CN112239767B - 一种突破颅骨限制无损监测神经炎症小鼠模型的构建方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种突破颅骨限制无损监测神经炎症小鼠模型的构建方法及其应用。本发明将新型荧光素酶AkaLuc、黄色荧光蛋白Venus基因串联后，通过IRES序列连接在Gfap基因后面构建了Gfap‑IRES‑Venus‑AkaLuc knockin小鼠模型，在此基础上，通过颅内注射病毒诱导神经炎症的小鼠模型，通过无损动态检测病毒诱导神经炎症的小鼠模型中的荧光强度升高，证明了本发明构建的小鼠模型可应用于神经炎症的无损动态检测，本发明首次构建的小鼠模型在神经炎症的研究中具有潜在的应用价值。

Description

一种突破颅骨限制无损监测神经炎症小鼠模型的构建方法及 其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种小鼠模型的构建方法，具体而言，涉及一种突破颅骨限制无损监测神经炎症小鼠模型的构建方法。

背景技术

神经炎症来源于多种外周因素和/或中枢因素引起的小胶质细胞、星形胶质细胞活化，可推动多种中枢神经系统疾病发生发展。动态监测神经炎症具有重要意义，但是由于颅骨的存在，体外监测较为困难。某些特定分子如小胶质细胞特异表达的钙结合蛋白Iba1和线粒体外膜蛋白TSPO在神经炎症状态表达水平显著升高，利用放射性同位素标记的TSPO配基作为体内探针，即可通过PET/SPECT技术精确观察炎症反应的脑区定位，不仅能用于动物模型，而且已经在临床有较多应用(Notter T,Coughlin JM,Sawa A,MeyerU.Reconceptualization of translocator protein as a biomarker ofneuroinflammation in psychiatry.Mol Psychiatry 2018；23:36-47.)，但是，放射性同位素标记配基的体内应用不可避免地对机体具有损伤性，因此，构建神经炎症无损体外监测的方法和相应动物模型具有重要意义。

目前，神经炎症无损体外监测的方法和相应动物模型均未见报道。GFAP是一种主要表达于星形胶质细胞中的中间丝蛋白，在星形胶质细胞活化时表达水平显著升高。利用GFAP启动子控制的荧光素酶转基因小鼠能够可视化地观测体内神经炎症，但是灵敏度不够，必须打开颅骨才能观测。为了提高灵敏度，本发明采用了经改造效率提高100-1000倍的荧光素酶AkaLuc，这个基因和黄色荧光蛋白Venus基因串联，通过IRES加在GFAP基因的后面，建立了一种突破颅骨限制无损监测神经炎症的小鼠模型(Gfap-IRES-Venus-AkaLucknockin)，通过颅内注射水疱性口炎病毒(Vesicular Stomatitis Virus,VSV)诱导神经炎症，利用商品化的新型荧光素体内注射，实现了神经炎症的无损活体成像观测。

发明内容

针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种突破颅骨限制无损监测神经炎症小鼠模型的构建方法及其应用，本发明构建的突破颅骨限制无损监测神经炎症小鼠模型具有灵敏度高、突破颅骨限制(无损)和动态监测的优点，可用于临床研究神经炎症的病因、发生发展机制和治疗。

本发明的上述目的通过以下技术方案得以实现：

本发明的第一方面提供了一种突破颅骨限制无损监测神经炎症小鼠模型的构建方法。

进一步，所述方法包括如下步骤：

(1)载体构建：构建携带黄色荧光蛋白基因Venus和荧光素酶报告基因AkaLuc的同源重组载体；

(2)将Cas9 mRNA、gRNA和步骤(1)构建的同源重组载体导入到小鼠体内，构建得到突破颅骨限制无损监测神经炎症小鼠模型。

进一步，通过IRES将GFAP基因加在串联的Venus和AkaLuc基因之前。

进一步，步骤(1)中所述同源重组载体包括5’同源臂、IRES-Venus-AkaLuc和3’同源臂。

进一步，所述方法包括对小鼠进行基因型的鉴定。

进一步，所述鉴定包括同源重组阳性小鼠PCR鉴定方案：5’臂同源重组阳性基因组应扩增出4.2kb片段，阴性基因组应无产物；3’臂同源重组阳性基因组应扩增出3.7kb片段，阴性基因组应扩增出7.6kb片段。

