CN111560330A

CN111560330A - 一种具有免疫调节、抗炎和抗宫颈癌作用的干酪乳杆菌及应用

Info

Publication number: CN111560330A
Application number: CN202010396730.3A
Authority: CN
Inventors: 王楠; 何红鹏; 张同存; 刘美玲; 郝云鹏; 申敬; 张秀霞; 扈士月; 凌涛; 罗学刚; 齐威; 李中媛; 宋亚囝
Original assignee: Tianjin University of Science and Technology
Current assignee: Tianjin University of Science and Technology
Priority date: 2020-05-12
Filing date: 2020-05-12
Publication date: 2020-08-21
Anticipated expiration: 2040-05-12
Also published as: CN111560330B

Abstract

本发明涉及一种具有免疫调节、抗炎和抗宫颈癌作用的干酪乳杆菌，名称为：LH23，分类名称为：Lactobacillus casei，保藏编号为：CGMCC No.16656，可以调节免疫、调节M1/M2型巨噬细胞平衡，增加Treg细胞的数量；改善小鼠结肠炎症状，结肠长度缩短和肠道上皮细胞凋亡，抑制促炎因子(TNF‑α、IL‑1β、IL‑6)的过度分泌，恢复肠道内短链脂肪酸(SCFAs)的浓度；可以抗宫颈癌，抑制宫颈癌HeLa细胞增殖和组蛋白的乙酰化修饰，引起HeLa细胞的凋亡，抑制人乳头瘤病毒HPVE6、E7蛋白的表达。该菌用于制备抑制炎症性肠病和宫颈癌的发酵食品，具有非常广泛的应用前景。

Description

一种具有免疫调节、抗炎和抗宫颈癌作用的干酪乳杆菌及应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，尤其是一种具有免疫调节、抗炎和抗宫颈癌作用的干酪乳杆菌及应用。

背景技术

炎症性肠病(inflammatory bowel disease，IBD)是一类发病机制尚不明确的胃肠的炎症性疾病，主要包括溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)和克罗恩病(Crohn’sdisease，CD)。这两种肠胃炎症都不是致命，但是影响人正常生活，表现为腹痛，腹泻，营养障碍，便血。对近50年有关IBD流行病学的文献进行分析，目前，IBD欧洲发病率最高，但是随着许多发展中的国家生活方式西化发病也逐渐增加。

现代医学主要药物治疗主要包括氨基糖苷类、糖皮质激素、免疫抑制剂、单克隆抗体类，氨基水杨酸主要包括兰索拉嗪、奥沙拉嗪，是治疗轻中度IBD的首要用药，糖皮质激素主要有氢化可松、泼尼松等，是治疗中重度IBD的主流用药。免疫抑制剂主要有泼磷酰胺、硫唑嘌呤、甲氨喋呤和新型的免疫制剂。重度IBD的患者可用于治疗氨基水杨酸和糖皮质激素均无效或疗效欠佳。单克隆抗体类药物是一类机体的免疫病理反应，如英夫利昔单抗和戈利木单抗等，可用于治疗重度IBD患者。但生物制剂的使用会引起强烈的副作用，比如食欲不振、血压降低、皮炎和免疫复合性血清病等。因此寻找新的治疗IBD的方法，具有重要的实际意义。

而IBD的主要诱因与免疫功能的紊乱和肠道菌群的失调密切相关。巨噬细胞是重要的免疫效应细胞，从循环外周血单核细胞分化而来，在稳定状态下或在炎症反应中迁移到组织中。根据不同的微环境下，巨噬细胞可被激活为两种主要的功能表型，即经典激活的巨噬细胞(M1)和替代性激活的巨噬细胞(M2)。M1型巨噬细胞，其典型的激活刺激是IFN-γ和LPS，M1具有重要的杀菌作用，提呈抗原，参与正向免疫应答，发挥免疫监视的功能，并在Th1型介导的免疫中发挥作用，其特征是高水平表达诱导型一氧化氮合酶和各种促炎细胞因子，如TNF-α、IL-1、IL-6和IL-12；M2型巨噬细胞，进一步细分为M2a(由IL-4或IL-13诱导)、M2b(由免疫复合物联合IL-1β或LPS诱导)和M2c(由IL-10，TGF-β或糖皮质激素诱导)，M2支持Th2相关的效应功能，抗原提呈能力较弱，具有抗炎和组织修复的作用，其特征是高水平表达表面分子如MR、CD204、CD163，高水平的IL-10，以及高水平的替代激活信号，如Arg1、Ym1和Fizz1。因此促进M1巨噬细胞向M2巨噬细胞的转化有助于IBD病情的缓解和治疗。

