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CN110904213B - 一种基于肠道菌群的溃疡性结肠炎生物标志物及其应用 - Google Patents

一种基于肠道菌群的溃疡性结肠炎生物标志物及其应用 Download PDF

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CN110904213B CN201911267223.3A CN201911267223A CN110904213B CN 110904213 B CN110904213 B CN 110904213B CN 201911267223 A CN201911267223 A CN 201911267223A CN 110904213 B CN110904213 B CN 110904213B
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ulcerative colitis
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Qilu Hospital of Shandong University
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Abstract

本发明提供一种基于肠道菌群的溃疡性结肠炎生物标志物及其应用，属于生物医药技术领域。本发明的提供基于肠道菌群的溃疡性结肠炎生物标志物可以克服现有溃疡性结肠炎诊断不能做到早期预警、不能预测发病以及发展趋势等缺点，能够帮助疾病病理分型以及为药物作用靶点研究、精准用药、发病机理的研究等，因此具有良好的实际应用之价值。

Description

一种基于肠道菌群的溃疡性结肠炎生物标志物及其应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种基于肠道菌群的溃疡性结肠炎生物标志物及其应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)，也称非特异性溃疡性结肠炎是一种会导致结肠与直肠发炎与溃疡的慢性疾病。其发作时的主要症状包括腹痛与伴有血便的腹泻，体重减轻、发热以及贫血的症状也有可能在溃疡性结肠炎发作时出现。通常其症状发生的进程缓慢，且会轻重不一，其症状表现常间歇出现，两次发作中间常伴随有一段无症状期。
溃疡性结肠炎可发生于任何年龄，但通常在30岁之前开始，少数患者在50～70岁间初次发病，尽管既往研究表明溃疡性结肠炎发病是由遗传因素及环境因素共同作用所致，但目前对溃疡性结肠炎的诊断仍依赖于症状学评价，尚无可靠的生物学标记物标识。此外，现有的诊断标准不能早期预测发病，疗效及预后。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供一种基于肠道菌群的溃疡性结肠炎生物标志物及其应用，提供可以克服现有溃疡性结肠炎诊断不能做到早期预警、不能预测发病以及发展趋势等缺点，能够帮助疾病病理分型以及为药物作用靶点研究、精准用药、发病机理的研究等。
为实现上述技术目的，本发明采用的技术方案如下：
本发明的第一个方面，提供一种生物标志物，所述生物标志物包括选自下列中的至少一种：
Blautia和/或其类似物；
unclassified_Ruminococcaceae和/或其类似物；
Clostridium XlVa和/或其类似物；
Lachnospiracea_incertae_sedis和/或其类似物；
Roseburia和/或其类似物；
Bifidobacterium和/或其类似物；
Gemmiger和/或其类似物；
Enterococcaceae和/或其类似物；
Adlercreutzia和/或其类似物；
Clostridium IV和/或其类似物。
进一步的，所述Blautia的类似物与Blautia相比，比对相似度在85％以上，如85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％和100％。
所述unclassified_Ruminococcaceae的类似物与unclassified_Ruminococcaceae相比，比对相似度在85％以上，如85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％和100％。
