CN111606984B - 一种植物抗虫蛋白及其编码基因和应用 - Google Patents

Abstract

本申请公开了一种用于植物抗虫的蛋白质，所述蛋白质的氨基酸序列为SEQ ID NO:3。同时还提供了该抗虫蛋白的编码基因SEQ ID NO:1。本发明进一步提供了上述抗虫蛋白和基因在抗地老虎中的应用。本发明提供的抗虫蛋白和基因能够提供更好的地老虎抗性和草地贪夜蛾抗性。

Description

一种植物抗虫蛋白及其编码基因和应用

技术领域

本申请涉及基因工程生物防治技术领域，具体而言涉及人工改造的抗虫基因mCry1Fa、其编码表达形成的以后的蛋白质，以及在植物抗虫方面的应用。

背景技术

生物防治是利用某些有益生物或生物代谢产物来控制害虫种群数量，以达到降低或消灭害虫的目的，如用赤眼蜂或白僵菌防治草地螟。其特点是对人、畜安全，对环境污染少，对某些害虫可达到长期控制的目的；但是效果常不稳定，并且不论草地螟发生轻重均需同样投资进行。为了解决农业防治、化学防治、物理防治和生物防治在实际应用中的局限性，科学家们经过研究发现将编码杀虫蛋白的抗虫基因转入植物中，可获得一些抗虫转基因植物以防治植物虫害。

Bt基因编码杀虫晶体蛋白，来自苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)，该菌为革兰氏阳性土壤杆菌，属于芽孢杆菌属，其菌体为短杆状，生鞭毛，单生或形成短链。它在芽孢形成过程中产生称为δ-内毒素的杀虫伴胞晶体蛋白(控制合成这种蛋白质的基因在质粒上)，这些蛋白对鳞翅目、双翅目、鞘翅目、膜翅目等多种昆虫具有特异性的杀虫活性。

1981年Schenpf和Whiteley从苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)中克隆了第一个编码δ-内毒素的cry基因Cry1Aa1。1985年Adang,M.J等从苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)中克隆了Cry1Ac基因，1986年Wabiko,H.等人从苏云金芽孢杆菌中克隆了cry1Ab基因，该基因编码1155个氨基酸，是目前产业化应用较为广泛的抗虫基因。1991年Chambers,J克隆了cry1Fa基因。截止到目前，已确定千余种苏云金芽孢杆菌菌系及万余种的杀虫晶体蛋白。

地老虎发育进度中有多个作为幼虫的龄期。虽然较后龄期幼虫咬噬幼苗产生最明显的损害和经济损失，但食叶通常造成农作物诸如玉米的减产。在接近晚期龄期时(例如第三至四龄)，幼虫开始咬噬植株或植株部分，特别是幼苗。由于进食方式的改变，在极少早期警告信号的情况下能够不可预见地形成造成经济损失的种群。大的地老虎每天可破坏数株幼苗，并且严重的害虫侵袭可除去整个群丛的农作物。地老虎的夜间习惯和向地下挖洞的行为也使观测和治理很成问题。

小地老虎(The black cutworm)(Agrotis ipsilon(Hufnagel)；鳞翅目(Lepidoptera)：夜蛾科(Noctuidae))是多种农作物包括玉米、棉花、十字花科芸苔属蔬菜(白菜(Brassica)，青花椰菜，甘蓝，大白菜)以及草坪的严重害虫。次级宿主植物包括甜菜根，辣椒，鹰嘴豆，faba beans，莴苣，紫花苜蓿(lucerne)，洋葱，马铃薯，萝卜，油菜，水稻，大豆，草莓，甜菜，烟草，番茄，以及森林树木。在北美洲，地老虎属(Agrotis)的害虫以苜蓿，玉米(maize)，烟草，大麻，洋葱，草莓，黑莓，覆盆子，紫花苜蓿(alfalfa)，大麦，豆类，甘蓝，燕麦，豌豆，马铃薯，红薯(sweetpotatoes)，番茄，花园花卉，草，紫花苜蓿(lucern)，玉米(maize)，芦笋，葡萄，几乎所有类型的叶子、野草和许多其它农作物和花园植物为食。

对小地老虎(A.ipsilon)的培养控制诸如周边野草控制可以帮助防止严重的侵袭；但是，这种方法不是总能适用或有效。侵袭是散发性的，并且在种植前或种植时施用杀虫剂在过去是无效的。存在控制农作物中地老虎的一些诱饵。为了保护草皮草诸如creepingbentgrass，使用了化学杀虫剂。因为公众与这些区域的紧密接触，在草皮-覆盖区(例如高尔夫球草地，运动场，公园和其它娱乐区域，专业景观美化以及家庭草坪)使用化学杀虫剂受到特别的关注。天然产物(例如线虫和印苦楝子素(azadirachtin))通常效果不佳。地老虎的迅速取食和挖洞的行为使它们特别难以使用目前生物基础的害虫溶液来控制。例如Cry1A(b)毒素对地老虎是基本无效的。在专利公开号为CN102246823A的中国专利申请中公开了通过对Cry1F基因进行改造，使其编码的蛋白质具有杀灭地考虑的效果。

草地贪夜蛾(学名：Spodoptera frugiperda)：是夜蛾科灰翅夜蛾属的一种蛾。成虫在夜间活动，在植物叶子顶部产约100粒卵，卵阶段是在25℃的温度下持续3天。新孵出的幼虫以卵壳本身为食，然后静置2-10小时。幼虫即毛毛虫更喜欢以新叶为食，由于它们的食性习惯，通常会各自找到一片新叶，其幼虫分别以玉米和水稻为主要食物。现有技术中，目前对于草地贪夜蛾的防治主要采用化学防治方式，该虫已对许多农药产生了较强的抗药性。另外，采用化学防治方式带来的农药残留等问题，存在人畜安全隐患和生态环境影响的风险。探求绿色、安全、高效、持续的防治草地贪夜蛾的措施已势在必行。

发明内容

本申请的目的在于提供一种改造的Cry1Fa基因，本发明提供的mCry1Fa基因转入植物后，所获得的高表达mCry1Fa蛋白质的转基因植物具有更高的地老虎和/或草地贪夜蛾抗性。

本发明公开了，一种用于植物抗虫的蛋白质，所述蛋白质的氨基酸序列为SEQ IDNO:3。

本发明还公开了编码上述植物抗虫蛋白质的抗虫基因，具体的，该抗虫基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:1。本发明的mCry1Fa基因转入植物后，所获得的高表达mCry1Fa蛋白的转基因植物具有更高的地老虎和/或草地贪夜蛾的抗性。

本发明进一步提供了一种含有上述抗虫基因的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系。

本发明的另一方面提供了一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包含上述的抗虫基因。

在根据本发明的一个实施方案中，所述的表达载体中依次包含以下基因结构：

来自玉米泛素基因启动子(Ubi)；如权利要求2或3所述的抗虫基因；胭脂碱合成酶的终止子(Nos)；编码膦丝菌素乙酰转移酶基因(PAT)；来自花椰菜花叶病毒(CaMV)的终止子(35s)。

