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CN114720700A - 检测抗细胞骨架相关蛋白4-IgG自身抗体的试剂在制备检测血管内皮损伤试剂盒的应用 - Google Patents

检测抗细胞骨架相关蛋白4-IgG自身抗体的试剂在制备检测血管内皮损伤试剂盒的应用 Download PDF

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CN114720700A
CN114720700A CN202210491015.7A CN202210491015A CN114720700A CN 114720700 A CN114720700 A CN 114720700A CN 202210491015 A CN202210491015 A CN 202210491015A CN 114720700 A CN114720700 A CN 114720700A
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Zhejiang University ZJU
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Abstract

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及Cytoskeleton‑associatedprotein4在制备血管内皮细胞损伤检测试剂盒中的应用。本发明还提供了一种检测抗Cytoskeleton‑associatedprotein4‑IgG抗体的试剂盒，对生物样本中的抗Cytoskeleton‑associatedprotein4‑IgG抗体进行定性定量检测，准确度和灵敏度较高，且简便快速，填补了本领域中检测抗Cytoskeleton‑associatedprotein‑IgG抗体试剂盒的空白。

Description

检测抗细胞骨架相关蛋白4-IgG自身抗体的试剂在制备检测 血管内皮损伤试剂盒的应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及Cytoskeleton-associated protein 4在制备血管内皮细胞损伤检测试剂盒中的应用。
背景技术
血液、血管和心脏组成了人体的血液循环系统。血液循环系统中的血液在血管中流动，流经心脏、肺、肝等全身脏器。血管的最里层附着有血管内皮细胞，血管内皮细胞是介于血流和血管壁组织之间的一层单核细胞，可通过自分泌、内分泌、旁分泌三种途径分泌一系列NO、PGI2、ET-1等血管活性物质发挥调节血管紧张性、抗血栓形成、抑制平滑肌细胞增殖及血管壁炎症反应等功能。NO是内皮细胞产生最重要的舒血管因子，由内皮细胞的NO合酶(eNOs) 作用于L-精氨酸产生，NO可扩散至血管壁平滑肌细胞激活鸟氨酸环化酶，介导cGMP调控的血管舒张。不仅如此，NO还具有抑制血小板聚集、抑制单核细胞粘附于内皮细胞、抑制平滑肌细胞增殖等作用。然而血管内皮在受到一系列有害因素作用时，内皮细胞释放的舒血管因子减少，缩血管因子增多，打破血管平衡稳态，最终导致一系列心血管事件的发生。血管内皮细胞自身抗体会造成血管内皮细胞损伤，诱发血液循环系统功能障碍，从而导致心脏、肺、肝等脏器的损伤，引发各个脏器相关的疾病，包括肾病综合征。
内皮细胞是血管内侧的单层细胞，具有高代谢活性，在许多生理过程中起关键作用，包括调控血管舒缩张力、血液与组织之间的血细胞运输、维持血液流动性，通透性，血管生成和固有和适应性免疫，参与大多数疾病的病理生理过程，是病理生理学的主要决定因素或受害者。与其余器官相比，肾脏具有最丰富和最多样化的内皮细胞群体，这种广泛的多样性包括肾脏内皮细胞有助于跨肾各个部分的不同转运能力以及不同的内皮细胞承受环境中的氧气含量和渗透压不同。因而，血管内皮细胞损伤可导致包括肾病综合征在内的多种脏器疾病，危害严重。
肾病综合征(nephrotic syndrome，NS)表现为大量蛋白尿、低蛋白血症、高度水肿、高脂血症的一组临床症候群。可由多种病因引起，分为原发性、继发性和遗传性三大类，原发性肾病综合征属于原发性肾小球疾病，有多种病理类型构成。微小病变病(MCD)是儿童肾病综合征的主要病因，也是自身免疫性肾病综合征中的一种，占成人肾病综合征致病因素的10～15％。微小病变病患者肾小球在光学显微镜下看起来基本正常，在电子显微镜下可见的唯一组织病理学异常是弥漫性足细胞足突融合消失。因此，MCD被认为是一种原发性足细胞疾病。皮质类固醇是治疗MCD的常见药物，且采用其治疗后的蛋白尿可完全缓解，同时由MCD所引起进行性肾功能衰竭很少见。然而，MCD会导致严重的并发症，在成人中观察到的与MCD疾病相关的并发症主要包括静脉血栓形成和需要临时透析的严重急性肾损伤。此外，由于MCD的特点是慢性、复发性病程，通常需要延长免疫抑制治疗以维持蛋白尿缓解。然而，长期免疫抑制治疗会增加严重感染的风险，并带来恶性肿瘤的长期风险。
目前，现有研究MCD的潜在发病机制仍然知之甚少。由于原发性局灶节段性肾小球硬化(FSGS)的发病机制与MCD非常相似，许多学者认为MCD和 FSGS是同一个疾病在不同阶段的表型。基于MCD与非霍奇金淋巴瘤之间的关联、麻疹感染诱导的缓解以及环磷酰胺治疗后的延长缓解，T细胞最早被怀疑是循环通透性因子的来源。然而，近些年利妥昔单抗和其他特异性B细胞消除药物的治疗效果对T细胞来源提出了挑战。值得注意的是，皮质类固醇和利妥昔单抗对足细胞的直接作用也被认为具有治疗效果。
尽管目前观察到的足细胞损伤是MCD的主要经典特征，但疾病机制可能还涉及肾小球血管内皮细胞。早在2000年Futrakul N等报道特发性肾病综合征 (INS)病人常伴有肾脏灌流不足，推测肾小球血管内皮细胞损伤可能是造成INS 病人肾脏灌流不足的原因。Purohit S等人发现在MCD病人循环系统中有内皮细胞损伤标志物syndecan 1升高，但是不清楚是否同时存在肾小球内皮细胞的损伤。Trachtman H等人在FSGS和MCD病人的肾组织中观察到了IgM与补体成分共沉积，且证实IgM是针对GEC和心磷脂表位的抗体。2022年BauerC等人发现，MCD病人血清中内皮细胞标志物有升高，同时肾组织病理证实肾小球内皮细胞caveolin-1表达明显上升，进一步将病人血清与体外培养的人肾小球内皮细胞共孵育会显著增加肾小球血管内皮细胞损伤的标志物thrombomodulin的表达，由此证明MCD病人存在肾小球血管内皮细胞的损伤。
