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CN111671922B - 两亲性梳形嵌段接枝共聚物基超声造影剂及其制备方法 - Google Patents

两亲性梳形嵌段接枝共聚物基超声造影剂及其制备方法 Download PDF

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CN111671922B
CN111671922B CN202010717453.1A CN202010717453A CN111671922B CN 111671922 B CN111671922 B CN 111671922B CN 202010717453 A CN202010717453 A CN 202010717453A CN 111671922 B CN111671922 B CN 111671922B
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朱笔挥
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Abstract

本发明属于超声影像诊断领域，具体涉及一种类磷脂两亲性梳形嵌段接枝共聚物基超声造影剂及其制备方法。本发明提供一种类磷脂两亲性梳形嵌段接枝共聚物基超声造影剂，所述超声造影剂包括外壳和内核，所述外壳为类磷脂两亲性梳形嵌段接枝共聚物聚己内酯‑b‑(聚溴代己内酯‑g‑聚甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱)，所述内核为超声响应物。本发明制备得到超声造影剂粒径分布较均匀，稳定性明显优于磷脂基超声造影剂，更适合用于超声诊断与治疗研究；并且可解决目前的超声造影剂的耐压性和耐机械指数变化的不足，拓展了超声造影剂的应用范围。

Description

两亲性梳形嵌段接枝共聚物基超声造影剂及其制备方法
技术领域
本发明属于超声影像诊断领域，具体涉及一种类磷脂两亲性梳形嵌段接枝共聚物基超声造影剂及其制备方法。
背景技术
超声造影剂可以增强超图像的对比度效果，显著提高超声诊断精度，广泛应用于临床诊断领域，而且在超声介导的治疗中也具有巨大的应用潜力。然而，目前应用于临床的超声造影剂多为小分子磷脂或白蛋白包裹惰性气体构成，其存在多分散性大或半衰期较短(<10min)等不足，限制了其在成像和治疗中的进一步应用。
为了增强超声造影剂稳定性，人们目前已经开发出具有比磷脂刚度更高的材料用来稳定超声造影剂中的气态核，这类造影剂被称为硬壳造影剂。该硬壳造影剂几乎不会出现体积膨胀，并且在低声压条件下可以保持完整。但是超过一定的压力阈值时，硬壳超声造影剂的壳也会破裂。聚合物刚度比磷脂更高，基于聚合物外壳制备形成的聚合物基超声造影剂，可以极大程度的改善超声造影剂的声学行为。而且，通过调节聚合物的化学组成和相对分子量，还可以控制聚合物基超声造影剂声学特性。聚合物壳的超声造影剂不仅具有更好的声学稳定性，并且在超声下其耐压性和耐机械指数变化也得到大大改善。此外，通过接枝或包封用于药物递送的治疗药物，其也可以用于超声图像引导的诊疗一体化制剂，增加了多模态超声造影剂的多功能性，进一步拓展了超声造影剂的应用范围。
发明内容
本发明的目的是提供一种新型的聚合物基超声造影剂及其制备方法，所得造影剂为类磷脂两亲性梳形嵌段接枝共聚物基超声造影剂，以解决目前的超声造影剂的耐压性和耐机械指数变化不足，拓展超声造影剂的应用范围。
本发明的技术方案：
本发明要解决的第一个技术问题是提供一种类磷脂两亲性梳形嵌段接枝共聚物基超声造影剂，所述超声造影剂包括外壳和内核，所述外壳为类磷脂两亲性梳形嵌段接枝共聚物聚己内酯-b-(聚溴代己内酯-g-聚甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱)(PCL-b-(PBrCL-g-PMPC))，所述内核为超声响应物。
进一步，所述类磷脂两亲性梳形嵌段接枝共聚物为ε-己内酯(CL)和2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱(MPC)经嵌段和接枝共聚得到的共聚物。
进一步，所述类磷脂两亲性梳形嵌段接枝共聚物采用下述方法制得：
(1)制备大分子主链PBrCLp-b-PCLm：首先以环己酮为原料与液溴反应得到α-溴代环己酮，再将α-溴代环己酮与间氯过氧苯甲酸反应得到α-溴代-ε-己内酯(αBrCL)，然后将αBrCL与ε-CL作为单体，以辛酸亚锡为催化剂，开环嵌段聚合得到大分子主链PBrCLp-b-PCLm，其中，p为共聚物主链中αBrCL平均所含的个数，m为CL的聚合度；
(2)制备类磷脂两亲性梳形嵌段接枝共聚物PCL-b-(PBrCL-g-PMPC)：以步骤(1)中得到的PBrCLp-b-PCLm为大分子主链，2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱(MPC)为单体，通过电子转移再生催化剂的原子转移自由基聚合(ARGET ATRP)方法侧链聚合得到类磷脂两亲性梳形嵌段接枝共聚物PCL-b-(PBrCL-g-PMPC)。
进一步，所述超声造影剂中的外壳还包括改性物质M，所述改性物质M是：为外壳提供可避免被体内免疫系统清除的含PEG链段的物质，以增加超声造影剂的循环时间。
