CN102652830A - 金环蛇抗菌肽Cathelicidin-BF在制造抗肿瘤药物中的用途 - Google Patents
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Abstract
金环蛇抗菌肽Cathelicidin-BF或含有金环蛇抗菌肽Cathelicidin-BF的药物组合物在制造药物中的用途，该药物用于治疗或预防人体的肿瘤，所述的金环蛇抗菌肽Cathelicidin-BF是从金环蛇蛇毒中分离出来的活性多肽,是金环蛇基因编码的一种N-端有α-螺旋的直链多肽，含有三十个氨基酸残基，分子量3637.54Da，等电点11.79，全序列为：赖氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-精氨酸-赖氨酸-亮氨酸-赖氨酸-赖氨酸-丝氨酸-缬氨酸-赖氨酸-赖氨酸-精氨酸-丙氨酸-赖氨酸-谷氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸-赖氨酸-脯氨酸-精氨酸-缬氨酸-异亮氨酸-甘氨酸-缬氨酸-丝氨酸-异亮氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸。
Description
技术领域：
本发明属于生物化学中的多肽药物技术领域，具体涉及金环蛇抗菌肽Cathelicidin-BF在抗肿瘤药物中的应用。
背景技术：
Cathelicidin是一类N-端有一段Cathelin结构域而C-端含有高度特异的成熟肽段的抗菌肽家族,主要发现于哺乳动物。目前,由于对Cathelicidin家族肽的研究领域不断扩大,人们已不断从鸡、虹鳟鱼、丑鱼和大西洋鲑鱼等非哺乳动物中发现新型的Cathelicidin。金环蛇抗菌肽Cathelicidin-BF是从金环蛇蛇毒中分离出来的活性多肽,是金环蛇Cathelicidin基因编码的一种N-端有α-螺旋的直链多肽，含有三十个氨基酸残基，分子量3637.54Da，等电点11.79。全序列为：赖氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-精氨酸-赖氨酸-亮氨酸-赖氨酸-赖氨酸-丝氨酸-缬氨酸-赖氨酸-赖氨酸-精氨酸-丙氨酸-赖氨酸-谷氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸-赖氨酸-脯氨酸-精氨酸-缬氨酸-异亮氨酸-甘氨酸-缬氨酸-丝氨酸-异亮氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸。对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌具有非常强的杀菌活性，作用时间迅速，几乎没有溶血活性和细胞毒性，还具有非盐依赖性和重要的生物学功能，包括促进创伤修复，作为化学引诱剂召集炎症细胞到达炎症部位，诱导血管生成，结合内毒素，以及诱导细胞溶解等。Cathelicidin的这些生物学效应增强了宿主的防御机制，促使机体能够从病原体感染中恢复过来。
目前，申请号为200810058976.9的发明专利公开了金环蛇抗菌肽Cathelicidin-BF及其基因和应用，公开了金环蛇抗菌肽Cathelicidin-BF分子量小、杀菌作用强、作用时间迅速、对多种临床耐药菌有非常强的杀灭作用，此外还具有广谱抗菌性和非盐依赖等有效特点；申请号为201110265011.9的发明专利公开了金环蛇抗菌肽Cathelicidin-BF在制备治疗细菌性阴道炎药物中的作用。
发明内容：
金环蛇抗菌肽Cathelicidin-BF或含有金环蛇抗菌肽Cathelicidin-BF的药物组合物在制造药物中的用途，该药物用于治疗或预防人体的肿瘤，所述的金环蛇抗菌肽Cathelicidin-BF是从金环蛇蛇毒中分离出来的活性多肽,是金环蛇基因编码的一种N-端有α-螺旋的直链多肽，含有三十个氨基酸残基，分子量3637.54Da，等电点11.79，全序列为：赖氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-精氨酸-赖氨酸-亮氨酸-赖氨酸-赖氨酸-丝氨酸-缬氨酸-赖氨酸-赖氨酸-精氨酸-丙氨酸-赖氨酸-谷氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸-赖氨酸-脯氨酸-精氨酸-缬氨酸-异亮氨酸-甘氨酸-缬氨酸-丝氨酸-异亮氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸。
