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CN111479829A - 具有降低的生物活性的抗体变体和同种型 - Google Patents

具有降低的生物活性的抗体变体和同种型 Download PDF

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Abstract

作为具有比艾美赛珠单抗低的FVIII样活性的抗体变体和同种型，提供了其中在可变区中的特定氨基酸残基被切割和缺失的抗体变体(Q‑CDR‑剪切变体)，和其中重链间二硫键在温和还原条件下几乎不被还原的抗体同种型。

Description

具有降低的生物活性的抗体变体和同种型
技术领域
本发明涉及具有降低的生物活性的抗体变体和同种型。例如，本发明涉及艾美赛珠单抗(Emicizumab)的抗体变体和同种型，所述抗体变体和同种型具有降低的凝血因子VIII(FVIII)模拟活性。本发明还涉及以低含量比率包含此类抗体变体或同种型的药物组合物。本发明进一步涉及用于检测抗体变体和同种型的方法和用于分析抗体变体和同种型的方法。
背景技术
由于抗体在血浆中高度稳定且几乎没有副作用，因此作为药物引起了人们的关注。其中，许多IgG型抗体药物可在市场上获得，并且许多抗体药物目前正在开发中(NPL 1、2和3)。
甲型血友病是由FVIII功能的遗传性降低或缺乏引起的出血异常。甲型血友病患者通常施用FVIII制剂用于出血(按需施用)。近年来，还预防性地施用FVIII制剂以预防出血事件(预防性施用；NPL 1和2)。FVIII制剂在血液中的半衰期为大约12至16小时。因此，为了持续预防，向患者每周三次施用FVIII制剂(NPL 3和4)。在按需施用中，还根据需要以一定间隔额外施用FVIII制剂以防止再出血。此外，FVIII制剂的施用是静脉内施用。因此，强烈需要与FVIII制剂相比具有更轻的施用负担的药剂。
偶尔，血友病患者中会产生针对FVIII的抗体(抑制剂)。这种抑制剂抵消了FVIII制剂的作用。对于已经产生了抑制剂的患者(抑制剂患者)的出血，可施用旁路剂。它们的作用机制不依赖于FVIII功能，即，通过活化的凝血因子IX(FIXa)催化凝血因子X(FX)活化的功能。因此，在一些情况下，旁路剂不能充分地阻止出血。因此，强烈需要不受抑制剂存在影响且在功能上替代FVIII的药剂。
作为解决该问题的手段，已经报道了功能上替代FVIII的双特异性抗体及其用途(PTL 1、2、3和4)。通过将两个因子彼此靠近放置以展示FVIII模拟活性，针对FIXa和FX的双特异性抗体能够在功能上取代FVIII(NPL5)。据报道，通过优化对FIXa和FX的亲和力，可增强抗体的FVIII模拟活性(NPL 6)。据报道，具有高FVIII模拟活性的艾美赛珠单抗(ACE910)(其是这些抗体之一)在血友病的猴模型中发挥止血效果(NPL 7和8)；因此，正在对甲型血友病患者进行临床试验。
文献列表
[专利文献]
[PTL 1]WO 2005/035754
[PTL 2]WO 2005/035756
[PTL 3]WO 2006/109592
[PTL 4]WO 2012/067176
[非专利文献]
[NPL 1]Blood 58，1-13(1981)
[NPL 2]Nature 312，330-337(1984)
[NPL3]Nature 312，337-342(1984)
[NPL 4]Biochim.Biophys.Acta 871，268-278(1986)
[NPL 5]Nat Med.2012年10月；18(10)：1570-4.
[NPL 6]PLoS One.2013；8(2)：e57479.
[NPL 7]J ThrombHaemost.2014年2月；12(2)：206-213.
[NPL 8]Blood.2014年11月13日；124(20)：3165-71.
[NPL9]J.Appl.Cryst.13，577-584(1980)
[NPL 10]IUCrJ.2，9-18(2015)
发明内容
[技术问题]
鉴于上述情况实现了本发明。本发明的目的是提供具有降低的FVIII模拟活性的抗体变体或同种型。
[解决问题的方案]
本发明人进行了专门的研究以解决上述问题，并成功地鉴定了含有艾美赛珠单抗作为活性成分的药物组合物中所包含的抗体变体和同种型。本发明人还发现，与艾美赛珠单抗的活性相比，这些抗体变体和同种型的FVIII模拟活性非常低。
基于这些发现而完成了本发明，并提供以下[1]-[21]。
[1]抗体变体，其包含含有氨基酸序列SISPSGQSTYYRREVKG(SEQ ID NO：2)的可变区，其中
(a)在从所述序列的N末端侧起第12位(从艾美赛珠单抗Q链的N末端侧起第61位：根据Kabat编号的位置60)的氨基酸残基R或
(b)在从所述序列的N末端侧起第10-12位(从艾美赛珠单抗Q链的N末端侧起第59-61位：根据Kabat编号的位置58-60)的氨基酸残基YYR
是缺失的，并且所述可变区在缺失位点被切割。
[2]如[1]所述的抗体变体，其中所述序列是CDR序列。
[3]如[1]所述的抗体变体，其中所述序列是CDR2序列。
[4]如[1]所述的抗体变体，其中所述序列是包含在重链中的序列。
[5]如[1]所述的抗体变体，其是双特异性抗体的变体。
[6]如[1]所述的抗体变体，其是艾美赛珠单抗的变体。
[7][1]-[6]中任一项所述的抗体变体的检测方法，其包括通过亲和色谱、离子交换色谱、正相色谱、反相色谱、亲水相互作用色谱(HILIC)、疏水相互作用色谱(HIC)、基于电荷的分离、尺寸排阻色谱(SEC)、凝胶渗透色谱(GPC)或其组合分离含有抗体的样品的步骤，所述抗体包含含有氨基酸序列SISPSGQSTYYRREVKG(SEQ ID NO：2)的可变区。
[8]如[7]所述的检测方法，其使用[1]-[6]中任一项所述的抗体变体作为参考标准。
[8-2]如[8]所述的检测方法，其包括进行一种或更多种分析的步骤，其中所述分析选自由定量分析、定性分析和结构分析组成的组。
[9]药物组合物，其包含[1]-[6]中任一项所述的抗体变体，其中在所述药物组合物中，所述抗体变体在总抗体分子中的百分比为5％或更低。
[10]如[9]所述的药物组合物，其中所述抗体是艾美赛珠单抗。
[11]如[9]所述的药物组合物，其通过纯化方法获得，所述纯化方法包括通过阳离子交换色谱(CEX)纯化。
[12]用于抑制[1]-[6]中任一项所述的抗体变体产生的方法，其包括在7.1或更高的pH下和/或在36℃或更低的培养温度下，培养抗体产生细胞的步骤。
[12-2]如[12]所述的方法，其中，在培养期间，将用于培养所述抗体产生细胞的条件改变为7.1或更高的pH和/或36℃或更低的培养温度。
[13]双特异性抗体的同种型，其包含第一重链(Q链，SEQ ID NO：10)和第二重链(J链，SEQ ID NO：11)，其中
在以下中形成二硫键：
(1a)在所述第一重链的根据EU编号的位置144(从SEQ ID NO：10的N末端侧起第150位)的半胱氨酸和所述第二重链的根据EU编号的位置200(从SEQ ID NO：11的N末端侧起第202位)的半胱氨酸之间；以及
(1b)在所述第一重链的根据EU编号的位置200(从SEQ ID NO：10的N末端侧起第206位)的半胱氨酸和所述第二重链的根据EU编号的位置144(从SEQ ID NO：11的N末端侧起第146位)的半胱氨酸之间；或其中在以下中形成二硫键：
(2a)在所述第一重链的根据EU编号的位置226(从SEQ ID NO：10的N末端侧起第229位)的半胱氨酸和所述第二重链的根据EU编号的位置229(SEQ ID NO：11的N末端起第228位)的半胱氨酸之间；以及
