CN114231443A - 一种植物乳杆菌复合菌及其在制备缓解肠道炎症或治疗溃疡性结肠炎复合益生菌中的应用 - Google Patents
一种植物乳杆菌复合菌及其在制备缓解肠道炎症或治疗溃疡性结肠炎复合益生菌中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种植物乳杆菌复合菌及其在制备缓解肠道炎症或治疗溃疡性结肠炎复合益生菌中的应用，属于微生物技术领域。所述植物乳杆菌复合菌包括植物乳杆菌DPUL‑F50和植物乳杆菌Y44，DPUL‑F50的菌株保藏号为CCTCCNO：M2021838；Y44的菌株保藏号为CCTCCNO：M2018558。所述乳杆菌复合物可以显著抑制大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的生长；促进抗炎细胞因子的表达；可以缓解结肠炎小鼠结肠长度的缩短，并且调节了结肠炎小鼠的肠道微生物群，增加了微生物群的多样性，减少有害菌群的相对丰度。
Description
技术领域
本发明涉及一种植物乳杆菌复合菌及其在制备缓解肠道炎症或治疗溃疡性结肠炎复合益生菌中的应用，属于微生物技术领域。
背景技术
炎症性肠病(IBDs)是一种慢性炎症复发性疾病，克罗恩病(CD)和溃疡性结肠炎(UC)是炎症性肠病的主要类型。炎症性肠病的临床症状一般为：体重下降、腹痛、腹泻和胃肠道出血等症状。炎症性肠病一般与遗传、表观遗传和环境方面有密切的关系。特别是，环境因素，包括食物饮食消费、缺乏运动和吸烟，在结直肠癌的发生和发展中起着最重要的作用。IBD的发病率在世界各地都在增加，目前的IBD治疗方法包括使用消炎类固醇或免疫抑制剂来减轻炎症，以及使用外科手术切除受损的肠道，这样可以控制症状。此外，在使用抗炎药物时可能会出现一些副作用，如过敏反应、发烧、肝脏问题等。
益生菌是活的微生物，摄入一定量会对宿主产生有益作用。益生菌可以促进肠道产生固有免疫物质，如杯状细胞分泌的粘蛋白。另外一方面，益生菌可以调节肠道的适应性免疫反应，包括诱导肠上皮细胞产生细胞因子和巨噬细胞极化，在炎症反应中发挥关键的作用，被诱导合成和分泌炎症介质和促炎细胞因子/趋化因子。另外，益生菌可以调节肠道微生态平衡，增加肠道微生物多样性，使肠道菌群趋于正常化。益生菌定殖在肠道内在代谢过程中产生有机酸等多种化合物，进而改善溃疡性结肠炎。因此，摄食某些乳杆菌属细菌可以帮助宿主缓解溃疡性结肠炎。
不同益生菌的复合物，较之于单菌株益生菌，在益生功能方面具有协同效应，是益生菌产品开发的趋势。
发明内容
本发明提供了一种植物乳杆菌复合菌，包括植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum) DPUL-F50和植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Y44，植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Y44已于2018年8月21日，保藏于中国典型培养物保藏中心，菌株保藏号为CCTCC NO：M 2018558。植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)DPUL-F50已于2021年7月8日，保藏于中国典型培养物保藏中心，菌株保藏号为CCTCC NO：M 2021838。
本发明的目的之二是提供植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)DPUL-F50和植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Y44的复合菌在制备用于缓解肠道炎症或治疗溃疡性结肠炎的复合益生菌中的应用。
进一步地，上述技术方案中，所述缓解肠道炎症包括抑制病原微生物的生长。
进一步地，上述技术方案中，所述病原微生物包括大肠杆菌和金黄色葡萄球菌。
进一步地，上述技术方案中，所述缓解肠道炎症包括抑制LPS诱导巨噬细胞产生NO、ROS、TNF-α和iNOs等炎症标志物，促进抗炎细胞因子IL-10和抗氧化酶SOD、 CAT和GPx1的表达。
进一步地，上述技术方案中，所述治疗溃疡性结肠炎包括缓解体重下降、结肠缩短和结肠组织学病变。
进一步地，上述技术方案中，所述治疗溃疡性结肠炎包括调节体液免疫和细胞免疫，增加肠道菌群的多样性，下调肠道菌群中有害菌群的丰度。
附图说明
图1为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)DPUL-F50和植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Y44及其复合物对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌生长的抑制作用。
图2为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)DPUL-F50和植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Y44及其复合物对LPS诱导RAW264.7细胞产生炎症因子的影响。
图3为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)DPUL-F50和植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Y44及其复合物对LPS诱导RAW264.7细胞产生iNOs、SOD、CAT和GPx1 的影响。
图4为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)DPUL-F50和植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Y44及其复合物对结肠炎小鼠体重的影响。
