CN111529688B

CN111529688B - 抗菌肽在制备肺癌治疗药物中的应用

Info

Publication number: CN111529688B
Application number: CN202010213844.XA
Authority: CN
Inventors: 熊飞
Original assignee: Second Affiliated Hospital of Soochow University
Current assignee: Second Affiliated Hospital of Soochow University
Priority date: 2020-03-24
Filing date: 2020-03-24
Publication date: 2022-06-14
Anticipated expiration: 2040-03-24
Also published as: CN111529688A

Abstract

本发明涉及抗菌肽(cec4)在制备肺癌治疗药物中的应用，该抗菌肽(cec4)的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示，其中所有氨基酸均为L‑型。本发明公开了吸血昆虫来源的抗菌肽的新用途，为开发新的肺癌治疗药物提供了新方向。

Description

抗菌肽在制备肺癌治疗药物中的应用

技术领域

本发明涉及生物医学领域，尤其涉及一种抗菌肽在制备肺癌治疗药物中的应用。

背景技术

肺癌(Lung cancer)，为当前世界各地最常见的恶性肿瘤之一，2019年美国癌症协会发布的数据显示，美国前十位癌症新发和死亡病例中，肺癌在男性和女性癌症患者中均排列在前两位。据《2019年中国肿瘤登记年报》统计，中国恶性肿瘤发病和死亡率居第一位的仍是肺癌，发病率和致死率已与发达国家水平相当。肺癌根据组织学特点将其分成非小细胞型和小细胞型两大类，其中非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)的患者数量占患肺癌患者总数的80～85％。

抗菌肽(antimicrobial peptide,AMP)具有广谱的抗菌、抗病毒等病原微生物的作用，随着研究的深入，人们发现其中一部分抗菌肽还具有明显的抗肿瘤活性。近年来，越来越多的研究证实抗菌肽对肝癌、黑色素瘤、乳腺癌、结直肠癌和膀胱癌等具有较强的抑制作用，且对小鼠的肝肾功能及血液系统无明显影响。近期有研究证实抗菌肽cecropins具有杀伤肿瘤细胞的作用，且对血液系统和各脏器并无不良影响。多篇报道指出来源于家蝇和天蚕的抗菌肽cecropins对人肺癌、胃癌、乳腺癌和结直肠癌等细胞均具有良好的抑制作用，可以诱导多种肿瘤细胞凋亡。抗菌肽不易导致癌细胞耐药性的产生，且抗菌肽通常对肿瘤细胞具有高毒性，而对正常细胞低毒性或者无毒性。抗菌肽以其独特的抗肿瘤机制和在耐药性方面的优势，使其在抗肿瘤方面有良好的应用前景。目前，已知的抗菌肽抗肿瘤的机制主要包括：1)诱导细胞凋亡；2)抑制DNA合成，影响细胞增殖；3)在肿瘤细胞膜上形成穿膜孔道，致使细胞死亡；4)作用于细胞骨架，使其结构紊乱。CN105061573A公开了姚虻天然抗炎症多肽cecropin-TY1及其在制备抗炎药物中的应用，该抗菌肽是否具有肺癌抑制作用，仍然未知。

目前临床治疗肺癌的手段主要包括手术、放疗、化疗和分子靶向治疗，主要是根据肺癌的分期及个体对药物的耐受性情况，选用适合的治疗方法。但由于手术容易复发且易引起术后并发症、放化疗药物的毒副作用大且易产生耐药性及分子靶向药物也会产生不同程度的获得性耐药，一定程度上限制了当前的肺癌治疗手段在临床治疗中的应用。

肺癌细胞释放的外泌体可以促进非小细胞肺癌细胞的生长、促进肿瘤组织血管的生成、诱导间质细胞的转化、促进肺癌的微环境形成促进肺癌转移并帮助肺癌细胞进行免疫逃逸。针对外泌体的肺癌靶向治疗新方法可能为肺癌患者带来一种新的治疗选择。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种抗菌肽在制备肺癌治疗药物中的应用，本发明公开了吸血昆虫来源的抗菌肽的新用途，为开发新的肺癌治疗药物提供了新方向。

本发明公开了抗菌肽(cec4)在制备肺癌治疗药物中的应用，该抗菌肽(cec4)的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示，其中所有氨基酸均为L-型。

