CN111575237A - 一种乳腺癌无支架类器官专用培养基及培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种乳腺癌无支架肿瘤类器官培养基及培养方法，包括N‑2，B27，Noggin，青霉素/链霉素双抗，EGF，FGF10，Y‑27632，A83‑01，SB202190，N‑乙酰半胱氨酸，R‑Spondin，烟酰胺，Wnt3A，KGF，庆大霉素，Heregulin，胎牛血清和DMEM‑F/12。该培养基及培养方法可以帮助建立一种无需支架材料、且能高度保持肿瘤特异性的乳腺癌肿瘤类器官，实现大小可控，球形规则，且成功率高、时间短、药敏结果特异性高。本发明培养基及培养方法可为乳腺肿瘤的发生、发展、体外药敏筛选及耐药机制研究提供理想模型。

Description

一种乳腺癌无支架类器官专用培养基及培养方法

技术领域

本发明涉及细胞培养技术领域，具体涉及一种乳腺癌类器官专用培养基及培养方法。

背景技术

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，其发病率逐年上升。2018年9月，世卫组织下属国际癌症研究机构IARC发布了《2018全球癌症统计数据》，乳腺癌发病率和死亡率双双夺魁，堪称全球女性的第一大癌症杀手。我国乳腺癌患者每年新增21万例，发病率的增速是全球平均增速的两倍，在全世界排第一。在我国乳腺癌在城市中的发病率为女性恶性肿瘤的第二位，在一些大城市中，乳腺癌的发病率已经上升到了第一，防控形势不容乐观。

在人类对抗肿瘤的战役中，化疗不当或无效是癌症死亡率居高不下的原因之一。临床上对乳腺癌患者主要是进行手术治疗，为了避免该病患者乳腺的癌细胞发生转移，降低其病情的复发率，在手术后需要对其进行辅助化疗。随着现代医疗水平的提高及人们健康保健意识的增强，使乳腺癌的诊断率不断提高，越来越多的乳腺癌患者在发病早期就确诊。乳腺癌是一个个体化差异非常大的疾病，发现很早的乳腺癌，规范治疗后有的很快就复发和转移了，有的发现很晚，规范治疗后可长期生存。手术和化疗是临床治疗局部晚期乳腺癌的重要手段。尽管化疗能够减少乳腺癌的复发转移率，提高病人生存率，但是这种治疗手段还存在许多有待解决的问题，如化疗药物对人体细胞的低选择性、个体对化疗药物的敏感性差异、肿瘤的异质性等。

很多患者往往需要经过不断试药，才能找到最能扼杀其肿瘤的化疗药物，这种给药现状极易贻误患者的最佳治疗时间，造成治疗失败。通过药物敏感实验筛选对个体最敏感的化疗药物，实现肿瘤患者的个体化化疗，可能是提高化疗药物疗效和减少无效治疗的有效方式。传统的肿瘤体外药物敏感测试模型主要有人源肿瘤细胞系和人源肿瘤异种移植模型。人源肿瘤细胞系可快速得到药敏筛选结果，但其培养方式影响原代病人肿瘤特性的保持，药敏筛选的准确率与患者体内反应的一致性相对较低；人源肿瘤异种移植模型可以原代病人肿瘤的特性，可以作为活体肿瘤用于保存和传代，为肿瘤学研究提供非常宝贵的研究标本，但该模型成功率低，筛药测试时间太长、花费太高。近年来兴起的人源肿瘤的类器官模型类器官是将癌症患者手术获取的肿瘤进行体外细胞3D培养，建成肿瘤类器官模型。该模型维持了肿瘤组织的生理结构和功能特点，同时维持了肿瘤细胞在体内的特征，临床相关性达到95％，且效率高、耗时少，适用于大批量筛选。但是，目前的肿瘤类器官培养技术多局限于基质胶中，该培养方式限制了类器官与外界的气体交换和物质代谢，当类器官形成较大的组织后，循环系统的缺乏和氧气养分交换的局限性严重影响了类器官所需营养物质的吸收以及代谢废物的清除。目前研究人员试图通过改变培养基质成分尝试创造更大的物质交换空间，如摒弃使用的Matrigel换用能够提供更大空腔的水凝胶作为支架。此外，基于外基质的类器官培养技术先天还具有很大的不足，因细胞团周围有外基质而无法进行原位光学检测，同时某些常规的后续检测需要去除外基质过程，该过程不仅繁琐，而且一定程度上会对细胞活性造成影响。

