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CN111574592A - 一类具有拮抗pd-1/pd-l1相互作用的环肽类化合物及其应用 - Google Patents

一类具有拮抗pd-1/pd-l1相互作用的环肽类化合物及其应用 Download PDF

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CN111574592A
CN111574592A CN202010447004.XA CN202010447004A CN111574592A CN 111574592 A CN111574592 A CN 111574592A CN 202010447004 A CN202010447004 A CN 202010447004A CN 111574592 A CN111574592 A CN 111574592A
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Abstract

本发明公开了一种环肽类化合物及其应用，该环肽类化合物及其药学上可以接收的盐、酯或溶剂化合物可以制备PD‑1/PD‑L1通路抑制剂，在制备治疗肿瘤药物中有良好的应用前景。与单抗研究开发相比，PD‑1/PD‑L1抑制剂领域的肽类抑制剂却进展缓慢，所以研究开发抑制PD‑1/PD‑L1相互作用的抑制剂具有重要的临床意义。

Description

一类具有拮抗PD-1/PD-L1相互作用的环肽类化合物及其应用
技术领域
本发明涉及一类化合物及其应用，具体为环肽类化合物及其药学上可以接收的盐、酯或溶剂化合物，其作为PD-1/PD-L1抑制剂在制备治疗恶性肿瘤药物中的用途。
背景技术
PD-1又称CD279，是一种相对分子量为55000～60000的Ⅰ型跨膜蛋白，属免疫球蛋白超家族成员，其结构主要包括胞外免疫球蛋白可变区(IgV)样结构域、疏水的跨膜区以及胞内区。胞内区包括C端和N端氨基酸残基，含有2个独立的磷酸化作用位点，分别为免疫受体酪氨酸抑制基序(immunoreceptor tyrosine based inhibitory motif,ITIM)和免疫受体酪氨酸转换基序(immunoreceptor tyrosine based switch motif,ITSM)。PD-1主要表达于活化的CD4+T细胞、CD8+T细胞、B细胞、NK细胞、单核细胞和树突状细胞等免疫细胞上，促进T细胞的成熟。PD-1的配体属B7家族成员，包括PD-L1(又名B7-H1，CD274)和PD-L2(又名B7-DC)，两者均高表达于胎盘组织；低表达于脾脏、淋巴结、胸腺；脑组织中无表达。其中，PD-L1同是Ⅰ型跨膜蛋白，主要表达于抗原提呈细胞、B细胞、T细胞、上皮细胞、肌细胞、内皮细胞等。PD-1及PD-L1共同组成PD-1/PD-L1信号通路，抑制生长因子的生成和细胞增殖，并对T细胞的活化及调控免疫应答起到重要作用。PD-1/PD-L1通路激活后，在癌症、妊娠、组织移植以及自身免疫病中抑制免疫系统。目前PD-1/PD-L1抑制剂的开发主要集中在单克隆抗体领域，已有Nivolumab,Lambrolizumab,Atezolizumab,Durvalumab,Avelumab等单抗在国内外上市，可用于治疗非小细胞肺癌，黑色素瘤等常规治疗方法效果不佳的疾病具有明显的治疗效果。与单抗研究开发相比，该领域的肽类抑制剂却进展缓慢。所以研究开发抑制PD-1/PD-L1相互作用的抑制剂具有重要的临床意义。
发明内容
发明目的：本发明的目的在于提供一种环肽类化合物及其应用，该化合物为PD-1/PD-L1抑制剂，影响抑制生长因子的生成和细胞增殖。本发明的另一个目的是指出该化合物在制备治疗乳腺癌、黑色素瘤药物中有良好的应用前景。
技术方案：本发明所述的环肽类化合物及其药学上可以接收的盐、酯或溶剂化合物，该化合物结构如通式(I)所示：
Figure BDA0002506245900000021
R1选自于下列结构或其立体异构或消旋体中的一种：
-Me[Ala]、-CH2CH(CH3)2[Leu]、Me(Et)CH-[Ile]、-CH2NMe2[4-aza-leu]、CH3CH2CH2CH2-[Nle]-CH2CH2CH(CH3)2[HOLeu]、
Figure BDA0002506245900000022
[Cpa]；
R2选自于下列结构或其立体异构或消旋体中的一种：
-Me[Ala]、-CH2CH(CH3)2[Leu]、Me(Et)CH-[Ile]、-CH2NMe2[4-aza-leu]、CH3CH2CH2CH2-[Nle]-CH2CH2CH(CH3)2[HOLeu]、
Figure BDA0002506245900000023
[Cpa]、Ph(4-Ph)-CH2-[4-Ph-Phe]、PhCH2-[Phe]、4-OH-Phe[Tyr]；
R3选自于下列结构或其立体异构或消旋体中的一种：
-CH2NH2[Dap]、-CH2CH2NH2[Dab]、-CH2CH2CH2NH2[Orn]、-CH2CH2CH2CH2NH2[Lys]、
Figure BDA0002506245900000024
[His]；
R4、R5选自于下列结构或其立体异构或消旋体中的一种：
Figure BDA0002506245900000031
R6选自于下列结构或其立体异构或消旋体中的一种：
-CH2CONH2[Asn]、-CH2CH2CONH2[Gln]、CH2CH2CH2NHC(N)NH2[Arg]、CH2CH-2CH2NHCONH2[Cit]、CH2NHCONH2[Alb]；
R7，R8选自于下列结构或其立体异构或消旋体中的一种：
Figure BDA0002506245900000032
R9选自于下列结构中的一种：
-H[Phe]，-NH2[4-NH2-Phe]，-NHMe[4-NHMe-Phe]，-NMe2[4-NMe2-Phe]，-OH[Tyr]，-OMe[OMe-Tyr]，-Ph[4-Ph-Phe]；
L选自于下列结构中的一种：
Figure BDA0002506245900000041
Figure BDA0002506245900000042
波浪线指代连接方式。
所述的环肽类化合物及其药学上可以接收的盐、酯或溶剂化合物，所述环肽类化合物选自下述化合物：
Figure BDA0002506245900000043
Figure BDA0002506245900000051
Figure BDA0002506245900000061
Figure BDA0002506245900000071
Figure BDA0002506245900000081
Figure BDA0002506245900000091
药物组合物，包含所述的环肽类化合物及其药学上可以接收的盐、酯或溶剂化合物。
所述的药物组合物，所述环肽类化合物及其药学上可以接收的盐、酯或溶剂化合物添加一种或多种药学上的辅料制成制剂。
所述的药物组合物，所述药学上的辅料包括稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、吸收促进剂、表面活性剂、润滑剂或稳定剂。
所述的药物组合物，所述制剂为片剂、胶囊、颗粒剂、散剂、糖浆剂、口服液或注射剂。