本发明还提供了用于植物抗虫的蛋白质，或者，上述抗虫基因，或，含有上述抗虫基因的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系在植物抗虫中的应用，其特征在于，所述应用选自以下两者或两者之一：a)制备具有抗地老虎和/或草地贪夜蛾效果的药剂；b)培育具有或提高抗地老虎和草地贪夜蛾能力的转基因植物。

本发明进一步提供了一种培育具有或提升抗地老虎和/或草地贪夜蛾能力的植物的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：将上述抗虫基因导入受体植物中，得到转基因植物。

在根据本发明的一个实施方案中，所述植物选自单子叶植物、双子叶植物、禾本科植物中的一种或多种；优选为玉米。

本发明具有以下有益效果：

本发明提供的mCry1Fa对小地老虎和/或草地贪夜蛾的致死效率远远高于Cry1Fa，修改过的基因mCry1Fa具有更好的杀虫效果，表达本发明mCry1Fa基因的植物对于地老虎和/或草地贪夜蛾也具有更好的抗性，有利于农业中对于小地老虎和/或草地贪夜蛾的防治。

附图说明

图1为本发明的含有mCry1Fa核苷酸序列的重组克隆载体LP05-T构建流程图；

图2为本发明的含有mCry1Fa核苷酸序列的重组表达载体LP-PT05构建流程图；

图3为本发明的转化体的PCR检测图，其中WT为野生型植株，PC为质粒对照，NC为水对照，1～20为20个阳性转化体；

图4为本发明控制害虫的方法的转化体的玉米螟抗虫生测图，其中WT为野生型植株，Cry1Fa为转化了未经修饰的Cry1Fa转化事件，mCry1Fa为转化了经过修饰的Cry1Fa转化事件。

具体实施方式

以下实施例用于说明本申请，但不用来限制本申请的范围。

下面将更详细地描述本申请的具体实施例。提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本申请，并且能够将本申请的范围完整的传达给本领域的技术人员。

如在通篇说明书及权利要求当中所提及的“包含”或“包括”为一开放式用语，故应解释成“包含但不限定于”。说明书后续描述为实施本申请的较佳实施方式，然所述描述乃以说明书的一般原则为目的，并非用以限定本申请的范围。本申请的保护范围当视所附权利要求所界定者为准。

实施例1Cry1Fa基因的获得和合成

1、获得Cry1Fa核苷酸序列

mCry1Fa杀虫蛋白质的氨基酸序列(605个氨基酸)，如序列表中SEQ ID NO:3所示；编码相应于所述mCry1Fa杀虫蛋白质的氨基酸序列(605个氨基酸)的mCry1Fa核苷酸序列(1818个核苷酸)，如序列表中SEQ ID NO:1所示。

Cry1Fa杀虫蛋白质的氨基酸序列(605个氨基酸)，如序列表中SEQ ID NO:4所示；编码相应于所述Cry1Fa杀虫蛋白质的氨基酸序列(605个氨基酸)的Cry1Fa核苷酸序列(1818个核苷酸)，如序列表中SEQ ID NO:2所示。

2、合成上述Cry1Fa核苷酸序列

所述mCry1Fa核苷酸序列(如序列表中SEQ ID NO:1所示)和所述Cry1Fa核苷酸序列(如序列表中SEQ ID NO:3所示)由南京金斯瑞生物科技公司合成；合成的mCry1Fa核苷酸序列的5’端还连接有NcoI酶切位点，所述mCry1Fa核苷酸序列的3’端还连接有EcoRI酶切位点；合成的所述Cry1Fa核苷酸序列的5’端还连接有NcoI酶切位点，所述Cry1Fa核苷酸序列的3’端还连接有EcoRI酶切位点。

将合成的mCry1Fa核苷酸序列连入克隆载体pEASY-T5(Transgen，Beijing，China，CAT：CT501-01)上，操作步骤按Transgen公司产品pEASY-T5载体说明书进行，得到重组克隆载体LP05-T，其构建流程如图1所示(其中Kan表示卡那霉素抗性基因；Amp表示氨苄青霉素抗性基因；pUC origin表示质粒pUC的复制区序列，可引导双链DNA复制过程；LacZ为LacZ起始密码子；mCry1Fa为mCry1Fa核苷酸序列(SEQ ID NO:1)。

然后将重组克隆载体LP05-T用热激方法转化大肠杆菌T1感受态细胞(Transgen，Beijing，China；Cat.No：CD501)，其热激条件为：50μl大肠杆菌T1感受态细胞、10μl质粒DNA(重组克隆载体LP05-T)，42℃水浴30秒；37℃水浴45分钟(200rpm转速下摇床摇动)，涂布的氨苄青霉素(100毫克/升)的LB平板(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，琼脂15g/L，用NaOH调pH至7.5)上生长过夜。挑取白色菌落，在LB液体培养基(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，氨苄青霉素100mg/L，用NaOH调pH至7.5)中于温度37℃条件下培养过夜。碱法提取其质粒：将菌液在12000rpm转速下离心1min，去上清液，沉淀菌体用100μl冰预冷的溶液I(25mM Tris-HCl，10mM EDTA(乙二胺四乙酸)，50mM葡萄糖，pH8.0)悬浮；加入150μl新配制的溶液II(0.2M NaOH，1％SDS(十二烷基硫酸钠))，将管子颠倒4次，混合，置冰上3-5min；加入150μl冰冷的溶液III(4M醋酸钾，2M醋酸)，立即充分混匀，冰上放置5-10min；于温度4℃、转速12000rpm条件下离心5min，在上清液中加入2倍体积无水乙醇，混匀后室温放置5min；于温度4℃、转速12000rpm条件下离心5min，弃上清液，沉淀用质量浓度为70％的乙醇洗涤后晾干；加入30μl含Rnase(20μg/ml)的TE(10mM Tris-HCl，1mM EDTA，PH8.0)溶解沉淀；于温度37℃下水浴30min，消化RNA；于温度-20℃保存备用。

提取的质粒经NcoI和EcoRI酶切鉴定后，对阳性克隆进行测序验证，结果表明重组克隆载体LP05-T中插入的所述mCry1Fa核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列，即mCry1Fa核苷酸序列正确插入。

按照上述构建重组克隆载体LP05-T的方法，将合成的所述Cry1Fa核苷酸序列连入克隆载体pEASY-T5上，得到重组克隆载体LP05CK-T，其中，Cry1Fa为Cry1Fa核苷酸序列。酶切和测序验证重组克隆载体LP05CK-T中所述Cry1Fa核苷酸序列正确插入。

实施例2构建含有Cry1Fa基因的重组表达载体

用限制性内切酶NcoI和EcoRI分别酶切重组克隆载体LP05-T和表达载体LP-BB(载体骨架：pCAMBIA3301(CAMBIA机构可以提供))，将切下的mCry1Fa核苷酸序列片段插到表达载体LP-BB的NcoI和EcoRI位点之间，利用常规的酶切方法构建载体是本领域技术人员所熟知的，构建成重组表达载体LP-PT05，其构建流程如图2所示(Kan：卡那霉素基因；RB：右边界；Ubi：玉米Ubiquitin(泛素)基因启动子(SEQ ID NO:8)；mCry1Fa：mCry1Fa核苷酸序列(SEQ ID NO:1)；Nos：胭脂碱合成酶的终止子(SEQ ID NO:6)；Ubi：玉米Ubiquitin(泛素)基因启动子(SEQ ID NO:8)；PAT：编码膦丝菌素乙酰转移酶基因(SEQ ID NO:7)；35s：指来自花椰菜花叶病毒(CaMV)的终止子(SEQ ID NO:9)；LB：左边界)。