进一步，所述改性物质M选自：二棕榈酰磷脂酰乙醇胺-甲氧基聚乙二醇5000(DPPE-mPEG 5000)、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺-甲氧基聚乙二醇2000(DPPE-mPEG2000)、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(DSPE-MPEG2000)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-叠氮聚乙二醇5000(DSPE-PEG5000-N3)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-叠氮聚乙二醇2000(DSPE-PEG2000-N3)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-巯基交连物(DSPE-PEG5000-SH)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-巯基交连物(DSPE-PEG2000-SH)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇5000-氨基交连物(DSPE-PEG5000-NH2)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-氨基交连物(DSPE-PEG2000-NH2)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇5000-羧基交连物(DSPE-PEG5000-COOH)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-羧基交连物(DSPE-PEG2000-COOH)或二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇5000-羟基交连物(DSPE-PEG5000-OH)中的至少一种。
优选的，所述超声造影剂的内核为气态全氟化碳或可相变的液态全氟化碳。
进一步，所述超声造影剂的内核包括全氟丙烷、全氟丁烷、全氟戊烷、全氟己烷或全氟庚烷中的至少一种。
进一步，当所述超声造影剂的内核为可相变的液态全氟化碳时，所述类磷脂两亲性梳形嵌段接枝共聚物基超声造影剂由聚己内酯-b-(聚溴代己内酯-g-聚甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱)和超声响应物通过自组装的方式制得纳米乳，所得纳米乳再经过相变作用形成类磷脂两亲性梳形嵌段接枝共聚物包裹气态全氟化碳的超声造影剂。
进一步，当所述超声造影剂的内核为气态全氟化碳时，所述类磷脂两亲性梳形嵌段接枝共聚物基超声造影剂由聚己内酯-b-(聚溴代己内酯-g-聚甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱)和超声响应物通过自组装的方式制得超声造影剂。
进一步，所述自组装的方式为下述方式中的一种：高速剪切匀浆、高压匀浆、高速振荡或超声声振。
进一步，所述类磷脂两亲性梳形嵌段接枝共聚物基超声造影剂的平均粒径分布范围为5±0.13μm。
进一步，所述类磷脂两亲性梳形嵌段接枝共聚物基超声造影剂用生理盐水进行稀释后，在激光共聚焦显微镜下观察，形态呈球形，分散良好，表面光滑透亮。
本发明要解决的第二个技术问题是提供上述类磷脂两亲性梳形嵌段接枝共聚物基超声造影剂的制备方法，所述制备方法为：将聚己内酯-b-(聚溴代己内酯-g-聚甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱)和超声响应物通过自组装制得聚己内酯-b-(聚溴代己内酯-g-聚甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱)包裹超声响应物的超声造影剂。
进一步，所述自组装采用下述方式中的一种：高速剪切匀浆、高压匀浆、高速振荡或超声声振。
进一步，所述超声响应物为可相变的液态全氟化碳或气态全氟化碳；优选为液态全氟化碳。选择液态可相变的全氟化碳，比气体的稳定性更好，储存的时间更长，可以选择使用之前再进行相变这一步；而直接使用气态的制备的成功率低，且不利于储存。
进一步，当所述超声造影剂中的超声响应物为气态全氟化碳时，所述类磷脂两亲性梳形接枝共聚物基超声造影剂的制备方法为：将聚己内酯-b-(聚溴代己内酯-g-聚甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱)和超声响应物通过直接超声声振或高速振荡的方式制得类磷脂两亲性梳形嵌段接枝共聚物基超声造影剂。
进一步，当所述超声造影剂中的超声响应物为可相变的液态全氟化碳时，所述类磷脂两亲性梳形接枝共聚物基超声造影剂的制备方法为：将聚己内酯-b-(聚溴代己内酯-g-聚甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱)和超声响应物通过自组装的方式制得纳米乳，所得纳米乳再经过温致相变或声致相变形成类磷脂两亲性梳形嵌段接枝共聚物基超声造影剂。当壳层使用类磷脂两亲性梳形嵌段接枝共聚物，内部包裹高温疏水的可相变的液态全氟化碳，利用相似相容原理及亲疏水相互作用，通过自组装的方式制备出纳米乳，也称纳米液粒，再经过相变作用形成可超声造影的类磷脂两亲性共聚物包裹气态全氟化碳的超声造影剂。
进一步，当所述超声造影剂中的超声响应物为可相变的液态全氟化碳时，上述制备方法包括以下步骤：
