CN115530123A - 一种高血糖实验性自身免疫性神经炎小鼠模型的构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于动物模型构建技术领域，公开了一种高血糖实验性自身免疫性神经炎小鼠模型的构建方法，通过既定方案，预先对小鼠腹腔注射链脲佐菌素，实现稳定高血糖的实验小鼠，并以此为基础，通过应用百日咳毒素、髓鞘蛋白P0180‑199等序贯对实验小鼠进行免疫，从而使实验小鼠产生自身抗体并获得实验性自身免疫性神经炎。本发明通过检测小鼠血糖，以及对小鼠症状体征进行标准化评估，从而实现具有高血糖背景的免疫性神经炎小鼠模型。本发明对于观察和研究血糖升高后免疫性神经炎相关疾病具有重大意义，比如吉兰‑巴雷综合征、糖尿病周围神经病等周围神经损伤性疾病。
Description
技术领域
本发明属于动物模型构建技术领域，尤其涉及一种高血糖实验性自身免疫性神经炎小鼠模型的构建方法。
背景技术
目前，神经炎症来源于多种外周因素和/或中枢因素引起的神经胶质细胞活化、免疫细胞募集，可推动多种中枢或外周神经系统疾病发生发展。周围神经炎症中，免疫环境与调控方式复杂，具体机制不明，构建相关动物模型能够为上述研究提供有效研究对象，具有重要意义。因此，构建神经炎症无损体外监测的方法和相应动物模型具有重要意义，但现有技术中针对高血糖实验性自身免疫性神经炎小鼠模型的构建方法尚未见报道。
在临床中，合并高血糖人群可能较血糖正常人群更易罹患“吉兰-巴雷综合征”，其临床症状可能也相对更重。目前，对该类患者发病机制、治疗手段的研究属于前沿热点，但是，目前为止缺乏很好的动物模型。因此，具有很好地临床研究实用性。
“实验性自身免疫性神经炎”是临床疾病“吉兰-巴雷综合征”的小鼠模型，能够在动物模型体内模拟周围神经损伤，该模型的构建方法目前已比较成熟。然而，针对合并高血糖的模型小鼠建立方法，目前没有很好的方案。因此，本技术进一步拓展了当前实验方案的技术瓶颈。
通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：现有技术中针对高血糖实验性自身免疫性神经炎小鼠模型的构建方法尚未见报道。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种高血糖实验性自身免疫性神经炎小鼠模型的构建方法。
本发明是这样实现的，一种高血糖实验性自身免疫性神经炎小鼠模型的构建方法，所述高血糖实验性自身免疫性神经炎小鼠模型的构建方法包括以下步骤：
步骤一，预先对小鼠腹腔注射链脲佐菌素，得到稳定高血糖的实验小鼠；
步骤二，通过应用序贯对实验小鼠进行免疫，从而使实验小鼠产生自身抗体并获得实验性自身免疫性神经炎；
步骤三，通过检测小鼠血糖，以及对小鼠症状体征进行标准化评估，从而实现具有高血糖背景的免疫性神经炎小鼠模型。
进一步，所述步骤一中，选取出生6～8周、体重25g的雄性C57BL/6小鼠。
进一步，所述步骤二中，通过应用百日咳毒素、髓鞘蛋白P0180-199的序贯对实验小鼠进行免疫。
本发明的另一目的在于提供一种实施所述的高血糖实验性自身免疫性神经炎小鼠模型的构建方法在动物模型构建领域中的应用。
本发明的另一目的在于提供一种实施所述的高血糖实验性自身免疫性神经炎小鼠模型的构建方法构建得到的高血糖实验性自身免疫性神经炎小鼠模型在筛选预防和/或抑制和/或治疗周围神经损伤性疾病药物中的应用。
进一步，所述周围神经损伤性疾病包括吉兰-巴雷综合征、糖尿病周围神经病、慢性炎性脱髓鞘性多发性神经根神经炎。
进一步，所述周围神经损伤性疾病药物为液体剂、气体剂、固体剂型或半固体剂。
进一步，所述周围神经损伤性疾病药物为注射剂。
进一步，所述周围神经损伤性疾病药物为口服剂。
本发明的另一目的在于提供一种筛选预防和/或抑制和/或治疗周围神经损伤性疾病药物的方法，所述筛选预防和/或抑制和/或治疗周围神经损伤性疾病药物的方法包括：
(1)将测试候选药物施用于经血糖升高的所述的小鼠模型的构建方法构建得到的高血糖实验性自身免疫性神经炎小鼠模型中；
(2)体外无损动态监测小鼠模型经血糖升高后诱导的实验性自身免疫性神经炎症；
(3)选择使小鼠体内荧光强度降低的测试候选药物。