尽管如此，至今现有研究并不清楚造成肾小球内皮细胞损伤的致病因子到底是什么。本申请人团队通过前期的研究在MCD和FSGS肾病综合征患者体内筛选和鉴定到了一系列的肾小球血管内皮细胞自身抗体。动物实验证实这些肾小球血管内皮细胞自身抗体会引起小鼠肾小球血管内皮细胞严重损伤。体外细胞培养实验也表明这些自身抗体会影响血管内皮细胞的形态和功能。临床研究更是表明这些肾小球血管内皮细胞自身抗体与患者的高凝状态以及不良预后有关。
抗Cytoskeleton-associated protein-IgG抗体是其中一种重要的肾小球血管内皮细胞自身抗体，与MCD和FSGS肾病综合征的发生发展密切相关，且能指导临床的诊疗。然而，目前国内外关于肾脏疾病患者有关Cytoskeleton-associated protein 4、抗Cytoskeleton-associated protein 4-IgG抗体的研究仅限于分子机制层面上的研究，并没有定量检测其在患者血清中水平，且市场上缺乏相应的临床检测试剂盒。
发明内容
本发明的目的在于提供与Cytoskeleton-associated protein 4特异性结合的抗体作为生物标志物在制备检测血管内皮细胞损伤的试剂或试剂盒中的应用，以与Cytoskeleton-associated protein 4特异性结合的抗体为生物标志物可以对血管内皮细胞损伤相关的疾病进行检测，增加Cytoskeleton-associated protein 4的医药用途。
本发明提供了检测抗Cytoskeleton-associated protein 4-IgG自身抗体的试剂在制备检测血管内皮损伤的试剂盒中的应用。
优选的，所述检测抗Cytoskeleton-associated protein 4-IgG自身抗体的试剂包括Cytoskeleton-associated protein 4蛋白、含标签的Cytoskeleton-associatedprotein 4重组蛋白或多肽。
优选的，所述标签包括His标签、硫氧还蛋白、GST标签、麦芽糖结合蛋白、谷胱甘肽转移酶的SA标签、c-Myc标签、Flag标签或生物素标签。
优选的，当所述标签为His标签时，所述含标签的Cytoskeleton-associatedprotein 4蛋白的氨基酸序列包括SEQ ID NO.1所示。
优选的，所述血管内皮损伤包括肾小球血管内皮细胞损伤。
本发明还提供了一种检测抗Cytoskeleton-associated protein 4-IgG抗体的试剂盒，所述试剂盒包括：上述技术方案任一项所述应用中的检测抗 Cytoskeleton-associated protein 4-IgG自身抗体的试剂、固相载体和标记抗体。
优选的，所述标记抗体包括酶标记的二抗或化学发光剂标记的二抗或生物素标记的二抗或荧光标记的二抗；
优选的，所述二抗包括抗人IgG抗体。
优选的，所述酶标记的二抗包括辣根过氧化物酶标记的抗人IgG抗体；所述化学发光剂标记的二抗包括吖啶酯标记抗人IgG抗体或荧光标记抗人IgG抗体；所述生物素标记的二抗包括生物素标记的抗人IgG抗体。
优选的，所述固相载体包括硝酸纤维素膜、荧光编码微球、磁条芯片、磁微粒和酶标微孔板中的一种或多种。
有益效果：
本发明提供了与Cytoskeleton-associated protein 4特异性结合的抗体作为生物标志物在制备检测血管内皮细胞损伤的试剂或试剂盒中的应用，以与 Cytoskeleton-associated protein 4特异性结合的抗体为生物标志物可以对血管内皮细胞损伤相关的疾病进行检测。此外，本发明首次在部分肾病综合征患者的体内检测到了一种抗Cytoskeleton-associated protein 4-IgG自身抗体，且确定了该自身抗体针对的靶抗原为肾小球血管内皮细胞上Cytoskeleton-associated protein 4。本发明发现Cytoskeleton-associated protein 4蛋白抗体是一种重要的肾小球血管内皮细胞自身抗体，与MCD和FSGS肾病综合征的发生发展密切相关，且能指导临床的诊疗。抗Cytoskeleton-associated protein 4-IgG自身抗体的检测，能够实现血管内皮损伤的检测，具体为研究肾病综合征的分子机制和临床诊疗提供依据。本发明提供的检测抗Cytoskeleton-associated protein 4-IgG自身抗体的试剂盒既可以定性也可以定量检测肾病综合征患者血清中抗 Cytoskeleton-associated protein 4-IgG抗体，且本发明试剂盒利用人抗标签肽的 IgG抗体作为标准品以及结合生物素-亲和素放大系统、磁微粒化学发光免疫分析大大提高了检测的准确性、灵敏度、特异性及检测速度。具体的，与现有技术相比本发明试剂盒的有益之处如下：
1、本发明试剂盒能够实现血管内皮损伤的高效检测，检测到抗 Cytoskeleton-associated protein 4-IgG自身抗体，则判定存在血管内皮损伤。
2、目前国内外关于肾脏疾病患者有关Cytoskeleton-associated protein 4、抗Cytoskeleton-associated protein 4-IgG抗体仅限于分子机制研究，并没有定量检测其在患者血清中水平。本发明首次鉴定了针对Cytoskeleton-associated protein 4 的IgG自身抗体，并针对该自身抗体发明了检测试剂盒，填补了国内外空白。利用本发明试剂盒检测298例肾病综合征患者血清中抗Cytoskeleton-associated protein 4-IgG抗体，结果显示有116例患者抗Cytoskeleton-associated protein 4-IgG 抗体阳性，即阳性检出率为38.93％。本发明对抗Cytoskeleton-associated protein 4-IgG抗体进行检测后续可以为研究肾病综合征的分子机制和临床诊疗提供依据。
