BR102014003618A2

BR102014003618A2 - Métodos para controle de pragas

Info

Publication number: BR102014003618A2
Application number: BR102014003618-0A
Authority: BR
Inventors: Derong Ding; Jie Pang; Chao Han
Original assignee: Beijing Dabeinong Tech Group; Beijing Dabeinong Technology Group Co Ltd Biotech Ct; Beijing Green Agrosino Plant Prot Technology Co Ltd
Priority date: 2013-02-25
Filing date: 2014-02-17
Publication date: 2014-10-29
Also published as: US20140242048A1; PH12014000062A1; CN103190316A; AR096286A1

Abstract

MÉTODOS PARA CONTROLE DE PRAGAS A presente invenção refere-se a um método para controlar as pragas de Sesamia inferens, compreendendo a etapa de colocar em contato Sesamia inferens com proteína Cry1B. Sesamia inferens é controlado pela proteína Cry1B tendo atividade pesticida contra Sesamia inferens, que é produzido nas plantas. Comparado com o controle agrícola, o controle químico e o controle de biologia usado atualmente na técnica anterior, o presente pedido pode proteger toda a planta durante todo o período de crescimento dos danos de Sesamia inferen. Além disso, não provoca poluição e nenhum resíduo e proporciona um efeito de controle estável e completo. Também é simples, prático e econômico.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTODOS PARA CONTROLE DE PRAGAS".

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS [001] Este pedido reivindica prioridade ao pedido de patente chinesa número 2013100587355 depositado em 25 de fevereiro de 2013 intitulado "Methods for controlling pest", que é aqui incorporado para referência na sua totalidade.

CAMPO TÉCNICO

[002] O presente pedido proporciona um método para o controle de pragas, em particular, um método para o controle de pragas de Se-samia inferens por proteína Cry1 B expressa em uma planta. ANTECEDENTES DA TÉCNICA [003] Sesamia inferens pertence a Lepidoptera, Noctuidae, que é uma praga polífaga. Além do milho, ela também ataca muitas outras colheitas de gramíneas, tais como o arroz, cana de açúcar, sorgo e semelhantes. Esta praga amplamente se distribui na China central e sudeste, especialmente na maior área de plantação de arroz do sul da província de Shaanxi e na província de Henan. Larva de Sesamia inferens fura o tronco das culturas e faz com que ele fique oco ou até mesmo resulta na morte de toda a planta. Os buracos causados pela broca Sesamia inferens são geral mente grandes, com uma massa de fécula defecada fora da haste. Acontece seriamente em terras baixas e os campos de milho em consórcio com trigo e milho de verão são afetados mais seriamente do que o milho de primavera. Milho e sorgo são culturas alimentares importantes na China. Sesamia inferens provoca a perda muito grande de grãos a cada ano. Ela ainda afeta as condições de vida das populações locais. Atualmente, o controle agrícola, o controle químico e controle biológico são normalmente aplicados para controlar Sesamia inferens. [004] Controle agrícola é um método para gerir globalmente múl- tiplos fatores de todo o sistema ecológico de terras agrícolas. Por meio da regulação de culturas, pragas e fatores ambientais, um ambiente ecológico de terra é criado, o que é propício para o crescimento das culturas e desvantajoso para a invasão de Sesamia inferens. Tratamento de hospedeiros que hibernam de Sesamia inferens, reforma do sistema de cultivo, plantio de culturas resistentes a Sesamia inferens, aplicação de culturas armadilha e intercultura e similares são as principais medidas para reduzir o dano de Sesamia inferens. Porque as demandas de distribuição e produção da cultura devem ser garantidas, a aplicação de controle agrícola é limitada e não pode servir como uma das medidas de emergência. Ela não funciona quando Sesamia inferens invade. [005] O controle químico, isto é, controle de pesticidas, é um método para matar pragas pelo uso de pesticidas químicos. O controle químico é uma parte importante do tratamento abrangente de Sesamia inferens. É rápido, prático, simples e econômico. O controle químico é uma medida indispensável para a emergência quando Sesamia inferens surta. Sesamia inferens pode ser eliminada antes que cause danos e perdas utilizando controle químico. Métodos de controle químico atuais incluem, principalmente, grânulos de fármacos, espalhamento de solo envenenado, pulverização de solução médica, fumigação dos adultos hibernando em pilhas de palha, etc. Mas o controle químico também tem suas limitações. Por exemplo, a operação inadequada pode geralmente causam fitotoxicidade de colheita, resistência a pragas e a fármacos. Além disso, os inimigos naturais também podem ser mortos por pesticidas. Os pesticidas químicos causam poluição ambiental e destroem o ecossistema agrícola também. Além disso, os resíduos de pesticidas podem representar uma ameaça para a segurança de pessoas e animais e levam a outros resultados graves. [006] O controle biológico é um método para controlar popula- ções de pragas, utilizando alguns organismos benéficos ou metaboli-tos biológicos, que, finalmente, reduzem ou eliminam as pragas. O controle biológico é seguro para humanos e animais e causa menos poluição ao meio ambiente. E algumas pragas podem ser controladas em longo prazo, utilizando o controle biológico. Mas o efeito de controle é geral mente instável, e o investimento não pode ser coordenado de acordo com as diferentes ocorrências de ataque de Sesamia inferens. [007] A fim de resolver as limitações do controle agrícola, o controle químico e o controle biológico em aplicações práticas, os cientistas descobriram que, por meio de transfecção de genes que codificam a proteína pesticida em plantas, algumas plantas transgênicas resistentes a insetos foram obtidas para controlar as pragas. Proteína pesticida Cry1B é uma das numerosas proteínas pesticidas, que é uma proteína de cristal parasporal insolúvel produzida por Bacillus thuringi-ensis. [008] Proteína Cry1B é levada por insetos e que entra em seu intestino e esta protoxina de proteína tóxica é dissolvida no intestino médio do inseto sob condições alcalinas. Extremidades C- e N- da proteína são digeridas por uma protease alcalina e este vira-se para a protoxina de fragmentos ativos. Estes fragmentos ativos se ligam aos receptores na membrana das células epiteliais do intestino médio de insetos e inserem-se na membrana celular, o que provoca lesões de perfuração da membrana celular. Danifica o equilíbrio de pressão os-mótica e pH dentro e fora da membrana celular, interrompe o processo de digestão e, eventualmente, resulta na morte do inseto. [009] Ficou provado que as plantas transgênicas Cry1B podem resistir a pragas de lepidópteros, como Ostrinia nubilalis, Plutella xyl-lostella. No entanto, até agora não há nenhum relatório sobre a aplicação de plantas transgênicas expressando proteínas Cry1B para controlar Sesamia inferens.

SUMÁRIO [0010] O presente pedido de patente consiste em proporcionar um método para controlar as pragas. É, pela primeira vez para controlar Sesamia inferens pela produção de plantas transgênicas expressando proteína Cry1B. O presente pedido supera eficazmente as limitações técnicas do estado da técnica, tais como controle agrícola, controle químico e controle biológico. [0011] Em um aspecto, o presente pedido proporciona um método para o controle de Sesamia inferens, compreendendo uma etapa de colocar em contato Sesamia inferens com proteína Cry1 B. [0012] Em algumas modalidades, a proteína é a proteína CryIBa Cry1 B. [0013] Em algumas modalidades, a proteína CryIBa está presente em uma célula vegetal que exprime a proteína CryIBa, e a referida Sesamia inferens entra em contato com a CryIBa pela ingestão da célula. [0014] Em algumas modalidades, a proteína CryIBa está presente na planta transgênica que expressa a proteína CryIBa, e Sesamia inferens entra em contato com a proteína CryIBa pela ingestão de um tecido de planta transgênica, de tal modo que o crescimento de Sesamia inferens é suprimido ou mesmo resulta na morte de Sesamia inferens para alcançar o controle de danos causados por Sesamia inferens. [0015] A planta transgênica está em qualquer período de crescimento. [0016] O tecido das plantas transgênicas é selecionado a partir do grupo consistindo em lâmina, talo, borla, orelha, anteras e filamentos. [0017] O controle de danos causados por Sesamia inferens é independente do local de plantação ou tempo de plantação. [0018] A planta é selecionada a partir do grupo que consiste em milho, arroz, sorgo, trigo, milho, algodão, junco, cana do açúcar, água de bambu, fava e colza. [0019] Em algumas modalidades, antes da etapa de colocar em contato, uma etapa de cultivo de uma planta que contém um polinu-cleotídeo que codifica a proteína Cry1 Ba é realizada. [0020] Em algumas modalidades, a sequência de aminoácidos da proteína CryIBa compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2. A sequência de nucleotídeos que codifica a proteína CryIBa compreende uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 4. [0021] Com base nas soluções técnicas acima, a planta adicionalmente compreende pelo menos uma segunda sequência de nucleotídeos, que é diferente daquela que codifica a proteína Cry1 Ba. [0022] Em algumas modalidades, o segundo nucleotídeo codifica uma proteína pesticida tipo Cry, proteína pesticida tipo VIP, um inibidor da protease, lectinas, ?-amilase ou peroxidase. [0023] Em outras modalidades, o segundo nucleotídeo codifica uma proteína Cry1Ab/Ac, proteína CrylAc, proteína Cry1 Ab/Ac/Ac, proteína Cry1 Fa ou proteína Vip3A. [0024] Ainda em algumas modalidades, o segundo nucleotídeo compreende uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 6. [0025] Alternativamente, o segundo nucleotídeo é dsRNA que inibe o(s) gene(s) importante(s) de uma praga alvo. [0026] No presente pedido, proteína Cry1B é expressa em uma planta transgênica acompanhada pelas expressões de uma ou mais proteínas pesticidas Tipo Cry e/ou proteínas pesticidas tipo Vip. Esta coexpressão de mais do que um tipo de toxinas pesticidas em uma mesma planta transgênica pode ser alcançada através de transfecção e expressão dos genes de interesse em plantas através da engenharia genética. Além disso, a proteína Cry1B pode ser expressa em uma planta (Progenitora 1) por meio de operações de engenharia genética e proteína pesticida tipo Cry e/ou proteínas pesticidas Tipo VIP podem ser expressas na segunda planta (Progenitora 2) através de uma operação de engenharia genética. A progênie expressando todos os genes de Progenitora 1 e Progenitora 2 pode ser obtida pelo cruzamento de Progenitora 1 e Progenitora 2. [0027] Interferência de RNA (RNAi), refere-se a uma degradação altamente conservada e eficaz de mRNA homólogo específico induzido por RNA de duplo filamento (dsRNA) durante a evolução. Portanto, a tecnologia RNAi é aplicada para especificamente encerrar ou desligar a expressão de um gene específico da praga alvo na presente a-pli cação. [0028] Ambos Sesamia inferens e Ostrinia nubilalis pertencem a Lepidoptera, Noctuidae. Ambos são pragas polífagas, mas obviamente plantas apetite de gramíneas. Normalmente, a maioria deles prejudica milho, arroz, sorgo, cana de açúcar e assim por diante. Apesar disso, Sesamia inferens e Ostrinia nubilalis são duas espécies definitiva e completamente diferentes em biologia. As principais diferenças entre eles são mostradas como a seguir: [0029] Sesamia inferens pertence Ncctuidae enquanto Ostrinia nubilalis pertence a Pyralidae. [0030] Áreas de distribuição são diferentes. Sesamia inferens amplamente se distribui na China central e no sudeste, especialmente na maior área de plantação de arroz do sul da província de Shaanxi e Henan e área de plantio de milho do sudoeste da China. Além da China, Sesamia inferens também se distribui nos países do Sudeste Asiático que plantam arroz, milho e cana de açúcar, incluindo Vietnã, Laos, índia, etc. Enquanto Ostrinia nubilalis inclui broca do milho asiática e broca do milho europeia, em que broca do milho asiática se distribui no Leste e sudoeste da China, principalmente o plantio de milho e sorgo; broca do milho europeia se distribui principalmente na província de Xinjiang da China e da Europa, América do Norte, África Ocidental e Ásia Menor.