调节性T细胞(Regulatorycell，简称Treg)一类具有显著免疫抑制作用的CD4+T细胞亚群，能够抑制其他细胞的免疫应答，在维持机体免疫平衡和预防自身免疫疾病、移植排斥方面发挥着重要作用。Treg细胞是维持肠道免疫稳态的重要因素。Treg细胞数量减少或功能异常均有可能导致IBD发生。Treg细胞体外调节可通过CTLA-4、TGF-β及GITR等直接与靶细胞上的相应受体结合,并抑制靶细胞上IL-2Rα链的表达,降低靶细胞对IL-2的反应性从而抑制效应T细胞的增殖；体内调节功能主要依靠抑制性细胞因子,如IL-10、IL-4及分泌型TGF-β；Treg细胞还可通过与抗原提呈细胞的作用来调节机体免疫。

益生菌可以定植于胃肠道以改变微生物群落结构，并在局部和系统水平与免疫系统细胞相互作用，以调节宿主免疫系统的发育和功能，包括巨噬细胞、T细胞的功能。在一些炎症相关疾病中，益生菌可以抑制M1的极化，并通过调节NF-κB、MAPK、PI3K/Akt和STAT等信号通路来调节M2巨噬细胞的极化，改善某些炎症性疾病，从而抑制炎症和控制免疫平衡。M1型和M2型巨噬细胞的平衡也能反映Th1和Th2的平衡。而肠道微生物的代谢产物可以通过增加Treg细胞的数量缓解小鼠肠炎。

宫颈癌是世界范围内的第二大女性恶性肿瘤，宫颈癌主要致病因素为高危型人乳头瘤病毒(HPV)的感染，而高危型HPV编码的蛋白E6和E7是主要致癌的因素，其表达受到细胞中组蛋白修饰的影响。乳酸菌广泛存在于人体胃肠道和阴道，参与人体健康的调节。相对于复杂的胃肠道菌群，阴道菌群的构成比较简单，乳酸菌是其优势菌，通过产生乳酸、过氧化氢和乳酸菌素维持阴道酸性环境并抑制致病菌生长。阴道菌群失调与女性生殖系统炎症密切相关，与宫颈癌之间也存在相关性，但是乳酸菌对宫颈癌的抑制作用及其机制仍不明确。

目前，我国已有一些关于干酪乳杆菌缓解肠炎的发明专利和专利申请，如：CN109674827A公开了一株干酪乳杆菌，明显改善肾功能，减少肾脏炎症因子分泌和巨噬细胞浸润，减少肠道损伤及炎症反应，有效改善肠道通透性。CN104031855A公开了一种具有预防和治疗肠炎的功能性食品，其中涉及干酪乳杆菌。CN108741091A公开了一种用于调节小儿肠炎免疫反应的复合益生压片制剂，其中涉及干酪乳杆菌。

总之，目前已公开的专利或专利申请中，虽已有用于缓解肠炎的干酪乳杆菌的报道，但其机制各不相同，能够调节免疫、具有调节M1/M2型巨噬细胞平衡、增加Treg细胞数目的干酪乳杆菌尚未检索到，而能够抑制E6、E7表达抗宫颈癌作用的干酪乳杆菌尚未见报道。因此，筛选具有免疫调节、缓解肠炎、抗宫颈癌作用的益生菌具有非常重要的应用价值和现实意义。

发明内容

本发明目的在于克服现有技术中的不足之处，提供一种具有免疫调节、抗炎和抗宫颈癌作用的干酪乳杆菌及应用。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种具有免疫调节、抗炎和抗宫颈癌作用的干酪乳杆菌，名称为：LH23，分类名称为：Lactobacillus casei，保藏编号为：CGMCC No.16656，保藏日期为：2018年10月30日，北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院生物研究所，保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

而且，所述干酪乳杆菌来源于酒曲；

而且，所述干酪乳杆菌在固体平板上菌落呈白色、圆形、表面光滑湿润、边缘整齐、凸起的菌落，在37℃恒温的条件下，在MRS培养基中培养达到12h对数末期。

而且，所述干酪乳杆菌具有较强的耐胆汁盐和耐酸能力及结肠癌细胞黏附能力；

而且，所述干酪乳杆菌能够调节免疫、调节M1/M2型巨噬细胞平衡，增加Treg细胞的数量；

或者，所述干酪乳杆菌能够显著抑制LPS体外诱导RAW264.7巨噬细胞引起的NO的产生和促炎因子产生，或者，能够调节腹腔M1/M2型巨噬细胞的平衡，或者，能够增加肠系膜淋巴结Treg细胞的数量；