将重组表达载体LP-PT05用热激方法转化大肠杆菌T1感受态细胞，其热激条件为：50μl大肠杆菌T1感受态细胞、10μl质粒DNA(重组表达载体LP-PT05)，42℃水浴30秒；37℃水浴1小时(100rpm转速下摇床摇动)；然后在含50mg/L卡那霉素(Kanamycin)的LB固体平板(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，琼脂15g/L，用NaOH调pH至7.5)上于温度37℃条件下培养12小时，挑取白色菌落，在LB液体培养基(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，卡那霉素50mg/L，用NaOH调pH至7.5)中于温度37℃条件下培养过夜。碱法提取其质粒。将提取的质粒用限制性内切酶NcoI和EcoRI酶切后鉴定，并将阳性克隆进行测序鉴定，结果表明重组表达载体LP-PT05在NcoI和EcoRI位点间的核苷酸序列为序列表中SEQ IDNO:1所示核苷酸序列，即mCry1Fa核苷酸序列。

按照上述构建重组表达载体LP-PT05的方法，将NcoI和EcoRI酶切重组克隆载体LP02-T切下的所述Cry1Fa核苷酸序列插入表达载体LP-BB，得到重组表达载体LP-PT05-CK。酶切和测序验证重组表达载体LP-PT05-CK在NcoI和EcoRI位点间即为所述Cry1Fa核苷酸序列。

实施例3重组表达载体转化农杆菌

对己经构建正确的重组表达载体LP-PT05和LP-PT05-CK用液氮法转化到农杆菌LBA4404(Invitrgen，Chicago，USA；Cat.No：18313-015)中，其转化条件为：100μL农杆菌LBA4404、3μL质粒DNA(重组表达载体)；置于液氮中10分钟，37℃温水浴10分钟；将转化后的农杆菌LBA4404接种于LB试管中于温度28℃、转速为200rpm条件下培养2小时，涂于含50mg/L的利福平(Rifampicin)和50mg/L的卡那霉素(Kanamycin)的LB平板上直至长出阳性单克隆，挑取单克隆培养并提取其质粒，用限制性内切酶NotI和SalI对重组表达载体LP-PT05和LP-PT05-CK酶切后进行酶切验证，结果表明重组表达载体LP-PT05和LP-PT05-CK结构完全正确。

转化具体步骤如下：

1).玉米幼胚的准备

将公司内部玉米自交系AX808种植于大田或是温室，取人工授粉后8-10天(夏季)/10-13天(秋季)的玉米作为幼胚的来源。

2)农杆菌的准备

(1)取已转化鉴定好的农杆菌甘油菌在添加有100mg/L kan和12mg/L tet的YEP固体培养基上划线，28℃暗培养2-3天；

(2)在灭菌的2ml离心管中加入1ml侵染培养基，取步骤1的农杆菌放入侵染培养基中，并用移液枪充分打散混匀；

(3)另取1个灭菌的2ml离心管，用侵染培养基调菌液浓度，使OD660到0.5-0.7。

3)玉米幼胚与农杆菌的共培养

(1)除去装幼胚离心管中的侵染培养基，加入1.5ml新鲜侵染培养基将胚清洗一次；

(2)除去侵染培养基，加入调好的农杆菌菌液；

(3)最大转速震荡30s，室温放置5min；

(4)将胚倒到共培养基上，吸干液体；

(5)将胚平面朝上，盾面朝上放置；

(6)将胚放到22℃暗培养2-3天。

4)愈伤的诱导和筛选

(1)共培养后的胚转到诱导愈伤培养基上，28℃培养箱中暗培养7-10天；

(2)将诱导好的愈伤转到筛选培养基上进行筛选培养，筛选压为5.0mM草甘膦，28℃暗培养2-3周；

(3)取第一次筛选存活的愈伤进行第二次筛选，筛选压同为2.0mM；

5)转化株系的再生与培养

(1)取筛选后长出的胚性愈伤放到预分化培养基上，28℃暗培养10-14天；

(2)取胚性愈伤到分化培养基上，28℃光培养10-14天，直到幼苗分化出来；

(3)将分化好的幼苗转到生根培养基上，28℃光培养，直到根发育完全；

(4)将长势良好的幼苗移栽至温室基质内。

待转基因植株开花结实后收种。将收获的种子播种在温室，植株长到4-6叶期时，采用PCR技术进行表达分析检测。

2、用全式金公司2×EasyTaq PCR SuperMix(China，Beijing，Cat:AS111-11)普通PCR验证转入Cry1Fa基因的玉米植株。

PCR的引物是：

Cry1Fa-393F(SEQ ID NO:10)：cgtcatcccaacttacaagg

Cry1Fa-930R(SEQ ID NO:11)：CATGATTCAGCACATGGGAG

片段大小：510bp

PCR反应的条件是：30个循环，每个循环是95℃30’,58℃30’,72℃40’

3)用qRT-PCR验证转入Cry1Fa基因的玉米植株

分别取转入mCry1Fa核苷酸序列的玉米植株和转入Cry1Fa核苷酸序列的玉米植株的叶片约100mg作为样品，用Transgen的EasyPure Plant Genomic DNA Kit(含RNase A)(Transgen，Beijing，China，Cat:EE111-01)提取其基因组DNA，通过TransStart Green荧光定量PCR方法检测mCry1Fa基因的拷贝数。同时以野生型玉米植株作为对照，按照上述方法进行检测分析。实验设3次重复，取平均值。

检测Cry1Fa基因拷贝数的具体方法如下：

步骤11、分别取转入mCry1Fa核苷酸序列的玉米植株和野生型玉米植株的叶片各100mg，分别在研钵中用液氮研成匀浆，每个样品取3个重复；

步骤12、使用Transgen的EasyPure Plant Genomic DNA Kit(含RNase A)(Transgen，Beijing，China，Cat:EE111-01)提取上述样品的基因组DNA，具体方法参考其产品说明书；

步骤13、用NanoDrop 2000(Thermo Scientific)测定上述样品的基因组DNA浓度；

步骤14、调整上述样品的基因组DNA浓度至同一浓度值，所述浓度值的范围为80-100ng/μl；

步骤15、采用TransStart Green荧光定量PCR方法鉴定样品的拷贝数，以经过鉴定已知拷贝数的样品作为标准品，以野生型玉米植株的样品作为对照，每个样品3个重复，取其平均值；荧光定量PCR引物和探针序列分别是：