进一步，所述方法包括对根据本发明所述的构建方法构建获得的小鼠模型进行功能鉴定。

进一步，所述的功能鉴定的具体方法包括如下步骤：

(1)小鼠模型颅内注射病毒，建立颅内病毒感染小鼠模型；

(2)检测步骤(1)中所述的小鼠模型中干扰素的表达水平；

(3)若干扰素表达水平升高，则证明小鼠模型成功建立。

进一步，步骤(1)中所述的颅内病毒感染小鼠模型是通过颅内注射病毒诱导的神经炎症的小鼠模型。

进一步，步骤(1)中所述的病毒包括但不限于：水疱性口炎病毒(VSV)、单纯疱疹病毒(HSV)、B疱疹病毒(BV)、EB病毒、巨细胞病毒和水痘带状疱疹病毒。

进一步，所述的检测干扰素表达水平的方法包括但不限于：实时荧光定量PCR、原位杂交、基因芯片、蛋白免疫印迹法(Western blot)、酶联免疫吸附测定法(ELISA)、胶体金检测法。

(1)实时荧光定量PCR(Real-time PCR，RT-PCR)

实时荧光定量PCR技术是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时检测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定性及定量的分析，其特点有：用产生荧光信号的指示剂显示扩增产物的量，进行实时动态连续的荧光监测。荧光信号通过荧光染料嵌入双链DNA，或荧光探针特异结合目的检测物等方法获得，大大提高了检测的灵敏度、特异性和精确度。

(2)原位杂交(In situ hybridization)

原位杂交化学技术是核酸杂交技术的一种方式，是指将特定标记的已知顺序核酸为探针与细胞或组织切片中核酸进行杂交，从而对特定核酸顺序进行精确定量定位的过程。具有安全、快速、灵敏度高、特异性好、探针能长期保存、能同时显示多种颜色的优点。

(3)基因芯片(Genechip)

基因芯片或DNA微阵列(DNA Array)，是指采用原位光刻技术或微量点样等方法，将大量DNA分子有序地固定于支持物(如玻片、硅片、聚丙烯酰胺凝胶、尼龙膜等载体)的表面，组成密集二维分子排列，然后与已标记的待测生物样品中靶分子杂交，通过特定的仪器如激光共聚焦扫描或电荷偶联摄影像机(CCD)对杂交信号的强度进行快速、并行、高效地检测分析，从而判断样品中靶分子的数量。具有快速、高效、自动化的优点。

(4)蛋白免疫印迹法(Western blot)

蛋白免疫印迹法是指将蛋白质通过蛋白凝胶电泳(SDS-PAGE)分离在聚丙烯酰胺凝胶上，再从凝胶转移到NC膜或PVDF膜上，然后用抗体进行印迹检测的一种蛋白分析方法，是一种常用的检测蛋白质特性、表达与分布的的方法，具有分析容量大、敏感度高、特异性强的优点。

(5)酶联免疫吸附测定法(ELISA)

酶联免疫吸附的原理是将抗原或抗体与底物(酶)结合，使其保持免疫反应和酶的活性。把标记的抗原或抗体与包被于固相载体上的配体结合，再使之与相应的无色底物作用而显示颜色，根据显色深浅程度目测或用酶标仪测定OD值定量测定结果。主要分为夹心法、间接法、竞争法和捕获法，具有操作简单、快速、敏感性高、特异性强和应用范围广泛的优点。

(6)胶体金检测法

胶体金检测法的原理是将特异性的抗体以条带状固定在膜上(T线)，胶体金标记试剂吸附在结合上(金垫)，当待检抗原加到试纸条一端的样本垫上后，样本通过毛细作用向前移动，溶解结合垫上的胶体金标记试剂后相互反应，再移动至固定的抗原或抗体的区域时，待检物与金标试剂的结合物又与之发生特异性结合而被截留，聚集在检测带上。具有快速、操作简便、成本低和稳定性好的优点。

