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CN111343971A - 药物剂的组合物和递送方法 - Google Patents

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CN111343971A
CN111343971A CN201880061764.8A CN201880061764A CN111343971A CN 111343971 A CN111343971 A CN 111343971A CN 201880061764 A CN201880061764 A CN 201880061764A CN 111343971 A CN111343971 A CN 111343971A
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alb
fusion protein
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Nal Pharmaceutical Group Ltd
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Abstract

提供了纳米颗粒和微球，用于将抗癌剂或其他活性剂递送至受试者。纳米颗粒和微球由芯形成，芯由包含生长抑素‑白蛋白融合蛋白或其类似物的涂层或壳包裹。生长抑素‑白蛋白融合蛋白包括至少一个白蛋白(或其类似物)部分、至少一个生长抑素部分(例如SST‑14、SST‑28)和至少一个将白蛋白连接至白蛋白、将生长抑素连接至生长抑素和/或将白蛋白连接至生长抑素部分的间隔物。

Description

药物剂的组合物和递送方法
相关申请的交叉引用
本申请要求于2017年8月25日提交的美国临时申请No.62/550,535的优先权，其内容通过引用并入本文。
技术领域
本发明涉及包含以颗粒形式封装的药物活性成分的组合物。特别地，该药物活性成分被封装在生物相容性聚合物壳中，该聚合物壳包括重组融合蛋白，重组融合蛋白包括白蛋白结构域和生长抑素结构域。
背景技术
大多数抗癌剂的治疗效果取决于能否在肿瘤部位获得足够的局部递送。许多癌症化疗剂在体外已经显示出很高的疗效，但在体内却非同样有效。这种差异被认为部分归因于在治疗水平上难以将药物递送至肿瘤部位，以及需要高百分比的肿瘤细胞清除率才能提供有效的治疗(Jain,1994,Scientific American271(1):58-65；Tannock,1998,Lancet.351 Suppl 2:SII9-16)。治疗分子、细胞因子、抗体和病毒载体由于难以穿过血管壁，因而它们影响肿瘤的能力常常受到限制(Yuan,1998,Seminars in RadiationOncology8(3):164-175)。不充分的特异性递送可能导致目前癌症化疗中经常观察到的低治疗指数。
生长抑素(“SST”)是由多种内分泌和非内分泌组织分泌的一种多肽激素，且广泛分布于全身。生长抑素抑制垂体、胰腺和胃肠激素分泌的释放，以及细胞因子的产生、肠道运动和吸收、血管收缩和细胞增殖。最近的研究发现，SST对某些内分泌系统癌症有治疗作用，抑制肿瘤生长，抑制内分泌肿瘤的增殖，以及许多其他实体肿瘤，诸如乳腺癌、结直肠癌、肝癌、肺癌、内分泌癌、神经内分泌癌、胰腺癌和前列腺癌。此外，正如
Figure BDA0002422083080000022
1997,The Oncologist 2:50-58所报告的，SST将选择性地结合于某些肿瘤，包括神经内分泌肿瘤，这些肿瘤表达SST受体，SST和SST的治疗类似物将优先结合于这些受体。
生长抑素分子具有两种生物活性形式：生长抑素-14(SST-14)(环十四肽)和生长抑素-28(SST-28)(SST-14的N端伸长形式)。SST-14是14个残基长的环肽，在半胱氨酸的位置3和14之间含有二硫键。SST-28是同一前体的N端延伸形式(28个残基)，其通过蛋白质水解产生SST-14。虽然这两种形式的生长抑素具有相似的活性，但它们各自的效价和组织学特征不同。例如，SST-14对胰高血糖素和胃泌素的抑制作用更明显，而SST-28对生长激素和胰岛素的抑制作用更明显。这两种形式的生长抑素都通过靶细胞上的SST受体并经细胞内途径发挥它们各自的生物学功能。已经识别了生长抑素受体的五个亚型(SSTR 1-5)，SSTR2有两个剪接变体：SSTR2A和SSTR2B，具有不同的羧基末端。
生长抑素在治疗某些高分泌性内分泌疾患中的有益作用及其对肿瘤的抗增殖作用已得到公认。然而，由于酶降解和内吞作用，生长抑素在体内的半衰期只有2-3分钟，限制了生长抑素的临床应用。在过去的十年里，已经开发了许多稳定的生长抑素类似物。例如，奥曲肽(octreotide)和兰瑞肽(lanreotide)被用于治疗生长激素(GH)分泌性腺癌和类癌。
美国专利No.5,439,686，描述了基本上不溶于水的成分，诸如紫杉醇
Figure BDA0002422083080000021
在具有外壳的颗粒内配制，外壳包含生物相容性聚合物，例如蛋白质，诸如白蛋白，并且颗粒悬浮在生物相容性液体中。
国际申请日为2016年2月26日的共同拥有的国际专利申请No.PCT/US2016/019950，以及于2016年8月26日提交的共同拥有的美国专利申请序列No.15/249,346，描述了包含白蛋白部分和生长抑素部分的稳定重组融合蛋白，其中这些部分经间隔物连接。融合蛋白有助于提供稳定的生长抑素类似物，用于治疗或下调对生长抑素响应的肿瘤。然而，尽管有这一进展，但本领域仍长期需要将生长抑素活性的益处与其他治疗或诊断部分(包括其他类型的抗癌剂)相结合的组合物。
发明内容
因此，本发明提供了包含药物活性成分或诊断成分和聚合物壳的颗粒，其中聚合物壳包含生长抑素-白蛋白融合蛋白。
在本发明的某些实施方式中，聚合物壳基本上包含药物活性剂。
在本发明的其他实施方式中，聚合物壳占按重量计生长抑素-白蛋白融合蛋白(“SST融合蛋白”)的约5％至约100％，或者可替换地，聚合物壳占按重量计生长抑素-白蛋白蛋白的约65％至约95％。在某些方面，SST融合蛋白与药物活性成分或诊断成分在颗粒中的重量比为约20:1至1:20。
在本发明的另一实施方式中，该颗粒还包括作为抗癌剂的药物活性成分。例如，抗癌剂选自由以下组成的组：氮芥、亚硝基脲、亚乙基亚胺(ethyleneimine)、烷基磺酸盐、四嗪、铂类化合物、嘧啶类似物、嘌呤类似物、抗代谢物、叶酸类似物、蒽环类、紫杉烷、长春花生物碱、拓扑异构酶抑制剂、激素剂及其组合。例如，当抗癌剂是紫杉烷时，紫杉烷可选地选自由以下组成的组：紫杉醇(paclitaxel)、多西紫杉醇(docetaxel)、喜树碱(camptothecin)、卡巴他赛(cabazitaxel)、紫衫宁(taxinine)、三尖杉宁碱(cephalomannine)及其类似物和衍生物。
优选地，本发明的生长抑素-白蛋白融合蛋白包括：
SST；
L；以及
ALB，可操作地将其连接，
其中
L按任何顺序连接SST和ALB，
SST是生长抑素、其类似物或衍生物；
L是间隔物或接头；以及
ALB是白蛋白、其类似物或变体。
在特定实施方式中，融合蛋白选自由以下组成的组：
SST-(L)x1-ALB (I)；
ALB-(L)x1-SST (II)；
[SST-(L)x1]y1-ALB (III)；
ALB-[(L)x1-SST]y1 (IV)；
[SST-(L)x1]y1-ALB-[(L)x2-SST]y2 (V)；
[SST-(L)x1]y1-ALB-[(L)x2-SST]y2-(L)x3-ALB (VI)；
[SST-(L)x1]y1-ALB-[(L)x2-SST]y2-(L)x3-ALB-[(L)x4-SST]y3 (VII)；
ALB-(L)x1-[SST-(L)x2]y1-ALB (VIII)；
ALB-(L)x1-[SST-(L)x2]y1-ALB-[(L)x3-SST]y2-(L)x1-ALB (IX)；以及
ALB-(L)x1-[SST-(L)x2]y1-ALB-[(L)x3-SST]y2-(L)x1-ALB-[(L)x4-SST]y3 (X)；
其中，x1、x2、x3、x4、y1、y2或y3独立地为零或从1-10中选择的整数。
本发明的颗粒包括融合蛋白，其中SST是自然发生的或合成制造的。在本发明的特定实施方式中，融合蛋白的SST包括编码SST-14或SST-28的序列的一个或多个串联重复，分别由SEQ ID NO:17或18表示，或与这些序列中的任一序列具有至少85％的同一性的序列。例如，融合蛋白的SST是SST-14或SST-28。
此外，融合蛋白包括接头L，其是柔性的或α螺旋结构的多肽接头或间隔物。在特定实施方式中，L是具有2-100个氨基酸的肽。在另一实施方式中，L是包含至少一个GGGGS、A(EAAAK)4A、(AP)n结构域、(G)8或(G)5或其任何组合的肽，其中n是从10-34中选择的整数。
融合蛋白还包括哺乳动物血清白蛋白(ALB)。在特定实施方式中，ALB是哺乳动物血清白蛋白，包括例如根据SEQ ID NO:25的ALB，或与其具有至少85％序列同一性的蛋白质序列。
在本发明的特定实施方式中，x1、x2、x3、x4各自独立地是从1-5中选择的整数，和/或y1、y2、y3各自独立地是从1-5中选择的整数。
在另一实施方式中，生长抑素-白蛋白融合蛋白基本上通过二硫键交联，例如，二硫键通过超声波处理形成。
可选地制备本发明的颗粒，使得聚合物壳的最大横截面尺寸为约1微米至0.01微米。可替换地，可选地制备本发明的颗粒，使得聚合物壳的最大横截面尺寸为0.4微米至0.01微米。
在某些实施方式中，其中含有药物活性剂的聚合物壳悬浮在生物相容性水溶液中或生物相容性分散剂中。
特别地，生物相容性分散剂选自大豆油，椰子油，橄榄油，红花油，棉籽油，具有4-30个碳原子的脂肪族、环脂肪族或芳香族烃，具有2-30个碳原子的脂肪族或芳香族醇，具有2-30个碳原子的脂肪族或芳香族酯，具有2-30个碳原子的烷基、芳基或环醚，具有1-30个碳原子可选地具有一个以上的卤素取代基的烷基或芳基卤化物，具有3-30个碳原子的酮，聚亚烷基二醇或其任何两个或更多个的组合。
在本发明的另一实施方式中，该颗粒还包括诊断成分。诊断剂可选地选自由以下组成的组：超声造影剂、放射性造影剂、磁共振图像造影剂及其组合。
在又一实施方式中，本发明还提供了将基本上不溶于水的药物剂递送至需要它们的受试者的方法，该方法包括向需要它们的所述受试者给药有效量的本发明颗粒。
在又一实施方式中，本发明还提供了制备包含药物活性成分的颗粒的方法，包括：
使含有生长抑素-白蛋白融合蛋白和药物活性剂的水介质经受剪切条件持续足够的时间，以促进生长抑素-白蛋白融合蛋白通过二硫键的交联，从而产生在其中含有药物活性剂的聚合物壳。药物活性剂可选地分散在分散剂中。例如，通过在约10最大至100,000psi范围内的静态混合、高压均匀化、微射流条件下均匀化含有生长抑素-白蛋白融合蛋白和药物活性剂的水介质来提供剪切条件。
药物活性成分可选地为水溶性或水不溶性抗癌剂，抗癌剂选自由以下组成的组：氮芥、亚硝基脲、亚乙基亚胺、烷基磺酸盐、四嗪、铂类化合物、嘧啶类似物、嘌呤类似物、抗代谢物、叶酸类似物、蒽环类、紫杉烷、长春花生物碱、拓扑异构酶抑制剂、激素剂及其组合。特别是，例如，抗癌剂是紫杉醇或多西紫杉醇。
在另一实施方式中，当制备本发明颗粒时，例如通过高强度超声波提供剪切条件，高强度超声波包括在约50最大至200瓦/cm2范围内的声功率，持续约2秒至5分钟的时间段。
在本发明的优选方面中，本发明颗粒经肿瘤生长抑素受体选择性地结合于肿瘤细胞。
为了更充分地理解本发明，以下术语定义如下。
本发明广泛地提供用于药物递送的小尺寸颗粒，即“微球”和/或“纳米颗粒”。微球和纳米粒颗的定义是基于所包括的颗粒的平均横截面直径。
如本文所使用的，术语“微米”是指千分之一毫米(1μm)或1000nm的测量单位。
根据本发明的“微球”是具有平均横截面直径从约1μm到约1000μm的发明颗粒，其包括聚合物壳覆盖物，以及全部或部分地，包括一种或多种活性剂的芯。
根据本发明的“纳米颗粒”在本文中被广泛定义为平均横截面直径从约0.001μm至约1μm的颗粒。
微球比纳米颗粒更大，并且具有的一般优点是每颗粒递送更多的活性剂，并且有可能提供活性剂的长期或受控释放，并且可以通过注射到组织中(例如，作为皮下或肌肉注射)来容易地给药。然而，微球在静脉给药时有一定的缺点，例如，注射后容易聚集或形成团块，并且对于较大的微球，可能难以在毛细血管床中循环。纳米颗粒，特别是小于0.4μm的纳米颗粒，相对于微球具有优势，特别是对于静脉注射，例如，纳米颗粒不太可能聚集，并且更可能避免网状内皮系统(RES)，能够经胞饮作用进入细胞，并且基于实体肿瘤中的增强渗透和保留(EPR)效应在肿瘤组织中具有靶向性和积累性的优势。EPR效应是除了聚合物壳的SST融合蛋白组分选择性结合并靶向那些存在SST受体的肿瘤之外的。
还应理解的是，为了方便起见，在本申请中使用了单数形式，诸如“一个/种(a)”、“一个/种(an)”和“该”，然而，除非上下文或明确声明另有说明，否则单数形式旨在包括复数形式。
所有数值范围应理解为包括数值范围内的各个和每个数值点，并应解释为单独列举各个和每个数值点。指向同一组分或特性的所有范围的端点都是包含的，并且旨在可独立地被组合。
如本文所使用的，术语“约”是指在报告数值的10％以内，并且优选地在报告数值的5％以内。
词组“基本上由……组成”是指组合物或方法可以包括附加成分和/或步骤，但前提是附加成分和/或步骤没有实质性地改变所要求保护的组合物或方法的基本的和新颖的特征，即附加的一种或多种成分和/或一个或多个步骤对所要求保护的组合物或方法不起作用。
如本文所使用的，术语“生物相容性”描述了一种不会以任何不利的方式明显改变或影响其被引入的生物系统的物质。
如本文中所使用的，术语与本发明颗粒和一种或多种其他活性剂“共给药的”或“共给药”旨在涵盖将这种其他活性剂连同本发明颗粒一起给药至受试者，不论其是与颗粒同时给药，还是在颗粒的给药之前或之后给药。广义地说，本发明颗粒递送一种或多种活性剂，且当给药至还被给药未包含在本发明颗粒中的一种或多种其他活性剂的受试者时，这样的一种或多种活性剂可提供协调和/或协同效应。
如本文所使用的，术语“受试者”意指给药本发明颗粒的任何动物，并且优选地，该动物是哺乳动物。动物受试者可以包括人类受试者，或非人类受试者。无限制地，非人类或动物受试者是可给药本发明颗粒的任何动物，例如，在照料或治疗家畜或野生动物的过程中。非人类受试者优选地包括驯养哺乳动物，诸如犬属的成员(狗、狼、郊狼和豺狼)、猫属的成员(例如家猫)、骆驼属的成员(骆驼)、马属的成员(例如，马、驴和斑马)，羊亚科的成员(绵羊和山羊)和/或牛亚科的成员(有蹄类动物，诸如家牛、野牛、非洲水牛、水牛、牦牛以及四角羚羊和螺旋角羚羊)。非人类受试者也被设想包括例如，驯养的鸟类，诸如养殖的家禽，例如，鸡、鸭、火鸡、鹅、鸵鸟等，和/或宠物鸟类，诸如雀和/或鹦鹉目的成员，例如，鹦鹉和长尾鹦鹉。
在下文详细描述本发明之前，应当理解，本发明不限于本文描述的特定方法、方案和试剂，因为这些可能不同。还应理解，本文中使用的术语仅出于描述特定实施方式的目的，并且不旨在限制本发明的范围，本发明的范围将仅由所附权利要求限制。除非另有限定，否则本文中使用的所有技术术语和科学术语具有与本领域普通技术人员通常理解的相同含义。
附图说明
图1例示了在体外紫杉醇从生长抑素(SST)-人血清白蛋白(HSA)紫杉醇颗粒和Abraxane颗粒的释放曲线。以小时为单位的时间沿X轴，且释放百分比沿Y轴。用菱形(◆)标记的曲线标志着紫杉醇从SST-HSA颗粒的释放。用正方形(■)标记的曲线标志着Abraxane的释放。
具体实施方式
本发明提供了含有至少一种活性剂和包括包围和封装活性剂的聚合物壳的颗粒。可选地，活性剂的一部分暴露于介质或位于聚合物壳的外部。聚合物壳全部或部分地包括生长抑素-白蛋白融合蛋白。在一种实施方式中，生长抑素-白蛋白融合蛋白通过二硫键基本上交联。还可选地将颗粒悬浮在药物相容性运载体(诸如生理上可接受的缓冲溶液)中。
活性剂
本发明颗粒包括一种或多种药物活性成分，其在本文中也可被称为但不限于活性剂、治疗剂或一种或多种活性药物成分(API)。活性剂可以是生理或药物活性物质，其能够在受试者(诸如动物受试者，包括人类)中产生期望的生物效果。术语“活性剂”也旨在涵盖诊断剂或具有营养价值的活性剂。特定剂的选择取决于所需的应用。术语“活性剂”还旨在涵盖在体内转化为活性形式的活性剂的前体，例如，前药或其他前体。活性剂可以是无机化合物或有机化合物，包括肽、蛋白质、核酸和小分子。活性剂可以以多种形式，诸如未改变的分子、分子络合物、药物上可接受的盐，诸如盐酸盐、氢溴酸盐、硫酸盐、月桂酸盐、棕榈酸盐、磷酸盐、亚硝酸盐、硝酸盐、硼酸盐、醋酸盐、马来酸盐、酒石酸盐、油酸盐、水杨酸盐等。对于酸性治疗剂，可使用金属盐、胺盐或有机阳离子盐，例如季铵盐。药物的衍生物，诸如碱、酯和酰胺也可用作活性剂。水不溶性的活性剂可以其水溶性衍生物的形式使用，或作为其碱衍生物使用，其在这两种情况下，或通过其递送，由酶转化、由体pH水解或由其他代谢过程转化为原始的治疗活性形式。
