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CN112111006B - 抗牛结节性皮肤病病毒的抗体、检测试纸及试剂盒 - Google Patents

抗牛结节性皮肤病病毒的抗体、检测试纸及试剂盒 Download PDF

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CN112111006B CN202010962112.0A CN202010962112A CN112111006B CN 112111006 B CN112111006 B CN 112111006B CN 202010962112 A CN202010962112 A CN 202010962112A CN 112111006 B CN112111006 B CN 112111006B
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Abstract

本发明涉及特异性结合牛结节性皮肤病病毒(Lumpy skin disease，LSD)的抗体或其活性片段、包括所述抗体的胶体金免疫层析检测试纸或试剂盒及其制备方法和应用。本发明的检测试纸或试剂盒生产方便，效果稳定，无非特异反应，包被量低，有利于大批量生产。本发明所提供的牛结节性皮肤病病毒的检测方法操作简便，重现性好，在LSD的现场快检领域实现了突破，丰富了现有的LSD检测方法。

Description

抗牛结节性皮肤病病毒的抗体、检测试纸及试剂盒
技术领域
本发明涉及免疫领域，具体涉及抗牛结节性皮肤病病毒的抗体以及检测牛结节性皮肤病病毒的检测试纸及试剂盒。
背景技术
牛结节性皮肤病(Lumpy skin disease，LSD)，是由牛结节性皮肤病病毒(LSDV)引起的一种牛的急性、亚急性接触性传染病，该病发病率在5％至45％之间，病死率最高可达10％。LSDV属于痘病毒科脊椎动物痘病毒亚科山羊痘病毒属，与绵羊痘病毒和山羊痘病毒的基因组的同源性高达96％。该病是世界动物卫生组织(英语：World Organization forAnimal Health；法语：Office international desépizooties,OIE)的通报性疾病(OIE2014年版名录)，是《中华人民共和国进境动物检疫疫病名录》确定的一类传染病，该病的发生可以引起产奶量暂时性下降，引起公牛暂时或永久性不育，损坏皮张，甚至因为继发细菌感染而导致动物死亡，在世界范围内已造成巨大的经济损失。LSD于2019至2020年间传入我国多个省区，给当地造成巨大的经济损失，同时也给我国的防控工作带来一定的压力，快速有效的防控、检测、鉴别牛结节性皮肤病病毒是当前的工作重点。
目前，牛结节性皮肤病(Lumpy skin disease，LSD)的检测方法主要有分离培养鉴定法、聚合酶链式反应(PCR)法和荧光定量PCR(FQ-PCR)法，免疫荧光、琼脂免疫扩散、酶联免疫吸附试验(ELISA)等。由于分离培养鉴定法操作繁琐、费时，PCR法和FQ-PCR及其他上述方法需要昂贵的仪器和试剂，检测成本高，不适合基层单位实验室和现场检测应用。
发明内容
本发明的第一目的在于提供特异性结合牛结节性皮肤病病毒的抗体或其活性片段。
具体而言，本发明提供的抗体或活性片段可以与牛结节性皮肤病病毒中的核心蛋白P32特异性结合。本发明通过分析比对LSDV毒株和疫苗株氨基酸序列，发现P32蛋白的氨基酸序列相对保守，且具有较好的免疫原性，所以选择P32蛋白作为靶标检测LSD。所述抗体或活性片段包含至少一个重链可变区和至少一个轻链可变区；其中：
所述重链可变区具有SEQ ID NO:1所示的CDR1，SEQ ID NO:2所示的CDR2和/或SEQID NO:3所示的CDR3；或者，所述重链可变区具有SEQ ID NO:7所示的CDR1，SEQ ID NO:8所示的CDR2和/或SEQ ID NO:9所示的CDR3；
所述轻链可变区具有SEQ ID NO:4所示的CDR1，SEQ ID NO:5所示的CDR2和/或SEQID NO:6所示的CDR3；或者，所述轻链可变区具有SEQ ID NO:10所示的CDR1，SEQ ID NO:11所示的CDR2和/或SEQ ID NO:12所示的CDR3。
作为本发明的一种优选方案，所述抗体中，重链可变区具有SEQ ID NO:1所示的CDR1，SEQ ID NO:2所示的CDR2和/或SEQ ID NO:3所示的CDR3；所述轻链可变区具有SEQ IDNO:4所示的CDR1，SEQ ID NO:5所示的CDR2和/或SEQ ID NO:6所示的CDR3。
作为本发明的一种优选方案，所述抗体中，所述重链可变区具有SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列，或SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰获得的保守性变异体；所述轻链可变区具有SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列，或SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列经一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰获得的保守性变异体。
作为本发明的一种优选方案，所述抗体中，所述重链可变区具有SEQ ID NO:7所示的CDR1，SEQ ID NO:8所示的CDR2和/或SEQ ID NO:9所示的CDR3；所述轻链可变区具有SEQID NO:10所示的CDR1，SEQ ID NO:11所示的CDR2和/或SEQ ID NO:12所示的CDR3。