(1)制备类磷脂两亲性梳形嵌段接枝共聚物聚己内酯-b-(聚溴代己内酯-g-聚甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱)；
(2)制备类磷脂两亲性梳形嵌段接枝共聚物基超声造影剂：将(1)中得到的类磷脂两亲性梳形嵌段接枝共聚物和改性物质M经混合溶剂溶解后，与超声相应物质混合后通过自组装的方式制得制得纳米乳，再分离提纯，然后经温致相变或声致相变后制得类磷脂两亲性梳形嵌段接枝共聚物基超声造影剂；其中，所述改性物质M是：为外壳提供可避免被体内免疫系统清除的含PEG链段的物质；所述混合溶剂为四氢呋喃和甲醇的混合溶剂、或：三氯甲烷和甲醇的混合溶剂。
进一步，步骤(2)中，所述纳米乳分离提纯后经温致相变或声致相变后制得类磷脂两亲性梳形嵌段接枝共聚物基超声造影剂的方法为下述方式中的一种：
方式一：将制备的类磷脂两亲性梳形嵌段接枝共聚物基纳米乳悬浮液，用60～80℃(优选为70℃)水浴5～15min(优选为10min)，制备得到类磷脂两亲性嵌段梳形接枝共聚物基超声造影剂；
方式二：将制备的类磷脂两亲性梳形嵌段接枝共聚物基纳米乳悬浮液，用超声治疗仪超声作用得到类磷脂两亲性梳形嵌段接枝共聚物基超声造影剂，其中，超声功率为1～3W/cm2(优选为3W/cm2)，占空比为20％～80％(优选为50％)，作用时间2～5min(优选为3min)。
优选的，步骤(2)中，所述混合溶剂为体积比在2：1的四氢呋喃和甲醇的混合溶剂。
进一步，上述方法的步骤(2)中，所述改性物质M选自：二棕榈酰磷脂酰乙醇胺-甲氧基聚乙二醇5000(DPPE-mPEG 5000)、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺-甲氧基聚乙二醇2000(DPPE-mPEG2000)、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(DSPE-MPEG2000)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-叠氮聚乙二醇5000(DSPE-PEG5000-N3)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-叠氮聚乙二醇2000(DSPE-PEG2000-N3)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-巯基交连物(DSPE-PEG5000-SH)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-巯基交连物(DSPE-PEG2000-SH)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇5000-氨基交连物(DSPE-PEG5000-NH2)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-氨基交连物(DSPE-PEG2000-NH2)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇5000-羧基交连物(DSPE-PEG5000-COOH)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-羧基交连物(DSPE-PEG2000-COOH)或二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇5000-羟基交连物(DSPE-PEG5000-OH)中的至少一种。
进一步，步骤(1)中制备类磷脂两亲性梳形嵌段接枝共聚物采用下述方法制得：
(1)制备大分子主链PBrCLp-b-PCLm：首先以环己酮为原料与液溴反应得到α-溴代环己酮，再将α-溴代环己酮与间氯过氧苯甲酸反应得到α-溴代-ε-己内酯(αBrCL)，然后将αBrCL与ε-CL作为单体，以辛酸亚锡为催化剂，开环嵌段聚合得到大分子主链PBrCLp-b-PCLm，其中，p为共聚物主链中αBrCL平均所含的个数，m为CL的聚合度；
(2)制备类磷脂两亲性梳形嵌段接枝共聚物PCL-b-(PBrCL-g-PMPC)：以(1)中得到的PBrCLp-b-PCLm为大分子主链，2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱(MPC)为单体，通过电子转移再生催化剂的原子转移自由基聚合(ARGET ATRP)方法侧链聚合得到类磷脂两亲性梳形嵌段接枝共聚物PCL-b-(PBrCL-g-PMPC)。
本发明要解决的第三个技术问题是提供上述类磷脂两亲性梳形嵌段接枝共聚物基超声造影剂的应用，其可应用于超声影像诊断和治疗领域，用于体外琼脂糖模型造影成像；或将其载药后用于体内超声造影成像及治疗。
与现有技术相比，本发明具有以下有益技术效果：
(1)本发明制备得到类磷脂两亲性梳形嵌段接枝共聚物基超声造影剂粒径分布较均匀，稳定性明显优于磷脂基超声造影剂(商用声诺维SonoVue造影剂)，更适合用于超声诊断与治疗研究。
(2)本发明制备的类磷脂两亲性嵌段梳形接枝共聚物基超声造影剂，在超声造影的高机械指数模式下具有显著的增强图像效果，持续时间相比磷脂外壳的造影剂持续时间长，改善了磷脂基超声造影剂在高机械指数造影时间偏短，以及克服了部分高分子材料制备的超声造影剂外壳坚硬，难以显影的缺点。