活性剂可以是抗癌剂，诸如化疗剂。活性剂还可以是免疫抑制剂、细胞因子、细胞毒性剂、溶核化合物、放射性同位素、受体、抗炎剂、镇痛剂、抗生素、抗病毒剂、抗真菌剂、抗寄生虫剂和/或其任何组合。
用于包含在本发明颗粒中和/或用于与本发明颗粒共给药的药物活性抗癌剂的实例由美国专利8,173,115列出，通过引用并入本文，并且广泛地包括氮芥、亚硝基脲、亚乙基亚胺、烷基磺酸盐、四嗪、铂类化合物、嘧啶类似物、嘌呤类似物、抗代谢物、叶酸类似物、蒽环类、紫杉烷、长春花生物碱、拓扑异构酶抑制剂和激素剂。
具体的示例性化疗药物包括，例如，放线菌素d、爱克兰(alkeran)、Ara-C(阿糖胞嘧啶)、阿那曲唑(anastrozole)、天冬酰胺酶、卡莫司汀(bicnu)、比卡鲁胺(bicalutamide)、博莱霉素(bleomycin)、白消安(busulfan)、卡培他滨(capecitabine)、卡铂(carboplatin)、碳铂(carboplatinum)、卡莫司汀(carmustine)、CCNU、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、顺铂、克拉屈滨(cladribine)、CPT-11(伊立替康(irinotecan))、环磷酰胺、阿糖胞苷(cytarabine)、胞嘧啶阿拉伯糖苷(cytosine arabinoside)、环磷酰胺、氮烯咪胺(dacarbazine)(DTIC)、更生霉素(dactinomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、右丙亚胺(dexrazoxane)、多西紫杉醇、阿霉素(doxorubicin)、表阿霉素(epirubicin)、亚乙基亚胺、依托泊苷(etoposide)、氟尿苷、氟达拉滨(fludarabine)、氟尿嘧啶、氟他胺(flutamide)、福莫司汀(fotemustine)、吉西他滨(gemcitabine)、赫赛汀(herceptin)、六甲铵(hexamethylamine)、羟基脲、伊达比星(idarubicin)、异环磷酰胺、洛莫司汀(lomustine)、二氯甲基二乙胺(mechlorethamine)、美法仑(melphalan)、巯基嘌呤、甲氨蝶呤、丝裂霉素、米托坦(mitotane)、米托蒽醌(mitoxantrone)、奥沙利铂(oxaliplatin)、紫杉醇、帕米膦酸盐(pamidronate)、喷司他丁(pentostatin)、普卡霉素、甲基苄肼(procarbazine)、利妥昔单抗(rituximab)、链脲佐菌素(streptozocin)、伊马替尼(STI-571、
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)、链脲佐菌素、它莫西芬(tamoxifen)、替莫唑胺(temozolomide)、替尼泊苷(teniposide)、四嗪、硫鸟嘌呤、噻替派(thiotepa)、雷替曲塞(tomudex)、拓扑替康(topotecan)、曲奥舒凡(treosulphan)、三甲曲沙(trimetrexate)、长春花碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨、VP-16和希罗达(xeloda)。
预期包含在本发明颗粒中或与本发明颗粒共给药的有用的抗癌药物还包括烷化剂，诸如噻替派和环磷酰胺；烷基磺酸盐，诸如白消安、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶，诸如苯多巴(benzodopa)、卡巴醌(carboquone)、美妥替哌(meturedopa)和乌瑞替哌(uredopa)；乙撑亚胺(ethylenimine)和甲基蜜胺(methylamelamine)，包括六甲蜜胺(altretamine)、三亚乙基蜜胺(triethylenemelamine)、三亚乙基磷酰胺(triethylenephosphoramide)、三亚乙基硫代磷酰胺(triethylenethiophosphoramide)和三羟甲蜜胺(trimethylolomelamine)；氮芥，诸如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、胆磷酰胺(cholophosphamide)、雌莫司汀(estramustine)、异环磷酰胺(ifosfamide)、二氯甲基二乙胺、盐酸甲氧氮芥(mechlorethamine oxide hydrochloride)、美法仑、新氮芥(novembiehin)、苯芥胆甾醇(phenesterine)、泼尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥(uracil mustard)；硝基脲，诸如卡莫司汀、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫斯汀(nimustine)和雷莫司汀(ranimnustine)；抗生素，诸如阿克拉霉素(aclacinomysin)、放线菌素、安曲霉素(authramycin)、重氮丝氨酸、博莱霉素、放线菌素(cactinomycin)、卡奇霉素(calicheamicin)、卡柔比星(carabicin)、洋红霉素(carminomycin)、嗜癌菌素(carzinophilin)、色霉素(chromoniycin)、更生霉素、柔红霉素、地托比星(detorubicin)、6-重氮基-5-氧亚基-l-正亮氨酸、阿霉素、表阿霉素、依索比星(esorubicin)、伊达霉素(idambicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素、霉酚酸(mycophenolic acid)、诺加霉素(nogalamycin)、橄榄霉素、培洛霉素(peplomycin)、泊非霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素、奎拉霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑菌素、链脲佐菌素、杀结核菌素、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)和佐柔比星(zorubicin)；抗代谢物，诸如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，诸如二甲叶酸(denopterin)、甲氨蝶呤、蝶罗呤(pteropterin)和三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤类似物，诸如氟达拉滨、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤(thiamiprine)和硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，诸如安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷(ancitabine)、6-氮杂尿苷、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷、双脱氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷和5-FU；雄激素，诸如卡鲁睾酮(calusterone)、屈他雄酮(dromostanolone)丙酸酯、环硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)和睾内酯；抗肾上腺，诸如氨鲁米特(aminoglutethimide)、米托坦和曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂，诸如亚叶酸(frolinic acid)；醋葡醛内酯(aceglatone)；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamideglycoside)；氨基乙酰丙酸；安吖啶(amsacrine)；阿莫司汀(bestrabucil)；比生群(bisantrene)；依达曲沙(edatraxate)；地磷酰胺(defofamine)；秋水仙胺(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；elfornithine；依利醋铵(elliptinium acetate)；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；氯尼达明(lonidamine)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌；莫哌达醇(mopidamol)；硝氨丙吖啶(nitracrine)；喷司他丁(pentostatin)；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；鬼臼酸(podophyllinicacid)；2-乙酰肼(2-ethylhydrazide)；甲基苄肼(procarbazine)；PSKTM；丙亚胺；西佐夫兰(sizofrran)；螺旋锗(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亚胺醌(triaziquone)；2,2',2”-三氯三乙胺；氨基甲酸乙酯(urethan)；长春地辛；氮烯咪胺；甘露醇氮芥；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷(pipobroman)；gacytosine；阿拉伯糖苷(“Ara-C”)；环磷酰胺；噻替派；紫杉烷类(taxoids)，例如，紫杉醇(
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Bristol-Myers SquibbOncology,Princeton,N.J.)、多烯紫杉醇(doxetaxel)(
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Rhone-Poulenc Rorer,Antony，法国)和卡巴他赛(
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Sanofi-Aventis)；苯丁酸氮芥；吉西他滨；6-硫鸟嘌呤(6-thioguanine)；巯基嘌呤；甲氨蝶呤；铂类似物，诸如顺铂和卡铂；长春碱；铂；依托泊苷(vp-16)；异环磷酰胺；丝裂霉素c；米托蒽醌；长春新碱；长春瑞滨；诺维本(navelbine)；诺肖林(novantrone)；替尼泊苷；柔红霉素；氨基蝶呤；希罗达；伊班膦酸盐(ibandronate)；cpt-11；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(dmfo)；维甲酸；埃斯培拉霉素(esperamicin)；卡培他滨；以及上述任何的药物上可接受的盐、酸或衍生物。还包括调节或抑制激素对肿瘤作用的抗激素剂，诸如抗雌激素，包括例如它莫西芬、雷罗昔芬(raloxifene)、芳香化酶抑制4(5)-咪唑、4-羟基它莫西芬、曲沃昔芬(trioxifene)、那洛西芬(keoxifene)、奥那斯酮(onapristone)和托瑞米芬(toremifene)(法乐通(fareston))；以及抗雄激素，诸如氟他胺、尼鲁米特(nilutamide)、比卡鲁胺、亮丙瑞林(leuprolide)和戈舍瑞林(goserelin)；以及上述任何的药物上可接受的盐、酸或衍生物。
细胞因子也可以被包括在本发明颗粒中作为一种或多种治疗剂，或与本发明颗粒共给药，例如，用于共同治疗或增强另一治疗剂。这样的细胞因子的实例是淋巴因子、单核因子和传统的多肽激素。
多核苷酸可以被封装在本发明颗粒中作为一种或多种治疗剂。多核苷酸包括但不限于小的或短的干扰RNA(“siRNA”)、微小RNA、RNA、DNA、反义或基因。
传统的多肽激素包括，例如，生长激素，诸如人类生长激素、N-甲硫氨酰基人类生长激素和牛生长激素；甲状旁腺激素；甲状腺素；胰岛素；胰岛素原；松弛素；松弛素原；糖蛋白激素，诸如卵泡刺激素(FSH)、促甲状腺激素(TSH)和黄体生成素(LH)；肝生长因子；成纤维细胞生长因子；催乳素；胎盘催乳素；肿瘤坏死因子α和肿瘤坏死因子β；苗勒(mullerian)抑制物质；小鼠促性腺激素相关肽；抑制素；激活素；血管内皮生长因子；整合素；血小板生成素(TPO)；神经生长因子，诸如NGF-β；血小板生长因子；转化生长因子(TGF)，诸如TGF-α和TGF-β；胰岛素样生长因子I和胰岛素样生长因子II(IGF-I和IGF-II)；前列腺素(PG)；前列腺素E1(PGE1，前列地尔)和前列腺素E2(PGE2，地诺前列酮)；红细胞生成素(EPO)；骨诱导因子；干扰素，诸如干扰素α、干扰素β和干扰素γ；集落刺激因子(CSF)，诸如巨噬细胞CSF(M-CSF)；粒细胞巨噬细胞CSF(GM-CSF)；以及粒细胞CSF(GCSF)；白细胞介素(IL)，诸如IL-1、IL-1a、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-11、IL-12、IL-15；肿瘤坏死因子，诸如TNF-α或TNF-β；以及其他多肽因子，包括LIF和kit配体(KL)。IGF-1的半衰期很短：大约10-20分钟。IGF-1可以被修饰成氨基酸类似物IGF-1 LR3(长的)或IGF-1 DES(截短的)。IGF-1 DES的效力是IGF-1的十倍。包括在这些细胞因子中的是干扰素(IFN)，例如IFNα、IFNβ和IFNγ干扰素，以及本领域已知的它们的重组变体。特别地，重组IFNα2b(
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A)被设想包括在根据本发明的颗粒中，或在某些条件下与本发明颗粒共给药。如本文所用，术语“细胞因子”包括来自天然来源或来自重组细胞培养的蛋白质和天然序列细胞因子的生物活性当量。
例如，干扰素作为某些癌症治疗的部分被给药，诸如胃肠胰神经内分泌肿瘤(GEP-NETS)，以增强生长抑素类似物诸如奥曲肽的益处。根据本发明的颗粒，其包括细胞因子(例如干扰素)，被封装在SST白蛋白融合蛋白壳内，被设想提供增强治疗剂靶向性的额外益处。
优选地，抗癌剂包括水溶性差的紫杉烷(如本文所使用的，术语“紫杉烷”旨在包括紫杉烷类似物和前药，例如，卡巴他赛
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紫杉醇
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和多西紫杉醇(TaxotereTM)。其他紫杉烷类药物也被设想包括在本发明颗粒中，诸如喜树碱及其衍生物。其他优选的抗癌药物包括，例如，胆甾醇对苯乙酸氮芥(phenesterine)、柔红霉素、阿霉素、米托坦、visadine、卤亚硝基脲(halonitrosourea)、anthrocylines、玫瑰树碱(ellipticine)、地西泮(diazepam)等，以及上述任何的药物上可接受的盐、酸或衍生物。
设想包括在本发明颗粒中和/或与本发明颗粒共给药的其他抗癌药物包括以下物质。
经批准用于治疗胰腺癌的药物，诸如盐酸厄洛替尼(erlotinib hydrochloride)、依维莫司(everolimus)、氟尿嘧啶、盐酸吉西他滨、盐酸伊立替康脂质体、丝裂霉素c、紫杉醇白蛋白稳定的纳米颗粒制剂和/或苹果酸舒尼替尼(sunitinib malate)和上述任何的药物上可接受的盐、酸或衍生物。
经批准用于治疗胃肠胰神经内分泌肿瘤的药物，诸如，醋酸兰瑞肽、顺铂和/或依托泊苷，以及上述任何的药物上可接受的盐、酸或衍生物。
经批准用于治疗甲状腺癌的药物，诸如，苹果酸卡博替尼(cabozantinib-s-malate)、盐酸阿霉素(doxorubicin hydrochloride)、甲磺酸乐伐替尼(lenvatinibmesylate)、甲苯磺酸索拉非尼(sorafenib tosylate)和/或凡德他尼(vandetanib)，以及上述任何的药物上可接受的盐、酸或衍生物。
经批准用于治疗垂体癌的药物，诸如，卡麦角林(cabergoline)和/或溴隐亭(bromocriptine)，以及上述任何的药物上可接受的盐、酸或衍生物。