所述Clostridium XlVa的类似物与Clostridium XlVa相比，比对相似度在85％以上，如85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％和100％。
所述Lachnospiracea_incertae_sedis的类似物与Lachnospiracea_incertae_sedis相比，比对相似度在85％以上，如85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％和100％。
所述Roseburia的类似物与Roseburia相比，比对相似度在85％以上，如85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％和100％。
所述Bifidobacterium的类似物与Bifidobacterium相比，比对相似度在85％以上，如85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％和100％。
所述Gemmiger的类似物与Gemmiger相比，比对相似度在85％以上，如85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％和100％。
所述Enterococcaceae的类似物与Enterococcaceae相比，比对相似度在85％以上，如85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％和100％。
所述Adlercreutzia的类似物与Adlercreutzia相比，比对相似度在85％以上，如85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％和100％。
所述Clostridium IV的类似物与Clostridium IV相比，比对相似度在85％以上，如85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％和100％。
这些生物标志物均可以作为溃疡性结肠炎检测的生物学标记物，可以通过确定对象肠道菌群中是否存在这些标志物中的一种或者两种或者多种，从而有效地确定检测对象是否患有或者易感溃疡性结肠炎(即预测患有溃疡性结肠炎的风险)，并且还可以进一步将这些生物标志物用于监控溃疡性结肠炎患者的治疗效果。另外，当健康样本量足够多的时候，本领域技术人员还可以根据检验和计算方法，得到每个生物标志物在肠道中的正常值或者正常的范围，从而用来指示每种标志物在健康样本中的含量，由此，通过对检测样本中这些生物标志物的至少一种在肠道菌群中的含量进行检测，来确定对象是否患有或者易感溃疡性结肠炎，同时可以用来监控溃疡性结肠炎患者的治疗效果的效率。而且本领域技术人员可知的是，当某种未知的微生物或者某种核酸来源的某些基因序列与某种已知菌株的基因序列相比，比对相似度在85％以上的时候，即可认为该微生物与该菌株属于同一属，或者可以将基因序列归类到与该菌株同属，而同属的微生物通常具有相同或相似的功能，因此，也可以利用这些类似物作为溃疡性结肠炎的标志物。
本发明中比对相似性，也可以称为比对相似度，是指序列比对过程中目标序列(待确定的序列)和参考序列(已知序列)之间相同碱基或氨基酸残基序列所占比例的大小。
本发明的第二方面，提供一种诊断对象是否患有溃疡性结肠炎或相关疾病或者预测对象是否患有溃疡性结肠炎或相关疾病的风险的方法。所述方法包括步骤：(1)从所述对象中采集样本；(2)确定步骤(1)中获得的所述样本中的生物标志物的相对丰度信息，所述生物标志物为根据本发明的第一方面的生物标志物；(3)将步骤(2)中所述的相对丰度信息与参考数据集与参考值进行比较。
需要说明的是，所述方法不仅仅用于专利法意义上的疾病诊断，同时可以用作科学研究或者其他个人遗传信息的丰富以及遗传信息库的丰富等非疾病诊断。利用检测对象中的各生物标志物的相对丰度信息与参考数据集或参考值进行比较，来确定对象是否患有溃疡性结肠炎或相关疾病，或者预测其患有溃疡性结肠炎或者相关疾病的风险。
本发明中所述参考数据集指的是对已确诊为患病个体和健康个体的样本进行操作，所获得的各生物标志物的相对丰度信息，用来作为每种生物标志物的相对丰度的参考。在本发明的一个实施方案中，参考数据集是指训练数据集。根据本发明，所述训练集是指和验证集具有本领域公知的含义。
在本发明的一个实施方案中，所述训练集是指包含一定样本数的溃疡性结肠炎受试者和非溃疡性结肠炎受试者待测样本中的各生物标志物的含量的数据集合。所述验证集是用来测试训练集性能的独立数据集合。
