CN108469412A - 一种多光子显微镜中轴向色差的自参考测量装置 - Google Patents
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Abstract
本发明适用于光电技术领域,提供了一种自参考测量装置,包括:激发单元,用于产生预置波长的泵浦光并射入第一光路调整单元;第一光路调整单元,用于对泵浦光进行偏振态调整并射入孤子产生单元;孤子产生单元,用于根据泵浦光产生激光脉冲并射入第二光路调整单元;第二光路调整单元,用于对激光脉冲进行处理并射入多光子显微镜单元;多光子显微镜单元,用于根据对样品进行成像进行轴向色差的测量,并将谐波信号发送给信号收集单元进行收集。本发明实施例不需要机械位移平台一直重复扫描,从而消除了单色激发光重复扫描时由位移平台引入的机械误差。
Description
技术领域
本发明属于光电技术领域,尤其涉及一种多光子显微镜中轴向色差的自参考测量装置。
背景技术
多光子显微成像是一种在活体内或体外对生物样品结构或者动力学行为进行亚细胞尺度观察必不可少的技术。在多光子显微成像中,信号仅在焦点处产生,因此具备本征三维成像的能力。通过二维扫描振镜或平移台的二维扫描,可以获得焦点这一层的二维图像。多光子显微成像中,一般使用可调谐激光获高效外源性或内源性多光子信号。
聚焦和发散的光学元件广泛用于多光子显微成像,比如扫描透镜,管镜和物镜。由于折射率是对波长依赖的,光经过聚焦光学元件后会产生轴向色差。这表明不同波长的激光会聚焦于样品中不同的平面。根据多光子显微成像的原理,轴向色差仅与激发光有关,与信号光波长无关。因此必须对多光子显微成像中的轴向色差进行定量测量。
实验上,测量轴向色差最直接的手段就是改变激光波长后重复扫描样品。然而,这种方法的测量精度往往会被机械平移台的精度所限制,特别是反冲或双向移动的可重复性。平移台每次往复运动都可能出现上述问题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种多光子显微镜中轴向色差的自参考测量装置,旨在解决现有技术在进行轴向色差测量时,测量精度被机械平移台的精度所限制的问题。
本发明是这样实现的,一种多光子显微镜中轴向色差的自参考测量装置,包括激发单元、第一光路调整单元、孤子产生单元、第二光路调整单元、多光子显微镜单元和信号收集单元:
所述激发单元,用于产生预置波长的泵浦光,并将所述泵浦光射入所述第一光路调整单元;
所述第一光路调整单元,用于对所述泵浦光进行偏振态调整,并按照预置角度将偏振态调整后的泵浦光射入所述孤子产生单元;
所述孤子产生单元,用于根据入射的泵浦光产生激光脉冲,并将所述激光脉冲射入所述第二光路调整单元,所述激光脉冲包括宽度可调谐、波长可调谐且正交偏振的第一孤子和第二孤子;
所述第二光路调整单元,用于对所述激光脉冲进行消色差和滤波处理,并按照预置角度将处理后的激光脉冲射入所述多光子显微镜单元;
所述多光子显微镜单元,用于根据入射的激光脉冲对样品进行成像,根据成像信号进行轴向色差的测量,并收集所述第一孤子和第二孤子激发所述样品产生的谐波信号,将所述谐波信号发送给所述信号收集单元;
所述信号收集单元,用于收集所述谐波信号,用以确定所述谐波信号中每个波长的焦平面位置。
进一步地,所述激发单元为波长1550nm、500-fs、线偏振输出的光纤激光器。
进一步地,所述第一光路调整单元包括第一反射镜、第二反射镜、半波片和第一透镜;
所述泵浦光经所述第一反射镜和第二反射镜反射后,入射至所述半波片;
所述半波片,用于对所述泵浦光进行偏振态调节,将调节偏振态的泵浦光射入所述第一透镜;
所述第一透镜,用于对入射的泵浦光进行聚焦,将聚焦后的泵浦光入射至所述孤子产生单元。
进一步地,所述孤子产生单元为大模场光纤。