进一步地，抗菌肽来源于吸血昆虫。

进一步地，吸血昆虫为姚虻。

进一步地，抗菌肽用于抑制肺癌细胞释放外泌体。

进一步地，肺癌细胞为A549细胞。

进一步地，肺癌治疗药物中，抗菌肽的浓度为2.5-10μg/mL。

发明人前期研究了一系列吸血昆虫来源的抗菌肽cecropins为候选分子，包括姚虻来源的cecropin-TY1(Parasites&Vectors，2015；CN105061573A)、版纳绳蚋来源的SibaCec(Parasites&Vectors，2015)、埃及伊蚊子来源的AeaeCec1、AeaeCec2、AeaeCec3、AeaeCec4和AeaeCec4(Parasites&Vectors，2018)，把这些抗菌肽cecropins重新编号为cec1至cec7，分析cec1-7对非小细胞肺癌细胞NCI-A549释放外泌体的作用，拟筛选出外泌体抑制肽，并初步分析外泌体抑制肽对细胞增殖的功能、对细胞凋亡的功能、体内抗肿瘤活性。初步的实验结果发现：1)在所选的7个吸血昆虫抗菌肽cecropins中，cec4最为明显地抑制了非小细胞肺癌细胞NCI-A549的外泌体释放；2)cec4在2.5-10μg/mL的浓度范围内，以剂量依赖的方式抑制了NCI-A549的外泌体释放；3)cce4在该浓度范围内(2.5-10μg/mL)，不抑制NCI-A549的增殖；4)cec4在该浓度范围内(2.5-10μg/mL)，不诱导NCI-A549细胞凋亡；5)cec4(10mg/kg)可有效抑制小鼠体内NCI-A549移植瘤的生长。

本发明提供了抗菌肽cec4可通过其两亲性螺旋结构和携带的正电荷，与非小细胞肺癌细胞释放的外泌体的脂质双分子层外膜结合，打破外泌体脂质外膜表面的稳态并致其穿孔，导致外泌体内的促肺癌信号分子的外泄，从而抑制外泌体促进的非小细胞肺癌的生长、血管生成、免疫逃逸、侵袭和转移，因此，其可用于制备肺癌治疗药物。

借由上述方案，本发明至少具有以下优点：

吸血昆虫来源的抗菌肽cec4可以显著抑制非小细胞肺癌细胞NCI-A549来源的外泌体的分泌，切断肿瘤生长的信号传递，提高治疗效果，同时可以降低传统治疗药物的毒副作用。

在临床应用潜力方面，cec4无溶血活性和细胞毒性且分子量小，结构简单，易于化学合成和蛋白表达，且兼具直接杀菌功能和增强抗菌固有免疫应答功能，这些优点使其有望成为新一代临床肽类治疗肺癌药物的优良候选分子。

上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。

附图说明

图1图示了不同吸血昆虫抗菌肽cecropins对非小细胞肺癌NCI-A549细胞外泌体产生的影响；

图2是cec4对NCI-A549细胞增殖的检测结果；

图3是cec4在2.5-10μg/mL的浓度范围内对NCI-A549细胞凋亡的诱导结果；

图4是cec4对NCI-A549移植瘤的影响结果。

具体实施方式

下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1：cec4以剂量依赖的方式抑制了NCI-A549细胞培养上清中外泌体的累积

发明人以前期研究的一系列吸血昆虫来源的抗菌肽cecropins为候选分子，包括姚虻来源的cecropin-TY1(Parasites&Vectors，2015)、版纳绳蚋来源的SibaCec(Parasites&Vectors，2015)、埃及伊蚊子来源的AeaeCec1、AeaeCec2、AeaeCec3、AeaeCec4和AeaeCec4(Parasites&Vectors，2018)，把这些抗菌肽cecropins重新编号为cec1至cec7，cec1至cec7的氨基酸序列依次如SEQ ID No.1-SEQ ID No.7所示，以上多肽均采用化学法合成，其中所有氨基酸均为L-型，且cec2至cec7的氨基酸的碳末端酰胺化。用Western blot的方法检测cec1至cec7对非小细胞肺癌细胞NCI-A549释放外泌体的作用。