本发明中所述参考值指的是健康对照的参考值或正常值。本领域技术人员已知，当样本容量足够大时，可利用本领域公知的检测和计算方法获得样品中每个生物标志物的正常值(绝对值)的范围。当采用测定方法检测生物标志物的水平时，可将样品中的生物标志物水平的绝对值直接与参考值进行比较，以评估患病风险以及诊断或早期诊断溃疡性结肠炎或相关疾病，任选地，可以包括统计方法。
本发明中所述溃疡性结肠炎相关疾病，意指与溃疡性结肠炎相互关联的疾病，包括引发溃疡性结肠炎的前期的症状或疾病，以及由溃疡性结肠炎引发的后续的或者并发的症状或疾病，也包括各种类型的溃疡性结肠炎，例如慢性复发型溃疡性结肠炎、慢性持续型溃疡性结肠炎、急性暴发型溃疡性结肠炎、初发型溃疡性结肠炎等。
根据本发明的实施例，所述参考数据集包括来自多个溃疡性结肠炎患者和多个健康对照的样本中生物标志物的相对丰度信息，所述生物标志物为根据本发明第一方面的生物标志物。
根据本发明的实施例，在将步骤(2)中所述的相对丰度信息与参考数据集进行比较的步骤中，还包括执行多元统计模型以获得患病概率。利用多元统计模型可以实现快速高效检测。
根据本发明的实施例，所述多元统计模型为随机森林模型。
根据本发明的实施例，所述患病概率大于阈值表明所述对象患有溃疡性结肠炎或相关疾病或者有患有溃疡性结肠炎或相关疾病的风险。
根据本发明的实施例，所述阈值为0.5。
根据本发明的实施例，步骤(2)中所述生物标志物的相对丰度信息是利用测序方法得到的，进一步包括：从所述对象的所述样本中分离得到核酸样本，基于所获得的所述核酸样本，构建DNA文库，对所述DNA文库进行测序，以便获得测序结果，以及基于所述测序结果，将测序结果与参考基因集进行比对，以确定所述生物标志物的相对丰度信息。根据本发明的一种实施例，可以利用SOAP2和MAQ的至少一种将测序结果与参考基因集进行比对，由此，可以提高比对的效率，进而可以提高溃疡性结肠炎检测的效率。根据本发明的实施例，可以同时对多种(至少两种)生物标志物进行检测，可以提高溃疡性结肠炎检测的效率。
根据本发明的实施例，所述参考基因集包括从多个溃疡性结肠炎患者和多个健康对照的样本中进行宏基因组测序，获得非冗余基因集，然后将所述非冗余基因集与肠道微生物基因集合并，得到所述参考基因集。本发明中的参考基因集可以是已有的基因集，如现有的已经公开的肠道微生物参考基因集；也可以是将多个溃疡性结肠炎患者和多个健康对照的样品进行宏基因组测序，获得非冗余基因集，然后将所述非冗余基因集与肠道微生物基因集合并，得到所述参考基因集，由此获得的参考基因集信息更全面，检测结果更可靠。
本发明中所述非冗余基因集作本领域技术人员通常的理解来解释，简单来说是去除冗余基因后的剩余基因的集合。冗余基因通常指的是一条染色体上出现的一个基因的多个复份。
根据本发明的实施例，所述样本为粪便样本。
根据本发明的实施例，所述测序方法是通过第二代测序方法或第三代测序方法进行的。进行测序的手段并不受特别限制，通过二代或者三代测序的方法进行测序，可以实现快速高效的测序。
根据本发明的实施例，所述测序方法是通过选自Hiseq2000、SOLiD、454、和单分子测序装置的至少一种进行的。由此，能够利用这些测序装置的高通量、深度测序的特点，从而有利于对后续测序数据进行分析，尤其是进行统计学检验时的精确性和准确度。
本发明的第三方面，提出了一种试剂盒，包括用于检测生物标志物的试剂，所述生物标志物包括根据本发明的第一方面的生物标志物。利用该试剂盒，可以确定这些标志物在肠道菌群中的相对丰度，由此，可以通过所得到的相对丰度值，从而确定对象是否患有或者易感溃疡性结肠炎，以及用于监控溃疡性结肠炎患者的治疗效果。
根据本发明的实施例，所述试剂盒包括一组参考数据集或者参考值，用来作为每种生物标志物的相对丰度的参考。优选可以将参考数据集或者参考值附在物理载体上，例如光盘，如CD-ROM等。
根据本发明的实施例，所述试剂盒还包括第一计算机程序产品，该第一计算机程序产品用来执行获得所述的参考数据集或者参考值。即该第一计算机程序产品用来执行获得诊断对象是否患有溃疡性结肠炎或相关疾病或者预测对象是否患有溃疡性结肠炎或相关疾病的一组参考数据集或者参考值。
根据本发明的实施例，所述试剂盒还包括第二计算机程序产品，该第二计算机程序产品还可以用来执行根据本发明第二方面所述的诊断对象是否患有溃疡性结肠炎或相关疾病或者预测对象是否患有溃疡性结肠炎或相关疾病的风险的方法。