作为本发明的一种优选方案，所述抗体中，所述重链可变区具有SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列，或SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰获得的保守性变异体；所述轻链可变区具有SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列，或SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列经一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰获得的保守性变异体。
作为本发明的一种优选方案，所述抗体或活性片段为单克隆抗体和/或基因工程抗体；所述基因工程抗体选自单链抗体、单链抗体片段、嵌合单克隆抗体、嵌合单克隆抗体片段、改形单克隆抗体、改形单克隆抗体片段中的一种。
本发明的第二目的是保护编码SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:16所示氨基酸序列或所述抗体或活性片段的核苷酸序列。
在本发明中，SEQ ID NO:17所示的核苷酸序列编码SEQ ID NO:13所示氨基酸序列；SEQ ID NO:18所示的核苷酸序列编码SEQ ID NO:14所示氨基酸序列；SEQ ID NO:19所示的核苷酸序列编码SEQ ID NO:15所示氨基酸序列；SEQ ID NO:20所示的核苷酸序列编码SEQ ID NO:16所示氨基酸序列。
本发明的第三目的是保护检测牛结节性皮肤病病毒的免疫检测试纸或内部装配所述试纸的试剂盒，所述试纸上含有本发明提供的所述的抗体或活性片段。本发明优选所述试纸为胶体金免疫层析检测试纸。
作为本发明的优选方案，所述试纸包含结合垫、检测线(T线)和控制线(C线)；所述结合垫上包被有本发明所述抗体或活性片段与胶体金的偶联物，所述检测线上包被有本发明所述抗体或活性片段，所述控制线上包被有羊抗鼠IgG抗体。
其中，与胶体金偶联的包被于所述结合垫上的抗体或活性片段中，重链可变区具有SEQ ID NO:1所示的CDR1，SEQ ID NO:2所示的CDR2和/或SEQ ID NO:3所示的CDR3；轻链可变区具有SEQ ID NO:4所示的CDR1，SEQ ID NO:5所示的CDR2和/或SEQ ID NO:6所示的CDR3。优选地，与胶体金偶联的包被于所述结合垫上的抗体或活性片段中，重链可变区具有SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列，或SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰获得的保守性变异体；轻链可变区具有SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列，或SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列经一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰获得的保守性变异体。
其中，包被于所述检测线上的抗体或活性片段中，重链可变区具有SEQ ID NO:7所示的CDR1，SEQ ID NO:8所示的CDR2和/或SEQ ID NO:9所示的CDR3；轻链可变区具有SEQ IDNO:10所示的CDR1，SEQ ID NO:11所示的CDR2和/或SEQ ID NO:12所示的CDR3。优选地，包被于所述检测线上的抗体或活性片段中，重链可变区具有SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列，或SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰获得的保守性变异体；轻链可变区具有SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列，或SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列经一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰获得的保守性变异体。
作为本发明的优选方案，所述胶体金免疫层析检测试纸采用包括如下步骤的方法制备而成：
将本发明提供的抗体或活性片段与胶体金偶联后所得的溶液，喷于结合垫上；将本发明提供的抗体用包被缓冲液溶解后，包被于硝酸纤维素膜的T线上；将抗小鼠的IgG抗体用包被缓冲液溶解后，包被于硝酸纤维素膜的C线上；将所述结合垫以及硝酸纤维素膜组装于背板上，制成大版，裁成裸条，即试纸。
本发明的第四目的是保护本发明提供的抗体或活性片段，或所述试纸或试剂盒在样品中检测牛结节性皮肤病病毒的应用，尤其是检测牛结节性皮肤病病毒中蛋白P32的应用。优选地，所述样品为牛的唾液、结节区组织液或血液。
本发明的第五目的是保护利用本发明提供的抗体或活性片段，或所述试纸或试剂盒检测样品中牛结节性皮肤病病毒的方法，尤其是检测牛结节性皮肤病病毒中蛋白P32的方法。优选地，所述样品为牛的唾液、结节区组织液或血液。
作为本发明的优选方案，所述方法包括以下步骤：将待检样品的溶液滴加到胶体金免疫层析检测试纸上，或滴加到内部装配有所述试纸的试剂盒的加样孔中，静置，观察试纸上的T线和C线的显色情况。
