CN112113940A - 一种荧光成像装置和荧光成像方法 - Google Patents
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Abstract
本申请适用于荧光成像技术领域，提供了一种荧光成像装置和荧光成像方法，其中，荧光成像装置包括用于产生激光的激光发生器，以及沿所述激光的光路依次设置的频率调制设备、扫描振镜设备和荧光显微设备；所述频率调制设备包括沿所述激光的光路依次设置的耦合透镜、保偏大模场光纤、解耦合透镜，以及第一滤光片。利用了激光在保偏大模场光纤内的自相位调制效应，并使用第一滤光片对激光的频率进行选择，进而获得相应频率与波长的激光，以用于激光扫描共聚焦荧光显微，相较于传统的使用光子晶体光纤的方案，激光更容易耦合至保偏大模场光纤，而且保偏大模场光纤结构简单可靠、价格更低且市场保有量大，能够极大地降低荧光成像装置的成本。
Description
技术领域
本申请涉及荧光成像技术领域，特别涉及一种荧光成像装置和荧光成像方法。
背景技术
多光子显微成像(Multi-Photon Microscopy，MPM)是一种非线性光学成像技术，在高光子密度的长波长光的照射下，荧光分子能够同时吸收两个或者以上光子后，从低能态跃迁到高能态，并在衰变过程中重新向低能态跃迁并发出荧光。多光子显微成像根据激发同一荧光信号需要同时吸收的光子数可分为双光子显微成像，三光子显微成像和四光子显微成像等。相对于单光子荧光显微镜，多光子显微镜的最大的优势在于对活体组织具备更强的穿透能力，特别适用于对深层活体组织结构进行成像，比如能够用于对活体动物大脑的研究。
不同的激发光波长下存在不同的多光子显微成像模式，其中，采用1700nm波长窗口(大约从1600nm到1840nm)的激发光的三光子显微成像能够实现最大的成像深度。这一现象的物理解释是，在1700nm波长窗口的激光在皮下组织中的衰减(包括吸收造成的衰减和散射造成的衰减)最少；而且，相比于双光子显微成像，三光子显微成像中活体组织的表面处产生的背景荧光强度更低。
三光子显微成像技术中，常采用提高飞秒激光光源的激光强度的方式得到1700nm波长窗口的激光，如采用锁模激光技术，光参数振荡技术和光参数放大技术等，这些方案中都需要用到激光的孤子自频移效应(Soliton Self-Frequency Shift，SSFS)获得高能飞秒脉冲激光。孤子自频移效应是反常色散光纤中的一种非线性光学现象，利用孤子自频移效应能够使飞秒孤子脉冲的波长发生红移，进而将商用的1550nm飞秒激光光源发出的激光变更为1700nm波长窗口的激光。由于孤子的能量与光纤的有效模场面积Aeff成正比，而光子晶体光纤具有非常巨大的有效模场面积(可达几千平方微米)，能够在1700nm波长窗口的激光产生具有大于100nJ的孤子能量的激光，满足深层组织多光子显微成像的能量需求。但是，这也导致现有技术中，多光子显微成像的光源严重依赖光子晶体光纤，而光子晶体光纤存在光耦合困难的问题，而且价格极为昂贵。
发明内容
本申请的目的在于提供一种荧光成像装置，旨在解决传统的多光子显微荧光设备激光耦合困难的技术问题。
本申请是这样实现的，一种荧光成像装置，包括用于产生激光的激光发生器，以及沿所述激光的光路依次设置的频率调制设备、扫描振镜设备和荧光显微设备；所述频率调制设备包括沿所述激光的光路依次设置的耦合透镜、保偏大模场光纤、解耦合透镜，以及第一滤光片。
在本申请的一个实施例中，所述荧光显微设备包括设置于所述激光经过所述扫描振镜设备反射后的光路上的二向色镜、设置于所述激光经过所述二向色镜反射后的光路上的物镜组件，以及设置于所述二向色镜的远离所述物镜组件的方向上的成像组件。
在本申请的一个实施例中，所述成像组件包括设置于所述二向色镜的远离所述物镜组件的方向上的第二滤光片、依次设置于所述激光穿过所述第二滤光片后的光路上的第三滤光片和第一光传感器，以及依次设置于所述激光经过所述第二滤光片反射后的光路上的第四滤光片和第二光传感器。
在本申请的一个实施例中，所述第一滤光片和所述第三滤光片均采用长通滤光片，所述第二滤光片和所述第四滤光片均采用带通滤光片。