3、本发明试剂盒涉及固相膜免疫定性分析人血清中抗 Cytoskeleton-associated protein 4-IgG抗体，以人抗标签肽的IgG抗体作为标准品，大大提高了检测准确性。固相膜免疫定性检测操作简单，试剂用量较少，比传统ELISA节约近10倍；另外NC膜吸附能力极强接近100％，微量抗原能够完全吸附固定在NC膜上；吸附抗原或抗体或已有结果的NC膜可长期保存(-20℃可保存半年)，且不影响其活性；另外本发明固相膜免疫定性检测人血清中抗 Cytoskeleton-associated protein 4-IgG抗体的试剂盒引入生物素-亲和素放大系统，大大提高了检测灵敏度。
4、本发明涉及的磁微粒化学发光免疫分析定量检测人血清中抗 Cytoskeleton-associated protein 4-IgG抗体试剂盒，利用磁微粒为固相载体，其直径仅为1.0μm，这就大大增加了包被表面积，增加了抗原的吸附量，提高了反应速度，也使清洗分离更简便，从而减少污染，降低交叉感染概率。另一方面，采用吖啶酯发光剂直接标记抗人IgG，其化学反应简单、快速、无须催化剂；吖啶酯化学发光为闪光型，其通过起动发光试剂(H2O2、NaOH)0.4s后发射强度即可达到最大，半衰期为0.9s，2s内基本结束，便于快速检测。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1-1为肾小球血管内皮细胞上的Cytoskeleton-associated protein 4蛋白是肾病综合征病人体内自身抗体针对的主要靶抗原，其中A显示一抗为健康人血清的二维电泳蛋白点，B显示一抗为肾病综合征患者血清的二维电泳蛋白点；
图1-2为肾小球血管内皮细胞上的Cytoskeleton-associated protein 4蛋白的质谱鉴定图；
图2为表达的重组蛋白Cytoskeleton-associated protein 4的SDS-PAGE鉴定图，其中泳道A为细胞裂解物的上清液在15℃下诱导16小时，泳道B为细胞裂解物的上清液，在37℃下诱导4小时；
图3为固相膜免疫试剂盒检测肾病综合征患者血清中抗 Cytoskeleton-associated protein 4 1-IgG抗体；
图4为磁微粒化学发光免疫分析试剂盒检测抗Cytoskeleton-associatedprotein 4-IgG抗体的原理示意图；
图5为抗原蛋白Cytoskeleton-associated protein 4包被羧基磁微粒示意图；
图6为各类肾病病人中抗Cytoskeleton-associated protein 4-IgG抗体的检测情况，其中NS：肾病综合征，HSP：过敏性紫癜，HSPN：紫癜性肾炎，KD：川崎病，NC：健康儿童；
图7为抗Cytoskeleton-associated protein 4-IgG抗体与血管内皮损伤标志物线性相关图。
具体实施方式
本发明提供了检测抗Cytoskeleton-associated protein 4-IgG自身抗体的试剂在制备检测血管内皮损伤的试剂盒中的应用。本发明所述检测抗 Cytoskeleton-associated protein 4-IgG自身抗体的试剂优选包括 Cytoskeleton-associatedprotein 4蛋白、含标签的Cytoskeleton-associated protein 4 重组蛋白或多肽。本发明所述的Cytoskeleton-associated protein 4在NCBI中的登录号为BC082972。本发明所述血管内皮细胞损伤优选包括肾病综合征，进一步优选包括自身免疫性肾病综合征。血液、血管和心脏组成了人体的血液循环系统，血液循环系统中的血液在血管中流动，流经心脏、肺、肝等全身脏器。血管最里层附着着血管内皮细胞，血管内皮细胞自身抗体会造成血管内皮细胞损伤，诱发血液循环系统功能障碍，进而导致心脏、肺和肝等脏器的损伤，引发包括肾病综合征在内的各个脏器相关疾病，而不同脏器的血管内皮细胞都是一样的。因而，基于血液循环系统中检测血管内皮细胞自身抗体，可以用于临床血管内皮细胞损伤。本发明以与Cytoskeleton-associated protein 4特异性结合的抗体为生物标志物可实现血管内皮细胞损伤的检测。
本发明检测抗Cytoskeleton-associated protein 4-IgG自身抗体的试剂以Cytoskeleton-associated protein 4蛋白为靶点，进行Cytoskeleton-associatedprotein 4自身抗体的检测(即抗Cytoskeleton-associated protein 4-IgG自身抗体为检测血管内皮细胞损伤的生物标志物)，所述试剂能够实现血管内皮损伤的高效检测。在本发明中，所述试剂能够与来自组织(肾活检组织)或体液(特别是血液、血浆、血清)中的Cytoskeleton-associated protein 4蛋白自身抗体进行免疫反应。在本发明中，所述检测抗Cytoskeleton-associated protein 4-IgG自身抗体的试剂优选包括Cytoskeleton-associated protein 4蛋白或含标签的 Cytoskeleton-associated protein 4重组蛋白或多肽；所述Cytoskeleton-associated protein 4蛋白的NCBI蛋白登录号为BC082972。在本发明中，所述标签优选为具有某些生物学或物理功能的标签，特别是N-末端或C-末端；这些标签的存在有利于抗原蛋白纯化，固定，沉淀；所述标签更优选是能够特异性结合配体的序列或结构域，如标签肽，所述标签肽优选选自：His标签、硫氧还蛋白、GST 标签、麦芽糖结合蛋白、谷胱甘肽转移酶的SA标签、c-Myc标签、Flag标签或生物素标签。在本发明中，当所述标签为His标签时，所述含标签的 Cytoskeleton-associated protein 4重组蛋白的氨基酸序列优选如SEQ ID NO.1所示： MIFTEVQKRSQKEINDMKAKVASLEESEGNKQDLKALKEAVKEIQTSAKSRE WDMEALRSTLQTMESDIYTEVRELVSLKQEQQAFKEAADTERLALQALTEKL LRSEESVSRLPEEIRRLEEELRQLKSDSHGPKEDGGFRHSEAFEALQQKSQGL DSRLQHVEDGVLSMQVASARQTESLESLLSKSQEHEQRLAALQGRLEGLGSS EADQDGLASTVRSLGETQLVLYGDVEELKRSVGELPSTVESLQKVQEQVHTL LSQDQAQAARLPPQDFLDRLSSLDNLKASVSQVEADLKMLRTAVDSLVAYSV KIETNENNLESAKGLLDDLRNDLDRLFVKVEKIHEKVHHHHHH。本发明所述血管内皮细胞损伤优选包括肾病综合征，进一步优选包括自身免疫性肾病综合征。本发明以所述Cytoskeleton-associated protein 4为检测靶点可对血管内皮细胞损伤，尤其对肾病综合征等进行检测，进而将其用于血管内皮细胞损伤相关检测试剂盒的制备，增加了细胞骨架相关蛋白4的医药用途。