所述的环肽类化合物及其药学上可以接收的盐、酯或溶剂化合物在制备PD-1/PD-L1通路抑制剂中的应用。
所述的环肽类化合物及其药学上可以接收的盐、酯或溶剂化合物在制备T细胞免疫活性增强剂中的应用。
所述的环肽类化合物及其药学上可以接收的盐、酯或溶剂化合物或所述的药物组合物在制备预防或治疗乳腺癌、黑色素瘤药物中的应用。
所述预防或治疗乳腺癌、黑色素瘤药物为乳腺癌、黑色素瘤免疫治疗药物或乳腺癌、黑色素瘤化疗药物或乳腺癌、黑色素瘤靶向治疗药物。
有益效果：本发明提供的环肽类化合物，可制备PD-1/PD-L1抑制剂，影响抑制生长因子的生成和细胞增殖，并对T细胞的活化及调控免疫应答起到重要作用，在制备治疗乳腺癌、黑色素瘤药物中有良好的应用前景。
具体实施方式
1.固相合成一般方法
固相氨基酸的合成均在固相反应合成管中进行，使用rink amide-AM树脂(Merrifield聚合物负载(2,4-二甲氧基苯基)(4-烷氧基苯基)甲烷，其中4-烷氧基为与树脂连接的位置和化学键类型，负载量0.7mmol/g)。使用DMF和DCM溶解反应所用试剂后，沿管壁加入到反应管中，通入氮气后振荡所需时间。之后，反应液从反应管下侧通过真空泵抽去。反应中所用的溶剂和试剂为：DMF＝N,N-二甲基甲酰胺；DCM＝二氯甲烷；HATU＝1-[二(二甲胺基)亚甲基]-3-氧代-1H-1,2,3-三氮唑并[4,5-b]吡啶六氟磷酸盐；DIPEA＝二异丙基乙胺。树脂的溶胀过程如下文“树脂溶胀步骤”所述。缩合步骤如下文“缩合步骤”所述。使用的氨基酸衍生物和末端羧酸如下所示(侧链保护基置于括号中)：Fmoc-L-Gly-OH，Fmoc-L-Cys(Trt)-OH，Fmoc-L-Leu-OH，Fmoc-L-[N-Me]Nle-OH，Fmoc-L-Trp(CH2COOtBu)-OH，Fmoc-L-Trp(Boc)-OH，Fmoc-L-Dab(Boc)-OH，Fmoc-L-[O-tBu]Hyp-OH，Fmoc-L-Dap(Boc)-OH，Fmoc-L-Pro-OH，Fmoc-L-Asn(Trt)-OH，Fmoc-L-[N-Me]Ala-OH，Fmoc-L-[O-tBu]Tyr-OH，ClCH2COOH。
Figure BDA0002506245900000111
在一些实施例中，如下非天然氨基酸或其衍生物会被使用：
Figure BDA0002506245900000121
2.树脂溶胀步骤
将Rink Amide-AM树脂(286mg，0.2mmol)加入到10mL的固相合成反应管中，加入8mL的DCM，静置半小时。之后将DCM经真空泵抽去即可完成树脂的溶胀。
3.缩合步骤
将6mL 20％的哌啶/DMF溶液加入到反应管中，振荡30分钟。反应液抽干，树脂用无水DMF(10mL)，无水甲醇(10mL)和无水DCM(10mL)分别洗涤3次后，取样经四氯苯醌显色，树脂呈蓝色可指示脱除保护基结束。
脱除保护基结束后，将所需氨基酸(0.6mmol)，HATU(228mg，0.6mmol)，DMF(6mL)和DIPEA(210μL，1.2mmol)依次加入到干燥的圆底烧瓶中，超声助溶使其澄清。将混合液加入到固相合成反应管中，25℃反应3小时，取样经四氯苯醌显色，树脂呈无色透明可指示缩合反应结束。树脂用无水DMF(10mL)，无水甲醇(10mL)和无水DCM(10mL)分别洗涤3次后即可进行下一次缩合。
4.肽游离步骤
完成所需直链肽合成后，将树脂再用无水DMF洗涤1次，后抽至干。向干燥的树脂加入切割液(三氟乙酸：硫代苯甲醚：1,2-乙二硫醇：苯甲醚＝90:5:2.5:2.5，体积比)。混合物在10℃下振摇3小时。反应结束后，将切割液抽滤，浓缩至原体积1/5，浓缩液逐滴加入到10倍体积的-20℃无水乙醚中。抽滤形成的沉淀即得粗肽，可不经处理直接进行下一步反应。
5.线性肽环合步骤
取步骤4中所得粗品肽约100mg，溶于50mL乙腈中，向溶液中缓慢加入0.1M碳酸铵水溶液50mL。该反应液在室温下搅拌24小时。反应经RP-HPLC监测结束后，向反应液中加入0.6mL冰醋酸，反应液浓缩至乙腈全部蒸发后，水层经冻干可得环肽粗品。
6.RP-HPLC分离步骤
将所得的粗品肽溶于一定量的纯净水中，使用三乙胺或2M HCl调节PH至7，加入乙腈至澄清，冻干得粗品固体。加入一定量的乙腈使其完全溶解，经0.33μM滤器过滤。使用Aglient Eclipase XDB-C18柱进行分离，流动相A：0.1％TFA/H2O；流动相B：0.1％TFA/MeCN。色谱条件为10％B-100％B，20min。
实施例1
Figure BDA0002506245900000131
的制备：
其合成路线如下所示：
Figure BDA0002506245900000132
取25mL反应管，冲入氮气。依次加入Fmoc-(4-Br)-Phe-OH(1，233mg，0.5mmol)，PhB(OH)2(122mg，1mmol)，Pd(OAc)2(5.1mg,4.5mol％)，DtBuPF(11.9mg，5mol％)和K3PO4(265mg,1.25mmol)。加料完成后，反应液通入氮气以除去其他气体，然后加热至50℃。16小时后，加入20％的醋酸水溶液调节pH至4-5，有机层分离，水层再用乙酸乙酯萃取3次。有机层合并后浓缩至干，粗品经硅胶柱层析分离(石油醚：乙酸乙酯＝10:1)可得目标产物197mg，收率85％。该化合物的核磁共振氢谱数据与文献报道(J.Org.Chem.2016,81,9499-9506)完全一致，可认为是目标产物。
实施例2
Figure BDA0002506245900000141
的制备
其合成路线如下所示：
Figure BDA0002506245900000142
取化合物3(250mg，1.3mmol)溶于13mL丙酮中，缓慢加入10％碳酸钠水溶液13mL。反应液移至0℃，加入Fmoc-OSu(526mg，1.56mmol)。在0℃下搅拌5分钟后，反应液移至室温并搅拌24小时。反应结束后，加入2M盐酸溶液调节pH至2-3，加入乙酸乙酯萃取3次，水洗2次，饱和食盐水洗1次。有机层经无水硫酸钠干燥后，浓缩至干。粗品经硅胶柱层析分离(二氯甲烷：甲醇＝150:1)可得目标产物368mg，收率75％。1H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ7.81(dd,J＝7.8,1.1Hz,2H),7.70(dd,J＝7.7,1.5Hz,2H),7.65(td,J＝7.6,1.5Hz,2H),7.56(td,J＝7.6,1.2Hz,2H),4.46(d,J＝5.4Hz,2H),4.35–4.29(m,1H),4.21(d,J＝6.5Hz,1H),3.71(dd,J＝10.3,4.2Hz,1H),3.42(dd,J＝10.3,3.3Hz,1H),2.40–2.28(m,2H),1.77(m,1H),1.72–1.46(m,4H),1.39(m,1H).13C NMR(125MHz,Chloroform-d)δ172.84,156.53,144.92,144.83,139.80,127.04,126.92,125.02,124.92,122.20,122.09,69.76,67.37,54.22,47.92,47.21,46.36,34.04,33.48,25.64.HRESIMS:378.1633[M+H]+,calcd378.1626.