本发明的第四个方面，提供生物标志物在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于诊断对象是否患有溃疡性结肠炎或相关疾病或者预测对象是否患有溃疡性结肠炎或相关疾病的风险。根据本发明的实施例，所述诊断或预测包括如下步骤：1)从所述对象中采集样本；2)确定步骤1)中获得的所述样本中生物标志物的相对丰度信息，所述生物标志物为根据本发明的第一方面的生物标志物；3)将步骤2)中所述的相对丰度信息与参考数据集或参考值进行比较。根据所述的试剂盒，可以确定这些标志物在肠道菌群中的相对丰度，由此，可以通过所得到的相对丰度值，从而确定对象是否患有或者易感溃疡性结肠炎，以及用于监控溃疡性结肠炎患者的治疗效果的效率。
根据本发明的实施例，以上生物标志物在制备试剂盒中的用途，可以进一步附加如下技术特征：
根据本发明的实施例，以上用途中，所述参考数据集包括来自多个溃疡性结肠炎患者和多个健康对照的样本中的生物标志物的相对丰度信息，所述生物标志物为根据本发明第一方面的生物标志物。
根据本发明的实施例，以上用途中，在将步骤2)中所述的相对丰度信息与参考数据集进行比较的步骤中，还包括执行多元统计模型以获得患病概率，优选地，所述多元统计模型为随机森林模型。
根据本发明的实施例，以上用途中，所述患病概率大于阈值表明所述对象患有溃疡性结肠炎或相关疾病或者有患有溃疡性结肠炎或相关疾病的风险；优选地，所述阈值为0.5。
根据本发明的实施例，以上用途中，通过测序方法得到步骤2)中所述生物标志物的相对丰度信息，进一步包括：从所述对象的所述样本中分离得到核酸样本，基于所获得的所述核酸样本，构建DNA文库，对所述DNA文库进行测序，以便获得测序结果，以及基于所述测序结果，将测序结果与参考基因集进行比对，以确定所述生物标志物的相对丰度。
根据本发明的实施例，以上用途中，所述参考基因集包括从多个溃疡性结肠炎患者和多个健康对照的样本中进行宏基因组测序，获得非冗余基因集，然后将所述非冗余基因集与肠道微生物基因集合并，得到所述参考基因集。
根据本发明的实施例，以上用途中，所述样本为粪便样本。
根据本发明的实施例，以上用途中，所述测序方法是通过第二代测序方法或第三代测序方法进行的。
根据本发明的实施例，以上用途中，所述测序方法是通过选自Hiseq2000、SOLiD、454、和单分子测序装置的至少一种进行的。
本发明的第五个方面，提供一种生物标志物作为靶点用于筛选治疗或者预防溃疡性结肠炎或相关疾病的药物的用途。根据本发明的实施例，所述生物标志物为根据本发明第一方面的生物标志物。根据本发明的实施例，可以利用候选药物使用前和使用后对这些生物标志物的影响，从而确定候选药物是否可以用于治疗或预防溃疡性结肠炎。
即，根据本发明的实施例，所述的生物标志物相对丰度的变化为确定候选药物是否有效提供依据。
本发明的有益技术效果：
本发明基于以下事实和问题的发现和认识作出的：肠道的微生物数量巨大，肠道菌群，作为寄居在人体肠道内微生物群落的总称，与人体健康之间有复杂的关系，肠道菌群失调与营养不良、肥胖症、糖尿病等疾病息息相关，是近年来微生物学、医学、基因学等领域最引人关注的研究焦点之一。
肠道菌群与溃疡性结肠炎的发病密切相关，主要表现为共生菌的减少，其发病机制与肠道黏膜免疫相关。尽管目前溃疡性结肠炎的发病机制不明确，但肠道菌群与溃疡性结肠炎发病的关系是近年的研究热点，一系列的临床和动物实验显示溃疡性结肠炎患者与健康者的肠道菌群存在差异。溃疡性结肠炎活动期患者肠道菌群结构多样性明显降低，另外,溃疡性结肠炎患者间的肠道菌群存在个体差异较大的趋势，而正常对照组之间差异较小，说明溃疡性结肠炎患者肠道菌群不稳定。
本发明基于对溃疡性结肠炎患者和健康人群肠道菌群的比较和分析，得到多种相关的肠道微生物，结合高质量的溃疡性结肠炎人群和健康人群物种相对丰度数据作为训练集，能够准确地对溃疡性结肠炎患者进行患病风险评估、早期诊断。该方法与目前常用的诊断方法相比，具有方便、快捷的特点。
本发明提出的溃疡性结肠炎相关的生物标记物对早期诊断是有价值的。第一，本发明的标记物具有较高的特异性和灵敏性。第二，粪便的分析保证准确性、安全性、可负担性和患者依从性。并且粪便的样本是可运输的。基于聚合酶链反应(PCR)的试验舒适且无创，所以人们会更容易参与给定的筛选程序。第三，本发明的标记物还可以用作于对溃疡性结肠炎患者进行治疗监测的工具以检测对治疗的响应。由于丰度度量的原因，本发明10种标记物的组合特别适用于基于标记基因比对方法度量丰度的情况。因此具有良好的实际应用之价值。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为本发明实施例1中基于随机森林模型(10个肠道标志物)，由溃疡性结肠炎患者和健康对照OTU组成的ROC曲线和AUC。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。