在本发明的实施例中，步骤(1)中所述的病毒优选为水疱性口炎病毒(VSV)，步骤(2)中所述的干扰素优选为Ifnα4和Ifnβ1，检测方法优选为实时荧光定量PCR。

本发明的第二方面提供了本发明第一方面所述的小鼠模型的构建方法在动物模型构建领域中的应用。

本发明的第三方面提供了本发明第一方面所述的小鼠模型的构建方法构建获得的小鼠模型在筛选预防或治疗神经炎症药物中的应用。

进一步，所述应用包括一种筛选预防或治疗神经炎症候选药物的方法。

本发明的第四方面提供了一种筛选预防或治疗神经炎症候选药物的方法。

进一步，所述方法包括如下步骤：

(1)将测试候选药物施用于经病毒感染的本发明第一方面所述的构建方法构建的小鼠模型中；

(2)体外无损动态监测小鼠模型颅内病毒感染诱导的神经炎症；

(3)选择可以使小鼠体内荧光强度降低的测试候选药物。

进一步，步骤(1)中所述的经病毒感染的小鼠模型是通过颅内注射病毒诱导的神经炎症的小鼠模型。

进一步，步骤(1)中所述的病毒包括但不限于：水疱性口炎病毒(VSV)、单纯疱疹病毒(HSV)、B疱疹病毒(BV)、EB病毒、巨细胞病毒和水痘带状疱疹病毒。

进一步，步骤(2)中所述的动态监测是通过活体成像系统(IVIS)Spectrum(PerkinElmer,Santa Clara,CA,USA)进行生物发光成像，并使用IVIS系统专用的LivingImage 4.5.2软件(PerkinElmer)进行分析。

本发明的优点和有益效果：

(1)本发明首次构建出一种突破颅骨限制无损监测神经炎症小鼠模型，即Gfap-IRES-Venus-AkaLuc knockin小鼠模型。

(2)本发明构建的小鼠模型具有灵敏度高、突破颅骨限制(无损)和动态监测的优点。

(3)本发明提供了一种突破颅骨限制无损监测神经炎症小鼠模型的构建方法，该构建过程相对简单，操作方便，构建成本低。

(4)本发明构建的小鼠模型可用于神经炎症候选药物的筛选，为神经炎症的病因、发生发展机制和治疗的研究提供了重要的研究模型。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

图1是本发明构建的同源重组质粒载体图；

图2是Gfap-IRES-Venus-AkaLuc knockin小鼠模型构建示意图；

图3是F0代小鼠PCR鉴定电泳结果图，其中，A图：5’臂，B图：3’臂；

图4是F1代小鼠PCR鉴定电泳结果图，其中，A图：5’臂，B图：3’臂；

图5是对模型小鼠进行繁殖后的PCR鉴定电泳结果图，其中，A图：野生型小鼠，B图：HE小鼠(繁殖后的模型小鼠)；

图6是活体成像系统(IVIS)对小鼠进行生物发光成像得到的结果图；

图7是qRT-PCR检测对照组和VSV注射组的Ifnα4的表达水平结果图，其中，A图：扩增曲线图，B图：结果统计图；

图8是qRT-PCR检测对照组和VSV注射组的Ifnβ1的表达水平结果图，其中，A图：扩增曲线图，B图：结果统计图；

图9是免疫荧光分析颅内注射VSV病毒5天后胶质细胞的活化结果图，其中，A图：对照组，B图：VSV注射组；

图10是活体荧光成像分析颅内注射VSV病毒5天后神经炎症水平的结果图，其中A图：成像结果图，B图：结果统计图，401和407号小鼠注射VSV、408和409号小鼠注射等量生理盐水。

具体实施方式

下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。在以下的实施方式中，很多细节描述是为了使得本申请能被更好的理解，仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。然而，本领域技术人员可以毫不费力地认识到，其中部分特征在不同情况下是可以省略的，或者可以由其他元件、材料、方法所替代。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件，实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1 Gfap-IRES-Venus-AkaLuc knockin小鼠模型的构建

