactggggcc aagggactct ggtcactgtc tctgcagcta gcaccaaggg cccatcggtc 780
ttccccctgg caccctcctc caagagcacc tctgggggca cagcggccct gggctgcctg 840
gtcaaggact acttccccga accggtgacg gtgtcgtgga actcaggcgc cctgaccagc 900
ggcgtgcaca ccttcccggc tgtcctacag tcctcaggac tctactccct cagcagcgtg 960
gtgaccgtgc cctccagcag cttgggcacc cagacctaca tctgcaacgt gaatcacaag 1020
cccagcaaca ccaaggtgga caagagagtt gagcccaaat cttgtgacaa aactcacaca 1080
tgcccaccgt gcccagcacc tgaactcctg gggggaccgt cagtcttcct cttcccccca 1140
aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac 1200
gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc aactggtatg tggacggcgt ggaggtgcat 1260
aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag tacaacgcca cgtaccgtgt ggtcagcgtc 1320
ctcaccgtcc tgcaccaaga ctggctgaat ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac 1380
aaagccctcc cagcccccat cgccgcaacc atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa 1440
ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg gaggagatga ccaagaacca agtcagcctg 1500
acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg 1560
cagccggaga acaactacaa gaccacgcct cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc 1620
ctctattcca agctcaccgt ggacaagagc aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc 1680
tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg 1740
ggcaaatga 1749
<210> 16
<211> 582
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SIRPαD1-接头-EGFR抗体轻链
<400> 16
Glu Glu Glu Leu Gln Val Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Ser Val Ala
1 5 10 15
Ala Gly Glu Ser Ala Ile Leu His Cys Thr Val Thr Ser Leu Ile Pro
20 25 30
Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Ala Arg Glu Leu
35 40 45
Ile Tyr Asn Gln Lys Glu Gly His Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser
50 55 60
Glu Ser Thr Lys Arg Glu Asn Met Asp Phe Ser Ile Ser Ile Ser Ala
65 70 75 80
Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys Phe Arg Lys
85 90 95
Gly Ser Pro Asp Thr Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu Ser
100 105 110
Val Arg Ala Lys Pro Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu
130 135 140
Val Gln Pro Ser Gln Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe
145 150 155 160
Ser Leu Thr Asn Tyr Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys
165 170 175
Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr
180 185 190
Asn Thr Pro Phe Thr Ser Arg Leu Ser Ile Asn Lys Asp Asn Ser Lys
195 200 205
Ser Gln Val Phe Phe Lys Met Asn Ser Leu Gln Ser Gln Asp Thr Ala
210 215 220
Ile Tyr Tyr Cys Ala Arg Ala Leu Thr Tyr Tyr Asp Tyr Glu Phe Ala
225 230 235 240
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys
245 250 255
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly
260 265 270
Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
275 280 285
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
290 295 300
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
305 310 315 320
Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn
325 330 335
Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro
340 345 350
Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
355 360 365
Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
370 375 380
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
385 390 395 400
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
405 410 415
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
420 425 430
Ala Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
435 440 445
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
450 455 460
Ala Pro Ile Ala Ala Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
465 470 475 480
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
485 490 495
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
500 505 510
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
515 520 525
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
530 535 540
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
545 550 555 560
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
565 570 575
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
580
<210> 17
<211> 645
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码EGFR抗体轻链的核苷酸
<400> 17
gacatcttgc tgactcagtc tccagtcatc ctgtctgtga gtccaggaga aagagtcagt 60
ttctcctgca gggccagtca gagtattggc acaaacatac actggtatca gcaaagaaca 120
aatggttctc caaggcttct cataaagtat gcttctgagt ctatctctgg gatcccttcc 180
aggtttagtg gcagtggatc agggacagat tttactctta gcatcaacag tgtggagtct 240
gaagatattg cagattatta ctgtcaacaa aataataact ggccaaccac gttcggtgct 300
gggaccaagc tggagctgaa acgaactgtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 360
tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 420
cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480
gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540
ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600
ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gttag 645
<210> 18
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> EGFR抗体轻链
<400> 18
Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Val Ile Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn
20 25 30
Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Ser
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn Asn Trp Pro Thr
85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 19
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码信号肽的核苷酸
<400> 19
atgggatggt catgtatcat cctttttctg gtagcaactg caactggagt acattca 57
<210> 20
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Kozak
<400> 20
gccgccacc 9

Claims (9)

1.一种重组融合蛋白，其由信号调节蛋白的胞外Ig样结构域、接头和HER2抗体构成，其中信号调节蛋白的胞外Ig样结构域经由接头与HER2抗体的抗原结合互补位在构成抗原结合互补位的轻链的N端处连接，其中所述重组融合蛋白能够同时结合CD47、HER2、以及FcR，
其中信号调节蛋白的胞外Ig样结构域是信号调节蛋白的第一胞外Ig样结构域，且氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，
其中HER2抗体包含两条重链和两条轻链，其中重链的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示，轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示。
2.根据权利要求1所述的重组融合蛋白，其中接头为10-30氨基酸残基的肽。
3.根据权利要求2所述的重组融合蛋白，其中接头为-(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)3-。
4.根据权利要求1所述的重组融合蛋白，其中信号调节蛋白的胞外Ig样结构域-接头-HER2抗体轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO：12所示，HER2抗体重链的氨基酸序列如SEQ IDNO：6所示。
5.一种多核苷酸，其编码权利要求1-4中任一项所述的重组融合蛋白。
6.一种表达载体，其包含权利要求5所述的多核苷酸。
7.一种宿主细胞，其包含权利要求6所述的表达载体。
8.一种药物组合物，其包含权利要求1-4中任一项所述的重组融合蛋白、以及至少一种药物载体。
9.权利要求1-4中任一项所述的重组融合蛋白在制备一种用于治疗由CD47和/或HER2过表达引起的癌症的药物中的用途，其中所述癌症选自非小细胞肺癌、结肠癌、和乳癌。
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Address after: 201203 building 7, Lane 908, Ziping Road, Zhoupu, Pudong New Area, Shanghai

Applicant after: Yiming Angke biomedical technology (Shanghai) Co.,Ltd.

Address before: 201203 building 7, Lane 908, Ziping Road, Zhoupu, Pudong New Area, Shanghai

Applicant before: IMMUNEONCO BIOPHARM Co.,Ltd.

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Applicant after: Yiming Angke biomedical technology (Shanghai) Co.,Ltd.

Address before: 201203 building 7, Lane 908, Ziping Road, Zhoupu, Pudong New Area, Shanghai

Applicant before: Yiming Angke biomedical technology (Shanghai) Co.,Ltd.

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