[0031] Hábitos nocivos são diferentes. Sesamia inferens pertence a pragas chatas. Sua larva nasce na safra de caules, causando mudas de coração morto ou a morte de toda a planta. Os buracos causados pela broca Sesamia inferens são geralmente grandes, com uma massa de fécula defecada fora do caule, que é imprensada entre a bainha da folha e o caule. A lâmina e a bainha da folha prejudicadas ficam amarelas. Larvas de Sesamia inferens recentemente chocadas não dispersam, mas se agrupam no lado interno da bainha da folha, bainha da folha chata e caulicle. Após os 3 estágios, há dispersão de larvas nas plantas vizinhas e pode prejudicar 5-6 cepas. Este é um período grave mente danoso de Sesamia inferens. Se a temperatura se volta para acima de 10 °C no início da primavera, Sesamia inferens ocorre antes. Acontece Ela aparece seriamente em terras baixas e campos de milho em consórcio com trigo e milho de verão são afetados mais seriamente do que o milho de primavera. Em contraste, as larvas de Ostrinia nubilalis irão concentrar-se primeiro depois de chocadas e depois irão se espalhar sobre as partes jovens das plantas para prejudicar a mesma. Larvas recém-chocadas podem girar e cair e migram para as plantas vizinhas, com o auxílio do vento, para prejudicá-las. Normalmente existem cinco estágios de larvas, e as larvas residem principalmente na folha coração jovem, borla, folha bracteal e filamento e as ingerem. As folhas do coração prejudicadas mostram muitos furos horizontais depois de desdobradas. Depois de quarto estágio, a maioria das larvas perfuram folhas secas. Ostrinia nubilalis pode prejudicar diversas partes de plantas de milho acima do solo. A eficiência fotossintética pode ser reduzida depois que as folhas são mordidas. A borla é fácil de ser quebrada depois de furada, resultando que a polinização é afetada. Se as folhas bracteal e filamento são furadas, alguns grãos vão desaparecer e grãos não totalmente crescidos serão causados. Se as folhas secas, hastes ou espigas são furadas, túneis serão feitos os quais irão então destruir o transporte de água e nutrientes, aumentando as taxas de desramação quebradas e diminuindo o rendimento dos grãos. Plantas de milho plantadas na primavera, verão e outono em todo lugar podem ser prejudicadas, especialmente plantas de milho plantadas no verão. [0032] As características morfológicas são diferentes. [0033] Morfologia dos ovos diferente: Ovo de Sesamia inferen é oblato em forma, com linhas finas verticais e horizontais na superfície. O ovo é de cor branca, inicialmente, mas fica cinza amarelo com a i-dade. Eles cruzam ou se espalham, e se organizam em 2-3 linhas em geral. Em contraste, o ovo de Ostrinia nubilalis é oval plano em forma, com manchas pretas perto da extremidade frontal da parte de eclosão. Dezenas de ovos se organizam de forma irregular e escamosa. [0034] Morfologia das larvas diferente: o comprimento do corpo larval de Sesamia inferen é relatado como sendo cerca de 30 mm para o instar final. Na aparência, a cápsula cabeça é de cor variada de cas-tanho-avermelhado ao marrom escuro e as superfícies dorsal e traseira são prunosus de luz. Há cinco a sete estágios. Mas a parte dorsal de larvas de Ostrinia nubilalis é colorida de amarelo-branco ruivo claro e escuro. Cápsula cabeça e pronoto são de cor marrom escuro. Linha dorsal é óbvia e ladeada por duas linhas subdorsais marrom escuras, pouco claras. Segmentos abdominais 1-8 têm duas fileiras de verrugas, em que quatro verrugas estão na fileira da frente e duas verrugas estão na outra fileira. [0035] Morfologia de Pupa diferente: Pupa de Sesamia inferen é de 13-18 mm de comprimento, robusta e marrom avermelhada. Abdô- nnen é coberto com pó cinza; ápice abdominal tem 3 espinhos em forma de gancho. Em contraste, a pupa de Ostrinia nubilalis é de cor marrom amarelada. Costas e abdômen são cobertos com muitas rugas horizontais. Há 5-8 espinhos em forma de gancho na extremidade do abdômen. [0036] Morfologia de adulto diferente: Traça fêmea de Sesamia inferen adulto é de 15 mm de comprimento e envergadura é de cerca de 30 mm. A cabeça e o tórax são castanho-amarelados na cor o abdômen varia do amarelo claro ao pálido na cor. Antenas são filamento-sas, as asas anteriores são quase retangulares e marrom acinzentadas claras na cor. Quatro pequenas manchas pretas são organizadas quadrilateralmente. Traça macho é de cerca de 12 mm e a envergadura é de 27 mm de comprimento. A antena é tipo concha. Em contraste, as asas anteriores das traças de Ostrinia nubilalis são marrom amareladas na cor, com duas tiras horizontais em forma de onda, marrons entre as quais existe duas tiras curtas, marrom amareladas. As asas menores são na cor bege. A cor das asas das fêmeas é mais clara do que a dos machos. As asas anteriores das fêmeas são de cor amarela e as tiras horizontais internas e externas e Motting não são tão óbvias como a dos machos. [0037] Hábito e regularidade de crescimento de surto são diferentes. Sesamia inferen aparece 2-4 gerações por ano, diminuindo com o aumento da altitude e aumentando com o aumento da temperatura. Por exemplo, 2-3 gerações ocorrem no planalto Yunnan-Guizhou por ano, 3-4 gerações ocorrem na província de Jiangsu e província de Zhejiang por ano, 4 gerações ocorrem na província de Jiangxi, província de Hunan, província de Hubei e província de Sichuan por ano, 4 -5 gerações ocorrem na província de Fujian, na província de Guangxi e cidade Kaiyuan da província de Yunnan e 6-8 gerações ocorrem no sul da província de Guangdong e Taiwan. Na zona temperada, a larva madura hiberna nos corpos residuais parasitas (como as folhas secas ou rizomas de bambu de água e arroz) ou no solo próximo ao solo. Em meados de março do ano seguinte (a temperatura acima de 10 SC) larvas começam a fase de pupa e começam a eclosão a 15 QC. No início de abril, elas começam a copular e ovidepositar, e depois de 3-5 dias, a cópula e a oviposição chegam ao cume. E o cume da eclosão acontece no final de abril. Adultos se escondem durante o dia e muitas vezes pousam entre plantas e ao anoitecer as atividades começam. Sua fototaxia é fraca e tempo de vida é de cerca de 5 dias. traças fêmeas começam a oviposição de 2-3 dias após a cópula e depois de 3-5 dias a oviposição atinge o cume. Elas preferem oviposição sobre o milho e mudas do lado do campo. Ovos se localizam principalmente no interior de bainhas foliares do segundo e terceiro segmentos perto do solo das plantas de milho das quais a haste é mais fina e o obvolvente da bainha da folha não é apertado, o que pode se considerado por mais de 80% da quantidade de oviposição. Cada fêmea pode gerar 240 ovos e a duração da oviposição da primeira geração é de 12 dias, e que a da segunda e da terceira gerações é de 5-6 dias. Estágio larval da primeira geração é cerca de 30 dias, a segunda geração de cerca de 28 dias, e a terceira geração de cerca de 32 dias. Fase de pupa é de 10-15 dias. Traça fêmea voa fracamente e oviposição é relativamente concentrada. A densidade populacional é alta e prejudica fortemente no lugar perto de fonte de insetos. Por outro lado, as gerações ocorridas para Ostrinia nubi/a/is obviamente dependem da latitude: na China, uma geração acima de 45 graus de latitude norte; duas gerações entre 45-40 graus de latitude norte, três gerações entre 40-30 graus de latitude norte; quatro gerações entre 30-25 graus; 5-6 gerações entre 25-20 graus de latitude Norte. Quanto maior a altitude, menos ocorrem as gerações. Duas a quatro gerações ocorrem na província de Sichuan. Mais gerações irão ocorrer se a temperatura for muito elevada e a alti- tude for baixa. Normalmente, as larvas maduras hibernam em folhas secas e espiga de plantas de milho ou folhas secas de plantas de sor-go e girassol. Em março e abril do ano seguinte, as larvas começam a fase de pupa e começam a eclosão após cerca de dez dias. Adultos iniciam suas atividades no meio da noite e tem uma forte força de voo. Sua fototaxia é forte e tempo de vida é de 5-10 dias. Eles preferem oviposição ao lado da veia meidan sob a folha de milho, que é 50 cm acima do solo e que o crescimento é vigoroso. Cada fêmea pode gerar 350-700 ovos e a duração de oviposição é de 3-5 dias. Ostrinia nubila-lis desenvolve bem em condições quentes e úmidas. Danos sérios a Ostrinia nubilalis se a temperatura no inverno for alta e a quantidade de inimigos naturais parasitando for baixa, o que beneficia a reprodução de Ostrinia nubilalis. Danos ligeiros a Ostrinia nubilalis se for seco durante a oviposição, o que resulta na curvatura das folhas de milho, o que resulta que a massa de ovo de Ostrinia nubilalis é fácil de cair das folhas e provoca a morte dos ovos. [0038] Em conclusão, pode-se confirmar que Sesamia inferen e Ostrinia nubilalis são pragas diferentes com relação genética e elas não podem copular para obter descendentes. [0039] O genoma de plantas, tecidos vegetais ou células vegetais descritos no presente pedido, referem-se a qualquer material genético nas plantas, tecidos de plantas ou células da planta, incluindo o núcleo, plastídios e o genoma mitocondrial. [0040] Tal como descrito no presente pedido, os polinucleotídeos e/ou nucleotídeos formam um "gene" completo, que codifica proteínas ou polipeptídeos das células hospedeiras de interesse. É fácil para o versado na técnica perceber que os polinucleotídeos e/ou nucleotídeos no presente pedido podem ser introduzidos sob o controle das sequências reguladoras do hospedeiro alvo.