本发明还提供了一种检测抗Cytoskeleton-associated protein 4-IgG抗体的试剂盒，所述试剂盒中包括上述技术方案所述应用中的检测抗 Cytoskeleton-associatedprotein 4-IgG自身抗体的试剂、固相载体和标记抗体。
在本发明中，所述检测抗Cytoskeleton-associated protein 4-IgG自身抗体的试剂(Cytoskeleton-associated protein 4蛋白或含标签的Cytoskeleton-associatedprotein 4重组蛋白)优选固定于固相载体上。本发明所述“固定”是指与 Cytoskeleton-associated protein 4抗原蛋白不溶于水的固相载体结合，该固相载体或支持物不溶于水，更优选地通过共价键合，静电相互作用，疏水相互作用、或通过二硫键相互作用，最优选通过一个或多个共价键。固定可以是直接固定方式，例如通过过滤，离心或层析，将固定化的分子与不溶性载体一起从水溶液中分离出来。还包括可逆或不可逆的方式固定Cytoskeleton-associated protein 4 抗原蛋白。例如，抗原蛋白通过可裂解的共价键(如可添加含硫醇的试剂来裂解的二硫键)固定于载体，这种固定是可逆的。另外，如抗原蛋白通过在水性溶液中不会裂解的共价键(通过环氧化物基团与将赖氨酸侧链偶联至亲和柱的胺基团的反应形成的键)固定于载体，则固定是不可逆的。固定还可以是间接方式：如固定对所述抗原蛋白具有特异性亲和力的抗体，然后形成抗原蛋白-抗体复合物以达到固定的效目的。
本发明所述的抗原蛋白Cytoskeleton-associated protein 4固定方法优选为直接包被法：(1)抗原蛋白Cytoskeleton-associated protein 4通过物理吸附方式或非共价键结合到硝酸纤维素膜或聚苯乙烯微孔板上；(2)带有羧基功能团的磁微粒与抗原蛋白Cytoskeleton-associated protein 4的氨基结合，抗原蛋白 Cytoskeleton-associatedprotein 4通过化学偶联方式结合在磁微粒上。在本发明中，所述固相载体包括硝酸纤维素膜、荧光编码微球、磁条芯片、磁微粒和酶标微孔板中的一种或多种。
本发明优选采用基因重组原核表达方法成功表达并纯化出重组蛋白Cytoskeleton-associated protein 4，以此作为试剂盒中抗原蛋白，研发出一套适合于检测肾病综合征患者肾小球血管内皮细胞自身抗体抗Cytoskeleton-associated protein4-IgG抗体的试剂盒，包括一种定性或定量分析检测人血清中抗 Cytoskeleton-associated protein 4-IgG抗体的检测试剂盒。
在本发明中，所述Cytoskeleton-associated protein 4蛋白优选表达于细菌(如大肠杆菌)、酵母、昆虫或哺乳动物细胞中。表达得到Cytoskeleton-associated protein 4蛋白后，本发明优选利用Ni柱亲和层析、分子筛层析、离子交换层析、疏水柱纯化等方法对Cytoskeleton-associated protein 4蛋白进行纯化。
在本发明中，所述标记抗体优选包括酶标记的二抗或化学发光剂标记的二抗或生物素标记的二抗或荧光标记的二抗；所述二抗包括抗人IgG抗体。
在本发明中，所述酶标记的二抗优选包括辣根过氧化物酶标记的抗人IgG 抗体；所述化学发光剂标记的二抗包括吖啶酯标记抗人IgG抗体或荧光标记抗人IgG抗体；所述生物素标记的二抗包括生物素标记的抗人IgG抗体。
在本发明中，所述试剂盒的类型优选包括固相膜免疫试剂盒或磁微粒化学发光免疫分析试剂盒；当所述试剂盒为固相膜免疫试剂盒时，所述试剂盒优选还包括抗原稀释液、样品稀释缓冲液、抗体稀释液、底物显色液、洗涤液、酶工作液、标准品、阳性质控品和阴性质控品；当所述试剂盒为磁微粒化学发光免疫分析试剂盒时，所述试剂盒优选还包括化学发光预激发液A、化学发光激发液B、标准品和清洁溶液。在本发明中，标准品和阳性质控品优选均为重组人抗标签肽免疫球蛋白G或其片段、或从病人血清中提取抗Talin-1-IgG自身抗体；所述阴性质控品优选为健康体检者血清。
具体的，当所述试剂盒为固相膜免疫试剂盒时，所述试剂盒中，所述检测抗Cytoskeleton-associated protein 4-IgG自身抗体的试剂，即抗原优选为重组蛋白Cytoskeleton-associated protein 4(氨基酸序列包括SEQ ID NO.1所示)；固相载体优选为Satourius CN140硝酸纤维素膜；阳性质控品(标准品)优选为人抗His标签免疫球蛋白G(购自湖州英创)；阴性质控品优选为健康体检者血清；标记抗体优选为生物素标记抗人IgG抗体；酶工作液优选为碱性磷酸酶-链霉亲和素；所述底物显色剂优选为TMB、过氧化氢、AMPPD、4-MUP或BCIP；所述抗原稀释液优选为含有163mMNaCl、1％TritonX-100的1×PBSpH7.4；所述样品稀释缓冲液优选为含有10％BSA的0.01M PBS pH7.4；所述抗体稀释液优选为含有1M D-glucose、2％甘油、0.35％Tween20的0.01M PBS pH7.4；所述洗涤液优选为：含有163mMNaCl、10％甘油、1％TritonX-100的1×PBS pH7.4。
当所述试剂盒为磁微粒化学发光免疫分析试剂盒时，所述试剂盒中，抗原优选为重组蛋白Cytoskeleton-associated protein 4(氨基酸序列包括SEQ ID NO.1 所示)；固相载体优选为羧基磁珠；标记抗体优选为吖啶酯标记抗人IgG抗体；化学发光预激发液A和化学发光激发液B优选为常规市售产品、标准品优选为不同浓度的抗Cytoskeleton-associated protein 4-IgG自身抗体；洗涤液优选为含有0.15mol/L NaCl和0.05％Tween-20的pH 7.2、25mmol/L Tris-HCL溶液。