结合上述的技术方案和解决的技术问题，请从以下几方面分析本发明所要保护的技术方案所具备的优点及积极效果为：
第一、针对上述现有技术存在的技术问题以及解决该问题的难度，紧密结合本发明的所要保护的技术方案以及研发过程中结果和数据等，详细、深刻地分析本发明技术方案如何解决的技术问题，解决问题之后带来的一些具备创造性的技术效果。具体描述如下：
本发明涉及一种高血糖免疫性神经炎小鼠模型的构建方法。本发明通过既定方案，预先对小鼠腹腔注射链脲佐菌素，实现稳定高血糖的实验小鼠，并以此为基础，通过应用百日咳毒素、髓鞘蛋白P0180-199等序贯对实验小鼠进行免疫，从而使实验小鼠产生自身抗体并获得实验性自身免疫性神经炎。本发明通过检测小鼠血糖，以及对小鼠症状体征进行标准化评估，从而实现具有高血糖背景的免疫性神经炎小鼠模型。
第二，把技术方案看做一个整体或者从产品的角度，本发明所要保护的技术方案具备的技术效果和优点，具体描述如下：
本发明对于观察和研究血糖升高后免疫性神经炎相关疾病具有重大意义，比如吉兰-巴雷综合征、慢性炎性脱髓鞘性多发性神经根神经炎等周围神经损伤性疾病。
第三，作为本发明的权利要求的创造性辅助证据，还体现在以下几个重要方面：
(1)本发明的技术方案转化后的预期收益和商业价值为：本发明所明确的实验动物模型，是一种在医学基础研究中亟需，但目前尚未标准化制备或销售的重要实验用品，具有很高的市场应用前景。
(2)本发明的技术方案填补了国内外业内技术空白：本发明创造性的提供了一种合并高血糖的实验性自身免疫性神经炎小鼠模型，为临床合并高血糖的免疫性神经炎(包括但不仅限于吉兰-巴雷综合征、慢性炎性脱髓鞘性多发性神经根神经炎)等疾病的机制和治疗方案分析，提供了重要的实验平台，此为国内外首创。
(3)本发明的技术方案是否解决了人们一直渴望解决、但始终未能获得成功的技术难题：一直以来如何更好地分析高血糖对自身免疫性神经炎的影响是困扰技术人员的重要瓶颈，本发明所提供的技术方案，从根本上解决了实验对象高血糖不稳定、神经损伤体征不稳定不确切的分析短板。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对本发明实施例中所需要使用的附图做简单的介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例提供的高血糖实验性自身免疫性神经炎小鼠模型的构建方法流程图；
图2是本发明实施例提供的新高血糖EAN小鼠与对照EAN小鼠症状评分情况比较，高血糖组小鼠症状明显加重；
图3是本发明实施例提供的新高血糖EAN小鼠与对照EAN小鼠神经损伤变化；甲苯胺蓝染色观察可见高血糖组小鼠神经纤维密度较对照组明显减低；
图中：EAN：实验性自身免疫性神经炎。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种高血糖实验性自身免疫性神经炎小鼠模型的构建方法，下面结合附图对本发明作详细的描述。
一、解释说明实施例。为了使本领域技术人员充分了解本发明如何具体实现，该部分是对权利要求技术方案进行展开说明的解释说明实施例。
如图1所示，本发明实施例提供的高血糖实验性自身免疫性神经炎小鼠模型的构建方法包括以下步骤：
S101，通过既定方案，预先对小鼠腹腔注射链脲佐菌素，实现稳定高血糖的实验小鼠；
S102，通过应用序贯对实验小鼠进行免疫，从而使实验小鼠产生自身抗体并获得实验性自身免疫性神经炎；
S103，通过检测小鼠血糖，以及对小鼠症状体征进行标准化评估，从而实现具有高血糖背景的免疫性神经炎小鼠模型。
本发明实施例提供的步骤S101中，选取出生6～8周、体重25g的雄性C57BL/6小鼠。
本发明实施例提供的步骤S102中，通过应用百日咳毒素、髓鞘蛋白P0180-199的序贯对实验小鼠进行免疫。
作为优选实施例，本发明实施例提供的高血糖实验性自身免疫性神经炎小鼠模型的构建方法，具体包括以下步骤：
(1)选取合适年龄体重的小鼠(6～8周，雄性，体重约25g)，提前予以链脲佐菌素腹腔注射，具体注射方案为：
1.第一天夜间自19：00起小鼠禁食水，次日晨07：00配置链脲佐菌素(10mg/mL)，每只小鼠200μL腹腔注射，注意链脲佐菌素自配置至注射入小鼠腹腔内，时间不超过5分钟；