图5为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)DPUL-F50和植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Y44及其复合物对结肠炎小鼠结肠长度的影响。
图6为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)DPUL-F50和植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Y44及其复合物对结肠炎小鼠结肠组织学病变的影响。
图7为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)DPUL-F50和植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Y44及其复合物对肠道微生物丰富度的影响。
图8为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)DPUL-F50和植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Y44及其复合物对结肠炎小鼠肠道微生物门和科水平的影响，Bar图为科水平上的热图；B1表示正常组，B2表示模型组，B3表示Y44组，B4表示DPUL-F50组；B5表示乳杆菌混合物组，组间不同小写字母表示显著差异(p<0.05)。
具体实施方式
下述非限定性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
实施例1菌株培养
本发明的植物乳杆菌Y44和植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)DPUL-F50在MRS培养基中进行培养活化，具体步骤如下：
a.菌株培养方法：
(1)MRS培养基制备
按照20g/L葡萄糖，10g/L蛋白胨，5g/L酵母膏，10g/L牛肉膏，1mL吐温-80， 2g/L磷酸氢二钾，2g/L柠檬酸二铵，5g/L乙酸钠，0.58g/L七水硫酸镁，0.25g/L四水硫酸锰，称取这些原料，混合均匀，将得到的混合物混溶于去离子水中，得到的溶液在温度121℃下灭菌20min，得到所述的MRS培养基。
(2)菌株的培养
植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Y44和植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum) DPUL-F50划线接种于含有2％琼脂的步骤(1)培养基中，在温度37℃下厌氧培养48h～ 72h，挑取单菌落，接种到MRS液体培养基中在37℃下培养18h。
b.植物乳杆菌DPUL-F50的筛选与纯化
取新疆酸奶0.5mL加入到4.5mL的生理盐水中充分混匀后得到原菌液，将原菌液用生理盐水稀释到10-4，10-5和10-6进行涂布，在MRS平板上培养48h后挑去不同形态的菌落进行二次划线直到为单菌落后进行镜检，最后接种到液体培养基中进行液体培养并将培养好的菌株进行菌种保藏。
c.菌株保藏
所述菌株保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址：武汉市武昌珞珈山，中国典型培养物保藏中心，邮编430072)。植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum) Y44的菌种保藏号为CCTCC NO：M 2018558，保藏日期为2018年8月21日，分类命名为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)，菌株名称为Y44。植物乳杆菌 (Lactobacillus plantarum)DPUL-F50的菌种保藏号为CCTCC NO：M 2021838，保藏日期为2021年7月8日，分类命名为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)，菌株名称为DPUL-F50。
实施例2乳杆菌混合物的制备
取植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Y44和植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)DPUL-F50(以下用Y44和DPUL-F50表示)分别接种于MRS培养基中活化3次。活化后的菌株以2％(v/v)接种量于MRS培养液，37℃培养18h。将植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)Y44和植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum) DPUL-F50按1：1的比例以2％(v/v)的接种量接种到MRS培养液37℃培养18h。离心(5000rmp，5min)获得上清液用于后续的抑菌试验，并收集活化的菌株用0.85％生理盐水清洗3次，重悬至0.85％生理盐水中，调整Y44、DPUL-F50及Y44和DPUL-F50 的复合物(以下用Mix表示)(1：1)浓度为3×108CFU/mL。
实施例3植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)DPUL-F50和植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Y44及其复合物对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的影响