(3)本发明利用类磷脂两亲性梳形嵌段接枝共聚物包覆液态氟碳制备的相变型超声造影剂(即PCL-b-(PBrCL-g-PMPC)为壳，液态氟碳为核)，探索作为超声造影剂的可行性；体外和体内实验均表明，PCL-b-(PBrCL-g-PMPC)基超声造影剂在多种超声参数条件下都具有良好的回声特性。更重要的是，在相同的超声参数和浓度下，PCL-b-(PBrCL-g-PMPC)基超声造影剂相比于磷脂基超声造影剂的成像时间更长，该PCL-b-(PBrCL-g-PMPC)基超声造影剂具有很大的潜力作为超声成像中的新型造影剂。
(4)本发明所得类磷脂两亲性梳形嵌段接枝共聚物基超声造影剂中的类磷脂两亲性梳形接枝共聚物具有结构可控、安全无毒、成本明显低于合成磷脂，且制备工艺简便。此外，该制备方法可以在临床超声造影领域得到广泛应用且也可用于多种治疗药物的载体，具有较好的临床应用前景。
附图说明：
图1为本发明类磷脂两亲性梳形嵌段接枝共聚物PCL-b-(PBrCL-g-PMPC)的合成路线图及超声造影剂制备示意图。
图2为实施例所得聚合物PCL34、PCL34-b-PBrCL5和PCL34-b-(PBrCL5-g-PMPC5×5)的核磁谱图。
图3为实施例所得聚合物PCL34、PCL34-b-PBrCL5和PCL34-b-(PBrCL5-g-PMPC5×5)的红外谱图。
图4为实施例所得聚合物聚合物PCL43和PCL34-b-(PBrCL5-g-PMPC5×5)的DSC升温曲线(a)和降温曲线(b)。
图5为实施例所得类磷脂两亲性嵌段梳形接枝共聚物PCL34-b-(PBrCL5-g-PMPC5×5)基超声造影剂的CLSM照片(a)、size分布图(b)和size及zeta数据(c)。
图6为实施例所得类磷脂两亲性梳形嵌段接枝共聚物PCL34-b-(PBrCL5-g-PMPC5×5)基超声造影剂的体外不同超声参数的造影图和对应的灰度值-频率(a,d)、灰度值-机械指数MI(b,e)和灰度值-浓度(c,f)。
图7为实施例所得类磷脂两亲性梳形嵌段接枝共聚物PCL34-b-(PBrCL5-g-PMPC5×5)基超声造影剂的体外造影效果随时间的变化超声造影图(a)和对应的灰度值(b)。
图8a为实施例所得类磷脂两亲性梳形嵌段接枝共聚物PCL34-b-(PBrCL5-g-PMPC5×5)基超声造影剂的动物体内造影效果随时间的变化超声造影图(a)和对应的灰度值(b)；其中红色圆圈表示兔子的肾脏显影区域。
具体实施方式
本发明要解决的第一个技术问题是提供一种类磷脂两亲性梳形嵌段接枝共聚物基超声造影剂，所述超声造影剂包括外壳和内核，所述外壳为类磷脂两亲性梳形嵌段接枝共聚物聚己内酯-b-(聚溴代己内酯-g-聚甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱)(PCL-b-(PBrCL-g-PMPC))，所述内核为超声响应物。
本发明要解决的第二个技术问题是提供上述类磷脂两亲性梳形嵌段接枝共聚物基超声造影剂的制备方法，所述制备方法为：将聚己内酯-b-(聚溴代己内酯-g-聚甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱)和超声响应物通过自组装制得聚己内酯-b-(聚溴代己内酯-g-聚甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱)包裹超声响应物的超声造影剂。
本发明要解决的第三个技术问题是提供上述类磷脂两亲性梳形嵌段接枝共聚物基超声造影剂的应用，其可应用于超声影像诊断和治疗领域，用于体外琼脂糖模型造影成像；或将其载药后用于体内超声造影成像及治疗。
下面结合实施例对本发明的具体实施方式做进一步的描述，并不因此将本发明限制在所述的实例范围之中。
实施例1
1、类磷脂两亲性梳形嵌段接枝共聚物基超声造影剂的制备
1)PCL34-b-(PBrCL5-g-PMPC5×5)共聚物的制备：
①α-溴环己酮的合成与表征：将环己酮(31.00g,0.3159mol)和去离子水(200.0mL)加入到烧瓶(500mL)中，并用磁转子搅拌；然后，在5h内逐滴加入液溴(50.61g，0.3167mol)，在此期间，控制温度保持在25～30℃；滴加完成后，继续搅拌直至反应混合物无色(约1h)。将下层有机层与水层分离，并用无水MgSO4干燥；通过蒸馏获得纯的α-溴环己酮(26.7g，47％产率)。
②α-溴-ε-己内酯(αBrCL)的合成与表征：将3-氯过氧苯甲酸(36.80g，0.1599mol，75％)加入到α-溴环己酮(26.70g，0.1508mol)的CH2Cl2(200.0mL)溶液中；在室温下搅拌48h后，将反应烧瓶置于冰箱中3h以沉淀反应中生成的3-氯苯甲酸；然后将溶液过滤并用Na2S2O3饱和溶液(50.00mL)洗涤3次，用NaHCO3溶液(50.00mL)洗涤3次，最后用去离子水洗涤直至pH＝7.0；有机相用无水MgSO4干燥过夜；滤出MgSO4后，通过旋转蒸发除去溶剂CH2Cl2；将粗产物溶解在石油醚和乙酸乙酯(V/V，10/3)的混合物中，并通过用相同溶剂制备的硅胶柱，收集第二部分；通过旋转蒸发除去溶剂，并将白色固体在室温下真空干燥过夜。产量：20.20g(69％)。
③PCL34的合成与表征：将月桂醇(0.82g,0.004mol)，ε-CL(10.13g,0.089mol)和Sn(Otc)2(4.05g,0.01mol)加入到反应容器中；除去其中的O2和残留水；在120℃真空下反应24小时；将粗产物溶解在CH2Cl2中，并通过冷甲醇沉淀纯化得到PCL34。