[0041] Como bem conhecido por um versado na técnica, o DNA existe normalmente como filamentos duplos, que são complementares um com o outro. Quando o DNA é replicado em plantas, outros filamentos de DNA complementares também são gerados. Por conseguinte, os polinucleotídeos exemplificados na listagem de sequência e filamentos complementares dos mesmos estão compreendidos no presente pedido. O "filamento de codificação" geralmente utilizado na técnica refere-se a um filamento de ligação com um filamento antis-sentido. Para a expressão da proteína in vivo, um dos filamentos de DNA é normalmente transcrito para uma filamento complementar de mRNA, o qual serve como modelo de expressão da proteína. Na verdade, o mRNA é transcrito a partir do filamento "antissentido" de DNA. "Filamento de sentido" ou "filamento de codificação" contém uma série de códons (códon é um tripleto de nucleotídeos que codifica um ami-noácido específico), o qual pode ser lido como quadros de leitura aberta (ORF) que correspondem a genes que codificam proteínas alvo ou peptídeos. RNA e PNA (ácido nucleico peptídico), que são funcionalmente equivalentes ao DNA exemplificado também foram contemplados no presente pedido. [0042] Molécula de ácido nucleico ou os seus fragmentos foram hibridizados com o gene CryIBa sob condições rigorosas no presente pedido. Quaisquer métodos comuns de hibridação de ácidos nucleicos ou amplificação podem ser utilizados para identificar a presença do gene CryIBa no presente pedido. Moléculas de ácidos nucleicos ou fragmentos dos mesmos são capazes de hibridizar especificamente com outras moléculas de ácido nucleico, sob determinadas condições. Na presente aplicação, se duas moléculas de ácido nucleico podem formar uma estrutura de ácido nucleico antiparalelo com filamentos duplos, pode ser determinado que estas duas moléculas podem hibridizar uma com a outra especificamente. Se duas moléculas de ácidos nucleicos são totalmente complementares, uma das duas moléculas é chamada como o "complemento" da outra. Neste pedido, quando todos os nucleotídeos de uma molécula de ácido nucleico que é complementar com o nucleotídeo correspondente a uma outra molécula de ácido nucleico, é identificado que as duas moléculas são "completamente complementares". Se duas moléculas de ácidos nucleicos que podem hibridizar com a outra de modo a que possam se hibridar e se associar mutuamente com estabilidade suficiente sob as condições "de baixa severidade" pelo menos normais, estes dois ácidos nucleicos são identificados como "mínimo complementar". Do mesmo modo, se duas moléculas de ácido nucleico podem hibridar com a outra a fim de que elas possam emparelhar e ligar-se uma a outra com a estabilidade suficiente sob condições "de alta severidade" normais, é identificado que estes dois ácidos nucleicos são "complementares". Desvio de "totalmente complementar" pode ser permitido, desde que o desvio não impeça completamente que as duas moléculas formem uma estrutura de filamento duplo. Uma molécula de ácido nucleico que pode ser feita como um iniciador ou uma sonda deve ter sequências suficientemente complementares para formar uma estrutura de filamento duplo estável no solvente específico a uma concentração específica de sal. [0043] Neste pedido, a sequência homóloga refere-se basicamente a uma molécula de ácido nucleico, que pode hibridar especificamente com o filamento complementar de uma outra molécula de ácido nucleico combinada sob condição de "alta severidade". As condições de severidade para a hibridação de DNA são bem conhecidas por um versado na técnica, tal como tratamento com solução de 6,0 * cloreto de sódio / hidróxido de sódio (SSC) a cerca de 45 °Ce lavagem com 2,0 * SSC, a 50 QC. Por exemplo, a concentração de sal na etapa de lavagem é selecionada a partir de 2,0 * SSC e 50 °C para as condições de "baixa severidade" e 0,2 * SSC e 50 °C para as condições de "alta severidade". Além disso, a temperatura na etapa de lavagem va- ria de 22 °C para as condições de "baixa severidade" a 65 9C durante as condições de "alta severidade". Tanto a temperatura quanto a concentração de sal podem variar em conjunto ou apenas uma destas duas variáveis varia. Em algumas modalidades, a condição de severidade utilizada neste pedido pode ser como a seguir. SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 4 é especificamente hibridada em 6,0 * SSC e SDS a 0,5%, solução a 65 QC. Em seguida, a membrana foi lavada uma vez em 2 * SSC e solução de SDS a 0,1% e solução de 1 * SSC e SDS a 0,1%, respectivamente. [0044] Por conseguinte, as sequências de insetos resistentes que podem hibridar com a SEQ ID NO: 3 e/ou SEQ ID NO: 4, em condições de severidade foram compreendidas no presente pedido. Estas sequências foram, pelo menos, cerca de 40%-50% de homologia, ou cerca de 60%, 65% ou 70% de homologia, ainda, pelo menos, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais homólogos com as sequências do presente pedido. [0045] Os genes e proteínas descritos no presente pedido de patente incluem não apenas as sequências especificamente exemplificadas, mas também as partes e/ou seus fragmentos (incluindo deleção (ões) no interior e/ou no final da proteína de comprimento completo), variantes, mutantes, substitutos (proteínas que contêm o(s) aminoáci-do(s) substituído(s)), quimeras e proteínas de fusão que retêm a atividade pesticida dos mesmos. As "variantes" ou "variação" refere-se às sequências de nucleotídeos que codificam a mesma proteína ou que codificam uma proteína equivalente com atividade pesticida. A "proteína equivalente" refere-se às proteínas que possuem a mesma ou substancialmente a mesma bioatividade de anti-Sesam/a inferens que a das proteínas reivindicadas. [0046] O "fragmento" ou "truncamento" do DNA ou sequências de proteína, como descrito neste pedido de patente refere-se a uma parte ou uma forma modificada artificialmente dos mesmos (por exemplo, as sequências adequadas para expressão da planta) do DNA original ou sequências proteicas (nucleotídeos ou aminoácidos) envolvidas no presente pedido. O comprimento da sequência da referida sequência é variável, mas que é suficientemente longo para assegurar que a proteína (codificada) é uma toxina de inseto. [0047] É fácil de modificar genes e construir mutantes genéticos utilizando técnicas convencionais, tais como a técnica de ponto de mutação conhecida. Outro exemplo é o método descrito na patente U.S. 5605793 de DNA aleatoriamente dividido e depois voltar a montá-lo para criar outras moléculas diferentes. Endonucleases comercialmente disponíveis podem ser usadas para fazer fragmentos de gene do gene de comprimento completo, e exonuclease também pode ser operada segundo os procedimentos padrão. Por exemplo, enzimas tais como Bal31 ou mutagênese dirigida ao local podem ser utilizadas para remover os nucleotídeos sistematicamente das extremidades destes genes. Várias enzimas de restrição podem também ser aplicadas para obter os genes que codificam fragmentos ativos. Em adição, os fragmentos ativos dessas toxinas podem ser obtidos diretamente através das proteases. [0048] No presente pedido, as proteínas equivalentes e/ou genes que codificam estas proteínas podem ser derivados de B.t. isolados e/ou bibliotecas de DNA. Existem muitas maneiras de se obter as proteínas pesticidas da aplicação. Por exemplo, os anticorpos produzidos especificamente contra a proteína pesticida divulgada e protegida no presente pedido de patente podem ser utilizados para identificar e isolar outras proteínas a partir de misturas de proteínas. Em particular, o anticorpo pode ser produzido contra a parte mais constante da proteína e a parte mais diferente de outras proteínas B.t. Estes anticorpos podem então ser utilizados para identificar especificamente as proteí- nas equivalentes com a atividade característica utilizando métodos de imunoprecipitação, ensaio imunoenzimático (ELISA) ou um ensaio de Western Blotting. É fácil de preparar os anticorpos contra as proteínas, proteínas equivalentes ou fragmentos de proteínas divulgadas no presente pedido, utilizando procedimentos convencionais na técnica. Os genes que codificam estas proteínas podem então ser obtidos a partir de micro-organismos. [0049] Devido à redundância de códons genéticos, uma variedade de sequências de DNA diferentes pode codificar uma mesma sequência de aminoácidos. Encontra-se disponível para um versado na técnica alcançar sequências de DNA que codificam uma mesma proteína ou substancialmente a mesma proteína. Estas sequências de DNA diferentes são constituídas no presente pedido. A "substancialmente mesma" proteína refere-se a uma sequência em que certos aminoácidos são substituídos, eliminados, adicionados ou inseridos, mas a atividade pesticida dos mesmos não é substancial mente afetada, e também inclui os fragmentos restantes da atividade pesticida. [0050] Substituição, eliminação ou adição de alguns aminoácidos de sequências de aminoácidos neste pedido é a técnica convencional na arte. Em algumas modalidades, uma tal alteração de aminoácido inclui: alterar características menores, isto é, a substituição de aminoácidos reservadas qual a dose não influenciam significativamente a dobragem e/ou atividade da proteína; curto apagamento, normalmente uma deleção de cerca de 1-30 aminoácidos; curto alongamento do a-mino ou do terminal carboxilo, tal como um resíduo de metionina no alongamento amino-terminal; curto ligando peptídico, tal como cerca de 20-25 resíduos de comprimento. [0051] Os exemplos de substituição conservativa são as substituições que acontecem nos seguintes grupos de aminoácidos: aminoácidos básicos (tais como arginina, lisina e histidina), aminoácidos ácidos (tais como ácido glutâmico e ácido aspártico), aminoácidos polares (por exemplo, glutamina e asparagina), aminoácidos hidrofóbicos (tais como leucina, isoleucina e valina), aminoácidos aromáticos (por e-xemplo, fenilalanina, triptofano e tirosina), e pequenos aminoácidos moleculares (tais como glicina, alanina, serina e treonina e metionina). As substituições de aminoácidos em geral que não mudam a atividade específica são bem conhecidos na especialidade e foram já descritas, por exemplo, "Protein", editado por N. Neurath e R.L. Hill, publicado pela Academic Press, Nova Iorque, em 1979. As substituições mais comuns são Ala / Ser, Vai / lie, Asp / Glu, Thr / Ser, Ala / Thr, Ser / Asn, Ala / Vai, Ser / Gly, Tyr / Phe, Ala / Pro, Lys / Arg, Asp / Asn, Leu / lie, Leu / Vai, Ala / Glu e Asp / Gly, e substituições reversas dos mesmos. [0052] Obviamente, para um versado na técnica, uma tal substituição pode acontecer fora das regiões que são importantes para a função molecular e ainda causar a produção de polipeptídeos ativos. Para o polipeptídeo do presente pedido, os resíduos de aminoácidos que são necessários para a sua atividade e escolhidos como os resíduos substituídos podem ser identificados de acordo com os métodos conhecidos da técnica, tais como mutagênese dirigida ao local ou muta-gênese por varredura de alanina (vide, por exemplo, Cunningham and Wells, 1989, Science 244:1081-1085). A segunda técnica é efetuada através da introdução de mutações em cada resíduo positivamente carregado na molécula, e a detecção da atividade resistente a insetos das moléculas de mutação obtidas, de modo a identificar os resíduos de aminoácidos que são importantes para a atividade das moléculas. Sítios de interação enzima-substratos podem também ser determinados através da análise da sua estrutura tridimensional, que pode ser determinada por algumas técnicas, como análise de ressonância magnética nuclear (RMN), cristalografia ou marcação por fotoafinidade (vi- de, por exemplo, de Vos et al., 1992, Science 255:306-312, ; Smith, et al., 1992, J. Mol. Biol 224:899-904; Wlodaver et al., 1992, FEBS Let-ters 309:59-64). [0053] Na aplicação, a proteína Cry1B inclui, mas não está limitada à proteína Cry1Ba3, Cry1Bb1, Cry1Bc1, Cry1Bd2 ou Cry1Be3, ou os fragmentos pesticidas ou domínios funcionais com atividade pesticida contra Sesamia inferen, cujas sequências de aminoácidos são pelo menos 70% de homologia com a da proteína acima mencionada. [0054] Por conseguinte, as sequências de aminoácidos que têm certa homologia com as sequências de aminoácidos expostas em SEQ ID NO. 1 e/ou SEQ ID NO. 2 também estão compreendidas no presente pedido. A semelhança / homologia de sequências entre estas sequências e as sequências descritas no presente pedido são tipicamente mais do que 60%, de preferência mais do que 75%, mais preferivelmente mais do que 80%, ainda mais preferivelmente mais do que 90% e mais preferivelmente mais do que 95%. Os polinucleotídeos e as proteínas preferidas do presente pedido também podem ser definidos de acordo com faixas mais específicas da homologia e/ou semelhança. Por exemplo, eles têm uma homologia e/ou semelhança de 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% com as sequências descritas neste pedido. [0055] As sequências reguladoras descritas neste pedido de patente incluem, mas não estão limitadas a um promotor, peptídeo de trânsito, terminador, potenciador, sequência líder, íntrons e outras sequências reguladoras que podem ser operacionalmente ligadas à proteína Cry1 B. [0056] O promotor é um promotor expressável em plantas, em que o referido "um promotor expressável em plantas" refere-se a um promotor que assegura que as sequências codificadoras ligadas ao promotor podem ser expressas em células de plantas. O promotor expressável em plantas pode ser um promotor constitutivo. Os exemplos de promotores capazes de dirigir a expressão constitutiva em plantas incluem, mas não estão limitados ao promotor 35S derivado do vírus do mosaico da couve-flor, promotor Ubi, promotor do gene GOS2 derivado de arroz e semelhantes. Alternativamente, o promotor expressável em plantas pode ser um promotor específico do tecido, o que significa que o nível de expressão dirigido por este promotor em alguns tecidos de plantas, tais como em clorênquima, é mais elevado do que em outros tecidos da planta (pode ser medido através do teste convencional de RNA), tal como o promotor de PEP carboxilase. [0057] Alternativamente, o promotor expressável em plantas pode ser promotores indutíveis de ferida. Promotores indutíveis de ferida ou promotores que direcionam maneiras de expressão induzível de ferida referem-se a promotores pelos qual o nível de expressão das sequências de codificação pode ser aumentado em comparação com aqueles notavelmente sob as condições normais de crescimento quando as plantas são sujeitas a ferida mecânica ou ferida causada pelo roer de um inseto. Os exemplos de promotores induzíveis de feridas incluem, mas não estão limitados a promotores de genes inibidor de protease da batata e do tomate (pino I e pino II) e o promotor do gene inibidor de protease de milho (MPI). [0058] O peptídeo de trânsito (também chamado de sequência de sinal secretário ou sequência líder) direciona os produtos de genes para organelas específicas ou compartimento celular. Para a proteína receptora, o peptídeo de trânsito pode ser heterogêneo. Por exemplo, as sequências codificadoras do peptídeo de trânsito do cloroplasto são usadas para levar para o cloroplasto, ou sequência reservada 'KDEL' é usada para conduzir para o retículo endoplasmático ou CTPP do gene da lectina de cevada é usado para conduzir para o vacúolo. [0059] As sequências líder incluem, mas não estão limitadas a sequências líder de pequeno vírus de RNA, tais como sequência líder de EMCV (região de não codificação 5' do vírus da encefalomiocardite); sequências líder do vírus Y da batata, tal como sequência líder de MDMV (vírus do Mosaico do Milho anão); proteína de ligação de cadeia pesada de imunoglobulina humana (BIP); sequência líder não traduzida do mRNA da proteína de revestimento do vírus do Mosaico da Alfafa (AMV RNA4); sequência líder do vírus do Mosaico do Tabaco (TMV). [0060] O potenciador inclui, mas não se limita ao potenciador do vírus do Mosaico da Couve-flor (CaMV), potenciador do vírus do Mosaico de Figwort (FMV), potenciador do vírus anel corrosivo de cravos (CERV), potenciador do vírus do Mosaico da Veia da Mandioca (CsVMV), potenciador do vírus do Mosaico da mirabilis (MMV), potenciador do vírus de ondulação de folha amarela Cestrum (CmYLCV), vírus Multan da folha de algodão (CLCuMV), potenciador do vírus marmóreo amarelo de Commelina (CoYMV) e caulimovirus de sequência clorótica de amendoim (PCLSV). [0061] Para a aplicação da monocotilédone, os íntrons incluem, mas são limitados a íntrons hsp70 de milho, íntrons ubiquitina de milho, íntron 1 Adh, íntrons sacarose sintase ou íntrons Act1 de arroz. Para a aplicação de plantas dicotiledôneas, os íntrons incluem, mas não estão limitados a íntrons CAT-1, íntrons pKANNIBAL, íntrons PIV2 e íntrons "super ubiquitina". [0062] Os terminadores podem ser as sequências de sinal de poli-adenilação adequadas que desempenham um papel nas plantas. Eles incluem, mas não se limitam a sequência de sinal de poliadenilação derivada dos genes de nopalina sintetase (NOS) de Agrobacterium tumefaciens, sequência de sinal de poliadenilação derivada do gene inibidor de protease II (pino II), sequência de sinal de poliadenilação derivada do gene ssRUBISCO E9 da ervilha e sequência de sinal de poliadenilação derivada do gene a-tubulina. [0063] O termo "operativamente ligado", descrito neste pedido de patente refere-se a ligação de sequências de ácidos nucleicos, que proporciona as sequências da função pretendida das sequências ligadas. O termo "operativamente ligado" descrito no presente pedido pode ser um promotor de ligação com as sequências de interesse, o que faz a transcrição dessas sequências sob o controle e regulação do promotor. Quando a sequência de interesse codifica uma proteína e a expressão desta proteína é necessária, o termo "operativamente ligado" indica que a ligação do promotor e a referida sequência torna a transcrição obtida para ser eficazmente traduzida. Se a ligação entre o promotor e a sequência de codificação resulta em fusão da transcrição e a expressão da proteína de codificação são necessárias, uma tal ligação é gerada para certificar-se de que o primeiro códon de iniciação da tradução da transcrição obtida é o códon de iniciação da sequência de codificação. Alternativamente, se é necessária a ligação do promotor e a sequência de codificação resulta em fusão de tradução e a expressão da proteína de codificação, uma tal ligação é gerada para cer-tificar-se de que o primeiro códon de iniciação de tradução da sequência não traduzida 5' está relacionado com o promotor, e tal um modo de ligação faz com que a relação entre os produtos de tradução obtidos e a estrutura de leitura aberta que codifica a proteína de interesse conheça a estrutura de leitura. As sequências de ácidos nucleicos que podem ser operacionalmente ligadas incluem, mas não estão limitadas a sequências que fornecem a função de expressão do gene (ou seja, elementos de expressão do gene, tais como um promotor, a região não traduzida 5', íntrons, a região de codificação da proteína, a região não traduzida 3', sítios de poliadenilação e/ou terminadores de transcrição); sequências que fornecem a função de transferência de DNA e/ou integração (isto é, sequências de fronteira T-DNA, sítios de reconhecimento de enzima recombinante específica do local, sítios de reconhecimento de integrase); sequências que fornecem a função sele-cionável (isto é, marcadores de resistência a antibiótico, genes biossin-téticos); sequências que fornecem a função de marcadores de pontuação; sequências assistentes com a operação de sequências in vitro ou in vivo (sequências poliligantes, sequências recombinantes específicas do local) e sequências que fornecem a função de replicação (isto é, origens de replicação de bactérias, sequências de replicação autônoma, sequências centroméricas). [0064] O termo "pesticida" descrito no presente pedido, significa que ele é venenoso para as pragas das culturas. Mais especificamente, os insetos alvo são pragas Sesamia inferen Walker. [0065] Proteína Cry1 B desta aplicação é venenosa para pragas Sesamia inferen Walker. As plantas mencionadas na aplicação, especialmente o sorgo e milho, contêm DNA exógeno em seu genoma. O DNA exógeno contém sequências de nucleotídeos que codificam a proteína Cry1B. Quando Sesamia inferens contata com a proteína CryIBa através de alimentação com os tecidos dessas plantas trans-gênicas, o crescimento de Sesamia inferens é inibido ea morte de Sesamia inferens é causada eventualmente. O termo "inibição" refere-se a letal ou subletal. Ao mesmo tempo, as plantas devem ser normais em morfologia, e podem ser cultivadas com os meios normais para o consumo e/ou geração de produtos. Além disso, o requisito de pesticidas químicos ou biológicos da planta pode ser essencialmente eliminado (os pesticidas químicos ou biológicos são aqueles contra Sesamia inferen mirado pela proteína Cry1 B). [0066] O nível de proteínas cristalinas pesticidas (ICP), nos mate- riais de planta de expressão pode ser determinado utilizando vários métodos descritos neste campo, tais como o método de quantificação de mRNA que codifica a proteína pesticida no tecido através da utilização de iniciadores específicos, ou o método de quantificação do proteína pesticida direta e especificamente. [0067] O efeito pesticida de ICP nas plantas pode ser detectado por meio de testes diferentes. Os insetos alvo do presente pedido de patente são principalmente Sesamia inferen. [0068] A proteína Cry1B no presente pedido de patente pode ter as sequências de aminoácidos expostas em SEQ ID NO: 1 e/ou SEQ ID NO: 2 na listagem de sequência. A proteína contém não só a região codificadora de proteína Cry1B, mas também outros elementos, tais como as regiões que codificam proteínas marcadoras selecionáveis. [0069] Em adição, os cassetes de expressão contendo a sequência de nucleotídeos que codifica a proteína de Cry1B do presente pedido podem também ser coexpressos com, pelo menos, um tipo de proteínas codificadas por genes de resistência a herbicidas em plantas, o que resulta que as plantas transgênicas obtidas têm ambas uma elevada atividade pesticida e uma atividade de resistência ao herbicida. Os genes de resistência aos herbicidas incluem, mas não estão limitados a genes de resistência a glufosinato (tal como o gene bare o gene pat), genes de resistência a fenmedifam (por exemplo, gene pm-ph), genes de resistência a glifosato (tal como o gene EPSPS), genes de resistência a bromoxinil, genes de resistência a sulfonilureia, genes de resistência a dalapon, genes resistentes a cianamida ou genes de resistência resistentes a glutamina sintetase (tal como o PPT). [0070] Neste pedido, é ainda proporcionado um método de produção de plantas transgênicas capazes de expressar a proteína Cry1B (por exemplo, CryIBa) como descrito acima, que inclui uma etapa de introdução de DNA exógeno em uma célula de planta. O DNA exógeno refere-se a cassetes de expressão de genes, ou vetores recombinan-tes que codificam a proteína Cry1B. Os métodos para introduzir DNA exógeno em plantas incluem, mas não estão limitados a certos métodos convencionais, por exemplo, transfecção mediada por Agrobacte-rium, bombardeamento de partículas, consumo direto de DNA em pro-toplastos, eletroporação ou introdução de DNA mediada por silício. [0071] O presente pedido refere-se também a plantas transgênicas capazes de expressar a proteína Cry1B (por exemplo, CryIBa) obtida de acordo com o método tal como descrito acima. [0072] O presente pedido proporciona um método para controlar as pragas, com as seguintes vantagens: [0073] O controle baseado em causa interna. As técnicas anteriores são principalmente para controlar o mal das pragas Sesamia inferem por ação externa (ou seja, causa externa), tal como o controle a-grícola, o controle químico e controle biológico; enquanto o pedido é para controlar pragas Sesamia inferen através da proteína Cry1B produzida nas plantas que é capaz de matar pragas Sesamia inferen. [0074] Sem poluição e sem resíduo de fármacos. Embora o controle químico usado na técnica anterior tenha desempenhado um papel importante no controle da Sesamia inferen, também causou poluição, destruição e resíduos de fármacos e ao ecossistema humano, pecuário e agrícola; através da utilização do método de controle de pragas Sesamia inferen, estas consequências ruins podem ser eliminadas. [0075] Controle em todo o período de crescimento. Cada um dos métodos de controle de pragas de Sesamia inferen empregues na técnica anterior são em estágios, enquanto que o método do presente pedido é capaz de proteger as plantas, durante todo o seu período de crescimento. As plantas transgênicas (proteína Cry1B) podem se poupadas do mal de Sesamia inferen da germinação, crescimento, até florescer e fruticultura. [0076] Controle de toda a planta. A maior parte dos métodos de controle das pragas de Sesamia inferen da técnica anterior é localizada, tal como a pulverização da superfície da folha. Embora esta aplicação é para proteger toda a planta de Sesamia inferen, tais como folhas, caule, borla, ouvido, anteras e filamento da planta transgênica (proteína Cry1 B). [0077] Os efeitos estáveis. Pesticidas biológicos utilizados na técnica anterior são pulverizados diretamente na superfície da cultura, o que resulta na degradação das proteínas ativamente cristalizadas (incluindo proteína Cry1B) no ambiente. Comparado com isto, a proteína Cry1B mencionada no presente pedido é expressa na planta, deste modo evitando eficazmente a deficiência de instabilidade dos pesticidas biológicos na natureza. Além disso, os efeitos das plantas trans-gênicas (proteína Cry1B) deste pedido de controle são estáveis e consistentes em diferentes locais, tempo e origens genéticas. [0078] Ele é simples, prático e econômico. Pesticidas biológicos utilizados na técnica anterior são passíveis de serem degradados no meio ambiente, e, portanto, são obrigados a produção repetida e aplicação, o que traz dificuldades práticas na produção agrícola e, assim, aumentam muito o custo. A única coisa necessária para esta aplicação é plantar plantas transgênicas expressando proteínas Cry1B, sem a necessidade de outras medidas, de modo que a abundância de mão de obra, materiais e recursos financeiros são economizados. [0079] O efeito completo. O efeito de controle dos métodos existentes para controlar pragas Sesamia inferen é incompleto e só pode trazer um efeito de alívio. Comparado com isso, as plantas transgênicas (proteína Cry1B) desta aplicação podem resultar uma morte maciça de larvas recém-eclodidas de Sesamia inferen. Além disso, também podem significativamente inibir o progresso do desenvolvimento da rara sobrevivência da larva. Após 3 dias, as larvas ainda permanecem no estado incubado precoce ou no estado entre o estado incubado precoce e o estado de controle negativo, os quais são, obviamente, mal desenvolvidos, e o seu desenvolvimento foi interrompido. No entanto plantas transgênicas são geralmente um pouco prejudicadas. [0080] As soluções técnicas do presente pedido serão ainda descritas através das figuras anexas e exemplos como segue.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS [0081] A Figura 1 mostra o esquema para construir o vetor de clonagem recombinante DBN01-T contendo sequência de nucleotídeos Cry1Ba-01 para o controle de pragas no presente pedido; [0082] A Figura 2 mostra o esquema para construir o vetor de clonagem recombinante DBN100072 contendo sequência de nucleotídeo Cry1Ba-01 para o controle de pragas no presente pedido; [0083] A Figura 3 mostra os conteúdos relativos de mRNA de proteína pesticida CryIBa das plantas de milho transgênicas para o controle de pragas no presente pedido; [0084] A Figura 4 mostra o efeito de controle de plantas de milho transgênicas contra pragas de Sesamia inferen neste pedido; [0085] A Figura 5 mostra os conteúdos relativos de mRNA de proteína pesticida CryIBa das plantas de arroz transgênicas para o controle de pragas no presente pedido;