基于上述研究现状，本专利技术建立了一种无需引入外源性基质、且能保持肿瘤特异性的乳腺癌肿瘤类器官3D培养方案，具有成功率高、时间短、药敏结果特异性高的特点，可为乳腺肿瘤的发生、发展、体外药敏筛选及耐药机制研究提供理想的研究模型。

发明内容

针对现有的类器官培养均需要在培养基中添加Matrigel基质胶、水凝胶等支架材料，导致细胞生长不良、后期支架材料去除工序繁琐、以及影响细胞状态等缺陷，本发明提供了一种新的适用于乳腺癌类器官建立的专用培养基，使用该培养基可以不必局限于支架材料，也能够获得良好的培养效果。

以下详述本发明技术方案：

本发明提供的乳腺癌无支架类器官专用培养基，适用于培养无支架材料的3D乳腺癌类器官，由以下组分组成：

N-2，

B27，

Noggin，

青霉素/链霉素双抗，

EGF，

FGF10，

Y-27632，

A83-01，

SB202190，

N-乙酰半胱氨酸，

R-Spondin，

烟酰胺，

Wnt3A，

KGF，

庆大霉素，

Heregulin，

胎牛血清，

DMEM-F/12。

N-2是化学成分确定的，不含血清的，基于Bottenstein’s的N1配方的添加剂。

B-27是无血清添加剂，用于海马神经元和其他中枢神经系统(CNS)神经元的生长和保持其短期或长期活性。

Noggin是一种重要的胚胎蛋白，在胚胎背腹轴模式形成、神经管发育及神经诱导方面有重要功能

青霉素/链霉素双抗是专门用于细胞培养的，可以直接添加到细胞培养液内，抑制细菌生长；避免细胞污染。

EGF是人体内分泌的一种重要细胞生长因子，具有很强的生理活性，如能促进上皮细胞、成纤维细胞的增值。

FGF10是一种能促进成纤维细胞生长的多肽类物质。

Y-27632是一种ATP竞争性的ROCK-I和ROCK-II抑制剂，具有防止细胞凋亡的作用。

A83-01是一种TGF-βI型受体ALK5激酶、I型激活素ALK4以及I型节点受体ALK7的选择性抑制剂，加入培养基发挥维持细胞干性，抑制细胞分化的作用。

SB202190是一种有效的p38 MAPK抑制剂，靶向作用于p38α/β，对分离的原代肿瘤细胞具有保护作用。

N-乙酰半胱氨酸是一种抗氧化剂，可促进肿瘤细胞增殖。

R-Spondin可以激活Wnt/β-catenin信号通路，在类器官的形成过程发挥中药作用。

烟酰胺是一种细胞培养添加剂，可促进原代肿瘤细胞的增殖和分化。

Wnt3A是Wnt信号通路的重要组成蛋白之一，通过调控Wnt信号通路促进乳腺癌类器官3D细胞球的形成。

KGF是角质细胞生长因子，是上皮细胞特异的促有丝分裂剂。

庆大霉素，预防支原体污染。

Heregulin是人神经调节蛋白，一定浓度可促进原代肿瘤细胞的增殖。

胎牛血清是一种天然培养基，含有丰富的细胞生长必需的营养成份。

DMEM-F/12是基础培养基。

本发明提供的乳腺癌类器官专用培养基及培养方法适用于无支架材料的低吸附U型和V型孔板，借助重力促进细胞聚集的同时；通过培养基成分优化及方法改进，实现肿瘤细胞短时间内快速扩增构建类器官，成功率可达100％。相比于现有技术，很好的解决了类器官随机形成，成功率低，大小和形状不均一等问题。同时，本发明提供的类器官专用培养基可长期维持细胞活力和功能性高表达(＞20天)。本发明技术可在有效地时间内获得足够多的乳腺癌肿瘤类器官3D细胞球开展后续实验操作，极大提高了类器官的培养速度和成功率。

优选的，上述乳腺癌无支架类器官专用培养基中，各组分在培养基中的终浓度或体积百分比如下：

本发明还提供了另一种使用上述任一乳腺癌无支架类器官专用培养基培养3D乳腺癌类器官的方法，包括以下步骤：

(1)纯化：将分离的原代肿瘤细胞悬液经离心去除上清后，收集的沉淀细胞加入到所述专用培养基中，利用差速贴壁法进行细胞纯化；

(2)扩大培养：纯化后的细胞使用专用培养基继续扩增培养；

(3)无支架肿瘤类器官的建立：将细胞培养至80％融合时，用TrypLE消化，离心后用专用培养基重悬细胞，计数后接种至独特结构的96孔PDO专用培养板中，培养箱内培养即可。