设想包括在本发明颗粒中和/或与本发明颗粒共给药的麻醉剂包括以下剂，诸如甲氧基氟烷(methoxyfluorane)、异氟醚(isofluorane)、烯氟烷(enfluorane)、氟烷、苯佐卡因(benzocaine)、丹曲林(dantrolene)、巴比妥酸盐等，以及上述任何的药物上可接受的盐、酸或衍生物。
设想包括在本发明颗粒中和/或与本发明颗粒共给药的其他药物剂，仅作为实例，包括非甾体抗炎剂，诸如，布洛芬(ibuprofen)、吡罗昔康(piroxicam)、乙酰水杨酸(阿司匹林)、胆碱、水杨酸钠和水杨酸镁、塞来昔布(celecoxib)、双氯芬酸钠/双氯芬酸吡咯烷乙醇盐、二氟尼柳(diflunisal)、依托度酸(etodolac)、非诺洛芬钙(fenoprofen calcium)、氟比洛芬(flurbiprofen)、吲哚美辛(indomethacin)、酮洛芬(ketoprofen)、酮咯酸(ketorolac)、甲氯芬那酸钠(meclofenamate sodium)、甲芬那酸(mefenamic acid)、美洛昔康(meloxicam)、萘丁美酮(nabumetone)、萘普生(naproxen)、萘普生钠、奥沙普秦(oxaprozin)、罗非昔布(rofecoxib)、双水杨酸(salsalate)、舒林酸(sulindac)、托美汀钠(tolmetin sodium)和/或伐地昔布(valdecoxib)，以及上述任何的药物上可接受的盐、酸或衍生物。
设想包括在本发明颗粒中和/或与其共给药的其他药物剂，仅作为实例，包括H2阻断抗酸剂，诸如西咪替丁(cimetidine)、法莫替丁(famotidine)、雷尼替丁(ranitidine)；基本上不溶于水的类固醇地塞米松(dexamethasone)、甲基强的松龙(methylprednisolone)、强的松(prednisone)、可的松(cortisone)、强的松龙(prednisolone)、曲安奈德(triamcinolone)、二氟拉松(diflorasone)、倍他米松(betamethasone)和/或睾酮。
此外，还设想包括在本发明颗粒中和/或与其共给药的是基本上不溶于水的免疫抑制剂，诸如例如，环孢素类、硫唑嘌呤、FK506、强的松、霉酚酸、来氟米特(lefunomide)、特立氟胺(teriflunomide)、他克莫司(tacrolimus)、环孢素、依维莫司和/或西罗莫司(sirolimus)、利伐塞班(rivaroxaban)等。
还设想包括在本发明颗粒中和/或与其共给药的是抗菌剂，诸如抗生素剂、抗病毒剂、抗真菌剂、抗凝血剂、抗血栓形成剂和/或抗寄生虫剂。
例如，抗生素(抗菌)剂包括任何具有杀菌或抑菌作用的分子。包括在术语内的是，例如：经典抗生素，例如，两性霉素B、氯霉素、红霉素、林可霉素(lincomycin)、夫西地酸(fusidic acid)、链霉素、莫西沙星(moxifloxicin)其他氨基糖苷类抗生素、四环素、多粘菌素、磷霉素、万古霉素、利托菌素(ristocetin)、杆菌肽、短杆菌肽(gramacidin)、青霉素和头孢菌素；抗代谢物，例如，磺胺类和甲氧苄啶；以及其他杀菌或抑菌剂，诸如小分子毒素、放射性化合物和核苷类似物。
抗病毒剂包括，例如，碘苷(idoxuridine)、阿昔洛韦(acyclovir)、更昔洛韦(ganciclovir)、金刚烷胺、金刚乙胺、奥司他韦(oseltamivir)、扎那米韦(zanamivir)、奈韦拉平(nevirapine)、地拉韦定(delavirdine)、依法韦仑(efavirenz)、齐多夫定(zidovudine)、地达诺新(didanosine)、扎西他滨(zalcitabine)、司他夫定(stavudine)、拉米夫定(lamivudine)、阿巴卡韦(abacavir)、恩曲他滨(emtricitabine)、安普那韦(amprenavir)、福沙那韦(fosamprenavir)、茚地那韦(indinavir)、利托那韦(ritonavir)、沙奎那韦(saquinavir)、奈非那韦(nelfinavir)、替诺福韦(tenofovir)和/或阿德福韦(adefovir)。
抗真菌剂包括，例如，系统性抗真菌药，诸如两性霉素B、伏立康唑(voriconazole)、泊沙康唑(posaconazole)和/或氟康唑(fluconazole)，以及例如，局部抗真菌药，诸如阿莫罗芬(amorolfine)、布替萘芬(butenafine)、布康唑(butoconazole)、石炭酸复红(carbolfuchsin)、环吡酮(ciclopirox)、氯碘羟喹(clioquinol)、克霉唑(clotrimazole)、益康唑(econazole)、氟康唑、灰黄霉素、伊曲康唑(itraconazole)、酮康唑(ketoconazole)、咪康唑(miconazole)、萘替芬(naftifine)、制霉菌素(nystatin)、奥昔康唑(oxiconazole)、硫康唑(sulconazole)、特比萘芬(terbinafine)、特康唑(terconazole)、噻康唑(tioconazole)和/或托萘酯(tolnaftate)。
抗寄生虫剂包括，例如，阿苯达唑(albendazole)、两性霉素B、依洛尼塞(eflornithine)、烟曲霉素(fumagillin)、美拉胂醇(melarsoprol)、甲硝唑、米替福新(miltefosine)、氯硝柳胺(niclosamide)、硝唑尼特(nitazoxanide)、替硝唑(nitazoxanide)、吡喹酮(praziquantel)、利福平(rifampin)。
设想用于本发明实践中的诊断剂的实例包括超声造影剂、放射性造影剂(例如，碘辛烷、卤代烃、泛影葡胺(renografin)等)、磁性造影剂(例如，碳氟化合物、脂溶性顺磁性化合物、量子点等)，以及其他诊断剂，其在不进行一些物理和/或化学修饰以适应其基本上不溶于水的性质的情况下，则无法轻易被递送。
设想用于本发明实践中的具有营养价值的剂的实例包括氨基酸、糖、蛋白质、碳水化合物、脂溶性维生素(例如，维生素A、D、E、K等)、脂肪、营养品(诸如姜黄素)和/或其组合。
本发明颗粒中包括的剂可以是水不溶性的或基本上是水不溶性的。
本发明的颗粒优选用于体内递送基本上水不溶性的活性剂。如本文所使用的，术语“体内递送”是指通过口服、静脉内、皮下、腹腔内、鞘内、肌肉内、吸入、局部、经皮、栓剂(直肠)、阴道栓(阴道)等给药途径递送药物活性剂。
所包括的剂可以是固体或液体，并且基本上或完全包含在聚合物壳内。
因此，活性剂颗粒是可以包含在具有约1微米到约0.001微米或更小的横截面直径的壳内的纳米颗粒。横截面直径小于0.5微米的纳米颗粒更为优选，而小于0.2微米的横截面直径是目前通过静脉给药途径给药的纳米颗粒的最优选横截面直径。在某些实施方式中，本发明纳米颗粒优选的尺寸范围为约0.05微米到约0.3微米，这取决于纳米颗粒的制备方式和将使用它们的目的。
在另一实施方式中，生长抑素-白蛋白融合蛋白通过形成二硫键而选择性地交联，通过例如在蛋白质的自然结构中出现的氨基酸半胱氨酸。例如，超声工艺用于将含有溶解的或悬浮的药物活性剂的分散剂分散到含有巯基或二硫基的生长抑素-白蛋白融合蛋白的水溶液中，从而在非水性介质的细小液滴周围形成交联的生长抑素-白蛋白融合蛋白的壳。超声工艺在液体中产生空化，引起巨大的局部加热，并导致超氧离子的形成，其通过氧化巯基残基(和/或破坏现有的二硫键)以形成新的交联二硫键来交联聚合物。
生长抑素-白蛋白融合蛋白药物制剂的示例性范围是蛋白质与药物的比率(w/w)为0.01:1至约100:1。更优选地，比率在0.02:1至约40:1的范围内。虽然必须针对不同的蛋白质和药物剂组合优化融合蛋白与药物剂的比率，但通常融合蛋白与药物剂的比率为约18:1或更低(例如，约15:1、约10:1、约5:1或约3:1)。更优选地，该比率为约0.2:1至约12:1。最优选地，该比率为约1:1至约9:1。优选地，该制剂基本上不含
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且更优选地不含Cremophor
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(BASF)。
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是一种非离子乳化剂，其是蓖麻油和环氧乙烷的聚醚。
另一实施方式提供了用于通过溶剂蒸发技术从在高剪切力(例如，超声波、高压均匀化等)条件下制备的水包油乳状液中形成本发明颗粒的方法。这种方法可以在不使用任何传统表面活性剂的情况下进行，且也不使用任何聚合物芯材料来形成颗粒的基质。相反，生长抑素-白蛋白融合蛋白被用作稳定剂。
本发明还提供了用于可重复形成横截面直径小于0.2微米的异常小颗粒(即纳米颗粒)的方法，其可以可选地通过0.22微米过滤器进行无菌过滤。例如，这通过向有机相中添加水溶性溶剂(例如乙醇)，并通过仔细选择有机相的类型、相分数和有机相中的药物浓度来实现。由于含有大量的任何蛋白质(例如白蛋白)的制剂因为蛋白质的热凝固而无法通过诸如高压灭菌的常规方法灭菌，因此能够形成可通过0.22微米过滤器过滤的尺寸的纳米颗粒是有利的。
本发明还提供了药物递送系统，其中药物活性剂分子的一部分结合于生长抑素-白蛋白融合蛋白，并因此在给药至受试者时立即可生物利用。药物活性剂的另一部分包含在由融合蛋白包裹的颗粒内。含有药物活性剂的颗粒作为纯活性成分存在，不被任何聚合物基质稀释。
根据本发明，还提供了粉末形式的亚微米平均横截面直径的纳米颗粒，其易于在水或盐水中重构。粉末是通过冷冻干燥去除水分后获得的。生长抑素-白蛋白融合蛋白作为本发明纳米颗粒的结构成分，且也作为冷冻保护剂和重构辅助剂。根据本文所述的本发明方法，制备可通过0.22微米过滤器过滤的颗粒，然后干燥或冻干，产生可用于静脉注射的无菌固体制剂。
虽然认识到根据本发明产生的颗粒可以是结晶的、非晶的或其混合物，但通常优选的是药物以非晶形式存在于制剂中。这将导致更容易溶解和吸收，从而产生更好的生物利用度。
本发明某些实施方式的生长抑素-白蛋白融合蛋白包括白蛋白的变体，包括人血清白蛋白和/或生长抑素衍生物。本发明另一实施方式的间隔物涵盖在一个末端上共价连接到生长抑素并在另一个末端上共价连接到白蛋白的肽。本发明其他实施方式中的间隔物包括具有2-100个氨基酸的肽序列。
SST融合蛋白
本发明颗粒中使用的生长抑素-白蛋白融合蛋白、用于产生生长抑素-白蛋白融合蛋白的载体和宿主细胞以及蛋白质的纯化方法，由国际申请日为2016年2月26日的共同拥有的国际专利申请No.PCT/US2016/019950，以及于2016年8月26日提交的共同拥有的美国专利申请序列No.15/249,346详细描述。
制备生长抑素-白蛋白融合蛋白及其类似物以包括白蛋白(或其类似物)部分、生长抑素部分(例如SST-14、SST-28)和分开这两部分的间隔物。白蛋白的变体，包括人血清白蛋白和/或生长抑素衍生物，也被视为融合蛋白的一部分。融合蛋白内的间隔物包括大小为约2个至约100个氨基酸残基的肽序列。
在一种实施方式中，所用的融合蛋白包括：
SST；
L；以及
ALB，
其中，
SST是生长抑素或其类似物或衍生物；
L是间隔物或接头；
ALB是白蛋白或其类似物或变体。
在某些实施方式中，从如下式I-X中选择本发明的融合蛋白。
SST-(L)x1-ALB (I)；
ALB-(L)x1-SST (II)；
[SST-(L)x1]y1-ALB (III)；
ALB-[(L)x1-SST]y1 (IV)；
[SST-(L)x1]y1-ALB-[(L)x2-SST]y2 (V)；
[SST-(L)x1]y1-ALB-[(L)x2-SST]y2-(L)x3-ALB (VI)；
[SST-(L)x1]y1-ALB-[(L)x2-SST]y2-(L)x3-ALB-[(L)x4-SST]y3 (VII)；
ALB-(L)x1-[SST-(L)x2]y1-ALB (VIII)；
ALB-(L)x1-[SST-(L)x2]y1-ALB-[(L)x3-SST]y2-(L)x1-ALB (IX)；以及
ALB-(L)x1-[SST-(L)x2]y1-ALB-[(L)x3-SST]y2-(L)x1-ALB-[(L)x4-SST]y3 (X)；
其中，
x1、x2、x3、x4、y1、y2或y3各自独立地为零或从1-10中选择的整数，前提是融合蛋白中存在至少一个L。
在又一实施方式中，所用的白蛋白生长抑素融合蛋白由核苷酸序列编码，该核苷酸序列包括：
SST；
L；以及
ALB，
其中，
SST是生长抑素或其类似物或衍生物；
L是间隔物或接头；
ALB是白蛋白或其类似物或变体。
在某些实施方式中，选择核苷酸序列以编码以下中的白蛋白生长抑素融合蛋白，
SST-(L)x1-ALB (I)；
ALB-(L)x1-SST (II)；
[SST-(L)x1]y1-ALB (III)；
ALB-[(L)x1-SST]y1 (IV)；
[SST-(L)x1]y1-ALB-[(L)x2-SST]y2 (V)；
[SST-(L)x1]y1-ALB-[(L)x2-SST]y2-(L)x3-ALB (VI)；
[SST-(L)x1]y1-ALB-[(L)x2-SST]y2-(L)x3-ALB-[(L)x4-SST]y3 (VII)；
ALB-(L)x1-[SST-(L)x2]y1-ALB (VIII)；
ALB-(L)x1-[SST-(L)x2]y1-ALB-[(L)x3-SST]y2-(L)x1-ALB (IX)；以及
ALB-(L)x1-[SST-(L)x2]y1-ALB-[(L)x3-SST]y2-(L)x1-ALB-[(L)x4-SST]y3 (X)；
其中，
x1、x2、x3、x4、y1、y2或y3各自独立地为零或从1-10中选择的整数，前提是编码白蛋白生长抑素融合蛋白的核苷酸序列中存在至少一个L。
在编码白蛋白生长抑素融合蛋白的核苷酸序列的另一实施方式中，间隔物序列由编码由SEQ ID NO:31或-GGGGS-表示的氨基酸序列的序列组成。
还设想了编码白蛋白生长抑素融合蛋白的核苷酸序列，其包含：
(a)第一区域，包括含有编码人类生长抑素肽的一个或多个相邻重复序列的核苷酸序列；
(b)第二区域，包括编码人血清白蛋白的核苷酸序列或其片段；
(c)间隔物区域，包括编码长度为2-100个残基的多肽的核苷酸序列；
其中，间隔物区域存在于第一区域和第二区域之间，或者存在于第一区域和另一第一区域之间；
其中，编码人类生长抑素肽的一个或多个相邻重复序列编码SST-14或SST-28，分别由SEQ ID NO:17和18表示，或者由与这两个序列中的任何一个序列具有至少85％的同一性的序列表示；或者
其中，间隔物序列由编码由SEQ ID NO:31或GGGGS或由SEQ ID NO:30A(EAAAK)4A表示的氨基酸序列的序列组成；或者
其中，区域(a)由SST-14或SST-28的一个或多个相邻重复组成，分别由SEQ ID NO:23和24表示，或者由与这两个序列中的任何一个序列具有至少85％同一性的序列表示。
在编码白蛋白生长抑素融合蛋白的核苷酸序列的又一实施方式中，第一区域(a)编码与SEQ ID NO:17或18具有至少85％序列同一性的多肽、SST-14、SST-28或其片段。
在编码白蛋白生长抑素融合蛋白的核苷酸序列的另一实施方式中，第二区域(b)编码与SEQ ID NO:19具有至少85％序列同一性的多肽、白蛋白或其片段。
此外，设想本发明使用的融合蛋白包括白蛋白生长抑素融合蛋白，其包含：
(a)第一区域，包括生长抑素肽(其可以是人类生长抑素肽)的多肽序列；
(b)第二区域，包括血清白蛋白(其可以是人血清白蛋白)的多肽序列，或其片段；
(c)间隔物区域，包括长度为2-100个残基的多肽。
间隔物区域(c)可以存在于区域(a)和区域(b)之间或者区域(a)和区域(a)之间。此外，区域(a)可以包括编码SST-14或SST-28的一个或多个串联重复序列，分别由SEQ IDNO:17或18表示，或者由与这些序列中的任何一个序列具有85％同一性的序列表示。
例如，美国专利No.9,296,809描述了制备合适的表达载体和宿主细胞的一般方法，其通过引用并入本文。本发明采用的白蛋白生长抑素融合蛋白的重组表达需要构建包含编码融合蛋白的多核苷酸的表达载体。一旦获得编码白蛋白生长抑素融合蛋白的多核苷酸，可使用本领域众所周知的技术通过重组DNA技术生产用于产生白蛋白生长抑素融合蛋白的载体。因此，本文描述了通过表达包含编码白蛋白生长抑素的核苷酸序列的多核苷酸来制备融合蛋白的方法。本领域已知的方法可用于构建具有适当转录和翻译控制信号的表达载体。这些方法包括，例如，体外重组DNA技术、合成技术和体内基因重组。因此，制备了包含可操作地连接到启动子的编码融合蛋白的核苷酸序列的可复制载体。