1、Gfap-IRES-Venus-AkaLuc knockin小鼠模型的构建

采用CRISPR/Cas9技术，通过同源重组的方式，在Gfap基因终止密码子位点定点敲入IRES-Venus-AkaLuciferase表达框。

过程如下：通过体外转录的方式，获得Cas9 mRNA和gRNA，gRNA的序列为：CAATCTGGTGAGCCTGTATT(SEQ ID NO.15)，通过In-Fusion cloning的方法构建同源重组载体(donor vector)，该载体包含3.7kb 5’同源臂、IRES-Venus-AkaLuciferase和3.3kb 3’同源臂，所构建的同源重组质粒载体图谱见图1，其中元件Rep为复制起始位点，元件Amp为氨苄抗性筛选基因，元件5’arm为5’同源臂，元件3’arm为3’同源臂。将Cas9 mRNA、gRNA和同源重组质粒载体显微注射到C57BL/6J小鼠的受精卵中，将注射后的受精卵移植到假孕母鼠中，20天左右出生的小鼠为F0代小鼠，由于受精卵早期卵裂速度很快，因此得到的F0代小鼠为嵌合体，不一定具备稳定遗传的能力，因此需要进行传代以获得可稳定遗传的F1代小鼠，即将PCR鉴定阳性的F0代小鼠与野生型C57BL/6J小鼠交配繁育，获得F1代小鼠，通过PCR鉴定对其进行基因型鉴定。

2、基因型鉴定

对F0代小鼠进行PCR鉴定，同源重组阳性小鼠PCR鉴定方案：5’臂同源重组阳性基因组应扩增出4.2kb片段，阴性基因组应无产物；3’臂同源重组阳性基因组应扩增出3.7kb片段，阴性基因组应扩增出7.6kb片段。

对F1代小鼠进行PCR鉴定，同源重组阳性小鼠PCR鉴定方案：5’臂同源重组阳性基因组应扩增出4.2kb片段，阴性基因组应无产物；3’臂同源重组阳性基因组应扩增出3.7kb片段，阴性基因组应扩增出7.6kb片段。

(1)鼠尾DNA提取

1)将待鉴定的小鼠打耳号标记，剪取0.1-0.2cm小鼠尾巴末端放入1.5mL的E P管中，加入200mL组织裂解液(TL)及20mL蛋白酶K，震荡混匀。55℃恒温水浴4h或过夜。

2)向裂解液中加入100mL异丙醇，200mL结合液CB，充分混匀。

3)使用离心机13000rpm离心5min，将上清加入吸附柱中，10000rpm离心30s后，弃废液。

4)向吸附柱中加入500mL抑制物去除液(IR)，12000rpm离心30s，倒掉废液。

5)向吸附柱中加入700mL漂洗液(WB)，12000rpm离心30s后，倒掉废液。再重复离心1次，尽量去除漂洗液。

6)将吸附柱放入标有对应耳号的新的EP管中，加入100mL洗脱液，静置2min后，12000rpm离心1min。

7)将获得的DNA立即进行PCR或者置于-20℃冰箱保存。

(2)鼠尾基因型的鉴定

反应条件、反应体系和引物序列见表1-3。

表1反应条件

表2反应体系

表3引物序列

P1，P2用于扩增5’臂同源重组阳性基因组片段；P3，P4用于扩增3’臂同源重组阳性基因组片段。

同源重组阳性小鼠PCR鉴定方案：

5’臂同源重组阳性基因组应扩增出4.2kb片段，阴性基因组无产物；3’臂同源重组阳性基因组应扩增出3.7kb片段，阴性基因组应扩增出7.6kb片段。

3、实验结果

构建的同源重组载体质粒的图谱见图1，Gfap-IRES-Venus-AkaLuc knockin小鼠模型构建示意图见图2。F0代小鼠PCR鉴定电泳结果图见图3A和B，结果显示，只有1号5’臂同源重组基因组扩增出4.2kb片段，阴性基因组无产物，3’臂同源重组基因组扩增出3.7kb片段，阴性基因组扩增出7.6kb片段，表明双臂同源重组阳性的F0代小鼠为1号；F1代小鼠PCR鉴定电泳结果图见图4A和B，结果显示1号和7号的5’臂同源重组基因组扩增出4.2kb片段，阴性基因组无产物，3’臂同源重组基因组扩增出3.7kb片段，阴性基因组扩增出7.6kb片段，即PCR鉴定阳性小鼠为1号和7号，表明可稳定遗传的Gfap-IRES-Venus-AkaLuc knockin小鼠模型构建成功。