优选的，上述方法的步骤(2)培养过程中，专用培养基的第一次换液时间为接种后5天。研究发现增加换液时间间隔对细胞的增殖影响较大，当在接种后5天进行第一次换液时，既可以满足细胞的生长需求，也可最大程度地促进细胞增殖。

优选的，上述方法的步骤(2)培养过程中，第一次换液培养后，每2天更换一次专用培养基。第一次传代后，肿瘤细胞已经达到一定数量，每2天换液一次较为合适。

优选的，上述方法的步骤(3)培养过程中，每天更换一次专用培养基。使用96孔PDO专用培养板并且每天更换一次专用培养基的条件下，连续培养至20天仍可维持细胞球形态与活力的稳定，满足药物筛选及相关实验需要。

本发明提供的，具有如下有益效果：

本发明提供的乳腺癌类器官专用培养基，可以帮助建立一种无需引入外源性基质(支架材料)、且能保持肿瘤特异性的乳腺癌肿瘤类器官3D培养方案，具有成功率高、时间短、药敏结果特异性高的特点，可为乳腺肿瘤的发生、发展、体外药敏筛选及耐药机制研究提供理想的研究模型。特别是配合96孔PDO专用培养板使用时，可以在无需离心的情况下快速建立则的类器官3D细胞球，省时省力。

附图说明

图1为实施例中原代肿瘤细胞扩增培养时换液时间间隔对细胞增殖的影响；

图2为实施例中专用培养基分别配合专用孔板和市售普通U型孔板时细胞培养状态及活性的测定结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明的技术方案进行详细地解释和说明，以使本领域技术人员能够更好地理解并予以实施。

实施例1乳腺癌3D类器官的培养

1.乳腺癌类器官专用培养基配方

成分、各成分浓度或体积百分比含量如表1所示。

表1乳腺癌类器官专用培养基组成

2.患者乳腺癌组织处理

肿瘤组织主要来源于乳腺癌患者手术切除的标本及活检获取的肿瘤组织，要求患者未接受过任何抗肿瘤治疗。为保证分离肿瘤原代细胞的活性，手术切除的肿瘤标本，立即将组织标本上的血块、坏死组织、脂肪以及结缔组织剪掉，随后用含双抗(500U/mL青霉素和500μg/mL链霉素)的PBS溶液冲洗，再用组织剪将组织块剪至1mm³左右大小。可将组织置于培养基(含1％青霉素/链霉素双抗，体积比)中，存放于4℃或者冰盒运输至实验室进行细胞提取。

3.乳腺癌患者原代肿瘤细胞的分离和培养

根据获取肿瘤组织量加入2倍体积的组织消化液(0.1％Ⅲ型胶原酶+0.25％胰酶+Hank's溶液)，充分混匀后放入细胞培养箱中37℃消化30～60min(可根据即时消化情况适当延长消化时间，但最多不应超过2h，避免消化过度影响细胞活性)，每隔10min观察一次消化状态，并用力震荡，直至观察到组织出现弥散状态时即可终止消化，收集细胞。

分离的原代肿瘤细胞悬液1000rpm/min离心3分钟，除上清，收集沉淀，加入适量乳腺癌类器官专用培养基重悬，利用差速贴壁法进行细胞纯化。

纯化后的细胞可直接用于接种至96孔PDO专用培养板中(信安佳公司专利产品)，也可在普通贴壁培养瓶中贴壁培养扩增，以获得更大的原代肿瘤细胞量。

通过上述培养体系对6例临床乳腺癌患者手术获取的肿瘤组织进行了提取培养，原代肿瘤细胞的分离培养成功率为100％，均获得了第一代来源于患者的原代肿瘤细胞。

4.乳腺癌原代肿瘤细胞的扩增培养

研究发现，细胞培养过程中的换液时间和换液方式一定程度上会对细胞的生长状态造成影响。为了能更快地获得足够量的原代细胞，减少长期培养对肿瘤细胞组织特性丢失的影响，本研究考察了原代细胞纯化后接种至25cm²培养瓶中，培养至第一次换液之间的时间对细胞的影响。