进一步地,所述第二光路调整单元包括第二透镜、滤光片、第三反射镜和 XY扫描振镜;
所述第二透镜,用于对入射的激光脉冲进行消色差后准直,将准直后的激光脉冲入射至所述滤光片;
所述滤光片,用于对所述准直后的激光脉冲进行滤波处理,将滤波后的激光脉冲入射至所述第三反射镜;
所述第三反射镜,用于将所述滤波后的激光脉冲反射入所述XY扫描振镜;
所述XY扫描振镜,用于控制所述滤波后的激光脉冲的光斑,以使光斑在 X和Y方向上移动,并将控制后的激光脉冲入射至所述多光子显微镜单元
进一步地,所述滤光片为1600nm的长波通滤光片。
进一步地,所述多光子显微镜单元包括扫描透镜、管镜、第四反射镜、双色片和物镜;
所述扫描透镜,用于对入射的激光脉冲进行聚焦,将聚焦后的激光脉冲入射到所述管镜;
所述管镜,用于对所述聚焦后的激光脉冲进行准直,将准直后的激光脉冲入射到所述第四反射镜;
所述第四反射镜,用于将所述准直后的激光脉冲反射入所述双色片;
所述双色片,用于将所述准直后的激光脉冲入射至所述物镜;
所述物镜,安装在电动平台上,用于将所述准直后的激光脉冲照射到所述样品,并收集所述样品受所述准直后的激光脉冲激发产生的谐波信号,并消除所述谐波信号中所述样品的玻片产生的像差,将消除像差后的谐波信号入射至所述双色片;
所述双色片,还用于在所述消除像差后的谐波信号中滤出所需的谐波信号,将滤出的谐波信号入射至所述信号收集单元。
进一步地,所述物镜包括空气物镜和水浸物镜。
进一步地,所述信号收集单元包括第一光电倍增管、第二光电倍增管、第一带通滤光片和第二带通滤光片;
所述第一带通滤光片,用于滤出所述第一孤子的三次谐波信号,并将所述第一孤子的三次谐波信号入射至所述第一光电倍增管;
所述第一光电倍增管,用于收集所述第一孤子的三次谐波信号;
所述第二带通滤光片,用于滤出所述第二孤子的三次谐波信号,并将所述第二孤子的三次谐波信号入射至所述第二光电倍增管;
所述第二光电倍增管,用于收集所述第二孤子的三次谐波信号。
进一步地,所述第一光电倍增管为镓砷磷光电倍增管,所述第二光电倍增管为多碱光电倍增管。
本发明与现有技术相比,有益效果在于:本发明实施例通过孤子产生单元根据激发单元产生的泵浦光产生激光脉冲,该激光脉冲包括宽度可调谐、波长可调谐且正交偏振的第一孤子和第二孤子,该激光脉冲经第二光路调整单元调整后入射至多光子显微镜单元对样品进行成像,多光子显微镜单元收集该第一股子和第二孤子激发样品产生的谐波信号,该谐波信号被收集单元收集。本发明实施例通过两个不同波长的孤子同时激发样品,得到样品中同一结构的双色三次谐波图像,可以得到两种波长孤子的轴向分离量,即多光子显微成像中的轴向色差,本发明实施例不需要机械位移平台一直重复扫描,从而消除了单色激发光重复扫描时由位移平台引入的机械误差。
附图说明
图1是本发明实施例提供的一种多光子显微镜中轴向色差的自参考测量装置的结构示意图;
图2是本发明实施例提供的一种多光子显微镜中轴向色差的自参考测量装置的详细结构示意图;
图3a是本发明实施例提供的5对双色孤子的光谱图;
图3b是本发明实施例提供的用一个线偏振片将双色孤子分开测量其相关迹的示意图;
图4a是本发明实施例提供的空气物镜三次谐波信号沿轴向的分布示意图;
图4b是本发明实施例提供的水浸物镜三次谐波信号沿轴向的分布示意图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白,以下结合附图及实施例,对本发明进行进一步详细说明。应当理解,此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明,并不用于限定本发明。
图1示出了本发明实施例提供的一种多光子显微镜中轴向色差的自参考测量装置,包括激发单元101、第一光路调整单元102、孤子产生单元103、第二光路调整单元104、多光子显微镜单元105和信号收集单元106:
激发单元101,用于产生预置波长的泵浦光,并将所述泵浦光射入第一光路调整单元102;
第一光路调整单元102,用于对所述泵浦光进行偏振态调整,并按照预置角度将偏振态调整后的泵浦光射入孤子产生单元103;
孤子产生单元103,用于根据入射的泵浦光产生激光脉冲,并将所述激光脉冲射入第二光路调整单元104,所述激光脉冲包括宽度可调谐、正交偏振的第一孤子和第二孤子;
第二光路调整单元104,用于对所述激光脉冲进行消色差和滤波处理,并按照预置角度将处理后的激光脉冲射入多光子显微镜单元105;
多光子显微镜单元105,用于根据入射的激光脉冲对样品进行成像,根据成像信号进行轴向色差的测量,并收集所述第一孤子和第二孤子激发所述样品产生的谐波信号,将所述谐波信号发送给收集单元106;
收集单元106,用于收集所述谐波信号,用以确定所述谐波信号中每个波长的焦平面位置。具体地,样品按照现有技术制备得到,包括样品本体、水和盖玻片等,本实施例中,谐波信号是激光脉冲打在盖玻片与水接触面时产生的信号,信号轴向最大值就是孤子的焦平面。收集谐波信号可以确定每个波长的焦平面位置。
具体地,如图2所示,激发单元101为波长1550nm、500-fs、线偏振输出的光纤激光器Laser;
第一光路调整单元102包括第一反射镜M1、第二反射镜M2、半波片HWP 和第一透镜L1;所述泵浦光经第一反射镜M1和第二反射镜M2反射后,入射至半波片HWP;半波片HWP,用于对所述泵浦光进行偏振态调节,将调节偏振态的泵浦光射入第一透镜L1;第一透镜L1,用于对入射的泵浦光进行聚焦,将聚焦后的泵浦光入射至孤子产生单元103。具体地,第一反射镜M1和第二反射镜M2均为镀银膜反射镜。
孤子产生单元103为大模场光纤LMAF。
第二光路调整单元104包括第二透镜L2、滤光片LPF、第三反射镜M3和 XY扫描振镜XYSM;第二透镜L2,用于对入射的激光脉冲进行消色差后准直,将准直后的激光脉冲入射至滤光片LPF;滤光片LPF,用于对所述准直后的激光脉冲进行滤波处理,将滤波后的激光脉冲入射至第三反射镜M3;第三反射镜M3,用于将所述滤波后的激光脉冲反射入XY扫描振镜XYSM;XY扫描振镜XYSM,用于控制所述滤波后的激光脉冲的光斑,以使光斑在X和Y方向上移动,并将控制后的激光脉冲入射至多光子显微镜单元105。具体地,第二透镜L2为消色差透明,滤光片LPF为1600nm的长波通滤光片,第三反射镜 M3为镀银膜反射镜。XY扫描振镜为两个小的反射镜,每个反射镜连接各自连接一个电动马达,由电脑程序控制一个反射镜在x方向震动,一个反射镜在y 方向震动,这样出来的光斑就可以在x,y方向动,以实现二维成像。
多光子显微镜单元105包括扫描透镜SL、管镜TL、第四反射镜M4、双色片DC和物镜OL,信号收集单元106包括第一光电倍增管PMT1、第二光电倍增管PMT2、第一带通滤光片BPF1和第二带通滤光片BPF2。
扫描透镜SL,用于对入射的激光脉冲进行聚焦,将聚焦后的激光脉冲入射到管镜TL;管镜TL,用于对所述聚焦后的激光脉冲进行准直,将准直后的激光脉冲入射到第四反射镜M4;第四反射镜M4,用于将所述准直后的激光脉冲反射入双色片DC;双色片DC,用于将所述准直后的激光脉冲入射至物镜OL;物镜OL,安装在电动平台上,用于将所述准直后的激光脉冲照射到所述样品,并收集所述样品受所述准直后的激光脉冲激发产生的谐波信号,并消除所述谐波信号中所述样品的玻片产生的像差,将消除像差后的谐波信号入射至双色片DC;双色片DC,还用于在所述消除像差后的谐波信号中滤出所需的谐波信号,将滤出的谐波信号入射至信号收集单元106。
第一带通滤光片BPF1,用于滤出所述第一孤子的三次谐波信号,并将所述第一孤子的三次谐波信号入射至第一光电倍增管PMT1;第一光电倍增管 PMT1,用于收集所述第一孤子的三次谐波信号;第二带通滤光片BPF2,用于滤出所述第二孤子的三次谐波信号,并将所述第二孤子的三次谐波信号入射至第二光电倍增管PMT2;第二光电倍增管PMT2,用于收集所述第二孤子的三次谐波信号。