将制备的表达载体通过常规技术转染到宿主细胞中，然后通过常规技术培养该转染的细胞以产生白蛋白生长抑素融合蛋白。因此，使用含有可操作地连接到异源启动子的编码白蛋白生长抑素融合蛋白的多核苷酸的宿主细胞。
多种宿主表达载体系统可用于表达白蛋白生长抑素融合蛋白。这种宿主表达系统代表了通过其可产生并随后纯化感兴趣的编码序列的载体，但也代表当用适当的核苷酸编码序列转化或转染时可原位表达白蛋白生长抑素融合蛋白的细胞。宿主系统例如由美国专利No.8,969,538公开。这些包括但不限于微生物，诸如用含有白蛋白生长抑素融合蛋白编码序列的重组噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒(cosmid)DNA表达载体转化的细菌(例如，大肠杆菌(E.coli)、枯草杆菌(B.subtilis))；用含有白蛋白生长抑素融合蛋白编码序列的重组酵母表达载体转化的酵母(例如，酵母菌(Saccharomyces)、毕赤酵母(Pichia))；用含有白蛋白生长抑素融合蛋白编码序列的重组病毒表达载体(例如杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；用重组病毒表达载体(例如，花椰菜花叶病毒，CaMV；烟草花叶病毒，TMV)感染或用含有白蛋白生长抑素融合蛋白编码序列的重组质粒表达载体(例如Ti质粒)转化的植物细胞系统；或哺乳动物细胞系统(例如，COS、CHO、BHK、HEK293细胞、3T3细胞、小鼠Sp2/0细胞)，其含有源于哺乳动物细胞基因组(例如金属硫蛋白启动子)或源于哺乳动物病毒(例如，腺病毒晚期启动子；痘苗病毒7.5K启动子)的启动子的重组表达构建物。除了瞬时转染的哺乳动物细胞外，还包括为表达白蛋白生长抑素融合蛋白的稳定池或稳定细胞系的形式的稳定转染的细胞。
在本发明的特定实施方式中，本发明颗粒包括具有表1的多肽序列(例如，白蛋白生长抑素融合蛋白的多肽序列或表达这种蛋白的质粒构建物)的分离和纯化的白蛋白生长抑素融合蛋白。
Figure BDA0002422083080000251
Figure BDA0002422083080000261
Figure BDA0002422083080000271
对于融合蛋白，例如，SEQ ID NO:1-5、7-10和13-16，应注意，这些被编码为具有22个残基信号肽(SEQ ID NO:20)的前蛋白。
生长抑素-白蛋白融合蛋白
本发明涵盖包括多肽构建物的颗粒，其中生长抑素部分由与内源性人类SST-14或SST-28的核苷酸序列(SEQ ID NO分别为：23和24)具有至少85％的序列同一性的核苷酸编码。
本发明还涵盖包括多肽构建物的颗粒，其中人血清白蛋白部分由与内源性人血清白蛋白的核苷酸序列(SEQ ID NO：25)具有至少85％的序列同一性的核苷酸编码。编码多肽构建物的核苷酸序列也可以可选地与SEQ ID NO：25具有至少90％或95％的序列同一性。本发明还涵盖包括多肽构建物的药物组合物，其中人血清白蛋白部分是内源性人血清白蛋白蛋白质的片段，例如，其通过由SEQ ID NO:25的子序列组成的核苷酸编码。例如，人血清白蛋白片段可选地包括三个人血清白蛋白球状结构域中的一个或多个，每个结构域包含两个子结构域，命名为IA、IB、IIA、IIB、IIIA和IIIB子结构域(Dockal,1999,The Journal OfBiological Chemistry,274(41):29303–29310)。
本发明还涵盖包括多肽构建物的颗粒，其中生长抑素部分具有与内源性SST-14或SST-28的多肽序列(SEQ ID NO分别为：17和18)有至少85％的序列同一性，优选至少90％的序列同一性，更优选至少95％的序列同一性的多肽序列。
本发明还涵盖包括多肽构建物的颗粒，其中人血清白蛋白部分具有与成熟的人血清白蛋白的多肽序列(SEQ ID NO：19)有至少85％的序列同一性、优选至少90％的序列同一性和更优选至少95％的序列同一性的多肽序列。
本发明还涵盖包括融合蛋白的颗粒，该融合蛋白包含信号肽、纯化标签(His-6)、第一接头、人血清白蛋白部分、第二接头和生长抑素部分。在一种实施方式中，融合蛋白是由SEQ ID NO:9或与其具有85％的序列同一性的序列表示的多肽。
本发明还涵盖包括融合蛋白的颗粒，该融合蛋白包含生长抑素部分、第一接头、人血清白蛋白部分、第二接头、生长抑素部分和纯化标签(His-6)。在一种实施方式中，融合蛋白是由SEQ ID NO:10或与其具有85％、90％或95％的序列同一性的序列表示的多肽。
融合蛋白由核苷酸序列(SEQ ID NO:11)编码，该核苷酸序列编码包含由肽间隔物分开的N端人血清白蛋白部分和C端生长抑素部分的融合蛋白。可替换地，核苷酸序列可替换地编码白蛋白生长抑素融合构建物，其具有与SEQ ID NO:11的85％、90％或95％的序列同一性。
核苷酸序列(SEQ ID NO:12)可替换地编码包含由肽间隔物分开的N端生长抑素部分和C端人血清白蛋白部分的融合蛋白。可替换地，核苷酸序列编码白蛋白生长抑素融合构建物，其具有与SEQ ID NO:12的85％、90％或95％的序列同一性。
融合蛋白可替换地包括多肽，其中生长抑素部分包含串联排列的SST-14或SST-28序列的两个或更多个复制，即分别为“(SST-14)2”或“(SST-14)3”或“(SST-28)2”或“(SST-28)3”。可选地，在两个或更多个串联生长抑素部分之间包括接头序列，和/或在融合蛋白的N端包括信号肽序列。
融合蛋白可替换地包括多肽，其中生长抑素部分包含SST-14序列的两个或更多个复制，排列方式为SST14的至少一个复制通过白蛋白分别在两侧连接。可选地，在两个或更多个串联生长抑素部分之间以及生长抑素和白蛋白之间包括接头序列，和/或在融合蛋白的N端包括信号肽序列。例如，多肽构建物可包括信号肽、由间隔物分开的两个SST-14部分、第二间隔物和HSA部分，如所表示的。可选地，构建物省略了N端信号肽。
融合蛋白可选地包括多肽构建物，其中生长抑素部分包含串联排列的SST-28序列的两个或三个复制，即分别为“(SST-28)2”或“(SST-28)3”。可选地，在两个或更多个串联生长抑素部分之间包括接头序列。
融合蛋白可替换地包括包含上述段落中描述的任何白蛋白生长抑素融合蛋白的多肽，其中白蛋白生长抑素融合蛋白具有比内源性SST-14或SST-28肽更长的体内半衰期。
融合蛋白可替换地包括包含上述段落中描述的任何白蛋白生长抑素融合蛋白的多肽，其中白蛋白生长抑素融合蛋白对生长抑素受体的结合亲和性与内源性SST-14或SST-28相比大致相等或更大。
融合蛋白可替换地包括包含白蛋白生长抑素融合蛋白的多肽，其包含由SEQ IDNO:15、SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:2表示的N端白蛋白部分、由SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8表示的内部SST部分和C端白蛋白部分。可选地，N端可进一步包括信号肽。
可选地，白蛋白和SST结构域中的一个或多个可以各自通过由SEQ ID NO:1表示的独立选择的接头序列分开。
在一些实施方式中，SST部分可包括一对或多个串联SST序列，例如(SST-14)2或(SST-28)3，在两个或多个串联SST重复之间具有或不具有干预间隔序列。可选地，一个或多个纯化标签序列可包括在两个部分之间的或者在N端或C端上的序列中，以协助纯化融合蛋白。可替换的实施方式包括由间隔物分开的一对SST-14部分，如由SEQ ID NO:4表示的。另一实施方式可省略纯化标签(例如His6)，如由SEQ ID NO:5表示的多肽序列所示的。
生长抑素
与本发明的融合蛋白一起使用的生长抑素结构域可以是任何合适的生长抑素结构域、其类似物或衍生物。它可以是人类生长抑素，任何其他分离的或自然产生的生长抑素。SST部分可以是类似物，诸如奥曲肽、兰瑞肽、帕瑞肽(pasireotide)、司格列肽(seglitide)、伐普肽(vapreotide)、SST受体1拮抗剂(例如L797-591)、SST受体2拮抗剂(例如L779-976)、BIM23014(奥曲肽)、CH-275(CAS NO.174688-78-9)、SST受体3拮抗剂(例如L796-778)、SST受体4拮抗剂(例如L803 087)和/或SST受体5拮抗剂(例如帕瑞肽，L817818)。
融合蛋白还可以可替换地包括多肽构建物，其中生长抑素部分包含生长抑素类似物。优选地，这种类似物适合作为融合蛋白的一部分在重组宿主细胞中表达。应当理解，可以使用合适的生长抑素类似序列来代替本文公开的任何实例中包括的SST-14或SST-28序列。
可替换地，融合蛋白可以包括多肽构建物，其中生长抑素部分包含生长抑素多肽序列的两个或更多个串联重复，例如SST-14或SST-28；SEQ ID NO分别为:17和18。每一个重复的生长抑素多肽序列都可以是与SST-14或SST-28具有至少85％序列同一性的多肽序列。这些重复的变体序列是独立选择的，即在一些实施方式中重复是相同的，而在其他实施方式中它们是独一无二的。
白蛋白
与本发明一起使用的白蛋白可以是任何白蛋白、其类似物或变体。白蛋白可以是人血清白蛋白、牛或马血清白蛋白、禽卵白蛋白(例如鸡卵白蛋白)和/或任何其他分离的或自然产生的白蛋白或其片段。
可替换地，融合蛋白还可包括多肽，其中人血清白蛋白部分包含多肽序列变体，其由于存在比天然形式更多或更少的半胱氨酸残基而具有可替换的排列或二硫键数目(例如SEQ ID NO:25)。
白蛋白还包括不同的白蛋白变体，诸如前白蛋白：克赖斯特彻奇(Christchurch)型(盖恩斯维尔(Gainesville)，Y-血清3433)、替克夫(Takefu)型、里尔(Lille)型(波利鲍尔(Pollibauer)，东京岛(Tokyshima)，台北)；白蛋白变体：长崎-3(Nagasaki-3)、雅诺马马-2(Yanomama-2)、塔利亚科佐(Tagliacozzo)、帕克兰斯(Parklands)、纳斯卡皮(Naskapi)型(Mersin)、长崎-2、马库(Maku)、墨西哥-2、B、Mi/Fg；链终止(Ge/Ct)等。
间隔物或接头
如早前所述，间隔物或接头可与本发明一起使用。间隔物或接头可独立于生长抑素或白蛋白。
融合蛋白可替换地还包括多肽构建物，其中肽间隔物可替换地称为接头，由长度为约2个至约100个氨基酸残基的多肽序列组成。融合蛋白可替换地涵盖多肽构建物，其中肽间隔物的长度为约2个至约50个氨基酸残基，优选为约2个至约30个氨基酸残基，或更优选为约3个至约20个氨基酸残基。
融合蛋白可替换地包括多肽构建物，其中肽间隔物(可替换地称为接头)具有多肽序列“GGGGS”(SEQ ID NO:31)。富含Gly、Ser或Thr的多肽具有特殊的优势：(i)多肽主链的旋转自由度，使相邻结构域相对于另一结构域自由移动；(ii)增强的溶解度；(iii)对蛋白质水解的抗性。此外，许多天然的接头呈现α螺旋结构。α螺旋结构比富含Gly的接头更为刚性和稳定。具有A(EAAAK)4A序列(SEQ ID NO:30)的经验刚性接头可用于分开功能域。除了将蛋白质结构域连接在一起的作用外，人工接头还可以为融合蛋白的生产提供其他优势，诸如提高生物活性、增加蛋白质表达和获得理想的药代动力学曲线。
Figure BDA0002422083080000321
Figure BDA0002422083080000331
生长抑素-白蛋白融合蛋白的制备
根据本发明使用的生长抑素-白蛋白融合蛋白是通过表达包含将载体引入宿主的基因编码的重组融合蛋白来制备的。例如，融合蛋白是通过在宿主(诸如酵母)中表达而获得的。例如，毕赤酵母GS115可以用作合适的表达宿主，并且用于构建重组表达的载体是pPIC9K。此外，哺乳动物系诸如CHO或HEK293可以用作优选的表达宿主。
还提供了能够表达白蛋白生长抑素融合蛋白的质粒构建物，其包含编码如前述任一段落所述的生长抑素-白蛋白融合蛋白的核苷酸序列。例如，合适的质粒构建物包括但不限于由SEQ ID NO:26表示的pcDNA3.1载体，其DNA序列编码本文公开的任何白蛋白生长抑素融合蛋白，连接到该载体的多个克隆位点中。本领域已知的其他合适的蛋白质表达载体可以基于表达宿主来选择(例如，具有哺乳动物启动子系统的表达载体将适合在人类细胞系中表达，而如果希望在酵母或细菌这些生物体中的任一种中表达，则将选择酵母或细菌表达质粒)。
还提供了细菌或酵母蛋白质表达系统，包括用包含编码生长抑素-白蛋白融合蛋白的核苷酸序列的质粒构建物转化的细菌细胞或酵母细胞，如前述任一段落所述的。合适的细菌菌株包括，例如大肠杆菌。合适的酵母菌株包括，例如毕赤酵母。示例性质粒构建物包括pPIC9K(Invitrogen)，如SEQ ID NO:27所表示的，其核苷酸序列编码本文所述的任何白蛋白生长抑素融合蛋白，并入载体的多个克隆位点中。
还提供了分离的和纯化的融合生长抑素融合蛋白，具有如前面任一段落中所述的多肽序列。
Figure BDA0002422083080000341
当SST是生长抑素类似物时，可以使用本领域已知的可替换的方法来制备缀合物。这种可替换的方法可选地是通过化学合成、肽的化学修饰、蛋白质合成期间的非天然氨基酸掺入等。
设计了十一个具有不同接头序列的SST14白蛋白融合蛋白构建物。这些构建物中的八个在质粒内被制成融合基因，并由HEK 293在100mL范围内瞬时表达而产生。从培养基中收集蛋白质，通过基于白蛋白的亲和纯化而纯化，并透析到存储缓冲液。评估这些融合蛋白与SSTR2受体的结合亲和性，以及评估抑制SSTR2过度表达CHO-K1细胞系中cAMP产生的基于细胞的活性。这些研究结果表明，接头的长度和类型对SSTR2受体结合亲和性、体外基于细胞的功能活性和融合蛋白生产产量有显著影响。
与相应的未融合SST分子相比，SST白蛋白融合蛋白在体外和/或体内具有更长的血清半衰期和/或在溶液或药物组合物中的活性更稳定。例如，在大鼠血浆中，90％以上的SST融合蛋白在温育40分钟后被检测到，以及70％以上的SST融合蛋白保持最长至少180min。在相同条件下，温育40分钟后仍保持不到约50％的游离SST，且超过120分钟后未检测到游离SST。大鼠血浆SST融合蛋白浓度的测定表明，SST融合蛋白的浓度缓慢下降，T1/2为～6小时，相比之下，仅SST的血浆浓度显示的T1/2为几分钟。因此，SST融合蛋白在血浆中的浓度达到零浓度需要约72小时。
此外，与相应的未融合的游离SST分子相比，SST白蛋白融合蛋白在体外和/或体内表现出显著更长的血清半衰期和/或在溶液或药物组合物中改善的药代动力学曲线。比较体外大鼠血浆中游离SST和SST融合蛋白的稳定性。当在37℃下于新鲜制备的大鼠血浆中温育时，游离SST和SST融合蛋白显示的降解半衰期分别为33分钟和5.5小时。
还生成了体内药代动力学曲线以证明SST融合蛋白相对于游离SST的改善的稳定性。静脉给药SST融合蛋白的大鼠表现出双相药代动力学曲线，其中α相T1/2为1.01小时，以及β相T1/2为6.14小时。在大鼠中，计算的半衰期明显长于游离SST的已报告的血浆T1/2(<1分钟；Yogesh C.Patel and Thomas Wheatley.In Vivo and in Vitro PlasmaDisappearance and Metabolism of Somatostatin-28 and Somatostatin-14 in theRat.Endocrinology.Vol.112,No.1(1992),pages 220-225)。
本发明颗粒的制备及应用
因此，本发明颗粒被设想用于诊断或治疗已知所封装的活性剂对其有效的任何病症。为了治疗癌症，本发明被设想涵盖通过给药本发明颗粒来治疗人类受试者中的癌症的方法，如前面任一段落中所述的，其中癌症选自例如，乳腺癌、结直肠癌、肝癌、肺癌、内分泌癌、神经内分泌癌、胰腺癌和前列腺癌。
例如，可通过下述方法制备颗粒。
白蛋白融合蛋白的颗粒可以通过几种不同的制备方法而生成，包括但不限于均匀化、乳化或化学交联，通过添加有机溶剂并在高温下稳定或者扩散。白蛋白融合蛋白的颗粒还可以包括作为运载体的一部分的其他物质，包括但不限于，可生物降解聚合物、不可降解聚合物、脂质、油等。可生物降解聚合物包括但不限于，生物多酯(诸如聚(乳酸-co-乙醇酸)/PLGA、聚乳酸/PLA、聚乙醇酸/PGA、聚己内酯/PCL、甲氧基聚(乙二醇)-嵌段-聚-L-乳酸/MPEG-L-PLA、甲氧基聚(乙二醇)-嵌段-聚-DL-乳酸/MPEG-DL-PLA、甲氧基聚(乙二醇)-嵌段-聚(ε-己内酯)/MPEG-PEG-PCL、聚乙二醇-b-聚{N'-[N-(2-氨基乙基)-2-氨基乙基]天冬酰胺}/PEG-PAsp(DET)、聚羟基丁酸酯、多糖和蛋白质。白蛋白融合蛋白形成的颗粒通常为纳米颗粒或微球，即对于纳米颗粒的直径，其横截面直径为约0.001μm至约1μm，且对于微球的直径，其横截面直径为1μm(1微米)至约1000μm。在一种实施方式中，该尺寸范围对于这些纳米颗粒和微球的生物分布或药代动力学特性非常重要。直径小于100-200nm的较小颗粒通常被网状内皮系统(RES)吸收，并在肝和脾以及实体肿瘤中积聚。直径为5-100μm的较大颗粒，通常以毛细血管床为靶标。当注射到某些组织中时，这些直径为5-100μm的颗粒提供延长释放，例如在患者的手臂三角肌、大腿股外侧肌、髋部腹侧黄体肌和臀部背侧黄体肌中。本发明的白蛋白融合蛋白微球可携带治疗剂或诊断剂，包括小分子和高分子二者。