(2b)在所述第一重链的根据EU编号的位置229(SEQ ID NO：10的N末端起第232位)的半胱氨酸和所述第二重链的根据EU编号的位置226(SEQ ID NO：11的N末端起第225位)的半胱氨酸之间。
[14]如[13]所述的双特异性抗体同种型，其中在(1a)和(1b)中形成二硫键。
[15]包含第一重链(Q链，SEQ ID NO：10)和第二重链(J链，SEQ ID NO：11)的双特异性抗体的同种型，其特征在于当使用阳离子交换色谱分离时，其在比所述双特异性抗体更接近碱性侧的区域洗脱。
[16]如[13]-[15]中任一项所述的双特异性抗体的同种型，其是艾美赛珠单抗的同种型。
[17]检测[13]-[16]中任一项所述的抗体同种型的检测方法，其包括通过亲和色谱、离子交换色谱、正相色谱、反相色谱、亲水相互作用色谱(HILIC)、疏水相互作用色谱(HIC)、基于电荷的分离、尺寸排阻色谱(SEC)、凝胶渗透色谱(GPC)或其组合分离含有双特异性抗体的样品的步骤。
[18]如[17]所述的检测方法，其使用[13]-[16]中任一项所述的双特异性抗体的同种型作为参考标准。
[18-2]如[18]所述的检测方法，其包括进行一种或更多种分析的步骤，其中所述分析选自由定量分析、定性分析和结构分析组成的组。
[19]药物组合物，其包含[13]-[16]中任一项所述的双特异性抗体同种型，其中在所述药物组合物中，所述抗体同种型在总抗体分子中的百分比为2％或更低。
[20]用于降低[13]-[16]中任一项所述的双特异性抗体同种型的含量百分比的方法，其包括通过阳离子交换色谱纯化的步骤。
[21]如[1]、[13]或[15]所述的抗体同种型或变体，其中所述抗体的生物活性显著降低。
[22]具有两个各自识别不同表位的可变区的抗体或其衍生物的同种型，其中所述同种型具有相对于所述抗体或其衍生物小3％或更多，优选4％或更多，更优选5％或更多，或再更优选6％或更多的平均Rg值，和/或其中所述同种型具有相对于所述抗体或其衍生物小5％或更多，优选6％或更多，更优选7％或更多，或再更优选7.5％或更多的平均Dmax值。
[23]具有两个各自识别不同表位的可变区的抗体或其衍生物的同种型，其中所述同种型具有相对于所述抗体或其衍生物小0.15nm或更多，优选0.2nm或更多，更优选0.25nm或更多，或再更优选0.3nm或更多的平均Rg值，和/或其中所述同种型具有相对于所述抗体或其衍生物小0.5nm或更多，优选1.0nm或更多，更优选1.2nm或更多，或再更优选1.4nm或更多的平均Dmax值。
[24]如[22]或[23]所述的同种型，其中所述同种型具有与所述抗体或其衍生物中的二硫键不同的二硫键。
[25]如[22]-[24]任一项所述的同种型，其中所述抗体或其衍生物是艾美赛珠单抗(双特异性抗体，其包含第一重链(Q链，SEQ ID NO：10)、第二重链(J链，SEQ ID NO：11)和每个均与所述第一重链或所述第二重链形成配对的共同轻链(SEQ ID NO：12))。
[26]艾美赛珠单抗的同种型，其中所述同种型具有4.9nm或更小，或优选4.8nm或更小的平均Rg值，和/或其中所述同种型具有17.0nm或更小，或优选16.5nm或更小的平均Dmax值。
[27]如[25]或[26]所述的同种型，其中所述同种型具有在所述第一重链的根据EU编号的位置144的半胱氨酸(从SEQ ID NO：10的N末端侧起第150位)与所述第二重链的根据EU编号的位置200的半胱氨酸(从SEQ ID NO：11的N末端侧起第202位)之间的二硫键，以及在所述第一重链的根据EU编号的位置200的半胱氨酸(从SEQ ID NO：10的N末端侧起第206位)与所述第二重链的根据EU编号的位置144的半胱氨酸(从SEQ ID NO：11的N末端侧起第146位)之间的二硫键。
[28]药物组合物，其包含艾美赛珠单抗和如[22]-[27]中任一项所述的同种型，其中在所述药物组合物中，所述同种型在总抗体分子中的百分比为2％或更低。
[29]双特异性抗体(Q499-z121/J327-z119/L404-k；艾美赛珠单抗)的同种型，所述双特异性抗体包含第一重链(Q链，SEQ ID NO：10)、第二重链(J链，SEQ ID NO：11)和每个均与所述第一重链或所述第二重链形成配对的共同L链(SEQ ID NO：12)，其中所述同种型与艾美赛珠单抗在以下位置的氨基酸残基中具有分子结构的差异：从所述Q链的根据EU编号的位置146到所述Q链的根据EU编号的位置174(从SEQ ID NO：10的N末端侧起第152位到第180位)的氨基酸，和从所述J链的根据EU编号的位置146到所述J链的根据EU编号的位置174(从SEQ ID NO：11的N末端侧起第148位到第176位)的氨基酸。
[30]如[29]所述的同种型，其中将所述分子结构的差异测量为HDX-MS测量中的氘交换率(％D)的差异。
[31]药物组合物，其包含艾美赛珠单抗和如[29]或[30]所述的同种型，其中在所述药物组合物中，所述同种型在总抗体分子中的百分比为2％或更低。
本发明进一步提供了以下[A1]-[A9]。
[A1]如[7]或[17]所述的检测方法，其包括使含有所述抗体和/或所述抗体变体或同种型的样品进行还原反应、水解反应(消化反应)、蛋白质变性反应或其组合的步骤。
[A2]如[A1]所述的检测方法，其中所述还原反应在温和的还原条件下进行(例如，在37℃下，用在Tris缓冲液(pH7.0)中的DTT还原)。
[A3]如[A1]所述的检测方法，其中所述水解反应是使用位点特异性切割酶(例如，诸如IdeS蛋白酶、Lys-C、木瓜蛋白酶等的序列特异性蛋白酶)进行。
[A4]如[7]、[17]和[A1]-[A3]中任一项所述的检测方法，其包括通过亲和色谱、离子交换色谱、正相色谱、反相色谱、亲水相互作用色谱(HILIC)、疏水相互作用色谱(HIC)、基于电荷的分离、尺寸排阻色谱(SEC)、凝胶渗透色谱(GPC)或其组合，分离含有所述抗体、所述抗体变体或同种型、其反应产物或其组合的样品的步骤。
[A5]如[8]、[18]和[A1]-[A4]中任一项所述的检测方法，其包括通过SE-HPLC分析、动态光散射(DLS)方法、SAXS测量、电子显微镜测量、3D建模、SPR测定、HDX MS分析或其组合进行分析的步骤。
[A6]包含艾美赛珠单抗的药物组合物的质量控制方法，其包括[7]、[8]、[17]、[18]或[A1]-[A5]的步骤或将这些方法组合的步骤。
[A7]包含艾美赛珠单抗的药物组合物的制备方法，其包括来自[A6]的方法的步骤。
[A8]包含艾美赛珠单抗的组合物的纯化方法，其特征在于，所述方法包括阳离子交换色谱(CEX)的结合&洗脱模式的步骤。
[A9]包含艾美赛珠单抗的药物组合物的制备方法，其包括来自[A8]的纯化方法的步骤。
发明效果
本发明人成功鉴定了在含有艾美赛珠单抗作为活性成分的药物组合物中所包含的抗体变体和同种型。本发明人还发现，与艾美赛珠单抗的FVIII模拟活性相比，这些抗体变体和同种型的FVIII模拟活性非常低。因此，包含艾美赛珠单抗和仅在低含量的这种抗体变体和同种型的药物组合物可用作治疗血友病的手段。
附图说明
[图1-1]图1A显示通过CE-HPLC分离艾美赛珠单抗药物物质的结果。用粗线框标记的峰表示Q-CDR-剪切变体。
[图1-2]图1B是显示Q-CDR-剪切变体的分子结构的图。图中的数字和其正下方的字母分别表示从艾美赛珠单抗Q链的N-末端计数的氨基酸残基的位置和该位置的氨基酸残基(单字母代码)。
[图2-1]图2A显示通过CE-HPLC分离艾美赛珠单抗药物物质的结果。用粗线框标记的峰表示受保护的二硫化物同种型。