④PCL34-b-PBrCL5的合成与表征：将③中得到的PCL34(5.00g)与②中得到的αBrCL(0.9670g，5.010mmol)加入Schlenk烧瓶中并搅拌，然后，将辛酸亚锡催化剂(5.200mg，0.1wt％)加入到先前的混合物中；脱氧操作后，混合物在N2下于120℃反应24h。将粗产物溶于CH2Cl2中，并使用冷甲醇形成沉淀；得到最终产物PCL34-b-PBrCL5。
⑤PCL34-b-(PBrCL5-g-PMPC5×5)的合成与表征：通过ARGET(电子转移再生活化剂)ATRP方法合成梳形嵌段-接枝共聚物PCL34-b-(PBrCL5-g-PMPC5×5)，其中，PMPC5×5中5×5表示PMPC侧链的聚合度为5，共聚物主链上PMPC侧链的平均数为5；将Me6TREN(20μL)，CuBr2(8.200mg)和THF/MeOH的混合溶液(V/V＝6/6mL)添加到Schlenk烧瓶中并搅拌；然后，在N2下添加MPC(1.117g)，PCL34-b-PBrCL5(0.3615g)和维生素C(6.500mg)；进行三个冷冻-抽真空-融化循环，混合物在N2下于35℃反应24h；透析粗溶液72h；然后，冷冻干燥所得悬浮液并获得梳形嵌段-接枝共聚物PCL34-b-(PBrCL5-g-PMPC5×5)。
2)超声造影剂的制备：
具体制备过程如下：分别称取3mg PCL34-b-(PBrCL5-g-PMPC5×5)共聚物和1mgDPPE-mPEG 5000溶解于567μL四氢呋喃(THF)和283μL甲醇(MeOH)中(2:1，v/v)，水浴超声充分分散溶解后，加入2mLPBS缓冲液(0.01M，pH＝7.4)，然后再加入150μL全氟戊烷(PFP)；在冰水浴环境下，用探头超声乳化，其中超声参数：频率24KHz，功率35W，超声开3s后关6s，声振探头直径3mm，处理时间3min，形成乳白色悬浮液，然后在3000g的离心力下离心5min，弃去上清液，加入6mLPBS进行重悬；将得到的共聚物基纳米乳悬浮液，用70℃水浴作用10min，制备得到类磷脂两亲性梳形嵌段接枝共聚物基超声造影剂。
2、类磷脂两亲性梳形嵌段接枝共聚物的表征
图2为聚合物PCL34、PCL34-b-PBrCL5和PCL34-b-(PBrCL5-g-PMPC5×5)的核磁谱图，PCL的链段特征峰(δ＝4.1ppm；δ＝2.3ppm；δ＝1.7ppm；δ＝1.4ppm)均出现在核磁谱图上，表明PCL的成功合成，PCL的聚合度由峰的面积比计算得到；通过计算可知，本发明成功得到了聚合度分别为40的共聚物；特征峰的出现，表明PMPC链段成功接枝到PCL链段上；同时PMPC链段的聚合度由峰的面积比进行确定。
通过红外进一步表征了聚合物的结构，结果如图3所示；1728cm-1处的尖峰为C＝O的伸缩振动峰，2910cm-1处为连续的亚甲基吸收峰。可以发现，PCL34-b-(PBrCL5-g-PMPC5×5)在红外谱图中出现了与磷脂胆碱结构相关的特征吸收峰(1090cm-1和1230cm-1，-POCH2-；970cm-1，N+(CH3)3)，也表明PCL34-b-(PBrCL5-g-PMPC5×5)共聚物的成功合成。
通过DSC测试所合成聚合物的热性能，结果如图4所示；由图4可知，PCL均聚物具有最高结晶温度、熔融温度和结晶度等数据；与PCL相比，PCL34-b-(PBrCL5-g-PMPC5×5)共聚物随着非结晶型PMPC链段的引入，PCL在结晶时，链段的规整性排列受阻，从而导致各项数据降低。
3、微泡的表征
加入PBS和PFP后的PCL34-b-(PBrCL5-g-PMPC5×5)共聚物溶液在声振处理后，变成了不透明的乳白色悬浮液，除去有机溶剂后，再以温度触发PFP的相变后，仍为乳白色悬浮溶液；在相变后共聚物基超声造影剂的粒径变化，如图5所示。PCL34-b-(PBrCL5-g-PMPC5×5)共聚物及超声造影剂的粒径尺寸分布范围较窄，利用马尔文纳米粒度分析仪测得PCL34-b-(PBrCL5-g-PMPC5×5)共聚物基超声造影剂的平均粒径约在5μm左右。
3、稳定性实验
将库尔特测得本发明所得共聚物基超声造影剂和参照样磷脂基超声造影剂(商用声诺维Sonovue造影剂)的浓度进行稀释，使得共聚物基超声造影剂和磷脂基超声造影剂具有相同浓度，放置于4℃的冰箱静置24h后取样显微镜下观察，结果磷脂基超声造影剂浓度低于共聚物基超声造影剂，表明共聚物基超声造影剂稳定性明显高于磷脂基超声造影剂。
4、体外造影及爆破实验
用0.3mL步骤1制备得到的共聚物基超声造影剂，加入到琼脂糖凝胶模型中，采用西门子彩色成像系统(SIEMENS Acuson Antares)，在Cadence造影剂成像(CCAI)模式下(MI＝0.21)观察，见模型内回声明显增强，呈密集细点状回声，并且观察到从超声频率4.0MHz到10.0MHz回声强度的变化，在该超声成像系统中，造影剂的最佳显影频率为5.71MHz(见图6)；启动爆破(MI＝0.67)模式将造影剂击破，模型内回声瞬间降低，细点状回声数量急剧下降。
5、新西兰大白兔肝脏造影
