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CN111574592B - 一类具有拮抗pd-1/pd-l1相互作用的环肽类化合物及其应用 - Google Patents

一类具有拮抗pd-1/pd-l1相互作用的环肽类化合物及其应用 Download PDF

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CN111574592B
CN111574592B CN202010447004.XA CN202010447004A CN111574592B CN 111574592 B CN111574592 B CN 111574592B CN 202010447004 A CN202010447004 A CN 202010447004A CN 111574592 B CN111574592 B CN 111574592B
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Abstract

本发明公开了一种环肽类化合物及其应用，该环肽类化合物及其药学上可以接收的盐、酯或溶剂化合物可以制备PD‑1/PD‑L1通路抑制剂，在制备治疗肿瘤药物中有良好的应用前景。与单抗研究开发相比，PD‑1/PD‑L1抑制剂领域的肽类抑制剂却进展缓慢，所以研究开发抑制PD‑1/PD‑L1相互作用的抑制剂具有重要的临床意义。

Description

一类具有拮抗PD-1/PD-L1相互作用的环肽类化合物及其应用
技术领域
本发明涉及一类化合物及其应用，具体为环肽类化合物及其药学上可以接收的盐、酯或溶剂化合物，其作为PD-1/PD-L1抑制剂在制备治疗恶性肿瘤药物中的用途。
背景技术
PD-1又称CD279，是一种相对分子量为55000～60000的Ⅰ型跨膜蛋白，属免疫球蛋白超家族成员，其结构主要包括胞外免疫球蛋白可变区(IgV)样结构域、疏水的跨膜区以及胞内区。胞内区包括C端和N端氨基酸残基，含有2个独立的磷酸化作用位点，分别为免疫受体酪氨酸抑制基序(immunoreceptor tyrosine based inhibitory motif,ITIM)和免疫受体酪氨酸转换基序(immunoreceptor tyrosine based switch motif,ITSM)。PD-1主要表达于活化的CD4+T细胞、CD8+T细胞、B细胞、NK细胞、单核细胞和树突状细胞等免疫细胞上，促进T细胞的成熟。PD-1的配体属B7家族成员，包括PD-L1(又名B7-H1，CD274)和PD-L2(又名B7-DC)，两者均高表达于胎盘组织；低表达于脾脏、淋巴结、胸腺；脑组织中无表达。其中，PD-L1同是Ⅰ型跨膜蛋白，主要表达于抗原提呈细胞、B细胞、T细胞、上皮细胞、肌细胞、内皮细胞等。PD-1及PD-L1共同组成PD-1/PD-L1信号通路，抑制生长因子的生成和细胞增殖，并对T细胞的活化及调控免疫应答起到重要作用。PD-1/PD-L1通路激活后，在癌症、妊娠、组织移植以及自身免疫病中抑制免疫系统。目前PD-1/PD-L1抑制剂的开发主要集中在单克隆抗体领域，已有Nivolumab,Lambrolizumab,Atezolizumab,Durvalumab,Avelumab等单抗在国内外上市，可用于治疗非小细胞肺癌，黑色素瘤等常规治疗方法效果不佳的疾病具有明显的治疗效果。与单抗研究开发相比，该领域的肽类抑制剂却进展缓慢。所以研究开发抑制PD-1/PD-L1相互作用的抑制剂具有重要的临床意义。
发明内容
发明目的：本发明的目的在于提供一种环肽类化合物及其应用，该化合物为PD-1/PD-L1抑制剂，影响抑制生长因子的生成和细胞增殖。本发明的另一个目的是指出该化合物在制备治疗乳腺癌、黑色素瘤药物中有良好的应用前景。
技术方案：本发明所述的环肽类化合物及其药学上可以接收的盐、酯或溶剂化合物，该化合物结构如通式(I)所示：
Figure GDA0003963383980000021
R1选自于下列结构或其立体异构或消旋体中的一种：
-Me[Ala]、-CH2CH(CH3)2[Leu]、Me(Et)CH-[Ile]、-CH2NMe2[4-aza-leu]、CH3CH2CH2CH2-[Nle]-CH2CH2CH(CH3)2[HOLeu]、
Figure GDA0003963383980000022
[Cpa]；
R2选自于下列结构或其立体异构或消旋体中的一种：
-Me[Ala]、-CH2CH(CH3)2[Leu]、Me(Et)CH-[Ile]、-CH2NMe2[4-aza-leu]、CH3CH2CH2CH2-[Nle]-CH2CH2CH(CH3)2[HOLeu]、
Figure GDA0003963383980000023
[Cpa]、Ph(4-Ph)-CH2-[4-Ph-Phe]、PhCH2-[Phe]、4-OH-Phe[Tyr]；
R3选自于下列结构或其立体异构或消旋体中的一种：
-CH2NH2[Dap]、-CH2CH2NH2[Dab]、-CH2CH2CH2NH2[Orn]、-CH2CH2CH2CH2NH2[Lys]、
Figure GDA0003963383980000024
[His]；
R4、R5选自于下列结构或其立体异构或消旋体中的一种：
Figure GDA0003963383980000031
R6选自于下列结构或其立体异构或消旋体中的一种：
-CH2CONH2[Asn]、-CH2CH2CONH2[Gln]、CH2CH2CH2NHC(N)NH2[Arg]、CH2CH-2CH2NHCONH2[Cit]、CH2NHCONH2[Alb]；
R7，R8选自于下列结构或其立体异构或消旋体中的一种：
Figure GDA0003963383980000032
R9选自于下列结构中的一种：
-H[Phe]，-NH2[4-NH2-Phe]，-NHMe[4-NHMe-Phe]，-NMe2[4-NMe2-Phe]，-OH[Tyr]，-OMe[OMe-Tyr]，-Ph[4-Ph-Phe]；
L选自于下列结构中的一种：
Figure GDA0003963383980000041
Figure GDA0003963383980000042
波浪线指代连接方式。
所述的环肽类化合物及其药学上可以接收的盐、酯或溶剂化合物，所述环肽类化合物选自下述化合物：
Figure GDA0003963383980000043
Figure GDA0003963383980000051
Figure GDA0003963383980000061
Figure GDA0003963383980000071
Figure GDA0003963383980000081
Figure GDA0003963383980000091
药物组合物，包含所述的环肽类化合物及其药学上可以接收的盐、酯或溶剂化合物。
所述的药物组合物，所述环肽类化合物及其药学上可以接收的盐、酯或溶剂化合物添加一种或多种药学上的辅料制成制剂。
所述的药物组合物，所述药学上的辅料包括稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、吸收促进剂、表面活性剂、润滑剂或稳定剂。
所述的药物组合物，所述制剂为片剂、胶囊、颗粒剂、散剂、糖浆剂、口服液或注射剂。