采用牛津杯双层平板扩散法进行抑菌实验，先将15mL 2％(m/v)素琼脂倒入培养皿中，形成琼脂培养基，待琼脂凝固后均匀摆放两个牛津杯(直径8.00mm)。将大肠肝菌或金黄色葡萄球菌悬液按2％(v/v)接种量接种到20mL冷却至45℃-55℃的LB固体培养基中充分混匀，倒在素琼脂层上方。待其自然凝固后，用无菌镊子将牛津杯沿垂直方向取出，向孔内分别加入100μL单株乳杆菌或混合乳杆菌的培养上清液。将平板置于37℃恒温培养箱孵育24h后，游标卡尺测量的抑菌圈直径表示形式为平均值。从图1中可以看出，相比单株乳杆菌，乳杆菌混合物培养上清液对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的生长具有更明显的抑制作用。
实施例4植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)DPUL-F50和植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Y44及其复合物对巨噬细胞免疫活性的调节
1.细胞培养
鼠巨噬细胞(RAW264.7)细胞系购自中国科学院细胞库(上海，中国)。RAW264.7 细胞系培养于Dulbecco改良的Eagle’s培养基(DMEM,Hyclone,Logan,UT)中，添加 10％(v/v)灭活(56℃，30min)胎牛血清(bioindustries,Beit Haemek,Israel)，100U/mL青霉素和100mg/mL链霉素(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)，在37℃含5％CO2的培养箱中培养。
2.植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)DPUL-F50和植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Y44及其复合物对LPS诱导RAW264.7细胞产生炎症因子的影响
调整RAW264.7巨噬细胞浓度为2×105cell/mL，接种于24孔细胞培养板中，培养24h后弃去上清液，每孔接种1mL 3×108CFU/mL的单株乳杆菌或乳杆菌混合物处理细胞2h，培养结束后弃去上清用PBS清洗细胞3次，随后加入1mL LPS(1 μg/mL)诱导细胞24h，对上清液中的NO、IL-10和TNF-α含量进行测定，并测定细胞内活性氧含量(ROS)。结果显示如图2所示，相比空白组，LPS刺激RAW264.7 细胞导致NO、ROS和TNF-α的表达上调，用乳杆菌混合物预处理RAW264.7细胞逆转了这个变化并上调IL-10缓解炎症。
3.植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)DPUL-F50和植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Y44及其复合物通过抑制LPS诱导RAW264.7细胞产生iNOs、CAT、SOD 和GPx1的影响
将细胞接种在6孔细胞培养板，密度为每孔3×105个细胞。隔夜培养后。然后用单株乳杆菌或乳杆菌混合物处理2h。暴露于LPS下30min。收集细胞并在裂解缓冲液中裂解细胞，然后测定细胞裂解物的蛋白质含量，通过免疫印迹分析检测相关蛋白的表达水平。
结果如图3所示，与空白组相比，LPS诱导巨噬细胞导致iNOs的表达上调。混合乳杆菌预处理RAW264.7后明显下调了iNOs的表达，上调了CAT、SOD和GPx1 的表达。这说明乳杆菌混合物可通过抑制LPS诱导RAW264.7产生iNOs，促进抗氧化酶CAT、SOD和GPx1的表达缓减炎症。
实施例5植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)DPUL-F50和植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Y44及其复合物对结肠炎小鼠炎症的缓解
1.动物分组
六周龄的雄性C57BL/6小鼠适应性饲养一周后，随机分组，每组8只。正常组(Control)小鼠每日灌胃生理盐水，7天后自由饮用正常饮用水，模型组(Model)小鼠每日灌胃生理盐水，7天后自由饮用3％的葡聚糖硫酸钠水溶液(DSS)，Y44组(Y44) 每日灌胃0.75×108CFU/mL植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Y44，7天后自由饮用3％的葡聚糖硫酸钠水溶液(DSS)，DPUL-F50组(DPUL-F50)每日灌胃0.75 ×108CFU/mL植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)DPUL-F50，7天后自由饮用3％的葡聚糖硫酸钠水溶液(DSS)，乳杆菌混合物组(Mix)每日灌胃0.75×108CFU/mL 植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)Y44和植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum) DPUL-F50的混合物(1:1)，7天后自由饮用3％的葡聚糖硫酸钠水溶液(DSS)，实验一共进行3周。
2.植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)DPUL-F50和植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Y44及其复合物对小鼠体重和结肠长度的影响
通过记录小鼠从实验开始后每一天的体重变化，21天后处死小鼠取小鼠结肠进行长度测量。结果如图4、5所示，结果显示，乳杆菌混合物能缓减结肠炎小鼠体重下降，减少结肠长度缩短。
