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CN111705096A - 一种酶转化法生产β-烟酰胺单核苷酸的方法 - Google Patents

一种酶转化法生产β-烟酰胺单核苷酸的方法 Download PDF

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CN111705096A
CN111705096A CN202010610158.6A CN202010610158A CN111705096A CN 111705096 A CN111705096 A CN 111705096A CN 202010610158 A CN202010610158 A CN 202010610158A CN 111705096 A CN111705096 A CN 111705096A
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楼秀余
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Abstract

本发明公开了一种酶转化法生产β‑烟酰胺单核苷酸的方法，涉及药物制备技术领域。其技术要点是：该方法包括如下步骤：S1，将反应原料加入到缓冲溶液中形成反应溶液；S2，将转化酶加入到反应溶液中进行催化转化；S3，后处理得到β‑烟酰胺单核苷酸；步骤S2中，还加入有山梨醇和海藻酸钠。通过采用本发明的酶转化方法制备得到的β‑烟酰胺单核苷酸具有较高的收率和纯度，且本发明成本低，对环境友好，易操作，适合大规模化生产。

Description

一种酶转化法生产β-烟酰胺单核苷酸的方法
技术领域
本发明涉及药物制备技术领域，更具体地说，它涉及一种酶转化法生产β-烟酰胺单核苷酸的方法。
背景技术
β-烟酰胺单核苷酸（NMN）是辅酶I的合成底物，同时NMN也被用于抗衰老研究。日本庆应义塾大学和美国华盛顿大学合作，对β-NMN的抗衰老效果和安全性进行人体临床试验。研究表明，β-烟酰胺单核苷酸对胰岛素的分泌也能起到调节作用，对mRNA的表达水平也有影响，β-烟酰胺单核苷酸在医疗治疗领域有着广泛的应用前景。
在公开号为CN109053838A的中国发明申请专利中公开了一种β-烟酰胺单核苷酸的制备方法，其主要以烟酸乙酯和四乙酰核糖作为起始物质，经过缩合、脱乙酰基、磷酸化和氨解主要工艺步骤，制备得到β-烟酰胺单核苷酸。
上述发明提供的β-烟酰胺单核苷酸的合成路线，其收率为80%，产率较低，而且用到大量的有机溶剂，对环境破坏严重。
因此，需要提出一种新的方案来解决上述问题。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种酶转化法生产β-烟酰胺单核苷酸的方法，该方法可以较低的成本、较短的周期生产出高纯度的β-烟酰胺单核苷酸产品，并且对环境污染相对传统方法大大减少。
为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：
一种酶转化法生产β-烟酰胺单核苷酸的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1，将反应原料加入到缓冲溶液中形成反应溶液；
S2，将转化酶加入到反应溶液中进行催化转化；
S3，后处理得到β-烟酰胺单核苷酸；
步骤S2中，还加入有山梨醇和海藻酸钠。
通过采用上述技术方案，实际生产中，直接将转化酶加入到反应体系中，烟酰胺单核苷酸的产率并不高且纯度也较低，本发明通过在反应体系中加入山梨醇和海藻酸钠作为保护剂，能够大大提高烟酰胺单核苷酸产物的产率和纯度。转化酶属于蛋白质，受到温度、pH和金属离子等因素影响较大，导致转化酶不能完全发挥作用，加入山梨醇和海藻酸钠作为保护剂，山梨醇的多羟基和酶分子发生作用，减少了酶分子的水合作用，从而加强酶分子的稳定性；海藻酸钠中的多羟基与酶的水溶液相互作用，使酶与水之间溶剂化，且其氢键能够改变酶分子折叠的驱动力，降低酶分子的自由能，增强酶分子的稳定性，减小酶分子受到外界因素的影响。
进一步优选为，所述反应原料包括烟酰胺核糖和三磷酸腺苷。
通过采用上述技术方案，烟酰胺核糖（NR）和三磷酸腺苷（ATP）两者反应合成β-烟酰胺单核苷酸（β-NMN）。
进一步优选为，所述缓冲溶液为磷酸盐缓冲溶液或三乙醇胺缓冲溶液。
通过采用上述技术方案，本发明采用磷酸盐缓冲溶液或三乙醇胺缓冲溶液，能够一定程度上抵消或减轻外界因素对溶液酸碱度的影响，从而反应体系的pH值相对稳定。
进一步优选为，所述转化酶为烟酰胺核糖激酶。