所述的环肽类化合物及其药学上可以接收的盐、酯或溶剂化合物在制备PD-1/PD-L1通路抑制剂中的应用。
所述的环肽类化合物及其药学上可以接收的盐、酯或溶剂化合物在制备T细胞免疫活性增强剂中的应用。
所述的环肽类化合物及其药学上可以接收的盐、酯或溶剂化合物或所述的药物组合物在制备预防或治疗乳腺癌、黑色素瘤药物中的应用。
所述预防或治疗乳腺癌、黑色素瘤药物为乳腺癌、黑色素瘤免疫治疗药物或乳腺癌、黑色素瘤化疗药物或乳腺癌、黑色素瘤靶向治疗药物。
有益效果：本发明提供的环肽类化合物，可制备PD-1/PD-L1抑制剂，影响抑制生长因子的生成和细胞增殖，并对T细胞的活化及调控免疫应答起到重要作用，在制备治疗乳腺癌、黑色素瘤药物中有良好的应用前景。
具体实施方式
1.固相合成一般方法
固相氨基酸的合成均在固相反应合成管中进行，使用rink amide-AM树脂(Merrifield聚合物负载(2,4-二甲氧基苯基)(4-烷氧基苯基)甲烷，其中4-烷氧基为与树脂连接的位置和化学键类型，负载量0.7mmol/g)。使用DMF和DCM溶解反应所用试剂后，沿管壁加入到反应管中，通入氮气后振荡所需时间。之后，反应液从反应管下侧通过真空泵抽去。反应中所用的溶剂和试剂为：DMF＝N,N-二甲基甲酰胺；DCM＝二氯甲烷；HATU＝1-[二(二甲胺基)亚甲基]-3-氧代-1H-1,2,3-三氮唑并[4,5-b]吡啶六氟磷酸盐；DIPEA＝二异丙基乙胺。树脂的溶胀过程如下文“树脂溶胀步骤”所述。缩合步骤如下文“缩合步骤”所述。使用的氨基酸衍生物和末端羧酸如下所示(侧链保护基置于括号中)：Fmoc-L-Gly-OH，Fmoc-L-Cys(Trt)-OH，Fmoc-L-Leu-OH，Fmoc-L-[N-Me]Nle-OH，Fmoc-L-Trp(CH2COOtBu)-OH，Fmoc-L-Trp(Boc)-OH，Fmoc-L-Dab(Boc)-OH，Fmoc-L-[O-tBu]Hyp-OH，Fmoc-L-Dap(Boc)-OH，Fmoc-L-Pro-OH，Fmoc-L-Asn(Trt)-OH，Fmoc-L-[N-Me]Ala-OH，Fmoc-L-[O-tBu]Tyr-OH，ClCH2COOH。
Figure GDA0003963383980000111
在一些实施例中，如下非天然氨基酸或其衍生物会被使用：
Figure GDA0003963383980000121
2.树脂溶胀步骤
将Rink Amide-AM树脂(286mg，0.2mmol)加入到10mL的固相合成反应管中，加入8mL的DCM，静置半小时。之后将DCM经真空泵抽去即可完成树脂的溶胀。
3.缩合步骤
将6mL 20％的哌啶/DMF溶液加入到反应管中，振荡30分钟。反应液抽干，树脂用无水DMF(10mL)，无水甲醇(10mL)和无水DCM(10mL)分别洗涤3次后，取样经四氯苯醌显色，树脂呈蓝色可指示脱除保护基结束。
脱除保护基结束后，将所需氨基酸(0.6mmol)，HATU(228mg，0.6mmol)，DMF(6mL)和DIPEA(210μL，1.2mmol)依次加入到干燥的圆底烧瓶中，超声助溶使其澄清。将混合液加入到固相合成反应管中，25℃反应3小时，取样经四氯苯醌显色，树脂呈无色透明可指示缩合反应结束。树脂用无水DMF(10mL)，无水甲醇(10mL)和无水DCM(10mL)分别洗涤3次后即可进行下一次缩合。
4.肽游离步骤
完成所需直链肽合成后，将树脂再用无水DMF洗涤1次，后抽至干。向干燥的树脂加入切割液(三氟乙酸：硫代苯甲醚：1,2-乙二硫醇：苯甲醚＝90:5:2.5:2.5，体积比)。混合物在10℃下振摇3小时。反应结束后，将切割液抽滤，浓缩至原体积1/5，浓缩液逐滴加入到10倍体积的-20℃无水乙醚中。抽滤形成的沉淀即得粗肽，可不经处理直接进行下一步反应。
5.线性肽环合步骤
取步骤4中所得粗品肽约100mg，溶于50mL乙腈中，向溶液中缓慢加入0.1M碳酸铵水溶液50mL。该反应液在室温下搅拌24小时。反应经RP-HPLC监测结束后，向反应液中加入0.6mL冰醋酸，反应液浓缩至乙腈全部蒸发后，水层经冻干可得环肽粗品。
6.RP-HPLC分离步骤
将所得的粗品肽溶于一定量的纯净水中，使用三乙胺或2M HCl调节PH至7，加入乙腈至澄清，冻干得粗品固体。加入一定量的乙腈使其完全溶解，经0.33μM滤器过滤。使用Aglient Eclipase XDB-C18柱进行分离，流动相A：0.1％TFA/H2O；流动相B：0.1％ TFA/MeCN。色谱条件为10％ B-100％ B，20min。
实施例1
Figure GDA0003963383980000131
的制备：
其合成路线如下所示：
Figure GDA0003963383980000132
取25mL反应管，冲入氮气。依次加入Fmoc-(4-Br)-Phe-OH(1，233mg，0.5mmol)，PhB(OH)2(122mg，1mmol)，Pd(OAc)2(5.1mg,4.5mol％)，DtBuPF(11.9mg，5mol％)和K3PO4(265mg,1.25mmol)。加料完成后，反应液通入氮气以除去其他气体，然后加热至50℃。16小时后，加入20％的醋酸水溶液调节pH至4-5，有机层分离，水层再用乙酸乙酯萃取3次。有机层合并后浓缩至干，粗品经硅胶柱层析分离(石油醚：乙酸乙酯＝10:1)可得目标产物197mg，收率85％。该化合物的核磁共振氢谱数据与文献报道(J.Org.Chem.2016,81,9499-9506)完全一致，可认为是目标产物。
实施例2
Figure GDA0003963383980000141
的制备
其合成路线如下所示：
Figure GDA0003963383980000142
取化合物3(250mg，1.3mmol)溶于13mL丙酮中，缓慢加入10％碳酸钠水溶液13mL。反应液移至0℃，加入Fmoc-OSu(526mg，1.56mmol)。在0℃下搅拌5分钟后，反应液移至室温并搅拌24小时。反应结束后，加入2M盐酸溶液调节pH至2-3，加入乙酸乙酯萃取3次，水洗2次，饱和食盐水洗1次。有机层经无水硫酸钠干燥后，浓缩至干。粗品经硅胶柱层析分离(二氯甲烷：甲醇＝150:1)可得目标产物368mg，收率75％。1H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ7.81(dd,J＝7.8,1.1Hz,2H),7.70(dd,J＝7.7,1.5Hz,2H),7.65(td,J＝7.6,1.5Hz,2H),7.56(td,J＝7.6,1.2Hz,2H),4.46(d,J＝5.4Hz,2H),4.35–4.29(m,1H),4.21(d,J＝6.5Hz,1H),3.71(dd,J＝10.3,4.2Hz,1H),3.42(dd,J＝10.3,3.3Hz,1H),2.40–2.28(m,2H),1.77(m,1H),1.72–1.46(m,4H),1.39(m,1H).13C NMR(125MHz,Chloroform-d)δ172.84,156.53,144.92,144.83,139.80,127.04,126.92,125.02,124.92,122.20,122.09,69.76,67.37,54.22,47.92,47.21,46.36,34.04,33.48,25.64.HRESIMS:378.1633[M+H]+,calcd378.1626.