大体上，本发明的微球通过以下制备：
1.使用高压均匀法制备SST-HSA蛋白结合紫杉醇颗粒。
SST-HSA溶液是通过将SST-HSA蛋白原液加入去离子(DI)水中制备的。将10mg紫杉醇溶于氯仿中，并在均匀化的同时加入到SST-HSA溶液以形成SST-HSA蛋白与紫杉醇比率为10:1(w/w)的乳状液。然后，将乳状液转移到旋转蒸发器中以去除有机溶剂，并然后进行冻干工艺。然后将SST-HSA/紫杉醇粉末在0.9％盐水中重构，并通过过滤进一步分级。分级用来测量颗粒的尺寸。例如，制备生产出的三种分级具有的粒径的Z平均直径为86nm(43-122nm的范围)、164nm(79-190nm的范围)和235nm(106-295nm的范围)，如由Malvern ZetaSizer所测量的。
2.使用高压均匀法制备SST-HSA/HSA蛋白结合紫杉醇纳米颗粒
通过将SST-HSA蛋白原液和HSA按SST-HSA:HSA＝1:9-1:19的比率加入水中，制备SST-HSA/HSA溶液的混合物。首先将紫杉醇溶于氯仿中，并在均匀化同时加入SST-HSA/HSA溶液以形成SST-HSA和HSA与紫杉醇比率为10:1(w/w)的乳状液。然后，将乳状液转移到旋转蒸发器中以去除有机溶剂，然后进行冻干工艺。然后将SST-HSA/HSA/紫杉醇粉末在0.9％盐水中重构以测量粒径。例如，制备生产出三种分级，其具有的Z平均粒径为206nm(78-220nm的范围)(SST-HAS:HSA＝1:9)和177nm(68-164nm的范围)(SST-HSA:HSA＝1:19)，如由Malvern Zeta Sizer所测量的。
3.使用高压均匀法制备SST-HSA蛋白结合多西紫杉醇纳米颗粒
通过将SST-HSA蛋白原液加入DI水中制备SST-HSA溶液。多西紫杉醇溶于氯仿。在均匀化的同时将多西紫杉醇溶液加入SST-HSA溶液中以形成乳状液。然后将均匀的乳状液转移到旋转蒸发器中以去除有机溶剂。然后将最后的分散液通过0.8μm注射器过滤器过滤并冻干。在0.9％盐水溶液中测量了重组纳米颗粒的尺寸。分级用来测量颗粒的尺寸。例如，制备生产出的三种分级具有的纳米颗粒的Z平均直径尺寸为113nm或0.113μm(68-295nm的范围)，如由Malvern Zeta Sizer所测量的。
还设想给药本发明的颗粒以治疗携带生长抑素受体的癌症和/或生长抑素类似物被认为提供有效治疗的癌症，例如，胃肠道内分泌肿瘤、生长激素(GH)分泌垂体肿瘤、转移性内分泌肿瘤，诸如胰腺肿瘤和类癌。包含一个或多个白蛋白生长抑素融合蛋白的聚合物壳将选择性地结合于并靶向那些表达活性生长抑素受体的肿瘤细胞，从而增强颗粒的选择性。生长抑素及其类似物常常抑制这种肿瘤细胞。已知显示生长抑素受体并对SST治疗有响应的癌症一般包括神经内分泌肿瘤。例如，这些包括的肿瘤诸如类癌、胰岛细胞癌、胰高血糖素瘤、胃泌素瘤、胰岛素瘤、血管活性肠肽瘤(VIPomas)和甲状腺髓样癌。这种特性的代谢基础是通过肿瘤神经内分泌细胞在细胞内吸收胺并使胺脱羧基的能力(Kvols,等人,1992,The Yale Journal of Biology And Medicine65,505-518)。
本发明还涵盖通过给药含有本发明的融合蛋白的组合物(诸如如前述任一段落中所述的分离的和纯化的白蛋白生长抑素融合蛋白)治疗人类受试者癌症的方法。该组合物还可以包括合适的运载体。
因此，本发明还涵盖用颗粒融合蛋白形式的生长抑素类似物以及作为所给药的纳米颗粒有效载荷的任何抗癌剂二者来治疗生长抑素响应性肿瘤。
任何适当的方法可用于给药包含本发明颗粒的组合物。例如，包含本发明颗粒的组合物可以经注射(例如，皮下注射、肌肉注射、静脉注射或鞘内注射或通过直接灌注是器官或者潜在或实际体腔)来给药。
在向受试者给药包含本发明颗粒的组合物之前，可对受试者进行评估，以确定受试者是否具有适合所给药颗粒类型的临床病症或诊断需要(例如癌症)。技术人员可以容易地确定受试者是否应该接受这种组合物。例如受试者(例如人类)可以使用标准的诊断技术被确定患有癌症。
在确定受试者患有本发明颗粒为适当治疗方式所针对的临床病症后，可给药受试者包含适当颗粒的组合物。
本发明还涵盖治疗生长抑素响应性内分泌癌或其他类型的癌症，其通过递送额外的抗癌剂(不是制成颗粒的一部分)来提供对此类癌症的增强或协同治疗。
包括含有药物活性成分的本发明颗粒的组合物的有效量可以是允许在受试者中产生临床有效结果的任何量，其中结果是适合于药物活性成分的结果。当药物活性成分为抗癌剂时，由技术人员临床确定有效量为降低癌症进展率、增加无进展生存率或增加进展中位时间而不会对受试者产生显著毒性的量。通常，含有并递送紫杉醇的颗粒的有效量可以是受试者的约50mg/m2至约150mg/m2(例如约80mg/m2)。如果特定的受试者对特定的量没有响应，那么颗粒的量可以增加例如两到三倍。在接受这种较高浓度后，可以监测受试者对治疗的响应性和毒性症状，并作出相应的调整。给药量可以保持恒定，或者可以根据受试者对治疗的响应在滑动量表或可变剂量上进行调整。各种因素可以影响用于特定应用的实际有效量。例如，给药频率、治疗持续时间、多种治疗剂的使用、给药途径和癌症的严重程度可能需要增加或减少实际给药的有效量。
本发明颗粒的给药频率可以是产生或保持临床有效性的任何频率。在抗癌剂的例子中，频率优选地是降低癌症的进展率、增加无进展生存率或增加进展的中间时间而不会对哺乳动物产生显著毒性的频率。例如，给药频率可以从约每月一次至约每月三次，或者从约每月两次至约每月六次，或者从约每两个月一次至约每两个月三次。给药频率可以保持恒定，或者可以在治疗期间变化。用包括含有紫杉醇的颗粒的组合物的治疗过程可以包括休息期。例如，含有紫杉醇的颗粒的组合物可以在两周内给药，然后是两周的休息期，且这样的方案可以重复多次。与有效量一样，各种因素可以影响用于特定应用的实际给药频率。例如，有效量、治疗持续时间、多种治疗剂的使用、给药途径和癌症的严重程度可能需要增加或减少给药频率。
用于给药包括本文提供的本发明颗粒的组合物的有效持续时间可以是产生临床响应的任何持续时间。当颗粒含有抗癌剂时，持续时间是降低癌症进展率、增加无进展生存率或增加进展中间时间而不会对受试者产生显著毒性的持续时间。因此，有效持续时间可以从几天到几周、几个月或几年不等。一般来说，治疗癌症的有效持续时间可以从持续几周到几个月不等。在某些情况下，有效持续时间可以是和个体受试者活着的时间一样长。多种因素可以影响特定治疗所采用的实际有效持续时间。例如，有效持续时间可以随给药频率、有效量、多种治疗剂的使用、给药途径和癌症的严重程度而变化。
含有本发明颗粒的组合物可以是任何适当形式。例如，本文提供的组合物可以是溶液或粉末形式，具有或不具有稀释剂以制备可注射悬浮液。该组合物还可以包括附加成分，包括但不限于药物上可接受的承载体。药物上可接受的承载体可以是，例如，盐水、水、乳酸、甘露醇或其组合。
向受试者给药本文提供的组合物后，可监测受试者以确定临床病症(例如癌症)是否得到有效治疗。例如，治疗后可以对受试者进行评估，以确定癌症的进展率是否降低或停止。如本文所述，任何现有技术已知的方法可用于评估进展和存活率。
在一些情况下，在受试者群体的8周无进展生存率为65％或比在没有接受包括含有抗癌剂的颗粒的组合物的可比较的受试者群体中观察到的更高(例如，66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％或更高)的情况下，可向患有癌症的受试者给药包括含有抗癌剂的本发明颗粒的组合物。在一些情况下，在受试者群体的进展中间时间为至少150天(例如，至少155天、160天、163天、165天或170天)的情况下，可将包括含有抗癌剂的颗粒的组合物给药于患有癌症的受试者。
通过向受试者给药组合物并确定诊断剂是否是可检测的且是否与该诊断剂用于的疾病、疾患或病症相关，技术人员容易地确定包括含有诊断剂的本发明颗粒的组合物的有效量。
可生物降解聚合物、PEG、磷脂和脂质
与生长抑素-白蛋白融合蛋白结合，许多生物相容性聚合物可用于形成包围基本上不溶于水的药物活性剂的聚合物壳。本质上，任何在其结构内含有巯基或二硫键的天然的或合成的聚合物可用于制备围绕药物活性剂颗粒的二硫交联的壳。巯基或二硫键可能预先存在于聚合物结构内，或者可能通过适当的化学修饰将它们引入。例如天然聚合物，诸如蛋白质、寡肽、多核酸、多糖(例如，淀粉、纤维素、右旋糖酐、海藻酸盐、壳聚糖、果胶、透明质酸等)等，是此类修饰的候选者。
作为合适的生物相容性聚合物的实例，可以使用天然存在的或合成的蛋白质，只要这些蛋白质在其氨基酸序列内有足够的半胱氨酸残基(即巯基或二硫基)，以便交联(例如，通过二硫键形成，作为在超声波作用或超声波辐照期间的氧化的结果)可以发生。合适的蛋白质的实例包括白蛋白(其包含35个半胱氨酸残基)、胰岛素(其包含6个半胱氨酸)、血红蛋白(其每α2β2单位包含6个半胱氨酸残基)、溶菌酶(其包含8个半胱氨酸残基)、免疫球蛋白、α-2-巨球蛋白、纤维连接蛋白、玻连蛋白、纤维蛋白原等。其他键合，诸如酯、酰胺、醚等，也可以在超声辐照步骤期间形成(只要起始材料上存在必需的官能团)。
可与白蛋白融合蛋白一起并入微球和/或纳米颗粒中的可生物降解聚合物包括但不限于，生物多酯(诸如聚(乳酸-co-乙醇酸)/PLGA、聚乳酸/PLA、聚乙醇酸/PGA、聚己内酯/PCL、甲氧基聚(乙二醇)-嵌段-聚-L-乳酸/MPEG-L-PLA、甲氧基聚(乙二醇)-嵌段-聚-DL-乳酸/MPEG-DL-PLA、甲氧基聚(乙二醇)-嵌段-聚(ε-己内酯)/MPEG-PEG-PCL、聚乙二醇-b-聚{N'-[N-(2-氨基乙基)-2-氨基乙基]天冬酰胺}/PEG-PAsp(DET)、聚羟基丁酸酯、多糖和蛋白质。
聚合物还包括一些PEG衍生物，诸如单官能线性PEG、双官能PEG、多臂PEG、支化PEG、杂官能PEG、叉型PEG等。
磷脂和脂质也可用于微球和纳米颗粒。
脂质包括来自天然源的纯化磷脂(诸如氢化大豆磷脂酰胆碱/HSPC、氢化卵磷脂酰胆碱/HEPC、卵鞘磷脂)、纯化合成磷脂(1,2-二癸酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱/DDPC、1,2-二月桂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱/DLPC、1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱/DMPC、1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱/DPPC、1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱/DSPC、1,2-二亚油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱/DLoPC、1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱/DOPC、1,2-二芥酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱/DEPC、1-肉豆蔻酰-2-棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱/MPPC、1-肉豆蔻酰-2-硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱/MSPC、1-棕榈酰-2-肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱/PMPC、1-棕榈酰-2-硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱/PSPC、1-肉豆蔻酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱/MOPC、1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱/POPC、1-硬脂酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱/SOPC、1-肉豆蔻酰-2-赖氨酸-sn-甘油-3-磷酸胆碱/M-LysoPC、1-棕榈酰-2-赖氨酸-sn-甘油-3-磷酸胆碱/P-LysoPC、1-硬脂酰-2-赖氨酸-sn-甘油-3-磷酸胆碱/S-LysoPC、1-油酰-2-赖氨酸-sn-甘油-3-磷酸胆碱/O-LysoPC、非氢化卵磷脂酰甘油、钠盐/MPG-Na、1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸甘油、钠盐/DMPG-Na、1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸甘油、铵盐/DMPG-NH4、1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸甘油、钠盐/DPPG-Na、1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸甘油、铵盐/DPPG-NH4、1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸甘油、钠盐/DSPG-Na、1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸甘油、铵盐/DSPG-NH4、1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸甘油、钠盐/DOPG-Na、1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸甘油、钠盐/POPG-Na、1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷脂酸、钠盐/DMPA-Na、1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷脂酸、钠盐/DPPA-Na、1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷脂酸、钠盐/DSPA-Na、非氢化卵磷脂酰乙醇胺/EPE、1,2-二月桂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺/DLPE、1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺/DMPE、1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺/DPPE、1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺/DSPE、1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺/DOPE、1,2-二亚油酰酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺/DLoPE、1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺/POPE、1,2-二芥酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺/DEPE、1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸-L-丝氨酸、钠盐/DMPS-Na、1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸-L-丝氨酸、钠盐/DPPS-Na、1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸-L-丝氨酸、钠盐/DSPS-Na、1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸-L-丝氨酸、钠盐/DOPS-Na、1-棕榈酰-2-油酰-sn-3-磷酸-L-丝氨酸、钠盐/POPS-Na，)，聚乙二醇化脂质(诸如N-(羰基甲氧基聚乙二醇2000)-1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、钠盐/DSPE-PEG2000、N-(羰基甲氧基聚乙二醇5000)-1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、钠盐/DSPE-PEG 