金环蛇抗菌肽Cathelicidin-BF或含有金环蛇抗菌肽Cathelicidin-BF的药物组合物在制造药物中的用途，该药物用于治疗或预防人体的恶性肿瘤，所述的金环蛇抗菌肽Cathelicidin-BF 是从金环蛇蛇毒中分离出来的活性多肽,是金环蛇基因编码的一种N-端有α-螺旋的直链多肽，含有三十个氨基酸残基，分子量3637.54Da，等电点11.79，全序列为：赖氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-精氨酸-赖氨酸-亮氨酸-赖氨酸-赖氨酸-丝氨酸-缬氨酸-赖氨酸-赖氨酸-精氨酸-丙氨酸-赖氨酸-谷氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸-赖氨酸-脯氨酸-精氨酸-缬氨酸-异亮氨酸-甘氨酸-缬氨酸-丝氨酸-异亮氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸。
金环蛇抗菌肽Cathelicidin-BF或含有金环蛇抗菌肽Cathelicidin-BF的药物组合物在制造药物中的用途，该药物用于治疗或预防人体的宫颈癌，所述的金环蛇抗菌肽Cathelicidin-BF是从金环蛇蛇毒中分离出来的活性多肽,是金环蛇基因编码的一种N-端有α-螺旋的直链多肽，含有三十个氨基酸残基，分子量3637.54Da，等电点11.79，全序列为：赖氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-精氨酸-赖氨酸-亮氨酸-赖氨酸-赖氨酸-丝氨酸-缬氨酸-赖氨酸-赖氨酸-精氨酸-丙氨酸-赖氨酸-谷氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸-赖氨酸-脯氨酸-精氨酸-缬氨酸-异亮氨酸-甘氨酸-缬氨酸-丝氨酸-异亮氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸。
金环蛇抗菌肽Cathelicidin-BF或含有金环蛇抗菌肽Cathelicidin-BF的药物组合物在制造药物中的用途，该药物用于治疗或预防人体的淋巴瘤，所述的金环蛇抗菌肽Cathelicidin-BF是从金环蛇蛇毒中分离出来的活性多肽,是金环蛇基因编码的一种N-端有α-螺旋的直链多肽，含有三十个氨基酸残基，分子量3637.54Da，等电点11.79，全序列为：赖氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-精氨酸-赖氨酸-亮氨酸-赖氨酸-赖氨酸-丝氨酸-缬氨酸-赖氨酸-赖氨酸-精氨酸-丙氨酸-赖氨酸-谷氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸-赖氨酸-脯氨酸-精氨酸-缬氨酸-异亮氨酸-甘氨酸-缬氨酸-丝氨酸-异亮氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸。
金环蛇抗菌肽Cathelicidin-BF或含有金环蛇抗菌肽Cathelicidin-BF的药物组合物在制造药物中的用途，该药物用于治疗或预防人体的肺癌，所述的金环蛇抗菌肽Cathelicidin-BF是从金环蛇蛇毒中分离出来的活性多肽,是金环蛇基因编码的一种N-端有α-螺旋的直链多肽，含有三十个氨基酸残基，分子量3637.54Da，等电点11.79，全序列为：赖氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-精氨酸-赖氨酸-亮氨酸-赖氨酸-赖氨酸-丝氨酸-缬氨酸-赖氨酸-赖氨酸-精氨酸-丙氨酸-赖氨酸-谷氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸-赖氨酸-脯氨酸-精氨酸-缬氨酸-异亮氨酸-甘氨酸-缬氨酸-丝氨酸-异亮氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸。