实施例3
S3的制备
根据前述“树脂溶胀步骤”，使树脂溶胀后，根据“缩合步骤”，选用氨基酸分别为Fmoc-L-Gly-OH，Fmoc-L-Cys(Trt)-OH，Fmoc-L-Leu-OH，Boc-L-Trp-OH，Fmoc-L-Trp(Boc)-OH，Fmoc-L-Dab(Boc)-OH，Fmoc-L-[O-tBu]Hyp-OH，Fmoc-L-Dap(Boc)-OH，Fmoc-L-Pro-OH，Fmoc-L-Asn(Trt)-OH，Fmoc-L-[N-Me]Ala-OH，Fmoc-L-Ala-OH，Fmoc-L-[O-tBu]Tyr-OH。缩合完成后，根据前述“肽游离步骤”可得直链肽前体粗品，根据前述“线性肽环合步骤”可得环肽粗品。将该混合物溶于乙腈：水＝1:1(体积比)中，根据前述“RP-HPLC分离步骤”可得环肽化合物纯品。tR＝14.892min。HRESIMS:[M+H]+＝1844.9095。
实施例4
S4的制备
根据前述“树脂溶胀步骤”，使树脂溶胀后，根据“缩合步骤”，选用氨基酸分别为Fmoc-L-Gly-OH，Fmoc-L-Cys(Trt)-OH，Fmoc-L-Leu-OH，Boc-L-Trp-OH，Fmoc-L-Trp(Boc)-OH，Fmoc-L-Dab(Boc)-OH，Fmoc-L-[O-tBu]Hyp-OH，Fmoc-L-Dap(Boc)-OH，Fmoc-L-Pro-OH，Fmoc-L-Asn(Trt)-OH，Fmoc-L-[N-Me]Ala-OH，Fmoc-L-Val-OH，Fmoc-L-[O-tBu]Tyr-OH。缩合完成后，根据前述“肽游离步骤”可得直链肽前体粗品，根据前述“线性肽环合步骤”可得环肽粗品。将该混合物溶于乙腈：水＝1:1(体积比)中，根据前述“RP-HPLC分离步骤”可得环肽化合物纯品。tR＝14.635min。
HRESIMS:[M+H]+＝1879.9401。
实施例5
S5的制备
根据前述“树脂溶胀步骤”，使树脂溶胀后，根据“缩合步骤”，选用氨基酸分别为Fmoc-L-Gly-OH，Fmoc-L-Cys(Trt)-OH，Fmoc-L-Leu-OH，Boc-L-Trp-OH，Fmoc-L-Trp(Boc)-OH，Fmoc-L-Dab(Boc)-OH，Fmoc-L-[O-tBu]Hyp-OH，Fmoc-L-Dap(Boc)-OH，Fmoc-L-Pro-OH，Fmoc-L-Asn(Trt)-OH，Fmoc-L-[N-Me]Ala-OH，Fmoc-L-Val-OH，Fmoc-L-[O-tBu]Tyr-OH。缩合完成后，根据前述“肽游离步骤”可得直链肽前体粗品，根据前述“线性肽环合步骤”可得环肽粗品。将该混合物溶于乙腈：水＝1:1(体积比)中，根据前述“RP-HPLC分离步骤”可得环肽化合物纯品。tR＝14.812min。HRESIMS:[M+H]+＝1886.9555。
实施例6
S6的制备
根据前述“树脂溶胀步骤”，使树脂溶胀后，根据“缩合步骤”，选用氨基酸分别为Fmoc-L-Gly-OH，Fmoc-L-Cys(Trt)-OH，Fmoc-L-Leu-OH，Boc-L-Trp-OH，Fmoc-L-Trp(Boc)-OH，Fmoc-L-Dab(Boc)-OH，Fmoc-L-[O-tBu]Hyp-OH，Fmoc-L-Dap(Boc)-OH，Fmoc-L-Pro-OH，Fmoc-L-Asn(Trt)-OH，Fmoc-L-[N-Me]Ala-OH，Fmoc-L-Val-OH，Fmoc-L-[O-tBu]Tyr-OH。缩合完成后，根据前述“肽游离步骤”可得直链肽前体粗品，根据前述“线性肽环合步骤”可得环肽粗品。将该混合物溶于乙腈：水＝1:1(体积比)中，根据前述“RP-HPLC分离步骤”可得环肽化合物纯品。tR＝14.812min。HRESIMS:[M+H]+＝1886.9557。
实施例7
S7的制备
根据前述“树脂溶胀步骤”，使树脂溶胀后，根据“缩合步骤”，选用氨基酸分别为Fmoc-L-Gly-OH，Fmoc-L-Cys(Trt)-OH，Fmoc-L-Leu-OH，Boc-L-Trp-OH，Fmoc-L-Trp(Boc)-OH，Fmoc-L-Dab(Boc)-OH，Fmoc-L-[O-tBu]Hyp-OH，Fmoc-L-Dap(Boc)-OH，Fmoc-L-Pro-OH，Fmoc-L-Asn(Trt)-OH，Fmoc-L-[N-Me]Ala-OH，Fmoc-L-Val-OH，Fmoc-L-[O-tBu]Tyr-OH。缩合完成后，根据前述“肽游离步骤”可得直链肽前体粗品，根据前述“线性肽环合步骤”可得环肽粗品。将该混合物溶于乙腈：水＝1:1(体积比)中，根据前述“RP-HPLC分离步骤”可得环肽化合物纯品。tR＝15.022min。HRESIMS:[M+H]+＝1996.9712。
实施例8
S8的制备
根据前述“树脂溶胀步骤”，使树脂溶胀后，根据“缩合步骤”，选用氨基酸分别为Fmoc-L-Gly-OH，Fmoc-L-Cys(Trt)-OH，Fmoc-L-Leu-OH，Boc-L-Trp-OH，Fmoc-L-Trp(Boc)-OH，Fmoc-L-Dab(Boc)-OH，Fmoc-L-[O-tBu]Hyp-OH，Fmoc-L-Dap(Boc)-OH，Fmoc-L-Pro-OH，Fmoc-L-Asn(Trt)-OH，Fmoc-L-[N-Me]Ala-OH，Fmoc-L-Leu-OH，Fmoc-L-[O-tBu]Tyr-OH。缩合完成后，根据前述“肽游离步骤”可得直链肽前体粗品，根据前述“线性肽环合步骤”可得环肽粗品。将该混合物溶于乙腈：水＝1:1(体积比)中，根据前述“RP-HPLC分离步骤”可得环肽化合物纯品。tR＝15.022min。HRESIMS:[M+H]+＝1996.9712。
实施例9
S9的制备
根据前述“树脂溶胀步骤”，使树脂溶胀后，根据“缩合步骤”，选用氨基酸分别为Fmoc-L-Gly-OH，Fmoc-L-Cys(Trt)-OH，Fmoc-L-Leu-OH，Boc-L-Trp-OH，Fmoc-L-Trp(Boc)-OH，Fmoc-L-Dab(Boc)-OH，Fmoc-L-[O-tBu]Hyp-OH，Fmoc-L-Dap(Boc)-OH，Fmoc-L-Pro-OH，Fmoc-L-Asn(Trt)-OH，Fmoc-L-[N-Me]Ala-OH，Fmoc-Oic-OH，Fmoc-L-[O-tBu]Tyr-OH。缩合完成后，根据前述“肽游离步骤”可得直链肽前体粗品，根据前述“线性肽环合步骤”可得环肽粗品。将该混合物溶于乙腈：水＝1:1(体积比)中，根据前述“RP-HPLC分离步骤”可得环肽化合物纯品。tR＝14.922min。HRESIMS:[M+H]+＝1941.0002。