观察时间为分离接种后15天，换液间隔时间为3天、4天、5天、6天，到15天时终止培养。例如，间隔6天换液组是在接种后的第6天和第12天换液，然后在第15天时消化收集细胞进行计数。

通过培养过程中培养基的颜色和消化后获得的细胞确定最佳的换液时间。由于组织分离纯化后获得细胞的量比较少，因此在研究过程中各组的培养基颜色均比较清澈，未出现异常现象。而增加换液时间间隔对细胞的增殖影响比较大，间隔5天和6天换液在培养15天时，细胞均达70-80％的融合状态，可以进行传代，细胞计数结果见图1。

因此，通过研究确定细胞纯化接种后5天换液一次最佳，既可以满足细胞的生长需求，也可最大程度地促进细胞增殖。

第一次传代后，由于肿瘤细胞已达到一定数量，可按正常换液间隔进行换液，每2天换液一次。

5.乳腺癌来源的无支架肿瘤类器官的建立

本研究建立的乳腺腺癌类器官采用96孔PDO专用培养板(信安佳公司产品，专利申请号：201911327604.6)，同时采用市售超低吸附96孔板U形培养板(SUMITOMO BAKELITE公司，或其他同类型市售产品)作对照实验。

分离纯化后的来源于乳腺癌患者的原代肿瘤细胞培养至80％左右融合时(图2A)，采用TrypLE消化后，800g，离心5min后用乳腺癌类器官专用培养基重悬细胞，计数后接种。

按照2500cells/well的密度接种至信安佳96孔PDO专用培养板和市售超低吸附96孔板U形培养板中，每孔补充专用培养基150μL，放入37℃、5％CO₂培养箱中培养。

另外，使用信安佳96孔PDO专用培养板和市售超低吸附96孔板U形培养板的实验组均分为离心组和不离心组。培养过程中观测类器官的形成情况，并在接种后第3天进行细胞ATP测定，评价4个实验组的细胞活性，每个实验组设置8个复孔。

信安佳96孔PDO专用培养板24小时内即可形成类器官3D细胞球，且边缘光滑清晰，是否离心对聚集状态影响不大，均可以形成规则的类器官3D细胞球；市售超低吸附96孔板U形培养板中形成类器官所需的时间要长，离心组在24小时时观察到细胞聚集，但比较松散，72小时后可形成规则的类器官细胞球，未离心组未形成单一规则类器官3D细胞球，如图2B所示(物镜10×)。

类器官在接种第3天活性检测结果如图2C所示，信安佳96孔PDO专用培养板培养的细胞球活性最佳，其次为市售U型孔板接种后离心组。

该患者建立的PDOs在3天左右即达到稳定，体积开始增大。每天更换一次完全培养基，连续培养至20天仍可维持细胞球形态与活力的稳定，满足药物筛选及相关实验需要。

上述结果显示，本研究所建立的无支架类器官培养体系在96孔PDO专用培养板和市售普通低吸附U型板中均可建立规则的类器官3D细胞球，信安佳PDO专用培养板效果更优；若使用普通低吸附U型板则需要在接种后进行适当离心，帮助肿瘤细胞的聚集进而组装形成类器官3D细胞球。

5.基于体外建立乳腺癌PDO模型的药敏筛选

基于成功建立的乳腺癌PDO模型，本研究选用临床治疗乳腺癌的一线用药吉西他滨+紫杉醇和二线用药卡培他滨+拉帕替尼作为代表，进行药敏筛选测试。根据每种药物的最大血药浓度(PPC)来设定药敏筛选的浓度。吉西他滨的PPC为25μg/mL；紫杉醇的PPC为13.8μg/mL；卡培他滨的PPC为5.0μg/mL；拉帕替尼的PPC为2.5μmol/L。

来源于乳腺癌患者手术切除的乳腺癌组织，经原代细胞分离、纯化及培养增殖，达到80％融合后，用TrypLE消化后，800g，离心5min后用专用培养基重悬细胞，计数后接种。按照2500cells/well的密度接种至信安佳96孔PDO专用培养板中。

接种3天后对形成的无支架类器官3D细胞球随机分为6组：吉西他滨、紫杉醇、吉西他滨+紫杉醇联合给药；卡培他滨、拉帕替尼、卡培他滨+拉帕替尼。每个给药组设定5个给药浓度梯度，为0％、25％、50％、100％、200％PPC，每个浓度设置8个复孔。