[0086] A Figura 6 mostra o efeito de controle de plantas de arroz transgênicas contra pragas de Sesamia inferen neste pedido. DESCRIÇÃO DETALHADA [0087] As soluções técnicas deste pedido para o controle de pragas serão ainda ilustradas através dos exemplos seguintes.

Exemplo 1: Obtenção e síntese de gene Cry1 Ba Obtenção da sequência de nucleotídeos Crv1 Ba [0088] A sequência de aminoácidos de proteína pesticida CrylBa-01 (1228 aminoácidos) foi apresentada como SEQ ID NO: 1 na lista- gem de sequência; sequência de nucleotídeos do gene Cry1Ba-01 (3687 nucleotídeos) que codifica a sequência de aminoácidos correspondente de proteína pesticida Cry1Ba-01 (1228 aminoácidos) foi a-presentada como SEQ ID NO: 3 na listagem de sequência; sequência de aminoácido de proteína pesticida Cry1Ba-02 (731 aminoácidos) foi apresentada como SEQ ID NO: 2 na listagem de sequência, a sequência de nucleotídeos do gene Cry1Ba-02 (2196 nucleotídeos) que codifica a sequência de aminoácidos correspondente de proteína pesticida Cry1 Ba-02(731 aminoácidos) foi apresentada como SEQ ID NO: 4 na listagem de sequência.

Obtenção de sequências de nucleotídeos Crv1 Ab/Ac e VIP3A [0089] Sequência de nucleotídeos de Cry1 Ab/Ac (1830 nucleotídeos) que codifica a sequência de aminoácidos correspondente da proteína pesticida Cry1 Ab/Ac (609 aminoácidos) foi apresentada como SEQ ID NO: 5 na listagem de sequência e a sequência de nucleotídeos de Vip3A (2370 nucleotídeos) que codifica a sequência de aminoácidos correspondente da proteína pesticida Vip3A (789 aminoácidos) foi apresentada como SEQ ID NO: 6 na listagem de sequência. Síntese da sequência de nucleotídeos como acima descrito [0090] A sequência de nucleotídeos Cry1Ba-01 (apresentada como SEQ ID NO: 3 na listagem de sequência), sequência de nucleotídeos Cry1Ba-02 (apresentada como SEQ ID NO: 4 na listagem de sequência), sequência de nucleotídeos Cry1 Ab/Ac (apresentada como SEQ ID NO: 5 na listagem de sequência) e a sequência de nucleotídeos Vip3A (apresentada como SEQ ID NO: 6 na listagem de sequência), foram sintetizadas por GenScript CO, LTD, Nanjing, P.R. China. A sequência de nucleotídeo Cry1Ba-01 sintetizada (SEQ ID NO: 3) foi ligada a um sítio de restrição Ascl na extremidade 5' e um sítio de restrição Hindlll na extremidade 3'. A sequência de nucleotídeo CrylBa-02 sintetizada (SEQ ID NO: 4) foi ligada a um sítio de restrição Spel na extremidade 5' e a um sítio de restrição Swal na extremidade 3'. A sequência de nucleotídeos Cry1Ab/Ac sintetizada (SEQ ID NO: 5) foi ligada a um sítio de restrição Ncol na extremidade 5' e a um sítio de restrição Kpnl na extremidade 3'. A sequência de nucleotídeos Vip3A sintetizada (SEQ ID NO: 6) foi ligada a um sítio de restrição Seal na extremidade 5' e a um sítio de restrição Spel na extremidade 3'. Exemplo 2: Construção de vetores de expressão recombinantes e a transfecção de Agrobacterium com os vetores de expressão recombinantes Construção dos vetores de clonagem recombinantes contendo o gene Crv1 B [0091] A sequência de nucleotídeo Cry1Ba-01 sintetizada foi sub-clonada no vetor de clonagem pGEM-T (Promega, Madison, USA, CAT: A3600), para obter o vetor de clonagem DBN01-T, seguindo as instruções da vetor pGEM-T Promega, e o processo de construção foi mostrado na Figura 1 (em que o amplificador é de genes de resistência a ampicilina; f1 é a origem de replicação do fago f1; LacZ é códon de iniciação de LacZ; SP6 é o promotor da RNA polimerase SP6; T7 é o promotor de RNA polimerase T7; Cry1Ba-01 é sequência de nucleotídeo Cry1 Ba-01 (SEQ ID NO: 3); MCS é múltiplos sítios de clonagem). [0092] O vetor de clonagem recombinante DBN01-T foi então transformado em célula competente T1 E. coli (Trnasgen, Beijing, China, o CAT: CD501) através do método de choque térmico. As condições de choque térmico foram como se segue: 50 ??. de células competentes de E. coli T1 e 10 ?? de plasmídeo de DNA (vetor de clonagem recombinante DBN01-T) foram incubados em banho-maria a 42 °C durante 30 segundos. Em seguida, as células de E .coli foram incubadas em banho-maria a 37 °C durante 1 h (100 rpm em um incubador com agitação) e, em seguida, foram cultivadas em uma placa de LB (10 g/L de triptona, 5 g/L de extrato de levedura, 10 g/L de NaCI, 15 g/L de ágar e o pH foi ajustado para 7,5 com NaOH) revestido na superfície com IPTG (isopropil-tio-beta-D-galactose glicosídeo), X-gal (5-bromo-4-cloro-3-indol-beta-D-galactose glicosídeo) e ampicilina (100 mg/L) durante a noite. As colônias brancas foram colhidas e cultivadas em caldo LB (10 g/L de triptona, 5 g/L de extrato de levedura, 10 g/L de NaCI, 100 mg/L de ampicilina e o pH foi ajustado para 7,5 com NaOH) a 37 °C durante a noite. Os plasmídeos dos mesmos foram extraídos utilizando o método da lise alcalina como se segue: o caldo de células foi centrifugado durante 1 min a 12000 rpm, o sobrenadante foi descartado e o pélete foi ressuspenso em 100 ?? de solução I arrefecida com gelo (25 mM de Tris-HCI, 10 mM de EDTA (ácido etilenodiami-notetracético) e 50 mM de glucose, pH 8,0), em seguida, 150 ?? de solução II preparada recentemente (NaOH a 0,2 M, 1% de SDS (dodecil-sulfato de sódio)) foi adicionada e o tubo foi invertido 4 vezes, misturado e, em seguida, colocado em gelo durante 3-5 minutos, 150 ?? de solução fria III (4M de acetato de potássio e 2M de ácido acético) foi adicionada, vigorosamente misturada imediatamente e incubada em gelo durante 5-10 minutos, a mistura foi centrifugada a 12000 rpm a 4 QC, durante 5 min, dois volumes de etanol anidro foram adicionados ao sobrenadante, misturados e, em seguida, colocados à temperatura ambiente durante 5 min, a mistura foi centrifugada a 12000 rpm a 4 °C durante 5 min, o sobrenadante foi descartado e o pélete foi seco depois lavado com etanol a 70% (V/V), 30 ?? de TE (10 mM de Tris-HCI, 1 mM de EDTA, pH 8,0) contendo RNase (20 mg / ml) foi adicionado para dissolver o precipitado, a mistura foi incubada a 37 °C em um banho de água durante 30 minutos para digerir o RNA e armazenado a -20 °C para utilização futura. [0093] Depois dos plasmídeos extraídos terem sido confirmados com as enzimas de restrição EcoRV e Styl, os clones positivos foram verificados através de sequenciamento. Os resultados mostraram que a sequência de nucleotídeos Cry1 Ba-01 inserida no vetor de clonagem recombinante DBN01-T era a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 3 na listagem de sequência, indicando que sequência de nucleotídeo Cry1 Ba-01 foi corretamente inserida. [0094] A sequência de nucleotídeos sintetizada Cry1Ba-02 foi inserida no vetor de clonagem pGEM-T para obter o vetor de clonagem recombinante DBN02-T seguinte ao processo para a construção de vetor de clonagem DBN01-T, como descrito acima, em que Cry1Ba-02 foi sequência de nucleotídeo Cry1Ba-02 (SEQ ID NO: 4). Verificou-se a sequência de nucleotídeos Cry1Ba-02 no vetor de clonagem recombinante DBN02-T como sendo inserida corretamente com a digestão de enzimas de restrição e sequenciamento. [0095] A sequência de nucleotídeos sintetizada Cry1Ab/Ac foi inserida no vetor de clonagem pGEM-T para obter o vetor de clonagem recombinante DBN03-T seguinte ao processo para a construção de vetor de clonagem DBN01-T, como descrito acima, em que Cry1Ab/Ac foi sequência de nucleotídeos Cry1 Ab/Ac (SEQ ID NO: 5). Verificou-se a sequência de nucleotídeos Cry1 Ab/Ac no vetor de clonagem recombinante DBN03-T como sendo inserida corretamente com digestão de enzimas de restrição e sequenciamento. [0096] A sequência de nucleotídeos sintetizada Vip3A foi inserida no vetor de clonagem pGEM-T para obter o vetor de clonagem recombinante DBN04-T a seguir o processo para a construção de vetor de clonagem DBN01-T, como descrito acima, em que a sequência de nucleotídeos Vip3A foi Vip3A (SEQ ID NO: 6). Verificou-se a sequência de nucleotídeos Vip3A no vetor de clonagem recombinante DBN04-T como sendo inserida corretamente com a digestão de enzimas de restrição e sequenciamento.