实施例3
S3的制备
根据前述“树脂溶胀步骤”，使树脂溶胀后，根据“缩合步骤”，选用氨基酸分别为Fmoc-L-Gly-OH，Fmoc-L-Cys(Trt)-OH，Fmoc-L-Leu-OH，Boc-L-Trp-OH，Fmoc-L-Trp(Boc)-OH，Fmoc-L-Dab(Boc)-OH，Fmoc-L-[O-tBu]Hyp-OH，Fmoc-L-Dap(Boc)-OH，Fmoc-L-Pro-OH，Fmoc-L-Asn(Trt)-OH，Fmoc-L-[N-Me]Ala-OH，Fmoc-L-Ala-OH，Fmoc-L-[O-tBu]Tyr-OH。缩合完成后，根据前述“肽游离步骤”可得直链肽前体粗品，根据前述“线性肽环合步骤”可得环肽粗品。将该混合物溶于乙腈：水＝1:1(体积比)中，根据前述“RP-HPLC分离步骤”可得环肽化合物纯品。tR＝14.892min。HRESIMS:[M+H]+＝1844.9095。
实施例4
S4的制备
根据前述“树脂溶胀步骤”，使树脂溶胀后，根据“缩合步骤”，选用氨基酸分别为Fmoc-L-Gly-OH，Fmoc-L-Cys(Trt)-OH，Fmoc-L-Leu-OH，Boc-L-Trp-OH，Fmoc-L-Trp(Boc)-OH，Fmoc-L-Dab(Boc)-OH，Fmoc-L-[O-tBu]Hyp-OH，Fmoc-L-Dap(Boc)-OH，Fmoc-L-Pro-OH，Fmoc-L-Asn(Trt)-OH，Fmoc-L-[N-Me]Ala-OH，Fmoc-L-Val-OH，Fmoc-L-[O-tBu]Tyr-OH。缩合完成后，根据前述“肽游离步骤”可得直链肽前体粗品，根据前述“线性肽环合步骤”可得环肽粗品。将该混合物溶于乙腈：水＝1:1(体积比)中，根据前述“RP-HPLC分离步骤”可得环肽化合物纯品。tR＝14.635min。
HRESIMS:[M+H]+＝1879.9401。
实施例5
S5的制备
根据前述“树脂溶胀步骤”，使树脂溶胀后，根据“缩合步骤”，选用氨基酸分别为Fmoc-L-Gly-OH，Fmoc-L-Cys(Trt)-OH，Fmoc-L-Leu-OH，Boc-L-Trp-OH，Fmoc-L-Trp(Boc)-OH，Fmoc-L-Dab(Boc)-OH，Fmoc-L-[O-tBu]Hyp-OH，Fmoc-L-Dap(Boc)-OH，Fmoc-L-Pro-OH，Fmoc-L-Asn(Trt)-OH，Fmoc-L-[N-Me]Ala-OH，Fmoc-L-Val-OH，Fmoc-L-[O-tBu]Tyr-OH。缩合完成后，根据前述“肽游离步骤”可得直链肽前体粗品，根据前述“线性肽环合步骤”可得环肽粗品。将该混合物溶于乙腈：水＝1:1(体积比)中，根据前述“RP-HPLC分离步骤”可得环肽化合物纯品。tR＝14.812min。HRESIMS:[M+H]+＝1886.9555。
实施例6
S6的制备
根据前述“树脂溶胀步骤”，使树脂溶胀后，根据“缩合步骤”，选用氨基酸分别为Fmoc-L-Gly-OH，Fmoc-L-Cys(Trt)-OH，Fmoc-L-Leu-OH，Boc-L-Trp-OH，Fmoc-L-Trp(Boc)-OH，Fmoc-L-Dab(Boc)-OH，Fmoc-L-[O-tBu]Hyp-OH，Fmoc-L-Dap(Boc)-OH，Fmoc-L-Pro-OH，Fmoc-L-Asn(Trt)-OH，Fmoc-L-[N-Me]Ala-OH，Fmoc-L-Val-OH，Fmoc-L-[O-tBu]Tyr-OH。缩合完成后，根据前述“肽游离步骤”可得直链肽前体粗品，根据前述“线性肽环合步骤”可得环肽粗品。将该混合物溶于乙腈：水＝1:1(体积比)中，根据前述“RP-HPLC分离步骤”可得环肽化合物纯品。tR＝14.812min。HRESIMS:[M+H]+＝1886.9557。
实施例7
S7的制备
根据前述“树脂溶胀步骤”，使树脂溶胀后，根据“缩合步骤”，选用氨基酸分别为Fmoc-L-Gly-OH，Fmoc-L-Cys(Trt)-OH，Fmoc-L-Leu-OH，Boc-L-Trp-OH，Fmoc-L-Trp(Boc)-OH，Fmoc-L-Dab(Boc)-OH，Fmoc-L-[O-tBu]Hyp-OH，Fmoc-L-Dap(Boc)-OH，Fmoc-L-Pro-OH，Fmoc-L-Asn(Trt)-OH，Fmoc-L-[N-Me]Ala-OH，Fmoc-L-Val-OH，Fmoc-L-[O-tBu]Tyr-OH。缩合完成后，根据前述“肽游离步骤”可得直链肽前体粗品，根据前述“线性肽环合步骤”可得环肽粗品。将该混合物溶于乙腈：水＝1:1(体积比)中，根据前述“RP-HPLC分离步骤”可得环肽化合物纯品。tR＝15.022min。HRESIMS:[M+H]+＝1996.9712。
实施例8
S8的制备
根据前述“树脂溶胀步骤”，使树脂溶胀后，根据“缩合步骤”，选用氨基酸分别为Fmoc-L-Gly-OH，Fmoc-L-Cys(Trt)-OH，Fmoc-L-Leu-OH，Boc-L-Trp-OH，Fmoc-L-Trp(Boc)-OH，Fmoc-L-Dab(Boc)-OH，Fmoc-L-[O-tBu]Hyp-OH，Fmoc-L-Dap(Boc)-OH，Fmoc-L-Pro-OH，Fmoc-L-Asn(Trt)-OH，Fmoc-L-[N-Me]Ala-OH，Fmoc-L-Leu-OH，Fmoc-L-[O-tBu]Tyr-OH。缩合完成后，根据前述“肽游离步骤”可得直链肽前体粗品，根据前述“线性肽环合步骤”可得环肽粗品。将该混合物溶于乙腈：水＝1:1(体积比)中，根据前述“RP-HPLC分离步骤”可得环肽化合物纯品。tR＝15.022min。HRESIMS:[M+H]+＝1996.9712。
实施例9
S9的制备
根据前述“树脂溶胀步骤”，使树脂溶胀后，根据“缩合步骤”，选用氨基酸分别为Fmoc-L-Gly-OH，Fmoc-L-Cys(Trt)-OH，Fmoc-L-Leu-OH，Boc-L-Trp-OH，Fmoc-L-Trp(Boc)-OH，Fmoc-L-Dab(Boc)-OH，Fmoc-L-[O-tBu]Hyp-OH，Fmoc-L-Dap(Boc)-OH，Fmoc-L-Pro-OH，Fmoc-L-Asn(Trt)-OH，Fmoc-L-[N-Me]Ala-OH，Fmoc-Oic-OH，Fmoc-L-[O-tBu]Tyr-OH。缩合完成后，根据前述“肽游离步骤”可得直链肽前体粗品，根据前述“线性肽环合步骤”可得环肽粗品。将该混合物溶于乙腈：水＝1:1(体积比)中，根据前述“RP-HPLC分离步骤”可得环肽化合物纯品。tR＝14.922min。HRESIMS:[M+H]+＝1941.0002。
实施例10
S10的制备