以下引物用来检测mCry1Fa和Cry1Fa核苷酸序列：

引物1(CF5)：CATTCGCGTACACCATTGTC如序列表中SEQ ID NO:12所示；

引物2(CR5)：ACCAGCAAAGATCCGTTCAC如序列表中SEQ ID NO:13所示；

以下引物用来检测18s的核苷酸序列，用于内参调平

18srRNA-F(SEQ ID NO:14)：CCATCCCTCCGTAGTTAGCTTCT

18srRNA-R(SEQ ID NO:15)：CCTGTCGGCCAAGGCTATATAC

PCR反应体系为：

PCR反应条件为：

利用SDS2.3软件(Applied Biosystems)分析数据。

实验结果如图3所示，mCry1Fa和Cry1Fa核苷酸序列己整合到所检测的玉米植株的染色体组中，而且转入mCry1Fa核苷酸序列的玉米植株均获得了含有单拷贝mCry1Fa和Cry1Fa基因的转基因玉米植株。

实施例4转基因玉米植株的杀虫蛋白质检测

1、转基因玉米植株的杀虫蛋白质(Cry1Fa蛋白)的含量检测

本实验中涉及的溶液如下：

萃取缓冲液：8g/L NaCl，0.2g/L KH2PO4，2.9g/L Na2HPO4·12H2O，0.2g/L KCl，5.5ml/L吐温20(Tween-20)，pH 7.4；

洗涤缓冲液PBST：8g/L NaCl，0.2g/L KH2PO4，2.9g/L Na2HPO4·12H2O，0.2g/LKCl，0.5ml/L吐温20(Tween-20)，pH 7.4；

终止液：1M HCl。

分别取3mg转入mCry1Fa核苷酸序列的单拷贝玉米植株和转入Cry1Fa核苷酸序列的单拷贝玉米植株的新鲜叶片作为样品，液氮研磨后加入800μl所述萃取缓冲液，4000rpm的转速下离心10min，取上清液用所述萃取缓冲液稀释40倍，取80μl稀释后的上清液用于ELISA检测。用ELISA(酶联免疫吸附测定法)试剂盒(ENVIRONLOGIX公司，Cry1F试剂盒，AP016)对样品中杀虫蛋白质(Cry1Fa蛋白)量占叶片鲜重的比例进行检测分析，具体方法参考其产品说明书。

同时以野生型玉米植株和经荧光定量PCR鉴定为非转基因的玉米植株作为对照，按照上述方法进行检测分析。转入mCry1Fa核苷酸序列的共3个株系(F1、F2和F3)，转入Cry1Fa核苷酸序列的共3个株系(F4、F5和F6)，经荧光定量PCR鉴定为非转基因的(NGM)共1个株系，野生型的(CK)共1个株系；从每个株系选3株进行测试，每株重复6次。

转基因玉米植株的杀虫蛋白质(Cry1Fa蛋白)含量的实验结果如表1所示。分别测得转入mCry1Fa核苷酸序列的玉米植株和转入Cry1Fa核苷酸序列的玉米植株的新鲜叶片中杀虫蛋白(Cry1Fa蛋白)平均表达量占叶片鲜重的比例(ng/g)分别为4642.20和4555.42，这一结果表明Cry1Fa蛋白在玉米中均获得了较高的表达量和稳定性。

表1、转基因玉米植株的Cry1Fa蛋白表达量测定平均结果

mCry1Fa蛋白的体外表达及纯化的步骤具体如下：

1、人工合成序列表中SEQ ID NO:1所示的双链DNA分子

2、将步骤1合成的双链DNA分子与原核表达载体pEASY-E1连接，得到重组质粒pEASY-mCry1Fa。对重组质粒pEASY-mCry1Fa进行测序。测序结果表明，重组质粒pEASY-mCry1Fa中含有序列表中SEQ ID NO:1所示的DNA分子，表达序列表中SEQ ID NO:3所示的mCry1Fa蛋白。

3、将重组质粒pEASY-mCry1Fa导入大肠杆菌transetta，得到重组菌，将该重组菌命名为transetta-mCry1Fa。

4、取transetta-mCry1Fa的单克隆，接种至100mL LB液体培养基(含50μg/mL氨苄霉素)，37℃、200rpm振荡培养12h，得到培养菌液。

5、取培养菌液，按体积比为1:100接种至50mL LB液体培养基(含50μg/mL氨苄青霉素)，37℃、200rpm振荡培养至OD600nm值为0.6，然后加入IPTG并使其浓度为1mM，28℃、220rpm振荡培养4h，4℃、10000rpm离心10min，收集菌体沉淀。

6、取菌体沉淀，加入100mL pH 8.0、100mM的Tris-HCl缓冲液，重悬后超声破碎(超声波功率600W，循环程序为：破碎4s，停6s，共20min)，然后4℃、10000rpm离心10min，收集上清液甲。

7、取上清液甲，4℃、12000rpm离心10min，收集上清液乙。

8、采用GE公司生产的镍柱对上清液乙进行纯化(纯化的具体步骤参考镍柱的说明书)，然后采用赛默飞世尔公司生产的蛋白定量试剂盒对mCry1Fa蛋白进行定量。

按照上述方法，将步骤1中“人工合成序列表中SEQ ID NO:1所示的双链DNA分子”替换为“人工合成序列表中SEQ ID NO:2所示的双链DNA分子”，其它步骤均不变，得到Cry1Fa蛋白。

9、草地贪夜蛾和小地老虎生物测定方法

根据Jing Xue(2008)报道的生测方法对mcry1Fa蛋白和cry1Fa蛋白进行活性比较，分别测定两种蛋白(mcry1Fa蛋白和cry1Fa蛋白)对四种鳞翅目昆虫(草地贪夜蛾和小地老虎)的杀虫活性，结果如表2所示。

10、转基因玉米植株的抗虫效果检测

将转入Cry1Fa基因序列的玉米植株、转入已知的优化mCry1Fa基因序列的玉米植株、野生型玉米植株和经荧光定量PCR鉴定为非转基因的玉米植株分别对草地贪夜蛾和小地老虎进行抗虫效果检测。

(1)草地贪夜蛾：分别取转入优化mCry1Fa基因序列的玉米植株、转入已知的Cry1Fa基因序列的玉米植株、野生型玉米植株和经荧光定量PCR鉴定为非转基因的玉米植株的新鲜叶片，用无菌水中洗干净并用纱布将叶片上的水吸干，同时剪长条状，取3片剪后的长条状叶片放入圆形塑料培养皿底部的滤纸上，所述滤纸用蒸馏水润湿，每个培养皿中放10头人工饲养的草地贪夜蛾和小地老虎(初孵幼虫)，虫试培养皿加盖后，在温度26-28℃、相对湿度70％-80％、光周期(光/暗)16∶8的条件下放置3-5天后统计幼虫死亡情况，计算各样品中亚洲玉米螟的平均死亡率。转入优化Cry1Fa基因序列的共4个株系(F4、F5和F6)，转入已知的优化Cry1Fa基因序列的共3个株系(F1、F2和F3)，结果如表3所示。

10、通过对玉米的损伤测定转基因Cry1Fa玉米植株抗小地老虎和草地贪夜蛾的效率：

1)植株处理：

V3期对照及转Cry1Fa幼苗，昆虫：小地老虎二龄幼虫

实验每个材料各六个重复，每个重复6株幼苗，每株幼苗一只幼虫。对照：6个重复，每个重复6株幼苗，每个幼苗3只幼虫。

2)流程：

每一个重复含有播种到透明矩形盘(15cmX25cm)的6颗种子，盘子放置在网内限制幼虫的活动范围，每一重复使用6只幼虫感染。将盘置于25％和75％湿度的条件下，感染72小时评估感染。结果如表4所示，mCry1Fa对小地老虎和草地贪夜蛾的活体生测的抗性远远高于Cry1Fa，本发明的mCry1Fa基因具有更好的抗虫效果，更好的保护植株。