实施例10
S10的制备
根据前述“树脂溶胀步骤”，使树脂溶胀后，根据“缩合步骤”，选用氨基酸分别为Fmoc-L-Gly-OH，Fmoc-L-Cys(Trt)-OH，Fmoc-L-Leu-OH，Boc-L-Trp-OH，Fmoc-L-Trp(Boc)-OH，Fmoc-L-Dab(Boc)-OH，Fmoc-L-[O-tBu]Hyp-OH，Fmoc-L-Dap(Boc)-OH，Fmoc-L-Pro-OH，Fmoc-L-Asn(Trt)-OH，Fmoc-L-[N-Me]Ala-OH，Fmoc-L-[O-tBu]Tyr-OH和实施例2中的化合物4。缩合完成后，根据前述“肽游离步骤”可得直链肽前体粗品，根据前述“线性肽环合步骤”可得环肽粗品。将该混合物溶于乙腈：水＝1:1(体积比)中，根据前述“RP-HPLC分离步骤”可得环肽化合物纯品。tR＝14.910min。HRESIMS:[M+H]+＝1926.9855。
实施例11
S11的制备
根据前述“树脂溶胀步骤”，使树脂溶胀后，根据“缩合步骤”，选用氨基酸分别为Fmoc-L-Gly-OH，Fmoc-L-Cys(Trt)-OH，Fmoc-L-Leu-OH，Boc-L-Trp-OH，Fmoc-L-Trp(Boc)-OH，Fmoc-L-Dab(Boc)-OH，Fmoc-L-[O-tBu]Hyp-OH，Fmoc-L-Dap(Boc)-OH，Fmoc-L-Pro-OH，Fmoc-L-Asn(Trt)-OH，Fmoc-L-[N-Me]Ala-OH，Fmoc-L-[O-tBu]Tyr-OH和实施例2中的化合物4。缩合完成后，根据前述“肽游离步骤”可得直链肽前体粗品，根据前述“线性肽环合步骤”可得环肽粗品。将该混合物溶于乙腈：水＝1:1(体积比)中，根据前述“RP-HPLC分离步骤”可得环肽化合物纯品。tR＝15.202min。HRESIMS:[M+H]+＝1904.2346。
实施例12
S12的制备
根据前述“树脂溶胀步骤”，使树脂溶胀后，根据“缩合步骤”，选用氨基酸分别为Fmoc-L-Gly-OH，Fmoc-L-Cys(Trt)-OH，Fmoc-L-Leu-OH，Boc-L-Trp-OH，Fmoc-L-Trp(Boc)-OH，Fmoc-L-Dab(Boc)-OH，Fmoc-L-[O-tBu]Hyp-OH，Fmoc-L-Dap(Boc)-OH，Fmoc-L-Pro-OH，Fmoc-L-Asn(Trt)-OH，Fmoc-L-[N-Me]Ala-OH，Fmoc-L-[O-tBu]Tyr-OH和S-Fmoc-piperidine-2-carboxylic acid。缩合完成后，根据前述“肽游离步骤”可得直链肽前体粗品，根据前述“线性肽环合步骤”可得环肽粗品。将该混合物溶于乙腈：水＝1:1(体积比)中，根据前述“RP-HPLC分离步骤”可得环肽化合物纯品。tR＝14.961min。HRESIMS:[M+H]+＝1900.9766。
实施例13
S13的制备
根据前述“树脂溶胀步骤”，使树脂溶胀后，根据“缩合步骤”，选用氨基酸分别为Fmoc-L-Gly-OH，Fmoc-L-Cys(Trt)-OH，Fmoc-L-Leu-OH，Boc-L-Trp-OH，Fmoc-L-Trp(Boc)-OH，Fmoc-L-Dab(Boc)-OH，Fmoc-L-[O-tBu]Hyp-OH，Fmoc-L-Dap(Boc)-OH，Fmoc-L-Pro-OH，Fmoc-L-Asn(Trt)-OH，Fmoc-L-[N-Me]Ala-OH，Fmoc-L-[O-tBu]Tyr-OH。缩合完成后，根据前述“肽游离步骤”可得直链肽前体粗品，根据前述“线性肽环合步骤”可得环肽粗品。将该混合物溶于乙腈：水＝1:1(体积比)中，根据前述“RP-HPLC分离步骤”可得环肽化合物纯品。tR＝14.929min。HRESIMS:[M+H]+＝1898.9523。
实施例14
S14的制备
根据前述“树脂溶胀步骤”，使树脂溶胀后，根据“缩合步骤”，选用氨基酸分别为Fmoc-L-Gly-OH，Fmoc-L-Cys(Trt)-OH，Fmoc-L-Leu-OH，Boc-L-Trp-OH，Fmoc-L-Trp(Boc)-OH，Fmoc-L-Dab(Boc)-OH，Fmoc-L-[O-tBu]Hyp-OH，Fmoc-L-Dap(Boc)-OH，Fmoc-L-Pro-OH，Fmoc-L-Asn(Trt)-OH，Fmoc-L-[N-Me]Ala-OH，Fmoc-L-[O-tBu]Tyr-OH。缩合完成后，根据前述“肽游离步骤”可得直链肽前体粗品，根据前述“线性肽环合步骤”可得环肽粗品。将该混合物溶于乙腈：水＝1:1(体积比)中，根据前述“RP-HPLC分离步骤”可得环肽化合物纯品。tR＝15.000min。HRESIMS:[M+H]+＝1953.0001。
实施例15
S15的制备
根据前述“树脂溶胀步骤”，使树脂溶胀后，根据“缩合步骤”，选用氨基酸分别为Fmoc-L-Gly-OH，Fmoc-L-Cys(Trt)-OH，Fmoc-L-Leu-OH，Boc-L-Trp-OH，Fmoc-L-Trp(Boc)-OH，Fmoc-L-Dab(Boc)-OH，Fmoc-L-[O-tBu]Hyp-OH，Fmoc-L-Dap(Boc)-OH，Fmoc-L-Pro-OH，Fmoc-L-Asn(Trt)-OH，Fmoc-L-[N-Me]Ala-OH，Fmoc-L-[O-tBu]Tyr-OH。缩合完成后，根据前述“肽游离步骤”可得直链肽前体粗品，根据前述“线性肽环合步骤”可得环肽粗品。将该混合物溶于乙腈：水＝1:1(体积比)中，根据前述“RP-HPLC分离步骤”可得环肽化合物纯品。tR＝14.992min。HRESIMS:[M+H]+＝1953.0001。
实施例16
S16的制备
根据前述“树脂溶胀步骤”，使树脂溶胀后，根据“缩合步骤”，选用氨基酸分别为Fmoc-L-Gly-OH，Fmoc-L-Cys(Trt)-OH，Fmoc-L-Leu-OH，Boc-L-Trp-OH，Fmoc-L-Trp(Boc)-OH，Fmoc-L-Dab(Boc)-OH，Fmoc-L-[O-tBu]Hyp-OH，Fmoc-L-Dap(Boc)-OH，Fmoc-L-Pro-OH，Fmoc-L-Asn(Trt)-OH，Fmoc-L-[N-Me]Ala-OH，Fmoc-L-[O-tBu]Tyr-OH。缩合完成后，根据前述“肽游离步骤”可得直链肽前体粗品，根据前述“线性肽环合步骤”可得环肽粗品。将该混合物溶于乙腈：水＝1:1(体积比)中，根据前述“RP-HPLC分离步骤”可得环肽化合物纯品。tR＝15.101min。HRESIMS:[M+H]+＝1914.9496。