根据前述“树脂溶胀步骤”，使树脂溶胀后，根据“缩合步骤”，选用氨基酸分别为Fmoc-L-Gly-OH，Fmoc-L-Cys(Trt)-OH，Fmoc-L-Leu-OH，Boc-L-Trp-OH，Fmoc-L-Trp(Boc)-OH，Fmoc-L-Dab(Boc)-OH，Fmoc-L-[O-tBu]Hyp-OH，Fmoc-L-Dap(Boc)-OH，Fmoc-L-Pro-OH，Fmoc-L-Asn(Trt)-OH，Fmoc-L-[N-Me]Ala-OH，Fmoc-L-[O-tBu]Tyr-OH和实施例2中的化合物4。缩合完成后，根据前述“肽游离步骤”可得直链肽前体粗品，根据前述“线性肽环合步骤”可得环肽粗品。将该混合物溶于乙腈：水＝1:1(体积比)中，根据前述“RP-HPLC分离步骤”可得环肽化合物纯品。tR＝14.910min。HRESIMS:[M+H]+＝1926.9855。
实施例11
S11的制备
根据前述“树脂溶胀步骤”，使树脂溶胀后，根据“缩合步骤”，选用氨基酸分别为Fmoc-L-Gly-OH，Fmoc-L-Cys(Trt)-OH，Fmoc-L-Leu-OH，Boc-L-Trp-OH，Fmoc-L-Trp(Boc)-OH，Fmoc-L-Dab(Boc)-OH，Fmoc-L-[O-tBu]Hyp-OH，Fmoc-L-Dap(Boc)-OH，Fmoc-L-Pro-OH，Fmoc-L-Asn(Trt)-OH，Fmoc-L-[N-Me]Ala-OH，Fmoc-L-[O-tBu]Tyr-OH和实施例2中的化合物4。缩合完成后，根据前述“肽游离步骤”可得直链肽前体粗品，根据前述“线性肽环合步骤”可得环肽粗品。将该混合物溶于乙腈：水＝1:1(体积比)中，根据前述“RP-HPLC分离步骤”可得环肽化合物纯品。tR＝15.202min。HRESIMS:[M+H]+＝1904.2346。
实施例12
S12的制备
根据前述“树脂溶胀步骤”，使树脂溶胀后，根据“缩合步骤”，选用氨基酸分别为Fmoc-L-Gly-OH，Fmoc-L-Cys(Trt)-OH，Fmoc-L-Leu-OH，Boc-L-Trp-OH，Fmoc-L-Trp(Boc)-OH，Fmoc-L-Dab(Boc)-OH，Fmoc-L-[O-tBu]Hyp-OH，Fmoc-L-Dap(Boc)-OH，Fmoc-L-Pro-OH，Fmoc-L-Asn(Trt)-OH，Fmoc-L-[N-Me]Ala-OH，Fmoc-L-[O-tBu]Tyr-OH和S-Fmoc-piperidine-2-carboxylic acid。缩合完成后，根据前述“肽游离步骤”可得直链肽前体粗品，根据前述“线性肽环合步骤”可得环肽粗品。将该混合物溶于乙腈：水＝1:1(体积比)中，根据前述“RP-HPLC分离步骤”可得环肽化合物纯品。tR＝14.961min。HRESIMS:[M+H]+＝1900.9766。
实施例13
S13的制备
根据前述“树脂溶胀步骤”，使树脂溶胀后，根据“缩合步骤”，选用氨基酸分别为Fmoc-L-Gly-OH，Fmoc-L-Cys(Trt)-OH，Fmoc-L-Leu-OH，Boc-L-Trp-OH，Fmoc-L-Trp(Boc)-OH，Fmoc-L-Dab(Boc)-OH，Fmoc-L-[O-tBu]Hyp-OH，Fmoc-L-Dap(Boc)-OH，Fmoc-L-Pro-OH，Fmoc-L-Asn(Trt)-OH，Fmoc-L-[N-Me]Ala-OH，Fmoc-L-[O-tBu]Tyr-OH。缩合完成后，根据前述“肽游离步骤”可得直链肽前体粗品，根据前述“线性肽环合步骤”可得环肽粗品。将该混合物溶于乙腈：水＝1:1(体积比)中，根据前述“RP-HPLC分离步骤”可得环肽化合物纯品。tR＝14.929min。HRESIMS:[M+H]+＝1898.9523。
实施例14
S14的制备
根据前述“树脂溶胀步骤”，使树脂溶胀后，根据“缩合步骤”，选用氨基酸分别为Fmoc-L-Gly-OH，Fmoc-L-Cys(Trt)-OH，Fmoc-L-Leu-OH，Boc-L-Trp-OH，Fmoc-L-Trp(Boc)-OH，Fmoc-L-Dab(Boc)-OH，Fmoc-L-[O-tBu]Hyp-OH，Fmoc-L-Dap(Boc)-OH，Fmoc-L-Pro-OH，Fmoc-L-Asn(Trt)-OH，Fmoc-L-[N-Me]Ala-OH，Fmoc-L-[O-tBu]Tyr-OH。缩合完成后，根据前述“肽游离步骤”可得直链肽前体粗品，根据前述“线性肽环合步骤”可得环肽粗品。将该混合物溶于乙腈：水＝1:1(体积比)中，根据前述“RP-HPLC分离步骤”可得环肽化合物纯品。tR＝15.000min。HRESIMS:[M+H]+＝1953.0001。
实施例15
S15的制备
根据前述“树脂溶胀步骤”，使树脂溶胀后，根据“缩合步骤”，选用氨基酸分别为Fmoc-L-Gly-OH，Fmoc-L-Cys(Trt)-OH，Fmoc-L-Leu-OH，Boc-L-Trp-OH，Fmoc-L-Trp(Boc)-OH，Fmoc-L-Dab(Boc)-OH，Fmoc-L-[O-tBu]Hyp-OH，Fmoc-L-Dap(Boc)-OH，Fmoc-L-Pro-OH，Fmoc-L-Asn(Trt)-OH，Fmoc-L-[N-Me]Ala-OH，Fmoc-L-[O-tBu]Tyr-OH。缩合完成后，根据前述“肽游离步骤”可得直链肽前体粗品，根据前述“线性肽环合步骤”可得环肽粗品。将该混合物溶于乙腈：水＝1:1(体积比)中，根据前述“RP-HPLC分离步骤”可得环肽化合物纯品。tR＝14.992min。HRESIMS:[M+H]+＝1953.0001。
实施例16
S16的制备
根据前述“树脂溶胀步骤”，使树脂溶胀后，根据“缩合步骤”，选用氨基酸分别为Fmoc-L-Gly-OH，Fmoc-L-Cys(Trt)-OH，Fmoc-L-Leu-OH，Boc-L-Trp-OH，Fmoc-L-Trp(Boc)-OH，Fmoc-L-Dab(Boc)-OH，Fmoc-L-[O-tBu]Hyp-OH，Fmoc-L-Dap(Boc)-OH，Fmoc-L-Pro-OH，Fmoc-L-Asn(Trt)-OH，Fmoc-L-[N-Me]Ala-OH，Fmoc-L-[O-tBu]Tyr-OH。缩合完成后，根据前述“肽游离步骤”可得直链肽前体粗品，根据前述“线性肽环合步骤”可得环肽粗品。将该混合物溶于乙腈：水＝1:1(体积比)中，根据前述“RP-HPLC分离步骤”可得环肽化合物纯品。tR＝15.101min。HRESIMS:[M+H]+＝1914.9496。
实施例17
S17的制备
根据前述“树脂溶胀步骤”，使树脂溶胀后，根据“缩合步骤”，选用氨基酸分别为Fmoc-L-Gly-OH，Fmoc-L-Cys(Trt)-OH，Fmoc-L-Leu-OH，Boc-L-Trp-OH，Fmoc-L-Trp(Boc)-OH，Fmoc-L-Dab(Boc)-OH，Fmoc-L-[O-tBu]Hyp-OH，Fmoc-L-Dap(Boc)-OH，Fmoc-L-Pro-OH，Fmoc-L-Asn(Trt)-OH，Fmoc-L-[N-Me]Ala-OH，Fmoc-L-[O-tBu]Tyr-OH。缩合完成后，根据前述“肽游离步骤”可得直链肽前体粗品，根据前述“线性肽环合步骤”可得环肽粗品。将该混合物溶于乙腈：水＝1:1(体积比)中，根据前述“RP-HPLC分离步骤”可得环肽化合物纯品。tR＝15.101min。HRESIMS:[M+H]+＝1914.9487。
实施例18