3)评估

植株—分类未损伤的，损伤的或在子叶下切割的。对各重复进行分级：1(未损伤或经商有一些咬痕的)至9(整个植株被切掉并且80％以上的组织被食)，结果如表4和图4所示。

4)技术效果

本发明的mCry1Fa基因转入植物后，所获得的高表达mCry1Fa蛋白的转基因植物小地老虎抗性优于高表达Cry1Fa蛋白的转基因植物。

表2

表3mCry1Fa植株离体生测致死率

注：本发明的mCry1Fa对小地老虎和草地贪夜蛾的致死效率远远高于Cry1Fa，本发明的mCry1Fa的基因具有更好的杀虫效果

表4mCry1Fa对小地老虎的活体生测结果

注：mCry1Fa对小地老虎的活体生测的抗性远远高于Cry1Fa，本发明的mCry1Fa基因具有更好的抗虫效果，更好的保护植株

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本申请作了详尽的描述，但在本申请基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本申请精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本申请要求保护的范围。

序列表

<110> 隆平生物技术（海南）有限公司

<120> 一种植物抗虫蛋白及其编码基因和应用

<130> 20200515

<160> 15

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1818

<212> DNA

<213> Bacillus thuringiensis

<400> 1

atggagaaca acatacagaa tcagtgcatt ccctttaact gcctcaacaa tcctgaagta 60

gagattctca acgaagagag gtcgactggc agattgccgt tagacatctc cctgtccctt 120

acacgtttcc tgttgtctga gtttgttcca ggtgtgggag ttgcgtttgg cctcttcgac 180

ctcatctggg gcttcatcac tccatctgat tggagcctct ttcttctcca gattgaacag 240

ttgattgaac aaaggattga gaccttggaa aggaatcggg ccatcactac ccttcgtggc 300

ttagcagaca gctatgagat ctacattgaa gcactaagag agtgggaagc caatcctaac 360

aatgcccaac tgagagaaga tgtgcgtata cgctttgcta acacagatga tgctttgatc 420

acagccatca acaacttcac ccttaccagc ttcgagatcc ctcttctctc ggtctatgtt 480

caagctgcta acctgcactt gtcactactg cgcgacgctg tgtcgtttgg gcaaggttgg 540

ggactggaca tagctactgt caacaatcac tacaacagac tcatcaatct gattcatcga 600

tacacgaaac attgtttgga tacctacaat cagggattgg agaacctgag aggtactaac 660

actcgccaat gggccaggtt caatcagttc aggagagacc ttacacttac tgtgttagac 720

atagttgctc tctttccgaa ctacgatgtt cgtacctatc cgattcaaac gtcatcccaa 780

cttacaaggg agatctacac cagttcagtc attgaagact ctccagtttc tgcgaacata 840

cccaatggtt tcaacagggc tgagtttgga gtcagaccac cccatctcat ggacttcatg 900

aactctttgt ttgtgactgc agagactgtt agatcccaaa ctgtgtgggg aggacactta 960

gttagctcac gcaacacggc tggcaatcgt atcaactttc ctagttacgg ggtcttcaat 1020

cccgggggcg ccatctggat tgcagatgaa gatccacgtc ctttctatcg gaccttgtca 1080

gatcctgtct tcgtccgagg aggctttggc aatcctcact atgtactcgg tcttagggga 1140

gtggcctttc aacaaactgg tacgaatcac acccgcacat tcaggaactc cgggaccatt 1200

gactctctag atgagatacc acctcaagac aacagcggcg caccttggaa tgactactcc 1260

catgtgctga atcatgttac ctttgtgcgc tggccaggtg agatctcagg ttccgactca 1320

tggagagcac caatgttctc ttggacgcat cgtagcgcta cccccacaaa caccattgat 1380

ccagagagaa tcactcagat tcccttggtg aaggcacaca cacttcagtc aggaactaca 1440

gttgtaagag ggccggggtt cacgggagga gacattcttc gacgcactag tggaggacca 1500

ttcgcgtaca ccattgtcaa catcaatggg caacttcccc aaaggtatcg tgccaggata 1560

cgctatgcct ctactaccaa tctaagaatc tacgttacgg ttgcaggtga acggatcttt 1620

gctggtcagt tcaacaagac aatggatacc ggtgatccac ttacattcca atctttctcc 1680

tacgccacta tcaacaccgc gttcaccttt ccaatgagcc agagcagttt cacagtaggt 1740

gctgatacct tcagttcagg caacgaagtg tacattgaca ggtttgagtt gattccagtt 1800

actgccacac tcgagtaa 1818

<210> 2

<211> 1818

<212> DNA

<213> Bacillus thuringiensis

<400> 2

atggagaaca acatacagaa tcagtgcgtc ccctacaact gcctcaacaa tcctgaagta 60

gagattctca acgaagagag gtcgactggc agattgccgt tagacatctc cctgtccctt 120

acacgtttcc tgttgtctga gtttgttcca ggtgtgggag ttgcgtttgg cctcttcgac 180

ctcatctggg gcttcatcac tccatctgat tggagcctct ttcttctcca gattgaacag 240

ttgattgaac aaaggattga gaccttggaa aggaatcggg ccatcactac ccttcgtggc 300

ttagcagaca gctatgagat ctacattgaa gcactaagag agtgggaagc caatcctaac 360

aatgcccaac tgagagaaga tgtgcgtata cgctttgcta acacagatga tgctttgatc 420

acagccatca acaacttcac ccttaccagc ttcgagatcc ctcttctctc ggtctatgtt 480

caagctgcta acctgcactt gtcactactg cgcgacgctg tgtcgtttgg gcaaggttgg 540

ggactggaca tagctactgt caacaatcac tacaacagac tcatcaatct gattcatcga 600

tacacgaaac attgtttgga tacctacaat cagggattgg agaacctgag aggtactaac 660

actcgccaat gggccaggtt caatcagttc aggagagacc ttacacttac tgtgttagac 720

atagttgctc tctttccgaa ctacgatgtt cgtacctatc cgattcaaac gtcatcccaa 780

cttacaaggg agatctacac cagttcagtc attgaagact ctccagtttc tgcgaacata 840

cccaatggtt tcaacagggc tgagtttgga gtcagaccac cccatctcat ggacttcatg 900

aactctttgt ttgtgactgc agagactgtt agatcccaaa ctgtgtgggg aggacactta 960

gttagctcac gcaacacggc tggcaatcgt atcaactttc ctagttacgg ggtcttcaat 1020

cccgggggcg ccatctggat tgcagatgaa gatccacgtc ctttctatcg gaccttgtca 1080

gatcctgtct tcgtccgagg aggctttggc aatcctcact atgtactcgg tcttagggga 1140

gtggcctttc aacaaactgg tacgaatcac acccgcacat tcaggaactc cgggaccatt 1200

gactctctag atgagatacc acctcaagac aacagcggcg caccttggaa tgactactcc 1260