通过采用上述技术方案，烟酰胺核糖激酶取自酿酒酵母，以催化烟酰胺核糖和ATP反应生成β-烟酰胺单核苷酸。
进一步优选为，所述缓冲溶液中还含有镁离子或锰离子。
通过采用上述技术方案，通过加入镁离子或锰离子二价金属离子，以促进转化酶的活性。
进一步优选为，步骤S3，通过HZ-818大孔树脂吸附得到β-烟酰胺单核苷酸。
通过采用上述技术方案，通过HZ-818大孔树脂对β-烟酰胺单核苷酸和其他未反应原料和副产物进行选择性吸附分离，从而提高产物的纯度。
进一步优选为，所述所述缓冲溶液的pH为7.0-8.5。
通过采用上述技术方案，pH=7.0-8.5时，烟酰胺单核苷酸激酶能够较好的发挥催化氧化作用，此时产物的收率也最高，转化效率也最高。
为实现上述目的二，本发明提供了如下技术方案：
进一步优选为，所述步骤S2中，转化酶加入到反应溶液中后，水浴加热到30-45℃。
通过采用上述技术方案，反应温度达到30-45℃时，烟酰胺单核苷酸激酶能够发挥较好的催化氧化作用，且此时转化效率最高。
综上所述，与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
（1）本发明通过在反应体系中加入山梨醇和海藻酸钠作为保护剂，能够大大提高烟酰胺单核苷酸产物的产率和纯度，山梨醇的多羟基和酶分子发生作用，减少了酶分子的水合作用，从而加强酶分子的稳定性；海藻酸钠中的多羟基与酶的水溶液相互作用，使酶与水之间溶剂化，且其氢键能够改变酶分子折叠的驱动力，降低酶分子的自由能，增强酶分子的稳定性，减小酶分子受到外界因素的影响；
（2）本发明还在反应体系中加入了二价金属离子，二价金属离子采用二价镁离子或二价锰离子，起到促进转化酶的活性的作用。
附图说明
图1为本发明中酶转化法生产β-烟酰胺单核苷酸的工艺流程图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例，对本发明进行详细描述。
实施例1：如图1，一种酶转化法生产β-烟酰胺单核苷酸的方法，具体步骤为：
S1，将1500mL、pH=8.3的磷酸盐缓冲溶液加入到反应瓶中，加入3g氯化镁、13g烟酰胺核糖和15g三磷酸腺苷，水浴加热至35℃保温搅拌1min；
S2，加入8g烟酰胺核糖激酶、15g山梨醇和16g海藻酸钠，搅拌溶解，升温至40℃，于220rpm下搅拌反应8h，停止反应；
S3，将上述步骤反应后的溶液进行过滤，并用HZ-818大孔树脂吸附，真空干燥，再用乙醇和水重结晶，即得到β-烟酰胺单核苷酸。
本实施例中得到β-烟酰胺单核苷酸的收率88.27%，采用HPLC方法进行产物纯度分析表示，产物中β-烟酰胺单核苷酸的纯度为97.95%。
实施例2：一种酶转化法生产β-烟酰胺单核苷酸的方法，具体步骤为：
S1，将1000mL、pH=8.3的磷酸盐缓冲溶液加入到反应瓶中，加入2g氯化镁、8.6g烟酰胺核糖和10g三磷酸腺苷，水浴加热至35℃保温搅拌1min；
S2，加入5.3g烟酰胺核糖激酶、10g山梨醇和10.6g海藻酸钠，搅拌溶解，升温至40℃，于220rpm下搅拌反应8h，停止反应；
S3，将上述步骤反应后的溶液进行过滤，并用HZ-818大孔树脂吸附，真空干燥，再用乙醇和水重结晶，即得到β-烟酰胺单核苷酸。
本实施例中得到β-烟酰胺单核苷酸的收率88.31%，采用HPLC方法进行产物纯度分析表示，产物中β-烟酰胺单核苷酸的纯度为97.46%。
实施例3：一种酶转化法生产β-烟酰胺单核苷酸的方法，具体步骤为：
S1，将1500mL、pH=8.0的磷酸盐缓冲溶液加入到反应瓶中，加入3g氯化镁、13g烟酰胺核糖和15g三磷酸腺苷，水浴加热至37℃保温搅拌1min；
S2，加入8g烟酰胺核糖激酶、15g山梨醇和16g海藻酸钠，搅拌溶解，升温至42℃，于220rpm下搅拌反应8h，停止反应；
S3，将上述步骤反应后的溶液进行过滤，并用HZ-818大孔树脂吸附，真空干燥，再用乙醇和水重结晶，即得到β-烟酰胺单核苷酸。
本实施例中得到β-烟酰胺单核苷酸的收率87.36%，采用HPLC方法进行产物纯度分析表示，产物中β-烟酰胺单核苷酸的纯度为96.42%。
实施例4：一种酶转化法生产β-烟酰胺单核苷酸的方法，具体步骤为：
S1，将1500mL、pH=8.1的三乙醇胺缓冲溶液加入到反应瓶中，加入2.8g硫酸锰、13g烟酰胺核糖和15g三磷酸腺苷，水浴加热至35℃保温搅拌1min；
S2，加入8g烟酰胺核糖激酶、15g山梨醇和16g海藻酸钠，搅拌溶解，升温至40℃，于220rpm下搅拌反应8h，停止反应；
S3，将上述步骤反应后的溶液进行过滤，并用HZ-818大孔树脂吸附，真空干燥，再用乙醇和水重结晶，即得到β-烟酰胺单核苷酸。