3.植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)DPUL-F50和植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Y44及其复合物改善DSS结肠炎小鼠结肠组织学病变
处死小鼠后取小鼠结肠，用4％多聚甲醛进行固定、包埋、切片以及H&E染色。实验结果如图6所示，与模型组相比，乳杆菌混合物灌胃小鼠结肠中大面积水肿明显消失、隐窝结构损伤的程度明显较少。这说明该植物乳杆菌复合物灌胃小鼠对结肠炎具有缓解作用。
4.植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)DPUL-F50和植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Y44及其复合物调节细胞免疫缓减DSS结肠炎
处死小鼠前进行眼球取血，采用ELISA试剂盒法检测血清中IL-8、IL-10、IL-4 和TNF-α的表达水平。实验结果表1所示，相比模型组小鼠，乳杆菌复合物明显上调了抗炎细胞因子IL-10和IL-4的表达水平，下调了促炎细胞因子IL-8和IL-1β的表达水平。这说明乳杆菌复合物干预小鼠可以通过细胞免疫缓减DSS引起小鼠结肠炎。
表1
5.植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)DPUL-F50和植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Y44及其复合物调节体液免疫缓减DSS结肠炎
处死小鼠前进行眼球取血，采用ELISA试剂盒法检测血清中LgM和LgG的表达水平。实验结果表1所示，相比模型组，乳杆菌复合物干预小鼠后，明显上调了LgM 和LgG的表达水平。这些结果说明乳杆菌复合物干预小鼠可以通过体液免疫缓减DSS 引起小鼠结肠炎。
6.植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)DPUL-F50和植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Y44及其复合物调节DSS结肠炎小鼠肠道菌群的功能分析
根据
soil DNA kit(Omega Bio-tek,Norcross,GA,U.S.)说明书进行小鼠粪便中微生物群落总DNA抽提，利用Illumina公司的Miseq PE300平台进行测序(上海美吉生物医药科技有限公司)。原始数据上传至NCBI SRA数据库。
结果显示与结肠炎小鼠组(Model)相比，乳杆菌复合物增加DSS诱导结肠炎小鼠肠道微生物多样性(图7)，减少有害菌的含量(图8)。证明乳杆菌混合物可以下调肠炎小鼠肠道中有害菌群的相对丰度。
SEQUENCE LISTING
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<120> 一种植物乳杆菌复合菌及其在制备缓解肠道炎症或治疗溃疡性结肠炎复合益
生菌中的应用
<130> 2021
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1546
<212> DNA
<213> 植物乳杆菌DPUL-F50 (Lactobacillus plantarum DPUL-F50)
<400> 1
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ggacagatga ttagggtgaa gtcgtaacaa ggtagccgta ggagaa 1546
Claims (7)
1.一种植物乳杆菌复合菌，其特征在于，包括植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)DPUL-F50和植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Y44，所述植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)DPUL-F50于2021年7月8日，保藏于中国典型培养物保藏中心，菌株保藏号为CCTCC NO：M 2021838；所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Y44于2018年8月21日，保藏于中国典型培养物保藏中心，菌株保藏号为CCTCC NO：M 2018558。
2.权利要求1所述的植物乳杆菌复合菌在制备用于缓解肠道炎症症状或治疗溃疡性结肠炎的复合益生菌中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述缓解肠道炎症包括抑制病原微生物的生长。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述病原微生物包括大肠杆菌和金黄色葡萄球菌。
5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述缓解肠道炎症包括抑制LPS诱导巨噬细胞产生NO、ROS、TNF-α和iNOs炎症标志物，促进抗炎细胞因子IL-10和抗氧化酶SOD、CAT和GPx1的表达。
6.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述治疗溃疡性结肠炎包括缓减体重下降、结肠缩短和结肠组织病变。
7.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述治疗溃疡性结肠炎包括调节体液免疫和细胞免疫，增加肠道菌群的多样性，下调肠道菌群中有害菌群的丰度。
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