分别在给药第3、5、7天进行细胞ATP测定，计算药物对细胞活性的抑制率，根据细胞ATP测定结果对测试药物的敏感性进行评价。药物敏感性评价依据生物荧光肿瘤体外药敏检测技术(ATP-TCA)的药敏评价标准。同时设置该患者来源的乳腺癌原代细胞普通2D培养作为药敏筛选的平行对照，比较2D药敏筛选和类器官3D细胞球对化疗药物的响应。药物敏感性评价的结果见表2所示。

表2药物敏感性评价结果

从类器官的接种到获得药敏结果仅需10天，其药敏筛选所需时间远远低于人源肿瘤异种移植模型。类器官形成3天即可达到稳定状态，开始药敏筛选实验，给药7天即可获得药敏结果。

根据ATP-TCA药敏评价标准，给药7天后，对于乳腺癌的2D细胞模型，吉西他滨、紫杉醇及其联合给药这3组药物敏感度维持在了中度敏感，虽然药敏度与给药第5天时一致，但抑制率有显著上调，敏感性有一定的时间依赖性。

对于乳腺癌的3D模型组，紫杉醇单独给药组维持了中度敏感度，吉西他滨及其联合给药则由中度敏感增强至强敏感，且药敏度强于2D组。结果显示相较于普通2D培养，该患者的类器官3D培养模型反而对这两组药物的敏感性更强，而该患者的临床化疗也显示其对吉西他滨和紫杉醇联合用药方案敏感。

从药筛筛选实验来看，卡培他滨与拉帕替尼这一组合对此细胞系存在耐药性，对细胞增殖几乎没有抑制作用，说明该组合用药对该患者不敏感。通过比较该患者的临床治疗效果与2D细胞培养和类器官3D细胞球的药敏筛选结果，提示类器官与临床有更好的相关性，类器官3D细胞球药敏筛选会得到更精准的结果，相较于目前常规培养的2D原代肿瘤细胞，本专利技术所建立的类器官3D模型更有利于个体化治疗方案的提出。

另外，从检测结果来看，2D普通培养和类器官3D细胞球状态的乳腺癌细胞均对卡培他滨、拉帕替尼及卡培他滨+拉帕替尼联合用药耐药，仅有两个时间点出现中度敏感，说明该患者对卡培他滨+拉帕替尼联合给药方案耐药；而对吉西他滨+紫杉醇联合用药方案表现出强敏感性，这也一定程度上说明吉西他滨+紫杉醇作为乳腺癌化疗一线用药治疗的有效性。

本发明技术建立的无支架乳腺癌类器官模型不仅可以用于化疗药物的个体化药敏筛选，还可应用于肿瘤发生机制及治疗预后等与乳腺癌的发生、发展及治疗相关的研究。

本文中应用了具体个例对发明构思及应用进行了详细阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离该发明构思的前提下，所做的任何显而易见的修改、等同替换或其他改进，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种乳腺癌无支架类器官专用培养基，适用于培养无支架材料的3D乳腺癌类器官，其特征在于，由以下组分组成：

N-2，

B27，

Noggin，

青霉素/链霉素双抗，

EGF，

FGF10，

Y-27632，

A83-01，

SB202190，

N-乙酰半胱氨酸，

R-Spondin，

烟酰胺，

Wnt3A，

KGF，

庆大霉素，

Heregulin，

胎牛血清，

DMEM-F/12。

2.根据权利要求1所述的乳腺癌无支架类器官专用培养基，其特征在于，各组分在培养基中的终浓度或体积百分比如下：

3.使用权利要求1或2所述乳腺癌无支架类器官专用培养基培养3D乳腺癌类器官的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)纯化：将分离的原代肿瘤细胞悬液经离心去除上清后，收集的沉淀细胞加入到所述专用培养基中，利用差速贴壁法进行细胞纯化；

(2)扩大培养：纯化后的细胞使用专用培养基继续扩增培养；

(3)无支架肿瘤类器官的建立：将细胞培养至80％融合时，用TrypLE消化，离心后用专用培养基重悬细胞，计数后接种至独特结构的96孔PDO专用培养板中，培养箱内培养即可。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(2)培养过程中，专用培养基的第一次换液时间为接种后5天。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(2)培养过程中，第一次换液培养后，每2天更换一次专用培养基。

6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(3)培养过程中，每天更换一次专用培养基。

Images