5000、N-(羰基甲氧基聚乙二醇2000)-1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、钠盐/DPPE-PEG 2000、N-(羰基甲氧基聚乙二醇2000)-1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、钠盐/DMPE-PEG 2000、1,2-二硬脂酰-sn-甘油、甲氧基聚乙二醇/DSG-PEG 5000、1，2-二硬脂酰-sn-甘油、甲氧基聚乙二醇/DSG-PEG 2000、1,2-二棕榈酰-sn-甘油、甲氧基聚乙二醇/DPG-PEG 2000、1,2-二油酰-sn-甘油、甲氧基聚乙二醇/DOG-PEG 2000、1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油、甲氧基聚乙二醇/DMG-PEG 2000、N-(羰基甲氧基聚乙二醇2000)-1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、钠盐/DPPE-PEG 5000、N-[羰基-2',3'-双(甲氧基聚乙二醇2000)]-1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、钠盐/DSPE-2臂PEG 2000、N-[羰基-2',3'-双(甲氧基聚乙二醇5000)]-1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、钠盐/DSPE-2臂PEG 5000、1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油、甲氧基聚乙二醇/DMG-PEG 5000、1,2-二棕榈酰-sn-甘油、甲氧基聚乙二醇/DPG-PEG 5000、1,2-二油酰-sn-甘油、甲氧基聚乙二醇/DOG-PEG 5000)、官能化磷脂(诸如N-(3-马来酰亚胺-1-氧丙基)-L-α-磷脂酰乙醇胺、二肉豆蔻酰/DMPE-MAL、N-(3-马来酰亚胺-1-氧丙基)-L-α-磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰/DPPE-MAL、N-(3-马来酰亚胺-1-氧丙基)-L-α-磷脂酰乙醇胺、二硬脂酰/DSPE-MAL、N-(3-马来酰亚胺-1-氧丙基)-L-α-磷脂酰乙醇胺、1-棕榈酰-2-油酰/POPE-MAL、N-(琥珀酰亚胺氧基-戊二酰)-L-α-磷脂酰乙醇胺、二油酰/DOPE-NHS、N-戊二酰-L-α-磷脂酰乙醇胺、二硬脂酰/DMPE-Glu、N-戊二酰-L-α-磷脂酰乙醇胺、二肉豆蔻酰/DPPE-Glu、N-戊二酰-L-α-磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰/DSPE-Glu、N-戊二酰-L-α-磷脂酰乙醇胺、二硬脂酰/DSPE-Glu、N-戊二酰-L-α-磷脂酰乙醇胺、二油酰/DOPE-Glu、N-戊二酰-L-α-磷脂酰乙醇胺、1-棕榈酰-2-油酰/POPE-Glu、N-(氨基丙基聚乙二醇)氨甲酰-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺/DSPE-PEG-NH2、N-[(3-马来酰亚胺-1-氧丙基)氨丙基聚乙二醇-氨甲酰]二硬脂酰磷脂酰-乙醇胺/DSPE-PEG-MAL、3-(N-琥珀酰亚胺氧基戊二酰)氨丙基、聚乙二醇-氨甲酰二硬脂酰磷脂酰乙醇胺/DSPE-PEG-NHS、N-(3-氧丙氧基聚乙二醇)氨甲酰-二硬脂酰-乙醇胺/DSPE-PEG-ALD、1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-(7-硝基-2-1,3-苯并噁二唑-4-基)[三乙胺盐]/NBD-DPPE、1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-(5-二甲氨基-1-萘磺酰)[三乙胺盐]/丹磺酰-DPPE、N-[3-(2-吡啶基二硫代)-1-氧丙基]-L-α-磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰/DPPE-PDP、N-(琥珀酰亚胺氧基-戊二酰)-L-α-磷脂酰乙醇胺、二硬脂酰/DSPE-NHS、N-(3-马来酰亚胺-1-氧丙基)-L-α-磷脂酰乙醇胺、二油酰/DOPE-MAL、N-(琥珀酰亚胺氧基-戊二酰)-L-α-磷脂酰乙醇胺、二肉豆蔻酰/DMPE-NHS、N-(琥珀酰亚胺氧基-戊二酰)-L-α-磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰/DPPE-NHS、N-(琥珀酰亚胺氧基-戊二酰)-L-α-磷脂酰乙醇胺、1-棕榈酰-2-油酰/POPE-NHS)、新脂类和阳离子脂类(诸如氯化1,2-二油酰氧基-3-三甲基铵丙烷/DOTAP、氯化1,2-二油烯氧基-3-三甲基铵丙烷/DOTMA、1,2-二油酰氧基-3-二甲氨基丙烷/DODAP、1,2-二油烯氧基-3-二甲氨基丙烷/DODMA)、聚甘氨酸-磷脂(诸如DSPE-聚甘氨酸-环己基-羧酸、DSPE-聚甘油-2-甲基戊二-羧酸)、SS-可切割的和pH-响应性类脂物质(诸如
Figure BDA0002422083080000441
SS-14/3AP-01、
Figure BDA0002422083080000442
SS-33/3AP-05、
Figure BDA0002422083080000443
SS-33/4PE-15、
Figure BDA0002422083080000451
SS-20/3AP-04)、一些其他赋形剂(诸如
Figure BDA0002422083080000452
MB系列NOFABLE系列
Figure BDA0002422083080000453
DKH-02HB、DKH-03HB和DKH-04HB(MACROGOL PEG200、300和400)
Figure BDA0002422083080000454
OE系列(生物相容性PEGAnchors))。
其他组分
根据本发明的聚合物壳可选地包括除白蛋白生长抑素基融合蛋白之外的其他组分。例如，聚合物壳包括可变量的常规或变体白蛋白或其片段，并且优选地，可以包括任何类型的人血清白蛋白。
可选地，蛋白质，诸如α-2-巨球蛋白，一种已知的调理素，被包括在壳组合物中，以增强巨噬细胞样细胞对药物活性剂的壳包颗粒的摄取，或者以增强壳包颗粒进入肝脏和脾脏的摄取。
类似地，含有半胱氨酸残基(巯基或二硫基)的合成多肽对于在药物活性剂上形成壳也是良好的候选者。此外，聚亚烷基二醇(例如直链或支链)、聚乙烯醇、聚羟乙基甲基丙烯酸酯、聚丙烯酸、聚乙基噁唑啉、聚丙烯酰胺、聚乙烯吡咯烷酮等，是化学修饰(以引入巯基和/或二硫键)和形成壳(通过引起其交联)的良好候选者。因此，例如，本发明实践中预期使用的物质是诸如含有半胱氨酸残基和/或二硫基的合成多氨基酸；经修饰以含有游离巯基和/或二硫基的聚乙烯醇；经修饰以含有游离巯基和/或二硫基的聚羟乙基甲基丙烯酸酯；经修饰以含有游离巯基和/或二硫基的聚丙烯酸；经修饰以含有游离巯基和/或二硫基的聚乙基噁唑啉；经修饰以含有游离巯基和/或二硫基的聚丙烯酰胺；经修饰以含有游离巯基和/或二硫基的聚乙烯吡咯烷酮；经修饰以含有游离巯基和/或二硫基的聚亚烷基二醇；经修饰以含有游离巯基和/或二硫基的聚乳酸、聚乙交酯、聚己内酯或其共聚物；以及其任何两种或更多种以上的混合物。
其他功能蛋白，诸如抗体或酶，其有助于将药物组合物靶向所需位点，可选地用于形成聚合物壳。
用于携带或悬浮本发明颗粒的生物相容性水溶液可选自，例如，水、盐水、含有适当缓冲液的溶液、含有营养剂(诸如氨基酸、糖、蛋白质、碳水化合物、维生素或脂肪)的溶液等。
药物组合物的制备方法
在另一实施方式中，本发明提供了制备药物组合物的方法，包括使含有药物活性剂和生长抑素-白蛋白融合蛋白的混合物经受促进生长抑素-白蛋白融合蛋白通过二硫键交联的条件。
该方法包括，例如，使混合物经受包括：
含有分散在其中的所述药物活性剂的有机相，以及含有生物相容性聚合物的水介质，
其中，所述混合物包含表面活性剂，或可选地，基本上不包含表面活性剂，以在高压均质机中均匀化。
可选地，有机相和/或水相在经受高剪切条件后从混合物中去除。
可选地，使用分散剂来悬浮或溶解药物活性剂。本发明实践中预期使用的分散剂包括能够悬浮或溶解药物活性剂而不与用于生产壳的聚合物或与药物活性剂本身发生化学反应的任何非水液体。实例包括植物油(例如，大豆油、矿物油、玉米油、菜籽油、椰子油、橄榄油、红花油、棉籽油等)，具有4-30个碳原子的脂肪族、环脂族或芳香族碳氢化合物(例如，正十二烷、正癸烷、正己烷、环己烷、甲苯、苯等)，具有2-30个碳原子的脂肪族或芳香族醇(例如辛醇等)，具有1-30个碳原子的脂肪族或芳香族酯(例如辛酸乙酯(辛酸酯)等)，具有2-30个碳原子的烷基、芳基或环醚(例如，二乙醚、四氢呋喃等)，具有1-30个碳原子(和可选地一个以上的卤素取代基，例如，CH3Cl、CH2Cl2、CH2Cl--CH2Cl等)的烷基或芳基卤化物，具有3-30个碳原子的酮类(例如，丙酮、甲基乙基酮等)，聚亚烷基二醇(例如聚乙二醇等)或其任何两个或更多个的组合。
分散剂/有机介质的特别优选的组合通常具有不大于约200℃的沸点，并且包括挥发性液体，诸如二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯、苯等(即对药物活性剂具有高度溶解性并可溶于所用的其他分散剂的溶剂)，以及分子量较高(挥发性较低)的分散剂。当添加到其他分散剂时，这些挥发性添加剂有助于驱动药物活性剂溶解到分散剂中。这是期望的，因为这一步通常很耗时。溶解后，通过蒸发(可选地在真空下)可去除挥发性成分。
如本文所述制备的基本上包含在聚合物壳内或与其相关联的药物活性剂颗粒，被不掺杂地递送，或者可选地作为悬浮液递送到生物相容性介质中。该介质可选自水、缓冲水介质、盐水、缓冲盐水、氨基酸的可选缓冲溶液、蛋白质的可选缓冲溶液、糖的可选缓冲溶液、碳水化合物的可选缓冲溶液、维生素的可选缓冲溶液、合成聚合物的可选缓冲溶液、含脂乳状液等。
根据本发明的另一实施方式，提供了用于体内递送的药物活性剂的制备方法，该方法包括将含有生长抑素-白蛋白融合蛋白和药物活性剂的介质经受高强度超声条件足够长的时间，以促进生物相容性物质通过二硫键的交联。药物活性剂可基本上完全包含在聚合物壳内。所述壳的最大横截面尺寸可以不大于约10微米，且优选不大于约0.2微米。
根据本发明的另一实施方式，生长抑素-白蛋白融合蛋白可由于暴露于高压均质机中的高剪切条件而被交联。高剪切用于将含有溶解的或悬浮的药物活性剂的分散剂分散到融合蛋白的水溶液中，从而在非水介质的细滴周围形成交联的聚合物壳。高剪切条件在液体中产生空化。空化引起局部加热并导致形成能够交联融合蛋白的超氧离子，例如，通过氧化巯基残基(和/或破坏现有的二硫键)以形成新的交联二硫键。
因此，根据本发明，药物活性剂溶于适当的溶剂(例如，氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯、乙醇、四氢呋喃、二氧六环、乙腈、丙酮、二甲基亚砜、二甲基甲酰胺、甲基吡咯烷酮等，以及其任何两种或更多种的混合物)中。本发明实践中预期使用的其他溶剂包括大豆油、椰子油、橄榄油、红花油、棉籽油、芝麻油、橙油、柠檬烯油、C1-C20醇、C2-C20酯、C3-C20酮、聚乙二醇、脂肪烃、芳香烃、卤代烃及其组合。
聚合物(例如聚乳酸)可以不溶于溶剂中。用于制备本发明组合物的油相可仅含有溶于溶剂中的药物活性剂。
接着，(在水相中)添加生长抑素-白蛋白融合蛋白作为稳定剂，以形成稳定的纳米液滴。融合蛋白可在约0.05％至25％(w/v)的浓度范围内添加，更优选地在约0.5％-5％(w/v)的范围内添加。可向混合物中添加表面活性剂(例如十二烷基硫酸钠、卵磷脂、吐温80、普朗尼克(pluronic)F-68等)。
接着，在高压和高剪切力下通过均匀化形成乳状液。使用高压均质机在高压下迫使水相和油相通过均质喷嘴来方便地进行此类均匀化。高压均质机通常在约3,000最高至30,000psi的压力范围内操作。优选地，在约6,000最高至25,000psi的压力范围内执行这种工艺。所得乳状液包含非常小的非水溶剂纳米液滴(包含已溶解的药物活性剂)和非常小的蛋白质稳定剂的纳米液滴。可接受的均匀化方法包括施加高剪切和空化的工艺，诸如高压均匀化、高剪切混合器、超声波处理、高剪切叶轮等。
最后，在减压下蒸发溶剂，以得到由蛋白包被的药物活性剂颗粒和融合蛋白组成的胶体体系。可接受的蒸发方法包括使用旋转蒸发器、降膜蒸发器、喷雾干燥器、冷冻干燥器等。
在溶剂蒸发后，可干燥液体悬浮液以获得含有药物活性剂和融合蛋白的粉末。所得到的粉末可以在任何方便的时间重新分散到适当的水介质中，诸如盐水、缓冲盐水、水、缓冲水介质、氨基酸溶液、维生素溶液、碳水化合物溶液等，以及其中任何两种或更多种的组合，以获得可给药于哺乳动物的悬浮液。设想用于获得此粉末的方法包括冷冻干燥、喷雾干燥等。
根据本发明的一种实施方式，提供了用于形成异常小的亚微米颗粒(纳米颗粒)(即直径小于0.2微米的颗粒)的方法。这种颗粒在以液体悬浮液的形式使用之前能够被无菌过滤。无菌过滤本发明制剂工艺的最终产品(即药物颗粒)的能力是非常重要的，因为不可能通过常规方法(诸如高压灭菌)对含有高浓度的蛋白质(例如血清白蛋白)的分散体进行灭菌。
为了获得无菌可过滤颗粒(即<0.2微米的颗粒)，药物活性剂最初以高浓度溶解于基本不溶于水的有机溶剂(例如，在水中溶解度小于约5％的溶剂，诸如例如氯仿)中，从而形成含有药物活性剂的油相。上面列出了合适的溶剂。聚合物(例如聚乳酸)可以不溶于溶剂中。本发明的工艺中使用的油相可仅含有溶于溶剂中的药物活性剂。
接着，以总有机相的约1％-99％v/v范围内，更优选地约5％-25％v/v范围内的最终浓度，向油相添加水溶性有机溶剂(例如，在水中溶解度大于约10％的溶剂，诸如例如乙醇)。水溶性有机溶剂可选自诸如乙酸乙酯、乙醇、四氢呋喃、二氧六环、乙腈、丙酮、二甲基亚砜、二甲基甲酰胺、甲基吡咯烷酮等的溶剂。可替换地，首先制备水不溶性溶剂与水溶性溶剂的混合物，然后溶解药物活性剂于混合物中。
接着，将生长抑素-白蛋白融合蛋白溶解于水介质中。此组分用作形成稳定纳米液滴的稳定剂。可选地，在水相中溶解足量的第一有机溶剂(例如氯仿)以使其接近饱和浓度。向饱和水相中添加单独测量量的有机相(其现在包含药物活性剂、第一有机溶剂和第二有机溶剂)，使得有机相的相分数介于约0.5％-15％v/v之间，并且更优选地介于1％和8％v/v之间。
接着，通过在低剪切力下均匀化形成由微液滴和纳米液滴组成的混合物。这可以通过多种方式来实现，如本领域技术人员容易识别的，例如，使用在约1,000最高至约30,000rpm范围内操作的常规实验室均质机。随后在高压下进行均匀化(即在约1,000最高至40,000psi范围内)。所得混合物包括蛋白质水溶液(例如人血清白蛋白)、水不溶性药物活性剂、第一溶剂和第二溶剂。最后，在真空下快速蒸发溶剂，以产生极微小纳米颗粒(即约0.01微米至0.2微米范围内的颗粒)形式的胶体分散系统(药物活性剂和蛋白质)，并从而可以无菌过滤。根据制剂和操作参数，颗粒的优选尺寸范围在约0.05-0.17微米之间。
根据本发明制备的胶体系统可通过去除其中的水(例如，在适当的温度-时间曲线下通过冻干)进一步转化为粉末形式。融合蛋白本身作为冷冻保护剂，并且粉末容易通过添加水、盐水或缓冲液来重组，无需使用这种常规冷冻保护剂如甘露醇、蔗糖、甘氨酸等。虽然不是必需的，但是当然可以理解，如果需要，则可以将常规冷冻保护剂添加到本发明制剂中。
根据本发明的另一实施方式，使用高强度超声波合成包含在聚合物壳内的药物活性剂。稳定聚合物壳的形成涉及两个非线性声学工艺(即声乳化和空化)。首先，声乳化将药物活性剂分散到蛋白质水溶液中。然后，形成的分散体通过形成二硫键来进行化学交联和稳定。二硫键是由半胱氨酸残基(生长抑素-白蛋白融合蛋白中)形成的，该残基由经声空化产生的超氧化物而被氧化。
得到的悬浮液可选地通过Centricon过滤器(100kDa截止)进行过滤，且过滤后的构建物或微气泡再悬浮于生理盐水或适当的缓冲液中。这些构建物的平均直径为约2微米。如用颗粒计数器所测定的，可以看出粒径分布相当窄(通常可以观察到平均直径为约3微米的高斯分布)。通过此技术获得的粒径范围可以为0.1微米至20微米。这种尺寸适合于医学应用，因为静脉或动脉内注射可以在不造成小血管阻塞和随后组织(缺氧引起的缺血)损伤的风险下完成。相比之下，正常红细胞的直径为约8微米。