在本发明实施例中,提出一种自参考测量装置,用于测量多光子显微镜中的轴向色差。该自参考测量装置使用两个不同波长的激发光同时激发样品,得到样品中同一结构的双色三次谐波图像。在具体应用中,将其中一种波长的激发光波长固定,类似于尺子上的“0”刻度,另一可调的波长的激发光类比于尺子上其他刻度。利用该自参考测量装置,可以得到两种波长激发光的轴向分离量,即也就是多光子显微成像中的轴向色差。此外,该自参考测量装置不需要机械位移平台一直重复扫描,从而消除了单色激发光重复扫描时由位移平台引入的机械误差。在本实施例中,对适用空气物镜和水浸物镜的多光子显微镜来测量轴向色差。
在本实施例中,为了在实验上获得两个不同波长不同且共线传播的飞秒脉冲,采用大模场光纤中的孤子自频移效应。大模场光纤中的孤子自频移效应被广泛用于获得宽带可调谐的飞秒脉冲。利用大模场光导比如大模场光纤,或光子晶体光纤棒,根据光纤中孤子的能量定标可以有效提高脉冲能量。实验中需要使用宽带可调谐的两个不同波长的孤子来测量(波长依赖的)轴向色差,不同波长成像的焦平面不一样,轴向色差也不一样。本实施例中,通过改变保偏大模场光纤(LMA fiber,large-mode-area fiber)中孤子的功率和偏振态来调节两个孤子的波长间隔分离量。本实施例中,将输入大模场光纤LMAF中的线偏振激光脉冲分裂为两个分别沿大模场光纤中两个主轴的正交偏振的激光脉冲。这两个正交偏振的激光脉冲的功率都可以分别进行调节,从而实现波长间隔可调的双波长孤子。不同于传统的锁膜激光器和光参量振荡器产生的双色的孤子脉冲,本发明实施例从同一个光纤输出的两个孤子是共线传播的,使得后面光路准直难度大大下降,特别是对多光子成像这种对光路调节要求很高的应用而言,更是降低了准直的难度。
本发明实施例提供的双色孤子轴向色差的自参考测量装置如图1所示。泵浦光源为波长1550nm、500-fs、线偏振输出的光纤激光器Laser(FLCPA-02CSZU, Calmar),其重复频率为5-MHz。一段5.5m的保偏大模场光纤 LMAF(DC-200/40-PZ-S,NKT Photonics)用于获得宽带可调谐的双色孤子。将半波片HWP(AHWP05M-1600,Thorlabs)放置在大模场光纤LMAF前用于调节输入激光的偏振态,结合功率调谐可以调节双色孤子的波长间隔。经过一个消色差透镜L2(AC254-30-C-ML,Thorlabs)准直和一个1600nm的长波通滤光片 LPF(1600LPF,Omega Optical)后可以滤掉残余泵浦光。
实验中使用的多光子显微镜系统(MOM,Sutter)包含以下透射式聚焦光学元件组成:扫描透镜SL(AC254-040-C-ML,Thorlabs),管镜TL(93020,Nikon),以及一个安装在电动平台用于轴向扫描的物镜OL。实验中使用的物镜分别是一个0.75NA的空气物镜(RMS40X-PF,Olympus),一个1.05NA的水浸物镜 (XLPLN25XWMP2-SP1700,Olympus),它们都可以矫正成像中由玻片产生的像差,实验时确保光斑完全填充。两个孤子激发样品产生的三次谐波信号同时由两个通道收集:通道1使用一个镓砷磷光电倍增管PMT1(H7422p-50,Hamamatsu)收集信号,通道2使用一个多碱光电倍增管PMT2(H10515B-20, Hamamatsu)收集信号。为了测量显微镜的轴向色差,本发明实施例中对样品中盖玻片与水的界面成像,对线偏振方向不敏感。对平面进行三次谐波成像时,激发光的焦平面对应三次谐波信号的最大值,因此三次谐波信号最大值的轴向位置即对应于激发光的焦平面。
