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CN111961731A - 基于CpG的猪肉色性状全基因组甲基化位点的定位方法 - Google Patents

基于CpG的猪肉色性状全基因组甲基化位点的定位方法 Download PDF

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CN111961731A
CN111961731A CN202010653633.8A CN202010653633A CN111961731A CN 111961731 A CN111961731 A CN 111961731A CN 202010653633 A CN202010653633 A CN 202010653633A CN 111961731 A CN111961731 A CN 111961731A
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唐国庆
王凯
吴平先
周洁
陈德娟
杨喜堤
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Sichuan Agricultural University
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Abstract

本发明公开了本发明公开一种基于CpG的猪肉色性状全基因组甲基化位点的定位方法，该甲基化位点基于国际猪参考基因组11.1版本参考序列12号染色体上，该位点上呈高甲基化水平。本发明提供的CpG甲基化位点与大白猪的肉色性状黄度值显著相关，因此可以通过鉴定该位点CpG甲基化来筛选肉色稳定性良好的大白猪，进而得到肉质良好的商品猪肉，因而具有重要的经济效益和社会价值。

Description

基于CpG的猪肉色性状全基因组甲基化位点的定位方法
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，特别是涉及一种基于CpG的猪肉色性状全基因组甲基化位点的定位方法。
背景技术
养猪业的目的是满足人们不断增长的对猪肉及其制品的消费需求，这既包括对其量的需求，也包括对其质的需求。在猪的遗传育种过程中，猪的生产性能一直是主要的育种目标，并且已经取得了显著的成果。然而近年来，随着我国规模化养猪业的发展和人们生活水平的提升，消费者对高品质的猪肉的需求越来越迫切，猪肉的品质也越发引起人们的重视。肉色是肉质性状中最重要的测量指标之一，是肌肉的生理学、生物化学和微生物学变化的外部表现，也是衡量猪肉质量的一个重要的经济指标。当前研究肉色性状常用的方法是通过分子标记以及全基因组关联分析挖掘与肉色性状关联的SNP位点和候选基因，然而，肉色性状受多种因素影响，表观遗传变异也是影响性状的一个重要因素。因此通过开发和利用新的方法来改良猪肉品质意义重大。
大白猪以生长速度快、瘦肉率高的特点而被作为生猪产业中主要的引进品种，但是其猪肉品质与中国地方猪相比较差，这会对养殖产业造成巨大的经济损失。因此，在保证生长性能的基础上改善大白猪猪肉品质，提高肉色稳定性对猪产业有重要意义。然而，猪的肉质性状与生长性状大多呈负的遗传相关，通过分子标记和候选基因的方法有着一定的局限性，因此，通过表观遗传学的方法挖掘影响表型性状的DNA甲基化位点是一种新颖有效的方法。
表观遗传学是研究基因表达发生了可遗传的改变，而DNA序列不发生改变的一门生物学分支。表观遗传主要通过基因修饰、蛋白质相互之间、蛋白质与其它分子之间的相互作用的方式改变染色质的结构，从而调控基因的功能和特性，并且能够通过细胞的分裂和增殖传递给下一代。DNA甲基化是最常见、最早被发现、研究最多和最为深入的一种表观修饰方式。在猪的表观遗传学的相关研究很多，但大多数研究集中在差异甲基化分析和非编码RNA上，很少有研究利用全基因技术来进行表观遗传变异与性状之间的关联分析，进而深入揭示表型性状与表观遗传变异间的关系。
发明内容
针对上述问题，本发明提供了一种基于CpG的猪肉色性状全基因组甲基化位点的定位方法，得到的CpG甲基化位点与大白猪的肉色性状黄度值显著相关，具有鉴定准确、可靠性高的优点。
本发明的技术方案是：
一种基于CpG的猪肉色性状全基因组甲基化位点的定位方法，包括以下步骤：
S1、选择实验猪；
S2、校正实验猪的肉色性状表型数据；
S3、采集实验猪的肌肉组织样品，提取基因组DNA；
S4、对提取的基因组DNA进行质量和浓度检测，选择质量合格的基因组DNA进行简化代表性甲基化测序，提取CpG位点甲基化水平信息；
S5、采用R软件CpGassoc包对校正后的实验猪的表型性状和全基因组CpG位点甲基化水平进行关联分析，其分析模型为：y＝Xm+An+e，其中，y表示矫正后的表型性状向量；m表示CpG位点甲基化程度；n表示剩余CpG位点甲基化程度；e表示残差效应向量；X和A分别表示m和a的关联矩阵；
S6、采用Bonferroni校正法控制多重检验对关联分析结果进行校正，将显著性阈值确定为P＜7.79e-8，绘制关联分析Manhattan图，由Manhattan图显示与肉色性状显著相关的关键位点。
在进一步的技术方案中，步骤S2中，校正实验猪的肉色性状表型数据，建立的回归模型如下：Y＝parity+year+month+gender+weight+Farm+e，其中，Y为肉色形状；parity为胎次；year为年度；month为月度；gender为性别；weight为屠宰重；Farm为场次；e为残差。
在进一步的技术方案中，步骤S3中，提取基因组DNA的方法如下：
S31、取黄豆大小组织样，尽量剪碎放入离心管中，加入裂解液及蛋白酶K；
S32、样品置于55℃恒温箱中孵育，至管中无组织块为止；
S33、加入Tris饱和酚，轻微混匀10min，4℃、12000r/min离心12min；
S34、取上清液加入质量比为25：24：1的Tris饱和酚、氯仿和异戊醇，混摇10min，4℃、12000r/min离心12min；