作为本发明的优选方案，如果T线与C线均显红色，则样品中含有浓度大于或等于10ng/ml的牛结节性皮肤病病毒蛋白P32；如果C线为红色，T线不显色，则样品中含有浓度小于10ng/ml的牛结节性皮肤病病毒蛋白P32或不含有牛结节性皮肤病病毒蛋白P32；如果C线不显色，检测试剂失效。
附图说明
图1为用本发明提供的胶体金免疫检测层析试纸检测的结果示意图。
具体实施方式
根据本发明的技术方案，在不改变蛋白的活性或功能的情况下，可以对氨基酸序列中的某些氨基酸进行保守取代，参见下面表1：
表1
残基 保守性替换 残基 保守性替换
Ala Ser Leu Ile；Val
Arg Lys Lys Arg；Gln
Asn Gln；His Met Leu；Ile
Asp Glu Phe Met；Leu；Tyr
Gln Asn Ser Thr；Gly
Cys Ser Thr Ser；Val
Glu Asp Trp Tyr
Gly Pro Tyr Trp；Phe
His Asn；Gln Val Ile；Leu
Ile Leu；Val
此外，因为碱基的简并性，在不改变多核苷酸序列的活性或功能的情况下，可以对多核苷酸序列的碱基进行取代，参见下面表2：
表2
Figure BDA0002680934420000061
Figure BDA0002680934420000071
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1：P32蛋白的原核表达和纯化
本实施例进行P32蛋白的原核表达和纯化，具体步骤如下：
1、从GeneBank中查询LSDV基因组序列，通过比对分析，选取保守的基因LSDV-P32，表达P32蛋白。通过在线软件TMHMM分析P32蛋白氨基酸序列发现在C端有一跨膜区，因跨膜区蛋白不可溶，表达时去掉C端跨膜区，并进行密码子优化。LSDV P32蛋白氨基酸序列如表3所示。
表3：P32蛋白的氨基酸序列
Figure BDA0002680934420000072
2、选取测序正确的pGEX-6P-2-N280质粒，转化到BL21(DE3)感受态细胞中，37℃恒温培养箱培养过夜。挑取单克隆，置100mL2YT培养基中，37℃，200rpm培养过夜。按照1:50转接到2YT培养基中，置37℃，200rpm恒温摇床中。待OD600为0.6时，取5～10mL菌液，将剩余菌中加入终浓度为0.4mM/L的IPTG，置20℃诱导过夜。取5～10mL诱导后的菌液，剩余菌4℃，6000rpm离心20min，加入预冷的结合Buffer，1mM/L的PMSF，冰浴超声破碎。4℃，45000g超速离心1h，收集上清过滤。将上述取出的5～10mL诱导前后的菌进行超声破碎，跑PAGE胶，考染，查看蛋白表达情况。
3、将GE Healthcare Glutathione SepharoseTM 4B用预冷的结合Buffer平衡3次后，与破碎后的蛋白结合。用预冷的Wash Buffer洗蛋白至蛋白快染液不变色(大约15个柱体积)后，加入终浓度为1mM/L的DTT、PreScission蛋白酶，4℃酶切过夜。将酶切后的蛋白留样后，4℃4500rpm离心5min，收集上清，用Wash Buffer清洗介质2～3次，收集所有上清，置20mM Tris-HCl pH8.0的Buffer中透析过夜，过GE Healthcare HiTrapTM Q柱。分别收集各个峰的样品，进行PAGE胶检测，收集28KD的蛋白，并进行浓缩，PBS迭代。加入终浓度为10～15％的甘油，液氮速冻，置-80℃保存。
实施例2：P32蛋白单克隆抗体的制备
将实施例1纯化好的P32蛋白抗原免疫8只8～12周龄雌性Balb/c小鼠，免疫3次后，对小鼠进行眼眶采血，获取小鼠血清，用ELISA检测小鼠血清中P32蛋白抗体滴度，若滴度<10000，则进行加强免疫1～2次，直到抗体滴度>10000。
取抗体滴度>10000的小鼠脾细胞与骨髓瘤SP2/0细胞融合，并通过HAT选择培养基筛选融合细胞，并对融合细胞进行ELISA阳性筛选及亚克隆；筛选出的阳性单克隆，取腹水，用Protein A/G抗体纯化柱纯化抗体，纯化后的抗体ELISA效价>1:128000，纯度>90％。
两株单克隆抗体对应的细胞株编号分别为701和901。
实施例3：P32蛋白单克隆抗体CDR区序列的扩增以及序列测定
复苏杂交瘤细胞株701和901后培养，待细胞长至对数生长期，细胞计数约8×107个/ml时，收集细胞。按照TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit说明书提取杂交瘤细胞总RNA，依表4所示反应体系，置65℃保温5min后，冰上迅速冷却，再按照表5所示的反应体系置42℃60min；70℃15min；25℃1min进行1st-Strand cDNA合成反应。
表4：1st-Strand cDNA合成反应混合液
试剂 使用量
Oligo dT Primer(50μM) 1μL
dNTP Mixture(10mM each) 1μL
模板RNA <5μg
RNase Free dH<sub>2</sub>O Up to 10μL
表5：反转录反应液
试剂 使用量
上述变性后反应液(from step 2) 10μL
5xPrimeScriptⅡbuffer 4μL
RNase Inhibitor 0.5μL(20U)
PrimeScriptⅡRTase(200U/μL) 1μL(200U)
RNase Free dH<sub>2</sub>O Up to 20μL
以cDNA为模板，设计并合成轻链和重链可变区的上下游引物，引物序列如表6所示，PCR扩增轻链、重链可变区核酸序列，经胶回收得到DNA片段，检测回收核酸浓度。参照pMDTM19-T Vector Cloning Kit说明书，将DNA片段克隆至pMDTM19-T载体中，经16℃反应30min后，通过热激转化至TOP10感受态细胞中，经PCR菌落鉴定后，选取阳性菌落进行扩大培养，后按照天根质粒小提试剂盒说明书提取质粒，测定浓度，进行PCR鉴定后，测序。