实施例17
S17的制备
根据前述“树脂溶胀步骤”，使树脂溶胀后，根据“缩合步骤”，选用氨基酸分别为Fmoc-L-Gly-OH，Fmoc-L-Cys(Trt)-OH，Fmoc-L-Leu-OH，Boc-L-Trp-OH，Fmoc-L-Trp(Boc)-OH，Fmoc-L-Dab(Boc)-OH，Fmoc-L-[O-tBu]Hyp-OH，Fmoc-L-Dap(Boc)-OH，Fmoc-L-Pro-OH，Fmoc-L-Asn(Trt)-OH，Fmoc-L-[N-Me]Ala-OH，Fmoc-L-[O-tBu]Tyr-OH。缩合完成后，根据前述“肽游离步骤”可得直链肽前体粗品，根据前述“线性肽环合步骤”可得环肽粗品。将该混合物溶于乙腈：水＝1:1(体积比)中，根据前述“RP-HPLC分离步骤”可得环肽化合物纯品。tR＝15.101min。HRESIMS:[M+H]+＝1914.9487。
实施例18
S18的制备
根据前述“树脂溶胀步骤”，使树脂溶胀后，根据“缩合步骤”，选用氨基酸分别为Fmoc-L-Gly-OH，Fmoc-L-Cys(Trt)-OH，Fmoc-L-Leu-OH，Boc-L-Trp-OH，Fmoc-L-Trp(Boc)-OH，Fmoc-L-Dab(Boc)-OH，Fmoc-L-[O-tBu]Hyp-OH，Fmoc-L-Dap(Boc)-OH，Fmoc-L-Pro-OH，Fmoc-L-Asn(Trt)-OH，Fmoc-L-[N-Me]Ala-OH，Fmoc-L-[O-tBu]Tyr-OH。缩合完成后，根据前述“肽游离步骤”可得直链肽前体粗品，根据前述“线性肽环合步骤”可得环肽粗品。将该混合物溶于乙腈：水＝1:1(体积比)中，根据前述“RP-HPLC分离步骤”可得环肽化合物纯品。tR＝14.892min。HRESIMS:[M+H]+＝1912.9755。
实施例19
S19的制备
根据前述“树脂溶胀步骤”，使树脂溶胀后，根据“缩合步骤”，选用氨基酸分别为Fmoc-L-Gly-OH，Fmoc-L-Cys(Trt)-OH，Fmoc-L-Leu-OH，Boc-L-Trp-OH，Fmoc-L-Trp(Boc)-OH，Fmoc-L-Dab(Boc)-OH，Fmoc-L-[O-tBu]Hyp-OH，Fmoc-L-Dap(Boc)-OH，Fmoc-L-Pro-OH，Fmoc-L-Asn(Trt)-OH，Fmoc-L-[N-Me]Ala-OH，Fmoc-L-[O-tBu]Tyr-OH。缩合完成后，根据前述“肽游离步骤”可得直链肽前体粗品，根据前述“线性肽环合步骤”可得环肽粗品。将该混合物溶于乙腈：水＝1:1(体积比)中，根据前述“RP-HPLC分离步骤”可得环肽化合物纯品。tR＝14.999min。HRESIMS:[M+H]+＝1812.9623。
实施例20
S20的制备
根据前述“树脂溶胀步骤”，使树脂溶胀后，根据“缩合步骤”，选用氨基酸分别为Fmoc-L-Gly-OH，Fmoc-L-Cys(Trt)-OH，Fmoc-L-Leu-OH，Boc-L-Trp-OH，Fmoc-L-Trp(Boc)-OH，Fmoc-L-Dab(Boc)-OH，Fmoc-L-[O-tBu]Hyp-OH，Fmoc-L-Dap(Boc)-OH，Fmoc-L-Pro-OH，Fmoc-L-Asn(Trt)-OH，Fmoc-L-[N-Me]Ala-OH，Fmoc-L-[O-tBu]Tyr-OH。缩合完成后，根据前述“肽游离步骤”可得直链肽前体粗品，根据前述“线性肽环合步骤”可得环肽粗品。将该混合物溶于乙腈：水＝1:1(体积比)中，根据前述“RP-HPLC分离步骤”可得环肽化合物纯品。tR＝15.102min。HRESIMS:[M+H]+＝1897.9724。
实施例21
S21的制备
根据前述“树脂溶胀步骤”，使树脂溶胀后，根据“缩合步骤”，选用氨基酸分别为Fmoc-L-Gly-OH，Fmoc-L-Cys(Trt)-OH，Fmoc-L-Leu-OH，Boc-L-Trp-OH，Fmoc-L-Trp(Boc)-OH，Fmoc-L-Dab(Boc)-OH，Fmoc-L-[O-tBu]Hyp-OH，Fmoc-L-Dap(Boc)-OH，Fmoc-L-Pro-OH，Fmoc-L-Asn(Trt)-OH，Fmoc-L-[N-Me]Ala-OH，Fmoc-L-[O-tBu]Tyr-OH。缩合完成后，根据前述“肽游离步骤”可得直链肽前体粗品，根据前述“线性肽环合步骤”可得环肽粗品。将该混合物溶于乙腈：水＝1:1(体积比)中，根据前述“RP-HPLC分离步骤”可得环肽化合物纯品。tR＝14.986min。HRESIMS:[M+H]+＝1911.9880。
实施例22
S22的制备
根据前述“树脂溶胀步骤”，使树脂溶胀后，根据“缩合步骤”，选用氨基酸分别为Fmoc-L-Gly-OH，Fmoc-L-Cys(Trt)-OH，Fmoc-L-Leu-OH，Boc-L-Trp-OH，Fmoc-L-Trp(Boc)-OH，Fmoc-L-Dab(Boc)-OH，Fmoc-L-[O-tBu]Hyp-OH，Fmoc-L-Dap(Boc)-OH，Fmoc-L-Pro-OH，Fmoc-L-Asn(Trt)-OH，Fmoc-L-[N-Me]Ala-OH，Fmoc-L-[O-tBu]Tyr-OH。缩合完成后，根据前述“肽游离步骤”可得直链肽前体粗品，根据前述“线性肽环合步骤”可得环肽粗品。将该混合物溶于乙腈：水＝1:1(体积比)中，根据前述“RP-HPLC分离步骤”可得环肽化合物纯品。tR＝15.001min。HRESIMS:[M+H]+＝1898.9466。
实施例23
S23的制备
根据前述“树脂溶胀步骤”，使树脂溶胀后，根据“缩合步骤”，选用氨基酸分别为Fmoc-L-Gly-OH，Fmoc-L-Cys(Trt)-OH，Fmoc-L-Leu-OH，Boc-L-Trp-OH，Fmoc-L-Trp(Boc)-OH，Fmoc-L-Dab(Boc)-OH，Fmoc-L-[O-tBu]Hyp-OH，Fmoc-L-Dap(Boc)-OH，Fmoc-L-Pro-OH，Fmoc-L-Asn(Trt)-OH，Fmoc-L-[N-Me]Ala-OH，Fmoc-L-[O-tBu]Tyr-OH。缩合完成后，根据前述“肽游离步骤”可得直链肽前体粗品，根据前述“线性肽环合步骤”可得环肽粗品。将该混合物溶于乙腈：水＝1:1(体积比)中，根据前述“RP-HPLC分离步骤”可得环肽化合物纯品。tR＝14.886min。HRESIMS:[M+H]+＝1912.9733。
实施例24
S24的制备