2.注射完毕1小时后恢复小鼠饮食；
3.第二天夜间19：00起再次小鼠禁食水，重复第一天操作。
4.5天后通过测小鼠晨07：00血糖，评估小鼠高血糖状态。
(2)按照“实验性自身免疫性神经炎”方案免疫小鼠，具体如下：
1.准备免疫小鼠用试剂：①免疫原试剂A：0.9％生理盐水溶解P0180-199肽至2mg/mL，4℃备用；佐剂B：在弗氏完全佐剂中溶解热灭活的H37RA株结核分支杆菌素至20mg/mL，4℃备用；使用前于室温将等量免疫原试剂A缓慢加入佐剂B中振荡混合至完全乳化；②增强佐剂：无菌PBS溶液溶解百日咳毒素PT至1.6μg/mL，4℃备用；
2.免疫小鼠方案：①第-1日，麻醉小鼠后腹腔注射250μL百日咳毒素增强佐剂；②第0日，麻醉小鼠后于后肢之间背部皮肤下注射50μL制备好的免疫原试剂；③第1日，重复步骤(1)-c-①；④第3日，再次重复步骤(1)-c-①；⑤第8日，重复步骤(1)-c-②，于相同部位皮下注射；对照组小鼠仅给予第-1、1、3日给予增强佐剂腹腔注射处理。
(3)对小鼠症状体征进行标准化评估
1.症状体征评分：①自第0日起开始对小鼠症状体征评分；②对每只小鼠给予0～4评分，参见评分标准(要求单日内由同一名实验者做评分)；
2.评分标准(见表1)。
表1评分标准
本发明实施例提供了一种实施高血糖实验性自身免疫性神经炎小鼠模型的构建方法在动物模型构建领域中的应用。
本发明实施例提供了一种实施高血糖实验性自身免疫性神经炎小鼠模型的构建方法构建得到的高血糖实验性自身免疫性神经炎小鼠模型在筛选预防和/或抑制和/或治疗周围神经损伤性疾病药物中的应用。
本发明实施例提供的周围神经损伤性疾病包括吉兰-巴雷综合征、糖尿病周围神经病。
本发明实施例提供的周围神经损伤性疾病药物为液体剂、气体剂、固体剂型或半固体剂。
本发明实施例提供的周围神经损伤性疾病药物为注射剂。
本发明实施例提供的周围神经损伤性疾病药物为口服剂。
本发明实施例提供的筛选预防和/或抑制和/或治疗周围神经损伤性疾病药物的方法包括以下步骤：
(1)将测试候选药物施用于经血糖升高的所述的小鼠模型的构建方法构建得到的高血糖实验性自身免疫性神经炎小鼠模型中；
(2)体外无损动态监测小鼠模型经血糖升高后诱导的实验性自身免疫性神经炎症；
(3)选择使小鼠体内荧光强度降低的测试候选药物。
二、应用实施例。为了证明本发明的技术方案的创造性和技术价值，该部分是对权利要求技术方案进行具体产品上或相关技术上的应用实施例。
1.在一项关于“银杏内酯”在吉兰-巴雷综合征中治疗作用的研究中，实验者通过P0180-199肽进行免疫的方式，制备实验性自身免疫性神经炎(EAN)小鼠，并以此为基础研究发现银杏内酯对EAN具有减轻神经损伤症状、延迟疾病达峰时间的治疗作用，且这一治疗作用是通过下调EAN小鼠脾脏TH17细胞、减轻IFN-γ和IL-12分泌来实现的；
2.在一项研究microRNA-338转染施旺细胞后调节其功能的研究中，实验者利用P0180-199肽对实验动物进行免疫，从而制备实验性自身免疫性神经炎(EAN)模型，并在该模型基础上发现microRNA-338编码慢病毒载体处理后EAN模型中，施旺细胞炎症状态减轻、神经肌肉功能改善；
3.在研究布比卡因进行神经组织对正常及高糖小鼠神经毒性的研究中，实验者采用链脲佐菌素对实验小鼠进行腹腔注射，以获得稳定的可用于实验的高血糖模型；
4.在研究海藻糖治疗缓解坐骨神经损伤的研究中，实验者利用链脲佐菌素处理小鼠，制备糖尿病模型的同时，获得糖尿病周围神经损伤小鼠，在此基础上发现海藻糖通过减轻施旺细胞凋亡，实现对链脲佐菌素诱导的高糖小鼠神经损伤的治疗作用。
三、实施例相关效果的证据。本发明实施例在研发或者使用过程中取得了一些积极效果，和现有技术相比的确具备很大的优势，下面内容结合试验过程的数据、图表等进行描述。
本发明实施例提供的具体应用效果如图2～图3所示。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种高血糖实验性自身免疫性神经炎小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述高血糖实验性自身免疫性神经炎小鼠模型的构建方法包括以下步骤：