表6：可变区引物序列
序列号 名称 引物序列(5’-3’)
SEQ ID NO:22 LSDV-P32-VLF GTTAGATCTCCAGCTTGGTCCC
SEQ ID NO:23 LSDV-P32-VLR GACATTCAGCTGACCCAGTCTCCA
SEQ ID NO:24 LSDV-P32-VHVR1 CTCACCATGGRATGSAGCTGKGTMATS
SEQ ID NO:25 LSDV-P32-VHCR2 AYCTCCACACACAGGRRCCAGTGGATAGAC
实施例4：单克隆细胞株701可变区序列
将测序结果在GenBank中进行Blast比对，结果显示该抗体的轻链和重链的可变区序列与提交的小鼠IgG可变区序列的同源性超过96％，确定测序得到的基因序列为小鼠抗体序列。利用IMGT/V-QUEST与ABYSIS软件分析得到抗体轻链和重链可变区的氨基酸序列及CDR区、FR区的划分。结果如下：
表7：单克隆细胞株701抗体测序结果
Figure BDA0002680934420000101
Figure BDA0002680934420000111
实施例5：单克隆细胞株901的可变区序列
将测序结果在GenBank中进行Blast比对，结果显示该抗体的轻链和重链的可变区序列与提交的小鼠IgG可变区序列的同源性超过96％，确定测序得到的基因序列为小鼠抗体序列。利用IMGT/V-QUEST与ABYSIS软件分析得到抗体轻链和重链可变区的氨基酸序列及CDR区、FR区的划分。结果如下：
表8：单克隆细胞株901抗体测序结果
Figure BDA0002680934420000112
Figure BDA0002680934420000121
Figure BDA0002680934420000131
实施例5：胶体金免疫检测层析试剂检测
将从细胞株编号为701对应的小鼠腹水中纯化出的抗体，与粒径40nm的胶体金偶联，溶于复溶液中，使用金标三维划膜喷点仪喷于预处理好的结合垫上；从细胞株编号为901对应腹水中纯化出的抗体，用包被缓冲液溶解后，使用金标三维划膜喷点仪包被于预处理好的硝酸纤维素(NC)膜的TEST线(T线)上；将外购的羊抗鼠IgG抗体，用包被缓冲液溶解后，使用金标三维划膜喷点仪包被于预处理好的硝酸纤维素膜的CONTROL线(C线)上；将喷金处理的结合垫、包被处理的NC膜、预处理的结合垫组装于背板上，制成大版。使用切条机将上一步制作的大版裁成宽度为4mm的裸条，组装于配套的卡壳中，制备成可用于检测P32的胶体金检测试剂。
配制不同浓度的P32样品液(溶剂为pH7.4，0.01M的磷酸盐缓冲液)，移液器分别移取不同浓度的P32样品液80μl，平行滴加于胶体金检测试剂的加样孔，观察10min时，T线和C线的显色情况，如果T线与C线均显红色，为阳性；C线为红色，T线不显色为阴性；C线不显色，检测试剂失效。如图1所示。
经测定，该P32胶体金检测试剂检测限为10ng/ml。
本发明采用原核表达融合GST标签的P32蛋白，大大提高了P32蛋白的表达量，利用谷胱甘肽琼脂糖4B介质富集GST-P32蛋白，后用PSP酶酶切，获得纯度>90％的P32蛋白，免疫小鼠制备了多株抗P32单克隆抗体，对制备的单克隆抗体进行胶体金检测配对，将配对成功的两株单克隆抗体(细胞株编号分别为701和901)，分别用于胶体金标记和包被，建立检测P32的胶体金试纸条检测方法。该方法操作简便、重现性好、在LSD的现场快检领域实现了突破，丰富了现有的LSD检测方法。
虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 北京三安新特生物科技有限公司
<120> 抗牛结节性皮肤病病毒的抗体、检测试纸及试剂盒
<130> RYP2010790.9
<160> 25
<170> PatentIn version 3.5
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Thr Tyr Ala Val His
1 5
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<220>
<223> 701重链可变区的CDR2
<400> 2
Val Ile Trp Ser Gly Gly Arg Thr Asp Tyr Asn Ala Ala Phe Met Cys
1 5 10 15
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<400> 3
Asn Tyr Tyr Gly Gly Ser Leu Asp Tyr
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 701轻链可变区的CDR1
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Arg Ala Ser Asn Ser Val Ser Thr Ser Arg Tyr Ser Tyr Met His
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<220>
<223> 701轻链可变区的CDR2
<400> 5
Leu Val Ser Asn Leu Glu Ser
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<220>