实验中,使用的最短的波长的激发光为1620nm,可以用一个1600nm长波通滤光片从泵浦光中滤出来。当将泵浦光的偏振态沿着固定偏振态的大模场光纤主轴传播时,此时两个孤子的分离量最大(此时最长波长为1890nm,数据没有给出)为270nm(270nm=1890nm-1620nm)。将其中一波长固定在1620nm,调谐输入激光的偏振态和功率,可以持续调谐两个孤子间的分离量。实验中使用了4对双色孤子,分别是,1620-1870nm,1620-1820nm,1620-1770nm, 1620-1720nm,使其中一波长固定在1620nm作为测量轴向色差中的“0”刻度。光谱测量结果如图3a所述。由于收集信号时,没有适合的滤光片将1620-1670nm 的三次谐波信号分开,实验中将最后一对双色孤子定为1670-1870nm,如图3a。实验中收集1620nm三次谐波信号所使用的滤光片是535/50带通滤光片 (HQ535/50M-2P,Chroma),1720-nm、1770-nm、1820-nm和1870-nm波长使用的是605/70带通滤光片(ET605/70M-2P,Chroma),1670nm波长使用的是 540/80带通滤光片(FF01-540/80-25,Semrock)。
尽管两个孤子是同时存在的,但由于它们正交偏振的特性,可以很容易将它们分别开来单独测量其中一个波长的脉冲参量。实验中,用一个线偏振片将双色孤子分开测量其自相关迹(如图3b)和功率。孤子脉宽和功率如表一所示。
表一.孤子脉冲参量
接下来,对样品中的盖玻片与水的界面成像来测量显微镜的轴向色差。空气物镜和水浸物镜三次谐波信号沿轴向的分布分别如图4a和4b所示。为获得三次谐波信号的轴向最大值,也就是每个波长激发脉冲的焦平面,实验中,对三次谐波信号进行了高斯拟合处理,如图4所示。在本实施例中,实验中测量的双色孤子的三次谐波信号是同时单向(从上而下)扫描获得的,双色孤子同时激发样品,并由两个光电倍增管同时收集信号。所以与用单个波长激发并重复扫描确认焦平面的方法相比,该自参考测量装置只需要知道两个孤子三次谐波信号的轴向相对位置。因此,将1620nm激发样品产生的三次谐波信号的轴向最大值即其轴向焦平面zf定为“0”,“—”定为焦平面上方。表二中,列出了所有孤子的轴向焦平面。
表二、所有孤子的轴向焦平面zf
从图4可以清楚的看到用空气物镜和水浸物镜成像时存在轴向色差,即不同波长孤子的焦平面位于不同轴向位置。对轴向色差进行计算,具体结果如表二所示。当激发光波长红移时,对应的焦平面会朝物镜的前方向上移。通过波长范围横跨250nm(1620nm到1870nm)的测量结果,使用空气物镜时,两个波长对的最大轴向色差为3.73μm(zf,1620-zf,1870),水浸物镜是1.87μm(zf,1620-zf,1870)。从这些测量结果,认为在整个多光子显微镜中高数值物镜对轴向色差有主导性作用。采用该自参考测量装置,可以成功的测量多光子显微镜的轴向色差。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种多光子显微镜中轴向色差的自参考测量装置,其特征在于,包括激发单元、第一光路调整单元、孤子产生单元、第二光路调整单元、多光子显微镜单元和信号收集单元:
所述激发单元,用于产生预置波长的泵浦光,并将所述泵浦光射入所述第一光路调整单元;
所述第一光路调整单元,用于对所述泵浦光进行偏振态调整,并按照预置角度将偏振态调整后的泵浦光射入所述孤子产生单元;
所述孤子产生单元,用于根据入射的泵浦光产生激光脉冲,并将所述激光脉冲射入所述第二光路调整单元,所述激光脉冲包括宽度可调谐、波长可调谐且正交偏振的第一孤子和第二孤子;
所述第二光路调整单元,用于对所述激光脉冲进行消色差和滤波处理,并按照预置角度将处理后的激光脉冲射入所述多光子显微镜单元;