药物活性剂颗粒周围的壳的形成可能涉及生长抑素-白蛋白融合蛋白在水相和非水相之间的界面处的展开和重新定向，从而使蛋白质内的亲水区域暴露于水相，而蛋白质内的疏水区域朝向非水相。为了影响聚合物的展开或改变其构象，必须向蛋白质供应能量。两相(即水相和非水相)之间的界面自由能(界面张力)有助于该界面处蛋白质构象的变化。热能也有助于蛋白质构象的展开和/或改变所需的能量池。
热能输入可以为如以下这些变量的函数：超声工艺中使用的声功率、超声时间、经受超声处理的物质的性质、经受超声处理的物质的体积等。声波工艺的声功率可以有很大的变化，通常落入约1最大至1000瓦/cm2的范围内；目前优选的范围是约50最大至200瓦/cm2的声功率。类似地，超声时间可以有很大的变化，通常落入约2秒最长至约5分钟的范围内。优选地，超声时间将落入约15最长至60秒的范围内。本领域技术人员认识到，所应用的声功率越高，则所需的超声时间越短，且反之亦然。
界面自由能与两相/液体之间的极性差成正比。因此，在给定操作温度下，两种液体之间的界面处的最小自由能对于形成所需的聚合物壳是必不可少的。因此，如果采用极性逐渐变化的同系物系列的分散剂，例如烷酸的乙酯，则较高的同系物越来越非极性，即这些分散剂与水之间的界面张力随着酯中碳原子数量的增加而增加。因此，我们发现，尽管乙酸乙酯(即2碳酸的酯)在室温下(约20℃)是不溶于水的，但仅此分散剂不会产生显著的聚合物壳包覆的颗粒的产量。反之，更高的酯，诸如辛酸乙酯(8碳酸的酯)，给出了高产量的聚合物壳包覆的颗粒。事实上，庚酸乙酯(7碳酸的酯)给出了适中的产量，而较低的酯(3、4、5或6碳酸的酯)给出了较低的产量。因此，在给定的温度下，可以设定形成高产量聚合物壳包覆的颗粒所需的最小水分散剂界面张力的条件。
温度是另一可被操纵以影响聚合物壳包覆的颗粒的产量的变量。一般来说，液体的表面张力随着温度的升高而降低。不同液体的表面张力随温度的变化率往往不同。因此，例如，两种液体之间的界面张力(Δγ)在温度T1时可以是Δγ1，且在温度T2时可以是Δγ2。如果T1处的Δγ1接近形成聚合物壳所需的最小值，并且如果Δγ2(在温度T2下)大于Δγ1，则温度从T1到T2的变化将增加聚合物壳的产量。这可能是庚酸乙酯的情况，其在20℃时给出了中等的产量，但在10℃时给出了较高的产量。
温度也会影响所用液体的蒸汽压。温度越低，总蒸汽压越低。总蒸汽压越低，空化气泡的溃灭效率越高。超声气泡的更有效溃灭与超氧化物(HO2 -)形成速率的增加有关。在较低的温度下，超氧化物形成速率的增加导致聚合物壳的产量增加。然而，作为一种补偿考虑，超氧离子氧化巯基(即以形成二硫键)的反应速率随着温度的升高而增加。因此，对于经受超声波条件的给定液体，存在一个相当窄的最佳操作温度范围，在此范围内可获得高产量的聚合物壳。
因此，两种效应的结合，即表面张力随温度的变化(其直接影响融合蛋白的展开和/或构象变化)和反应产量随温度的变化(反应是经由形成二硫键使融合蛋白交联)决定了聚合物壳包覆的颗粒的总转化率或产量。适用于制备本发明聚合物壳的温度可以落入约0℃-80℃的范围内。
上述超声波工艺可被操纵以产生含有一系列尺寸的药物活性剂的聚合物壳包覆颗粒。目前优选的颗粒半径落入约0.1最大至约5微米的范围内。在这个范围内的窄的尺寸分布非常适合静脉递送药物。然后，在通过适当的方法给药之前，将聚合物壳包覆的颗粒悬浮在水性生物相容性液体(如上所述)中。
此外，聚合物壳可以可选地由合适的剂进行修饰，其中该剂通过可选共价键与聚合物壳相关联。设想用于此类连接的共价键包括酯、醚、氨基甲酸乙酯、二酯、酰胺、二级或三级胺、磷酸酯、硫酸盐酯等键。设想用于聚合物壳的这种可选修饰的合适的剂包括合成聚合物(聚亚烷基二醇(例如，直链或支链聚乙二醇)、聚乙烯醇、聚羟乙基甲基丙烯酸酯、聚丙烯酸、聚乙基噁唑啉、聚丙烯酰胺、聚乙烯吡咯烷酮等)、磷脂(诸如磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰肌醇(PI)、鞘磷脂等)、蛋白质(诸如酶、抗体等)、多糖(诸如淀粉、纤维素、右旋糖酐、海藻酸盐、壳聚糖、果胶、透明质酸等)、化学修饰剂(诸如5'-磷酸吡哆醛、吡哆醛的衍生物、双醛、琥珀酰水杨酸酯(diaspirin ester)等)或其任何两种或更多种的组合。
包封在聚合物壳内的已溶解的药物活性剂的一般主题的变化是可能的。在生物相容性分散剂中的药物活性剂的细小颗粒的悬浮液可用于(代替含有已溶解的药物活性剂的生物相容性分散剂)产生含有分散剂悬浮的药物活性剂颗粒的聚合物壳。换言之，聚合物壳可含有药物活性剂在分散剂中的饱和溶液。另一种变化是含有药物活性剂的固体芯的聚合物壳，其通过最初将药物活性剂溶解在挥发性有机溶剂(例如苯)中，形成聚合物壳并在真空下蒸发挥发性溶剂，例如在旋转蒸发器中，或者冷冻干燥整个悬浮液而产生。这导致了具有被聚合物涂层包围的药物活性剂的固体芯的结构。后一种方法特别有利于以相对较小的体积递送大剂量的药物活性剂。在一些情况下，形成围绕芯的壳的聚合物本身可以是治疗剂或诊断剂，例如，在胰岛素的情况下，其可以作为在上述超声波工艺中形成的聚合物壳的一部分来递送。
聚合物壳的变化也是可能的。例如，少量含有巯基的PEG可以包含在融合蛋白中。在超声波作用下，PEG交联成融合蛋白，并形成聚合物壳的组分。可替换地，PEG可以在制备壳之后联接到聚合物壳(而不是作为制备壳的介质的一部分被包括)。已知PEG具有非粘附性，并且它被附接在蛋白质和酶上以增加它们在体内的循环时间[Abuchowski et al.,J.Biol.Chem.Vol.252:3578(1977)]。它还被附接在脂质体中形成脂质双层的磷脂上，以减少它们的摄取并延长在体内的寿命[Klibanov et al.,FEBS Letters Vol.268:235(1990)]。因此，PEG与交联蛋白壳壁的结合改变了它们的血液循环时间。此特性可用于维持较高的药物活性剂血液水平并延长药物活性剂释放时间。
亲电PEG衍生物包括PEG咪唑、琥珀酰亚胺琥珀酸酯、硝基苯基碳酸酯、三氟乙基磺酸酯(tresylate)等；亲核PEG衍生物包括PEG胺、氨基酸酯、酰肼、硫醇等也用于聚合物壳的修饰。PEG修饰的聚合物壳比其未修饰的对应物在循环中会保持更长的时期。用PEG对聚合物壳进行修饰可在壳形成之前或其形成之后进行。目前优选的技术是在聚合物壳形成之后对其进行修饰。其他聚合物包括葡聚糖、海藻酸盐、羟乙基淀粉等，可用于聚合物壳的修饰。
本领域技术人员将认识到，在本发明的范围和精神内可以有多种变体。聚合物壳内的分散剂可以多种多样，可以使用多种药物活性剂，并且可以使用多种蛋白质以及其他天然的和合成的聚合物来形成聚合物壳的壁。应用范围也相当广泛。
根据本发明的又一实施方式，上述给药模式由含有多西紫杉醇的新型组合物促进，其中多西紫杉醇悬浮在生物相容性液体中，并且其中所得的悬浮液包含横截面尺寸不大于10微米且优选0.2微米的多西紫杉醇颗粒。所需的小于约10微米的粒径可以通过多种方式实现，例如，通过研磨、喷雾干燥、沉淀、超声波处理等。
多西紫杉醇颗粒的尺寸优选小于10微米、更优选小于5微米以及最优选小于1微米，其允许以悬浮液的形式进行静脉递送，而没有在器官和组织的微循环中发生堵塞的风险。
由于所递送药物的纳米颗粒特性，大部分药物被具有网状内皮系统的器官(诸如脾、肝和肺)从循环中清除。这使得以颗粒形式的药物活性剂靶向体内的这种位点。
此实施方式中设想使用的生物相容性液体与上述生物相容性液体相同。此外，肠外营养剂，诸如Intralipid(用作肠外营养剂的市售脂肪乳状液的商标名；可从KabiVitrum,Inc.,Clayton,N.C.获得)、NutripidTM(用作肠外营养剂的市售脂肪乳状液的商标名；可从McGaw,Irvine,Calif.获得)、Liposyn III(用作肠外营养剂的市售脂肪乳状液的商标名(包含20％大豆油、1.2％卵磷脂和2.5％甘油)；可从Abbott Laboratories,NorthChicago,Ill.获得)等，可用作药物颗粒的运载体。可替换地，如果生物相容性液体包含药物溶解物质，诸如大豆油(例如，在IntralipidTM的情况下)，则药物可部分或完全溶解于运载体液体中，以帮助其递送。这种情况的一个实例是多西紫杉醇在作为运载体的IntralipidTM中递送。目前在本实施方式中使用的优选生物相容性液体是肠外营养剂，诸如上文所述的那些。
在另一实施方式中，本发明提供了通过给药含有药物活性剂和聚合物壳的药物组合物来治疗包括人类受试者在内的受试者的癌症的方法。
根据本发明的又一实施方式，提供了用于体内递送多西紫杉醇的组合物，其中多西紫杉醇溶解在肠外营养剂中。
实施例
将参考以下实验和比较实施例来进一步详细描述本发明的选定实施方式。这些实施例仅用于说明性目的，并不旨在限制本发明的范围。
实施例1：哺乳动物系统中融合蛋白的表达
实施例1-1.重组基因合成
制备了与表5中所列的融合蛋白相对应的八个构建体。首先，从头合成编码每个融合蛋白的基因序列，然后将其插入pcDNA3.1载体中。
实施例1-2.质粒生成
Maxi-prep或Mega-prep用于生成～20mg的各DNA。
实施例1-3.转染与蛋白质生产
(A)悬浮细胞法
FreeStyleTM293-F细胞以0.55-0.6×106细胞/mL接种于烧瓶中。约24小时后，将细胞以1.1-1.2×106细胞/mL接种于摇瓶中。在500μg DNA/80mL的FreeStyle培养基中制备DNA。聚亚乙基亚胺(PEI)在FreeStyle培养基中以每80mL 1.8mL PEI制备。DNA在FreeStyle培养基中混合，并在DNA溶液中加入有效量的PEI，然后在室温下旋涡温育约15分钟，以形成DNA-PEI复合物。将80mL温育的DNA-PEI复合物添加到细胞培养物中。约3小时后，添加TC酵母提取物(Yeastolate)饲料(BD)，以使培养物的最终浓度为4克/升。约7-8天后，通过离心法收集培养基。
(B)贴壁细胞法
转染前约24小时，将HEK293细胞接种到50-90％融合的培养瓶中，并加入完全培养基。约24小时后，清洗细胞，然后加入基础培养基。
DNA和PEI溶液是通过向无血清培养基中添加DNA制备的。将PEI溶液加入DNA溶液中，并在室温下温育15分钟，以形成DNA-PEI复合物。
将DNA-PEI复合物添加到细胞中，并将混合物在37℃下温育约4-6小时。去除培养基，并添加具有谷氨酰胺和血清的新鲜培养基，然后在37℃下温育4天。
在约4天后通过离心收集上清液而收获培养基。用具有L-谷氨酰胺的新鲜培养基补充沉淀，再温育3天，以重复收获工艺。
实施例1-4：蛋白质浓度、Ni-NTA纯化和缓冲交换
收集的培养基通过TFF系统(Millipore)浓缩到一定体积，这取决于纯化方法(连续色谱法或人工分批纯化)。
将浓缩的蛋白与新鲜Ni-NTA树脂在约4℃下于结合缓冲液中温育，并使用色谱法或分批系统用洗涤缓冲液洗涤。用洗脱缓冲液洗脱蛋白质，然后收集并浓缩级分以回收纯化的蛋白质。使用尺寸排阻层析纯化可进一步纯化蛋白质。
最终洗脱的缓冲液可以通过透析交换到所需的缓冲液。
实施例2:SST-白蛋白融合蛋白的产量
SST-HSA融合蛋白均以可溶性形式表达，产量高。接头的长度或性质可以影响融合蛋白的蛋白产量和溶解度。结果表明，随着融合蛋白构建体的延长和复杂程度的增加，产品产量略有下降。然而，所有构建体都表现出了扩大生产的产量。
Figure BDA0002422083080000571
实施例3：水介质中多西紫杉醇颗粒的制备
多西紫杉醇晶体在球磨机中研磨，直到获得尺寸小于10微米的固体多西紫杉醇颗粒。颗粒的尺寸是通过将颗粒悬浮在等渗盐水中并借助于颗粒计数器进行计数来确定的。继续研磨，直到100％的粒径小于5微米。静脉递送的优选粒径小于5微米且最优选小于1微米。
可替换地，多西紫杉醇的颗粒通过在水中对多西紫杉醇悬浮液进行超声波处理获得，直到所有颗粒的直径小于10微米。
多西紫杉醇颗粒直径小于10微米，也可以通过加入水从乙醇中的多西紫杉醇溶液中沉淀多西紫杉醇，直到获得浑浊的悬浮液。可选地，多西紫杉醇的溶液可以在加水期间进行超声波处理，直到获得浑浊的悬浮液。然后对所得悬浮液进行过滤和干燥，以获得所需尺寸范围内的纯多西紫杉醇颗粒。
多西紫杉醇的细小颗粒是由多西紫杉醇溶液在挥发性溶剂(诸如乙醇)中喷雾干燥制备的。溶液通过超声波喷嘴，其形成含有多西紫杉醇的乙醇液滴。由于在喷雾干燥器中蒸发的乙醇，获得了多西紫杉醇的细小颗粒。通过改变乙醇中多西紫杉醇的浓度，调节通过喷嘴的液体的流速和超声波功率来改变粒径。合适的超声波仪包括具有CV33型探头的Vibracell VCX 750，Sonics and Materials Inc.，Newtown，Conn。
实施例4：含油蛋白壳的制备
取3ml的5％生长抑素-白蛋白融合蛋白溶液于圆柱形容器中，该容器与超声波探针相连。合适的超声波仪包括具有CV33型探头的Vibracell VCX 750，Sonics andMaterials Inc.，Newtown，Conn。生长抑素-白蛋白融合蛋白溶液被6.5ml的大豆油(豆油)覆盖。超声波探针的尖端被带到两种溶液之间的界面上，并将组件保持在20℃的冷却槽中。允许系统平衡，并打开超声波进行30秒。发生剧烈混合并获得白色乳状悬浮液。用生理盐水将悬浮液稀释1:5。利用颗粒计数器测定含油蛋白壳的尺寸分布和浓度。
实施例6：影响聚合物壳形成的参数
检测了几种变量，诸如蛋白质浓度、温度、超声波时间、药物活性剂浓度以及声强度，以优化聚合物壳的形成。这些参数是为含有甲苯的交联生长抑素-白蛋白融合蛋白壳测定的。
由蛋白质浓度为1％、2.5％、5％和10％的溶液制成的聚合物壳用颗粒计数器计数，以测定产生的聚合物壳的尺寸和数量的变化。聚合壳的尺寸随蛋白质浓度的变化而变化，但每毫升形成的“乳状悬浮液”中聚合壳的数量随着蛋白质浓度的增加而增加，最高达5％。超过该浓度时，聚合物壳的数量没有显著变化。
初始容器温度对聚合物壳的最佳制备至关重要。通常，初始容器温度保持在0℃到45℃之间。用于形成聚合物壳的油的水-油界面张力是一个重要参数，其也随温度变化。药物活性剂的浓度对蛋白壳的产量没有显著影响。如果药物活性剂以溶解状态加入或悬浮在分散介质中，则相对不重要。
超声波时间是测定每ml产生的聚合物壳的数量的重要因素。超过三分钟的超声波时间会导致聚合物壳总数的减少，这表明过度超声波处理可能会破坏聚合物壳。不到三分钟的超声波时间产生足够数量的聚合物壳。关于超声波发生器的声功率额定值，在最高功率设置下产生最大数量的聚合物壳，例如，在声功率为约200瓦/cm2的情况下。
实施例7：在油运载体中制备含有多西紫杉醇的聚合物壳
多西紫杉醇以2mg/ml的浓度溶解在USP级大豆油中。3ml的5％生长抑素-白蛋白融合蛋白溶液被置于圆柱形容器中，该容器可连接于超声波探针。用6.5ml的大豆油/多西紫杉醇溶液覆盖生长抑素-白蛋白融合蛋白溶液。超声探针的尖端被带到两个溶液之间的界面，并且保持组件平衡，打开超声波发生器进行30秒。发生剧烈混合并获得稳定的白色乳状悬浮液，其包含包裹油/多西紫杉醇溶液的蛋白壁聚合物壳。
为了在交联蛋白壳中获得更高的药物负载量，可以将油和药物(其中药物具有相当高的溶解度)的互溶剂与油混合。如果该溶剂相对无毒(例如乙酸乙酯)，则其可与原运载体一起注入。在其他情况中，在制备聚合物壳之后，可通过在真空下蒸发液体将其去除。
实施例8：聚合物壳的稳定性
分析已知浓度的聚合物壳悬浮液在三种不同温度(即4℃、25℃和38℃)下的稳定性。稳定性是通过颗粒数随时间的变化来测量的。如上所述制备含有大豆油(SBO)的交联蛋白(生长抑素-白蛋白融合蛋白)壳(见实施例2)，在盐水中稀释至最终油浓度为20％，并在上述温度下储存。获得每个样品的颗粒数(Elzone)随时间变化。
在实验期间，已计数的颗粒(即聚合物壳)的浓度保持相当恒定。该范围表明，在各种温度条件下，聚合物壳的稳定性在近四周内都良好。
实施例9：体内生物分布——含荧光团的交联蛋白壳
为了测定静脉注射后交联生长抑素-白蛋白融合蛋白壳的去向，将荧光染料(红荧烯，a/k/a(5,6,11,12-四苯基并四苯，从Aldrich获得)溶解在甲苯中，并通过超声波处理如上所述制备含有甲苯/红荧烯的交联蛋白壳。所得到的乳状悬浮液在生理盐水中稀释五倍。然后在10分钟内将2ml稀释的悬浮液注射入大鼠的尾静脉。注射后一小时处死一只动物，且注射后24小时处死另一只动物。
在荧光下检查冰冻肺、肝、肾、脾和骨髓切片是否存在含有荧光染料的聚合物壳。在一小时时，大多数聚合物壳完好无损，且在肺和肝中发现的亮荧光颗粒直径为约1微米。在24小时时，在肝、肺、脾和骨髓中发现聚合物壳。还观察到组织的一般染色，表明聚合物壳被消化，且染料从其中释放。这一结果与预期一致，并证明了本发明组合物用于延迟或控制释放包埋的药物剂(诸如多西紫杉醇)的潜在用途。
实施例10：含有大豆油(SBO)的聚合壳的毒性
如实施例2所述制备含有大豆油(SBO)的聚合物壳。所得悬浮液在生理盐水中稀释以产生两种不同的溶液，一种含有20％的SBO，且另一种含有30％的SBO。