<223> 701轻链可变区的CDR3
<400> 6
Gln His Ile Arg Glu Leu Thr
1 5
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1 5
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<220>
<223> 901重链可变区的CDR2
<400> 8
Val Ile Trp Ile Gly Gly Arg Thr Asp Tyr Asn Ala Ala Phe Ile Ser
1 5 10 15
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Asn Tyr Tyr Gly Gly Ser Phe Asp Tyr
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Arg Asp Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Tyr Met His
1 5 10 15
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Leu Val Ser Asn Leu Glu Ser
1 5
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Gln His Ile Arg Glu Leu Thr
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<220>
<223> 701重链可变区的氨基酸序列
<400> 13
Gln Ser Ala Pro Gly Leu Val Gln Ala Ser Gln Cys Leu Ser Ile Thr
1 5 10 15
Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Thr Tyr Ala Val His Trp Val
20 25 30
Arg Gln Pro Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Gln Gly Val Ile Trp Ser
35 40 45
Gly Gly Arg Thr Asp Tyr Asn Ala Ala Phe Met Cys Arg Leu Ser Ile
50 55 60
Ser Lys Asp Asn Ser Asn Ser Gln Asp Phe Phe Lys Met Asn Ser Leu
65 70 75 80
Gln Ala Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Arg Asn Tyr Tyr Gly
85 90 95
Gly Ser Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
100 105 110
<210> 14
<211> 109
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 701轻链可变区的氨基酸序列
<400> 14
Asp Ile Val Leu Thr Gln Thr Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Ser Arg Ala Ser Asn Ser Val Ser Thr Ser
20 25 30
Arg Tyr Ser Tyr Met His Trp Asn Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Val Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His
65 70 75 80
Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ile Arg
85 90 95
Glu Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
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<220>
<223> 901重链可变区的氨基酸序列
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Gln Val Gln Leu Asn Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Leu Ser Gly Phe Ser Leu Thr Thr Tyr
20 25 30
Ala Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Val Ile Trp Ile Gly Gly Arg Thr Asp Tyr Asn Ala Ala Phe Ile
50 55 60
Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe
65 70 75 80
Glu Met Asn Ser Leu Gln Pro Asn Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Asn Tyr Tyr Gly Gly Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr
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Leu Thr Val Ser
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<223> 901轻链可变区的氨基酸序列
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Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Tyr Arg Asp Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Asn Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Val Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His
65 70 75 80
Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ile Arg
85 90 95
Glu Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 17
<211> 467
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 编码701重链可变区的核苷酸序列
<400> 17
tctcaccatg gctgtcttgg ggctgctctt ctgcctggtg acattcccaa gctgtgtcct 60
atcccaggcg caggtgaatc agtcagcacc aggcctagtg caggcctcac agtgcctgtc 120
catcacctgc acagtctctg gtttctcatt aactacctat gctgtacact gggttcgcca 180
gcctccagga cagggtctgg agtggcaggg agtgatatgg agtggtggaa ggacagacta 240
taatgctgct ttcatgtgca gactgagcat cagcaaggac aactccaaca gccaagattt 300
ctttaaaatg aacagtctac aagctgatga cacagccata tactactgtg ccagaaatta 360
ctacggtggt agccttgact actggggcca aggcaccact ctcacagtct cctcagccaa 420
aacgacaccc ccatctgtct atccactggc ccctgtgtgt ggagata 467
<210> 18
<211> 358
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 编码701轻链可变区的核苷酸序列
<400> 18
tgacattgtg ctcacacaga ctcctgcttc cttagctgta tctctggggc agagggccac 60
gatctcatcc agggccagca atagtgtcag tacatctcgc tatagttata tgcactggaa 120
ccaacagaaa ccaggacagc cacccagact cctcatctat cttgtatcca acctagaatc 180
tggggtccct gccaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcaccc tcaacatcca 240
tcctgtggag gaggaggatg ctgcaaccta ttactgtcag cacattaggg agcttacacg 300
ttcggagggg ggaccaagct ggaaataaaa cgggctgatg ctgcaccaac tgtatcca 358
<210> 19
<211> 467
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 编码901重链可变区的核苷酸序列
<400> 19
tctcaccatg gctgtcttgg ggctgctctt ctgcctggtg acattcccaa gctgtgtcct 60
ctcccaggtg cagctgaacc agtcaggtcc tggcctagtg cagccctcac agagcctgtc 120
catcacctgc acactctctg gtttctcctt aactacctat gctgtacact gggttcgcca 180
gtctccagga aagggtctgg agtggctggg agtgatttgg attggtggac gcacagacta 240
taatgcagct ttcatatcca gactgagcat cagcaaggac aattccaaga gccaagtttt 300
ctttgaaatg aacagtctgc aacctaatga cacagccata tattactgtg ccagaaatta 360
ctacggtggt agctttgact actggggcca aggcaccact ctcacagtct cctcagccaa 420
aacgacaccc ccatctgtct atccactggc ccctgtgtgt ggagata 467
<210> 20
<211> 358
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 编码901轻链可变区的核苷酸序列
<400> 20