雄性新西兰大白兔，体量为2.5～3kg，固定于实验台，耳缘静脉置入留置针，右侧腰背部脱毛后，采用耳缘静脉团注的方法，分别注射SonoVue和PCL34-b-(PBrCL5-g-PMPC5×5)共聚物造影剂，以获得了肝脏的超声造影图像。在对照组实验中，只注射PBS缓冲盐溶液，在超声图像为暗区，结果如图8所示。相比PBS对照组，分别静脉注射SonoVue和PCL34-b-(PBrCL5-g-PMPC5×5)共聚物造影剂后，肝脏区域开始出现明显的对比增强。肝脏明亮的超声图像表明PCL34-b-(PBrCL5-g-PMPC5×5)共聚物造影剂在血液循环过程中成功地通过肺毛细血管，这是静脉造影剂安全性能所必需的。从图8可以看出，SonoVue造影剂的超声信号强度在20s时基本与PCL34-b-(PBrCL5-g-PMPC5×5)共聚物造影剂的造影图像强度相当；但在40s时，SonoVue微泡的超声信号便迅速降低，80s时基本消失，而PCL34-b-(PBrCL5-g-PMPC5×5)共聚物造影剂在80s后，仍然具有可以观察的造影信号。这说明PCL34-b-(PBrCL5-g-PMPC5×5)嵌段接枝共聚物超声造影剂，相比于SouoVue造影剂，具有更长的体内持续时间，证明其有作为新型诊断治疗作用的超声造影剂的巨大潜力。
实施例2
采用与实施例1不同的方法，剪切法制备PCL34-b-(PBrCL5-g-PMPC5×5)造影剂，具体制备过程如下：
分别称取3mg PCL34-b-(PBrCL5-g-PMPC5×5)共聚物和1mg DPPE-mPEG 5000溶解于567μL四氢呋喃(THF)和283μL甲醇(MeOH)中(2:1，v/v)，水浴超声充分分散溶解后，加入2mLPBS缓冲液(0.01M，pH＝7.4)，然后再加入150μL全氟戊烷(PFP)；在冰水浴条件下，加入液态全氟戊烷，采用的电动内切匀浆法，其匀浆转速为12000～30000rpm，匀浆时间1～3min，匀浆后得包裹全氟戊烷的乳白色的接枝聚合物混合液。
将上述混合液，用治疗超声仪使其相变，形成PCL34-b-(PBrCL5-g-PMPC5×5)类磷脂两亲性梳形嵌段接枝共聚物基超声造影剂，超声仪的参数为3W/cm2，占空比为50％，作用时间3min。
实施例3
冻干法制备PCL34-b-(PBrCL5-g-PMPC5×5)造影剂，具体制备过程如下：分别称取3mgPCL34-b-(PBrCL5-g-PMPC5×5)共聚物和1mg DPPE-mPEG 5000溶解于567μL四氢呋喃(THF)和283μL甲醇(MeOH)中(2:1，v/v)，水浴超声充分分散溶解后，加入2mLPBS缓冲液(0.01M，pH＝7.4)，然后再加入150μL全氟戊烷(PFP)。在冰盐水浴条件下，进行超声声振，探头频率24KHz，功率35W，超声开3s，关6s，作用3min，形成乳白色悬浮液，然后在3000g离心力作用下离心5min，弃去上清液，各加入6mL含10％wt的蔗糖溶液进行重悬；用10mL规格的西林瓶，按照每瓶2mL体积分装，放入-20℃冰箱预冻过夜，冷冻干燥机进行冷冻干燥24h，其中冷阱温度设置为-80℃。
将制备得到的冻干粉末，可以通过换气装置填充全氟丙烷、全氟丁烷、六氟化硫等气体，换气后用2mL生理盐水重组，得到乳白色的共聚物悬液，将重组的微泡混悬液进行机械震荡，震荡作用时间1min，震荡频率为75Hz，制备得到PCL34-b-(PBrCL5-g-PMPC5×5)类磷脂两亲性梳形嵌段接枝共聚物基超声造影剂。
根据以上的三个实施例可知，本发明采用不同制备方法制备的PCL34-b-(PBrCL5-g-PMPC5×5)类磷脂两亲性梳形嵌段接枝共聚物基超声造影剂，形态呈球形，分散良好，表面光滑透亮，大小较均匀(见图5)，平均粒径分布范围为5±0.13μm。
机械指数值(MI)对超声造影图像有很大影响，其实质上决定了超声波的强度，因为具有较高能量的超声驱动，造影剂可以更加强烈反射回波信号，而当MI过大时，则可能引起造影剂的破裂而失去造影效果；与磷脂基造影剂相比，PCL34-b-(PBrCL5-g-PMPC5×5)类磷脂两亲性梳形嵌段接枝共聚物基超声造影剂可以耐受更高的超声机械指数的作用，保持完整的形态结构。
超声辐照后PCL34-b-(PBrCL5-g-PMPC5×5)共聚物基超声造影信号强度随时间的变化情况，通过在不同的时间点分别获取PCL34-b-(PBrCL5-g-PMPC5×5)共聚物基超声造影剂和SonoVue造影剂的超声图像，并分析共聚物基超声造影剂和SonoVue造影图像平均灰度值的变化，结果如图7所示。从图7中可以看出，随着时间的延长，SonoVue微泡在1～3min之间产生的超声图像的亮度就迅速变暗，超声信号强度急剧下降，到4min后几乎失去造影效果。而PCL34-b-(PBrCL5-g-PMPC5×5)共聚物基超声造影剂的超声图像，其亮度则表现出比较好的稳定性，在1-3min之间图像的亮度缓慢的变暗，超声信号强度缓慢下降，到6min后趋于稳定，并且在体外20min时仍然具有一定的造影效果。
然而，SonoVue超声造影剂产生的超声信号在大约3min的时间内急剧下降，降低到其初始强度的约20％，20min时仅有初始强度的2.5％；但PCL34-b-(PBrCL5-g-PMPC5×5)共聚物基超声造影剂的超声信号强度可以保持约20min，与其初始超声信号强度相比，最高降低到其初始强度的23％，最低则仅降低到其初始强度的50％。PCL34-b-(PBrCL5-g-PMPC5×5)共聚物基超声造影剂较强的稳定性归因于PCL34-b-(PBrCL5-g-PMPC5×5)共聚物可以在水溶液中形成稳定的核壳结构，这为在超声辐射下保持PFP气体在内核中不会扩散溶解提供了强大的屏障，而SonoVue超声造影剂的脂质壳层的仅有约4nm的厚度，在超声辐射下微泡内的气体会很快地通过这个壳层而扩散出去，从而使SonoVue超声造影剂的造影能力迅速下降。此外，PCL34-b-(PBrCL5-g-PMPC5×5)共聚物基超声造影剂中的气态PFP相比于SonoVue超声造影剂中的SF6气体，具有更低的水溶性，这也有助于增强PCL34-b-(PBrCL5-g-PMPC5×5)共聚物基超声造影剂的稳定性。这样使得PCL34-b-(PBrCL5-g-PMPC5×5)共聚物基超声造影剂具有较长的循环周期，为临床诊断提供了更长的成像时间窗口。