[图2-2]图2B是显示受保护的二硫化物同种型的分子结构的图。图中数字和其左边的字母C分别表示从艾美赛珠单抗Q链的N末端计数的氨基酸残基的位置和在该位置的半胱氨酸残基。图2C显示艾美赛珠单抗药物物质中受保护的二硫化物同种型的含量比率。各种条件(抗体产生细胞的培养条件)下的含量比率由在CE-HPLC分离结果(图2A所示)中的受保护的二硫化物同种型的峰面积百分比(面积％)的平均值(均值)和它们的标准偏差(StdDev)表示。
[图3]图3显示了在IdeS消化和还原处理后，通过反相高效液相色谱分离艾美赛珠单抗和受保护的二硫化物同种型的结果。图3A-D显示了含有艾美赛珠单抗(A和B)或受保护的二硫化物同种型(C和D)的样品的分离结果，所述样品经IdeS消化，然后在存在变性剂的条件下(A和C：完全还原条件)或不存在变性剂的条件下(B和D：部分还原条件)还原。对于来自完全还原条件的样品(图3A和C)，对于艾美赛珠单抗和受保护的二硫化物同种型，都检测到代表Q链Fd(Q-Fd)、J链Fd(J-Fd)、Q链Fc(Q-Fc)、J链Fc(J-Fc)和L链(LC)的峰：在艾美赛珠单抗和受保护的二硫化物同种型之间没有检测到还原模式的差异。在另一方面，对于来自部分还原条件的样品(图3B和D)，仅对于受保护的二硫化物同种型检测到与完全还原条件下相同的代表Q链Fd、J链Fd、Q链Fc、J链Fc和L链的峰，以及检测到除此之外的指示二硫化物键接在一起的Q链Fd和J链Fd的异二聚体(J-Fd-Q-Fd)的独特峰。
[图4]图4显示了在IdeS消化(和还原处理)后，通过反相高效液相色谱分离艾美赛珠单抗和受保护的二硫化物同种型的结果。图4A和B显示了IdeS消化的受保护的二硫化物同种型(A)或艾美赛珠单抗(B)的分离结果。图4C和D显示了被IdeS消化并然后变性处理的受保护的二硫化物同种型(C)或艾美赛珠单抗的分离结果。无论是否进行变性处理，受保护的二硫键同种型的F(ab’)2部分(LC-J Fab-Q Fab-LC)都以比艾美赛珠单抗的主要组分更长的保留时间而分离。
[图5]图5表示在各种培养条件下培养的艾美赛珠单抗产生CHO细胞的培养上清液中Q-CDR-剪切变体的含量比率。使用蛋白质A纯化的培养上清液样品用于测量Q-CDR-剪切变体的含量比率。纵轴表示Q-CDR-剪切变体含量比率(峰面积％)，横轴表示各种培养条件。
[图6]图6表示在各种培养条件下培养的艾美赛珠单抗产生CHO细胞的培养上清液中Q-CDR-剪切变体的含量比率。使用蛋白质A纯化的培养上清液样品用于测量Q-CDR-剪切变体的含量比率。纵轴表示Q-CDR-剪切变体含量比率(峰面积％)，横轴表示各种培养条件。
[图7]图7显示了对含有Q-CDR-剪切变体的抗体艾美赛珠单抗溶液的每个级分的CE-HPLC分析结果，所述级分是在包括阳离子交换色谱(CEX)结合&洗脱模式中的步骤的纯化过程中获得的。“加载级分”显示加载到阳离子交换柱上的抗体溶液的CE-HPLC分析结果。“洗涤级分”表示在通过含有25mmol/L氯化钠的pH7.2磷酸盐缓冲液(洗涤)后获得的柱吸附级分的CE-HPLC分析结果。“洗脱级分”显示在通过含有100mmol/L氯化钠的pH6.5磷酸盐缓冲液后获得的柱吸附级分的CE-HPLC分析结果。发现与加载级分和洗涤级分相比，在洗脱级分中，在比抗体艾美赛珠单抗的峰更酸性侧的Q-CDR-剪切变体的峰消失了。
[图8]图8A-D显示了用SAXS装置分析艾美赛珠单抗(MAIN)和受保护的二硫化物同种型(BiAb3)的分子结构的结果。“对-距离分布函数[p(r)]”，“Rg(nm)”和“Dmax(nm)”分别表示对距离分布函数、回转半径和最大尺寸。
[图9-1]图9A显示了在HDX-MS测量中，艾美赛珠单抗(阳离子交换高效液相色谱中的主要组分)和受保护的二硫化物同种型在氘交换率(％D)上的残留图(氘交换时间30s、60s、120s、240s、480s、960s、1920s和3840s)。图中的每个条形表示Q链、J链和L链的每个氘交换时间的结果差异的总和。图9B显示了通过HDX-MS测量提示受保护的二硫化物同种型与艾美赛珠单抗的分子结构差异的部分。在包含从Q链的根据EU编号的位置146到Q链的根据EU编号的位置174(从SEQ ID NO：10的N末端侧起第152位到第180位)的氨基酸残基的肽和包含从J链的根据EU编号的位置146到J链的根据EU编号的位置174(从SEQ ID NO：11的N末端侧起第148位到第176位)的氨基酸残基的肽中，受保护的二硫化物同种型与艾美赛珠单的的分子结构差异是显著的。参见用星号表示的部分。
[图9-2]图9-2是图9-1的延续。
具体实施方案
本发明的一个实施方案涉及具有降低的生物活性(例如，降低的FVIII模拟活性)的抗体变体和同种型。在本发明人分析艾美赛珠单抗药物物质期间，将抗体变体和同种型鉴定为两种类型的结构改变的分子(Q-CDR-剪切变体和受保护的二硫化物同种型)。在本申请中，“抗体变体”和“抗体同种型”也可以称为抗体分子的突变体或异构体。
艾美赛珠单抗是一种双特异性人源化IgG4抗体，其显示功能性取代FVIII作为辅因子的活性，并包含抗FIX(a)和抗FX，并且包含两种类型的重链(Q499和J327)和共同L链(L404)，其中每种重链分别识别FIX(a)和FX。
具体地，艾美赛珠单抗是双特异性抗体，其中第一多肽和第三多肽形成配对，第二多肽和第四多肽形成配对；其中第一多肽包含H链，所述H链分别包含SEQ ID NO：1、2和3的H链CDR 1、2和3(Q499的H链CDR)的氨基酸序列；第二多肽包含H链，所述H链分别包含SEQ IDNO：4、5和6的H链CDR 1、2和3(J327的H链CDR)的氨基酸序列；以及第三多肽和第四多肽包含共同L链，所述共同L链分别包含SEQ ID NO：7、8和9的L链CDR 1、2和3(L404的L链CDR)的氨基酸序列(Q499-z121/J327-z119/L404-k)。
更具体地，艾美赛珠单抗是双特异性抗体，其中第一多肽和第三多肽形成配对，第二多肽和第四多肽形成配对；其中第一多肽包含H链，所述H链包含SEQ ID NO：13的H链可变区的氨基酸序列，第二多肽包含H链，所述H链包含SEQ ID NO：14的H链可变区的氨基酸序列，以及第三多肽和第四多肽包含共同L链，所述共同L链包含SEQ ID NO：15的L链可变区的氨基酸序列。
再更具体地，艾美赛珠单抗是双特异性抗体，其中第一多肽和第三多肽形成配对，第二多肽和第四多肽形成配对；其中第一多肽包含H链，所述H链包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列，第二多肽包含H链，所述H链包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列，以及第三多肽和第四多肽包含SEQ ID NO：12的共同L链(Q499-z121/J327-z119/L404-k)。
这种抗体可以通过WO2005/035756、WO2006/109592、WO2012/067176等中描述的方法获得。
本发明中使用的抗体没有特别限制，只要它们与所需的抗原结合即可，并且它们可以是多克隆抗体或单克隆抗体。单克隆抗体是优选的，因为可稳定地产生同质抗体。
本发明的氨基酸序列中所包含的氨基酸可以进行翻译后修饰(例如，通过焦谷氨酰化将N末端谷氨酰胺修饰为焦谷氨酸是本领域技术人员公知的)。自然地，这种翻译后修饰的氨基酸包括在本发明所用的抗体中。
在本发明中，抗体或抗体变体或抗体同种型的生物活性优选为FVIII模拟活性。在本发明中，“FVIII模拟活性”是指功能性取代FVIII的活性(功能性取代FVIII作为辅因子的活性)。在本发明中，短语“功能性取代FVIII”是指识别FIX或FIXa和FX，并通过FIXa促进FX活化(通过FIXa促进FXa产生)。可使用例如包含FIXa、FX、合成底物S-2222(FXa的合成底物)和磷脂的测量系统来评价FXa产生促进活性。这种测量系统显示了与甲型血友病病例中的疾病严重性和临床症状的相关性(Rosen S，Andersson M，