或者，所述干酪乳杆菌能够缓解炎症性肠病；

或者，所述干酪乳杆菌能够改善小鼠结肠炎症状，或者能够预防体重下降、结肠长度缩短和肠道上皮细胞凋亡，或者能够抑制促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6的过度分泌，或者能够恢复肠道内短链脂肪酸SCFAs的浓度。

而且，所述干酪乳杆菌能够抑制宫颈癌；

或者，所述干酪乳杆菌能够抑制宫颈癌HeLa细胞增殖，或者能够引起HeLa细胞的凋亡，或者能够抑制人乳头瘤病毒HPVE6、E7蛋白的表达，或者能够抑制HeLa细胞中组蛋白的乙酰化修饰。

如上所述的具有免疫调节、抗炎和抗宫颈癌作用的干酪乳杆菌在制备预防和/或治疗结肠炎的药物中的应用。

而且，所述药物为益生菌制剂；或者，所述药物为包含干酪乳杆菌及药学上通常使用的矫味剂、润滑剂、填充剂、崩解剂的载体组成的复合物。

如上所述的具有免疫调节、抗炎和抗宫颈癌作用的干酪乳杆菌在制备抗宫颈癌的药物中的应用。

而且，所述药物为微生态制剂；或者，所述药物为包含干酪乳杆菌及药学上通常使用的矫味剂、润滑剂、填充剂、崩解剂的载体组成的复合物。

利用如上所述的具有免疫调节、抗炎和抗宫颈癌作用的干酪乳杆菌发酵生产制得的发酵食品。

而且，所述发酵食品包括乳制品、豆制品、果蔬制品。

本发明取得的优点和积极效果为：

1、本发明干酪乳杆菌LH23可以调节免疫、调节M1/M2型巨噬细胞平衡，增加Treg细胞的数量；可以改善小鼠结肠炎症状，可以预防体重下降、结肠长度缩短和肠道上皮细胞凋亡，抑制促炎因子(TNF-α、IL-1β、IL-6)的过度分泌，恢复肠道内短链脂肪酸(SCFAs)的浓度；可以抗宫颈癌，抑制宫颈癌HeLa细胞增殖，引起HeLa细胞的凋亡，抑制人乳头瘤病毒HPVE6、E7蛋白的表达，抑制Hela细胞中组蛋白的乙酰化修饰。本发明干酪乳杆菌可以用于制备抑制炎症性肠病和宫颈癌的发酵食品，具有非常广泛的应用前景。

2、本发明干酪乳杆菌LH23具有较好的酸和胆盐耐受性和结肠细胞黏附能力；可以显著抑制LPS体外诱导RAW264.7巨噬细胞引起的NO的产生和促炎因子产生；调节腹腔M1/M2型巨噬细胞的平衡；增加肠系膜淋巴结Treg细胞的数量；可以改善小鼠结肠炎症状；可以预防体重下降、结肠长度缩短和肠道上皮细胞凋亡；抑制促炎因子(TNF-α、IL-1β、IL-6)的过度分泌；恢复肠道内短链脂肪酸(SCFAs)的浓度；此外，干酪乳杆菌LH23可以抑制宫颈癌HeLa细胞增殖；引起HeLa细胞的凋亡；可以抑制人乳头瘤病毒HPVE6、E7蛋白的表达；可以抑制HeLa细胞中组蛋白的乙酰化修饰。

附图说明

图1为本发明中干酪乳杆菌的耐酸能力图；

图2为本发明中干酪乳杆菌的耐胆盐能力图；

图3为本发明中干酪乳杆菌对结肠细胞黏附能力图；

图4为本发明中干酪乳杆菌对溃疡性结肠炎模型小鼠体重的影响图；

图5为本发明中干酪乳杆菌对溃疡性结肠炎模型小鼠DAI的影响图；

图6为本发明中干酪乳杆菌对溃疡性结肠炎模型小鼠结肠长度的影响图；

图7为本发明中干酪乳杆菌对溃疡性结肠炎模型小鼠血清中IL-1β和TNF-α水平的改善情况图；

图8为本发明中干酪乳杆菌对溃疡性结肠炎型小鼠肠道内容物短链脂肪酸水平的影响图；其中，a为盲肠内容物的短链脂肪酸的含量图，b为小肠内容物的短链脂肪酸的含量图；

图9为本发明中干酪乳杆菌对HeLa细胞增殖的影响图；其中，a为MTT法检测细胞增殖图，b为培养皿中细胞密度变化图；

图10为本发明中干酪乳杆菌对HeLa细胞凋亡的检测图；

图11为本发明中干酪乳杆菌对HPV18 E6和E7基因表达的影响图；

图12为本发明中干酪乳杆菌对组蛋白乙酰化修饰的影响图。

具体实施方式

下面详细叙述本发明的实施例，需要说明的是，本实施例是叙述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。