实施例2 F1代Gfap-IRES-Venus-AkaLuc knockin小鼠模型的繁育与基因型鉴定

在小鼠交配繁殖过程中，根据目的序列敲入前后，野生型和突变型PCR鉴定时，PCR产物的有无和片段大小的不同来区分不同的基因型，在本实施例中通过短片段PCR的方式对小鼠基因型进行鉴定。

1、鼠尾DNA提取

(1)将待鉴定的小鼠打耳号标记，剪取0.1-0.2cm小鼠尾巴末端放入1.5mL的EP管中，加入200mL组织裂解液(TL)及20mL蛋白酶K，震荡混匀。55℃恒温水浴4h或过夜。

(2)向裂解液中加入100mL异丙醇，200mL结合液CB，充分混匀。

(3)使用离心机13000rpm离心5min，将上清加入吸附柱中，10000rpm离心30s后，弃废液。

(4)向吸附柱中加入500mL抑制物去除液(IR)，12000rpm离心30s，倒掉废液。

(5)向吸附柱中加入700mL漂洗液(WB)，12000rpm离心30s后，倒掉废液。再重复离心1次，尽量去除漂洗液。

(6)将吸附柱放入标有对应耳号的新的EP管中，加入100mL洗脱液，静置2min后，12000rpm离心1min。

(7)将获得的DNA立即进行PCR或者置于-20℃冰箱保存。

2、鼠尾基因型的鉴定

小鼠基因型鉴定所需反应条件、反应体系和引物序列如表4-6所示。

表4反应条件

表5反应体系

表6引物序列

P1，P2用于扩增332bp条带；P3，P4用于扩增702bp条带。

将产物进行琼脂糖凝胶电泳，胶浓度为1.5％。

小鼠基因组使用引物对(P1，P2)，(P3，P4)分别扩增，鉴定方案如下：

野生型：只有(P1，P2)扩增出332bp条带，(P3，P4)无条带；

杂合子：(P1，P2)扩增出332bp条带，(P3，P4)也扩增出小条带702bp；

纯合子：(P1，P2)无条带，(P3，P4)可扩增出小条带702bp。

3、实验结果

结果显示，经过繁育后的He突变型小鼠扩增出702bp条带，野生型小鼠扩增出332bp条带(见图5A和B)，进一步证明了突变型Gfap-IRES-Venus-AkaLuc knockin小鼠模型的成功构建。

实施例3 Gfap-IRES-Venus-AkaLuc knockin小鼠模型颅内病毒注射诱导I型干扰素的表达

1、VSV(水疱性口炎病毒)颅内注射

用戊巴比妥(150mg/kg)麻醉小鼠；将小鼠放置于立体定位仪上并固定；用小型电动剃须刀剃去小鼠颅顶部的毛发并消毒；用镊子将颅顶部的皮肤提起并用剪刀剪去一圈皮肤(直径约5mm)，充分暴露颅骨冠状线和矢状线交汇区域；用镊子和刀片清理暴露部位的骨膜并修理颅骨；用高速微型颅钻在颅骨上钻孔(直径约0.5mm，打孔部位距中线1.5mm、前囟0.7mm)；使用微量注射泵控制微量注射器在打孔部位进行颅内注射VSV(深度为2mm，体积为2μL，浓度为1×10⁶pfu/g，注射时间为10min，注射完放置10min，取出注射器)或等量生理盐水；术后将小鼠轻柔的放回，维持体温，直至恢复正常。

2、生物发光成像

使用小型电动剃须刀剃去小鼠头部的毛发；成像前12min给与小鼠腹腔注射荧光素酶底物AkaLumine(商品名TokeOni，Sigma-Aldrich，货号808350，50μL/只，浓度为300μmol/mL)；底物注射5min后麻醉小鼠；底物注射10min后放入机器中，俯卧位摆放；底物注射12min后使用活体成像系统(IVIS)Spectrum(Perki nElmer,Santa Clara,CA,USA)进行生物发光成像(参数如下：open for total bio luminescence，exposure time＝auto，binning＝medium:8，field of view＝25.2×25.2cm and f/stop＝1)，并使用IVIS系统专用的Living Image 4.5.2软件(PerkinElmer)进行分析；小鼠连续进行活体成像间隔时间为24h。