Figure BDA0002534985520000111
M等人.Clinicalapplications of a chromogenic substrate method for determination of FVIIIactivity.ThrombHaemost 1985；54：811-23)。
可以根据例如，在WO2005/035756、WO2006/109592、WO2012/067176等中描述的方法评价抗体诸如艾美赛珠单抗和抗体变体和抗体同种型的FVIII模拟活性。
在本发明中，当与参考抗体的生物活性相比抗体或抗体变体或同种型的生物活性降低时，该抗体或抗体变体或同种型被称为“具有降低的生物活性”，并且优选地，所述降低是统计学显著的。在本发明中，当与参考抗体的生物活性相比抗体或抗体变体或抗体同种型的生物活性降低10％或更多，例如20％或更多，30％或更多，40％或更多，50％或更多，60％或更多，70％或更多，80％或更多，或90％或更多时，该抗体或抗体变体或抗体同种型被称为“具有显著(或极度)降低的生物活性”。
在本发明中，术语“Q链”和“J链”是指包含可变区的H链(重链)，所述可变区能够分别展示与FIX(a)和FX的结合能力。
在本发明中，术语“共同L链”是指能够与两个或多个不同H链中的每一个形成配对并且能够展示与它们各自抗原的结合能力的L链。在此，术语“不同的H链”优选指针对不同抗原的抗体的H链，但不限于此；它是指氨基酸序列彼此不同的H链。共同L链能够例如根据WO2006/109592中描述的方法获得。
术语“抗体”以最广义使用，包括单克隆抗体、多克隆抗体、二聚体、多聚体、多特异性抗体(诸如双特异性抗体)、抗体衍生物和经修饰的抗体(Miller K等人.JImmunol.2003，170(9)，4854-61)，只要它们显示所需的生物学活性即可。抗体可以是小鼠抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体或衍生自另一物种的抗体，或人工合成的抗体。本文公开的抗体可以是免疫球蛋白分子的的任何类型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD和IgA)、类别(例如，IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类。免疫球蛋白可来源于任何物种(例如，人、小鼠或兔)。术语“抗体”、“免疫球蛋白”和“免疫球蛋白”在广义上可互换使用。
“双特异性抗体”指具有两个可变区的抗体，每个可变区识别不同的表位，其中可变区存在于相同的抗体分子中。双特异性抗体可以是识别两种或更多种不同抗原的抗体，或识别相同抗原上的两种或更多种不同表位的抗体。双特异性抗体不仅可以包括完整抗体，还可以包括抗体衍生物。
通过使用基因工程技术产生的重组抗体可用作抗体。重组抗体可通过以下获得：从杂交瘤或抗体产生细胞(例如产生抗体的致敏淋巴细胞)中克隆编码抗体的DNA；将其插入载体；然后将其导入宿主(宿主细胞)以产生抗体。
双特异性抗体不限于IgG型的那些；例如，IgG型双特异性抗体可从杂交的杂交瘤(四源杂交瘤(quadroma))分泌，所述杂交的杂交瘤是通过将两种类型的产生IgG抗体的杂交瘤融合而产生的(Milstein C.等人，Nature1983，305：537-540)。它们也可以通过将构成两种感兴趣的IgG的L链和H链基因，即总共四种基因，导入细胞中以共表达这些基因而被分泌。
本发明的抗体可以通过本领域技术人员已知的方法产生。具体地，将编码感兴趣的抗体的DNA插入表达载体中。进行向表达载体中的插入，使得表达在表达调控区如增强子和启动子的控制下发生。接着，使用该表达载体转化宿主细胞以表达抗体。在这种情况下可使用宿主和表达载体的适当组合。
由此获得的本发明的抗体可从宿主细胞内部或细胞外部(培养基等)分离，并纯化为基本上纯的、同质的抗体。可通过通常用于分离和纯化抗体的方法分离和纯化抗体，并且该方法不以任何方式进行限制。例如，已知WO2013/086448中描述的方法用于分离IgG2二硫化物同种型。为了分离和纯化本发明中的抗体和抗体变体或抗体同种型，例如，可通过适当选择和组合柱色谱、过滤、超滤、盐析、溶剂沉淀、溶剂萃取、蒸馏、免疫沉淀、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦、透析、重结晶等来分离和纯化抗体和抗体变体或抗体同种型。例如，在使用色谱柱的分离和纯化中，可使用各种类型的基质，包括强阳离子交换基质、弱阳离子交换基质、抗人IgG亲和基质和蛋白L基质。
在一个方面，本发明涉及具有下述特征的抗体变体(在本申请中有时称为“Q-CDR-剪切变体”)：
-与艾美赛珠单抗相比具有极低的生物活性(FVIII模拟活性)；
-缺失的氨基酸残基的N末端侧的片段和C末端侧的其他片段通过二硫键连接在一起(图1B)；
-产生的量根据培养抗体产生细胞的时间、温度和pH而变化。
在一个实施方案中，Q-CDR-剪切变体是包含可变区的抗体变体，所述可变区包含氨基酸序列SISPSGQSTYYRREVKG(SEQ ID NO：2)，其中
(a)从SEQ ID NO：2的氨基酸序列N末端侧起第12位(从艾美赛珠单抗Q链的N末端侧起第61位：根据Kabat编号的位置60)的氨基酸残基R；或
(b)从SEQ ID NO：2的氨基酸序列N末端侧起第10-12位(从艾美赛珠单抗Q链的N末端侧起第59-61位：根据Kabat编号的位置58-60)的氨基酸残基YYR，
是缺失的，并且所述可变区在缺失位点被切割。
Q-CDR-剪切变体优选是双特异性抗体的变体，更优选是艾美赛珠单抗的变体。
在另一方面，本发明还涉及用于检测Q-CDR-剪切变体的方法和用于分析Q-CDR-剪切变体的方法。在一个实施方案中，用于检测Q-CDR-剪切变体的方法包括通过亲和色谱、离子交换色谱、正相色谱、反相色谱、亲水相互作用色谱(HILIC)、疏水相互作用色谱(HIC)、基于电荷的分离、尺寸排阻色谱(SEC)、凝胶渗透色谱(GPC)或其组合分离含有抗体的样品的步骤，所述抗体包含含有氨基酸序列SISPSGQSTYYRREVKG(SEQ ID NO：2)的可变区。在一个实施方案中，用于分析Q-CDR-剪切变体的方法包括使用Q-CDR-剪切变体作为参考标准进行一种或更多种分析的步骤，其中所述分析选自由定量分析、定性分析和结构分析组成的组。
在这种检测方法和分析方法中，可将具有SEQ ID NO：2氨基酸序列的Fab(Q链Fab)中的缺失部分的存在或不存在用作检测和分析的指标。缺失部分可以例如通过使用LCMS分析中缺失导致的分子量变化作为指标来检测。在Q-CDR-剪切变体中，缺失的氨基酸残基的N末端侧上的片段和C末端侧上的其它片段通过二硫键连接在一起；因此，通过分析进行还原二硫键的反应之后的样品，利用各种分析技术诸如CE-HPLC、LCMS、LC-UV，可以检测基于缺失部分的存在或不存在引起的还原模式的差异。也可以利用通过NMR测量等的结构分析。
备选地，可将通过离子交换色谱的分辨率差异用作指标。例如，当通过阳离子交换色谱进行分离时，Q-CDR-剪切变体将在比艾美赛珠单抗主峰酸性更强的区域中分离。
在另一个方面，在本发明中，可通过进行上述检测方法和分析方法之一或其任何组合来实施包含艾美赛珠单抗的药物组合物的生产和质量控制。因此，本发明涉及用于包含艾美赛珠单抗的药物组合物的质量控制的方法，其包括进行上述检测方法和分析方法的步骤或将那些方法中的任何方法组合的步骤。本发明还涉及包含艾美赛珠单抗的药物组合物的制备，其包括进行这种用于质量控制的方法的步骤。