在本申请的一个实施例中，所述频率调制设备还包括用于承载所述保偏大模场光纤的光纤支架，以及连接所述光纤支架的调节平台。
在本申请的一个实施例中，所述荧光成像装置还包括扩束准直镜组，所述扩束准直镜组设置于所述第一滤光片和所述荧光显微设备之间的光路上。
本申请的另一目的在于提供一种荧光成像方法，包括以下步骤：
获取光纤参数：模拟计算保偏大模场光纤的参数；
搭建成像系统：加工所述保偏大模场光纤并搭建荧光成像装置；
获取荧光成像：采用所述荧光成像装置对样本进行影像学检查，获取所述样本的图像参数。
在本申请的一个实施例中，所述获取光纤参数步骤具体包括：获取所述激光发生器的脉宽和波长、所述样本的特征波长，以及所述保偏大模场光纤的有效模场面积和非线性折射率；将所述激光发生器的脉宽和波长、所述样本的特征波长，以及所述保偏大模场光纤的有效模场面积和非线性折射率代入频域传输方程，模拟计算所述保偏大模场光纤的长度。
在本申请的一个实施例中，所述频域传输方程为：
其中，
表示频域的复振幅；
表示非线性参数；β(ω)表示所述保偏大模场光纤的传输常数；β1(ω0)表示所述激光在所述保偏大模场光纤传输的群速度的逆；FT表示傅里叶变换；R(t)表示所述保偏大模场光纤的非线性响应函数，且R(t)满足：
其中，fR表示延迟拉曼响应的分数贡献，τ1和τ1表示延迟拉曼响应的时间参数，Θ(t)表示赫维赛德阶跃函数，δ(t)表示狄拉克函数。
在本申请的一个实施例中，所述获取荧光参数步骤前，还包括荧光标记步骤，所述荧光标记步骤具体包括：向所述样本注射逆转录病毒，所述逆转录病毒的基因中包含能够表达为荧光蛋白的基因片段；或者，向所述样本注射蛋白荧光染料。
实施本申请任一实施例提供的一种荧光成像装置或者荧光成像方法，至少具有以下有益效果：
本申请任一实施例提供的荧光成像装置或者荧光成像方法，利用激光在光纤中的自相位调制效应，使得激光在保偏大模场光纤内产生频移后，使用第一滤光片对激光的频率进行选择，进而获得相应频率与波长的激光，以用于激光扫描共聚焦荧光显微。比如，保偏大模场光纤与自相位调制结合，能够将1550nm的激光转化为1700nm波长窗口的高能飞秒激光脉冲，从而在样本表面实现1500μm深度的荧光显微成像。本申请任一实施例提供的荧光成像装置或者荧光成像方法，利用保偏大模场光纤的自相位调制能够获得频移的激光，相较于传统的使用光子晶体光纤的方案，激光更容易耦合至保偏大模场光纤，而且保偏大模场光纤结构简单可靠、价格更低且市场保有量大，能够极大地降低荧光成像装置或者荧光成像方法的成本。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本申请的一个实施例提供的荧光成像装置的结构示意图；
图2是本申请的一个实施例提供的荧光成像方法的流程示意图；
图3是本申请的另一个实施例提供的荧光成像方法的流程示意图；
图4是采用本申请提供的荧光成像装置与荧光成像方法对样本表面进行成像的效果图。
上述附图所涉及的标号明细如下：
1-激光发生器；2-频率调制设备；21-耦合透镜；22-保偏大模场光纤；23-解耦合透镜；24-第一滤光片；3-扫描振镜设备；4-荧光显微设备；41-二向色镜；42-物镜组件；43-第二滤光片；44-第三滤光片；45-第一光传感器；46-第四滤光片；47-第二光传感器；5-半波片；6-扩束准直镜组；7-反射镜；8-样本。
具体实施方式
为了使本申请的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本申请进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本申请，并不用于限定本申请。