金环蛇抗菌肽Cathelicidin-BF或含有金环蛇抗菌肽Cathelicidin-BF的药物组合物在制造药物中的用途，该药物用于治疗或预防人体的黑色素瘤，所述的金环蛇抗菌肽Cathelicidin-BF是从金环蛇蛇毒中分离出来的活性多肽,是金环蛇基因编码的一种N-端有α-螺旋的直链多肽，含有三十个氨基酸残基，分子量3637.54Da，等电点11.79，全序列为：赖氨酸-苯丙氨 酸-苯丙氨酸-精氨酸-赖氨酸-亮氨酸-赖氨酸-赖氨酸-丝氨酸-缬氨酸-赖氨酸-赖氨酸-精氨酸-丙氨酸-赖氨酸-谷氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸-赖氨酸-脯氨酸-精氨酸-缬氨酸-异亮氨酸-甘氨酸-缬氨酸-丝氨酸-异亮氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸。
体内及体外实验均表明，金环蛇抗菌肽Cathelicidin-BF具有明显的抑制肿瘤细胞生长的作用，可用来制备抗肿瘤药物，用于治疗肿瘤。
附图说明：
图1Cathelicidin-BF对不同细胞的体外生长抑制作用，其中cell viability为细胞活力、μM为μmol/L即微摩尔每升
图2Cathelicidin-BF对鼠淋巴瘤YAC-1细胞体外生长抑制的时间和剂量依赖关系，其中hr为小时
图3Cathelicidin-BF对鼠黑色素瘤B16F10细胞体外生长抑制的时间和剂量依赖关系
图4Cathelicidin-BF对鼠黑色素瘤B16F10体内生长抑制作用的各组小鼠照片
图5Cathelicidin-BF对鼠黑色素瘤B16F10体内生长抑制作用各组肿瘤组织照片
图6Cathelicidin-BF体内对鼠黑色素瘤B16F10瘤重的影响，其中tumor weight为肿瘤重量
图7Cathelicidin-BF体内对鼠黑色素瘤B16F10抑瘤率的影响，其中inhibitory rate为抑制率
具体实施方式：
本发明的目的在于研究金环蛇抗菌肽Cathelicidin-BF或含有金环蛇抗菌肽Cathelicidin-BF的药物组合物在制造抗肿瘤药物中的用途，其抗肿瘤活性尚未报道，下面将金环蛇抗菌肽Cathelicidin-BF的抗肿瘤活性作详尽阐述：
实施例1Cathelicidin-BF对不同细胞的体外生长抑制作用
取对数生长期的狗肾MDCK细胞、人宫颈癌Hela细胞、鼠肺癌Lewis细胞、鼠黑色素瘤B16F10细胞、鼠淋巴瘤YAC-1细胞，（MDCK细胞用含有10%FBS的DMEM培养基，Lewis细胞用含有10%FBS的RPMI-1640培养基，Hela细胞、B16F10细胞、YAC-1细胞用含有10%NBS的RPMI-1640培养基），细胞用培养基用各自培养基调整细胞浓度为5×104/ml，于96孔培养板中加入细胞悬液100μl，并加入用培养液稀释的不同浓度BF-3020μl/孔（终浓度分别为：0、10、20、40、80、μM），培养液调零，37℃、5%CO2培养48小时后，离心吸上清，加入80μl新鲜培养液，然后每孔加入5mg/ml的MTT 20μl，继续培养4小时，离心，仔细吸去上清，每孔加入150μl DMSO，轻轻振荡以使甲臜完全溶解，在490nm波长处用酶标仪测吸光值，按公式计算细胞活率：
按照上述方法，结果表明（附图1）,在40uM浓度范围内金环蛇抗菌肽Cathelicidin-BF对MDCK细胞的生长没有抑制作用，但是对肿瘤细胞：Lewis细胞、Hela细胞、B16F10细 胞、YAC-1细胞有明显的抑制肿瘤细胞生长的作用，且剂效关系明显，并与每种细胞的空白对照组相比有统计学差异（*P<0.01）。金环蛇抗菌肽Cathelicidin-BF对各细胞株的IC50值如表1所示：
表1Cathelicidin-BF对各细胞株的IC50
实施例2Cathelicidin-BF对鼠淋巴瘤YAC-1细胞体外生长抑制的时间和剂量依赖关系
取对数生长期的YAC-1细胞，用含有10%NBS的RPMI-1640培养调整细胞浓度为5×104/ml，于96孔培养板中加入细胞悬液100μl，并加入用培养液稀释的不同浓度BF-3020μl/孔（终浓度分别为：0、10、20、40uM），培养液调零，37℃、5%CO2培养不同时间（2hr、4hr、8hr、24hr、48hr），培养结束后，离心吸上清，加入80μl新鲜培养液，然后每孔加入5mg/ml的MTT 20μl，继续培养4小时，离心，仔细吸去上清，每孔加入150μl DMSO，轻轻振荡以使甲臜完全溶解，在490nm波长处用酶标仪测吸光值，计算细胞活率。
按照上述方法，结果表明（附图2）,金环蛇抗菌肽Cathelicidin-BF在40μM浓度范围内，在72h的时间范围内对YAC-1细胞的生长抑制作用剂量和时间依赖关系明显，并与每个时间点的空白对照组相比，有统计学差异（*P<0.01）。