catgtgctga atcatgttac ctttgtgcgc tggccaggtg agatctcagg ttccgactca 1320

tggagagcac caatgttctc ttggacgcat cgtagcgcta cccccacaaa caccattgat 1380

ccagagagaa tcactcagat tcccttggtg aaggcacaca cacttcagtc aggaactaca 1440

gttgtaagag ggccggggtt cacgggagga gacattcttc gacgcactag tggaggacca 1500

ttcgcgtaca ccattgtcaa catcaatggg caacttcccc aaaggtatcg tgccaggata 1560

cgctatgcct ctactaccaa tctaagaatc tacgttacgg ttgcaggtga acggatcttt 1620

gctggtcagt tcaacaagac aatggatacc ggtgatccac ttacattcca atctttctcc 1680

tacgccacta tcaacaccgc gttcaccttt ccaatgagcc agagcagttt cacagtaggt 1740

gctgatacct tcagttcagg caacgaagtg tacattgaca ggtttgagtt gattccagtt 1800

actgccacac tcgagtaa 1818

<210> 3

<211> 605

<212> PRT

<213> Bacillus thuringiensis

<400> 3

Met Glu Asn Asn Ile Gln Asn Gln Cys Ile Pro Phe Asn Cys Leu Asn

1 5 10 15

Asn Pro Glu Val Glu Ile Leu Asn Glu Glu Arg Ser Thr Gly Arg Leu

20 25 30

Pro Leu Asp Ile Ser Leu Ser Leu Thr Arg Phe Leu Leu Ser Glu Phe

35 40 45

Val Pro Gly Val Gly Val Ala Phe Gly Leu Phe Asp Leu Ile Trp Gly

50 55 60

Phe Ile Thr Pro Ser Asp Trp Ser Leu Phe Leu Leu Gln Ile Glu Gln

65 70 75 80

Leu Ile Glu Gln Arg Ile Glu Thr Leu Glu Arg Asn Arg Ala Ile Thr

85 90 95

Thr Leu Arg Gly Leu Ala Asp Ser Tyr Glu Ile Tyr Ile Glu Ala Leu

100 105 110

Arg Glu Trp Glu Ala Asn Pro Asn Asn Ala Gln Leu Arg Glu Asp Val

115 120 125

Arg Ile Arg Phe Ala Asn Thr Asp Asp Ala Leu Ile Thr Ala Ile Asn

130 135 140

Asn Phe Thr Leu Thr Ser Phe Glu Ile Pro Leu Leu Ser Val Tyr Val

145 150 155 160

Gln Ala Ala Asn Leu His Leu Ser Leu Leu Arg Asp Ala Val Ser Phe

165 170 175

Gly Gln Gly Trp Gly Leu Asp Ile Ala Thr Val Asn Asn His Tyr Asn

180 185 190

Arg Leu Ile Asn Leu Ile His Arg Tyr Thr Lys His Cys Leu Asp Thr

195 200 205

Tyr Asn Gln Gly Leu Glu Asn Leu Arg Gly Thr Asn Thr Arg Gln Trp

210 215 220

Ala Arg Phe Asn Gln Phe Arg Arg Asp Leu Thr Leu Thr Val Leu Asp

225 230 235 240

Ile Val Ala Leu Phe Pro Asn Tyr Asp Val Arg Thr Tyr Pro Ile Gln

245 250 255

Thr Ser Ser Gln Leu Thr Arg Glu Ile Tyr Thr Ser Ser Val Ile Glu

260 265 270

Asp Ser Pro Val Ser Ala Asn Ile Pro Asn Gly Phe Asn Arg Ala Glu

275 280 285

Phe Gly Val Arg Pro Pro His Leu Met Asp Phe Met Asn Ser Leu Phe

290 295 300

Val Thr Ala Glu Thr Val Arg Ser Gln Thr Val Trp Gly Gly His Leu

305 310 315 320

Val Ser Ser Arg Asn Thr Ala Gly Asn Arg Ile Asn Phe Pro Ser Tyr

325 330 335

Gly Val Phe Asn Pro Gly Gly Ala Ile Trp Ile Ala Asp Glu Asp Pro

340 345 350

Arg Pro Phe Tyr Arg Thr Leu Ser Asp Pro Val Phe Val Arg Gly Gly

355 360 365

Phe Gly Asn Pro His Tyr Val Leu Gly Leu Arg Gly Val Ala Phe Gln

370 375 380

Gln Thr Gly Thr Asn His Thr Arg Thr Phe Arg Asn Ser Gly Thr Ile

385 390 395 400

Asp Ser Leu Asp Glu Ile Pro Pro Gln Asp Asn Ser Gly Ala Pro Trp

405 410 415

Asn Asp Tyr Ser His Val Leu Asn His Val Thr Phe Val Arg Trp Pro

420 425 430

Gly Glu Ile Ser Gly Ser Asp Ser Trp Arg Ala Pro Met Phe Ser Trp

435 440 445

Thr His Arg Ser Ala Thr Pro Thr Asn Thr Ile Asp Pro Glu Arg Ile

450 455 460

Thr Gln Ile Pro Leu Val Lys Ala His Thr Leu Gln Ser Gly Thr Thr

465 470 475 480

Val Val Arg Gly Pro Gly Phe Thr Gly Gly Asp Ile Leu Arg Arg Thr

485 490 495

Ser Gly Gly Pro Phe Ala Tyr Thr Ile Val Asn Ile Asn Gly Gln Leu

500 505 510

Pro Gln Arg Tyr Arg Ala Arg Ile Arg Tyr Ala Ser Thr Thr Asn Leu

515 520 525

Arg Ile Tyr Val Thr Val Ala Gly Glu Arg Ile Phe Ala Gly Gln Phe

530 535 540

Asn Lys Thr Met Asp Thr Gly Asp Pro Leu Thr Phe Gln Ser Phe Ser

545 550 555 560

Tyr Ala Thr Ile Asn Thr Ala Phe Thr Phe Pro Met Ser Gln Ser Ser

565 570 575

Phe Thr Val Gly Ala Asp Thr Phe Ser Ser Gly Asn Glu Val Tyr Ile

580 585 590

Asp Arg Phe Glu Leu Ile Pro Val Thr Ala Thr Leu Glu

595 600 605

<210> 4

<211> 605

<212> PRT

<213> Bacillus thuringiensis

<400> 4

Met Glu Asn Asn Ile Gln Asn Gln Cys Val Pro Tyr Asn Cys Leu Asn

1 5 10 15

Asn Pro Glu Val Glu Ile Leu Asn Glu Glu Arg Ser Thr Gly Arg Leu

20 25 30

Pro Leu Asp Ile Ser Leu Ser Leu Thr Arg Phe Leu Leu Ser Glu Phe

35 40 45

Val Pro Gly Val Gly Val Ala Phe Gly Leu Phe Asp Leu Ile Trp Gly

50 55 60

Phe Ile Thr Pro Ser Asp Trp Ser Leu Phe Leu Leu Gln Ile Glu Gln

65 70 75 80

Leu Ile Glu Gln Arg Ile Glu Thr Leu Glu Arg Asn Arg Ala Ile Thr

85 90 95

Thr Leu Arg Gly Leu Ala Asp Ser Tyr Glu Ile Tyr Ile Glu Ala Leu

100 105 110

Arg Glu Trp Glu Ala Asn Pro Asn Asn Ala Gln Leu Arg Glu Asp Val

115 120 125

Arg Ile Arg Phe Ala Asn Thr Asp Asp Ala Leu Ile Thr Ala Ile Asn