所述多光子显微镜单元,用于根据入射的激光脉冲对样品进行成像,根据成像信号进行轴向色差的测量,并收集所述第一孤子和第二孤子激发所述样品产生的谐波信号,将所述谐波信号发送给所述信号收集单元;
所述信号收集单元,用于收集所述谐波信号,用以确定所述谐波信号中每个波长的焦平面位置。
2.如权利要求1所述的自参考测量装置,其特征在于,所述激发单元为波长1550nm、500-fs、线偏振输出的光纤激光器。
3.如权利要求1所述的自参考测量装置,其特征在于,所述第一光路调整单元包括第一反射镜、第二反射镜、半波片和第一透镜;
所述泵浦光经所述第一反射镜和第二反射镜反射后,入射至所述半波片;
所述半波片,用于对所述泵浦光进行偏振态调节,将调节偏振态的泵浦光射入所述第一透镜;
所述第一透镜,用于对入射的泵浦光进行聚焦,将聚焦后的泵浦光入射至所述孤子产生单元。
4.如权利要求1所述的自参考测量装置,其特征在于,所述孤子产生单元为大模场光纤。
5.如权利要求1所述的自参考测量装置,其特征在于,所述第二光路调整单元包括第二透镜、滤光片、第三反射镜和XY扫描振镜;
所述第二透镜,用于对入射的激光脉冲进行消色差后准直,将准直后的激光脉冲入射至所述滤光片;
所述滤光片,用于对所述准直后的激光脉冲进行滤波处理,将滤波后的激光脉冲入射至所述第三反射镜;
所述第三反射镜,用于将所述滤波后的激光脉冲反射入所述XY扫描振镜;
所述XY扫描振镜,用于控制所述滤波后的激光脉冲的光斑,以使光斑在X和Y方向上移动,并将控制后的激光脉冲入射至所述多光子显微镜单元。
6.如权利要求5所述的自参考测量装置,其特征在于,所述滤光片为1600nm的长波通滤光片。
7.如权利要求1所述的自参考测量装置,其特征在于,所述多光子显微镜单元包括扫描透镜、管镜、第四反射镜、双色片和物镜;
所述扫描透镜,用于对入射的激光脉冲进行聚焦,将聚焦后的激光脉冲入射到所述管镜;
所述管镜,用于对所述聚焦后的激光脉冲进行准直,将准直后的激光脉冲入射到所述第四反射镜;
所述第四反射镜,用于将所述准直后的激光脉冲反射入所述双色片;
所述双色片,用于将所述准直后的激光脉冲入射至所述物镜;
所述物镜,安装在电动平台上,用于将所述准直后的激光脉冲照射到所述样品,并收集所述样品受所述准直后的激光脉冲激发产生的谐波信号,并消除所述谐波信号中所述样品的玻片产生的像差,将消除像差后的谐波信号入射至所述双色片;
所述双色片,还用于在所述消除像差后的谐波信号中滤出所需的谐波信号,将滤出的谐波信号入射至所述信号收集单元。
8.如权利要求7所述的自参考测量装置,其特征在于,所述物镜包括空气物镜和水浸物镜。
9.如权利要求1所述的自参考测量装置,其特征在于,所述信号收集单元包括第一光电倍增管、第二光电倍增管、第一带通滤光片和第二带通滤光片;
所述第一带通滤光片,用于滤出所述第一孤子的三次谐波信号,并将所述第一孤子的三次谐波信号入射至所述第一光电倍增管;
所述第一光电倍增管,用于收集所述第一孤子的三次谐波信号;
所述第二带通滤光片,用于滤出所述第二孤子的三次谐波信号,并将所述第二孤子的三次谐波信号入射至所述第二光电倍增管;
所述第二光电倍增管,用于收集所述第二孤子的三次谐波信号。
10.如权利要求9所述的自参考测量装置,其特征在于,所述第一光电倍增管为镓砷磷光电倍增管,所述第二光电倍增管为多碱光电倍增管。
Priority Applications (1)
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- 2018-03-26 CN CN201810252271.4A patent/CN108469412A/zh active Pending
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