根据前述“树脂溶胀步骤”，使树脂溶胀后，根据“缩合步骤”，选用氨基酸分别为Fmoc-L-Gly-OH，Fmoc-L-Cys(Trt)-OH，Fmoc-L-Leu-OH，Boc-L-Trp-OH，Fmoc-L-Trp(Boc)-OH，Fmoc-L-Dab(Boc)-OH，Fmoc-L-[O-tBu]Hyp-OH，Fmoc-L-Dap(Boc)-OH，Fmoc-L-Pro-OH，Fmoc-L-Asn(Trt)-OH，Fmoc-L-[N-Me]Ala-OH，Fmoc-L-[O-tBu]Tyr-OH。缩合完成后，根据前述“肽游离步骤”可得直链肽前体粗品，根据前述“线性肽环合步骤”可得环肽粗品。将该混合物溶于乙腈：水＝1:1(体积比)中，根据前述“RP-HPLC分离步骤”可得环肽化合物纯品。tR＝15.102min。HRESIMS:[M+H]+＝1953.0002。
实施例25
S25的制备
根据前述“树脂溶胀步骤”，使树脂溶胀后，根据“缩合步骤”，选用氨基酸分别为Fmoc-L-Gly-OH，Fmoc-L-Cys(Trt)-OH，Fmoc-L-Leu-OH，Boc-L-Trp-OH，Fmoc-L-Trp(Boc)-OH，Fmoc-L-Dab(Boc)-OH，Fmoc-L-[O-tBu]Hyp-OH，Fmoc-L-Dap(Boc)-OH，Fmoc-L-Pro-OH，Fmoc-L-Asn(Trt)-OH，Fmoc-L-[N-Me]Ala-OH，Fmoc-L-[O-tBu]Tyr-OH。缩合完成后，根据前述“肽游离步骤”可得直链肽前体粗品，根据前述“线性肽环合步骤”可得环肽粗品。将该混合物溶于乙腈：水＝1:1(体积比)中，根据前述“RP-HPLC分离步骤”可得环肽化合物纯品。tR＝15.220min。HRESIMS:[M+H]+＝1958.9986。
实施例26
S26的制备
根据前述“树脂溶胀步骤”，使树脂溶胀后，根据“缩合步骤”，选用氨基酸分别为Fmoc-L-Gly-OH，Fmoc-L-Cys(Trt)-OH，Fmoc-L-Leu-OH，Boc-L-Trp-OH，Fmoc-L-Trp(Boc)-OH，Fmoc-L-Dab(Boc)-OH，Fmoc-L-[O-tBu]Hyp-OH，Fmoc-L-Dap(Boc)-OH，Fmoc-L-Pro-OH，Fmoc-L-Asn(Trt)-OH，Fmoc-L-[3-F]-Pro-OH，Fmoc-L-[O-tBu]Tyr-OH。缩合完成后，根据前述“肽游离步骤”可得直链肽前体粗品，根据前述“线性肽环合步骤”可得环肽粗品。将该混合物溶于乙腈：水＝1:1(体积比)中，根据前述“RP-HPLC分离步骤”可得环肽化合物纯品。tR＝14.993min。HRESIMS:[M+H]+＝1915.9503。
实施例27
S27的制备
根据前述“树脂溶胀步骤”，使树脂溶胀后，根据“缩合步骤”，选用氨基酸分别为Fmoc-L-Gly-OH，Fmoc-L-Cys(Trt)-OH，Fmoc-L-Leu-OH，Boc-L-Trp-OH，Fmoc-L-Trp(Boc)-OH，Fmoc-L-Dab(Boc)-OH，Fmoc-L-[O-tBu]Hyp-OH，Fmoc-L-Dap(Boc)-OH，Fmoc-L-Pro-OH，Fmoc-L-Asn(Trt)-OH，Fmoc-L-[3-F]-Pro-OH，Fmoc-L-[O-tBu]Tyr-OH。缩合完成后，根据前述“肽游离步骤”可得直链肽前体粗品，根据前述“线性肽环合步骤”可得环肽粗品。将该混合物溶于乙腈：水＝1:1(体积比)中，根据前述“RP-HPLC分离步骤”可得环肽化合物纯品。tR＝15.230min。HRESIMS:[M+H]+＝1915.9798。
实施例28
S28的制备
根据前述“树脂溶胀步骤”，使树脂溶胀后，根据“缩合步骤”，选用氨基酸分别为Fmoc-L-Gly-OH，Fmoc-L-Cys(Trt)-OH，Fmoc-L-Leu-OH，Boc-L-Trp-OH，Fmoc-L-Trp(Boc)-OH，Fmoc-L-Dab(Boc)-OH，Fmoc-L-[O-tBu]Hyp-OH，Fmoc-L-Dap(Boc)-OH，Fmoc-L-Pro-OH，Fmoc-L-Asn(Trt)-OH，Fmoc-L-[3-F]-Pro-OH，Fmoc-L-[O-tBu]Tyr-OH。缩合完成后，根据前述“肽游离步骤”可得直链肽前体粗品，根据前述“线性肽环合步骤”可得环肽粗品。将该混合物溶于乙腈：水＝1:1(体积比)中，根据前述“RP-HPLC分离步骤”可得环肽化合物纯品。tR＝15.230min。HRESIMS:[M+H]+＝1930.9497。
实施例29
S29的制备
根据前述“树脂溶胀步骤”，使树脂溶胀后，根据“缩合步骤”，选用氨基酸分别为Fmoc-L-Gly-OH，Fmoc-L-Cys(Trt)-OH，Fmoc-L-Leu-OH，Boc-L-Trp-OH，Fmoc-L-Trp(Boc)-OH，Fmoc-L-Dab(Boc)-OH，Fmoc-L-[O-tBu]Hyp-OH，Fmoc-L-Dap(Boc)-OH，Fmoc-L-Pro-OH，Fmoc-L-Asn(Trt)-OH，Fmoc-L-[3-F]-Pro-OH，Fmoc-L-[O-tBu]Tyr-OH。缩合完成后，根据前述“肽游离步骤”可得直链肽前体粗品，根据前述“线性肽环合步骤”可得环肽粗品。将该混合物溶于乙腈：水＝1:1(体积比)中，根据前述“RP-HPLC分离步骤”可得环肽化合物纯品。tR＝15.298min。HRESIMS:[M+H]+＝1966.0170。
实施例30
Figure GDA0003963383980000231
的制备
Fmoc-4-aza-Leu的合成路线如下所示：
Figure GDA0003963383980000232
将化合物5(1.1g，5mmol)溶于70mL甲醇中，加入37％甲醛的水溶液2.3mL，氮气置换反应瓶中的气体。之后加入0.22g 10％ Pd/C，反应瓶用氢气球置换气体。反应液在室温下搅拌24小时。反应经TLC监测(DCM:MeOH＝5:1，茚三酮显色)结束后，反应液经硅藻土助滤，滤液浓缩至近干，冻干除去剩余的溶剂可得化合物6粗品，可不经纯化直接进行下一步反应。
将化合物6粗品(约5mmol)溶于22mL DCM中，加入5mL三乙基硅烷，缓慢加入三氟醋酸22mL，该反应液在室温下反应1小时。反应结束后，反应液浓缩至干，加入无水乙醚，倾倒上清液可得油状化合物7粗品，可不经纯化直接进行下一步反应。