由上述可知，本发明所得的类磷脂两亲性梳形嵌段接枝共聚物基超声造影剂，应用于体外模型超声造影成像，设定微泡的浓度为5.0×108个/mL和机械指数MI＝0.2后，在4～10MHz的频率范围内获得超声造影图像，并分析共聚物超声造影剂的造影图像平均灰度值随频率的变化，由于超声造影剂的共振频率与超声驱动频率之间存在差异，导致随着频率从4MHz增大到5.71MHz后，部分PCL-b-(PBrCL-g-PMPC)共聚物基超声造影剂的超声造影图像的亮度增大。当频率增大6.67MHz后，所有超声造影图像的亮度都迅速减小；到7.27MHz后图像的亮度基本保持不再变化。当超声频率选择在5.71MHz时，超声造影剂的造影图像灰度值最大。共聚物基超声造影剂相比SonoVue造影剂，共聚物基超声造影剂具有更长的持续时间。所述的类磷脂两亲性梳形嵌段接枝共聚物基超声造影剂，应用于新西兰大白兔体内超声造影成像，表明该超声造影剂具有一定的体内造影效果，类磷脂两亲性梳形嵌段接枝共聚物基超声造影剂相比于磷脂基造影剂在高机械指数下的造影时间得到延长。

Claims (18)

1.一种类磷脂两亲性梳形嵌段接枝共聚物基超声造影剂，其特征在于，所述超声造影剂包括外壳和内核，所述外壳为类磷脂两亲性梳形嵌段接枝共聚物聚己内酯-b-（聚溴代己内酯-g-聚甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱），所述内核为超声响应物。
2.根据权利要求1所述的类磷脂两亲性梳形嵌段接枝共聚物基超声造影剂，其特征在于，所述类磷脂两亲性梳形嵌段接枝共聚物为ε-己内酯和2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱经嵌段和接枝共聚得到的共聚物。
3.根据权利要求1或2所述的类磷脂两亲性梳形嵌段接枝共聚物基超声造影剂，其特征在于，所述超声造影剂中的外壳还包括改性物质M，所述改性物质M是：为外壳提供可避免被体内免疫系统清除的含PEG链段的物质。
4.根据权利要求3所述的类磷脂两亲性梳形嵌段接枝共聚物基超声造影剂，其特征在于，所述改性物质M选自：二棕榈酰磷脂酰乙醇胺-甲氧基聚乙二醇5000、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺-甲氧基聚乙二醇2000、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-叠氮聚乙二醇5000、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-叠氮聚乙二醇2000、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-巯基交连物、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇5000-氨基交连物、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-氨基交连物、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇5000-羧基交连物、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-羧基交连物或二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇5000-羟基交连物中的至少一种。
5.根据权利要求4所述的类磷脂两亲性梳形嵌段接枝共聚物基超声造影剂，其特征在于，所述改性物质M选自二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-巯基交连物。
6.根据权利要求1或2所述的类磷脂两亲性梳形嵌段接枝共聚物基超声造影剂，其特征在于，所述超声造影剂的内核为气态全氟化碳或可相变的液态全氟化碳。
7.根据权利要求6所述的类磷脂两亲性梳形嵌段接枝共聚物基超声造影剂，其特征在于，所述超声造影剂的内核包括全氟丙烷、全氟丁烷、全氟戊烷、全氟己烷或全氟庚烷中的至少一种。
8.根据权利要求6所述的类磷脂两亲性梳形嵌段接枝共聚物基超声造影剂，其特征在于，当所述超声造影剂的内核为可相变的液态全氟化碳时，所述类磷脂两亲性梳形嵌段接枝共聚物基超声造影剂由聚己内酯-b-（聚溴代己内酯-g-聚甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱）和超声响应物通过自组装的方式制得纳米乳，所得纳米乳再经过相变作用形成类磷脂两亲性梳形嵌段接枝共聚物包裹气态全氟化碳的超声造影剂。
9.根据权利要求6所述的类磷脂两亲性梳形嵌段接枝共聚物基超声造影剂，其特征在于，当所述超声造影剂的内核为气态全氟化碳时，所述类磷脂两亲性梳形嵌段接枝共聚物基超声造影剂由聚己内酯-b-（聚溴代己内酯-g-聚甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱）和超声响应物通过自组装的方式制得超声造影剂。