tgacattgtg ctgacccagt ctcctgcttc cttagctgta tctctggggc agagggccac 60
catctcatac agggacagca aaagtgtcag tacatctggc tatagttata tgcactggaa 120
ccaacagaaa ccaggacagc cacccagact cctcatctat cttgtgtcca acctagaatc 180
tggggtccct gccaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcaccc tcaacatcca 240
tcctgtggag gaggaggatg ctgcaaccta ttactgtcag cacattaggg agcttacacg 300
ttcggagggg ggaccaagct ggaaataaaa cgggctgatg ctgcaccaac tgtatcca 358
<210> 21
<211> 280
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> P32蛋白
<400> 21
Met Ala Asp Ile Pro Leu Tyr Val Ile Pro Ile Val Gly Arg Glu Ile
1 5 10 15
Ser Asp Val Val Pro Glu Leu Lys Ser Asp Asn Asp Ile Phe Tyr Lys
20 25 30
Lys Val Asp Thr Val Lys Asp Phe Lys Asn Ser Asp Val Asn Phe Phe
35 40 45
Phe Lys Asp Lys Lys Asp Ile Ser Leu Ser Tyr Lys Phe Leu Ile Trp
50 55 60
Glu Lys Val Glu Lys Ser Gly Gly Val Glu Asn Phe Thr Glu Tyr Phe
65 70 75 80
Ser Gly Leu Cys Asn Ala Leu Cys Thr Lys Glu Ala Lys Ser Ser Ile
85 90 95
Val Lys His Phe Ser Leu Trp Lys Ser Tyr Ala Asp Ala Asp Ile Lys
100 105 110
Asn Ser Glu Asn Lys Phe Ile Val Val Ile Glu Asp Asp Asn Thr Leu
115 120 125
Lys Asp Leu Ile Thr Ile His Asn Ile Ile Ile Glu Met Gln Glu Lys
130 135 140
Asn Ile Asp Ile Phe Gln Leu Arg Glu Thr Phe His Asn Ser Asn Ser
145 150 155 160
Arg Ile Leu Phe Asn Gln Glu Asn Asn Asn Phe Met Tyr Ser Tyr Thr
165 170 175
Gly Gly Tyr Asp Phe Thr Leu Ser Ala Tyr Val Ile Arg Leu Ser Ser
180 185 190
Ala Ile Lys Ile Ile Asn Glu Ile Ile Lys Asn Lys Gly Ile Ser Thr
195 200 205
Ser Leu Ser Phe Glu Met Tyr Lys Leu Glu Lys Glu Leu Lys Leu Asn
210 215 220
Arg Gln Val Leu Asn Asp Ser Ser Lys Tyr Ile Leu His Asn Thr Lys
225 230 235 240
Tyr Leu Ser Lys Lys Arg Ala Asn Glu Met Lys Asn Gly Ile Trp Asn
245 250 255
Arg Val Gly Lys Trp Met Ala His Arg Phe Pro Asp Phe Ser Tyr Tyr
260 265 270
Ile Ser His Pro Leu Val Ser Phe
275 280
<210> 22
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> LSDV-P32-VLF
<400> 22
gttagatctc cagcttggtc cc 22
<210> 23
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> LSDV-P32-VLR
<400> 23
gacattcagc tgacccagtc tcca 24
<210> 24
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> LSDV-P32-VHVR1
<400> 24
ctcaccatgg ratgsagctg kgtmats 27
<210> 25
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> LSDV-P32-VHCR2
<400> 25
ayctccacac acaggrrcca gtggatagac 30

Claims (17)

1.特异性结合牛结节性皮肤病病毒的抗体或其活性片段，其特征在于，所述抗体或活性片段包含如下的重链可变区和轻链可变区；