130 135 140

Asn Phe Thr Leu Thr Ser Phe Glu Ile Pro Leu Leu Ser Val Tyr Val

145 150 155 160

Gln Ala Ala Asn Leu His Leu Ser Leu Leu Arg Asp Ala Val Ser Phe

165 170 175

Gly Gln Gly Trp Gly Leu Asp Ile Ala Thr Val Asn Asn His Tyr Asn

180 185 190

Arg Leu Ile Asn Leu Ile His Arg Tyr Thr Lys His Cys Leu Asp Thr

195 200 205

Tyr Asn Gln Gly Leu Glu Asn Leu Arg Gly Thr Asn Thr Arg Gln Trp

210 215 220

Ala Arg Phe Asn Gln Phe Arg Arg Asp Leu Thr Leu Thr Val Leu Asp

225 230 235 240

Ile Val Ala Leu Phe Pro Asn Tyr Asp Val Arg Thr Tyr Pro Ile Gln

245 250 255

Thr Ser Ser Gln Leu Thr Arg Glu Ile Tyr Thr Ser Ser Val Ile Glu

260 265 270

Asp Ser Pro Val Ser Ala Asn Ile Pro Asn Gly Phe Asn Arg Ala Glu

275 280 285

Phe Gly Val Arg Pro Pro His Leu Met Asp Phe Met Asn Ser Leu Phe

290 295 300

Val Thr Ala Glu Thr Val Arg Ser Gln Thr Val Trp Gly Gly His Leu

305 310 315 320

Val Ser Ser Arg Asn Thr Ala Gly Asn Arg Ile Asn Phe Pro Ser Tyr

325 330 335

Gly Val Phe Asn Pro Gly Gly Ala Ile Trp Ile Ala Asp Glu Asp Pro

340 345 350

Arg Pro Phe Tyr Arg Thr Leu Ser Asp Pro Val Phe Val Arg Gly Gly

355 360 365

Phe Gly Asn Pro His Tyr Val Leu Gly Leu Arg Gly Val Ala Phe Gln

370 375 380

Gln Thr Gly Thr Asn His Thr Arg Thr Phe Arg Asn Ser Gly Thr Ile

385 390 395 400

Asp Ser Leu Asp Glu Ile Pro Pro Gln Asp Asn Ser Gly Ala Pro Trp

405 410 415

Asn Asp Tyr Ser His Val Leu Asn His Val Thr Phe Val Arg Trp Pro

420 425 430

Gly Glu Ile Ser Gly Ser Asp Ser Trp Arg Ala Pro Met Phe Ser Trp

435 440 445

Thr His Arg Ser Ala Thr Pro Thr Asn Thr Ile Asp Pro Glu Arg Ile

450 455 460

Thr Gln Ile Pro Leu Val Lys Ala His Thr Leu Gln Ser Gly Thr Thr

465 470 475 480

Val Val Arg Gly Pro Gly Phe Thr Gly Gly Asp Ile Leu Arg Arg Thr

485 490 495

Ser Gly Gly Pro Phe Ala Tyr Thr Ile Val Asn Ile Asn Gly Gln Leu

500 505 510

Pro Gln Arg Tyr Arg Ala Arg Ile Arg Tyr Ala Ser Thr Thr Asn Leu

515 520 525

Arg Ile Tyr Val Thr Val Ala Gly Glu Arg Ile Phe Ala Gly Gln Phe

530 535 540

Asn Lys Thr Met Asp Thr Gly Asp Pro Leu Thr Phe Gln Ser Phe Ser

545 550 555 560

Tyr Ala Thr Ile Asn Thr Ala Phe Thr Phe Pro Met Ser Gln Ser Ser

565 570 575

Phe Thr Val Gly Ala Asp Thr Phe Ser Ser Gly Asn Glu Val Tyr Ile

580 585 590

Asp Arg Phe Glu Leu Ile Pro Val Thr Ala Thr Leu Glu

595 600 605

<210> 5

<211> 1134

<212> DNA

<213> p35s nt

<400> 5

ccattgccca gctatctgtc actttattgt gaagatagtg gaaaaggaag gtggctccta 60

caaatgccat cattgcgata aaggaaaggc catcgttgaa gatgcctctg ccgacagtgg 120

tcccaaagat ggacccccac ccacgaggag catcgtggaa aaagaagacg ttccaaccac 180

gtcttcaaag caagtggatt gatgtgatat ctccactgac gtaagggatg acgcacaatc 240

ccactatcct tcgcaagacc cttcctctat ataaggaagt tcatttcatt tggagaggac 300

acgctgacaa gctgactcta gcagatctac cgtcttcggt acgcgctcac tccgccctct 360

gcctttgtta ctgccacgtt tctctgaatg ctctcttgtg tggtgattgc tgagagtggt 420

ttagctggat ctagaattac actctgaaat cgtgttctgc ctgtgctgat tacttgccgt 480

cctttgtagc agcaaaatat agggacatgg tagtacgaaa cgaagataga acctacacag 540

caatacgaga aatgtgtaat ttggtgctta gcggtattta tttaagcaca tgttggtgtt 600

atagggcact tggattcaga agtttgctgt taatttaggc acaggcttca tactacatgg 660

gtcaatagta tagggattca tattataggc gatactataa taatttgttc gtctgcagag 720

cttattattt gccaaaatta gatattccta ttctgttttt gtttgtgtgc tgttaaattg 780

ttaacgcctg aaggaataaa tataaatgac gaaattttga tgtttatctc tgctccttta 840

ttgtgaccat aagtcaagat cagatgcact tgttttaaat attgttgtct gaagaaataa 900

gtactgacag tattttgatg cattgatctg cttgtttgtt gtaacaaaat ttaaaaataa 960

agagtttcct ttttgttgct ctccttacct cctgatggta tctagtatct accaactgac 1020

actatattgc ttctctttac atacgtatct tgctcgatgc cttctcccta gtgttgacca 1080

gtgttactca catagtcttt gctcatttca ttgtaatgca gataccaagc ggcc 1134

<210> 6

<211> 253

<212> DNA

<213> nos nt

<400> 6

gatcgttcaa acatttggca ataaagtttc ttaagattga atcctgttgc cggtcttgcg 60

atgattatca tataatttct gttgaattac gttaagcatg taataattaa catgtaatgc 120

atgacgttat ttatgagatg ggtttttatg attagagtcc cgcaattata catttaatac 180

gcgatagaaa acaaaatata gcgcgcaaac taggataaat tatcgcgcgc ggtgtcatct 240

atgttactag atc 253

<210> 7

<211> 552

<212> DNA

<213> cPAT NT

<400> 7

atgtctccgg agaggagacc agttgagatt aggccagcta cagcagctga tatggccgcg 60

gtttgtgata tcgttaacca ttacattgag acgtctacag tgaactttag gacagagcca 120

caaacaccac aagagtggat tgatgatcta gagaggttgc aagatagata cccttggttg 180

gttgctgagg ttgagggtgt tgtggctggt attgcttacg ctgggccctg gaaggctagg 240

aacgcttacg attggacagt tgagagtact gtttacgtgt cacataggca tcaaaggttg 300