S18的制备
根据前述“树脂溶胀步骤”，使树脂溶胀后，根据“缩合步骤”，选用氨基酸分别为Fmoc-L-Gly-OH，Fmoc-L-Cys(Trt)-OH，Fmoc-L-Leu-OH，Boc-L-Trp-OH，Fmoc-L-Trp(Boc)-OH，Fmoc-L-Dab(Boc)-OH，Fmoc-L-[O-tBu]Hyp-OH，Fmoc-L-Dap(Boc)-OH，Fmoc-L-Pro-OH，Fmoc-L-Asn(Trt)-OH，Fmoc-L-[N-Me]Ala-OH，Fmoc-L-[O-tBu]Tyr-OH。缩合完成后，根据前述“肽游离步骤”可得直链肽前体粗品，根据前述“线性肽环合步骤”可得环肽粗品。将该混合物溶于乙腈：水＝1:1(体积比)中，根据前述“RP-HPLC分离步骤”可得环肽化合物纯品。tR＝14.892min。HRESIMS:[M+H]+＝1912.9755。
实施例19
S19的制备
根据前述“树脂溶胀步骤”，使树脂溶胀后，根据“缩合步骤”，选用氨基酸分别为Fmoc-L-Gly-OH，Fmoc-L-Cys(Trt)-OH，Fmoc-L-Leu-OH，Boc-L-Trp-OH，Fmoc-L-Trp(Boc)-OH，Fmoc-L-Dab(Boc)-OH，Fmoc-L-[O-tBu]Hyp-OH，Fmoc-L-Dap(Boc)-OH，Fmoc-L-Pro-OH，Fmoc-L-Asn(Trt)-OH，Fmoc-L-[N-Me]Ala-OH，Fmoc-L-[O-tBu]Tyr-OH。缩合完成后，根据前述“肽游离步骤”可得直链肽前体粗品，根据前述“线性肽环合步骤”可得环肽粗品。将该混合物溶于乙腈：水＝1:1(体积比)中，根据前述“RP-HPLC分离步骤”可得环肽化合物纯品。tR＝14.999min。HRESIMS:[M+H]+＝1812.9623。
实施例20
S20的制备
根据前述“树脂溶胀步骤”，使树脂溶胀后，根据“缩合步骤”，选用氨基酸分别为Fmoc-L-Gly-OH，Fmoc-L-Cys(Trt)-OH，Fmoc-L-Leu-OH，Boc-L-Trp-OH，Fmoc-L-Trp(Boc)-OH，Fmoc-L-Dab(Boc)-OH，Fmoc-L-[O-tBu]Hyp-OH，Fmoc-L-Dap(Boc)-OH，Fmoc-L-Pro-OH，Fmoc-L-Asn(Trt)-OH，Fmoc-L-[N-Me]Ala-OH，Fmoc-L-[O-tBu]Tyr-OH。缩合完成后，根据前述“肽游离步骤”可得直链肽前体粗品，根据前述“线性肽环合步骤”可得环肽粗品。将该混合物溶于乙腈：水＝1:1(体积比)中，根据前述“RP-HPLC分离步骤”可得环肽化合物纯品。tR＝15.102min。HRESIMS:[M+H]+＝1897.9724。
实施例21
S21的制备
根据前述“树脂溶胀步骤”，使树脂溶胀后，根据“缩合步骤”，选用氨基酸分别为Fmoc-L-Gly-OH，Fmoc-L-Cys(Trt)-OH，Fmoc-L-Leu-OH，Boc-L-Trp-OH，Fmoc-L-Trp(Boc)-OH，Fmoc-L-Dab(Boc)-OH，Fmoc-L-[O-tBu]Hyp-OH，Fmoc-L-Dap(Boc)-OH，Fmoc-L-Pro-OH，Fmoc-L-Asn(Trt)-OH，Fmoc-L-[N-Me]Ala-OH，Fmoc-L-[O-tBu]Tyr-OH。缩合完成后，根据前述“肽游离步骤”可得直链肽前体粗品，根据前述“线性肽环合步骤”可得环肽粗品。将该混合物溶于乙腈：水＝1:1(体积比)中，根据前述“RP-HPLC分离步骤”可得环肽化合物纯品。tR＝14.986min。HRESIMS:[M+H]+＝1911.9880。
实施例22
S22的制备
根据前述“树脂溶胀步骤”，使树脂溶胀后，根据“缩合步骤”，选用氨基酸分别为Fmoc-L-Gly-OH，Fmoc-L-Cys(Trt)-OH，Fmoc-L-Leu-OH，Boc-L-Trp-OH，Fmoc-L-Trp(Boc)-OH，Fmoc-L-Dab(Boc)-OH，Fmoc-L-[O-tBu]Hyp-OH，Fmoc-L-Dap(Boc)-OH，Fmoc-L-Pro-OH，Fmoc-L-Asn(Trt)-OH，Fmoc-L-[N-Me]Ala-OH，Fmoc-L-[O-tBu]Tyr-OH。缩合完成后，根据前述“肽游离步骤”可得直链肽前体粗品，根据前述“线性肽环合步骤”可得环肽粗品。将该混合物溶于乙腈：水＝1:1(体积比)中，根据前述“RP-HPLC分离步骤”可得环肽化合物纯品。tR＝15.001min。HRESIMS:[M+H]+＝1898.9466。
实施例23
S23的制备
根据前述“树脂溶胀步骤”，使树脂溶胀后，根据“缩合步骤”，选用氨基酸分别为Fmoc-L-Gly-OH，Fmoc-L-Cys(Trt)-OH，Fmoc-L-Leu-OH，Boc-L-Trp-OH，Fmoc-L-Trp(Boc)-OH，Fmoc-L-Dab(Boc)-OH，Fmoc-L-[O-tBu]Hyp-OH，Fmoc-L-Dap(Boc)-OH，Fmoc-L-Pro-OH，Fmoc-L-Asn(Trt)-OH，Fmoc-L-[N-Me]Ala-OH，Fmoc-L-[O-tBu]Tyr-OH。缩合完成后，根据前述“肽游离步骤”可得直链肽前体粗品，根据前述“线性肽环合步骤”可得环肽粗品。将该混合物溶于乙腈：水＝1:1(体积比)中，根据前述“RP-HPLC分离步骤”可得环肽化合物纯品。tR＝14.886min。HRESIMS:[M+H]+＝1912.9733。
实施例24
S24的制备
根据前述“树脂溶胀步骤”，使树脂溶胀后，根据“缩合步骤”，选用氨基酸分别为Fmoc-L-Gly-OH，Fmoc-L-Cys(Trt)-OH，Fmoc-L-Leu-OH，Boc-L-Trp-OH，Fmoc-L-Trp(Boc)-OH，Fmoc-L-Dab(Boc)-OH，Fmoc-L-[O-tBu]Hyp-OH，Fmoc-L-Dap(Boc)-OH，Fmoc-L-Pro-OH，Fmoc-L-Asn(Trt)-OH，Fmoc-L-[N-Me]Ala-OH，Fmoc-L-[O-tBu]Tyr-OH。缩合完成后，根据前述“肽游离步骤”可得直链肽前体粗品，根据前述“线性肽环合步骤”可得环肽粗品。将该混合物溶于乙腈：水＝1:1(体积比)中，根据前述“RP-HPLC分离步骤”可得环肽化合物纯品。tR＝15.102min。HRESIMS:[M+H]+＝1953.0002。
实施例25
S25的制备
根据前述“树脂溶胀步骤”，使树脂溶胀后，根据“缩合步骤”，选用氨基酸分别为Fmoc-L-Gly-OH，Fmoc-L-Cys(Trt)-OH，Fmoc-L-Leu-OH，Boc-L-Trp-OH，Fmoc-L-Trp(Boc)-OH，Fmoc-L-Dab(Boc)-OH，Fmoc-L-[O-tBu]Hyp-OH，Fmoc-L-Dap(Boc)-OH，Fmoc-L-Pro-OH，Fmoc-L-Asn(Trt)-OH，Fmoc-L-[N-Me]Ala-OH，Fmoc-L-[O-tBu]Tyr-OH。缩合完成后，根据前述“肽游离步骤”可得直链肽前体粗品，根据前述“线性肽环合步骤”可得环肽粗品。将该混合物溶于乙腈：水＝1:1(体积比)中，根据前述“RP-HPLC分离步骤”可得环肽化合物纯品。tR＝15.220min。HRESIMS:[M+H]+＝1958.9986。