需说明的是，当部件被称为“固定于”或“设置于”另一个部件，它可以直接或者间接位于该另一个部件上。当一个部件被称为“连接于”另一个部件，它可以是直接或者间接连接至该另一个部件上。术语“上”、“下”、“左”、“右”、“前”、“后”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”、“内”、“外”等指示的方位或位置为基于附图所示的方位或位置，仅是为了便于描述，不能理解为对本技术方案的限制。术语“第一”、“第二”仅用于便于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明技术特征的数量。“多个”的含义是两个或两个以上，除非另有明确具体的限定。
为了说明本申请所述的技术方案，以下结合具体附图及实施例进行详细说明。
请参阅图1，本申请的一个实施例提供了一种荧光成像装置，包括用于产生激光的激光发生器1，以及沿激光的光路依次设置的频率调制设备2、扫描振镜设备3和荧光显微设备4；频率调制设备2包括沿激光的光路依次设置的耦合透镜21、保偏大模场光纤22、解耦合透镜23，以及第一滤光片24。
具体而言，本实施例提供的荧光成像装置是这样工作的：
激光发生器1产生的激光，依次经过频率调制设备2和扫描振镜设备3后，照射到荧光显微设备4，并被荧光显微设备4用作激光扫描共聚焦荧光显微的光源。激光在通过频率调制设备2时，首先被耦合透镜21耦合至保偏大模场光纤22内，激光在保偏大模场光纤22内发生自相位调制(Self-phase Modulation，SPM)；而后，激光经过解耦合透镜23时被解耦合并照射到第一滤光片24，第一滤光片24能够对自相位调制后的激光的波段进行筛选，去除激光中对荧光成像产生干扰的杂光，也即仅保留用于使样本8产生荧光的波长的光。经过第一滤光片24的激光在扫描振镜设备3的控制下，照射到荧光显微设备4，进而对样本8进行激光扫描共聚焦荧光显微。
自相位调制是一种高能、超短脉冲的激光在光纤等介质中产生的非线性光学效应，本质上是一个四波混频过程。在自相位调制的过程中，两个光子在激光的原有频率处被湮没，产生两个新的光子，频率分别蓝移(波长变短，能量增加)和红移(波长变长，能量减少)，激光的光谱被展宽，同时在短波长侧和长波长侧出现新的光谱成分，也即旁瓣。比如，对于三光子激光扫描共聚焦荧光显微，可以利用自相位调制效应，从1550nm的激光光源中获得并分离出1700nm波长窗口的激光，用于样本8的三光子激光扫描共聚焦荧光显微。
实施本实施例提供的荧光成像装置，至少具有以下有益技术效果：
本实施例提供的荧光成像装置，利用激光在光纤中的自相位调制效应，使得激光在保偏大模场光纤22内产生频移后，使用第一滤光片24对激光的频率进行选择，进而获得相应频率与波长的激光，以用于激光扫描共聚焦荧光显微。比如，保偏大模场光纤22与自相位调制结合，能够将1550nm的激光转化为1700nm波长窗口的高能飞秒激光脉冲，从而在样本8表面实现1500μm深度的荧光显微成像。本实施例提供的荧光成像装置，利用保偏大模场光纤22的自相位调制能够获得频移的激光，相较于传统的使用光子晶体光纤的方案，激光更容易耦合至保偏大模场光纤22，而且保偏大模场光纤22结构简单可靠、价格更低且市场保有量大，能够极大地降低荧光成像装置的成本。
作为本实施例的一个具体方案，激光发生器1可以采用1550nm激光发生器1，经过保偏大模场光纤22的自相位调制效应，能够经过进一步的滤光获得1700nm波长窗口的激光；激光发生器1输出的激光的脉冲频率为1MHz，脉宽为556fs，且为线偏振光，可以在激光发生器1和频率调制设备2之间设置半波片5，以使得激光的偏振是对准保偏大模场光纤22的主轴的；第一滤光片24采用1575nm长通滤光片，以滤除经过保偏大模场光纤22后的激光经过蓝移产生的短波分量。
请参阅图1，在本申请的一个实施例中，荧光显微设备4包括设置于激光经过扫描振镜设备3反射后的光路上的二向色镜41、设置于激光经过二向色镜41反射后的光路上的物镜组件42，以及设置于二向色镜41的远离物镜组件42的方向上的成像组件。扫描振镜设备3能够控制激光在样本8表面进行扫描，物镜组件42通过自身焦距的调整控制样本8表面成像的深度。
作为本实施例的一个具体方案，二向色镜41以45°角斜对经过扫描振镜设备3的反射后的激光，激光被二向色镜41反射至物镜组件42后，照射到样本8上并激发样本8；样本8在受激后产生荧光，荧光经过物镜组件42后再次照射向二向色镜41，二向色镜41对光线的透过具有选择性，荧光能够穿过二向色镜41并被成像组件接收。