S35、再取上清液，加入氯仿，混摇10min，4℃、12000r/min离心12min；
S36、再取上清液，加无水乙醇和3M乙酸钠，混摇6min，4℃、1000r/min离心8min；
S37、去除上清液，留DNA沉淀团，加入75％乙醇，混5min，4℃、1000r/min离心5min；
S38、将离心管放入通风橱，吹干至管内无小滴；
S39、样品加超纯水，轻微吹打至DNA溶解，经过分光光度计检测质量与浓度后，将浓度统一稀释到50ng/μL，于-20℃下保存备用。
在进一步的技术方案中，步骤S4中，对提取的基因组DNA进行质量和浓度检测的方法如下：
S41、采用Nanodrop-2000检测各基因组DNA浓度和OD值，选取浓度大于等于50ng/μL，OD260/OD280＝1.8-2.0的基因组DNA样品；
S42、对上述样品利用1.0％的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性，选择DNA条带单一、主条带明显的基因组DNA为合格样品，置于-80℃冰箱保存待用。
在进一步的技术方案中，步骤S4中，对质量合格的基因组DNA进行简化代表性甲基化测序的方法如下：对质量和浓度检测后的实验猪的DNA构建文库，然后进行简化代表性甲基化测序，利用Bismrak软件将测序数据比对到国际猪基因组11.2版本参考序列上，然后提取CpG位点甲基化水平信息。
本发明的有益效果是：本发明通过表观遗传学的方法挖掘影响表型性状的DNA甲基化位点，得到的CpG甲基化位点与大白猪的肉色性状黄度值显著相关，具有鉴定准确、可靠性高的优点，可以通过鉴定该位点CpG甲基化来筛选肉色稳定性良好的大白猪，进而得到肉质良好的商品猪肉，因而具有重要的经济效益和社会价值。
附图说明
图1是本发明实施例所述基因组DNA的电泳图；
图2是本发明实施例所述猪基因组上影响肉色性状的Manhattan图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的实施例作进一步说明。
实施例：
一种基于CpG的猪肉色性状全基因组甲基化位点的定位方法，包括以下步骤：
S1、选择实验猪140头；
S2、校正140头实验猪的肉色性状表型数据；
S3、采集实验猪的肌肉组织样品，提取基因组DNA，图1为基因组DNA的电泳图；
S4、对提取的基因组DNA进行质量和浓度检测，选择质量合格的基因组DNA进行简化代表性甲基化测序，提取CpG位点甲基化水平信息；
S5、采用R软件CpGassoc包对校正后的实验猪的表型性状和全基因组CpG位点甲基化水平进行关联分析，其分析模型为：y＝Xm+An+e，其中，y表示矫正后的表型性状向量；m表示CpG位点甲基化程度；n表示剩余CpG位点甲基化程度；e表示残差效应向量；X和A分别表示m和a的关联矩阵；
S6、采用Bonferroni校正法控制多重检验对关联分析结果进行校正，将显著性阈值确定为P＜7.79e-8，绘制关联分析Manhattan图，由Manhattan图显示与肉色性状显著相关的关键位点，如图2所示，结果显示12号染色体存在显著与肉色性状显著相关的关键位点，该位点位于国际猪基因组11.2版本参考序列12号染色体上(cpg2272837-chr12:36261646)。
在进一步的技术方案中，步骤S2中，校正140头实验猪的肉色性状表型数据，建立的回归模型如下：Y＝parity+year+month+gender+weight+Farm+e，其中，Y为肉色形状；parity为胎次；year为年度；month为月度；gender为性别；weight为屠宰重；Farm为场次；e为残差。
在进一步的技术方案中，步骤S3中，提取基因组DNA的方法如下：
S31、采集140头猪的肌肉组织样品，放置于装有75％乙醇的离心管中，-20℃冰箱保存备用，取黄豆大小组织样，尽量剪碎放入2mL离心管中，加入裂解液800μL及蛋白酶K30μL(20mg/mL)；
S32、样品置于55℃恒温箱中孵育，至管中无组织块为止；
S33、加入Tris饱和酚800μL，轻微混匀10min，4℃、12000r/min离心12min；
S34、取650μL上清液加入Tris饱和酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)800μL，混摇10min，4℃、12000r/min离心12min；
S35、再取上清液550μL，加入氯仿800μL，混摇10min，4℃、12000r/min离心12min；
以下步骤换1.5mL的离心管。
S36、再取上清液450μL，加无水乙醇800μL和3M乙酸钠40μL，混摇6min，4℃、1000r/min离心8min；
S37、去除出上清液，留DNA沉淀团，加入1000μL75％乙醇，混5min，4℃、1000r/min离心5min；
S38、将离心管放入通风橱，吹干至管内无小滴；
S39、样品加100μL超纯水，轻微吹打至DNA溶解，经过Nanodrop-100分光光度计检测质量与浓度后，将浓度统一稀释到50ng/μL，于-20℃下保存备用。
在进一步的技术方案中，步骤S4中，对提取的基因组DNA进行质量和浓度检测的方法如下：
S41、采用Nanodrop-2000检测各基因组DNA浓度和OD值，选取浓度大于等于50ng/μL，OD260/OD280＝1.8-2.0的基因组DNA样品；
S42、对上述样品利用1.0％的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性，选择DNA条带单一、主条带明显的基因组DNA为合格样品，置于-80℃冰箱保存待用。
在进一步的技术方案中，步骤S4中，对质量合格的基因组DNA进行简化代表性甲基化测序的方法如下：对质量和浓度检测后的实验猪的DNA构建文库，然后进行简化代表性甲基化测序，利用Bismrak软件将测序数据比对到国际猪基因组11.2版本参考序列上，然后提取CpG位点甲基化水平信息。
以上所述实施例仅表达了本发明的具体实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