在本发明中，所述试剂盒的待测样品优选来自全血、血清、血浆、尿液、淋巴液、胸腹水；更优选为哺乳动物(人类)血清。
在本发明中，检测血清中抗Cytoskeleton-associated protein 4-IgG抗体试剂盒的原理优选为：利用间接法反应原理，首先将Cytoskeleton-associated protein 4 抗原吸附于固相载体作为包被抗原，然后加入阳性质控品或标准品或待检血清样本进行孵育，再加入标记抗体(标记二抗)反应后，若待检血清中含有抗 Cytoskeleton-associatedprotein 4-IgG抗体，则形成包被抗原 Cytoskeleton-associated protein 4-待检血清抗Cytoskeleton-associated protein 4-IgG抗体-标记抗人IgG抗体三元复合物，最后利用光显色法、化学发光法、荧光发光法来检测光信号，以达到定性或定量分析人血清中抗Cytoskeleton-associated protein 4-IgG抗体的目的。
下面结合具体实施例对本发明所述的检测抗Cytoskeleton-associated protein4-IgG自身抗体的试剂在制备检测血管内皮损伤的试剂盒中的应用做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。
实施例1
血管内皮细胞上的Cytoskeleton-associated protein 4蛋白是肾病综合征病人体内自身抗体针对的主要靶抗原：
本发明通过前期大量临床和分子机制研究，首次发现肾病综合征患者血清IgG水平较高，并证实血管内皮细胞上的Cytoskeleton-associated protein 4是自身免疫性肾病综合征病人体内自身抗体针对的主要靶抗原。因此检测血清中抗 Cytoskeleton-associated protein 4-IgG抗体的存在及其定量水平有助于明确血管内皮细胞损伤。
具体实施如下：
(1)血管内皮细胞总蛋白的提取：培养血管内皮细胞株(ECV 304)，用 PBS洗涤2-3次，然后用聚焦超声仪(Covaris S220，Gene)在含有30mm Tris-HCl、 8m尿素、4％CHAPS和蛋白酶抑制剂(#ab65621；Abcam，1：200稀释)的裂解缓冲液中在冰上进行充分裂解，然后将样本置于离心机，12000g，4℃，离心 30min。收集上清，即为收集到的血管内皮细胞总蛋白。利用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定收集到的血管内皮细胞总蛋白浓度。
(2)二维电泳：提取血管内皮细胞总蛋白进行二维电泳后转到硝酸纤维素膜上，分别用健康人和自身免疫性肾病综合征病人的血清作为一抗进行孵育，之后加上二抗进行显影，见图1中的A图和B图。
(3)基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱分析：将步骤(2)显影后进行阳性点的差异分析，选取二维电泳胶上肾病综合征病人强阳性，而健康人阴性或者弱阳性的蛋白点，从凝胶上取下选中的蛋白点，将干燥后的凝胶用胰蛋白酶(0.1μg/μL)进行消化，然后向反应混合物中加入10μL的25mM碳酸氢铵， 37℃孵育过夜，然后用三氟乙酸(0.1％)从凝胶中提取肽。用基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱分析(MALDI-TOF-MS)质谱仪对提取的肽进行分析，得到肽质量图谱，鉴定为Cytoskeleton-associated protein 4蛋白，见图1中的C图。
实施例2
重组抗原蛋白Cytoskeleton-associated protein 4表达及纯化
利用基因工程的方法以编码Cytoskeleton-associated protein 4蛋白的基因为模板，进行PCR扩增，然后构建表达载体进行蛋白表达。本发明表达的抗原蛋白上含有His标签的标签肽。表达的重组蛋白经镍柱亲和层析进行纯化，最后利用SDS-PAGE鉴定重组蛋白Cytoskeleton-associated protein 4的分子量为40KDa，见图2(表达的重组蛋白Talin-1的SDS-PAGE鉴定图)，其中，泳道A：细胞裂解物的上清液，在15℃下诱导16小时；泳道B：细胞裂解物的上清液，在37℃下诱导4小时。
实施例3
本发明采用正交试验设计对试剂盒反应条件进行优化
根据抗原Cytoskeleton-associated protein 4包被浓度(50μg、80μg、100μg、150μg四个包被浓度)、各反应时间(15min、30min、45min)和温度(25℃、 37℃)、酶标二抗最佳稀释度(1：100、1：500、1：1000、1：1500四个稀释度)等4个因素选择正交表，每个因素按2水平重复测定标准阳性血清和标准阴性血清，选择阳性血清的最高光信号值(P)和阴性血清的最低光信号值(N) 的比值(P/N)。通过正交设计本发明得到了本试剂盒最佳抗原Cytoskeleton-associated protein 4包被浓度为250ug/mL、固相膜免疫检测抗Cytoskeleton-associated protein 4-IgG抗体试剂盒最佳抗原抗体反应温度为25℃、最佳抗原抗体反应时间30min及最佳生物素标记抗人IgG抗体最佳工作稀释度为1：500；磁微粒化学发光免疫分析检测抗Cytoskeleton-associated protein 4-IgG 抗体试剂盒最佳抗原抗体反应温度为37℃、最佳抗原抗体反应时间15min及最佳吖啶酯标记抗人IgG抗体最佳工作稀释度为1：500。
实施例4
用于检测抗Cytoskeleton-associated protein 4-IgG抗体的固相膜免疫试剂盒的制备：
抗原：重组蛋白Cytoskeleton-associated protein 4
固相载体：Satourius CN140硝酸纤维素膜
阳性质控品(标准品)：人抗His标签免疫球蛋白G(购自湖州英创)
阴性质控品：健康体检者血清
标记抗体：生物素标记抗人IgG抗体
抗原稀释液
样品稀释缓冲液