本发明中所使用的原料，如无特殊说明，均为常规的市售产品；本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域的常规方法。

较优地，所述干酪乳杆菌在固体平板上菌落呈白色、圆形、表面光滑湿润、边缘整齐、凸起的菌落，在37℃恒温的条件下，在MRS培养基中培养达到12h对数末期。

较优地，所述干酪乳杆菌能够调节免疫、调节M1/M2型巨噬细胞平衡，增加Treg细胞的数量；

或者，所述干酪乳杆菌能够缓解炎症性肠病；

较优地，所述干酪乳杆菌能够抑制宫颈癌；

较优地，所述药物为益生菌制剂；或者，所述药物为包含干酪乳杆菌及药学上通常使用的矫味剂、润滑剂、填充剂、崩解剂的载体组成的复合物。

较优地，所述药物为微生态制剂；或者，所述药物为包含干酪乳杆菌及药学上通常使用的矫味剂、润滑剂、填充剂、崩解剂的载体组成的复合物。

较优地，所述发酵食品包括乳制品、豆制品、果蔬制品。

具体地，相关制备及检测如下：

实施例1：菌株的筛选与鉴定

(1)菌株的分离与纯化

用无菌研钵将酒曲研磨均匀，称取1g酒曲到10mL生理盐水中，梯度稀释至10^-6，取10^-4、10^-5、10^-6三个梯度的稀释液100μl分别涂布于MRS固体平板上，37℃培养48h，挑选不同形态的菌落进行划线分离，直至得到菌落形态一致的纯的单菌落，挑取单菌落接种于5mlMRS液体培养基中，培养过夜，取800μl菌液加入200μl 60％甘油于-80℃保存。

(2)菌株的鉴定

将分离得到的菌株进行PCR扩增16S rDNA，PCR产物送到金唯智进行测序，将测序结果在NCBI中进行核酸序列比对，得到干酪乳杆菌1株，命名为干酪乳杆菌LH23。

(3)培养

将干酪乳杆菌接入MRS固体培养基上于37℃厌氧培养48h后，观察菌落形态呈白色，圆形，表面光滑湿润，边缘整齐、凸起。

实施例2：干酪乳杆菌LH23耐酸能力测定

将乳酸菌进行3次活化，放置37℃厌氧培养箱，过夜培养；将其菌体的浓度稀释到5×10⁸CFU/mL，换置不同pH值的MRS培养基中，pH分别为2.0、3.0、4.0；将不同pH的菌液放置96孔板里，每一个实验组设置6个平行孔，需要设置阴性对照，其阴性对照为pH值为7的MRS，置于37℃厌氧培养箱中，培养时间为4h。将加入20μL的MTT(5mg/mL)，放置厌氧培养箱4h。在酶联免疫检测仪测量490nm处各孔的吸光值(A实验组)，并与阴性对照组吸光值(A对照组)对比，测定存活率。存活率计算公式如下：

存活率(％)＝(A实验组)/(A对照组)×100式(1)

结果如图1所示，Pediococcusacidilactici ML2523、Lactobacillus caseiLH23、L.acidoph ilus ML4523、Lactobacillus casei LH2723，这4株乳酸菌均可在pH2，pH3和pH4条件下生长。其中干酪乳杆菌LH23在pH 2.0的耐酸能力显著强于其它菌种，在pH为2.0的条件下培养4h后存活率为分别为18.63％±2.54。综上所述，菌株LH23具有较强的耐酸性。

实施例3：干酪乳杆菌LH23耐胆盐能力测定

将乳酸菌进行3次活化，放置37℃厌氧培养箱，过夜培养；将其菌体的浓度稀释到5×10⁸CFU/mL，换置不同胆盐浓度的MRS培养基中，胆盐的浓度为0.1％(w/v)、0.2％(w/v)、0.3％(w/v)；采用实施例1中的方法测定存活率。

结果如图2所示，Pediococcusacidilactici ML2523、Lactobacillus caseiLH23、L.acidop hilus ML4523、Lactobacillus casei LH2723，这4株乳酸菌分别在含0.1％(w/v)、0.2％(w/v)、0.3％(w/v)混合胆盐的MRS液体培养基中培养4h后的存活率差异显著。其中LH23在0.1％～0.3％耐胆盐能力显著强于其它菌种，在胆盐为0.1％时，LH23为118.92％±2.19，在胆盐为0.3％时，LH23为41.82％±4.26。综上所述，干酪乳杆菌LH23具有较强的胆盐耐受性能。