ggcctaggat ccacattgta cacacatttg cttaagtcta tggaggcgca aggttttaag 360

tctgtggttg ctgttatagg ccttccaaac gatccatctg ttaggttgca tgaggctttg 420

ggatacacag cccggggtac attgcgcgca gctggataca agcatggtgg atggcatgat 480

gttggttttt ggcaaaggga ttttgagttg ccagctcctc caaggccagt taggccagtt 540

acccagatct ga 552

<210> 8

<211> 1993

<212> DNA

<213> pUbi nt

<400> 8

ctgcagtgca gcgtgacccg gtcgtgcccc tctctagaga taatgagcat tgcatgtcta 60

agttataaaa aattaccaca tatttttttt gtcacacttg tttgaagtgc agtttatcta 120

tctttataca tatatttaaa ctttactcta cgaataatat aatctatagt actacaataa 180

tatcagtgtt ttagagaatc atataaatga acagttagac atggtctaaa ggacaattga 240

gtattttgac aacaggactc tacagtttta tctttttagt gtgcatgtgt tctccttttt 300

ttttgcaaat agcttcacct atataatact tcatccattt tattagtaca tccatttagg 360

gtttagggtt aatggttttt atagactaat ttttttagta catctatttt attctatttt 420

agcctctaaa ttaagaaaac taaaactcta ttttagtttt tttatttaat aatttagata 480

taaaatagaa taaaataaag tgactaaaaa ttaaacaaat accctttaag aaattaaaaa 540

aactaaggaa acatttttct tgtttcgagt agataatgcc agcctgttaa acgccgtcga 600

cgagtctaac ggacaccaac cagcgaacca gcagcgtcgc gtcgggccaa gcgaagcaga 660

cggcacggca tctctgtcgc tgcctctgga cccctctcga gagttccgct ccaccgttgg 720

acttgctccg ctgtcggcat ccagaaattg cgtggcggag cggcagacgt gagccggcac 780

ggcaggcggc ctcctcctcc tctcacggca ccggcagcta cgggggattc ctttcccacc 840

gctccttcgc tttcccttcc tcgcccgccg taataaatag acaccccctc cacaccctct 900

ttccccaacc tcgtgttgtt cggagcgcac acacacacaa ccagatctcc cccaaatcca 960

cccgtcggca cctccgcttc aaggtacgcc gctcgtcctc cccccccccc cctctctacc 1020

ttctctagat cggcgttccg gtgcatggtt agggcccggt agttctactt ctgttcatgt 1080

ttgtgttaga tccgtgtttg tgttagatcc gtgctgctag cgttcgtaca cggatgcgac 1140

ctgtacgtca gacacgttct gattgctaac ttgccagtgt ttctctttgg ggaatcctgg 1200

gatggctcta gccgttccgc agacgggatc gatttcatga ttttttttgt ttcgttgcat 1260

agggtttggt ttgccctttt cctttatttc aatatatgcc gtgcacttgt ttgtcgggtc 1320

atcttttcat gctttttttt gtcttggttg tgatgatgtg gtctggttgg gcggtcgttc 1380

tagatcggag tagatttctg tttcaaacta cctggtggat ttattaattt tggatctgta 1440

tgtgtgtgcc atacatattc atagttacga attgaagatg atggatggaa atatcgatct 1500

aggataggta tacatgttga tgcgggtttt actgatgcat atacagagat gctttttgtt 1560

cgcttggttg tgatgatgtg gtgtggttgg gcggtcgttc attcgttcta gatcggagta 1620

gaatactgtt tcaaactacc tggtgtattt attaattttg gaactgtatg tgtgtgtcat 1680

acatcttcat agttacgagt ttaagatgga tggaaatatc gatctaggat aggtatacat 1740

gttgatgtgg gttttactga tgcatataca tgatggcata tgcagcatct attcatatgc 1800

tctaaccttg agtacctatc tattataata aacaagtatg ttttataatt attttgatct 1860

tgatatactt ggatgatggc atatgcagca gctatatgtg gattttttta gccctgcctt 1920

catacgctat ttatttgctt ggtactgttt cttttgtcga tgctcaccct gttgtttggt 1980

gttacttctg cag 1993

<210> 9

<211> 195

<212> DNA

<213> 35s nt

<400> 9

ctgaaatcac cagtctctct ctacaaatct atctctctct ataataatgt gtgagtagtt 60

cccagataag ggaattaggg ttcttatagg gtttcgctca tgtgttgagc atataagaaa 120

cccttagtat gtatttgtat ttgtaaaata cttctatcaa taaaatttct aattcctaaa 180

accaaaatcc agtgg 195

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> Cry1Fa-393F

<400> 10

cgtcatccca acttacaagg 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> Cry1Fa-930R

<400> 11

catgattcag cacatgggag 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> CF5

<400> 12

cattcgcgta caccattgtc 20

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> cr5

<400> 13

accagcaaag atccgttcac 20

<210> 14

<211> 23

<212> DNA

<213> 18srRNA-F

<400> 14

ccatccctcc gtagttagct tct 23

<210> 15

<211> 22

<212> DNA

<213> 18srRNA-R

<400> 15

cctgtcggcc aaggctatat ac 22

Claims (10)

1.一种用于植物抗虫的蛋白质，其特征在于，所述蛋白质的氨基酸序列为SEQ ID NO:3。

2.一种抗虫基因，其特征于，所述抗虫基因包含编码如权利要求1所述的蛋白质的基因序列。

3.如权利要求2所述的抗虫基因，其特征在于，所述抗虫基因的核苷酸序列为SEQ IDNO:1。

4.一种含有如权利要求2或3所述抗虫基因的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系。

5.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包含如权利要求2所述的抗虫基因。

6.如权利要求5所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体中依次包含以下基因结构：

来自玉米泛素基因启动子；如权利要求2或3所述的抗虫基因；胭脂碱合成酶的终止子；编码膦丝菌素乙酰转移酶基因；来自花椰菜花叶病毒的终止子。

7.如权利要求1所述的用于植物抗虫的蛋白质或者权利要求2或3所述的抗虫基因或含有权利要求2或3所述抗虫基因的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系在植物抗虫中的应用，其特征在于，所述应用为：a)制备具有抗地老虎和/或草地贪夜蛾效果的药剂；b)培育具有或提高抗地老虎和/或草地贪夜蛾能力的转基因植物。

8.一种培育具有或提升抗地老虎和/或草地贪夜蛾能力的植物的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：将权利要求2或3所述抗虫基因导入受体植物中，得到转基因植物。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述植物选自单子叶植物或双子叶植物。

10.如权利要求8或9所述的方法，其特征在于，所述植物为玉米。

Images