请参阅图1，在本申请的一个实施例中，成像组件包括设置于二向色镜41的远离物镜组件42的方向上的第二滤光片43、依次设置于激光穿过第二滤光片43后的光路上的第三滤光片44和第一光传感器45，以及依次设置于激光经过第二滤光片43反射后的光路上的第四滤光片46和第二光传感器47。
具体而言，物镜组件42具有光轴，样本8、二向色镜41、第二滤光片43、第三滤光片44和第一光传感器45均沿物镜组件42的光轴设置，其中，样本8设置于物镜组件42的一侧，二向色镜41、第二滤光片43、第三滤光片44和第一光传感器45依次设置于物镜组件42的另一侧。第二滤光片43采用反射滤光片，能够使得部分波段的光线通过，且将剩余的光线反射；第二滤光片43以预设的角度斜对物镜组件42的光轴设置，第四滤光片46和第二光传感器47依次设置于样本8的荧光经过第二滤光片43反射后的光路上。
应当理解，本申请实施例中所述的光轴指的是物镜组件42所在的理想光具组的光轴，即物镜组件42所在的理想光具组中使光线不发生偏折的方向所在的一条直线。该解释适用于本申请各实施例中和光轴有关的描述，且光轴这一概念仅是为了简要清楚地说明本申请各实施例中的荧光显微设备的机械结构，不能理解为对本技术方案的限制。
请参阅图1，在本申请的一个实施例中，第一滤光片24和第三滤光片44均采用长通滤光片，第二滤光片43和第四滤光片46均采用带通滤光片。这样，第一滤光片24和第三滤光片44能够使得波长大于预设波长的光线通过，并阻止波长小于预设波长的光线；第二滤光片43和第四滤光片46则能够使得特定波段的光线通过，并阻止其他波段的光线。
作为本实施例的一个具体方案，当激光发生器1采用1550nm激光发生器1，且需要获得1700nm波长窗口的激光(如1603nm激光)以进行三光子荧光显微成像时，第一滤光片24采用1575nm的长通滤光片，第二滤光片43采用630nm带通反射滤光片，第三滤光片44采用593nm长通滤光片，第四滤光片46采用535nm带通滤光片；第一光传感器45采用磷砷化镓(GaAsP)光电倍增管(Photo Multiplier Tube，PMT)，用于采集样本8的三光子荧光信号，第二光传感器47采用砷化镓(GaAs)光电倍增管，用于采集样本8的三次谐波信号。
在本申请的一个实施例中，频率调制设备2还包括用于承载保偏大模场光纤22的光纤支架(图中未示出)，以及连接光纤支架的调节平台(图中未示出)。光纤支架对保偏大模场光纤22起到保护作用，同时避免保偏大模场光线弯折，确保保偏大模场光纤22能够产生预设的自相位调制效应，实现激光光谱的展宽。具体的，光纤支架可以采用三维运动平台，用于调节光纤与耦合透镜21之间的位置关系。
请参阅图1，在本申请的一个实施例中，荧光成像装置还包括扩束准直镜组6，扩束准直镜组6设置于第一滤光片24和荧光显微设备4之间的光路上，且扩束准直镜组6用于对激光进行扩束准直。
可选的，荧光成像装置还可以包括若干反射镜7，以实现光路的折叠；应当注意，设置反射镜7后，需要考虑反射镜7处的半波损失和偏振问题。
以下提供一个具体的实施方式：
请参阅图1，在本实施例中，荧光成像装置包括用于产生激光的激光发生器1，以及沿激光的光路依次设置的半波片5、频率调制设备2、反射镜7、扫描振镜设备3、扩束准直镜组6和荧光显微设备4；频率调制设备2包括沿激光的光路依次设置的耦合透镜21、保偏大模场光纤22、解耦合透镜23，以及第一滤光片24，频率调制设备2还包括承载保偏大模场光纤22的光纤支架，以及连接光纤支架以调节保偏大模场光纤22和耦合透镜21之间的位置关系的调节平台；荧光显微设备4包括具有光轴的物镜组件42，以及沿物镜组件42的光轴设置的二向色镜41、第二滤光片43、第三滤光片44和第一光传感器45，以及第四滤光片46和第二光传感器47，样本8设置于物镜组件42的一侧，二向色镜41、第二滤光片43、第三滤光片44和第一光传感器45依次设置于物镜组件42的另一侧；第二滤光片43采用反射滤光片，能够使得部分波段的光线通过，且将剩余的光线反射；第二滤光片43以预设的角度斜对物镜组件42的光轴设置，第四滤光片46和第二光传感器47依次设置于样本8的荧光经过第二滤光片43反射后的光路上。