本发明所用术语具有相关领域普通技术人员通常理解的含义。然而，为了更好地理解本发明，对一些定义和相关术语的解释如下：
“溃疡性结肠炎”，是以反复发生的肠道溃疡为特征的疾病,以腹泻、血便、腹痛等症状为主。发病被认为与宿主遗传易感性、黏膜免疫和肠道菌群有关。与正常人相比,溃疡性结肠炎患者存在不同程度的菌群失调，主要表现在益生菌数量的减少和条件致病菌数量的增多。
“生物标志物”，是指“一种可客观检测和评价的特性，可作为正常生物学过程、病理过程或治疗干预药理学反应的指示因子”。例如，核酸标志物(也可以称为基因标志物，例如DNA)，蛋白质标志物，细胞因子标记物，趋化因子标记物，碳水化合物标志物，抗原标志物，抗体标志物，物种标志物(种/属的标记)和功能标志物(KO/OG标记)等。其中，核酸标志物的含义并不局限于现有可以表达为具有生物活性的蛋白质的基因，还包括任何核酸片段，可以为DNA，也可以为RNA，可以是经过修饰的DNA或者RNA，也可以是未经修饰的DNA或者RNA，以及由它们组成的集合。在本文中核酸标志物有时也可以称为特征片段。在本发明中，生物标志物也可以用“肠道标志物”来表示，因为所发现的与溃疡性结肠炎相关的生物标志物均存在于受试者的肠道内。生物标记物经过测量和评估，经常用以检查正常生物过程，致病过程，或治疗干预药理响应，而且在许多科学领域都是有用的。
所述的生物标志物，可以运用高通量测序，批量分析健康人群和溃疡性结肠炎患者的粪便样本。基于高通量测序数据，对健康人群与溃疡性结肠炎患者群进行比对，从而确定与溃疡性结肠炎患者群相关的特异性核酸序列。
简言之，其步骤如下：
样品的收集与处理：收集健康人群与溃疡性结肠炎患者群的粪便样本，使用试剂盒进行DNA提取，得到核酸样本；
文库构建和测序：DNA文库构建和测序是利用高通量测序进行，以便得到粪便样品中所包含肠道微生物的核酸序列；
通过生物信息学的分析方法，确定与溃疡性结肠炎患者相关的特异性肠道微生物核酸序列。首先，将测序序列(reads)与参照基因集(也称为参考基因集，可以为新构建的基因集或任何已知序列的数据库，例如，采用已知的人肠道微生物群落非冗余基因集)进行比对。接下来，基于比对结果，分别确定来自健康人群和溃疡性结肠炎患者群粪便样品的核酸样本中各基因的相对丰度。通过将测序序列与参照基因集进行比对，可以将测序序列与参照基因集中的基因建立对应关系，从而针对核酸样本中的特定基因，与其相对应的测序序列的数目可以有效地反映该基因的相对丰度。由此，可以通过比对结果，按照常规的统计分析，确定在核酸样本中基因的相对丰度。最后，在确定核酸样本中各基因的相对丰度后，对来自健康人群和溃疡性结肠炎患者群粪便的核酸样本中各基因的相对丰度进行统计检验，由此，可以判断在健康人群和溃疡性结肠炎患者人群中是否存在相对丰度有显著差异的基因，如果存在基因是显著差异的，则该基因被当作是异常状态的生物标志物，即核酸标志物。
另外，对于已知或新构建的参照基因集，其通常包含基因物种信息和功能注释，由此，在确定基因相对丰度的基础上，可以进一步通过将基因的物种信息和功能注释进行分类，从而确定肠道菌群中各微生物的物种相对丰度和功能相对丰度，也就可以进一步确定异常状态的物种标志物和功能标志物。
简言之，确定物种标志物和功能标志物的方法进一步包括：将健康人群和溃疡性结肠炎患者群的测序序列与参照基因集进行比对；基于比对结果，分别确定健康人群和溃疡性结肠炎患者群的核酸样本中各基因的物种相对丰度和功能相对丰度；对来自健康人群和溃疡性结肠炎患者群的核酸样本中各基因的物种相对丰度和功能相对丰度进行统计学检验；以及分别确定在健康人群和溃疡性结肠炎患者群的核酸样本之间相对丰度存在显著差异的物种标志物和功能标志物。根据本发明的实施例，可以采用对来自相同物种的基因的相对丰度和具有相同功能注释的基因的相对丰度进行统计检验，例如加和、取平均值、中位数值等，来确定功能相对丰度和物种相对丰度。
最后，确定了在健康人群和溃疡性结肠炎患者群的粪便样品之间相对丰度存在显著差异的生物学标志物，即包括微生物物种：Blautia和/或其类似物；unclassified_Ruminococcaceae和/或其类似物(需要说明的是，unclassified_Ruminococcaceae即为未分类的瘤胃球菌科成员或瘤胃球菌科下未分类的属)；Clostridium XlVa和/或其类似物；Lachnospiracea_incertae_sedis和/或其类似物；Roseburia和/或其类似物；Bifidobacterium和/或其类似物；Gemmiger和/或其类似物；Enterococcaceae和/或其类似物；Adlercreutzia和/或其类似物；Clostridium IV和/或其类似物。