实施例4：干酪乳杆菌LH23结肠细胞黏附能力测定

用DMEM-HG完全培养基，将SW620细胞的密度调节为1×10⁵个的细胞悬液，接种于96孔板中，每孔100μL的培养基，过夜培养细胞完全贴壁，大约12h；分别将4株乳酸菌菌体的浓度稀释到5×10⁸CFU/mL，加入96孔细胞培养板中，每个孔100μL的体积。温度为37℃，细胞培养箱中孵育1h后，用PBS漂洗3次，完全洗去未黏附的菌。使用MTT的分析法分别测定PBS清洗后的益生菌、未清洗的益生菌及未加菌空白孔的吸光值，分别记为A总菌、A黏附菌、A对照，依照如下公式计算黏附率：

黏附率(％)＝("A黏附菌"－A对照)/(A总菌－A对照)×100 式(2)

结果如图3所示，这4株乳酸菌与结肠细胞黏附能力存在较为明显的差异，其中干酪乳杆菌LH23黏附能力最强，黏附值为76.47±3.56％。

实施例5：LPS诱导RAW264.7细胞释放NO含量测定

将RAW264.7细胞的密度调节为1×105个的细胞悬液，接种于96孔板中，每孔100μL的培养基，为1×10⁵个/mL，过夜培养细胞完全贴壁；待12h贴壁后，除空白对照组和LPS组外，其他各组分别加入等体积且浓度不一样(低浓度：0.15mg/mL；中浓度：0.60mg/mL；高浓度：1.20mg/mL)的干酪乳杆菌LH23裂解液上清；将实验组和空白对照孔设置6个复孔，将其实验组预处理1h，除空白对照组不需要加LPS，其他各组加入浓度为1μg/mL的LPS，继续培养24h取上清液；实验按照试剂盒说明书，用Griess法测细胞上清中的NO含量。结果如表1所示。

表1

#与对照组相比P<0.05；*与模型组相比P<0.05；**与模型组相比P<0.01

结果显示，干酪乳杆菌LH23裂解液上清可以显著抑制LPS诱导引起的NO的产生，证明其具有显著的抗炎能力。

实施例6：LPS诱导RAW264.7细胞分泌TNF-α、IL-6和IL-1β含量测定

RAW264.7细胞(5×10⁶个/mL)加入6孔培养板，每孔2mL；待12h贴壁后，除空白对照组和LPS组外，其他各组分别加入等体积且浓度不一样(低浓度：0.07mg/mL；中浓度：0.15mg/mL；高浓度：0.31mg/mL)的干酪乳杆菌LH23裂解液上清；每组3个复孔预处理1h，之后除空白对照组不加LPS，其余各组加入LPS，作用浓度为1μg/mL，继续培养24h取上清液；收集细胞上层清液，采用酶联免疫吸附法(ELISA)，按照试剂盒说明书测定细胞上清中TNF-α，IL-6和IL-1β的含量，制作标准曲线。结果如表2所示。

表2

结果显示，与模型组相比不同浓度干酪乳杆菌LH23的裂解液上清组中IL-1β，IL-6的分泌减少，且有显著性差异(*P<0.05，**P<0.01)，并呈现出一定的浓度依赖性关系。而TNF-α有抑制但是没有显著差异，表明干酪乳杆菌LH23具有抗炎的能力。

实施例7：干酪乳杆菌LH23对溃疡性结肠炎的缓解作用

(1)动物饲养

将购自中国食品药品监督管理实验动物资源研究所的24只雄性C57BL/6小鼠，置于25℃、55％湿度、12h光照/黑暗周期的对照条件下，饲喂标准实验室食品。

(2)实验流程

一周适应期，给与无限制食物和饮用水。适应期后，对实验组先灌胃干酪乳杆菌LH23和失活的干酪乳杆菌LH23(108CFU/mL)保护一周，200μL/鼠/天；空白组和模型组灌胃同等体积PBS。在此一周内所有小鼠饮用纯净水。第7天开始，空白组饮用纯净水，其他小鼠自饮2.5％(w/v)右旋糖酐硫酸钠盐(DSS)(分子量36000-50000；MP Biomedicals)一周诱导UC模型，建模一周内灌胃不间断，一边建模一边治疗。实验过程中每天记录体重。实验结束，眼球法取血后将其脱臼处死，取结肠。