3、I型干扰素表达检测

(1)RNA的提取

1)取小鼠脑组织约200μg，加入1mL TRIzol试剂，反复吹打使细胞裂解，室温静置5min；

2)加入200μL氯仿，进行剧烈震荡15s后，室温放置7min；

3)4℃ 12,000rpm离心15min，将上层水相转移到新的无RNA酶离心管中；

4)加入500μL异丙醇，颠倒混匀，室温放置15min；

5)4℃ 12,000rpm离心20min，弃上清；

6)加入DEPC水和无水乙醇配置的75％乙醇，1mL/管，洗涤RNA；

7)4℃ 7500rpm离心20min，弃上清；

8)室温放置通风橱中15min，晾干；加入15-60μL DEPC水，充分溶解RNA，置于冰上静置10min，或保存-70℃。

(2)cDNA的合成

按照biomake公司的cDNA合成试剂盒的说明书进行实验，反应体系如表7所示，反应条件如表8所示。

表7逆转录PCR的反应体系

表8逆转录PCR的反应条件

(3)实时荧光定量PCR

按照Toyobo公司Realtime PCR Master Mix说明书进行实验，反应体系如表9所示。

表9逆转录PCR的反应条件

反应条件：

1)95℃，3分钟预变性；

2)95℃，15秒变性，退火温度为60℃，时间为15s，72℃，30s延伸，40个循环；

3)最后60℃，30秒。

其中，所述的引物序列如表10所示：

表10引物序列

分析数据：以18S为内参按照2^-ΔΔCt方法进行统计分析。

4、实验结果

实验结果显示，Gfap-IRES-Venus-AkaLuc knockin小鼠(KI)和野生型小鼠(WT)体内注射新型荧光素酶底物AkaLumine后12min，利用PerkinElmer公司IVIS活体成像系统进行生物发光成像得到的结果图见图6，表明KI小鼠在颅骨无损的情况下可以检测到本底荧光信号，而WT小鼠无荧光信号，证明了对本发明构建的小鼠模型进行监测时，可突破颅骨的限制。

实验结果显示，Gfap-IRES-Venus-AkaLuc knockin小鼠内注射VSV病毒5天后I型干扰素Ifnα4和Ifnβ1大量表达，尤其是Ifnβ1(见图7A和B、图8A和B)，提示VSV颅内感染的Gfap-IRES-Venus-AkaLuc knockin小鼠模型的成功构建。

实施例4免疫荧光检测VSV颅内感染的Gfap-IRES-Venus-AkaLuc knockin小鼠模型胶质细胞的活化情况

1、实验方法

将脑组织浸入4％的多聚甲醛，包埋后冰冻切片；冰箱中取出冰冻切片，室温放置，复温5-10min；PBS洗涤3次，5min/次，以去除包埋试剂；冰甲醇-20℃固定1h；0.3％TritonX-100/3％BSA/(PBS配制)，室温封闭1-2h；Iba1抗体(Wako，货号019-19741)用3％BSA 1：100稀释，4℃孵育过夜或室温孵育2-5h；PBS洗涤3次，5min/次；荧光二抗(3％BSA1:100-200稀释)，室温孵育1h，避光；PBS洗涤3次，5min/次；DAPI室温孵育10min；封片；荧光显微镜下观察结果。

2、实验结果

实验结果显示，在共聚焦显微镜下，未经感染的KI小鼠由于黄色荧光蛋白Venus的存在呈现微弱的本底绿色荧光，而在VSV感染后，小鼠的整个脑区中绿色荧光都显著增强(见图9A和B)，由于Venus表达与GFAP一致，该结果提示星形胶质细胞活化，另一方面，未经感染的KI小鼠无红色荧光，而在VSV感染后呈现较多的红色荧光斑点，说明Iba1表达水平显著升高、小胶质细胞活化(见图9A和B)。这些结果进一步证明了KI小鼠颅内VSV病毒感染诱发了神经炎症。