Construção dos vetores de expressão recombinantes contendo gene Crv1 B [0097] O vetor de clonagem recombinante DBN01-T e o vetor de expressão DBNBC-01 (Estrutura principal do Vetor: pCAMBIA2301, disponível a partir da instituição CAMBIA) foram digeridos com as enzimas de restrição Ascl e Hindlll. O fragmento da sequência de nu-cleotídeo Cry1Ba-01 clivada foi ligado entre os sítios de restrição Ascl e BamHI do vetor de expressão DBNBC-01 para construir o vetor de expressão recombinante DBN100072. É um método convencional bem conhecido para a construção do vetor de expressão através de digestão de enzimas de restrição. O esquema de construção foi mostrado na Figura 2 (Kan: gene da canamicina; RB: borda direita; promotor do gene de Ubi: ubiquitina de milho (ubiquitina), (SEQ ID NO: 7); CrylBa-01: sequência de nucleotídeo Cry1Ba-01 (SEQ ID NO: 3); Nos, termi-nador do gene da sintetase da nopalina (SEQ ID NO: 8); PMI: gene da isomerase fosfomanose (SEQ ID NO: 9); LB: borda esquerda). [0098] O vetor de expressão recombinante DBN100072 foi transformado em células competentes E. coli T1 com método de choque térmico como se segue: 50 ?? de células competentes de E. coli T1 e 10 ?? de plasmídeo de DNA (vetor de expressão recombinante DBN100072) foram incubadas em banho-maria a 42 °C d Lrante 30 segundos. Em seguida, as células de E. coli foram incubadas em banho-maria a 37 °C durante 1 h (100 rpm em um incubador com agitação) e, em seguida, foram cultivadas em uma placa sólida LB (10 g/L de trip-tona, 5 g/L de extrato de levedura, 10 g/L de NaCI, 15 g/L de ágar e o pH foi ajustado para 7,5 com NaOH) contendo 50 mg/L de canamicina a 37 °C durante 12 horas. As colônias brancas foram colhidas e cultivadas em caldo LB (10 g/L de triptona, 5 g/L de extrato de levedura, 10 g/L de NaCI, 50 mg/L de canamicina e o pH foi ajustado para 7,5 com NaOH) a 37 °C durante a noite. Os plasmídeos dos mesmos foram extraídos utilizando o método de lise alcalina. Depois os plasmídeos extraídos foram confirmados com as enzimas de restrição Ascl e Hindlll, os clones positivos foram verificados através de sequenciamento. Os resultados mostraram que a sequência de nucleotídeos entre os sítios de restrição Ascl e Hindlll no vetor de expressão recombinante DBN100072 era a sequência de nucleotídeos descrita em SEQ ID NO: 3 na listagem de sequência, ou seja sequência de nucleotídeos Cry1 Ba-01. [0099] Seguindo o processo para a construção do vetor de expressão recombinante DBN100072 como descrito acima, os vetores de clonagem recombinantes DBN01-T e DBN03-T foram digeridos com as enzimas de restrição Ascl / Hindlll e Ncol / Kpnl, respectivamente, para clivar a sequência de nucleotídeos Cry1 Ba-01 e a sequência de nucleotídeos Cry1Ab/Ac que, em seguida, foram inseridas no vetor de expressão DBNBC-01 para obter o vetor de expressão recombinante DBN100056. Digestão de enzimas de restrição e sequenciamento verificou que o vetor de expressão recombinante DBN100056 continha as sequências de nucleotídeos apresentada em SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO: 5 na listagem de sequência, ou seja, as sequências de nucleotídeos Cry1 Ba-01 e Cry1Ab/Ac. [00100] Seguindo o processo para a construção do vetor de expressão recombinante DBN100072 como descrito acima, os vetores de clonagem recombinantes DBN02-T e DBN04-T foram digeridos com as enzimas de restrição Spel / Swal e Seal / Spel, respectivamente, para clivar a sequência de nucleotídeos Cry1Ba-02 e a sequência de nucleotídeos Vip3A que, em seguida, foram inseridas no vetor de expressão DBNBC-01 para obter o vetor de expressão recombinante DBN 100083. Digestão de enzimas de restrição e sequenciamento verificou que o vetor de expressão recombinante DBN 100083 continha as sequências de nucleotídeos apresentada em SEQ ID NO: 4 e SEQ ID NO: 6 na listagem de sequência, ou seja, as sequências de nucleotídeos Cry1 Ba-02 e Vip3A.

Transfeccão de Aarobacterium tumefaciens com vetores de expressão recombinantes [00101] Vetores de expressão recombinante corretamente construídos DBN100072, DBN100056 e DBN100083 foram transfectados em Agrobacterium LBA4404 (Invitrgen, Chicago, EUA, Cat. No: 18313-015) seguinte a método de congelamento rápido com nitrogênio líquido como se segue: 100 ?? de Agrobacterium LBA4404 e 3 ?? de DNA do plasmídeo (vetor de expressão recombinante) foram colocados em nitrogênio líquido durante 10 min e, em seguida, incubados em banho-maria a 37 °C durante 10 min. Em seguida, as célula sde Agrobacterium LBA4404 transfectadas foram inoculadas em caldo LB e cultivadas a 28 °C, 200 rpm durante 2 horas e aspergidas sobre uma placa de LB contendo 50 mg/L de rifampicina (rifampicina) e 100 mg/L de canarmi-cina (canamicina) até colônias mono positiva aparecerem. As colônias monopositivas foram apanhadas e cultivadas e os plasmídeos foram extraídos das mesmas. Vetores de expressão recombinantes DBN100072, DBN100056 e DBN100083 foram verificados com as enzimas de restrição ahdi e Aatll. Os resultados mostraram que os vetores de expressão recombinantes DBN100072, DBN100056 e DBN 100083 eram corretos na estrutura, respectivamente.

Exemplo 3: Obtenção e verificação da planta de milho transgênica com gene Cry1B inserido Obtenção da planta de milho transgênica com gene Crv1 B inserido [00102] De acordo com o método convencional de transfecção de Agrobacterium, o cultivar de milho Zong 31 (Z31) foi cultivado em condições de esterilidade e o embrião jovem foi cocultivado com as cepas de Agrobacterium construídas na parte 3 do Exemplo 2, de modo a introduzir T-DNA nos vetores de expressão recombinantes DBN100072, DBN100056 e DBN100083 construídos na parte 2 do Exemplo 2 (incluindo sequência promotora do gene da Ubitiquina do milho, sequência de nucleotídeos Cry1Ba-01, sequência de nucleotí-deos Cry1Ba-02, sequência de nucleotídeos Cry1Ab/Ac, sequência de nucleotídeos Vip3A, gene PMI e sequência de terminador Nos) no ge-noma do milho. As plantas de milho que contêm sequência de nucleo-tídeo Cry1Ba-01, as plantas de milho que contêm sequências de nucleotídeos Cry1 Ba-01-Cry1 Ab/Ac plantas de milho contendo a sequência de nucleotídeos Cry1 Ba-02-Vip3A foram obtidas, respectivamente, e plantas de milho do tipo selvagem foram tomadas como controle. [00103] Como para a transfecção mediada por Agrobacterium de milho, em resumo, embrião jovem de milho imaturo foi isolado de grãos e em colocado contato com a suspensão de Agrobacterium, em que o Agrobacterium pode entregar a sequência de nucleotídeos Cry1Ba-01, sequência de nucleotídeos Cry1 Ba-01-Cry1 Ab/Ac ou sequência de nucleotídeos Cry1 Ba-02-Vip3A em pelo menos uma célula de um embrião jovem. (Etapa 1: etapa de infecção). Nesta etapa, de preferência, embrião jovem foi imerso em suspensão de Agrobacterium (DO660 = 0,4 ~ 0,6, meio de infecção (4,3 g/L de sal de MS, vitaminas MS, 300 mg/L de caseína, 68,5 g/L de sacarose, 36 g/L de glicose, 40 mg/L de acetossiringona (aS), 1 mg/L de ácido 2,4- diclorofenoxiacético (2,4-D), pH = 5,3)) para dar início à inoculação. Embrião jovem e Agrobacterium foram cocultivados por um período (3 dias) (Etapa 2: etapa cocultivo). De preferência, o embrião jovem foi cultivado em meio sólido (4,3 g/L de sal de MS, vitaminas MS, 300 mg/L de caseína, 20 g/L de sacarose, 10 g/L de glucose, 100 mg/L de acetosiringona (aS), 1 mg/L de ácido 2,4- diclorofenoxiacético (2,4-D) e 8 g/L de ágar, pH = 5,8) após a etapa de infecção. Após esta etapa de cocultivo, uma etapa seletiva de "recuperação" pode ser precedida. Na etapa de "recuperação", o meio de recuperação (4,3 g/L de sal de MS, vitaminas MS, 300 mg/L de caseína, 30 g/L de sacarose, 1 mg/L de ácido 2,4- diclorofenoxiacético (2, 4-D) e 8 g/L de ágar, pH = 5,8), contém pelo menos um tipo de antibiótico de inibição de Agrobacteri-um conhecido (cefamicina), sem o agente seletivo para transfecção de plantas (etapa 3: etapa de recuperação). De preferência, o embrião jovem foi cultivado em uma cultura de meio sólido contendo antibióticos, mas sem agente seletivo, de modo a eliminar o Agrobacterium e proporcionar um período de recuperação para as células infectadas. Então, o embrião jovem inoculado foi cultivado em meio contendo a-gente seletivo (manose) e o calo transfectado foi selecionado (Etapa 4: a etapa de seleção). De preferência, o embrião jovem foi cultivado em meio sólido seletivo contendo agente seletivo (4,3 g/L de sal de MS, vitaminas MS, 300 mg/L de caseína, 5 g/L de sacarose, 12,5 g/L de manose, 1 mg/L de ácido 2,4- diclorofenoxiacético (2,4- D) e 8 g/L de ágar, pH = 5,8), resultando no crescimento seletivo das células trans-fectadas. Em seguida, o calo foi regenerado em plantas (Etapa 5: etapa de regeneração). De preferência, o calo foi cultivado em meio sólido contendo agente seletivo (meio de diferenciação MS e meio de enraizamento MS) para se regenerar em plantas. [00104] O calo resistente obtido foi transferido para meio de diferenciação MS (4,3 g/L de sal de MS, vitaminas MS, 300 mg/L de caseína, 30 g/L de sacarose, 2 mg/L de 6-benziladenina, 5 g/L de manose e 8 g/L de ágar, pH = 5,8) e cultivado e diferenciado a 25 SC. As plân-tulas diferenciadas foram transferidas para o meio de enraizamento MS (sal de 2,15 g/Lof de MS, vitaminas MS, 300 mg/L de caseína, 30 g/L de sacarose, 1 mg/L de ácido indol-3-acético, e 8 g/L de ágar, pH = 5,8) e cultivadas até cerca de 10 cm de altura, a 25 SC. Em seguida, as plantas foram transferidas para e cultivadas na estufa até frutificação. Na estufa, as plantas de milho foram cultivadas a 28 QC durante 16 horas e temperatura de 20 SC durante 8 horas por dia.