由此，通过检测上述微生物至少一种是否存在，来有效地确定对象是否患有或者易感溃疡性结肠炎病，并且可以用于监控溃疡性结肠炎病患者的治疗效果。在本文中所使用的术语“存在”应做广义理解，既可以指的是定性分析样本中是否含有相应的目标物，也可以指对样本中的目标物进行定量分析，并且还可以进一步将所得到的定量分析结果与参照(例如通过对具有已知状态的样本进行平行试验所得到的定量分析结果)进行统计学分析或者任何已知数学运算所得到的结果。本领域技术人员可以根据需要和试验条件进行容易的选择。根据本发明的实施例，还可以通过确定这些微生物在肠道菌群中的相对丰度，从而确定对象是否患有或者易感溃疡性结肠炎病，以及用于监控溃疡性结肠炎患者的治疗效果。
可以通过检测对象肠道菌群中是否存在上述微生物物种中的至少一种，也可以是检测对象肠道菌群中是否存在上述中的两种或者多种，即是否存在上述生物标志物组合，从而来有效地确定对象是否患有或者易感溃疡性结肠炎，并且可以用于监控溃疡性结肠炎患者的治疗效果。在本发明中，术语“生物标志物组合”是指一组生物标记物(即两个或更多个生物标志物的组合)。
对于物种标志物和功能标志物本领域技术人员还可以通过常规的菌种鉴别手段和生物活性检验手段来确定在肠道菌群中是否存在所述物种和功能。例如，菌种鉴别可以通过进行16s rRNA进行。
检测对象是否患有溃疡性结肠炎或相关疾病或者预测对象是否患有溃疡性结肠炎或相关疾病的设备
根据本发明的又一方面，本发明提出了一种检测对象是否患有溃疡性结肠炎或相关疾病或者预测对象是否患有溃疡性结肠炎或相关疾病的设备，所述设备包括样本采集装置、生物标志物相对丰度确定装置以及患病概率确定装置。
其中，样本采集装置适于从所述对象中采集样本；生物标志物相对丰度确定装置与所述样本采集装置相连，其适于确定所获得的样本中的生物标志物的相对丰度信息，所述生物标志物为根据本发明的第一方面的生物标志物；所述患病概率确定装置与所述生物标志物相对丰度确定装置相连，所述患病概率确定装置用于将相对丰度确定装置中获得的生物标志物的相对丰度信息与参考数据集或参考值进行比对。
根据本发明的一种具体实施方式，所述参考数据集包括来自多个溃疡性结肠炎患者和多个健康对照的样本中的根据本发明的第一方面的生物标志物的相对丰度信息。
根据本发明的一种具体实施方式，所述患病概率确定装置中还包括执行多元统计模型以获得患病概率；优选地，所述多元统计模型为随机森林模型。根据本发明的一种优选实施方式，所述患病概率大于阈值表明所述对象患有溃疡性结肠炎或相关疾病或者有患有溃疡性结肠炎或相关疾病的风险；优选地，所述阈值为0.5。
根据本发明的一种具体实施方式，所述生物标志物相对丰度确定装置进一步包括：核酸样本分离单元、测序单元以及比对单元。根据本发明的实施例，核酸样本分离单元适于从所述对象的所述样本中分离得到核酸样本，测序单元与核酸样本分离单元相连，并且基于所获得的核酸样本，构建DNA文库，对所述DNA文库进行测序，以便获得测序结果，比对单元与测序单元相连，并且基于所述测序结果，将测序结果与参考基因集进行比对，以确定所述生物标志物的相对丰度信息。
根据本发明的一种具体实施方式，所述参考基因集包括从多个溃疡性结肠炎患者和多个健康对照的样本中进行宏基因组测序，获得非冗余基因集，然后将所述非冗余基因集与肠道微生物基因集合并，得到所述参考基因集。
根据本发明的实施例，测序单元并不受特别限制。优选地，所述测序单元利用第二代测序方法或第三代测序方法进行。优选地，所述测序单元为选自Hiseq2000、SOLiD、454、和单分子测序装置的至少一种。由此，能够利用这些测序装置的高通量、深度测序的特点，从而有利于对后续测序数据进行分析，尤其是进行统计学检验时的精确性和准确度。
根据本发明的一个实施例，所述比对单元利用选自SOAP2和MAQ的至少一种进行所述比对。由此，可以提高比对的效率，进而可以提高检测溃疡性结肠炎的效率。
另外，根据本发明的实施例，本发明还提出了一种药物筛选方法。由此，根据本发明实施例，溃疡性结肠炎密切相关的标志物作为药物设计靶点来进行药物的筛选，促进新的治疗溃疡性结肠炎病的药物的发现。例如，可以通过检测与候选药物接触前后，生物标志物水平的变化，来确定候选药物是否可以作为治疗或预防溃疡性结肠炎病的药物。例如，检测有害生物标志物水平在接触药物候选物之后是否有所降低，有益生物标志物水平在接触药物候选物之后是否有所升高。另外，还可以通过确定药物对Blautia和/或其类似物；unclassified_Ruminococcaceae和/或其类似物；Clostridium XlVa和/或其类似物；Lachnospiracea_incertae_sedis和/或其类似物；Roseburia和/或其类似物；Bifidobacterium和/或其类似物；Gemmiger和/或其类似物；Enterococcaceae和/或其类似物；Adlercreutzia和/或其类似物；Clostridium IV和/或其类似物中的至少一种的生物活性的直接影响或间接影响来对候选化合物是否可以作为治疗或预防溃疡性结肠炎的药物来进行筛选。由此，根据本发明的实施例，本发明还提出了根据溃疡性结肠炎的生物标志物在筛选治疗或预防溃疡性结肠炎的药物中的用途。