10.根据权利要求8或9所述的类磷脂两亲性梳形嵌段接枝共聚物基超声造影剂，其特征在于，所述自组装的方式为下述方式中的一种：高速剪切匀浆、高压匀浆、高速振荡或超声声振。
11.根据权利要求1或2所述的类磷脂两亲性梳形嵌段接枝共聚物基超声造影剂，其特征在于，所述类磷脂两亲性梳形嵌段接枝共聚物基超声造影剂用生理盐水进行稀释后，在激光共聚焦显微镜下观察，形态呈球形，分散良好，表面光滑透亮。
12.权利要求1～11任一项所述的类磷脂两亲性梳形嵌段接枝共聚物基超声造影剂的制备方法，其特征在于，所述制备方法为：将聚己内酯-b-（聚溴代己内酯-g-聚甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱）和超声响应物通过自组装制得聚己内酯-b-（聚溴代己内酯-g-聚甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱）包裹超声响应物的超声造影剂。
13.根据权利要求12所述的类磷脂两亲性梳形嵌段接枝共聚物基超声造影剂的制备方法，其特征在于，所述自组装采用下述方式中的一种：高速剪切匀浆、高压匀浆、高速振荡或超声声振。
14.根据权利要求12所述的类磷脂两亲性梳形嵌段接枝共聚物基超声造影剂的制备方法，其特征在于，所述超声响应物为可相变的液态全氟化碳或气态全氟化碳；
当所述超声造影剂中的超声响应物为气态全氟化碳时，所述类磷脂两亲性梳形接枝共聚物基超声造影剂的制备方法为：将聚己内酯-b-（聚溴代己内酯-g-聚甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱）和超声响应物通过直接超声声振或高速振荡的方式制得类磷脂两亲性梳形嵌段接枝共聚物基超声造影剂；
当所述超声造影剂中的超声响应物为可相变的液态全氟化碳时，所述类磷脂两亲性梳形接枝共聚物基超声造影剂的制备方法为：将聚己内酯-b-（聚溴代己内酯-g-聚甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱）和超声响应物通过自组装的方式制得纳米乳，所得纳米乳再经过温致相变或声致相变形成类磷脂两亲性梳形嵌段接枝共聚物基超声造影剂。
15.根据权利要求14所述的类磷脂两亲性梳形嵌段接枝共聚物基超声造影剂的制备方法，其特征在于，当所述超声造影剂中的超声响应物为可相变的液态全氟化碳时，所述制备方法包括以下步骤：
（1）制备类磷脂两亲性梳形嵌段接枝共聚物聚己内酯-b-（聚溴代己内酯-g-聚甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱）；
（2）制备类磷脂两亲性梳形嵌段接枝共聚物基超声造影剂：将步骤（1）中得到的类磷脂两亲性梳形嵌段接枝共聚物和改性物质M经混合溶剂溶解后，与超声相应物质混合后通过自组装的方式制得纳米乳，再分离提纯，然后经温致相变或声致相变后制得类磷脂两亲性梳形嵌段接枝共聚物基超声造影剂；其中，所述改性物质M是：为外壳提供可避免被体内免疫系统清除的含PEG链段的物质；所述混合溶剂为四氢呋喃和甲醇的混合溶剂或三氯甲烷和甲醇的混合溶剂；步骤（2）中，所述混合溶剂为体积比在2：1的四氢呋喃和甲醇的混合溶剂。
16.根据权利要求15所述的类磷脂两亲性梳形嵌段接枝共聚物基超声造影剂的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，所述纳米乳分离提纯后经温致相变或声致相变后制得类磷脂两亲性梳形嵌段接枝共聚物基超声造影剂的方法为下述方式中的一种：
方式一：将制备的类磷脂两亲性梳形嵌段接枝共聚物基纳米乳悬浮液，用60 ~ 80 ℃水浴5 ~ 15 min，制备得到类磷脂两亲性嵌段梳形接枝共聚物基超声造影剂；
方式二：将制备的类磷脂两亲性梳形嵌段接枝共聚物基纳米乳悬浮液，用超声治疗仪超声作用得到类磷脂两亲性梳形嵌段接枝共聚物基超声造影剂，其中，超声功率为1 ~ 3W/cm2，占空比为20% ~ 80%，作用时间2 ~ 5 min。
17.根据权利要求15所述的类磷脂两亲性梳形嵌段接枝共聚物基超声造影剂的制备方法，其特征在于，所述两亲性梳形嵌段接枝共聚物聚己内酯-b-（聚溴代己内酯-g-聚甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱）采用下述方法制得：
（1）制备大分子主链PBrCLp-b-PCLm：
首先以环己酮为原料与液溴反应得到α-溴代环己酮，再将α-溴代环己酮与间氯过氧苯甲酸反应得到α-溴代-ε-己内酯，然后将α-溴代-ε-己内酯与ε-己内酯作为单体，以辛酸亚锡为催化剂，开环嵌段聚合得到大分子主链PBrCLp-b-PCLm，其中，p为共聚物主链中α-溴代-ε-己内酯平均所含的个数，m为己内酯的聚合度；
（2）制备类磷脂两亲性梳形嵌段接枝共聚物：以步骤（1）中得到的PBrCLp-b-PCLm为大分子主链，2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱为单体，通过电子转移再生催化剂的原子转移自由基聚合方法侧链聚合得到类磷脂两亲性梳形嵌段接枝共聚物。
18.类磷脂两亲性梳形嵌段接枝共聚物基超声造影剂用于体外琼脂糖模型造影成像；其中，所述类磷脂两亲性梳形嵌段接枝共聚物基超声造影剂为权利要求1～11任一项所述的超声造影剂，或为权利要求12～17任一项所述的制备方法制得的超声造影剂。
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