本实施例中得到β-烟酰胺单核苷酸的收率87.19%，采用HPLC方法进行产物纯度分析表示，产物中β-烟酰胺单核苷酸的纯度为96.91%。
对比例1：一种酶转化法生产β-烟酰胺单核苷酸的方法，具体步骤为：
S1，将1500mL、pH=8.3的磷酸盐缓冲溶液加入到反应瓶中，加入3g氯化镁、13g烟酰胺核糖和15g三磷酸腺苷，水浴加热至35℃保温搅拌1min；
S2，加入8g烟酰胺核糖激酶、16g海藻酸钠，搅拌溶解，升温至40℃，于220rpm下搅拌反应8h，停止反应；
S3，将上述步骤反应后的溶液进行过滤，并用HZ-818大孔树脂吸附，真空干燥，再用乙醇和水重结晶，即得到β-烟酰胺单核苷酸。
本对比例中得到β-烟酰胺单核苷酸的收率78.35%，采用HPLC方法进行产物纯度分析表示，产物中β-烟酰胺单核苷酸的纯度为86.23%。
对比例2：一种酶转化法生产β-烟酰胺单核苷酸的方法，具体步骤为：
S1，将1500mL、pH=8.3的磷酸盐缓冲溶液加入到反应瓶中，加入3g氯化镁、13g烟酰胺核糖和15g三磷酸腺苷，水浴加热至35℃保温搅拌1min；
S2，加入8g烟酰胺核糖激酶、15g山梨醇，搅拌溶解，升温至40℃，于220rpm下搅拌反应8h，停止反应；
S3，将上述步骤反应后的溶液进行过滤，并用HZ-818大孔树脂吸附，真空干燥，再用乙醇和水重结晶，即得到β-烟酰胺单核苷酸。
本对比例中得到β-烟酰胺单核苷酸的收率76.94%，采用HPLC方法进行产物纯度分析表示，产物中β-烟酰胺单核苷酸的纯度为86.51%。
对比例3：一种酶转化法生产β-烟酰胺单核苷酸的方法，具体步骤为：
S1，将1500mL、pH=8.3的磷酸盐缓冲溶液加入到反应瓶中，加入3g氯化镁、13g烟酰胺核糖和15g三磷酸腺苷，水浴加热至35℃保温搅拌1min；
S2，加入8g烟酰胺核糖激酶，搅拌溶解，升温至40℃，于220rpm下搅拌反应8h，停止反应；
S3，将上述步骤反应后的溶液进行过滤，并用HZ-818大孔树脂吸附，真空干燥，再用乙醇和水重结晶，即得到β-烟酰胺单核苷酸。
本对比例中得到β-烟酰胺单核苷酸的收率66.28%，采用HPLC方法进行产物纯度分析表示，产物中β-烟酰胺单核苷酸的纯度为80.42%。
对比例4：一种酶转化法生产β-烟酰胺单核苷酸的方法，具体步骤为：
S1，将1500mL、pH=8.3的磷酸盐缓冲溶液加入到反应瓶中，加入13g烟酰胺核糖和15g三磷酸腺苷，水浴加热至35℃保温搅拌1min；
S2，加入8g烟酰胺核糖激酶、15g山梨醇和16g海藻酸钠，搅拌溶解，升温至40℃，于220rpm下搅拌反应8h，停止反应；
S3，将上述步骤反应后的溶液进行过滤，并用HZ-818大孔树脂吸附，真空干燥，再用乙醇和水重结晶，即得到β-烟酰胺单核苷酸。
本对比例中得到β-烟酰胺单核苷酸的收率84.72%，采用HPLC方法进行产物纯度分析表示，产物中β-烟酰胺单核苷酸的纯度为95.74%。
通过上述实施例和对比例可知，本发明的酶转换法具有可重复性，且收率达到87.19%以上，纯度达到96.42%。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种酶转化法生产β-烟酰胺单核苷酸的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1，将反应原料加入到缓冲溶液中形成反应溶液；
S2，将转化酶加入到反应溶液中进行催化转化；
S3，后处理得到β-烟酰胺单核苷酸；
步骤S2中，还加入有山梨醇和海藻酸钠。
2.根据权利要求1所述的酶转化法生产β-烟酰胺单核苷酸的方法，其特征在于，所述反应原料包括烟酰胺核糖和三磷酸腺苷。
3.根据权利要求1所述的酶转化法生产β-烟酰胺单核苷酸的方法，其特征在于，所述缓冲溶液为磷酸盐缓冲溶液或三乙醇胺缓冲溶液。
4.根据权利要求2所述的酶转化法生产β-烟酰胺单核苷酸的方法，其特征在于，所述转化酶为烟酰胺核糖激酶。
5.根据权利要求1所述的酶转化法生产β-烟酰胺单核苷酸的方法，其特征在于，所述缓冲溶液中还含有镁离子或锰离子。
6.根据权利要求1所述的酶转化法生产β-烟酰胺单核苷酸的方法，其特征在于，步骤S3，通过HZ-818大孔树脂吸附得到β-烟酰胺单核苷酸。
7.根据权利要求1所述的酶转化法生产β-烟酰胺单核苷酸的方法，其特征在于，所述缓冲溶液的pH为7.0-8.5。
8.根据权利要求1所述的酶转化法生产β-烟酰胺单核苷酸的方法，其特征在于，步骤S2中，转化酶加入到反应溶液中后，水浴加热到30-45℃。
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