将化合物7(约5mmol)溶于70mL水中，分批加入碳酸钠(1.6g，15mmol)，反应液搅拌至无气体产生后，反应液移至冰浴，将Fmoc-OSu(1.9g，5.5mmol)溶于35mL二氧六环中，逐滴加入到反应液中。该反应在0℃下搅拌1小时，然后在室温下搅拌16小时。TLC监测反应结束后(DCM:MeOH＝5:1，茚三酮显色、紫外显色)，加入乙醚。弃去有机层，水层用2M HCl调节pH至3，用乙酸乙酯萃取3次。有机层合并，水洗2次，饱和氯化钠洗1次。有机层浓缩至干，经硅胶柱层析分离(DCM:MeOH＝8:1～3:1)可得目标产物化合物8(700mg，三步总产率47％)。1HNMR(300MHz,Methanol-d4)δ7.80(d,J＝7.4Hz,2H),7.67(t,J＝6.5Hz,2H),7.49–7.36(m,2H),7.31(m,2H),4.61–4.28(m,2H),4.22(t,J＝6.7Hz,1H),3.37(s,2H),3.61–3.15(m,1H),2.92(s,6H).13C NMR(125MHz,Methanol-d4)δ172.6,158.7,144.8,139.8,127.0,126.9,124.9,122.1,66.8,61.2,50.8,47.6,46.2。MS(ESI)＝354.2(M+H)+。
实施例31
S31的制备
根据前述“树脂溶胀步骤”，使树脂溶胀后，根据“缩合步骤”，选用氨基酸分别为Fmoc-L-Gly-OH，Fmoc-L-Cys(Trt)-OH，Fmoc-L-Leu-OH，Boc-L-Trp-OH，Fmoc-L-Trp(Boc)-OH，Fmoc-L-Dab(Boc)-OH，Fmoc-L-[O-tBu]Hyp-OH，Fmoc-L-Dap(Boc)-OH，Fmoc-L-HoPro-OH，Fmoc-L-Asn(Trt)-OH，Fmoc-L-[3-F]-Pro-OH，Fmoc-L-[O-tBu]Tyr-OH。缩合完成后，根据前述“肽游离步骤”可得直链肽前体粗品，根据前述“线性肽环合步骤”可得环肽粗品。将该混合物溶于乙腈：水＝1:1(体积比)中，根据前述“RP-HPLC分离步骤”可得环肽化合物纯品。tR＝14.864min。HRESIMS:[M+H]+＝1927.9645。
实施例32
S32的制备
根据前述“树脂溶胀步骤”，使树脂溶胀后，根据“缩合步骤”，选用氨基酸分别为Fmoc-L-Gly-OH，Fmoc-L-Cys(Trt)-OH，Fmoc-L-Leu-OH，Fmoc-L-4-aza-Leu-OH，Boc-L-Trp-OH，Fmoc-L-Trp(Boc)-OH，Fmoc-L-Dab(Boc)-OH，Fmoc-L-[O-tBu]Hyp-OH，Fmoc-L-Dap(Boc)-OH，Fmoc-L-HoPro-OH，Fmoc-L-Asn(Trt)-OH，Fmoc-L-[3-F]-Pro-OH，Fmoc-L-[O-tBu]Tyr-OH。缩合完成后，根据前述“肽游离步骤”可得直链肽前体粗品，根据前述“线性肽环合步骤”可得环肽粗品。将该混合物溶于乙腈：水＝1:1(体积比)中，根据前述“RP-HPLC分离步骤”可得环肽化合物纯品。tR＝13.992min。HRESIMS:[M+H]+＝1928.9611。
实施例33
S33的制备
根据前述“树脂溶胀步骤”，使树脂溶胀后，根据“缩合步骤”，选用氨基酸分别为Fmoc-L-Gly-OH，Fmoc-L-Cys(Trt)-OH，Fmoc-L-Leu-OH，Fmoc-L-4-aza-Leu-OH，Boc-L-Trp-OH，Fmoc-L-Trp(Boc)-OH，Fmoc-L-Dab(Boc)-OH，Fmoc-L-[O-tBu]Hyp-OH，Fmoc-L-Dap(Boc)-OH，Fmoc-L-HoPro-OH，Fmoc-L-Asn(Trt)-OH，Fmoc-L-[3-F]-Pro-OH，Fmoc-L-[O-tBu]Tyr-OH。缩合完成后，根据前述“肽游离步骤”可得直链肽前体粗品，根据前述“线性肽环合步骤”可得环肽粗品。将该混合物溶于乙腈：水＝1:1(体积比)中，根据前述“RP-HPLC分离步骤”可得环肽化合物纯品。tR＝13.992min。HRESIMS:[M+H]+＝1928.9610。
实施例34
S34的制备
根据前述“树脂溶胀步骤”，使树脂溶胀后，根据“缩合步骤”，选用氨基酸分别为Fmoc-L-Gly-OH，Fmoc-L-Cys(Trt)-OH，Fmoc-L-Leu-OH，Fmoc-L-4-aza-Leu-OH，Boc-L-Trp-OH，Fmoc-L-Trp(Boc)-OH，Fmoc-L-Dab(Boc)-OH，Fmoc-L-[O-tBu]Hyp-OH，Fmoc-L-Dap(Boc)-OH，Fmoc-L-HoPro-OH，Fmoc-L-Asn(Trt)-OH，Fmoc-L-[3-F]-Pro-OH，Fmoc-L-[O-tBu]Tyr-OH。缩合完成后，根据前述“肽游离步骤”可得直链肽前体粗品，根据前述“线性肽环合步骤”可得环肽粗品。将该混合物溶于乙腈：水＝1:1(体积比)中，根据前述“RP-HPLC分离步骤”可得环肽化合物纯品。tR＝13.501min。HRESIMS:[M+H]+＝1929.9598。
实施例35
均相时间荧光法测定实施例抑制PD-1/PD-L1相互作用的评估：
PD-1和PD-L1的相互作用可使用两种蛋白的胞外域部分的重组蛋白测定。PD-1和PD-L1蛋白质细胞外结构域表达为具有检测标签的融合蛋白，对于PD-1，标签是免疫球蛋白(PD-1-Ig)的Fc部分，对于PD-L1，它是6组氨酸基序(PD-L1-His)。人PD-1(25-167)，具有免疫球蛋白G(Ig)表位标签[hPD-1(25-167)-3S-IG]的C末端人Fc结构域和人PD-L1(18-239)具有C末端His表位标签[hPD-L1(18-239)-TVMV-His1]在HEK293T细胞中表达，并通过蛋白A亲和层析和尺寸排阻层析依次纯化。
相互作用研究均在由额外添加0.1％(含)牛血清白蛋白和0.05％(v/v)Tween-20的dPBS组成的HTRF测定缓冲液中进行。对于hPD-L1-His结合测定，将抑制剂与PD-L1-His(终浓度10nM)在4ul测定缓冲液中预孵育15分钟，然后加入PD-1-Ig(终浓度20nM)。在1uL测定缓冲液中并进一步培养15分钟。使用铕钙磷酸盐标记的抗Ig(终浓度1nM)和异烟酞菁(APC)标记的抗His(最终20nM)实现HTRF检测。将抗体在HTRF检测缓冲液中稀释并取5ul。使反应混合物平衡30分钟，并使用EnVision荧光计获得所得信号(665nm/620nm)。
各个环肽类化合物抑制PD-1/PD-L1相互作用测定结果如表1所示。
A：IC50<100nM；B：100nM<IC50<10μM；C：10μM<IC50<100μM
表1：均相时间荧光法测定实施例抑制PD-1/PD-L1相互作用结果