(3)体重记录

为了评价干酪乳杆菌LH23对结肠炎的影响，小鼠每天口服1×108CFU LH23，然后连续7天自由饮用含2.5％(w/v)DSS的饮用水。结果如图4所示，与正常组的小鼠相比，第14天实验结束时，DSS处理小鼠(DSS组)的体重显著下降(#P<0.05vs.正常组)；而DSS组与灌胃LH23组(DSS+LH23)体重增加有显著影响(*P<0.05vs.DSS组)。而灌胃HK-LH23(DSS+LH23)，第14天体重略有增加，但是无显著性差异。综上所述，LH23组明显缓解了小鼠体重的减轻(*p<0.05)。

(4)疾病活动指数评价

肠炎的严重性以疾病活动指数DAI(Disease Activity Index)评价，在实验过程中对小鼠进行观察，通过体重，毛色，饮食和饮水的数量粪便的颜色进行评分。

评分方法如表3所示。

表3疾病活动指数(DAI)评分标准

注：*正常粪便：成形、不黏连肛门成、颜色为黄褐色；软便：基本成形但是质地柔软，黏附于肛门上、有轻微便血；腹泻：不成的形状，黏附于肛门上，便血。

DAI评分基本公式如下。

DAI＝((体重下降率分数+大便性质分数+便血的分数))/3 式(3)

结果如图5所示，在第14天实验结束时，DSS组的DAI平均达到4.5±0.35，与正常相比DAI有显著性差异(*P<0.05)；灌胃干酪乳杆菌LH23组的DAI值为2.50±0.25；灌胃HK-LH23的小鼠的DAI为3.50±0.21，3.51±0.26。综上所述，干酪乳杆菌LH23显著降低DAI评分。

(5)比较结肠长度

结肠变短是溃疡性结肠炎的一个特征。在第14天实验结束的时候，颈椎脱臼处死小鼠，解剖取出结肠组织，观察并比较各组小鼠的结肠长度。

结果如图6所示，DSS诱导结肠炎小鼠的结肠长度明显比正常小鼠的结肠长度短，正常组小鼠的结肠长度是最长的，而DSS组小鼠的是最短的，干酪乳杆菌LH23预处理后的小鼠结肠长度适中，较DSS组小鼠结肠长(*P<0.05，**P<0.01)，经HK-LH23预处理后，结肠长度有部分恢复，且有显著性差异(*P<0.05)。综上所述，干酪乳杆菌LH23可显著增加溃疡性结肠炎小鼠的结肠长度。

(6)炎症因子测定

实验结束后，采取摘眼球法进行血液样品的采集，取完血采用脊椎断离法处死小鼠。血液在室温放置10min，设置离心的转速和时间分别为4000rpm、10min，吸取离心管中液体上清，待用；血清指标的检测，采用ELISA检测血清中TNF-α、IL-6、IL-1β，具体方法按照试剂盒说明书进行操作。

结果如图7所示，用DSS处理组小鼠血清中促炎因子IL-1β，TNF-α的含量较正常组高，而LH23显著抑制促炎细胞因子IL-1β和TNF-α(***P<0.001，**P<0.01)。HK-LH23略有抑制促炎细胞因子IL-1β和TNF-α(*P<0.05，**P<0.01)。综上所述，干酪乳杆菌LH23能够降低血清中炎症因子，从而对溃疡性结肠炎一定缓解的作用。

(7)短链脂肪酸测定

分别取小肠、盲肠的肠道内容物的样品，将其样品提前冻干好，制备10％匀浆，离心取上清液，过0.22μm滤膜。取乙酸(AA)、丙酸(PA)、异丁酸(SA)，琥珀酸(IBA)和乳酸(LA)配置一定梯度的标准溶液，并用液相色谱仪器相关短链脂肪酸含量。具体见表4。

表4液相色谱仪工作参数

结果如图8所示，与对照组相比，经DSS处理的小鼠小肠中PA和SA的浓度显著降低(#P<0.05vs.正常组)，而灌胃干酪乳杆菌LH23显著提高了AA，PA和SA的浓度(*P<0.05vs.DSS)。干酪乳杆菌LH23组盲肠中AA、PA、IBA含量增加(*P<0.05vs.DSS)。但是灌胃HK-LH23无明显上调了SCFAs的浓度。综上所述，干酪乳杆菌LH23上调了SCFAs的浓度，明显减轻了DSS引起的炎症反应。