平行进行多组实验，分别将NCI-A549细胞铺于T75细胞培养瓶中，待细胞长满约70-80％后，换成新鲜的DMEM完全培养基，向各培养基中分别加入10μg/mL的cec1至cec7，阳性对照组加入以外泌体抑制剂GW4869(5μM)，阴性对照组加入等体积的PBS，培养48小时后，收集培养上清中的外泌体，用Western blot检测上清中外泌体的产生情况。

结果如图1a所示，图1a图示了cec1-7对NCI-A549细胞外泌体释放的影响，图1a中，数字1-7依次代表加入抗菌肽cec1至cec7的实验组。结果表明，外泌体抑制剂GW4869可有效抑制NCI-A549细胞培养上清中外泌体(Alix)的累积，在抗菌肽cec1至cec7中，cec4(SEQ IDNo.4所示)最为明显地抑制了NCI-A549细胞培养上清中外泌体的累积，很明显，并非所有来源于吸血昆虫的抗菌肽都具有抑制NCI-A549细胞培养上清中外泌体的累积的作用。

此外，按照上述方法，分别将NCI-A549细胞铺于T75细胞培养瓶中，待细胞长满约70-80％后，换成新鲜的DMEM完全培养基，向各培养基中分别加入10μg/mL、5μg/mL、2.5μg/mL的cec4，阴性对照组加入等体积的PBS，培养48小时后，收集培养上清中的外泌体，用Western blot检测上清中外泌体的产生情况。

结果如图1b所示，图1b中，数字10、5、2.5代表向培养基中加入的cec4的浓度。结果表明，Cec4在2.5-10μg/mL的浓度范围内，以剂量依赖的方式抑制了NCI-A549培养上清中外泌体的累积，此外，在细胞培养上清中没有检测到Calnexin的表达，表明提取的外泌体纯度较高，没有被内质网膜污染。以上结果表明，Cec4以剂量依赖的方式抑制了非小细胞肺癌细胞NCI-A549的外泌体的累积。

实施例2：cec4在2.5-10μg/mL浓度范围内，不抑制NCI-A549细胞的增殖

为了明确Cec4是否通过影响NCI-A549的增殖来抑制外泌体的产生，因此检测了cec4对NCI-A549增殖的影响。将NCI-A549细胞铺于96孔板(约1×10⁴细胞/孔)，待细胞贴壁后，加入一系列二倍稀释的cec4，对照孔加入等体积的PBS，培养48小时后，用CCK-8检测不同浓度的cec4对NCI-A549增值的影响。

结果如图2所示(图2中ns,no significance,*p<0.05)，cec4的浓度在40μg/mL以下时，都不抑制NCI-A549细胞的增殖。表明，cec4(2.5-10μg/mL)抑制NCI-A549细胞外泌体的产生不是通过抑制细胞增殖来实现的。

实施例3：cec4在2.5-10μg/mL浓度范围内，不诱导NCI-A549细胞凋亡

为了验证cec4是否会诱导NCI-A549细胞凋亡，将NCI-A549细胞铺于24孔板(约2×10⁵细胞/孔)，分别加入2.5、5、10μg/mL的cec4，对照组加入等体积的PBS，培养48小时，用PEAnnexin V细胞凋亡检测试剂盒(BD Pharmingen)检测不同处理的NCI-A549细胞凋亡情况。

结果如图3所示，与对照组(PBS，图3a)相比，2.5μg/mL(图3d)、5μg/mL(图3c)、10μg/mL(图3b)的cec4都没有诱导NCI-A549细胞的凋亡。表明，cec4(2.5-10μg/mL)抑制NCI-A549细胞外泌体的产生不是通过诱导细胞凋亡来实现的。

实施例4：cce4可有效抑制NCI-A549体内移植瘤的生长

实施例1-3的实验结果显示，cec4在2.5-10μg/mL的浓度范围内，以剂量依赖的方式抑制了NCI-A549细胞外泌体的产生，但与抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡无关。因此，进一步分析cec4在小鼠体内是否可以抑制NCI-A549移植瘤的生长。