实施例26
S26的制备
根据前述“树脂溶胀步骤”，使树脂溶胀后，根据“缩合步骤”，选用氨基酸分别为Fmoc-L-Gly-OH，Fmoc-L-Cys(Trt)-OH，Fmoc-L-Leu-OH，Boc-L-Trp-OH，Fmoc-L-Trp(Boc)-OH，Fmoc-L-Dab(Boc)-OH，Fmoc-L-[O-tBu]Hyp-OH，Fmoc-L-Dap(Boc)-OH，Fmoc-L-Pro-OH，Fmoc-L-Asn(Trt)-OH，Fmoc-L-[3-F]-Pro-OH，Fmoc-L-[O-tBu]Tyr-OH。缩合完成后，根据前述“肽游离步骤”可得直链肽前体粗品，根据前述“线性肽环合步骤”可得环肽粗品。将该混合物溶于乙腈：水＝1:1(体积比)中，根据前述“RP-HPLC分离步骤”可得环肽化合物纯品。tR＝14.993min。HRESIMS:[M+H]+＝1915.9503。
实施例27
S27的制备
根据前述“树脂溶胀步骤”，使树脂溶胀后，根据“缩合步骤”，选用氨基酸分别为Fmoc-L-Gly-OH，Fmoc-L-Cys(Trt)-OH，Fmoc-L-Leu-OH，Boc-L-Trp-OH，Fmoc-L-Trp(Boc)-OH，Fmoc-L-Dab(Boc)-OH，Fmoc-L-[O-tBu]Hyp-OH，Fmoc-L-Dap(Boc)-OH，Fmoc-L-Pro-OH，Fmoc-L-Asn(Trt)-OH，Fmoc-L-[3-F]-Pro-OH，Fmoc-L-[O-tBu]Tyr-OH。缩合完成后，根据前述“肽游离步骤”可得直链肽前体粗品，根据前述“线性肽环合步骤”可得环肽粗品。将该混合物溶于乙腈：水＝1:1(体积比)中，根据前述“RP-HPLC分离步骤”可得环肽化合物纯品。tR＝15.230min。HRESIMS:[M+H]+＝1915.9798。
实施例28
S28的制备
根据前述“树脂溶胀步骤”，使树脂溶胀后，根据“缩合步骤”，选用氨基酸分别为Fmoc-L-Gly-OH，Fmoc-L-Cys(Trt)-OH，Fmoc-L-Leu-OH，Boc-L-Trp-OH，Fmoc-L-Trp(Boc)-OH，Fmoc-L-Dab(Boc)-OH，Fmoc-L-[O-tBu]Hyp-OH，Fmoc-L-Dap(Boc)-OH，Fmoc-L-Pro-OH，Fmoc-L-Asn(Trt)-OH，Fmoc-L-[3-F]-Pro-OH，Fmoc-L-[O-tBu]Tyr-OH。缩合完成后，根据前述“肽游离步骤”可得直链肽前体粗品，根据前述“线性肽环合步骤”可得环肽粗品。将该混合物溶于乙腈：水＝1:1(体积比)中，根据前述“RP-HPLC分离步骤”可得环肽化合物纯品。tR＝15.230min。HRESIMS:[M+H]+＝1930.9497。
实施例29
S29的制备
根据前述“树脂溶胀步骤”，使树脂溶胀后，根据“缩合步骤”，选用氨基酸分别为Fmoc-L-Gly-OH，Fmoc-L-Cys(Trt)-OH，Fmoc-L-Leu-OH，Boc-L-Trp-OH，Fmoc-L-Trp(Boc)-OH，Fmoc-L-Dab(Boc)-OH，Fmoc-L-[O-tBu]Hyp-OH，Fmoc-L-Dap(Boc)-OH，Fmoc-L-Pro-OH，Fmoc-L-Asn(Trt)-OH，Fmoc-L-[3-F]-Pro-OH，Fmoc-L-[O-tBu]Tyr-OH。缩合完成后，根据前述“肽游离步骤”可得直链肽前体粗品，根据前述“线性肽环合步骤”可得环肽粗品。将该混合物溶于乙腈：水＝1:1(体积比)中，根据前述“RP-HPLC分离步骤”可得环肽化合物纯品。tR＝15.298min。HRESIMS:[M+H]+＝1966.0170。
实施例30
Figure BDA0002506245900000231
的制备
Fmoc-4-aza-Leu的合成路线如下所示：
Figure BDA0002506245900000232
将化合物5(1.1g，5mmol)溶于70mL甲醇中，加入37％甲醛的水溶液2.3mL，氮气置换反应瓶中的气体。之后加入0.22g 10％Pd/C，反应瓶用氢气球置换气体。反应液在室温下搅拌24小时。反应经TLC监测(DCM:MeOH＝5:1，茚三酮显色)结束后，反应液经硅藻土助滤，滤液浓缩至近干，冻干除去剩余的溶剂可得化合物6粗品，可不经纯化直接进行下一步反应。
将化合物6粗品(约5mmol)溶于22mL DCM中，加入5mL三乙基硅烷，缓慢加入三氟醋酸22mL，该反应液在室温下反应1小时。反应结束后，反应液浓缩至干，加入无水乙醚，倾倒上清液可得油状化合物7粗品，可不经纯化直接进行下一步反应。
将化合物7(约5mmol)溶于70mL水中，分批加入碳酸钠(1.6g，15mmol)，反应液搅拌至无气体产生后，反应液移至冰浴，将Fmoc-OSu(1.9g，5.5mmol)溶于35mL二氧六环中，逐滴加入到反应液中。该反应在0℃下搅拌1小时，然后在室温下搅拌16小时。TLC监测反应结束后(DCM:MeOH＝5:1，茚三酮显色、紫外显色)，加入乙醚。弃去有机层，水层用2M HCl调节pH至3，用乙酸乙酯萃取3次。有机层合并，水洗2次，饱和氯化钠洗1次。有机层浓缩至干，经硅胶柱层析分离(DCM:MeOH＝8:1～3:1)可得目标产物化合物8(700mg，三步总产率47％)。1HNMR(300MHz,Methanol-d4)δ7.80(d,J＝7.4Hz,2H),7.67(t,J＝6.5Hz,2H),7.49–7.36(m,2H),7.31(m,2H),4.61–4.28(m,2H),4.22(t,J＝6.7Hz,1H),3.37(s,2H),3.61–3.15(m,1H),2.92(s,6H).13C NMR(125MHz,Methanol-d4)δ172.6,158.7,144.8,139.8,127.0,126.9,124.9,122.1,66.8,61.2,50.8,47.6,46.2。MS(ESI)＝354.2(M+H)+。
实施例31
S31的制备
根据前述“树脂溶胀步骤”，使树脂溶胀后，根据“缩合步骤”，选用氨基酸分别为Fmoc-L-Gly-OH，Fmoc-L-Cys(Trt)-OH，Fmoc-L-Leu-OH，Boc-L-Trp-OH，Fmoc-L-Trp(Boc)-OH，Fmoc-L-Dab(Boc)-OH，Fmoc-L-[O-tBu]Hyp-OH，Fmoc-L-Dap(Boc)-OH，Fmoc-L-HoPro-OH，Fmoc-L-Asn(Trt)-OH，Fmoc-L-[3-F]-Pro-OH，Fmoc-L-[O-tBu]Tyr-OH。缩合完成后，根据前述“肽游离步骤”可得直链肽前体粗品，根据前述“线性肽环合步骤”可得环肽粗品。将该混合物溶于乙腈：水＝1:1(体积比)中，根据前述“RP-HPLC分离步骤”可得环肽化合物纯品。tR＝14.864min。HRESIMS:
[M+H]+＝1927.9645。
实施例32
S32的制备
根据前述“树脂溶胀步骤”，使树脂溶胀后，根据“缩合步骤”，选用氨基酸分别为Fmoc-L-Gly-OH，Fmoc-L-Cys(Trt)-OH，Fmoc-L-Leu-OH，Fmoc-L-4-aza-Leu-OH，Boc-L-Trp-OH，Fmoc-L-Trp(Boc)-OH，Fmoc-L-Dab(Boc)-OH，Fmoc-L-[O-tBu]Hyp-OH，Fmoc-L-Dap(Boc)-OH，Fmoc-L-HoPro-OH，Fmoc-L-Asn(Trt)-OH，Fmoc-L-[3-F]-Pro-OH，Fmoc-L-[O-tBu]Tyr-OH。缩合完成后，根据前述“肽游离步骤”可得直链肽前体粗品，根据前述“线性肽环合步骤”可得环肽粗品。将该混合物溶于乙腈：水＝1:1(体积比)中，根据前述“RP-HPLC分离步骤”可得环肽化合物纯品。tR＝13.992min。HRESIMS:[M+H]+＝1928.9611。
实施例33
S33的制备
根据前述“树脂溶胀步骤”，使树脂溶胀后，根据“缩合步骤”，选用氨基酸分别为Fmoc-L-Gly-OH，Fmoc-L-Cys(Trt)-OH，Fmoc-L-Leu-OH，Fmoc-L-4-aza-Leu-OH，Boc-L-Trp-OH，Fmoc-L-Trp(Boc)-OH，Fmoc-L-Dab(Boc)-OH，Fmoc-L-[O-tBu]Hyp-OH，Fmoc-L-Dap(Boc)-OH，Fmoc-L-HoPro-OH，Fmoc-L-Asn(Trt)-OH，Fmoc-L-[3-F]-Pro-OH，Fmoc-L-[O-tBu]Tyr-OH。缩合完成后，根据前述“肽游离步骤”可得直链肽前体粗品，根据前述“线性肽环合步骤”可得环肽粗品。将该混合物溶于乙腈：水＝1:1(体积比)中，根据前述“RP-HPLC分离步骤”可得环肽化合物纯品。tR＝13.992min。HRESIMS:[M+H]+＝1928.9610。
实施例34
S34的制备
根据前述“树脂溶胀步骤”，使树脂溶胀后，根据“缩合步骤”，选用氨基酸分别为Fmoc-L-Gly-OH，Fmoc-L-Cys(Trt)-OH，Fmoc-L-Leu-OH，Fmoc-L-4-aza-Leu-OH，Boc-L-Trp-OH，Fmoc-L-Trp(Boc)-OH，Fmoc-L-Dab(Boc)-OH，Fmoc-L-[O-tBu]Hyp-OH，Fmoc-L-Dap(Boc)-OH，Fmoc-L-HoPro-OH，Fmoc-L-Asn(Trt)-OH，Fmoc-L-[3-F]-Pro-OH，Fmoc-L-[O-tBu]Tyr-OH。缩合完成后，根据前述“肽游离步骤”可得直链肽前体粗品，根据前述“线性肽环合步骤”可得环肽粗品。将该混合物溶于乙腈：水＝1:1(体积比)中，根据前述“RP-HPLC分离步骤”可得环肽化合物纯品。tR＝13.501min。HRESIMS:[M+H]+＝1929.9598。
实施例35
均相时间荧光法测定实施例抑制PD-1/PD-L1相互作用的评估：
PD-1和PD-L1的相互作用可使用两种蛋白的胞外域部分的重组蛋白测定。PD-1和PD-L1蛋白质细胞外结构域表达为具有检测标签的融合蛋白，对于PD-1，标签是免疫球蛋白(PD-1-Ig)的Fc部分，对于PD-L1，它是6组氨酸基序(PD-L1-His)。人PD-1(25-167)，具有免疫球蛋白G(Ig)表位标签[hPD-1(25-167)-3S-IG]的C末端人Fc结构域和人PD-L1(18-239)具有C末端His表位标签[hPD-L1(18-239)-TVMV-His1]在HEK293T细胞中表达，并通过蛋白A亲和层析和尺寸排阻层析依次纯化。
相互作用研究均在由额外添加0.1％(含)牛血清白蛋白和0.05％(v/v)Tween-20的dPBS组成的HTRF测定缓冲液中进行。对于hPD-L1-His结合测定，将抑制剂与PD-L1-His(终浓度10nM)在4ul测定缓冲液中预孵育15分钟，然后加入PD-1-Ig(终浓度20nM)。在1uL测定缓冲液中并进一步培养15分钟。使用铕钙磷酸盐标记的抗Ig(终浓度1nM)和异烟酞菁(APC)标记的抗His(最终20nM)实现HTRF检测。将抗体在HTRF检测缓冲液中稀释并取5ul。使反应混合物平衡30分钟，并使用EnVision荧光计获得所得信号(665nm/620nm)。
各个环肽类化合物抑制PD-1/PD-L1相互作用测定结果如表1所示。
A：IC50<100nM；B：100nM<IC50<10μM；C：10μM<IC50<100μM
表1：均相时间荧光法测定实施例抑制PD-1/PD-L1相互作用结果
Figure BDA0002506245900000251
Figure BDA0002506245900000261
如上表所示，实施例中的环肽化合物均有一定的抑制PD-1/PD-L1相互作用的能力。
实施例36
实施例细胞层面抑制PD-1/PD-L1相互作用评估：
该实验中使用重组鼠源PD-L1作为细胞实验中PD-L1的来源。小鼠脾细胞是将小鼠脾脏在40um细胞滤网中捣碎后，在室温下用1mL ACK裂解缓冲液进一步处理5分钟得到。用9mL RPMI完全培养基洗涤后，将细胞重悬于15mL管中的3mL 1xPBS中。小心地将3mL加入管底部，不干扰覆盖的脾细胞悬浮液。在室温下以800×g离心20分钟后，收集不透明的脾细胞层。得到的脾细胞再用冷PBS溶液冲洗两次，使用台盼蓝染色计数总细胞数用于之后的细胞层面测试。脾细胞在RPMI完全培养基(RPMI+10％胎牛血清+1mM丙酮酸钠+10,000u/mL青霉素和10,000ug/mL链霉素)中培养，并保持在37℃下含5％CO2的CO2培养箱中。
CFSE是一种被动扩散到细胞内并与细胞内蛋白结合的染料。1×106细胞/mL的脾细胞用5uM CFSE在预热的1x PBS/0.1％BSA溶液中于37℃处理10分钟。过量CFSE将5倍体积的0℃培养基淬灭至细胞中并在冰上孵育5分钟。用0℃完全RPMI培养基进一步洗涤CFSE标记的脾细胞三次。将CFSE标记的1×105脾细胞加入到含有MDA-MB231细胞(在高葡萄糖DMEM培养基中培养1×10个细胞)或重组人PD-L1(100ng/mL)和测试化合物的孔中。用抗小鼠CD3和抗小鼠CD28抗体(各1ug/mL)刺激脾细胞，并将培养物在37℃，5％CO2下进一步培养72小时。收获细胞并用冰冷的FACS缓冲液洗涤三次，并通过流式细胞术用488nm激发和521nm发射滤光片分析百分比增殖。
使用FACS程序分析脾细胞增殖百分比，并且在扣除背景增殖值(％)并将刺激的脾细胞增殖(％，阳性对照)标准化为100％后以计算化合物回复脾细胞增殖百分比。
刺激的脾细胞：脾细胞+anti-CD3/CD28
刺激背景增殖：脾细胞+anti-CD3/CD28+PD-L1
化合物增殖：脾细胞+anti-CD3/CD28+PD-L1+化合物
通过添加所需浓度来检测化合物效果。在配体(PD-L1)存在下化合物对anti-CD3/CD28刺激的脾细胞的表达(表4)。