具体的，激光发生器1采用1550nm激光发生器1，激光发生器1输出的激光的脉冲频率为1MHz，脉宽为556fs，且为线偏振光，保偏大模场光纤22的有效模场面积为616平方微米，长度13.5cm，非线性折射率n2＝2.6x10-20m2/W，这样，经过保偏大模场光纤22后，由于自相位调制效应，激光会产生一个1603nm波长的旁瓣；进一步的，第一滤光片24采用1575nm的长通滤光片，第二滤光片43采用630nm带通反射滤光片，第三滤光片44采用593nm长通滤光片，第四滤光片46采用535nm带通滤光片；第一光传感器45采用磷砷化镓光电倍增管，用于采集样本8的三光子荧光信号，第二光传感器47采用砷化镓光电倍增管，用于采集样本8的三次谐波信号。
请参阅图4，可以看到，本实施例提供的荧光成像装置，能够对样本表层以下1500μm以内的深度进行荧光成像。
请参阅图2，本申请的另一目的在于提供一种荧光成像方法，包括以下步骤：
S1：获取光纤参数：模拟计算保偏大模场光纤22的参数；
S2：搭建成像系统：加工保偏大模场光纤22并搭建荧光成像装置；
S3：获取荧光成像：采用荧光成像装置对样本8进行影像学检查，获取样本8的图像参数。
实施本实施例提供的荧光成像方法，至少具有以下有益技术效果：
本实施例提供的荧光成像方法中，利用激光在光纤中的自相位调制效应，使得激光在保偏大模场光纤22内产生频移后，使用滤光片对激光的频率进行选择，进而获得相应频率与波长的激光，以用于激光扫描共聚焦荧光显微。比如，保偏大模场光纤22与自相位调制结合，能够将1550nm的激光转化为1700nm波长窗口(如1603nm波长的激光)的高能飞秒激光脉冲，从而在样本8表面实现1500μm深度的荧光显微成像。本实施例提供的荧光成像方法，利用保偏大模场光纤22的自相位调制能够获得频移的激光，相较于传统的使用光子晶体光纤的方案，激光更容易耦合至保偏大模场光纤22，而且保偏大模场光纤22结构简单可靠、价格更低且市场保有量大，本实施例提供的荧光成像方法能够极大地降低荧光成像的成本。
请参阅图3，在本申请的一个实施例中，获取光纤参数步骤具体包括：S10：获取激光发生器1的脉宽和波长、样本8的特征波长，以及保偏大模场光纤22的有效模场面积和非线性折射率；将激光发生器1的脉宽和波长、样本8的特征波长，以及保偏大模场光纤22的有效模场面积和非线性折射率代入频域传输方程，模拟计算保偏大模场光纤22的长度。
根据激光发生器1的激光的相关参数、需要的激光的相关参数，以及激光在保偏大模场光纤22中的传播行为，可以通过模拟计算获得保偏大模场光纤22的长度等参数；进而可以根据这些参数对保偏大模场光纤22进行加工，使得激光经过保偏大模场光纤22后，能够通过自相位调制和进一步的滤光，获得所需的波长窗口的激光。
在本申请的一个实施例中，频域传输方程包括：
其中，
表示频域的复振幅；
表示非线性参数；β(ω)表示保偏大模场光纤22的传输常数；β1(ω0)表示激光在保偏大模场光纤22传输的群速度的逆；FT表示傅里叶变换；R(t)表示保偏大模场光纤22的非线性响应函数，且R(t)满足：
其中，fR表示延迟拉曼响应的分数贡献，τ1和τ1表示延迟拉曼响应的时间参数，Θ(t)表示赫维赛德阶跃函数，δ(t)表示狄拉克函数。
在本实施例中，根据上述公式，能够对激光发生器1发出的激光的相关参数和保偏大模场光纤22的具体参数进行拟合，进而可以根据拟合结果加工出符合要求的保偏大模场光纤22。例如，激光发生器1采用1550nm激光发生器1，需要经过保偏大模场光纤22的自相位调制效应和第一滤光片24的滤光获得1700nm波长窗口的激光，激光发生器1输出的激光的脉冲频率为1MHz，脉宽为556fs，且保偏大模场光纤22的有效模场面积为616平方微米，非线性折射率n2＝2.6x10-20m2/W时，根据上述公式拟合可知，当保偏大模场光纤22的长度为13.5cm时，能够获得波长1603nm的红移旁瓣。