结果如图4和表1所示，实验过程中，DDP(顺铂，2mg/kg，肿瘤局部注射给药，阳性对照)治疗组小鼠死亡3只，模型组(Mock，给予等量生理盐水，肿瘤局部注射给药)小鼠死亡2只，cec4(10mg/kg，肿瘤局部注射给药)治疗组小鼠死亡1只；与正常对照组(Normal)小鼠相比，cec4组小鼠体重没有明显变化，而DDP组小鼠体重下降明显，(图4a)。与PBS治疗组相比，cec4(10mg/kg，相当于2.9μM/kg)和DDP(2mg/kg，相当于6.7μM/kg)治疗组小鼠的NCI-A549的移植瘤生长都被显著抑制(**p<0.01)(图4b,c,d)，cec4和DDP抑瘤率分别为56.8％和76.8％(表1)。结果显示，cec4显著抑制了小鼠NCI-A549移植瘤的生长，且不会引起小鼠消瘦等副作用。

表1.cec4对NCI-A549移植瘤体积和重量的影响的统计

以上结果表明，抗菌肽cec4可用于制备肺癌治疗药物，cec4在2.5-10μg/mL的浓度范围内，其以剂量依赖的方式抑制NCI-A549的外泌体释放；在该浓度范围内，不抑制NCI-A549的增殖；在该浓度范围内，不诱导NCI-A549细胞凋亡；且可有效抑制小鼠体内NCI-A549移植瘤的生长。

以上仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 苏州大学附属第二医院

<120> 抗菌肽在制备肺癌治疗药物中的应用

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 36

<212> PRT

<213> (人工序列）

<400> 1

Gly Gly Leu Lys Lys Leu Gly Lys Lys Leu Glu Gly Ala Gly Lys Arg

1 5 10 15

Val Phe Asn Ala Ala Glu Lys Ala Leu Pro Val Val Ala Gly Ala Lys

20 25 30

Ala Leu Arg Lys

35

<210> 2

<211> 34

<212> PRT

<213> (人工序列）

<400> 2

Gly Gly Leu Lys Lys Leu Gly Lys Lys Leu Glu Gly Ala Gly Lys Arg

1 5 10 15

Val Phe Asn Ala Ala Glu Lys Ala Leu Pro Val Val Ala Gly Ala Lys

20 25 30

Ala Leu

<210> 3

<211> 34

<212> PRT

<213> (人工序列）

<400> 3

Gly Gly Leu Lys Lys Leu Gly Lys Lys Leu Glu Gly Val Gly Lys Arg

1 5 10 15

Val Phe Lys Ala Ser Glu Lys Ala Leu Pro Val Val Thr Gly Tyr Lys

20 25 30

Ala Ile

<210> 4

<211> 39

<212> PRT

<213> (人工序列）

<400> 4

Gly Trp Leu Lys Lys Ile Gly Lys Lys Ile Glu Arg Val Gly Gln Asn

1 5 10 15

Val Arg Asn Ala Ala Ile Ser Thr Leu Pro Ile Ala Gln Gly Ala Ala

20 25 30

Gly Val Ala Gly Ala Leu Asn

35

<210> 5

<211> 32

<212> PRT

<213> (人工序列）

<400> 5

Arg Trp Lys Phe Gly Lys Lys Leu Glu Lys Val Gly Lys Asn Val Phe

1 5 10 15

Asn Ala Ala Lys Lys Ala Leu Pro Val Val Ala Gly Tyr Lys Ala Leu

20 25 30

<210> 6

<211> 34

<212> PRT

<213> (人工序列）

<400> 6

Gly Lys Leu Thr Lys Asp Lys Leu Lys Arg Gly Ala Lys Lys Ala Leu

1 5 10 15

Asn Val Ala Ser Lys Val Ala Pro Ile Val Ala Ala Gly Ala Ser Ile

20 25 30

Ala Arg

<210> 7

<211> 34

<212> PRT

<213> (人工序列）

<400> 7

Gly Gly Leu Lys Lys Leu Gly Lys Lys Leu Glu Gly Ala Gly Lys Arg

1 5 10 15

Val Phe Lys Ala Ser Glu Lys Ala Leu Pro Val Val Val Gly Ile Lys

20 25 30

Ala Ile

Claims

1.抗菌肽在制备肺癌治疗药物中的应用，所述抗菌肽的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示，其中所有氨基酸均为L-型。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述抗菌肽来源于吸血昆虫。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述吸血昆虫为姚虻。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述抗菌肽用于抑制肺癌细胞释放外泌体。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述肺癌细胞为A549细胞。

6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述肺癌治疗药物中，抗菌肽的浓度为2.5-10μg/mL。