抗体稀释液
洗涤液
酶工作液：碱性磷酸酶-链霉亲和素
底物显色液：BCIP显色液。
4.2用于检测抗Cytoskeleton-associated protein 4-IgG抗体的固相膜免疫试剂盒的检测步骤如下：
4.2.1包被、封闭：将8μL浓度为250μg/mL的Cytoskeleton-associated protein 4抗原直接点于硝酸纤维素膜上置37℃孵育箱中干燥30min，将硝酸纤维素膜置于检测板中，加入200μL 5％BSA于37℃温盒中封闭30min，弃去封闭液后用洗涤液洗2次；
4.2.2抗原孵育：向检测板内加入10μL用稀释液稀释的抗体标准品或待检血清，同时做阴性对照、阳性对照，25℃孵育30min，每个样品设置3个平行孔；
4.2.3二抗孵育：弃去检测板内液体，洗涤液洗5次×1min，加入20μL 1： 500生物素标记抗人IgG抗体，25℃孵育30min；
4.2.4显色：弃去检测板内液体，洗涤液洗5次×1min，加500μL碱性磷酸酶-链霉亲和素，室温孵育20min，弃去检测板内液体，洗涤液洗5次×1min，然后加入BCIP显色液，室温反应20min，用流水冲洗检测板，终止酶反应。取出测试硝酸纤维素膜条用吹风机吹干膜条，用比色卡肉眼定性判定，出现明显棕色斑点者为阳性见图3(固相膜免疫试剂盒检测肾病综合征患者血清中抗 Cytoskeleton-associated protein 4-IgG抗体结果图)，或将膜条置于显影仪上扫描，显影仪自带的分析软件以参考标准品浓度作为纵坐标、仪器读取的灰度值作为横坐标，绘制标准曲线对血清中抗Cytoskeleton-associated protein 4-IgG抗体水平进行半定量分析。
实施例5
用于检测抗Cytoskeleton-associated protein 4-IgG抗体的磁微粒化学发光免疫分析试剂盒的制备(图4为磁微粒化学发光免疫分析试剂盒检测抗 Cytoskeleton-associated protein 4-IgG抗体的原理示意图)
5.1抗Cytoskeleton-associated protein 4-IgG抗体化学发光检测试剂盒，包括以下组成部分：
(1)吖啶酯标记的抗人IgG；
(2)与Talin-1抗原偶联的羧基磁珠；
(3)化学发光预激发液A(H2O2)和化学发光激发液B(NaOH)；
(4)抗Talin-1-IgG抗体系列标准溶液，标准浓度：0μg/mL、2μg/mL、4μg/mL、 8μg/mL、16μg/mL、20.0μg/mL，缓冲液为含0.5mol/L的Tris-HCl 5.0％BSA和 0.1～0.5％PC300；
(5)清洁溶液，特别是含有0.15mol/LNaCl和0.05％Tween-20的pH 7.2、 25mmol/LTris-HCl溶液。
5.2磁珠偶联抗原的制备(图5，抗原蛋白Cytoskeleton-associated protein 4包被羧基磁微粒示意图)
(1)取1mg羧基磁性颗粒于0.5mL离心管中，加入200μL的0.1mol/L MES 缓冲液，涡旋混匀，置于磁力架上，静置5min，使磁性颗粒从液体，并丢弃上清液。洗涤3次，然后加入200μL的MES(pH 5.0)缓冲液并涡旋；
(2)加入18μL(18μg)Cytoskeleton-associated protein 4抗原，涡旋，旋转反应管，室温孵育30min；
(3)加入10μL 10mg/mL偶联试剂EDC涡旋，旋转反应管，室温孵育2h；
(4)去除上清液，加入200μL洗涤缓冲液(TBS+0.05％Tween-20)洗涤3 次；
(5)用含1％BSA的缓冲液封闭，重复4次，每次10min。磁性颗粒悬浮液储存在2～8℃。
5.3吖啶酯标记抗体的制备
(1)将100μL的抗人IgG抗体放入透析袋中，将透析袋放入不少于1L的标记缓冲液进行透析，期间至少更换3次缓冲液，最后一次透析过夜，标记缓冲液为Na2CO3-NaHCO3缓冲液，pH为10.1，浓度为0.1mol/L；
(2)称取1.7mg吖啶酯NSP-DMAE-NHS溶于447μL无水二甲基甲酰胺 DMF中，形成6.5mmol/L NSP-DMAE-NHS DMF溶液；
(3)将透析后的抗体溶液置于500μL离心管中，加入100μL的6.5mmol/L NSP-DMAE-NHS DMF溶液，吖啶酯与抗体的摩尔比为7.4：1，加入200μL标记缓冲液、室温反应45min，加入10μL赖氨酸10μL，继续反应15min终止标记反应；
(4)通过Sephadex G-50柱(1×25cm)将标记物NSP-DMAE-NHS-Ab与游离的NSP-DMAE-NHS分离，用含纯化缓冲液pH为6.3和浓度为0.1mol/L；
(5)分离过程中，用色谱仪检测蛋白质峰，分别测定流出液的化学发光强度和430nm处的吸光度；
(6)收集高光度、高吸光度的洗脱液，加入1％BSA(体积)，冰上保存。
5.4样品制备：将样本按1：10的比例稀释
5.5用于检测抗Talin-1-IgG抗体的化学发光法试剂盒的检测步骤如下：
(1)100μL待测样品、150μL偶联磁粉悬液、150μL吖啶酯标记二抗依次加入反应管中，摇匀混合，37℃保温15min；
(2)隔离洗涤5次；
(3)充分振摇洗涤后的反应容器，使磁性颗粒均匀分散；
(4)加入100μL化学发光预激发液A，随后加入100μL化学发光激发液B，测定其相对发光强度。样品中抗Cytoskeleton-associated protein 4-IgG抗体的含量与其发光强度成正比。
实施例6
检测血清抗Cytoskeleton-associated protein 4-IgG抗体试剂盒的临床应用
6.1受试者纳入：从2018年6月到2020年6月诊断出各类肾病的患者，包括298例肾病综合征(NS)、100例过敏性紫癜(HSP)、100例紫癜性肾炎(HSPN)、 100例川崎病(KD)、同时期100例健康儿童(NC)。血清样本取自各类肾病患者和健康对照组。所有受试者在没有进行免疫抑制治疗之前进行第一次血清样本采集。