在本申请的一个实施例中，获取荧光参数步骤前，还包括荧光标记步骤，荧光标记步骤具体包括：向样本8注射逆转录病毒，逆转录病毒的基因中包含能够表达为荧光蛋白的基因片段；或者，向样本8注射蛋白荧光染料。
通过向样本8注射逆转录病毒，能够向活体样本8逆转录荧光蛋白的表达基因，从而使得样本8能够长期表达出荧光蛋白，荧光蛋白在1700nm波长窗口的激光的照射下能够产生荧光；或者，更直接的，也可以向样本8注射蛋白荧光染料，对样本8内的特定的蛋白分子进行染色，使得这些蛋白分子能够在1700nm波长窗口的激光的照射下产生荧光，能够更快地在样本8中获得能够产生荧光的蛋白分子。
应当理解，向样本8注射逆转录病毒或者蛋白荧光染料的步骤和获取光纤参数、搭建成像系统的步骤是并行的，不存在先后关系。
以上所述仅为本申请的可选实施例而已，并不用以限制本申请，凡在本申请的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种荧光成像装置，其特征在于，包括用于产生激光的激光发生器，以及沿所述激光的光路依次设置的频率调制设备、扫描振镜设备和荧光显微设备；所述频率调制设备包括沿所述激光的光路依次设置的耦合透镜、保偏大模场光纤、解耦合透镜，以及第一滤光片。
2.如权利要求1所述的荧光成像装置，其特征在于，所述荧光显微设备包括设置于所述激光经过所述扫描振镜设备反射后的光路上的二向色镜、设置于所述激光经过所述二向色镜反射后的光路上的物镜组件，以及设置于所述二向色镜的远离所述物镜组件的方向上的成像组件。
3.如权利要求2所述的荧光成像装置，其特征在于，所述成像组件包括设置于所述二向色镜的远离所述物镜组件的方向上的第二滤光片、依次设置于所述激光穿过所述第二滤光片后的光路上的第三滤光片和第一光传感器，以及依次设置于所述激光经过所述第二滤光片反射后的光路上的第四滤光片和第二光传感器。
4.如权利要求3所述的荧光成像装置，其特征在于，所述第一滤光片和所述第三滤光片均采用长通滤光片，所述第二滤光片和所述第四滤光片均采用带通滤光片。
5.如权利要求1-4任一项所述的荧光成像装置，其特征在于，所述频率调制设备还包括用于承载所述保偏大模场光纤的光纤支架，以及连接所述光纤支架的调节平台。
6.如权利要求1-4任一项所述的荧光成像装置，其特征在于，所述荧光成像装置还包括扩束准直镜组，所述扩束准直镜组设置于所述第一滤光片和所述荧光显微设备之间的光路上。
7.一种荧光成像方法，其特征在于，包括以下步骤：
获取光纤参数：模拟计算保偏大模场光纤的参数；
搭建成像系统：加工所述保偏大模场光纤并搭建荧光成像装置；
获取荧光成像：采用所述荧光成像装置对样本进行影像学检查，获取所述样本的图像参数。
8.如权利要求7所述的荧光成像方法，其特征在于，所述获取光纤参数步骤具体包括：获取所述激光发生器的脉宽和波长、所述样本的特征波长，以及所述保偏大模场光纤的有效模场面积和非线性折射率；将所述激光发生器的脉宽和波长、所述样本的特征波长，以及所述保偏大模场光纤的有效模场面积和非线性折射率代入频域传输方程，模拟计算所述保偏大模场光纤的长度。
9.如权利要求8所述的荧光成像方法，其特征在于，所述频域传输方程为：
其中，
表示频域的复振幅；
表示非线性参数；β(ω)表示所述保偏大模场光纤的传输常数；β1(ω0)表示所述激光在所述保偏大模场光纤传输的群速度的逆；FT表示傅里叶变换；R(t)表示所述保偏大模场光纤的非线性响应函数，且R(t)满足：
其中，fR表示延迟拉曼响应的分数贡献，τ1和τ1表示延迟拉曼响应的时间参数，Θ(t)表示赫维赛德阶跃函数，δ(t)表示狄拉克函数。
10.如权利要求7所述的荧光成像方法，其特征在于，所述获取荧光参数步骤前，还包括荧光标记步骤，所述荧光标记步骤具体包括：向所述样本注射逆转录病毒，所述逆转录病毒的基因中包含能够表达为荧光蛋白的基因片段；或者，向所述样本注射蛋白荧光染料。
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