Claims (5)

1.一种基于CpG的猪肉色性状全基因组甲基化位点的定位方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、选择实验猪；
S2、校正实验猪的肉色性状表型数据；
S3、采集实验猪的肌肉组织样品，提取基因组DNA；
S4、对提取的基因组DNA进行质量和浓度检测，选择质量合格的基因组DNA进行简化代表性甲基化测序，提取CpG位点甲基化水平信息；
S5、采用R软件CpGassoc包对校正后的实验猪的表型性状和全基因组CpG位点甲基化水平进行关联分析，其分析模型为：y＝Xm+An+e，其中，y表示矫正后的表型性状向量；m表示CpG位点甲基化程度；n表示剩余CpG位点甲基化程度；e表示残差效应向量；X和A分别表示m和a的关联矩阵；
S6、采用Bonferroni校正法控制多重检验对关联分析结果进行校正，将显著性阈值确定为P＜7.79e-8，绘制关联分析Manhattan图，由Manhattan图显示与肉色性状显著相关的关键位点。
2.根据权利要求1所述的基于CpG的猪肉色性状全基因组甲基化位点的定位方法，其特征在于，步骤S2中，校正实验猪的肉色性状表型数据，建立的回归模型如下：Y＝parity+year+month+gender+weight+Farm+e，其中，Y为肉色形状；parity为胎次；year为年度；month为月度；gender为性别；weight为屠宰重；Farm为场次；e为残差。
3.根据权利要求1所述的基于CpG的猪肉色性状全基因组甲基化位点的定位方法，其特征在于，步骤S3中，提取基因组DNA的方法如下：
S31、取黄豆大小组织样，尽量剪碎放入离心管中，加入裂解液及蛋白酶K；
S32、样品置于55℃恒温箱中孵育，至管中无组织块为止；
S33、加入Tris饱和酚，轻微混匀10min，4℃、12000r/min离心12min；
S34、取上清液加入质量比为25：24：1的Tris饱和酚、氯仿和异戊醇，混摇10min，4℃、12000r/min离心12min；
S35、再取上清液，加入氯仿，混摇10min，4℃、12000r/min离心12min；
S36、再取上清液，加无水乙醇和3M乙酸钠，混摇6min，4℃、1000r/min离心8min；
S37、去除上清液，留DNA沉淀团，加入75％乙醇，混5min，4℃、1000r/min离心5min；
S38、将离心管放入通风橱，吹干至管内无小滴；
S39、样品加超纯水，轻微吹打至DNA溶解，经过分光光度计检测质量与浓度后，将浓度统一稀释到50ng/μL，于-20℃下保存备用。
4.根据权利要求1所述的基于CpG的猪肉色性状全基因组甲基化位点的定位方法，其特征在于，步骤S4中，对提取的基因组DNA进行质量和浓度检测的方法如下：
S41、采用Nanodrop-2000检测各基因组DNA浓度和OD值，选取浓度大于等于50ng/μL，OD260/OD280＝1.8-2.0的基因组DNA样品；
S42、对上述样品利用1.0％的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性，选择DNA条带单一、主条带明显的基因组DNA为合格样品，置于-80℃冰箱保存待用。
5.根据权利要求4所述的基于CpG的猪肉色性状全基因组甲基化位点的定位方法，其特征在于，步骤S4中，对质量合格的基因组DNA进行简化代表性甲基化测序的方法如下：对质量和浓度检测后的实验猪的DNA构建文库，然后进行简化代表性甲基化测序，利用Bismrak软件将测序数据比对到国际猪基因组11.2版本参考序列上，然后提取CpG位点甲基化水平信息。
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