实施例8：流式细胞仪检测小鼠腹腔巨噬细胞

小鼠颈椎脱臼处死后，立即放入盛有75％酒精的烧杯中，浸泡3min，取出小鼠，置于无菌纱布上，腹面朝上；用镊子提起小鼠下腹部皮肤，剪开一小口，撕开皮肤(小心勿将覆膜撕破，保持完好无损的覆膜)，完全暴露覆膜；用镊子提起覆膜，用注射器向腹腔中注入Hanks液，针尖朝上，避开肠和脂肪，回抽腹腔液，向不同方向冲洗数次，吸出腹腔液，即为腹腔巨噬细胞。将吸出的腹腔液注入10mL离心管中，进行细胞计数，使其细胞数为1×10⁶，置于流式专用管中，FITC-F4/80，PE-CD11b标记腹腔巨噬细，室温孵育30min后，样品均予1500r/min离心5min，弃上清液，用冷PBS液3mL洗3次，最后0.5mLPBS重悬，上机(BD)检测。结果如表5所示。

实施例9：流式细胞仪检测小鼠肠系膜淋巴结细胞

摘取小鼠肠系膜淋巴结(MLN)后,去外膜与脂肪组织后，切成0.5cm×0.5cm的小块,在0.1％(w/v)的胶原酶Ⅲ中37℃孵育20min后,取组织块200目不锈钢筛网研磨，无血清1640制成细胞悬液于4℃保存。将细胞进行计数，使其细胞数为1×10⁶，置于流式专用管中，FITC-CD4，PerCP-CD3各4μL，PE-CD25 1.5μL标记MLN细胞，室温孵育30min后，样品均予1500r/min离心5min，弃上清液，用冷PBS液3mL洗3次，最后0.5mL PBS重悬，上机(BD)检测。结果如表5所示。

表5

细胞	对照组	模型组	LH23组
				F4/80<sup>+</sup>CD11b<sup>+</sup>％	11.5±3.63	23.8±3.60*	20.4±1.51
CD3<sup>+</sup>CD4<sup>+</sup>CD25<sup>+</sup>％	2.5±0.41	1.4±0.37	2.2±0.59

结果显示，干酪乳杆菌LH23可减轻用DSS喂养的小鼠的肠道炎症反应，其固有层淋巴细胞(LPL)中巨噬细胞(CD11b+F4/80+)的数量减少，在急性炎症期，模型组，与正常组相比，模型组腹腔巨噬细胞比例增加(*P<0.05)，显著差异；与LH23治疗组中腹腔巨噬细胞比例有所降低，但是无显著差异；与模型组相比，干酪乳杆菌LH23治疗组中肠系膜淋巴结Treg细胞比例明显高于正常组，但是无显著性差异。

实施例10：干酪乳杆菌LH23对宫颈癌细胞增殖的影响

将HeLa细胞的密度调节为1×10⁵个的细胞悬液，接种于96孔板中，每孔100μL的培养基，为1×105个/mL，过夜培养细胞完全贴壁；待完全贴壁后，除对照组外，其他各组分别加入等体积且浓度不一样的干酪乳杆菌LH23裂解液上清；将实验组和空白对照孔设置6个复孔，37℃分别培养24h、48h、72h后，弃培养基并用PBS清洗，每孔加入10μL MTT孵育4h后，加入100μL DMSO在490nm处检测吸光度。

结果如图9所示，在10mg/mL的干酪乳杆菌LH23菌体裂解液使HeLa细胞的增殖受到抑制，培养皿中的Hela细胞随着培养时间的增加细胞密度减少，干酪乳杆菌LH23菌体裂解液上清可以抑制宫颈癌HeLa细胞的增殖。

实施例11：干酪乳杆菌LH23对宫颈癌细胞凋亡的影响

接种1×10⁵个HeLa细胞于96孔板中，培养过夜后用干酪乳杆菌LH23裂解液上清处理细胞48h后收获细胞，4％(w/v)多聚甲醛固定30min，TritonX-100的细胞渗透剂，室温孵育15min，加入TUNEL检测液，37℃避光孵育60min，每孔加入100μL的DAPI(1:100)溶液，室温避光孵育5min，然后在共聚焦显微镜下观察、拍照。

结果如图10所示，通过TUNEL染色结果可以看出，LH23裂解液上清能够引起宫颈癌HeLa细胞DNA断裂，染色阳性的细胞数目明显的增加，意味着能够引起宫颈癌HeLa细胞的凋亡。

实施例12：干酪乳杆菌LH23对细胞中HPV18 E6和E7基因表达的影响

将HeLa细胞接种于6孔板，待贴壁后，加入干酪乳杆菌LH23裂解液上清进行处理，收集处理好的细胞，分别提取其蛋白和mRNA。蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳，之后转移至NC膜上，封入一抗、二抗，用Oddysey远红外成像仪进行扫膜；mRNA按照表6的反应体系进行实时定量PCR分析。