6.2各类肾病病人中抗Cytoskeleton-associated protein 4-IgG抗体的检测情况利用本发明试剂盒检测从2018年6月到2020年6月在诊断出各类肾病的患者血清中抗Cytoskeleton-associated protein 4-IgG抗体水平，包括298例肾病综合征、100例过敏性紫癜、100例紫癜性肾炎、100例川崎病及同时期100例健康儿童，结果显示部分肾病综合征病人中抗Cytoskeleton-associated protein 4-IgG 抗体阳性(有116例患者抗Cytoskeleton-associated protein 4-IgG抗体阳性，即抗 Talin-1-IgG抗体阳性检出率为38.93％)，而紫癜性肾炎、过敏性紫癜、川崎病以及健康儿童中抗Talin-1-IgG抗体为阴性，见图6(各类肾病病人中抗 Cytoskeleton-associated protein 4-IgG抗体的检测情况图，其中NS：肾病综合征， HP：过敏性紫癜，HPN：紫癜性肾炎，KD：川崎病，NC：健康儿童)。检测血清中抗Cytoskeleton-associated protein 4-IgG抗体的存在有助于肾病综合征血管内皮损伤的确定。。
6.3肾病综合征患者血清抗Cytoskeleton-associated protein 4-IgG抗体与血管内皮损伤标志物表达量呈线性相关
利用本发明试剂盒检测从2018年6月到2020年6月在诊断出肾病综合征患者血清中抗Cytoskeleton-associated protein 4-IgG抗体表达量，并检测患者血清中血管内皮损伤标志物Plvap的表达量，结果显示肾病综合征病人中抗 Cytoskeleton-associatedprotein 4-IgG抗体表达量与血管内皮损伤标志物表达量呈线性相关，肾病综合征与血管内皮损伤有关，抗Cytoskeleton-associated protein 4-IgG抗体的检测能够用于判断血管内皮损伤，即检测到抗 Cytoskeleton-associated protein 4-IgG抗体，则判定有血管内皮损伤，见图7(抗 Cytoskeleton-associated protein 4-IgG抗体与血管内皮损伤标志物线性相关结果图)。
由以上实施例可以得出，本发明所述抗Cytoskeleton-associated protein 4-IgG 可以作为血管内皮损伤的检测靶点；且以其为检测靶点制备的试剂盒可以用于检测抗细胞骨架相关蛋白4-IgG抗体，且灵敏度和准确率均较高，安全快速。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。
序列表
<110> 浙江大学
<120> 检测抗细胞骨架相关蛋白4-IgG自身抗体的试剂在制备检测血管内皮损伤试剂盒的应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 356
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Met Ile Phe Thr Glu Val Gln Lys Arg Ser Gln Lys Glu Ile Asn Asp
1 5 10 15
Met Lys Ala Lys Val Ala Ser Leu Glu Glu Ser Glu Gly Asn Lys Gln
20 25 30
Asp Leu Lys Ala Leu Lys Glu Ala Val Lys Glu Ile Gln Thr Ser Ala
35 40 45
Lys Ser Arg Glu Trp Asp Met Glu Ala Leu Arg Ser Thr Leu Gln Thr
50 55 60
Met Glu Ser Asp Ile Tyr Thr Glu Val Arg Glu Leu Val Ser Leu Lys
65 70 75 80
Gln Glu Gln Gln Ala Phe Lys Glu Ala Ala Asp Thr Glu Arg Leu Ala
85 90 95
Leu Gln Ala Leu Thr Glu Lys Leu Leu Arg Ser Glu Glu Ser Val Ser
100 105 110
Arg Leu Pro Glu Glu Ile Arg Arg Leu Glu Glu Glu Leu Arg Gln Leu
115 120 125
Lys Ser Asp Ser His Gly Pro Lys Glu Asp Gly Gly Phe Arg His Ser
130 135 140
Glu Ala Phe Glu Ala Leu Gln Gln Lys Ser Gln Gly Leu Asp Ser Arg
145 150 155 160
Leu Gln His Val Glu Asp Gly Val Leu Ser Met Gln Val Ala Ser Ala
165 170 175
Arg Gln Thr Glu Ser Leu Glu Ser Leu Leu Ser Lys Ser Gln Glu His
180 185 190
Glu Gln Arg Leu Ala Ala Leu Gln Gly Arg Leu Glu Gly Leu Gly Ser
195 200 205
Ser Glu Ala Asp Gln Asp Gly Leu Ala Ser Thr Val Arg Ser Leu Gly
210 215 220
Glu Thr Gln Leu Val Leu Tyr Gly Asp Val Glu Glu Leu Lys Arg Ser
225 230 235 240
Val Gly Glu Leu Pro Ser Thr Val Glu Ser Leu Gln Lys Val Gln Glu
245 250 255
Gln Val His Thr Leu Leu Ser Gln Asp Gln Ala Gln Ala Ala Arg Leu
260 265 270
Pro Pro Gln Asp Phe Leu Asp Arg Leu Ser Ser Leu Asp Asn Leu Lys
275 280 285
Ala Ser Val Ser Gln Val Glu Ala Asp Leu Lys Met Leu Arg Thr Ala
290 295 300
Val Asp Ser Leu Val Ala Tyr Ser Val Lys Ile Glu Thr Asn Glu Asn
305 310 315 320
Asn Leu Glu Ser Ala Lys Gly Leu Leu Asp Asp Leu Arg Asn Asp Leu