所述重链可变区具有SEQ ID NO:1所示的CDR1，SEQ ID NO:2所示的CDR2和SEQ ID NO:3所示的CDR3，所述轻链可变区具有SEQ ID NO:4所示的CDR1，SEQ ID NO:5所示的CDR2和SEQ ID NO:6所示的CDR3；或者
所述重链可变区具有SEQ ID NO:7所示的CDR1，SEQ ID NO:8所示的CDR2和SEQ ID NO:9所示的CDR3，所述轻链可变区具有SEQ ID NO:10所示的CDR1，SEQ ID NO:11所示的CDR2和SEQ ID NO:12所示的CDR3。
2.根据权利要求1所述的抗体或其活性片段，其特征在于，所述重链可变区具有SEQ IDNO:1所示的CDR1，SEQ ID NO:2所示的CDR2和SEQ ID NO:3所示的CDR3；
所述轻链可变区具有SEQ ID NO:4所示的CDR1，SEQ ID NO:5所示的CDR2和SEQ ID NO:6所示的CDR3。
3.根据权利要求2所述的抗体或其活性片段，其特征在于，
所述重链可变区具有SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列；
所述轻链可变区具有SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列。
4.根据权利要求1所述的抗体或其活性片段，其特征在于，所述重链可变区具有SEQ IDNO:7所示的CDR1，SEQ ID NO:8所示的CDR2和SEQ ID NO:9所示的CDR3；
所述轻链可变区具有SEQ ID NO:10所示的CDR1，SEQ ID NO:11所示的CDR2和SEQ IDNO:12所示的CDR3。
5.根据权利要求4所述的抗体或其活性片段，其特征在于，
所述重链可变区具有SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列；
所述轻链可变区具有SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列。
6.根据权利要求1~5任意一项所述的抗体或活性片段，其特征在于，所述抗体或活性片段为单克隆抗体或基因工程抗体；所述基因工程抗体选自单链抗体、单链抗体片段、嵌合单克隆抗体、嵌合单克隆抗体片段、改形单克隆抗体、改形单克隆抗体片段中的一种。
7.编码权利要求1~6任意一项所述抗体或活性片段的核酸分子。
8.牛结节性皮肤病病毒的免疫检测试纸或内部装配所述试纸的试剂盒，其特征在于，所述试纸上含有权利要求1~6任意一项所述的抗体或活性片段。
9.根据权利要求8所述的试纸或试剂盒，其特征在于，所述试纸为胶体金免疫层析检测试纸。
10.根据权利要求8所述的试纸或试剂盒，其特征在于，所述试纸包含结合垫、检测线和控制线；所述结合垫上包被有所述抗体或活性片段与胶体金的偶联物，所述检测线上包被有所述抗体或活性片段，所述控制线上包被有羊抗鼠IgG抗体；
其中，与胶体金偶联的包被于所述结合垫上的抗体或活性片段的重链可变区具有SEQID NO:1所示的CDR1，SEQ ID NO:2所示的CDR2和SEQ ID NO:3所示的CDR3，且轻链可变区具有SEQ ID NO:4所示的CDR1，SEQ ID NO:5所示的CDR2和SEQ ID NO:6所示的CDR3。
11.根据权利要求10所述的试纸或试剂盒，其特征在于，重链可变区具有SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列，且轻链可变区具有SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列。
12.根据权利要求10所述的试纸或试剂盒，其特征在于，包被于所述检测线上的抗体或活性片段的重链可变区具有SEQ ID NO:7所示的CDR1，SEQ ID NO:8所示的CDR2和SEQ IDNO:9所示的CDR3，且轻链可变区具有SEQ ID NO:10所示的CDR1，SEQ ID NO:11所示的CDR2和SEQ ID NO:12所示的CDR3。
13.根据权利要求12所述的试纸或试剂盒，其特征在于，重链可变区具有SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列，且轻链可变区具有SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列。
14.根据权利要求8所述的试纸或试剂盒，其特征在于，采用包括如下步骤的方法制备而成：
将权利要求2或3所述的抗体或活性片段与胶体金偶联后所得的溶液，喷于结合垫上；将权利要求4或5所述的抗体或活性片段用包被缓冲液溶解后，包被于硝酸纤维素膜的检测线上；将抗小鼠的IgG抗体用包被缓冲液溶解后，包被于硝酸纤维素膜的控制线上；将所述结合垫以及硝酸纤维素膜组装于背板上，将所得的大版裁成裸条，即试纸。
15.权利要求1~6任意一项的抗体或活性片段在制备用于检测在样品中的牛结节性皮肤病病毒的试纸或试剂盒中的应用。
16.根据权利要求15所述的应用，其特征在于，所述样品为牛的唾液、结节区组织液或血液。
17.根据权利要求15所述的应用，其特征在于，所述检测的方法包括以下步骤：将待检样品的溶液滴加到胶体金免疫层析检测试纸上，或滴加到内部装配有所述试纸的试剂盒的加样孔中，静置，观察试纸上的T线和C线的显色情况；
如果检测线与控制线均显红色，则样品中含有浓度大于或等于10 ng/ml的牛结节性皮肤病病毒蛋白P32；如果控制线为红色，检测线不显色，则样品中含有浓度小于10 ng/ml的牛结节性皮肤病病毒蛋白P32或不含有牛结节性皮肤病病毒蛋白P32；如果控制线不显色，检测试剂失效。
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