Verificação de plantas de milho transaênicas com gene Crv1 B inserido utilizando a técnica TaaMan [00105] 100 mg de folhas de cada planta de milho transfectada (planta de milho transfectada com sequência de nucleotídeos CrylBa-01, sequência de nucleotídeos Cry1 Ba-01-Cry1 Ab/Ac ou sequência de nucleotídeos Cry1 Ba-02-Vip3A, respectivamente) foi tomada como amostra, respectivamente. O DNA genômico foi extraído da mesma usando Kit DNeasy Plant Maxi (Qiagen) e os números de cópias de gene Cry1B, gene Cry1 Ab/Ac e gene Vip3A foram quantificados através ensaio de PCR quantitativo de fluorescência à base de sonda de Taqman. O tipo selvagem da planta de milho foi tomado como um controle e analisado de acordo com os processos como descritos acima. As experiências foram realizadas em triplicado e os resultados eram os valores médios. [00106] O método específico para a detecção de números de cópias de gene Cry1B, gene Vip3A e gene Cry1 Ab/Ac foi descrito como se segue. [00107] Etapa 11: 100 mg de folhas de cada planta de milho transfectada (planta de milho transfectada com a sequência de Cry1 Ba-01, Cry1 Ba-01-Cry1 Ab/Ac ou Cry1 Ba-02-Vip3A, respectivamente) foram tomadas e moídas em homogeneizado em um almofariz em nitrogênio líquido, respectivamente. Isto foi em triplicado para cada amostra. [00108] Etapa 12: os DNAs genômicos das amostras acima referidos foram extraídos utilizando Kit DNeasy Plant Mini (Qiagen) seguindo as instruções do mesmo produto. [00109] Etapa 13: as concentrações de DNA de genoma das amostras acima foram determinadas utilizando NanoDrop 2000 (Thermo Scientific). [00110] Etapa 14: as concentrações de DNA de genoma foram a-justadas para a mesma faixa de 80-100 ng / mL. [00111] Etapa 15: os números de cópia das amostras foram quantificados usando ensaio de PCR quantitativo de fluorescência baseado em sonda de Taqman, a amostra quantificada com o número de cópias conhecido foi tomada como uma amostra padrão e a planta de milho do tipo selvagem foi tomada como controle. Ele foi realizado em triplicado para cada amostra e os resultados eram os valores médios. Os iniciadores e as sondas utilizadas na PCR quantitativa de fluorescência foram mostrados como abaixo. [00112] Os seguintes iniciadores e sonda foram usados para detectar sequência de nucleotídeo Cry1Ba-01 e sequência de nucleotídeo Cry1 Ba-02: [00113] Iniciador 1 (CF1): TGCGGTGTCTAACCACTCAGC (como mostrado em SEQ ID NO: 10 na listagem de sequência); [00114] Iniciador 2 (CR1): ATGCACAGGG AGT CTT CG ATT C (como mostrado em SEQ ID NO: 11 na listagem de sequência); [00115] Sonda 1 (CP1): CAGATGGACCTCCTGCCAGATGCG (como mostrado em SEQ ID NO: 12 na listagem de sequência) [00116] Os seguintes iniciadores e sonda foram usadas para detectar a sequência de nucleotídeos Cry1 Ab/Ac: [00117] Iniciador 3 (CF 2): T G CGT ATT C AATT C AACG ACAT G (como mostrado em SEQ ID NO: 13 na listagem de sequência); [00118] Iniciador 4 (CR2): CTTGGTAGTTCTGGACTGCGAAC (como mostrado em SEQ ID NO: 14 na listagem de sequência); [00119] Sonda 2 (CP2): CAGCGCCTTGACCACAGCTATCCC (como mostrado em SEQ ID NO: 15 na listagem de sequência); [00120] Os seguintes iniciadores e sonda foram usadas para detectar a sequência de nucleotídeos Vip3A: [00121] Iniciador 5 (CF3): ATT CT CG AAAT CT CCCCT AG CG (como mostrado em SEQ ID NO: 16 na listagem de sequência); [00122] Iniciador 6 (CR3): GCTGCCAGTGGATGTCCAG (como mostrado em SEQ ID NO: 17 na listagem de sequência);

[00123] Sonda 3 (CP3): CTCCTGAGCCCCGAGCTGATTAACACC (como mostrado em SEQ ID NO: 18 na listagem de sequência) [00124] Sistema de reação de PCR foi como se segue: JumpStart ™ Taq Usinado ™ 10 ?? (Sigma) Mistura de 50X iniciador / sonda 1 ?? DNA genômico 3 ?? Água (ddH20) 6?? [00125] A mistura de 50X iniciador / sonda continha 45 ?? de cada iniciador (1 mM), 50 ?? de sonda (100 ??) e 860 ?? de tampão 1XTE e foi armazenado num tubo de cor âmbar a 4 °C. [00126] As condições de reação PCR foram fornecidas como se segue: Etapa Temperatura Tempo 21 95 °C 5 min 22 95 QC 30 s 23 60 2C 1 min 24 de volta para a etapa 22 e repetido 40 vezes [00127] Os dados foram analisados usando o software SDS 2.3 (Applied Biosystems). [00128] Os resultados experimentais mostraram que todas as sequências de nucleotídeos Cry1Ba-01, Cry1 Ba-01-Cry1 Ab/Ac e Cry1 Ba-02-Vip3A foram integradas em genomas de plantas de milho detectadas, respectivamente. Além disso, as plantas de milho transfec-tadas com sequências de nucleotídeos Cry1Ba-01, Cry1Ba-01-Cry1 Ab/Ac e Cry1 Ba-02-Vip3A respectivamente continham uma única cópia do gene Cry1B, gene Cry1 Ab/Ac, e/ou gene Vip3A respectivamente.

Exemplo 4: Detecção por RT-PCR da proteína pesticida em plantas de milho transgênicas Deteccão de teor relativo de mRNA da proteína pesticida em plantas de milho transgênicas [00129] 0,2 g de folhas frescas de plantas de milho transfectadas com a sequência de nucleotídeos Cry1Ba-01, Cry1 Ba01-Cry1 Ab/Ac ou Cry1 Ba-02-Vip3A respectivamente foi tomada como uma amostra, respectivamente. Todas as amostras foram trituradas em nitrogênio líquido e 100-200 mg de tecidos foram recolhidos e, em seguida, 1 ml de solução de extração TRIZOL foi adicionada. As amostras foram agitadas e completamente lisadas e, em seguida, colocadas à temperatura ambiente durante 5 min. 0,2 ml de clorofórmio foi adicionado no seu interior e a mistura foi agitada vigorosamente por 15 segundos e colocada à temperatura ambiente durante 10 min. A mistura foi centrifugada a 12000 rpm, a 4 °C durante 10 min e o sobrenadante foi retirado e 0,5 ml (ou seja, 0,5 x o volume inicial) de água livre de RNase foi adicionado. Em seguida, 1 ml de isopropanal (relação de volume de 1:1) foi adicionado na mesma e a mistura foi misturada completamente e colocada à temperatura ambiente durante 10 min para precipitar. A mistura foi centrifugada a 12000 rpm, 4 °C durante 10 min e o pélete foi retirado e 1 ml de etanol a 75% (volume / volume) foram adicionados nele para lavar o RNA precipitado. A solução foi centrifugada a 8000 rpm, 4 °C durante 10 min e o sobrenadante foi descartado. O RNA foi seco durante cerca de 10-15 minutos e, em seguida, 100 ?? de água livre de RNase foi adicionado para dissolver suficientemente o RNA. A amostra de RNA foi digerida com DNase I, [00130] por exemplo, [00131] Amostra de RNA (<5 pg, dissolvida em água ou tampão TE) 20 ??

Tampão 10 X DNase I 5 ?? DNase livre de RNase I 2 ?? água livre de RNase 23 ??

Volume de reação final 50 ??

[00132] Em seguida, a solução foi misturada e incubada a 37 °C durante 30 min e DNase I foi inativado (seguindo a instrução de DNase I). [00133] 1/10 do volume de 3M de NaOAc (RNase livre, pH 5,2) e 3 volumes de etanol foram adicionados para precipitar o RNA e colocados a -80 °C durante 2 horas. Em seguida, a mistura foi centrifugada a 12000 rpm, 2-8 °C durante 10 min e o pélete foi lavado com 500 mL de etanol a 75% (V / V), seguida por centrifugação a 10000 rpm, 2-8 °C durante 5 min. O pélete foi lavado com etanol a 75% (V / V) e centrifugado novamente. O etanol residual foi removido e o pélete foi seco à temperatura ambiente durante 10-15 minutos e em seguida suficientemente dissolvido com 100 ?? de RNase livre de água. A mistura foi centrifugada para remover impurezas. O sobrenadante obtido foi o RNA total preparado. A concentração e pureza (OD26o/OD28o) do RNA total foram determinadas com um método de densidade óptica (Gene Quant). O RNA total foi executado uma eletroforese para determinar se o RNA total foi degradado (armazenada a -80 °C). 2 pg de RNA total, 1 ?? de iniciadores, 1 ?? de 10 mM de dNTPs e volume adequado de água (RNase livre de água) foram adicionados para obter um volume total de 13 ??. Desnaturados a 65 °C durante 10 min e, em seguida, incubados em gelo durante 2 minutos imediatamente seguido por re-cozimento. Então 4?? de tampão 5 X M-MLV, 1 ?? de 20 mM de DTT, 1 ?? de Inibidor de RNase e 1 ?? de M-MLV (Invitrogen) foram adicionados nele. Incubados a 42 °C durante 1-2 horas e, em seguida, armazenados a -20 °C para uso futuro. 0,1 pg de cada amostra foi retirado para um ensaio de PCR em tempo real (RT-PCR). Os iniciadores utilizados foram os seguintes: [00136] O método de cálculo foi referido para Livak et al. "Analysis of Relative Gene Expression Data Using Real-Time PCR Quantitative and the 2'??0? Method", Method (2001) 25 (4): 402-408. [00137] Ao mesmo tempo, as plantas de milho do tipo selvagem e as plantas de milho identificadas como plantas de milho não transgêni-cas com a técnica de Taqman foram tomadas como controles e analisadas seguindo os métodos acima. Havia três cepas (S1, S2 e S3) contendo a sequência de nucleotídeos inserida Cry1Ba-01, três cepas (S4, S5 e S6) contendo a sequência de nucleotídeos inserida CrylBa-01-Cry1Ab/Ac e três cepas (S7, S8 e S9) contendo a sequência de nucleotídeos inserida Cry1 Ba-02-Vip3A. Foi apresentada uma cepa identificada como não transgênica (NGM1) através da técnica de Taqman e uma cepa do tipo selvagem (CK1). Três plantas de cada cepa foram selecionadas para novos testes e cada planta foi repetida seis vezes. [00138] Os conteúdos relativos de mRNA de proteína pesticida (proteína CryIBa) nas plantas de milho transgênicas foram mostrados na Figura 3. Os resultados mostraram que os teores relativos de mRNA de proteína pesticida (proteína CryIBa) nas folhas frescas de plantas de milho transfectadas com a sequência de nucleotídeos CryIBa- 01, Cry1Ba-01-Cry1 Ab/Ac ou Cry1 Ba-02-Vip3A respectivamente eram muito elevados e aproximadamente 5,6 vezes daquela da PMI. É bem conhecido por um versado na técnica a qual se refere que a técnica de RT-PCR foi sensível e a sua aplicação é muito vasta. RT-PCR pode ser usado diretamente para detectar os níveis dos transcritos de genes em células que apresentam o nível de expressão, estabilidade e quantidade de expressão destes genes indiretamente. Assim, estes resultados mostram que a proteína CryIBa era expressa alta e estavelmen-te em plantas de milho.

Testes de feitos de resistência a insetos das plantas transaênicas de milho [00139] Efeito de resistência de Sesamia inferen das plantas de milho transfectadas com sequência de nucleotídeo Cry1Ba-01, as plantas de milho transfectadas com a sequência de nucleotídeos CrylBa-01-Cry1 Ab/Ac, as plantas de milho transfectadas com a sequência de nucleotídeos Cry1 Ba-02-Vip3A, as plantas de milho e planas de milho de tipo selvagem identificadas como não transgênica com a técnica Taqman foram testadas. [00140] Folhas frescas das plantas de milho transfectadas com sequência de nucleotídeos Cry1Ba-01, sequência de nucleotídeos Cry1 Ba-01-Cry1 Ab/Ac ou sequência de nucleotídeos Cry1Ba-02-Vip3A, as plantas de milho do tipo selvagem e plantas de milho identificadas como não transgênicas com técnica Taqman (estágios V6-V8) foram retiradas e lavadas com água esterilizada, e a água mantida sobre a superfície das folhas foi seca com um pedaço de gaze. As nervuras foram removidas e, ao mesmo tempo as folhas foram cortadas em tiras (1 cm de comprimento * 2 centímetros). Uma faixa foi colocada em um papel de filtro na parte inferior de uma placa de Petri de plástico redondo. O papel de filtro foi molhado com água destilada e 10 Sesamia inferens alimentados artificial mente (larvas recém-eclodidas) foram colocados em cada placa de Petri de plástico redonda. Em seguida, a placa Petri foi coberta e mantida por 3 dias em uma condição com uma temperatura de 26-28 - C, umidade relativa de 70% -80%, fotoperíodo (claro / escuro) 16: 8. Em seguida, as estatísticas de alimentação de folha, a sobrevivência das larvas e condições de desenvolvimento foram realizadas e média de mortalidade corrigida e peso de larvas de cada amostra foram calculados. Média de mortalidade corrigida = M (Mt- Mc) / (1-Mc) * 100%, em que M é a mortalidade média corrigida (%), Mt é a média de mortalidade (%) dos insetos das plantas de milho a serem testados, Mt é a média de mortalidade (%) dos insetos sobre as plantas de controle (CK1). A norma de classificação de insetos-resistência foi mostrada na Tabela 1. Três cepas (S1, S2 e S3) de plantas de milho transfectadas com sequência de nucleo-tídeos Cry1Ba-01, três cepas (S4, S5 e S6) de plantas de milho transfectadas com a sequência Cry1 B-01-Cry1 Ab/Ac, três cepas (S7, S8 e S9) de plantas de milho transfectadas com a sequência Cry1Ba-02-Vip3A; uma cepa identificada como não transgênica (NGM1) através de técnica Taqman e uma cepa do tipo selvagem (CK1) foram selecionadas. Três plantas de cada linhagem foram testadas e cada planta é repetida seis vezes. Os resultados foram mostrados na Tabela 2 e Figura 4. [00141] Os resultados da Tabela 2 e Figura 4 mostraram que mortalidade corrigida média da maior parte das plantas de milho transfecta-das com a sequência de nucleotídeos Cry1Ba-01, plantas de milho transfectadas com Cry1 Ba-01-Cry1 Ab/Ac e plantas de milho transfec-tadas com Cry1 Ba-02-Vip3A foi aproximadamente ou acima de 90%, e a mortalidade corrigida média de algumas cepas foi de até 100%. Comparado com isso, a mortalidade corrigida média de plantas de milho do tipo selvagem foi geralmente arredondada ou abaixo de 10%. Em comparação com as plantas de milho do tipo selvagem, as eficiên-cias de controle contra a larva das plantas de milho transfectadas com a sequência de nucleotídeos Cry1 Ba-01, as plantas de milho transfectadas com Cry1 Ba-01-Cry1 Ab/Ac e plantas de milho transfectadas com Cry1 Ba-02-Vip3A foram quase 100% e as larvas individuais dificilmente sobrevividas também tiveram desenvolvimento substancialmente parado. Além disso, as plantas de milho transfectadas com a sequência de nucleotídeos Cry1 Ba-01, plantas de milho transfectadas com Cry1 Ba-01-Cry1 Ab/Ac e plantas de milho transfectadas com Cry1 Ba-02-Vip3A foram apenas ligeiramente prejudicadas em geral. [00142] Foi assim demonstrado que todas as plantas de milho transfectadas com a sequência de nucleotídeos Cry1 Ba-01, plantas de milho transfectadas com Cry1 Ba-01 -Cry1 Ab/Ac e plantas de milho transfectadas com Cry1 Ba-02-Vip3A apresentaram elevada atividade resistentes a Sesamia inferen, o que era o suficiente para resultar em um efeito prejudicial para o crescimento de Sesamia inferen e para controlar Sesamia inferen.