325 330 335
Asp Arg Leu Phe Val Lys Val Glu Lys Ile His Glu Lys Val His His
340 345 350
His His His His
355

Claims (10)

1.检测抗Cytoskeleton-associated protein 4-IgG自身抗体的试剂在制备检测血管内皮损伤的试剂盒中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述检测抗Cytoskeleton-associatedprotein 4-IgG自身抗体的试剂包括Cytoskeleton-associated protein 4蛋白、含标签的Cytoskeleton-associated protein 4重组蛋白或多肽。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述标签包括His标签、硫氧还蛋白、GST标签、麦芽糖结合蛋白、谷胱甘肽转移酶的SA标签、c-Myc标签、Flag标签或生物素标签。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，当所述标签为His标签时，所述含标签的Cytoskeleton-associated protein 4蛋白的氨基酸序列包括SEQ ID NO.1所示。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述血管内皮损伤包括肾小球血管内皮细胞损伤。
6.一种检测抗Cytoskeleton-associated protein 4-IgG抗体的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：权利要求1～5任一项所述应用中的检测抗Cytoskeleton-associatedprotein 4-IgG自身抗体的试剂、固相载体和标记抗体。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述标记抗体包括酶标记的二抗或化学发光剂标记的二抗或生物素标记的二抗或荧光标记的二抗。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述二抗包括抗人IgG抗体。
9.根据权利要求7或8所述的试剂盒，其特征在于，所述酶标记的二抗包括辣根过氧化物酶标记的抗人IgG抗体；所述化学发光剂标记的二抗包括吖啶酯标记抗人IgG抗体或荧光标记抗人IgG抗体；所述生物素标记的二抗包括生物素标记的抗人IgG抗体。
10.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述固相载体包括硝酸纤维素膜、荧光编码微球、磁条芯片、磁微粒和酶标微孔板中的一种或多种。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117074667A (zh) * 2023-03-02 2023-11-17 浙江大学 多肽或其片段在制备检测血管内皮细胞损伤试剂盒中的应用

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20070264259A1 (en) * 2006-03-27 2007-11-15 Genentech, Inc. Methods for treating kidney disorders
CN103492590A (zh) * 2011-02-22 2014-01-01 卡里斯生命科学卢森堡控股有限责任公司 循环生物标志物
CN103869086A (zh) * 2014-04-14 2014-06-18 杭州凯保罗生物科技有限公司 一种血清自身抗体检测试剂盒
CN106716135A (zh) * 2014-10-10 2017-05-24 松森昭 心力衰竭患者的检测方法、心脏疾病的识别方法、心力衰竭的检查试剂、心力衰竭的检查试剂盒、用于检测心力衰竭的装置及用于检测心力衰竭的程序
CN107249636A (zh) * 2015-02-27 2017-10-13 国立大学法人大阪大学 以ckap4作为靶分子的抗肿瘤剂

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20070264259A1 (en) * 2006-03-27 2007-11-15 Genentech, Inc. Methods for treating kidney disorders
CN103492590A (zh) * 2011-02-22 2014-01-01 卡里斯生命科学卢森堡控股有限责任公司 循环生物标志物
CN103869086A (zh) * 2014-04-14 2014-06-18 杭州凯保罗生物科技有限公司 一种血清自身抗体检测试剂盒
CN106716135A (zh) * 2014-10-10 2017-05-24 松森昭 心力衰竭患者的检测方法、心脏疾病的识别方法、心力衰竭的检查试剂、心力衰竭的检查试剂盒、用于检测心力衰竭的装置及用于检测心力衰竭的程序
CN107249636A (zh) * 2015-02-27 2017-10-13 国立大学法人大阪大学 以ckap4作为靶分子的抗肿瘤剂

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
卢浩 等: "血清细胞骨架相关蛋白4与慢性肾脏病患者血管钙化的关系", 《中国医药导报》 *
胡智祥: "《医院临床检验技术操作规范与实（化）验室管理全书》", 31 August 2004, 银声音像出版社 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117074667A (zh) * 2023-03-02 2023-11-17 浙江大学 多肽或其片段在制备检测血管内皮细胞损伤试剂盒中的应用
CN117074667B (zh) * 2023-03-02 2024-06-04 浙江大学 多肽或其片段在制备检测血管内皮细胞损伤试剂盒中的应用

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