在另一个方面，本发明涉及包含艾美赛珠单抗和Q-CDR剪切变体的药物组合物，其中在药物组合物中，Q-CDR剪切变体在总抗体分子中的比率保持较低。药物组合物可通过纯化方法获得，所述纯化方法包括通过阳离子交换色谱(CEX)纯化。例如，将含有艾美赛珠单抗和Q-CDR剪切变体的抗体溶液吸附到阳离子交换柱上，然后，仅可以选择性地洗脱和去除包括Q-CDR剪切变体的酸性侧变体。药物组合物中总抗体分子中的Q-CDR-剪切变体的比率可通过各种方法评价，包括上述用于检测/分析Q-CDR-剪切变体的方法，并且可由例如使用阳离子交换色谱(CEX)或CE-HPLC分析药物组合物得到的Q-CDR-剪切变体的峰面积的比率(峰面积比率)表示。药物组合物中总抗体分子中的Q-CDR-剪切变体的比率(例如，CEX峰面积比率)优选为5％或更低，例如为5.0％或更低、4.0％或更低、3.0％或更低、2.0％或更低或1.0％或更低。
本发明进一步涉及其中Q-CDR剪切变体的含量比率保持较低的药物组合物的制备方法，以及用于抑制Q-CDR剪切变体形成的方法。通过缩短抗体产生细胞的培养时间(例如，缩短至15天或更少，优选13天或更少)，或通过降低抗体产生细胞的培养温度(例如，降低至38℃或更低，优选37℃或更低，更优选36℃或更低)，和/或通过提高抗体产生细胞的培养pH(例如，提高至6.7或更高，优选6.9或更高，更优选7.1或更高)，可以减少Q-CDR剪切变体的形成量(图4)。因此，上述方法的特征在于，所述方法包括以下步骤：在比常规更低的培养温度(例如，约36℃或更低)和更高的pH(例如，7.1或更高)下，将抗体(例如，艾美赛珠单抗)产生细胞培养一定时间(例如，约15天或更少)。在一个实施方案中，上述方法包括在7.1或更高的pH和/或在36℃或更低的培养温度下，培养抗体产生细胞的步骤。在某些实施方案中，上述方法的特征在于，在培养中途(例如，在培养的第2天或更晚)，将抗体产生细胞的培养条件改变为7.1或更高的pH和/或36℃或更低的培养温度。
在另一个方面，本发明涉及用于纯化包含艾美赛珠单抗的组合物的方法，所述方法的特征在于包含阳离子交换色谱(CEX)的结合&洗脱模式的步骤。本发明进一步涉及用于制备包含艾美赛珠单抗的药物组合物的方法，所述方法包括进行纯化方法的步骤。
在另一个方面，本发明涉及具有下述特征的抗体同种型(在本申请中有时称为“受保护的二硫化物同种型”)：
-与艾美赛珠单抗相比具有极低的生物活性(FVIII模拟活性)；
-与艾美赛珠单抗相比，疏水性更强；
-具有重链间二硫键(图2B)，与艾美赛珠单抗相比，所述重链间二硫键在温和条件(部分还原条件)下对还原较不敏感；
-与条件(生产参数)无关地形成，所述条件诸如用于抗体产生细胞的培养基的溶解氧浓度和初始pH，以及添加MTX(氨甲喋呤)前的培养时间。
在一个实施方案中，受保护的二硫化物同种型的特征在于，它们能够结合抗原FIX(a)和FX，但不展示生物活性(FVIII模拟活性)。
在某些实施方案中，受保护的二硫化物同种型是结构异构体，其具有与艾美赛珠单抗相同的(正常)二硫键，但由于Fab部分的结构变化而具有比通常更强的疏水性，从而具有比通常对还原更不敏感的重链间二硫键。
在另一个实施方案中，受保护的二硫化物同种型是包含第一重链(Q链，SEQ IDNO：10)和第二重链(J链，SEQ ID NO：11)的双特异性抗体的同种型，其中，在受保护的二硫化物同种型中，
在以下中形成二硫键：
(1a)在所述第一重链的根据EU编号的位置144(从SEQ ID NO：10的N末端侧起第150位)的半胱氨酸和所述第二重链的根据EU编号的位置200(从SEQ ID NO：11的N末端侧起第202位)的半胱氨酸之间；以及
(1b)在所述第一重链的根据EU编号的位置200(从SEQ ID NO：10的N末端侧起第206位)的半胱氨酸和所述第二重链的根据EU编号的位置144(从SEQ ID NO：11的N末端侧起第146位)的半胱氨酸之间；或其中在以下中形成二硫键：
(2a)在所述第一重链的根据EU编号的位置226(从SEQ ID NO：10的N末端侧起第229位)的半胱氨酸和所述第二重链的根据EU编号的位置229(SEQ ID NO：11的N末端起第228位)的半胱氨酸之间；以及
(2b)在所述第一重链的根据EU编号的位置229(从SEQ ID NO：10的N末端侧起第232位)的半胱氨酸和所述第二重链的根据EU编号的位置226(从SEQ ID NO：11的N末端侧起第225位)的半胱氨酸之间。
在一个特定实施方案中，受保护的二硫化物同种型是双特异性抗体的同种型，并且优选是艾美赛珠单抗的同种型，其中，在受保护的二硫化物同种型中，
在以下中形成二硫键：
(1a)在所述第一重链的根据EU编号的位置144(从SEQ ID NO：10的N末端侧起第150位)的半胱氨酸和所述第二重链的根据EU编号的位置200(从SEQ ID NO：11的N末端侧起第202位)的半胱氨酸之间；
(1b)在所述第一重链的根据EU编号的位置200(从SEQ ID NO：10的N末端侧起第206位)的半胱氨酸和所述第二重链的根据EU编号的位置144(从SEQ ID NO：11的N末端侧起第146位)的半胱氨酸之间；
(1c)在所述第一重链的根据EU编号的位置226(从SEQ ID NO：10的N末端侧起第229位)的半胱氨酸和所述第二重链的根据EU编号的位置226(从SEQ ID NO：11的N末端起第225位)的半胱氨酸之间；以及
(1d)在所述第一重链中根据EU编号的位置229(从SEQ ID NO：10的N末端侧起第232位)的半胱氨酸和所述第二重链中根据EU编号的位置229(从SEQ ID NO：11的N末端侧起第228位)的半胱氨酸之间；或其中
在以下中形成二硫键：
(2a)在所述第一重链的根据EU编号的位置226(从SEQ ID NO：10的N末端侧起第229位)的半胱氨酸和所述第二重链的根据EU编号的位置229(从SEQ ID NO：11的N末端侧起第228位)的半胱氨酸之间；
(2b)在所述第一重链的根据EU编号的位置229(从SEQ ID NO：10的N末端侧起第232位)的半胱氨酸和所述第二重链的根据EU编号的位置226(SEQ ID NO：11的N末端起第225位)的半胱氨酸之间；
(2c)在所述第一重链的根据EU编号的位置144(从SEQ ID NO：10的N末端侧起第150位)的半胱氨酸和所述第一重链的根据EU编号的位置200(SEQ ID NO：10的N末端起第206位)的半胱氨酸之间；以及
(2d)在所述第二重链的根据EU编号的位置144(从SEQ ID NO：11的N末端侧起第146位)的半胱氨酸和所述第二重链的根据EU编号的位置200(从SEQ ID NO：11的N末端起第202位)的半胱氨酸之间。
在另一个方面，本发明涉及用于检测受保护的二硫化物同种型的方法和用于分析受保护的二硫化物同种型的方法。在一个实施方案中，用于检测受保护的二硫化物同种型的方法，其包括通过亲和色谱、离子交换色谱、正相色谱、反相色谱、亲水相互作用色谱(HILIC)、疏水相互作用色谱(HIC)、基于电荷的分离、尺寸排阻色谱(SEC)、凝胶渗透色谱(GPC)或其组合分离含有双特异性抗体的样品的步骤。在一个实施方案中，用于分析受保护的二硫化物同种型的方法包括使用受保护的二硫化物同种型作为参考标准进行一种或更多种分析的步骤，其中所述分析选自由定量分析、定性分析和结构分析组成的组。
在这种检测方法和分析方法中，可以利用受保护的二硫化物同种型和艾美赛珠单抗之间在形成重链间二硫键的区域和/或Fab区域的结构中的差异进行分析。可通过各种分析方法(诸如，例如以下所示的那些)检测结构差异。