一种市售全肠外营养(TPN)剂IntralipidTM，含有20％的SBO。当以1cc/min注射时，IntralipidTM在小鼠中的LD50为120ml/kg，或对于30g小鼠而言约4ml。
如下将两组小鼠(每组三只小鼠，每只小鼠体重约30g)用含SBO的本发明组合物处理。每只小鼠注射有4ml制备的含SBO聚合物壳的悬浮液。一个组的每个成员接受含20％SBO的悬浮液，而另一个组的每个成员接受含30％SBO的悬浮液。
与市售的SBO制剂(IntralipidTM)相比，根据本发明的聚合物壳内所含的油在其LD50剂量下无毒。这种影响可归因于油从聚合物壳体内缓慢(诸如一个或多个小时)释放(即成为生物可利用的受控速率)。与市售的乳状液达到的高油剂量相比，这种缓慢的释放阻止了达到油的致命剂量。
实施例11：从聚合壳释放的大豆油的体内生物利用度
将聚合物壳悬浮液注入大鼠血流后，进行检测以测定聚合物壳包封物质的缓慢或持续释放。如上所述，通过超声波处理制备了含有大豆油(SBO)的交联蛋白(生长抑素-白蛋白融合蛋白)壁聚合物壳。所得的含油聚合物壳的悬浮液在盐水中稀释成含20％油的最终悬浮液。在10分钟时间内，将5ml这种悬浮液注射入插管的大鼠颈外静脉。在注射后的几个时间点采集这些大鼠的血液，并通过常规分析测定血液中甘油三酯(大豆油主要是甘油三酯)的水平。
使用五毫升市售脂肪乳状液(IntralipidTM，一种含20％大豆油、1.2％蛋黄磷脂和2.25％甘油的水性肠外营养剂)作为对照。对照使用卵磷脂作为乳化剂来稳定乳状液。比较两个病例的血清甘油三酯水平，将给出油的生物利用度随时间变化的直接比较。除了含有20％油的聚合物壳的悬浮液之外，还注射了5ml在盐水中以30％油的最终浓度含油的聚合物壳的样品。三组中的各组使用两只大鼠。
对于IntralipidTM对照，注射后看到很高的甘油三酯水平。然后看到甘油三酯水平需要约24小时以降低到注射前水平。因此，在注射后，可见油可以立即用于新陈代谢。
含有与IntralipidTM(20％)相同量的总油的含油聚合物壳的悬浮液显示血清中可检测到的甘油三酯的可用性存在显著差异。这一水平表明，甘油三酯缓慢或持续释放到血液中的水平相当接近正常。接受具有30％油的含油聚合物壳的组显示出较高的甘油三酯水平(伴随较高的给药剂量)。再次，与接受IntralipidTM的对照组相比，这组的血液甘油三酯水平没有显著升高。这再次表明了本发明组合物的油的缓慢且持续的可用性，其优点是避免了聚合物壳内所含物质的危险高血液水平，以及在可接受的水平上有长时间的可用性。显然，在本发明的聚合物壳内递送的药物将实现这些相同的优点。
这种含大豆油的聚合物壳的体系可以悬浮在氨基酸、必需电解质、维生素和糖的水溶液中，以形成全胃肠外营养(TPN)剂。由于乳状液在电解质存在下不稳定，这种TPN不能从目前可用的脂肪乳状液(例如IntralipidTM)配制。
实施例12：含有药物活性剂固体芯的交联蛋白壁聚合物壳的制备
另一种将难溶于水的药物(诸如多西紫杉醇)递送到聚合物壳内的方法是在固体药物芯周围制备聚合物材料壳。这种“蛋白包被的”药物颗粒可按如下方式获得。使用有机溶剂以相对高浓度溶解多西紫杉醇重复实施例4中所述的程序。
通常使用的溶剂是有机物，诸如苯、甲苯、己烷、乙醚等。
如实施例4所述生产聚合物壳。将5mL的含有溶解的多西紫杉醇的聚合物壳的乳状悬浮液在生理盐水中稀释至10ml。将此悬浮液在室温下置于旋转蒸发器中，并通过真空去除挥发性有机物。在旋转蒸发器中约2小时后，在显微镜下检查这些聚合物壳，以显示不透明的芯，这表明几乎所有的有机溶剂都被去除，并且蛋白质壳内存在固体多西紫杉醇。
可替换地，将芯为含有溶解药物的有机溶剂的聚合物壳冷冻干燥以获得干燥易碎的粉末，该粉末可在使用时在盐水(或其他合适的液体)中再悬浮。在室温下不可能为固相的其他药物的情况中，获得了液体芯聚合物壳。此方法允许制备其中含有未稀释药物的交联蛋白壁壳。粒径分析表明，这些聚合物壳比含油的聚合物壳更小。尽管目前用于形成聚合壳的优选蛋白质是生长抑素-白蛋白融合蛋白，但其他蛋白质诸如α-2-巨球蛋白(已知的调理素)也可用于增强巨噬细胞样细胞对聚合物壳的摄取。可替换地，在形成聚合物壳的期间可添加PEF巯基(如下所述)，以在体内产生循环时间增加的聚合物壳。
实施例13：聚合物壳的体内循环和释放动力学
如上文所述制备含有多西紫杉醇的固体芯聚合物壳(参见，例如实施例4)并悬浮于生理盐水中。通过HPLC如下测定悬浮液中多西紫杉醇的浓度。首先，通过添加0.1M巯基乙醇(导致蛋白质二硫化物交联的交换和聚合物壳交联的破坏)释放聚合物壳内的多西紫杉醇，然后用乙腈从悬浮液中提取释放的多西紫杉醇。将所得混合物离心，并将上清液冷冻干燥。将冻干物溶解于甲醇并注入HPLC以测定悬浮液中多西紫杉醇的浓度。
通过颈静脉插管向大鼠注射2ml这种悬浮液。两小时后处死动物，并通过HPLC测定存在于肝脏中的多西紫杉醇的量。这需要对肝脏进行均匀化，然后用乙腈提取，并在离心后将上清液冻干。将冻干物溶解于甲醇并注入HPLC。
实施例14:SST-HSA紫杉醇纳米颗粒的组合物、制备和药物释放
实施例14-1：使用高压均匀化方法制备SST-HSA蛋白结合紫杉醇纳米颗粒
通过将4ml的2.5mg/ml SST-HSA蛋白和360μl的25％HSA加入5.64ml的DI水中，制备10ml的1％(w/v)SST融合蛋白和HSA溶液，并然后用52μl的氯仿预饱和溶液。将10mg的紫杉醇溶解于183μl的氯仿和17μl的乙醇的混合物中。将紫杉醇溶液均匀加入10ml SST融合蛋白和HSA溶液中。将混合物均匀化几分钟以形成粗乳状液。将粗乳状液转移到高压均质机中。在高压下进行乳化，同时将乳状液循环几分钟。通过使用旋转蒸发器去除挥发性有机溶剂，然后通过冻干去除剩余溶剂，以获得纳米颗粒，从而浓缩均匀的乳状液。最终的纳米颗粒储存在4℃下。使用Malvern Zeta Sizer测量重组纳米颗粒的尺寸，所得颗粒的Z平均粒径在0.17至0.2微米(170至200nm)之间。通过过滤或其他方法进一步将纳米颗粒分级以收集纳米颗粒的三个分级，直径约小于0.1微米(100nm)、0.1至0.2微米(100-200nm)和大于0.2微米(200nm)。合适的均质机包括直线Megatron均质机MT-V 3-65 F/FF/FF,KinematicaAG,瑞士。
另一批纳米颗粒由2ml的2.5mg/ml SST-HSA蛋白质和360ml的25％HSA在7.64ml的DI水中制备而成。这批纳米颗粒的尺寸分布与上述纳米颗粒相似。
实施例14-2：SST蛋白结合紫杉醇纳米颗粒的体外释放
使用USP装置II对SST-HSA紫杉醇纳米颗粒进行体外释放研究。Abraxane样品也用作参考。采样周期超过8小时，并用HPLC测定紫杉醇浓度。SST-HSA紫杉醇纳米颗粒和Abraxane纳米颗粒的释放曲线如图1所示：
结果表明，SST融合蛋白并没有改变紫杉醇的释放曲线。
实施例15：紫杉醇缀合的复合物的细胞毒性
紫杉醇SST融合蛋白(SEQ-ID-NO:1)的细胞毒性。缀合复合物已在表达人重组sst2a的CHO细胞中进行了检测。使用
Figure BDA0002422083080000641
发光细胞活力测定法(Promega)来测定细胞活力，该测定法基于作为代谢活性细胞的指标的ATP存在的定量测定了培养基中活细胞的数量。根据制造商手册(Promega Technical Bulletin，#TB288部分，产品G7570、G7571、G7572和G7573，2009年6月修订的)进行测定。
使用20μg/ml浓度的毛地黄皂苷为阳性对照，DMSO处理的和激动剂(奥曲肽)处理的孔用作承载体对照。在将测试化合物分配到孔后，将温育缓冲液中的细胞添加到孔中并温育20分钟。在温育结束时，向每个孔中加入CellTiter-Glo来测量发光。所有测试孔均含有0.4％DMSO。在0.14nM、0.42nM、1.4nM、4.2nM、14nM、42nM和110nM的不同紫杉醇浓度下，未观察到明显的细胞毒性(表5)。
结果表明，SST融合蛋白作为药物递送蛋白使用是安全的。
Figure BDA0002422083080000651
Figure BDA0002422083080000661
实施例16：通过紫杉醇SST融合蛋白(SEQIDNO:1)缀合的复合物抑制SST结合在SST2A受体上
在SST和sst2受体结合抑制测定中，检测了紫杉醇SST融合蛋白(SEQIDNO:1)的不同浓度0.3nM、1nM、3nM、10nM、0.03μM和0.1μM。紫杉醇SST融合蛋白缀合的复合物能抑制SST和SST2受体结合，IC50值为6.55nM。
Figure BDA0002422083080000662
实施例17：紫杉醇SST融合蛋白(SEQIDNO:1)缀合的复合物结合在CHO-K1细胞中的SST2A受体上
在腺苷酸环化酶测定中使用表达sst2a受体的CHO-K1细胞以定量确定紫杉醇SST融合蛋白缀合的复合物与sst2a受体的结合。不同浓度的紫杉醇SST融合蛋白(SEQIDNO:1)在1nM-0.3μM处进行检测。紫杉醇SST融合蛋白缀合的复合物能够结合于CHO-K1细胞表达的SST2a受体，EC50值为8.29nM(表7)。
Figure BDA0002422083080000671

Claims (45)

1.一种颗粒，包含药物活性成分或诊断成分以及聚合物壳，其中，所述聚合物壳包含生长抑素-白蛋白融合蛋白，并且所述聚合物壳封装所述药物活性成分或诊断成分。
2.根据权利要求1所述的颗粒，其中，所述聚合物壳包含按重量计约5％至约100％的生长抑素-白蛋白融合蛋白。
3.根据权利要求1所述的颗粒，其中，所述聚合物壳包含按重量计约65％至约95％的生长抑素-白蛋白蛋白质。
4.根据权利要求1所述的颗粒，其中，所述药物活性成分是抗癌剂、营养剂或营养品。
5.根据权利要求4所述的颗粒，其中，所述抗癌剂选自由以下组成的组：氮芥、亚硝基脲、亚乙基亚胺、烷基磺酸盐、四嗪、铂类化合物、嘧啶类似物、嘌呤类似物、抗代谢物、叶酸类似物、蒽环类、紫杉烷、长春花生物碱、拓扑异构酶抑制剂、激素剂及其组合。
6.根据权利要求4所述的颗粒，其中，所述紫杉烷选自由以下组成的组：紫杉醇、多西紫杉醇、卡巴他赛、喜树碱及其类似物和衍生物。
7.根据权利要求1所述的颗粒，其中，所述生长抑素-白蛋白融合蛋白包含：
SST；
L；以及
ALB，可操作地将其连接，
其中，
L按任何顺序连接SST和ALB，
SST是生长抑素、其类似物或衍生物；
L是间隔物或接头；以及
ALB是白蛋白、其类似物或变体，
其中L按任何顺序连接SST和ALB。
8.根据权利要求7所述的颗粒，其中，所述融合蛋白选自由以下组成的组：
SST-(L)x1-ALB(I)；
ALB-(L)x1-SST(II)；
[SST-(L)x1]y1-ALB(III)；
ALB-[(L)x1-SST]y1(IV)；
[SST-(L)x1]y1-ALB-[(L)x2-SST]y2(V)；
[SST-(L)x1]y1-ALB-[(L)x2-SST]y2-(L)x3-ALB(VI)；
[SST-(L)x1]y1-ALB-[(L)x2-SST]y2-(L)x3-ALB-[(L)x4-SST]y3(VII)；
ALB-(L)x1-[SST-(L)x2]y1-ALB(VIII)；
ALB-(L)x1-[SST-(L)x2]y1-ALB-[(L)x3-SST]y2-(L)x1-ALB(IX)；以及
ALB-(L)x1-[SST-(L)x2]y1-ALB-[(L)x3-SST]y2-(L)x1-ALB-[(L)x4-SST]y3(X)；
其中，x1、x2、x3、x4、y1、y2或y3独立地为零或从1-10中选择的整数。
9.根据权利要求7所述的颗粒，其中，所述SST是自然发生的或合成制造的。
10.根据权利要求7所述的颗粒，其中，所述SST包含编码SST-14或SST-28的序列的一个或多个串联重复，分别由SEQ ID NO:17或18表示，或与这些序列中的任一序列具有至少85％的同一性的序列。
11.根据权利要求7所述的颗粒，其中，所述SST是SST-14或SST-28。
12.根据权利要求7所述的颗粒，其中，L是柔性的或α螺旋结构的多肽接头或间隔物。
13.根据权利要求7所述的颗粒，其中，L是具有2-100个氨基酸的肽。
14.根据权利要求13所述的颗粒，其中，L是包含至少一个GGGGS、A(EAAAK)4A、(AP)n结构域、(G)8或(G)5或其任何组合的肽，其中n是从10-34中选择的整数。
15.根据权利要求7所述的颗粒，其中，ALB是哺乳动物血清白蛋白。
16.根据权利要求15所述的颗粒，其中，所述哺乳动物血清白蛋白是SEQ ID NO:25，或与其具有至少85％序列同一性的蛋白质序列。
17.根据权利要求8所述的颗粒，其中，x1、x2、x3、x4各自独立地是从1-5中选择的整数。
18.根据权利要求8所述的颗粒，其中，y1、y2、y3各自独立地是从1-5中选择的整数。
19.根据权利要求1所述的颗粒，其中，所述生长抑素-白蛋白融合蛋白基本上通过二硫键交联。
20.根据权利要求19所述的颗粒，其中，所述二硫键通过超声波处理形成。
21.根据权利要求1所述的颗粒，其中，所述聚合物壳基本上包含所述药物活性剂。
22.根据权利要求21所述的颗粒，其中，所述聚合物壳的最大横截面尺寸为约0.001微米至约1000微米。
23.根据权利要求21所述的颗粒，其中，所述聚合物壳的最大横截面尺寸为约0.01微米至约1.0微米。
24.根据权利要求21所述的颗粒，其中，其中含有所述药物活性剂的所述聚合物壳悬浮在生物相容性水溶液中。
25.根据权利要求1所述的颗粒，其中，所述药物活性剂悬浮在生物相容性分散剂中。
26.根据权利要求25所述的颗粒，其中，所述生物相容性分散剂选自大豆油，椰子油，橄榄油，红花油，棉籽油，具有4-30个碳原子的脂肪族、环脂肪族或芳香族烃，具有2-30个碳原子的脂肪族或芳香族醇，具有2-30个碳原子的脂肪族或芳香族酯，具有2-30个碳原子的烷基、芳基或环醚，具有1-30个碳原子可选地具有多于一个卤素取代基的烷基或芳基卤化物，具有3-30个碳原子的酮，聚亚烷基二醇或其任何两个或更多个的组合。
27.根据权利要求1所述的颗粒，其中，所述诊断成分选自由以下组成的组：超声造影剂、放射性造影剂、磁共振图像造影剂及其组合。
28.根据权利要求4所述的颗粒，其中，所述营养剂选自由以下组成的组：氨基酸、糖、蛋白质、碳水化合物、脂溶性维生素、脂肪、油及其组合。
29.根据权利要求28所述的颗粒，其中，所述脂溶性维生素选自由以下组成的组：维生素A、维生素D、维生素E、维生素K及其组合。
30.根据权利要求4所述的颗粒，其中，所述营养品是姜黄素。
31.一种向受试者递送基本上不溶于水的药物剂的方法，所述方法包括向所述受试者给药有效量的权利要求1所述的颗粒。
32.一种制备包含药物活性成分的颗粒的方法，包括：将含有生长抑素-白蛋白融合蛋白和药物活性剂的水介质经受剪切条件足够的时间，以促进所述生长抑素-白蛋白融合蛋白通过二硫键的交联从而产生其中含有所述药物活性剂的聚合物壳。
33.根据权利要求32所述的方法，其中，所述药物活性剂为抗癌剂，其选自由以下组成的组：氮芥、亚硝基脲、亚乙基亚胺、烷基磺酸盐、四嗪、铂类化合物、嘧啶类似物、嘌呤类似物、抗代谢物、叶酸类似物、蒽环类、紫杉烷、长春花生物碱、拓扑异构酶抑制剂、激素剂及其组合。
34.根据权利要求33所述的方法，其中，所述抗癌剂为紫杉醇、卡巴他赛或多西紫杉醇。
35.根据权利要求32所述的方法，其中，通过在约2秒到5分钟的时间段内，在约50最高至200瓦/cm2的声功率范围内的高强度超声波下对含有生长抑素-白蛋白融合蛋白和药物活性剂的所述水介质进行超声波处理来提供所述剪切条件。
36.根据权利要求32所述的方法，其中，通过在约10最高至100,000psi范围内的静态混合、高压均匀化、微射流条件下均匀化含有生长抑素-白蛋白融合蛋白和药物活性剂的所述水介质来提供所述剪切条件。
37.根据权利要求32所述的方法，其中，所述药物活性剂分散在分散剂中。
38.根据权利要求1所述的颗粒，其中，所述生长抑素-白蛋白融合蛋白占约0.05％至约25％重量/所述聚合物壳体积。
39.根据权利要求1所述的颗粒，其中，所述生长抑素-白蛋白融合蛋白占约0.5％至约5％重量/所述聚合物壳体积。
40.根据权利要求1所述的颗粒，其中，在所述颗粒中，所述SST融合蛋白与所述药物活性成分或所述诊断成分的重量比为约20:1至1:20。
41.根据权利要求1所述的颗粒，经由肿瘤生长抑素受体选择性地结合于肿瘤细胞。
42.根据权利要求41所述的颗粒，其中，所述肿瘤细胞存在于类癌、胰岛细胞癌、胰高血糖素瘤、胃泌素瘤、胰岛素瘤、血管活性肠肽瘤或甲状腺髓样癌中。
43.一种药物组合物，包含权利要求1所述的颗粒以及生理上可接受的赋形剂或运载体。
44.一种治疗或诊断癌症的方法，包括向有需要的受试者给药有效量的权利要求1所述的颗粒。
45.一种治疗或诊断癌症的方法，包括向有需要的受试者给药有效量的权利要求43所述的药物组合物。
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