表6实时定量PCR所需反应体系

结果如图11所示，LH23菌体裂解液上清在10mg/mL的浓度能够明显抑制HPV18 E6和E7基因的表达，上述结果提示，这株乳酸菌细胞中存在抑制HPV18 E6和E7基因表达的成分。

实施例13：干酪乳杆菌LH23对组蛋白修饰的影响

将HeLa细胞接种于6孔板，待贴壁后，加入干酪乳杆菌LH23裂解液上清进行处理，收集处理好的细胞，用蛋白裂解液裂解细胞，使用刮刀收集蛋白样品。收集到的蛋白样品进行SDS-PAGE凝胶电泳，转移至NC膜上，封入一抗、二抗，用Oddysey远红外成像仪进行扫膜。结果如图12所示，干酪乳杆菌LH23裂解液显著抑制HeLa细胞中组蛋白H3K9和H3K27的乙酰化修饰，而对组蛋白H3总量则无明显影响，提示干酪乳杆菌LH23可以选择性抑制宫颈癌细胞中组蛋白的乙酰化修饰。

实施例14：干酪乳杆菌LH23治疗宫颈癌的动物实验观察

将0.2ml(浓度为1×10⁷/ml)CaSki细胞悬液注射于小鼠腋窝皮下24h后随机分为两组：生理盐水组和LH23组，每组10只。LH23组每日灌服干酪乳杆菌0.2ml，生理盐水组每日灌服等量的生理盐水。连续给药14天，观察小鼠的精神、饮食、瘤块大小。结果显示，生理盐水组小鼠活动减少，觅食和饮水较少，对外界刺激不敏感，体重逐渐减轻，而LH23组小鼠活动自如，觅食和饮水正常，瘤块较生理盐水组小。

尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例所公开的内容。

Claims

1.一种具有免疫调节、抗炎和抗宫颈癌作用的干酪乳杆菌，其特征在于：名称为：LH23，分类名称为：Lactobacillus casei，保藏编号为：CGMCC No.16656，保藏日期为：2018年10月30日，北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院生物研究所，保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

2.根据权利要求1所述的具有免疫调节、抗炎和抗宫颈癌作用的干酪乳杆菌，其特征在于：所述干酪乳杆菌在固体平板上菌落呈白色、圆形、表面光滑湿润、边缘整齐、凸起的菌落，在37℃恒温的条件下，在MRS培养基中培养达到12h对数末期；

或者，所述干酪乳杆菌来源于酒曲。

3.根据权利要求1或2所述的具有免疫调节、抗炎和抗宫颈癌作用的干酪乳杆菌，其特征在于：所述干酪乳杆菌具有较强的耐胆汁盐和耐酸能力及结肠癌细胞黏附能力；

或者，所述干酪乳杆菌能够调节免疫、调节M1/M2型巨噬细胞平衡，增加Treg细胞的数量；

或者，所述干酪乳杆菌能够显著抑制LPS体外诱导RAW264.7巨噬细胞引起的NO的产生和促炎因子产生，或者，能够调节腹腔M1/M 2型巨噬细胞的平衡，或者，能够增加肠系膜淋巴结Treg细胞的数量；

或者，所述干酪乳杆菌能够缓解炎症性肠病；

4.根据权利要求1或2所述的具有免疫调节、抗炎和抗宫颈癌作用的干酪乳杆菌，其特征在于：所述干酪乳杆菌能够抑制宫颈癌；

5.如权利要求1至4任一项所述的具有免疫调节、抗炎和抗宫颈癌作用的干酪乳杆菌在制备预防和/或治疗结肠炎的药物中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述药物为益生菌制剂；或者，所述药物为包含干酪乳杆菌及药学上通常使用的矫味剂、润滑剂、填充剂、崩解剂的载体组成的复合物。

7.如权利要求1至4任一项所述的具有免疫调节、抗炎和抗宫颈癌作用的干酪乳杆菌在制备抗宫颈癌的药物中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述药物为微生态制剂；或者，所述药物为包含干酪乳杆菌及药学上通常使用的矫味剂、润滑剂、填充剂、崩解剂的载体组成的复合物。

9.利用如权利要求1至4任一项所述的具有免疫调节、抗炎和抗宫颈癌作用的干酪乳杆菌发酵生产制得的发酵食品。

10.根据权利要求9所述的具有免疫调节、抗炎和抗宫颈癌作用的干酪乳杆菌发酵生产制得的发酵食品，其特征在于：所述发酵食品包括乳制品、豆制品、果蔬制品。