例如，反映艾美赛珠单抗和受保护的二硫化物同种型之间的三维结构差异或疏水性强度差异的峰可在样品已经在非还原条件下被处理用于IdeS蛋白酶消化反应(在IgG中铰链区下方的单个位点处切割，以得到F(ab′)2和Fc片段)之后，通过使用反相柱(例如C4柱)分析样品检测。
反映艾美赛珠单抗和受保护的二硫化物同种型之间二硫键对还原敏感性差异的峰可在样品已被处理用于IdeS消化和随后用于在温和还原条件下(例如，在37℃下用DTT在Tris缓冲溶液(pH7.0)中还原)的还原反应之后，通过使用反相柱分析样品检测。
当在所有二硫键都被还原的条件下进行还原反应时，在使用用于艾美赛珠单抗和受保护的二硫化物同种型的反相柱获得的分析结果中将检测不到差异，而当在上述温和条件下进行还原反应时，在使用用于它们的反相柱获得的分析结果中将检测到还原模式的差异。不希望受任何特定理论的限制，据认为在上述温和还原条件下，在艾美赛珠单抗的情况下，重链和轻链之间的二硫键和重链之间的二硫键都被还原，而在受保护的二硫化物同种型的情况下，仅重链和轻链之间的二硫键被还原，而重链之间的二硫键不被还原。
反映由艾美赛珠单抗和受保护的二硫化物同种型之间的三维结构差异所引起的Lys-C消化模式差异的峰可在样品已经在非变性条件下(例如，在Tris缓冲液中)被处理用于有限的Lys-C消化(例如，通过中途停止Lys-C消化反应)后，通过使用反相柱(例如，C4柱)分析样品检测。不希望受任何特定理论的限制，据认为检测到反映三维结构差异的Lys-C消化模式，结果是在非变性条件下Lys-C消化期间保持三维结构的状态下，优选在Lys-C易于接近的位置处进行切割。
备选地，反映由艾美赛珠单抗和受保护的二硫化物同种型之间三维结构差异引起的Lys-C消化模式差异的峰可在将经预处理用于变性(例如，在37℃用5M胍处理30分钟)但未还原(即，保留SS键)的样品已经进行处理用于有限Lys-C消化之后，通过使用反相柱分析样品检测。不希望受任何特定理论的限制，据认为由于在对变性但未还原的样品进行Lys-C消化时，在三维结构不再保留但SS键(二硫键)保留的状态下，优选在Lys-C易于接近的位置进行切割，所以检测到反映SS键差异的Lys-C消化模式。
除了上述还原反应、IdeS消化和在非变性条件或变性条件下的有限Lys-C消化之外，可使用各种其它的分解反应如木瓜蛋白酶消化。除了使用C4柱等的反相色谱之外，可使用各种分析技术，诸如SE-HPLC分析、动态光散射(DLS)、SAXS测量、电子显微镜测量、3D建模、SPR测定、HDX MS分析。
在另一个方面，在本发明中，可通过进行上述检测方法和分析方法之一或其任何组合来实施包含艾美赛珠单抗的药物组合物的生产和质量控制。因此，本发明涉及用于包含艾美赛珠单抗的药物组合物的质量控制的方法，其包括进行上述检测方法和分析方法的步骤或将那些方法中的任何方法组合的步骤。本发明还涉及包含艾美赛珠单抗的药物组合物的制备，其包括进行这种用于质量控制的方法的步骤。
在另一个方面，本发明涉及包含艾美赛珠单抗和受保护的二硫化物同种型的药物组合物，其中在药物组合物中，受保护的二硫化物同种型在总抗体分子中的比率保持较低。药物组合物中总抗体分子中的受保护的二硫化物同种型的比率可通过各种方法评价，包括上述用于检测/分析受保护的二硫化物同种型的方法，并且可由例如使用阳离子交换色谱(CEX)或CE-HPLC分析药物组合物得到的受保护的二硫化物同种型的峰面积的比率(峰面积比率)表示。药物组合物中总抗体分子中的受保护的二硫化物同种型的比率(例如，CEX峰面积比率)优选为2％或更低，例如为2.0％或更低、1.5％或更低、1.0％或更低或0.5％或更低。
在另一个方面，本发明涉及用于纯化包含艾美赛珠单抗的组合物的方法，所述方法的特征在于包含阳离子交换色谱(CEX)的结合&洗脱模式的步骤。本发明进一步涉及用于制备包含艾美赛珠单抗的药物组合物的方法，所述方法包括进行纯化方法的步骤。
在另一个方面，本发明公开了艾美赛珠单抗的同种型(受保护的二硫化物同种型)，其具有与艾美赛珠单抗相同的重链和轻链氨基酸序列，但是具有比艾美赛珠单抗更小的Rg(nm)值和/或Dmax(nm)值的分子结构。这种同种型具有J链/Q链N末端之间的距离比艾美赛珠单抗更短的分子结构，并且特别地具有用SAXS装置测量的比艾美赛珠单抗小3％或更多，优选4％或更多，更优选5％或更多，或再更优选6％或更多的平均Rg值，和/或具有用SAXS装置测量的比艾美赛珠单抗小5％或更多，优选6％或更多，更优选7％或更多，或再更优选7.5％或更多的平均Dmax值。同种型可具有相对于艾美赛珠单抗小0.15nm或更多，优选0.2nm或更多，更优选0.25nm或更多，或者再更优选0.3nm或更多的平均Rg值，和/或可具有相对于艾美赛珠单抗小0.5nm或更多，优选1.0nm或更多，更优选1.2nm或更多，或者再更优选1.4nm或更多的平均Dmax值。这些同种型可具有4.9nm或更小，或优选4.8nm或更小的平均Rg值，和/或具有17.0nm或更小，或优选16.5nm或更小的平均Dmax值。
Rg和Dmax值可在以下鉴定的条件下测定：
(1)抗体浓度：抗体浓度为7.54mg/mL；
(2)溶剂条件：150mmol/L精氨酸，20mmol/L组氨酸-天冬氨酸，pH6.0；以及
(3)温度：25℃。
在此，可通过从吉尼耶图计算每次测量的Rg并对它们取平均值来获得平均Rg值。可通过从p(r)的x截距计算每次测量的Dmax并对它们取平均来获得平均Dmax值。关于分析吉尼耶图和p(r)的方法，参见以下描述的实施例9。
在另一个方面，本发明公开了艾美赛珠单抗的同种型(受保护的二硫化物同种型)，其具有与艾美赛珠单抗相同的重链和轻链氨基酸序列，但在以下氨基酸残基中具有与艾美赛珠单抗不同的分子结构：从Q链根据EU编号的位置146到Q链根据EU编号的位置174(从SEQ ID NO：10的N末端侧起第152位到第180位)的氨基酸残基，和从J链根据EU编号的位置146到J链根据EU编号的位置174(从SEQ ID NO：11的N末端侧起第148位到第176位)的氨基酸残基。分子结构的差异可测量为HDX-MS测量中氘交换率(％D)的差异，并且可确认为包含这些区域的氨基酸残基的肽的氘交换时间的差异，如图9A中具体所示。
在另一个方面，本发明公开了包含艾美赛珠单抗和同种型的药物组合物，其中在药物组合物中总抗体分子中的同种型的百分比是2％或更低。
在上述抗体分子、抗体变体、抗体同种型、包含抗体变体或同种型的药物组合物、用于分析抗体变体或同种型的方法或用于抑制抗体变体或同种型形成的方法中，所述抗体优选是双特异性抗体，更优选是艾美赛珠单抗(ACE910)。
如本文所用，表述“包含”所指的方面包括表述“基本上由......组成”所指的那些和表述“由......组成”所指的那些。
本文所述的数值可在一定范围内变化，例如，取决于本领域技术人员所用的仪器或设备、测量条件和程序，并且只要它们在允许实现本发明目的的范围内即可，它们可以涵盖例如约10％的偏差。
本文明确引用的所有专利和参考文献均通过引用以其整体并入本说明书。
通过以下实施例进一步说明本发明，但不应解释为限制于此。
具体实施方案
[实施例1]基因工程化的人源化双特异性单克隆抗体(抗体艾美赛珠单抗)的制备
为了艾美赛珠单抗异构体(抗体变体和同种型)的结构分析，通过下述方法大量制备艾美赛珠单抗抗体。将导入了编码艾美赛珠单抗的基因的CHO细胞作为艾美赛珠单抗产生细胞在市售的基础培养基(用于培养动物细胞的基础培养基)中培养。在赋予通常适于培养CHO细胞的环境下进行培养。
表达的抗体通过标准柱色谱(诸如亲和色谱、离子交换色谱、疏水色谱等)的组合进行纯化。
[实施例2]Q-CDR-剪切变体和受保护的二硫化物同种型的分离(阳离子交换高效 液相色谱)