实施例5 Gfap-IRES-Venus-AkaLuc knockin小鼠模型用于无损活体成像动态监测颅内病毒感染诱导的神经炎症

1、实验方法

在感染前，向KI小鼠体内注射新型荧光素酶底物AkaLumine，记录原始荧光强度。颅内注射VSV或者生理盐水5天后，再次给KI小鼠体内注射新型荧光素酶底物AkaLumine，记录处理后荧光强度。然后计算处理前后荧光强度的比值。

2、实验结果

实验结果显示，对照组荧光强度在处理前后没有明显变化，而病毒感染诱发的神经炎症导致荧光强度升高(见图10A和B)，证明了Gfap-IRES-Venus-AkaLuc knockin小鼠模型能够用于无损动态监测神经炎症。

上述实施例仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解为：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。

序列表

<110> 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院

<120> 一种突破颅骨限制无损监测神经炎症小鼠模型的构建方法及其应用

<141> 2020-10-24

<150> 202011017638.8

<151> 2020-09-24

<160> 15

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tgctggctgt gaggacatac 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

aggaagagag ggctctccag 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ccctatggag atgacggaga 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cccagtgctg gagaaattgt 20

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ttgacggaag ggcaccacca g 21

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gcaccaccac cacggaatcg 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tcacacagcc aaaaacccct 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ccttgttgaa tacgcttgag 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ccctgaaaat gttcgcagcc 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

tggggatgga gaaccttgga 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

agcaccaaag aaggggaagg 20

<210> 12

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

aggaagaaga caagctggaa agg 23

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

catctggtcc ccatcttgct c 21

<210> 14

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

ggttgtgccg cctttgc 17

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

caatctggtg agcctgtatt 20

Claims (9)

1.一种突破颅骨限制无损监测神经炎症的小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

(1)载体构建：构建携带黄色荧光蛋白基因Venus和荧光素酶报告基因AkaLuc的同源重组载体；

(2)将Cas9 mRNA、gRNA和步骤(1)构建的同源重组载体导入到小鼠体内，构建得到突破颅骨限制无损监测神经炎症的小鼠模型；

通过IRES将GFAP基因加在串联的Venus和AkaLuc基因之前；

所述同源重组载体包括5’同源臂、IRES-Venus-AkaLuc和3’同源臂；

所述gRNA为针对GFAP基因第8外显子的gRNA。

2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述方法包括对小鼠进行基因型的鉴定。

3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述鉴定包括同源重组阳性小鼠PCR鉴定方案：5’臂同源重组阳性基因组应扩增出4.2kb片段，阴性基因组应无产物；3’臂同源重组阳性基因组应扩增出3.7kb片段，阴性基因组应扩增出7.6kb片段。

4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述gRNA的序列如SEQ ID NO.15所示。

5.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(2)中所述的将Cas9mRNA、gRNA和步骤(1)构建的同源重组载体导入到小鼠体内包括如下步骤：

(a)将Cas9 mRNA、gRNA和步骤(1)构建的同源重组载体显微注射到小鼠的受精卵中；

(b)经注射后的受精卵移植到假孕母鼠中得到F0代小鼠；

(c)将F0代小鼠和野生型小鼠进行杂交，得到稳定遗传的F1代小鼠即为突破颅骨限制无损监测神经炎症的小鼠模型。

6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，所述小鼠为C57BL/6J小鼠。

7.权利要求1-6任一项所述的小鼠模型的构建方法在动物模型构建领域中的应用。

8.根据权利要求1-6任一项所述的小鼠模型的构建方法构建获得的小鼠模型在筛选预防或治疗神经炎症药物中的应用。

9.一种筛选预防或治疗神经炎症候选药物的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

(1)将测试候选药物施用于经病毒感染的权利要求1-6任一项所述的构建方法构建的小鼠模型中；

(2)体外无损动态监测小鼠模型颅内病毒感染诱导的神经炎症；

(3)选择可以使小鼠体内荧光强度降低的测试候选药物。

Images