实施例3Cathelicidin-BF对鼠黑色素瘤B16F10细胞体外生长抑制的时间和剂量依赖关系
取对数生长期的B16F10细胞，用含有10%NBS的RPMI-1640培养调整细胞浓度为5×104/ml，于96孔培养板中加入细胞悬液100μl，并加入用培养液稀释的不同浓度BF-3020μl/孔（终浓度分别为：0、2.5、5、10、20μM），培养液调零，37℃、5%CO2培养不同时间（3hr、6hr、9hr、24hr、48hr），培养结束后，离心吸上清，加入80μl新鲜培养液，然后每孔加入5mg/ml的MTT 20μl，继续培养4小时，离心，仔细吸去上清，每孔加入150μl DMSO，轻轻振荡以使甲臜完全溶解，在490nm波长处用酶标仪测吸光值，计算细胞活率。
按照上述方法，结果表明（附图3）,金环蛇抗菌肽Cathelicidin-BF在20μM浓度范围内，在48h的时间范围内对B16F10细胞的生长抑制作用呈剂量和时间依赖关系明显，与每个时间点的空白对照组相比，有统计学差异（*P<0.01）。
实施例4Cathelicidin-BF对鼠黑色素瘤B16F10体内生长抑制作用
取对数生长期的鼠黑色素瘤B16F10细胞，生理盐水稀释，台盼蓝染色后用血球计数板在倒置式显微镜下计数，活细胞数为98%以上，调整细胞浓度5×106/ml，C57/BL 6J小鼠腋下右侧皮下接种0.1ml细胞，接种14day后，取瘤组织，200目筛网研磨，生理盐水稀释，台盼蓝染色后用血球计数板在倒置式显微镜下计数，活细胞数为98%以上，调整细胞浓度为5×106/ml。实验采用6-8周龄C57/BL 6J小鼠25只，小鼠腋下右侧皮下接种0.1ml细胞。待小鼠瘤体积长至100-300mm3时，随机分为5组：肿瘤模型组，BF-30低、中、高剂量治疗组，阳性对照组（顺铂），每组5只。BF-30低、中、高三个剂量组分别为0.75，1.5，3mg/kg/d，阳性对照组为顺铂0.1mg/kg/day，每天注射药物50μl,肿瘤模型组每天注射等量生理盐水，给药方式均为瘤内注射。每天固定时间给药一次并记录小鼠的活动情况，连续7d。末次给药24h后，颈椎脱臼处死小鼠，剖瘤,称瘤重，计算抑瘤率。公式如下：
按照上述方法，结果表明（附图4，5，6），金环蛇抗菌肽Cathelicidin-BF体内对黑色素瘤抑瘤作用明显，瘤体积瘤重均明显减小，在0.75、1.5、3mg/kg/day剂量组抑瘤率（附图7）分别为41.4%、49.49%、63.5%，并与模型组相比具有统计学差异（*P<0.05，**P<0.01）。
Claims (6)
1. 金环蛇抗菌肽Cathelicidin-BF或含有金环蛇抗菌肽Cathelicidin-BF的药物组合物在制造药物中的用途，该药物用于治疗或预防人体的肿瘤，所述的金环蛇抗菌肽Cathelicidin-BF是从金环蛇蛇毒中分离出来的活性多肽, 是金环蛇基因编码的一种N-端有α-螺旋的直链多肽，含有三十个氨基酸残基，分子量3637.54 Da，等电点11.79，全序列为：赖氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-精氨酸-赖氨酸-亮氨酸-赖氨酸-赖氨酸-丝氨酸-缬氨酸-赖氨酸-赖氨酸-精氨酸-丙氨酸-赖氨酸-谷氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸-赖氨酸-脯氨酸-精氨酸-缬氨酸-异亮氨酸-甘氨酸-缬氨酸-丝氨酸-异亮氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸。
2. 金环蛇抗菌肽Cathelicidin-BF或含有金环蛇抗菌肽Cathelicidin-BF的药物组合物在制造药物中的用途，该药物用于治疗或预防人体的恶性肿瘤，所述的金环蛇抗菌肽Cathelicidin-BF是从金环蛇蛇毒中分离出来的活性多肽, 是金环蛇基因编码的一种N-端有α-螺旋的直链多肽，含有三十个氨基酸残基，分子量3637.54 Da，等电点11.79，全序列为：赖氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-精氨酸-赖氨酸-亮氨酸-赖氨酸-赖氨酸-丝氨酸-缬氨酸-赖氨酸-赖氨酸-精氨酸-丙氨酸-赖氨酸-谷氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸-赖氨酸-脯氨酸-精氨酸-缬氨酸-异亮氨酸-甘氨酸-缬氨酸-丝氨酸-异亮氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸。