若未特别指明，实施例中所采用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，可以参照《分子克隆实验指南》第三版或者相关产品进行，所采用的试剂和产品也均为可商业获得的。未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法，所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均与首次标明的内容相同。
本发明采用宏基因组关联分析(Metagenome-WideAssociationStudy,MWAS)的分析方法，经测序分析粪便样本的菌群组成，功能差异；用随机森林判别模型判别溃疡性结肠炎群体和非溃疡性结肠炎群体，获得患病概率，用于溃疡性结肠炎的患病风险评估、诊断、早期诊断或者寻找潜在药物靶点。
根据本发明，术语“个体”指动物，特别是哺乳动物，如灵长类动物，最好是人。
根据本发明，术语如“一”、“一个”和“这”不仅指单数的个体，而是包括可以用来说明特定实施方式的通常的一类。
在本发明中，所述的测序(二代测序)和MWAS为本领域所公知，本领域技术人员可以根据具体情况进行调整。根据本发明的实施例，可以依据文献(Wang J,JiaH.Metagenome-wide association studies:fine-mining the microbiome.NatureReviews Microbiology,2016,14(8):508-522.)中记载的方法进行。
在本发明中，随机森林模型和ROC曲线的使用方法为本领域所公知，本领域技术人员可以根据具体情况进行参数设置和调整。根据本发明的实施例，可以根据文献(DroganD,Dunn WB,Lin W,et al.Untargeted metabolic profiling identifies altered serummetabolites of type 2diabetes mellitus in a prospective,nested case controlstudy.Clin Chem 2015,61:487–497；Mihalik S J,Michaliszyn S F,De l H J,etal.Metabolomic Profiling of Fatty Acid and Amino Acid Metabolism in YouthWith Obesity and Type 2Diabetes:Evidence for enhanced mitochondrialoxidation.Diabetes Care,2012,35(3):605-611.通过引用全文并入此处)中记载的方法进行。
在本发明中，构建了溃疡性结肠炎受试者和非溃疡性结肠炎受试者的生物标志物的训练集，并以此为基准，对待测样本的生物标志物含量值进行评估。
本领域技术人员知晓，当进一步扩大样本量时，利用本领域公知的样本检测和计算方法，可以得出每种生物标志物在样本中的正常含量值区间(绝对数值)。可以将检测得到的生物标志物含量的绝对值与正常含量值进行比较，任选地，还可以结合统计学方法，以得出溃疡性结肠炎患病风险评价、诊断以及用于监控溃疡性结肠炎患者的治疗效果的效率等。
不希望受任何理论的限制，发明人指出这些生物标志物是存在于人体中的肠道菌群。通过本发明所述的方法对受试者肠道菌群进行关联分析，得到溃疡性结肠炎症群体的所述生物标志物在菌群检测中表现出一定的含量范围值。同时，需要说明的是，本发明针对溃疡性结肠炎的生物标志物具有较佳的特异性，对于临床症状与溃疡性结肠炎极其相似，极易引起误诊的缺血性结肠炎(ischemic colitis，IC)也显示了极强的区分能力，因此本发明可实现肠道微生物标志物对于溃疡性结肠炎的特异性诊断。
以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1
1.1样本收集