步骤一，预先对小鼠腹腔注射链脲佐菌素，得到稳定高血糖的实验小鼠；
步骤二，通过应用序贯对实验小鼠进行免疫，从而使实验小鼠产生自身抗体并获得实验性自身免疫性神经炎；
步骤三，通过检测小鼠血糖，以及对小鼠症状体征进行标准化评估，从而实现具有高血糖背景的免疫性神经炎小鼠模型。
2.如权利要求1所述高血糖实验性自身免疫性神经炎小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述步骤一中，选取出生6～8周、体重25g的雄性C57BL/6小鼠。
3.如权利要求1所述高血糖实验性自身免疫性神经炎小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述步骤二中，通过应用百日咳毒素、髓鞘蛋白P0180-199的序贯对实验小鼠进行免疫。
4.一种实施如权利要求1～3任意一项所述高血糖实验性自身免疫性神经炎小鼠模型的构建方法在动物模型构建领域中的应用。
5.一种实施如权利要求1～3任意一项所述高血糖实验性自身免疫性神经炎小鼠模型的构建方法构建得到的高血糖实验性自身免疫性神经炎小鼠模型在筛选预防和/或抑制和/或治疗周围神经损伤性疾病药物中的应用。
6.如权利要求5所述高血糖实验性自身免疫性神经炎小鼠模型在筛选预防和/或抑制和/或治疗周围神经损伤性疾病药物中的应用，其特征在于，所述周围神经损伤性疾病包括吉兰-巴雷综合征、糖尿病周围神经病、慢性炎性脱髓鞘性多发性神经根神经炎。
7.如权利要求5所述高血糖实验性自身免疫性神经炎小鼠模型在筛选预防和/或抑制和/或治疗周围神经损伤性疾病药物中的应用，其特征在于，所述周围神经损伤性疾病药物为液体剂、气体剂、固体剂型或半固体剂。
8.如权利要求5所述高血糖实验性自身免疫性神经炎小鼠模型在筛选预防和/或抑制和/或治疗周围神经损伤性疾病药物中的应用，其特征在于，所述周围神经损伤性疾病药物为注射剂。
9.如权利要求5所述高血糖实验性自身免疫性神经炎小鼠模型在筛选预防和/或抑制和/或治疗周围神经损伤性疾病药物中的应用，其特征在于，所述周围神经损伤性疾病药物为口服剂。
10.一种筛选预防和/或抑制和/或治疗周围神经损伤性疾病药物的方法，其特征在于，所述筛选预防和/或抑制和/或治疗周围神经损伤性疾病药物的方法，包括：
(1)将测试候选药物施用于经血糖升高的如权利要求1～3任意一项所述小鼠模型的构建方法构建得到的高血糖实验性自身免疫性神经炎小鼠模型中；
(2)体外无损动态监测小鼠模型经血糖升高后诱导的实验性自身免疫性神经炎症；
(3)选择使小鼠体内荧光强度降低的测试候选药物。
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Citations (2)
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| US20060130161A1 (en) * | 2004-10-12 | 2006-06-15 | Carantech, Inc. | Animal model systems for viral pathogenesis of neurodegeneration, autoimmune demyelination, and diabetes |
| CN112239767A (zh) * | 2020-09-24 | 2021-01-19 | 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 | 一种突破颅骨限制无损监测神经炎症小鼠模型的构建方法及其应用 |
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2022
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Patent Citations (2)
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