3. 金环蛇抗菌肽Cathelicidin-BF或含有金环蛇抗菌肽Cathelicidin-BF的药物组合物在制造药物中的用途，该药物用于治疗或预防人体的宫颈癌，所述的金环蛇抗菌肽Cathelicidin-BF是从金环蛇蛇毒中分离出来的活性多肽, 是金环蛇基因编码的一种N-端有α-螺旋的直链多肽，含有三十个氨基酸残基，分子量3637.54 Da，等电点11.79，全序列为：赖氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-精氨酸-赖氨酸-亮氨酸-赖氨酸-赖氨酸-丝氨酸-缬氨酸-赖氨酸-赖氨酸-精氨酸-丙氨酸-赖氨酸-谷氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸-赖氨酸-脯氨酸-精氨酸-缬氨酸-异亮氨酸-甘氨酸-缬氨酸-丝氨酸-异亮氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸。
4. 金环蛇抗菌肽Cathelicidin-BF或含有金环蛇抗菌肽Cathelicidin-BF的药物组合物在制造药物中的用途，该药物用于治疗或预防人体的淋巴瘤，所述的金环蛇抗菌肽Cathelicidin-BF是从金环蛇蛇毒中分离出来的活性多肽, 是金环蛇基因编码的一种N-端有α-螺旋的直链多肽，含有三十个氨基酸残基，分子量3637.54 Da，等电点11.79，全序列为：赖氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-精氨酸-赖氨酸-亮氨酸-赖氨酸-赖氨酸-丝氨酸-缬氨酸-赖氨酸-赖氨酸-精氨酸-丙氨酸-赖氨酸-谷氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸-赖氨酸-脯氨酸-精氨酸-缬氨酸-异亮氨酸-甘氨酸-缬氨酸-丝氨酸-异亮氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸。
5. 金环蛇抗菌肽Cathelicidin-BF或含有金环蛇抗菌肽Cathelicidin-BF的药物组合物在制造药物中的用途，该药物用于治疗或预防人体的肺癌，所述的金环蛇抗菌肽Cathelicidin-BF是从金环蛇蛇毒中分离出来的活性多肽, 是金环蛇基因编码的一种N-端有α-螺旋的直链多肽，含有三十个氨基酸残基，分子量3637.54 Da，等电点11.79，全序列为：赖氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-精氨酸-赖氨酸-亮氨酸-赖氨酸-赖氨酸-丝氨酸-缬氨酸-赖氨酸-赖氨酸-精氨酸-丙氨酸-赖氨酸-谷氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸-赖氨酸-脯氨酸-精氨酸-缬氨酸-异亮氨酸-甘氨酸-缬氨酸-丝氨酸-异亮氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸。
6. 金环蛇抗菌肽Cathelicidin-BF或含有金环蛇抗菌肽Cathelicidin-BF的药物组合物在制造药物中的用途，该药物用于治疗或预防人体的黑色素瘤，所述的金环蛇抗菌肽Cathelicidin-BF是从金环蛇蛇毒中分离出来的活性多肽, 是金环蛇基因编码的一种N-端有α-螺旋的直链多肽，含有三十个氨基酸残基，分子量3637.54 Da，等电点11.79，全序列为：赖氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-精氨酸-赖氨酸-亮氨酸-赖氨酸-赖氨酸-丝氨酸-缬氨酸-赖氨酸-赖氨酸-精氨酸-丙氨酸-赖氨酸-谷氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸-赖氨酸-脯氨酸-精氨酸-缬氨酸-异亮氨酸-甘氨酸-缬氨酸-丝氨酸-异亮氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸。
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