各个环肽类化合物在100nM浓度下抑制PD-1/PD-L1相互作用测定结果如表2所示。
A：>90％；B：70％<IC50<90％；C：50％<IC50<70％；D：<50％
表2：实施例细胞层面抑制PD-1/PD-L1相互作用结果
化合物 IC<sub>50</sub> 化合物 IC<sub>50</sub> 化合物 IC<sub>50</sub>
S3 A S14 A S25 A
S4 A S15 A S26 A
S5 A S16 A S27 A
S6 A S17 A S28 A
S7 A S18 A S29 A
S8 A S19 A S31 A
S9 A S20 A S32 A
S10 A S21 A S33 A
S11 A S22 A S34 A
S12 A S23 A
S13 A S24 A
如上表所示，实施例中的环肽化合物均有一定的抑制PD-1/PD-L1相互作用的能力。
实施例37
实施例恢复人外周血单个核细胞(PBMC)分泌IFN-γ作用的实验
人外周血单个核细胞(PBMC)活化后会分泌IFN-γ、IL-2和TNF-α等细胞因子，而hPD-L1(人源PD-L1)蛋白与人PBMC上的PD-1蛋白结合会抑制PBMC的活化，降低细胞因子分泌。在该实验中，由人源乳腺癌癌细胞系MDA-MB-231或人源黑色素瘤系B16F10作为人源PD-L1蛋白供体。本实验的目的是检测化合物阻断hPD-L1蛋白抑制PBMC活化的能力。具体操作如下：将人PBMC接种到96孔板中，每孔接种1x105个细胞。实验共分六组，一组为空白对照(只加入PBMC)，一组为激活组(PBMC+anti-CD3/anti-CD28抗体)，两组抑制组，其一为PBMC+anti-CD3/anti-CD28抗体+额外接种MDA-MB-231，共孵育，其二为PBMC+anti-CD3/anti-CD28抗体+额外接种B16F10，共孵育。最后两组分别为在抑制组的基础上加入1uM和10nM的实施例中的环肽化合物。48小时后采用Biolegend公司的IFN-γELISA检测试剂盒检测细胞上清液中IFN-γ的含量。实验结果显示，激活组中PBMC受到anti-CD3/anti-CD28抗体作用后，分泌IFN-γ显著增加，说明PBMC呈激活状态；抑制组中hPD-L1蛋白抑制PBMC分泌IFN-γ，说明PBMC的激活状态受到抑制；实施例3～实施例29以及实施例31～35中的化合物在1uM和10nM浓度下具有显著的恢复PBMC细胞分泌IFN-γ的作用。这表明本发明的化合物具有在人源乳腺癌癌细胞、人源黑色素瘤存在下抑制PD-1/PD-L1相互作用进而增强T细胞免疫活性的功效。

Claims (10)

1.一种环肽类化合物及其药学上可以接收的盐、酯或溶剂化合物，其特征在于，该化合物结构如通式(I)所示：
Figure FDA0002506245890000011
R1选自于下列结构或其立体异构或消旋体中的一种：
-Me[Ala]、-CH2CH(CH3)2[Leu]、Me(Et)CH-[Ile]、-CH2NMe2[4-aza-leu]、CH3CH2CH2CH2-[Nle]-CH2CH2CH(CH3)2[HOLeu]、
Figure FDA0002506245890000012
[Cpa]；
R2选自于下列结构或其立体异构或消旋体中的一种：
-Me[Ala]、-CH2CH(CH3)2[Leu]、Me(Et)CH-[Ile]、-CH2NMe2[4-aza-leu]、CH3CH2CH2CH2-[Nle]-CH2CH2CH(CH3)2[HOLeu]、
Figure FDA0002506245890000013
[Cpa]、Ph(4-Ph)-CH2-[4-Ph-Phe]、PhCH2-[Phe]、4-OH-Phe[Tyr]；
R3选自于下列结构或其立体异构或消旋体中的一种：
-CH2NH2[Dap]、-CH2CH2NH2[Dab]、-CH2CH2CH2NH2[Orn]、-CH2CH2CH2CH2NH2[Lys]、
Figure FDA0002506245890000021
[His]；
R4、R5选自于下列结构或其立体异构或消旋体中的一种：
Figure FDA0002506245890000022
R6选自于下列结构或其立体异构或消旋体中的一种：
-CH2CONH2[Asn]、-CH2CH2CONH2[Gln]、CH2CH2CH2NHC(N)NH2[Arg]、CH2CH-2CH2NHCONH2[Cit]、CH2NHCONH2[Alb]；
R7，R8选自于下列结构或其立体异构或消旋体中的一种：
Figure FDA0002506245890000023
R9选自于下列结构中的一种：
-H[Phe]，-NH2[4-NH2-Phe]，-NHMe[4-NHMe-Phe]，-NMe2[4-NMe2-Phe]，-OH[Tyr]，-OMe[OMe-Tyr]，-Ph[4-Ph-Phe]；
L选自于下列结构中的一种：
Figure FDA0002506245890000031
Figure FDA0002506245890000032
波浪线指代连接方式。
2.根据权利要求1所述的环肽类化合物及其药学上可以接收的盐、酯或溶剂化合物，其特征在于，所述环肽类化合物选自下述化合物：
Figure FDA0002506245890000033
Figure FDA0002506245890000041
Figure FDA0002506245890000051
Figure FDA0002506245890000061
Figure FDA0002506245890000071
Figure FDA0002506245890000081
3.一种药物组合物，其特征在于，包含权利要求1所述的环肽类化合物及其药学上可以接收的盐、酯或溶剂化合物。
4.根据权利要求3所述的药物组合物，其特征在于，所述环肽类化合物及其药学上可以接收的盐、酯或溶剂化合物添加一种或多种药学上的辅料制成制剂。
5.根据权利要求4所述的药物组合物，其特征在于，所述药学上的辅料包括稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、吸收促进剂、表面活性剂、润滑剂或稳定剂。
6.根据权利要求4所述的药物组合物，其特征在于，所述制剂为片剂、胶囊、颗粒剂、散剂、糖浆剂、口服液或注射剂。
7.如权利要求1所述的环肽类化合物及其药学上可以接收的盐、酯或溶剂化合物在制备PD-1/PD-L1通路抑制剂中的应用。
8.如权利要求1所述的环肽类化合物及其药学上可以接收的盐、酯或溶剂化合物在制备T细胞免疫活性增强剂中的应用。
9.如权利要求1所述的环肽类化合物及其药学上可以接收的盐、酯或溶剂化合物或权利要求2所述的药物组合物在制备预防或治疗乳腺癌、黑色素瘤药物中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述预防或治疗乳腺癌、黑色素瘤药物为乳腺癌、黑色素瘤免疫治疗药物或乳腺癌、黑色素瘤化疗药物或乳腺癌、黑色素瘤靶向治疗药物。
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