将用流动相溶液A(其组成如下所述)稀释样本以便分析而制备的样品溶液注入阳离子交换柱(ProPac WCX-10：粒径10μm；内径4.0mm，长度250mm)中。然后，使用酸性流动相(流动相溶液A，含有9.6mmol/L Tris、6.0mmol/L哌嗪、11.0mmol/L咪唑缓冲液(pH 6.0))和碱性流动相(流动相溶液B，含有9.6mmol/L Tris、6.0mmol/L哌嗪、11.0mmol/L咪唑和150mmol/L氯化钠(pH9.9))，通过液相色谱(柱温：30+/-5℃，测量波长：280nm，流速：1.0mL/min)进行分离。结果，证实了与对应于艾美赛珠单抗的主峰相比，Q-CDR-剪切变体和受保护的二硫化物同种型分别在更酸性和更碱性的区域中分离(图1A和图2A)。
[实施例3]受保护的二硫化物同种型的分离(IdeS消化、部分还原、反相高效液相 色谱)
将样本用磷酸盐缓冲液稀释，用IdeS蛋白酶和PNGase-F消化，然后用不含变性剂的Tris缓冲液中的DTT部分还原。将用TFA溶液稀释的样品倒入反相高效液相色谱柱中并分离。结果发现艾美赛珠单抗的主要成分在色谱仪上以重链和轻链之间的二硫键还原的状态分离，而受保护的二硫化物同种型用代表重链之间的二硫键保持未被还原的状态的独特峰检测(图3B和图3D)。
[实施例4]受保护的二硫化物同种型的分离(IdeS消化、变性、反相高效液相色谱)
将样本用缓冲液稀释，用IdeS蛋白酶和PNGase-F消化，然后使用变性缓冲液使蛋白质变性。然后，将用TFA溶液稀释的样品倒入反相高效液相色谱柱中并分离。结果发现，与艾美赛珠单抗的主要成分相比，受保护的二硫化物同种型的F(ab′)2部分在更长的保留时间后分离(图4C和图4D)。
[实施例5]受保护的二硫化物同种型的分离(IdeS消化、反相高效液相色谱)
将样本用缓冲液稀释，并用IdeS蛋白酶和PNGase-F消化。将使用TFA溶液稀释的样品通过反相高效液相色谱分离。结果发现，与艾美赛珠单抗的主要成分相比，受保护的二硫化物同种型的F(ab′)2部分在更长的保留时间后分离(图4A和图4B)。
[实施例6]Q-CDR-剪切变体和受保护的二硫化物同种型的生物活性的评价
显色测定
使用特定的显色底物，定量测定活化凝血因子X(FXa)的量，所述活化凝血因子X(FXa)是在提供磷脂的反应场中，在FIXa和FX的存在下，通过艾美赛珠单抗的反应产生的。具体地，通过向样品中添加含有三-羟甲基氨基甲烷、氯化钠和BSA的溶液(TBSB)，制备以各种浓度稀释的艾美赛珠单抗溶液。将每种稀释溶液添加到96孔微孔板的各自的孔中，向其中添加含有FIXa、FX、氯化钙、氯化镁、磷脂和TBSB的凝血因子溶液，摇动后，将板放置30分钟。将乙二胺四乙酸溶液添加到每个孔中，摇动平板，并将显色底物溶液添加到每个孔中(N-苯甲酰基-L-异亮氨酰-L-谷氨酰-甘氨酰-L-精氨酸-对硝基苯胺盐酸盐及其甲酯)。摇动后，将板放置35分钟。摇动一至两分钟后，使用酶标仪测量每个孔在405nm处的吸光度(Abs)。基于从标准溶液和各种浓度的样品溶液获得的吸光度值，从使用4参数平行线对数分析程序生成的回归曲线确定样品相对于标准溶液的比活度。结果，相对于艾美赛珠单抗标准溶液，Q-CDR-剪切变体显示18+/-1％的生物活性，受保护的二硫化物同种型显示8+/-0％的生物活性。
凝血测定
在该测定中，在使用因子VIII缺陷的人血浆的重建内源性凝固激活机制的系统中，基于作为指标的浊度的变化，测量直至由于血纤蛋白形成而导致凝血的时间。具体地，向样品中添加含有三-羟甲基氨基甲烷、氯化钠和BSA的溶液，以制备以各种浓度稀释的艾美赛珠单抗溶液。使用自动凝血测量装置，向稀释溶液中添加因子VIII缺陷血浆并进行温育，然后添加APTT试剂并温育，最后添加氯化钙溶液并测量，以确定凝血时间。通过平行线测定，计算样品相对于标准物质的比活度。结果，相对于艾美赛珠单抗标准溶液，Q-CDR-剪切变体显示18+/-1％的生物活性，受保护的二硫化物同种型显示16+/-1％的生物活性。
[实施例7]培养参数对Q-CDR剪切变体比率的影响的评价
[初始培养基]
将植物来源的水解产物、氨基酸等添加并溶解于可商购的基础培养基中。然后通过过滤将混合物灭菌。
[补料培养基]
将葡萄糖、氨基酸等添加并溶解于可商购的基础培养基中。然后通过过滤将混合物灭菌。
[细胞[
使用艾美赛珠单抗产生CHO细胞(DXB-11株)，所述细胞包含掺入其中的编码艾美赛珠单抗的基因。
[培养方法]
将生产培养基(至标准浓度的+/-10％)倒入1L规模的细胞培养装置中，并将上述CHO细胞株接种于其中，得到2至6×105个细胞/mL。在以下条件下开始细胞培养：温度为36-38℃，溶解氧浓度为40％，初始pH为7.20。从培养的第1天到第3天，以恒定流速添加补料培养基(至标准浓度的+/-10％)，并且在培养的第3天，将pH转变为6.70-7.10。继续培养13-15天。
根据基于包括12个中心点(6个因素：生产培养基的浓度、补料培养基的浓度、初始细胞密度、温度、开始添加补料培养基的时间、转变后的pH)的中心复合设计而设计的实验计划，在总共56个条件下进行培养。对于所有条件，在培养的第13、14和15天对培养基取样(总共168个样品)，并离心(3000rpm离心5分钟)。将上清液进行蛋白质A纯化，然后用于测量Q-CDR-剪切变体的比率。
[分析方法]
通过台盼蓝染色测量活细胞数和活细胞比率。Q-CDR剪切变体作为峰通过使用阳离子柱(ProPac WCX-10)的阳离子交换高效液相色谱检测。
[结果]
结果示于图5和图6中。Q-CDR-剪切变体的比率受温度和转变后的pH的影响。在测试的范围内(温度36-38℃，转变后的pH为6.70-7.10)，在36℃下培养和在7.10的转变pH下培养中，Q-CDR-剪切变体的比率降低更多。温度和转变后的pH(转变pH)之间存在相互作用。已发现，当转变pH低至6.70时，即使在38℃的培养条件下，可降低Q-CDR剪切变体的比率。
通过将培养温度控制在36-38℃，培养第3天或之后的pH控制在6.70-7.10，可将Q-CDR-剪切变体成功地控制在4％或更低。
[实施例8]通过阳离子交换色谱去除Q-CDR剪切变体
利用Q-CDR剪切变体和抗体艾美赛珠单抗的静电性质的差异，建立了分离它们的方法。下面描述了实例。
用Capto SP ImpRes(GE)或其可允许的替代物作为阳离子交换树脂填充柱子，并平衡。用含有Q-CDR剪切变体的抗体艾美赛珠单抗溶液加载柱子，以使二者被吸附。加载之后，用含有氯化钠的磷酸盐缓冲液洗涤柱子，然后，仅特异性洗脱包括Q-CDR-剪切变体的在酸性侧的变体，以便将它们从抗体艾美赛珠单抗上分离和去除。为了显示去除效果如何，对洗涤级分、洗脱级分和分离前的加载级分进行CE-HPLC分析(图7)。
加载、洗涤和洗脱的条件如下所示。
加载：在每1L树脂33g抗体艾美赛珠单抗的条件下，加载调节至pH 5.0的含有抗体艾美赛珠单抗的Tris-盐酸缓冲液。
洗涤：将调节至pH 7.2的含有25mmol/L氯化钠的磷酸盐缓冲液在室温下通过3.5CV柱。
洗脱：将调节至pH 6.5的含有100mmol/L氯化钠的磷酸盐缓冲液在室温下通过6.5CV柱。
[实施例9]受保护的二硫化物同种型的分子结构分析