Exemplo 5: Obtenção e verificação da planta de arroz transgênica com gene Cry1B inserido Obtenção da planta de arroz transgênica com gene Crv1 B inserido [00143] De acordo com o método de transfecção de Agrobacterium convencional, o arroz japonica Nipponbare foi cultivado em condições de esterilidade e o embrião jovem foi cocultivado com as cepas de A-grobacterium construídas na parte 3 do Exemplo 2, de modo a introduzir T-DNA em vetores de expressão recombinante DBN100072, DBN100056 e DBN100083 construídos na parte 2 do Exemplo 2 (incluindo sequência promotora do gene da Ubiquitina do milho, sequência de nucleotídeos de sequências de nucleotídeos Cry1Ba-01, sequência de nucleotídeos Cry1Ba-02, sequência de nucleotídeos Cry1Ab/Ac, sequência de nucleotídeos Vip3A, gene PMI e sequência terminadora Nos) no genoma do arroz. As plantas de arroz contendo sequência de nucleotídeo Cry1Ba-01, as plantas de arroz contendo a sequência de nucleotídeos Cry1 Ba-01-Cry1 Ab/Ac e plantas de arroz contendo sequência de nucleotídeos Cry1 Ba-02-Vip3A foram obtidas, respectivamente, e planta de arroz do tipo selvagem foi tomada como um controle. [00144] No que diz respeito à transfecção mediada por Agrobacterium de arroz, resumidamente, as sementes de arroz foram inoculadas em meio de indução (sal N6, vitaminas N6, 300 mg/L de caseína, 30 g/L de sacarose, 2 mg/L de ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D), e 3 g/L de gelatum de planta, pH = 5,8) e o calo foi induzido a partir de embriões maduros de arroz (etapa 1: etapa de indução do calo). Então, a seguir é otimizar calo. O calo foi contatado com uma suspensão de Agrobacterium, em que o Agrobacterium pode entregar a sequência de nucleotídeo Cry1Ba-01, sequência de nucleotídeos Cry1Ba-01-Cry1Ab/Ac ou sequência de nucleotídeos Cry1 Ba-02-Vip3A em pelo menos uma célula de calo (Etapa 2: etapa de infecção). Nesta etapa, de preferência, o calo foi mergulhado na suspensão de Agrobacterium (D066o = 0,3, média de infecção (sal N6, vitaminas N6, 300 mg/L de caseína, 30 g/L de sacarose, 10 g/L de glicose, 40 mg/L de acetossi-ringona (aS), 2 mg/L da ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D), pH = 5,4) para iniciar a infecção. Calo e Agrobacterium foram cocultivados durante um período de (3 dias) (Etapa 3: etapa de cocultivação) de preferência, calos foram cultivados em um meio sólido (sal N6, vitaminas N6, 300 mg/L de caseína, 30 g/L de sacarose, 10 g/L de glicose, 40 mg/L de acetossiringona (AS), 2 mg/L de ácido 2,4- diclorofenoxia-cético (2,4-D), e 3 g/L de gelatum de planta, pH = 5,8) após a etapa de infecção. Após este etapa de cocultura, uma etapa de "recuperação" pode ser prosseguida, na etapa de "recuperação", o meio de recuperação (sal N6, vitaminas N6, 300 mg/L de caseína, 30 g/L de sacarose, 10 g/L de glucose, 2 mg/L de ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4- D), e 3 g/L de gelatum de planta, pH = 5,8), contém pelo menos um tipo de antibiótico que inibem o Agrobacterium conhecido (cefamicina), sem o agente seletivo para transfecção de plantas (Etapa 4: etapa de recuperação). Preferivelmente, o calo foi cultivado em um meio de cultura sólido contendo antibióticos, mas sem agente seletivo, de modo a eliminar o Agrobacterium e proporcionar um período de recuperação para as células infectadas, em seguida, o calo inoculado foi cultivado em um meio contendo agente seletivo (manose) e o calo transfectado foi selecionado. (Etapa 5: etapa de seleção). Preferivelmente, o calo foi cultivado em meio sólido seletivo contendo agente seletivo (sal N6, vitaminas N6, 300 mg/L de caseína, 10 g/L de sacarose, 10 g/L de manose, 2 mg/L de ácido 2,4- diclorofenoxiacético (2,4- D), e 3 g/L de gelatum de planta, pH = 5,8), resultando no crescimento seletivo das células transfectadas. Então, calo regenerado em plantas (Etapa 6: etapa de regeneração). Preferivelmente, o calo foi cultivado em meio sólido contendo agente seletivo (meio de diferenciação N6 e meio de enraizamento MS) para se regenerar em plantas. [00145] O calo resistente obtido foi transferido para o meio de diferenciação N6 (sal N6, vitaminas N6, 300 mg/L de caseína, 20 g/L de sacarose, 2 mg/L de 6-benziladenina, 1 mg/L de ácido naftilacético e 3 g/L de gelatum de planta, pH = 5,8) e cultivado e diferenciado a 25 QC. As plântulas diferenciadas foram transferidas para o meio de enraizamento MS (sal MS, vitaminas MS, 300 mg/L de caseína, 15 g/L de sacarose, 3 g/L de gelatum de planta, pH = 5,8) e cultivadas até cerca de 10 cm de altura a 25 QC. Em seguida, as plantas foram transferidas e cultivadas na estufa até frutificação. Na estufa, as plantas de arroz foram cultivadas a 30 2C a cada dia.

Verificação de plantas de arroz transaênicas com gene Crv1B inserido usando técnica TaaMan [00146] 100 mg de folhas de cada planta de arroz transfectada (plantas de arroz transfectadas com sequência de nucleotídeos Cry1Ba-01, sequência de nucleotídeos Cry1 Ba-01-Cry1 Ab/Ac e sequência de nucleotídeos Cry1 Ba-02-Vip3A, respectivamente) foram tomados como amostra, respectivamente. O DNA genômico foi extraído das mesmas usando Kit DNeasy Plant MaxiKit (Qiagen) e os números de cópias de gene Cry1B, gene Cry1 Ab/Ac e gene Vip3A foram quantificados através ensaio de PCR quantitativo de fluorescência baseada em sonda de Taqman. A planta de arroz do tipo selvagem foi tomada como um controle e analisada de acordo com os processos como descritos acima. As experiências foram realizadas em triplicado e os resultados eram os valores médios. [00147] O método específico para a detecção de números de có- pias de gene Cry1B, do gene Vip3A e gene Cry1Ab/Ac foi descrito como se segue. [00148] Etapa 31: 100 mg de folhas de cada planta de arroz trans-fectada (plantas de arroz transfectadas com a sequência de nucleotí-deos Cry1Ba-01, Cry1 Ba-01-Cry1 Ab/Ac ou Cry1 Ba-02-Vip3A, respectivamente) foram tomadas e moídas em homogeneizado em um almofariz de nitrogênio líquido, respectivamente. Foi em triplicado para cada amostra. [00149] Etapa 32: os DNAs genômicos das amostras acima referidas foram extraídos utilizando Kit DNeasy Plant Mini (Qiagen) seguindo as instruções do mesmo produto. [00150] Etapa 33: as concentrações de DNA do genoma das amostras acima foram determinadas utilizando NanoDrop 2000 (Thermo Scientific). [00151] Etapa 34, as concentrações de DNA do genoma foram a-justadas para a mesma faixa de 80-100 ng / pL. [00152] Etapa 35: o número de cópias das amostras foi quantificado usando ensaio de PCR quantitativo de fluorescência baseada em sonda de Taqman, a amostra quantificada com o número de cópias conhecido, foi tomada como uma amostra padrão e a planta de arroz do tipo selvagem foi tomada como controle. Isto foi realizado em triplicado para cada amostra e os resultados eram os valores médios. Os inicia-dores e as sondas utilizados no PCR quantitativo de fluorescência foram mostrados como abaixo. [00153] Os seguintes iniciadores e sonda foram usados para detectar sequência de nucleotídeo Cry1Ba-01 e sequência de nucleotídeo Cry1 Ba-02: [00154] Iniciador 1 (CF1): TGCGGTGTCTAACCACTCAGC (como mostrado em SEQ ID NO: 10 na listagem de sequência); [00155] Iniciador 2 (CR1): ATGCACAGGGAGTCTTCGATTC (como mostrado em SEQ ID NO: 11 na listagem de sequência); [00156] Sonda 1 (CP1): CAGATGGACCTCCTGCCAGATGCG (como mostrado em SEQ ID NO: 12 na listagem de sequência) [00157] Os seguintes iniciadores e sonda foram usadas para detectar a sequência de nucleotídeos Cry1 Ab/Ac: [00158] Iniciador 3 (CF 2): T G CGTATT C AATT C AACG AC AT G (como mostrado em SEQ ID NO: 13 na listagem de sequência); [00159] Iniciador 4 (CR2): CTTGGTAGTTCTGGACTGCGAAC (como mostrado em SEQ ID NO: 14 na listagem de sequência); [00160] Sonda 2 (CP2): CAGCGCCTTGACCACAGCTATCCC (como mostrado em SEQ ID NO: 15 na listagem de sequência); [00161] Os seguintes iniciadores e sonda foram usadas para detectar a sequência de nucleotídeos Vip3A: [00162] Iniciador 5 (CF3): ATT CT CG AAAT CT CCCCT AG CG (como mostrado em SEQ ID NO: 16 na listagem de sequência); [00163] Iniciador 6 (CR3): GCTGCCAGTGGATGTCCAG (como mostrado em SEQ ID NO: 17 na listagem de sequência); [00164] Sonda 3 (CP3): CT CCT G AGCCCCG AG CT G ATT AACACC (como mostrado em SEQ ID NO: 18 na listagem de sequência) [00165] Sistema de reação de PCR foi como se segue: JumpStart ™ Taq Usinado ™ 10 ?? (Sigma) mistura 50X iniciador / sonda 1 ?? DNA genômico 3 ?? Água (ddH20) 6??

[00166] A mistura 50X iniciador / sonda continha 45 ?? de cada um dos iniciadores (1 mM), 50 ?? de sonda (100 ????) e 860 ?? de tampão 1XTE e foi armazenada em um tubo de cor âmbar a 4 °C [00167] As condições de reação PCR foram fornecidas como se segue: Etapa Temperatura Tempo 41 95 QC 5 min 42 95 QC 30 s 43 60 QC 1 min 44 de volta para a etapa 22 e repetido 40 vezes [00168] Os dados foram analisados usando o software SDS 2.3 (Applied Biosystems). [00169] Os resultados experimentais mostraram que todas as sequências de nucleotídeos Cry1Ba-01, Cry1 Ba-01-Cry1 Ab/Ac e Cry1 Ba-02-Vip3A foram integradas em genomas de plantas de arroz detectadas, respectivamente. Além disso, as plantas de arroz transfec-tadas com sequências de nucleotídeos Cry1Ba-01, Cry1Ba-01-Cry1 Ab/Ac e Cry1 Ba-02-Vip3A respectivamente continham uma única cópia do gene Cry1B, gene Cry1 Ab/Ac, e/ou gene Vip3A respectivamente.

Exemplo 6: Detecção RT-PCR de proteína pesticida em plantas de arroz transgênicas Deteccão de teor relativo de mRNA da proteína pesticida em plantas de arroz transgênicas [00170] 0,2 g de folhas frescas de plantas de arroz transfectadas com a sequência de nucleotídeos Cry1Ba-01, Cry1 Ba01-Cry1 Ab/Ac ou Cry1 Ba-02-Vip3A respectivamente foi tomada como uma amostra, respectivamente. Todas as amostras foram trituradas em nitrogênio líquido e 100-200 mg de tecidos foram recolhidos e, em seguida, 1 ml de solução de extração TRIZOL foi adicionado. As amostras foram agitadas e completamente lisadas e, em seguida, colocadas à temperatura ambiente durante 5 min. 0,2 ml de clorofórmio foi adicionado no seu interior e a mistura foi agitada vigorosamente por 15 segundos e colocada à temperatura ambiente durante 10 min. A mistura foi centrifugada a 12000 rpm, 4 °C durante 10 min e o sobrenadante foi retirado e 0,5 ml (ou seja, 0,5 x volume inicial) de água livre de RNase foi adicionado. Em seguida, 1 ml de isopropanal (relação de volume de 1:1) foi adicionado na mesma e a mistura foi misturada completamente e colocada à temperatura ambiente durante 10 min para precipitar. A mistura foi centrifugada a 12000 rpm, a 4 °C durante 10 min e o pélete foi retirado e 1 ml de etanol a 75% (volume / volume) foram adicionados nela para lavar o RNA precipitado. A solução foi centrifugada a 8000 rpm, 4 °C durante 10 min e o sobrenadante foi descartado. O RNA foi seco durante cerca de 10-15 minutos e, em seguida, 100 ?? de água livre de RNase foi adicionado para dissolver suficientemente o RNA. A amostra de RNA foi digerida com DNase I, [00171] por exemplo, [00172] Amostra de RNA (<5 pg, dissolvida em água ou tampão TE) 20 ?? tampão 10 X ADNase I 5 ?? DNase livre de RNase I 2 ?? Água livre de RNase 23 ??