Figure GDA0003963383980000251
Figure GDA0003963383980000261
如上表所示，实施例中的环肽化合物均有一定的抑制PD-1/PD-L1相互作用的能力。
实施例36
实施例细胞层面抑制PD-1/PD-L1相互作用评估：
该实验中使用重组鼠源PD-L1作为细胞实验中PD-L1的来源。小鼠脾细胞是将小鼠脾脏在40um细胞滤网中捣碎后，在室温下用1mL ACK裂解缓冲液进一步处理5分钟得到。用9mLRPMI完全培养基洗涤后，将细胞重悬于15mL管中的3mL1xPBS中。小心地将3mL加入管底部，不干扰覆盖的脾细胞悬浮液。在室温下以800×g离心20分钟后，收集不透明的脾细胞层。得到的脾细胞再用冷PBS溶液冲洗两次，使用台盼蓝染色计数总细胞数用于之后的细胞层面测试。脾细胞在RPMI完全培养基(RPMI+10％胎牛血清+1mM丙酮酸钠+10,000u/mL青霉素和10,000ug/mL链霉素)中培养，并保持在37℃下含5％CO2的CO2培养箱中。
CFSE是一种被动扩散到细胞内并与细胞内蛋白结合的染料。1×106细胞/mL的脾细胞用5uM CFSE在预热的1x PBS/0.1％BSA溶液中于37℃处理10分钟。过量CFSE将5倍体积的0℃培养基淬灭至细胞中并在冰上孵育5分钟。用0℃完全RPMI培养基进一步洗涤CFSE标记的脾细胞三次。将CFSE标记的1×105脾细胞加入到含有MDA-MB231细胞(在高葡萄糖DMEM培养基中培养1×10个细胞)或重组人PD-L1(100ng/mL)和测试化合物的孔中。用抗小鼠CD3和抗小鼠CD28抗体(各1ug/mL)刺激脾细胞，并将培养物在37℃，5％CO2下进一步培养72小时。收获细胞并用冰冷的FACS缓冲液洗涤三次，并通过流式细胞术用488nm激发和521nm发射滤光片分析百分比增殖。
使用FACS程序分析脾细胞增殖百分比，并且在扣除背景增殖值(％)并将刺激的脾细胞增殖(％，阳性对照)标准化为100％后以计算化合物回复脾细胞增殖百分比。
刺激的脾细胞：脾细胞+anti-CD3/CD28
刺激背景增殖：脾细胞+anti-CD3/CD28+PD-L1
化合物增殖：脾细胞+anti-CD3/CD28+PD-L1+化合物
通过添加所需浓度来检测化合物效果。在配体(PD-L1)存在下化合物对anti-CD3/CD28刺激的脾细胞的表达。
各个环肽类化合物在100nM浓度下抑制PD-1/PD-L1相互作用测定结果如表2所示。
A：>90％；B：70％<IC50<90％；C：50％<IC50<70％；D：<50％
表2：实施例细胞层面抑制PD-1/PD-L1相互作用结果
化合物 IC<sub>50</sub> 化合物 IC<sub>50</sub> 化合物 IC<sub>50</sub>
S3 A S14 A S25 A
S4 A S15 A S26 A
S5 A S16 A S27 A
S6 A S17 A S28 A
S7 A S18 A S29 A
S8 A S19 A S31 A
S9 A S20 A S32 A
S10 A S21 A S33 A
S11 A S22 A S34 A
S12 A S23 A
S13 A S24 A
如上表所示，实施例中的环肽化合物均有一定的抑制PD-1/PD-L1相互作用的能力。
实施例37
实施例恢复人外周血单个核细胞(PBMC)分泌IFN-γ作用的实验
人外周血单个核细胞(PBMC)活化后会分泌IFN-γ、IL-2和TNF-α等细胞因子，而hPD-L1(人源PD-L1)蛋白与人PBMC上的PD-1蛋白结合会抑制PBMC的活化，降低细胞因子分泌。在该实验中，由人源乳腺癌癌细胞系MDA-MB-231或人源黑色素瘤系B16F10作为人源PD-L1蛋白供体。本实验的目的是检测化合物阻断hPD-L1蛋白抑制PBMC活化的能力。具体操作如下：将人PBMC接种到96孔板中，每孔接种1x105个细胞。实验共分六组，一组为空白对照(只加入PBMC)，一组为激活组(PBMC+anti-CD3/anti-CD28抗体)，两组抑制组，其一为PBMC+anti-CD3/anti-CD28抗体+额外接种MDA-MB-231，共孵育，其二为PBMC+anti-CD3/anti-CD28抗体+额外接种B16F10，共孵育。最后两组分别为在抑制组的基础上加入1uM和10nM的实施例中的环肽化合物。48小时后采用Biolegend公司的IFN-γELISA检测试剂盒检测细胞上清液中IFN-γ的含量。实验结果显示，激活组中PBMC受到anti-CD3/anti-CD28抗体作用后，分泌IFN-γ显著增加，说明PBMC呈激活状态；抑制组中hPD-L1蛋白抑制PBMC分泌IFN-γ，说明PBMC的激活状态受到抑制；实施例3～实施例29以及实施例31～35中的化合物在1uM和10nM浓度下具有显著的恢复PBMC细胞分泌IFN-γ的作用。这表明本发明的化合物具有在人源乳腺癌癌细胞、人源黑色素瘤存在下抑制PD-1/PD-L1相互作用进而增强T细胞免疫活性的功效。

Claims (9)

1.一种环肽类化合物及其药学上可以接受的盐，其特征在于，所述环肽类化合物选自下述化合物：
Figure FDA0003963383970000011
2.一种药物组合物，其特征在于，包含权利要求1所述的环肽类化合物及其药学上可以接受的盐。
3.根据权利要求2所述的药物组合物，其特征在于，所述环肽类化合物及其药学上可以接受的盐添加一种或多种药学上的辅料制成制剂。
4.根据权利要求3所述的药物组合物，其特征在于，所述药学上的辅料包括稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、吸收促进剂、表面活性剂、润滑剂或稳定剂。
5.根据权利要求3所述的药物组合物，其特征在于，所述制剂为片剂、胶囊、颗粒剂、散剂、糖浆剂、口服液或注射剂。
6.如权利要求1所述的环肽类化合物及其药学上可以接受的盐在制备PD-1/PD-L1通路抑制剂中的应用。
7.如权利要求1所述的环肽类化合物及其药学上可以接受的盐在制备T细胞免疫活性增强剂中的应用。
8.如权利要求1所述的环肽类化合物及其药学上可以接受的盐或权利要求2所述的药物组合物在制备预防或治疗乳腺癌、黑色素瘤药物中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述预防或治疗乳腺癌、黑色素瘤药物为乳腺癌、黑色素瘤免疫治疗药物或乳腺癌、黑色素瘤化疗药物或乳腺癌、黑色素瘤靶向治疗药物。
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