制备艾美赛珠单抗和受保护的二硫化物同种型的抗体制剂(抗体浓度为7.54mg/mL，150mmol/L精氨酸，20mmol/L组氨酸-天冬氨酸，pH6.0)。使用SAXSess mc2系统(AntonPaar，Graz，Austria)产生的线准直X射线束(Cu Kα，λ＝0.1542nm)进行SAXS测量。测量温度设定为25℃，使用二维成像板进行检测。X射线束的曝光时间设定为30分钟。在SAXSQuant软件(Anton Paar)上将二维散射强度转换为一维散射强度I(q)。此处，q是散射矢量(scattering vector)，定义为q＝(4π/λ)sin(θ/2)(θ是散射角)。对于透射通过束霖止器的光束，将散射曲线针对在q＝0处的散射强度进行归一化，然后进行空白校正(用缓冲液和毛细管)和光学系统(去污)校正。在满足q x Rg＜1.3的条件下，在校正的散射曲线上进行吉尼耶作图，以获得回转半径，Rg(nm)；但是，当在小角度侧存在散射强度下降时，在进行吉尼耶作图时排除与其对应的q范围的数据，以避免粒子间排斥的影响。在假设没有粒子间相互作用(结构因子S(q)＝1)的系统中，散射强度I(q)作为对距离分布函数p(r)的傅立叶变换给出。通过间接傅里叶变换方法应用于校正的散射曲线(NPL9)，获得粒子的p(r)。最大尺寸Dmax(nm)由p(r)的x截距获得。对艾美赛珠单抗抗体制剂(MAIN)和受保护的二硫化物同种型抗体制剂(BiAb3)各进行三次测量。
结果，受保护的二硫化物同种型具有4.8nm或更小的平均Rg值(比艾美赛珠单抗的值小0.3nm或更多的值)和16.5nm或更小的平均Dmax值(比艾美赛珠单抗的值小1.4nm或更多的值)，并且展示了比Emcizumab小6％或更多的平均Rg值和小7.5％或更多的平均Dmax值。据报道，IgG4抗体分子(其为与艾美赛珠单抗相同的抗体亚类)的Dmax值对应于两个Fab结构域的尖端之间的距离(NPL 10)；因此，认为受保护的二硫化物同种型的两个Fab结构域的尖端之间的距离缩短，从而给出较小的Rg值，所述Rg值表示距分子质心(the center ofmass)的距离。基于上述，证实了受保护的二硫化物同种型具有这样的分子结构，与艾美赛珠单抗相比，其在J链/Q链的N末端之间具有更短的距离(图8)。对于介导两种类型抗原之间相互作用的双特异性抗体，鉴于三维结构，Fab结构域之间的距离在确定抗原间相互作用中应当是至关重要的。因此，不仅对于艾美赛珠单抗，而且通常对于包含双特异性抗体的抗体药物而言，如何控制药物组合物中此类同种型的百分比是重要的任务。
[实施例10]通过HDX-MS(氢氘交换质谱测定法)的分子结构分析
制备艾美赛珠单抗和每种受保护的二硫化物同种型的抗体制剂(抗体浓度为1mg/mL，150mmol/L精氨酸，20mmol/L组氨酸-天冬氨酸，pH6.0)，并使用HDX-MS装置(具有HDX-PAL(LEAP Technologies)的Orbitrap Fusion Lumos(Thermo Fisher Scientific)，UltiMate30000RSLCnano(Thermo Fisher Scientific))进行HDX-MS测量(在氘交换时间30s，60s，120s，240s，480s，960s，1920s和3840s测量)。
结果，HDX-MS测量中氘交换率(％D)的显著差异在包含从Q链根据EU编号的位置146到Q链根据EU编号的位置174(从SEQ ID NO：10的N末端侧起第152位到第180位)的氨基酸残基的肽和包含从J链根据EU编号的位置146到J链根据EU编号的位置174(从SEQ ID NO：11的N末端侧起第148位到第176位)的氨基酸残基的肽中观察到。基于该结果，确认了，受保护的二硫化物同种型在这些区域中具有与艾美赛珠单抗相比不同的结构(图9)。
工业实用性
与艾美赛珠单抗相比，本发明的抗体变体和同种型具有极度降低的FVIII模拟活性；因此，包含艾美赛珠单抗并且具有降低的此类抗体变体和同种型含量比率的本发明的药物组合物可用作治疗血友病的手段。本发明的用于分析抗体变体和同种型的方法，对于评价艾美赛珠单抗制剂的质量是有用的，并且对于开发具有降低的抗体变体和同种型含量比率的艾美赛珠单抗制剂或开发用于抑制抗体变体和同种型形成的方法也是有用的。
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Claims (21)

1.抗体变体，其包含含有氨基酸序列SISPSGQSTYYRREVKG(SEQ ID NO：2)的可变区，其中
(a)在从所述序列的N末端侧起第12位的氨基酸残基R；或
(b)在从所述序列的N末端侧起第10至第12位的氨基酸残基YYR，
是缺失的，并且所述可变区在缺失位点被切割。
2.如权利要求1所述的抗体变体，其中所述序列是CDR序列。
3.如权利要求1所述的抗体变体，其中所述序列是CDR2序列。
4.如权利要求1所述的抗体变体，其中所述序列是包含在重链中的序列。
5.如权利要求1所述的抗体变体，其是双特异性抗体的变体。
6.如权利要求1所述的抗体变体，其是艾美赛珠单抗的变体。
7.权利要求1-6中任一项所述的抗体变体的检测方法，其包括通过亲和色谱、离子交换色谱、正相色谱、反相色谱、亲水相互作用色谱(HILIC)、疏水相互作用色谱(HIC)、基于电荷的分离、尺寸排阻色谱(SEC)、凝胶渗透色谱(GPC)或其组合分离含有抗体的样品的步骤，所述抗体包含含有氨基酸序列SISPSGQSTYYRREVKG (SEQ ID NO：2)的可变区。
8.如权利要求7所述的检测方法，其使用权利要求1-6中任一项所述的抗体变体作为参考标准。
9.药物组合物，其包含权利要求1-6中任一项所述的抗体变体，其中在所述药物组合物中，所述抗体变体在总抗体分子中的百分比为5％或更低。
10.如权利要求9所述的药物组合物，其中所述抗体是艾美赛珠单抗。
11.如权利要求9所述的药物组合物，其通过纯化方法获得，所述纯化方法包括通过阳离子交换色谱(CEX)纯化。
12.用于抑制权利要求1-6中任一项所述的抗体变体产生的方法，其包括在7.1或更高的pH下和/或在36℃或更低的培养温度下，培养抗体产生细胞的步骤。
13.双特异性抗体的同种型，其包含第一重链和第二重链，其中
在以下中形成二硫键：
(1a)在所述第一重链的根据EU编号的位置144的半胱氨酸和所述第二重链的根据EU编号的位置200的半胱氨酸之间；以及
(1b)在所述第一重链的根据EU编号的位置200的半胱氨酸和所述第二重链的根据EU编号的位置144的半胱氨酸之间；或其中
在以下中形成二硫键：
(2a)在所述第一重链的根据EU编号的位置226的半胱氨酸和所述第二重链的根据EU编号的位置229的半胱氨酸之间；以及
(2b)在所述第一重链的根据EU编号的位置229的半胱氨酸和所述第二重链的根据EU编号的位置226的半胱氨酸之间。
14.如权利要求13所述的双特异性抗体同种型，其中在(1a)和(1b)中形成二硫键。
15.包含第一重链和第二重链的双特异性抗体的同种型，其特征在于当使用阳离子交换色谱分离时，其在比所述双特异性抗体更接近碱性侧的区域洗脱。
16.如权利要求13-15中任一项所述的双特异性抗体同种型，其是艾美赛珠单抗的同种型。
17.权利要求13-16中任一项所述的抗体同种型的检测方法，其包括通过亲和色谱、离子交换色谱、正相色谱、反相色谱、亲水相互作用色谱(HILIC)、疏水相互作用色谱(HIC)、基于电荷的分离、尺寸排阻色谱(SEC)、凝胶渗透色谱(GPC)或其组合分离含有双特异性抗体的样品的步骤。
18.如权利要求17所述的检测方法，其使用权利要求13-16中任一项所述的抗体同种型作为参考标准。
19.药物组合物，其包含权利要求13-16中任一项所述的双特异性抗体同种型，其中在所述药物组合物中，所述抗体同种型在总抗体分子中的百分比为2％或更低。
20.用于降低权利要求13-16中任一项所述的双特异性抗体同种型的含量百分比的方法，其包括通过阳离子交换色谱纯化的步骤。
21.如权利要求1、13或15所述的抗体同种型或变体，其中所述抗体的生物活性显著降低。
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