Volume de reação final 50 ?? [00173] Em seguida, a solução foi misturada e incubada a 37 °C durante 30 min e a DNase I foi inativado (seguindo a instrução de DNase I). [00174] 1/10 do volume de 3M de NaOAc (RNase livre, pH 5,2) e 3 volumes de etanol foram adicionados para precipitar o RNA e colocados a -80 °C durante 2 horas. Em seguida, a mistura foi centrifugada a 12000 rpm, 2-8 °C durante 10 min e o pélete foi lavado com 500 ml_ de etanol a 75% (V / V), seguida por centrifugação a 10000 rpm, 2-8 °C durante 5 min. O pélete foi lavado com etanol a 75% (V / V) e centrifugado novamente. O etanol residual foi removido e o pélete foi seco à temperatura ambiente durante 10-15 minutos e em seguida suficientemente dissolvido com 100 ml de RNase isento de água. A mistura foi centrifugada para remover impurezas. O sobrenadante obtido foi o RNA total preparado. A concentração e pureza (OD260/OD280) do RNA total foram determinadas com um método de densidade óptica (Gene Quant). O RNA total foi executado uma eletroforese para determinar se o RNA total foi degradado (armazenado a -80 °C). 2 pg de RNA total, 1 ?? de iniciadores, 1 ?? de 10 mM de dNTPs e o volume adequado de água (RNase isento de água) foram adicionados para obter um volume total de 13??. D desnaturado a 65 °C durante 10 min e, em seguida, incubadas em gelo durante 2 min imediatamente seguido por reco-zimento. Então 4?? de tampão 5 X M-MLV, 1 ?? de 20 mM de DTT, 1 ?? de Inibidor de RNase e 1 ?? de M-MLV (Invitrogen) foram adicionados nele. Incubados a 42 °C durante 1-2 horas e, em seguida, armazenados a -20 °C para uso futuro. 0,1 pg de cada amostra foi retirado para um PCR em tempo real (RT-PCR). Os iniciadores utilizados foram os seguintes: [00175] O método de cálculo foi referido para Livak et al. "Analysis of Relative Gene Expression Data Using Real-Time PCR Quantitative and the 2??0? Method", Method (2001) 25 (4): 402-408. [00176] Ao mesmo tempo, as plantas de milho do tipo selvagem e as plantas de milho identificadas como plantas de milho não transgêni-cas com a técnica de Taqman foram tomadas como controles e analisadas seguindo os métodos acima. Havia três cepas (S10, S11 e S12) contendo a sequência de nucleotídeos inserida Cry1Ba-01, três cepas (S13, S14 e S15) contendo a sequência de nucleotídeos inserida Cry1 Ba-01-Cry1 Ab/Ac e três cepas (S16, S17 e S18) contendo a sequência de nucleotídeos inserida Cry1 Ba-02-Vip3A. Foi apresentada uma cepa identificada como não transgênica (NGM1) através da técnica de Taqman e uma cepa do tipo selvagem (CK2). Três plantas de cada cepa foram selecionadas para novos testes e cada planta foi repetida 6 vezes. [00177] Os conteúdos relativos de mRNA de proteína pesticida (proteína CryIBa) nas plantas de milho transgênicas foram mostrados na Figura 5. Os resultados mostraram que os teores relativos de mRNA de proteína pesticida (proteína CryIBa) nas folhas frescas de plantas de milho transfectadas com a sequência de nucleotídeos CrylBa-01, Cry1 Ba-01-Cry1 Ab/Ac ou Cry1 Ba-02-Vip3A respectivamente eram muito elevados e aproximadamente 15,8 vezes daquela da PMI. É bem conhecido por um versado na técnica a qual se refere que a técnica de RT-PCR foi sensível e a sua aplicação é muito vasta. RT-PCR pode ser usado diretamente para detectar os níveis dos transcritos de genes em células que apresentam o nível de expressão, estabilidade e quantidade de expressão destes genes indiretamente. Assim, estes resultados mostram que a proteína CryIBa era expressa alta e esta-velmente em plantas de arroz.

Teste de efeito de resistência a inseto das plantas de arroz transaêni-cas [00178] Efeitos de resistência a Sesamia inferen das plantas de arroz transfectadas com sequência de nucleotídeo Cry1Ba-01, as plan- tas de arroz transfectadas com a sequência de nucleotídeos CrylBa-01-Cry1 Ab/Ac, as plantas de arroz transfectadas com a sequência de nucleotídeos Cry1 Ba-02-Vip3A, as plantas de arroz de tipo selvagem e as plantas de arroz identificadas como não transgênicas com a técnica Taqman foram testados. [00179] Folhas frescas das plantas de arroz transfectadas com sequência de nucleotídeos Cry1Ba-01, sequência de nucleotídeos Cry1Ba-01-Cry1 Ab/Ac ou sequência de nucleotídeos Cry1Ba-02-Vip3A, planta de arroz do tipo selvagem e planta de arroz identificadas como não transgênicas com a técnica Taqman (fase de perfilhamento) foram retiradas e lavadas com água esterilizada, e a água mantida sobre a superfície das folhas foi seca com um pedaço de gaze. As nervuras foram removidas e, ao mesmo tempo as folhas foram cortadas em tiras (1 cm de comprimento * 3 centímetros). Uma faixa foi colocada em um papel de filtro na parte inferior de uma placa de Petri de plástico redondo. O papel de filtro foi molhado com água destilada e 10 Se-samia inferens alimentados artificial mente (larvas recém-eclodidas) foram colocados em cada placa de Petri de plástico redondo. Em seguida, a placa de Petri foi coberta e mantida por 3 dias em uma condição com uma temperatura de 26-28 Q C, umidade relativa de 70% -80%, fotoperíodo (claro / escuro) 16: 8. Em seguida, as estatísticas de alimentação da folha, a sobrevivência das larvas e condições de desenvolvimento foram realizadas e a mortalidade corrigida média e peso de larvas de cada amostra foram calculados. Mortalidade corrigida média = M (Mt-Mc) / (1-Mc) * 100%, em que M é a mortalidade corrigida média (%), Mt é a mortalidade média (%) dos insetos nas plantas de arroz a ser testadas, Mc é a mortalidade média (%) dos insetos sobre as plantas de controle (CK2). A norma de classificação de resistência a insetos foi mostrada na Tabela 1. Três cepas (S10, S11, e S12) de plantas de arroz transfectadas com sequência de nucleotídeos Cry1Ba-01; três cepas (S13, S14 e S15) de plantas de arroz transfec-tadas com a sequência de nucleotídeo Cry1B-01-Cry1Ab/Ac; três cepas (S16, S17, S18 e) de plantas de arroz transfectadas com a sequência de nucleotídeo Cry1 Ba-02-Vip3A; uma cepa identificada como não transgênica (NGM2) através de técnica Taqman e uma cepa do tipo selvagem (CK2) foram selecionadas. Três plantas de cada cepa foram testadas e cada planta é repetida seis vezes. Os resultados foram apresentados na Tabela 3 e na Figura 6. [00180] Os resultados da Tabela 3 e na Figura 6 mostram que a média de mortalidade corrigida da maioria das plantas de arroz, trans-fectadas com a sequência de nucleotídeos Cry1Ba-01, as plantas de arroz transfectadas com o Cry1 Ba-01-Cry1 Ab/Ac e plantas de arroz transfectadas com o Cry1 Ba-02-Vip3A foi aproximadamente ou acima de 90%, e a mortalidade corrigida média de algumas cepas foi até 100%. Comparado com isso, a mortalidade corrigida média de plantas de arroz do tipo selvagem foi geralmente arredondada ou abaixo de 10%. Em comparação com as plantas de arroz do tipo selvagem, as eficiências de controle contra a larva das plantas de arroz, transfectadas com a sequência de nucleotídeos Cry1Ba-01, as plantas de arroz transfectadas com o Cry1 Ba-01-Cry1 Ab/Ac e plantas de arroz transfectadas com o Cry1 Ba-02-Vip3A foram quase 100% e as larvas indi- viduais que sobreviveram também substancialmente pararam o desenvolvimento. Além disso, as plantas de arroz transfectadas com a sequência de nucleotídeos Cry1Ba-01, as plantas de arroz transfectadas com o Cry1 Ba-01-Cry1 Ab/Ac e plantas de arroz transfectadas com o Cry1 Ba-02-Vip3A foram apenas ligeiramente prejudicadas em geral. [00181] Foi assim demonstrado que todas as plantas de arroz transfectadas com a sequência de nucleotídeos Cry1Ba-01, as plantas de arroz transfectadas com o Cry1 Ba-01-Cry1 Ab/Ac e plantas de arroz transfectadas com o Cry1 Ba-02-Vip3A mostraram atividade de resistência alta a Sesamia inferen, o que era o suficiente para resultar em um efeito prejudicial para o crescimento de Sesamia inferen e para controlar Sesamia inferen. [00182] Os resultados experimentais acima, também demonstraram que o controle Sesamia inferen de plantas de milho transfectadas com a sequência de nucleotídeos Cry1Ba-01, as plantas de milho transfectadas com o Cry1 Ba-01-Cry1 Ab/Ac, as plantas de milho transfectadas com o Cry1 Ba-02-Vip3A, as plantas de arroz transfectadas com a sequência de nucleotídeos Cry1Ba-01, as plantas de arroz transfectadas com o Cry1 Ba-01-Cry1 Ab/Ac e plantas de arroz transfectadas com o Cry1 Ba-02-Vip3A foi devido às proteínas Cry1B expressas nestes próprias plantas. Portanto, como bem conhecido por um versado na técnica, com base na mesma ação tóxica de proteínas Cry1 B de Sesamia inferen, outras plantas transgênicas semelhantes, capazes de expressar proteínas Cry1 B podem ser obtidas, de modo a controlar Sesamia inferen. Proteínas Cry1B neste pedido estão incluídas, mas não se limitam àquelas cujas sequências de aminoácidos foram fornecidas em modalidades específicas do presente pedido. Ao mesmo tempo, estas plantas transgênicas também podem produzir pelo menos uma segunda proteína pesticida diferente de proteína tal como proteína Cry1B Cry1 Ab/Ac, proteína Cry1 Ac, ou proteína Cry1 Fa ou proteína Vip3A, etc. [00183] Em conclusão, os métodos do controle do pragas no presente pedido foram para controlar pragas Sesamia inferen com proteína Cry1B produzida nas plantas, que pode matar Sesamia inferens. Comparado com o controle agrícola, o controle químico e o controle biológico usados atualmente no estado da técnica, o presente pedido pode proteger toda a planta durante todo o período de crescimento dos danos de Sesamia inferen. Além disso, não provoca poluição e nenhum resíduo e proporciona um efeito de controle estável e completo. Também é simples, prático e econômico. [00184] Finalmente o que deve ser explicado é que todos os exemplos acima são apenas intencionados para ilustrar as soluções técnicas do presente pedido, em vez de restringir o presente pedido. Embora esta descrição detalhada de aplicação tenha sido efetuada com referência aos exemplos preferidos, um versado na técnica deve entender que as soluções técnicas de aplicação podem ser modificadas ou substituídas de forma equivalente e ainda estarem dentro do espírito e do âmbito do presente pedido.

Claims

1. Método para o controle de Sesamia inferens compreendendo uma etapa de colocar em contato Sesamia inferens com proteína Cry1 B.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, em que a proteína Cry1 Ba é a proteína Cry1 B.

3. Método, de acordo com a reivindicação 2, em que a proteína CryIBa está presente em uma célula de planta que exprime a proteína CryIBa, e Sesamia inferens contata com a proteína CryIBa pela ingestão da célula.

4. Método, de acordo com a reivindicação 3, em que a proteína CryIBa está presente em uma planta transgênica que expressa a proteína CryIBa, e Sesamia inferens contata com a proteína CryIBa pela ingestão de um tecido de planta transgênica, tal que o crescimento de Sesamia inferens é suprimido ou mesmo resulta na morte de Sesamia inferens para alcançar o controle de danos causados por Sesamia inferens.

5. Método, de acordo com a reivindicação 4, em que a planta transgênica está em qualquer período de crescimento.

6. Método, de acordo com a reivindicação 4, em que o tecido das plantas transgênicas é selecionado a partir do grupo consistindo em lâmina, talo, borla, orelha, anteras e filamentos.

7. Método, de acordo com a reivindicação 4, em que o controle de danos causados por Sesamia inferens para a planta é independente do local de plantação ou tempo plantação.

8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 7, em que a planta está selecionada a partir do grupo que consiste em milho, arroz, sorgo, trigo, milho, algodão, cana, cana de açúcar, água de bambu, fava e colza.

9. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2-8, em que antes da etapa de colocar em contato, uma etapa de cultivo de uma planta que contém um polinucleotídeo que codifica a proteína Cry1 Ba é realizada.

10. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2-9, em que a sequência de aminoácidos da proteína Cry1 Ba compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2.

11. Método, de acordo com a reivindicação 10, em que a sequência de nucleotídeos que codifica a proteína CryIBa compreende uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 4.

12. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 11, em que a planta adicionalmente compreende, pelo menos, uma segunda sequência de nucleotídeos, que é diferente daquela que codifica a proteína Cry1 Ba.

13. Método, de acordo com a reivindicação 12, em que a segunda sequência de nucleotídeos codifica uma proteína pesticida tipo Cry, proteína pesticida tipo VIP, um inibidor da protease, lectinas, ?-amilase ou peroxidase.

14. Método, de acordo com a reivindicação 13, em que a segunda sequência de nucleotídeos codifica a proteína Cry1Ab/Ac, proteína CrylAc, proteína Cry1 Ab/Ac/Ac, proteína Cry1 Fa ou proteína Vip3A.

15. Método, de acordo com a reivindicação 14, em que a segunda sequência de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 6.

16. Método, de acordo com a reivindicação 12, em que a segunda sequência de nucleotídeos é dsRNA que inibe o(s) gene(s) importante(s) de uma praga alvo.