参照文献(A metagenome-wide association study of gut microbiota intype 2 diabetes.Nature,2012,490(7418):55-60)记载的方法，采集粪便样品后冷冻运输并迅速转移到-80℃保存，进行DNA提取，得到提取的DNA样本。本发明的溃疡性结肠炎和非溃疡性结肠炎受试者的粪便样本来自中国。共计99例，其中健康样本44例和溃疡性结肠炎样本55例。该研究方案得到了山东大学齐鲁医院伦理委员会的批准。
1.2宏基因组测序与组装
利用所提取的DNA样本构建测序文库，在IlluminaHiSeq2000测序平台上进行双向(Paired-end)宏基因组测序(插入片段350bp，读长100bp)。对测序产生的数据进行过滤(quality-controlled)，去除adapter污染序列、低质量序列和宿主基因组污染序列，得到高质量的测序片段(reads)。
1.3基因组比对与丰度计算
将上述“1.2宏基因组测序与筛选”的高质量测序片段(reads)输入到软件Metaphlan2(http://segatalab.cibio.unitn.it/tools/metaphlan2/)即可计算出物种的相对丰度。参照文献(Truong D T,Franzosa E A,Tickle T L,et al.MetaPhlAn2 forenhanced metagenomic taxonomic profiling.Nature Methods,2015,12(10):902-903)记载的方法。其丰度计算步骤如下：1)将高质量测序片段比对到参考的标记基因上；2)根据比对结果统计插入片段的数量；3)将插入片段的数量对标记基因的长度进行标准化(按平均基因长度进行标准化，并按照向下取整的方式得到对应物种的丰度)得到对应的丰度。
1.4利用随机森林(ROC/AUC)筛选溃疡性结肠炎发生发展的潜在生物标志物
为进一步筛选潜在疾病肠道生物标志物，本实施例构建了溃疡性结肠炎受试者和非溃疡性结肠炎受试者的生物标志物的训练集，并以此为基准，对待测样本的生物标志物含量值进行评估。其中，在本发明中，所述训练集和所述验证集具有本领域所公知的含义。在本发明的实施方案中，训练集是指包含一定样本数的溃疡性结肠炎受试者和非溃疡性结肠炎受试者待测样本中的各生物标志物的含量的数据集合。验证集是用来测试训练集性能的独立数据集合。其中，非溃疡性结肠炎受试者为精神状态良好的受试者，受试者可以为人或者模型动物，在本实施例中是以人为受试者进行实验的。
具体包括如下步骤：
本发明选取55个溃疡性结肠炎病人和44个健康人作为训练集。
1.4.1利用训练集数据筛选得到的生物标志物
首先，按照1.3描述的方法计算训练集中每个样本中物种的相对丰度。然后将训练集的物种输入随机森林(randomForest4.6-12inR3.2.5,RF)分类器。对分类器进行5次。
10折交叉验证，利用RF模型筛选的物种相对丰度对每一个体计算其溃疡性结肠炎患病风险，绘制ROC曲线，并计算出AUC作为判别模型效能评价参数。选取标志物组合数＜30，且判别效能最佳的组合为本发明组合。在模型中输出每个物种的重要性指数，重要性指数越高，代表该标志物用来判别溃疡性结肠炎和非溃疡性结肠炎的重要性越高。
本发明所得RF分类器包含了10个生物标记物，其详细信息如表1所示。图1示出了基于随机森林模型(10个生物标志物)由溃疡性结肠炎患者和健康对照组成的训练集的ROC曲线和AUC，其中特异性表征的是对于不患病判对的概率，敏感性指的是对于患病判对的概率，对训练集样本的判别效能为：AUC＝0.97，95％置信区间CI＝0.94-1。结果表明该模型所得标志物组合可作为区分溃疡性结肠炎与非溃疡性结肠炎的潜在生物标志物。
表1 10种生物标志物详细信息
OTU 生物标志物信息 重要性
OTU617 Blautia 6.94707
OTU3035 unclassified_Ruminococcaceae 5.53507
OTU659 Clostridium XlVa 5.32256
OTU3974 Lachnospiracea_incertae_sedis 4.9148
OTU3056 Roseburia 4.34222
OTU1360 Bifidobacterium 4.30603
OTU1995 Gemmiger 3.99925
OTU86 Enterococcaceae 3.64026
OTU8 Adlercreutzia 3.44398
OTU3791 Adlercreutzia 3.43459
1.4.2利用验证集数据验证筛选得到的生物标志物
本发明随机使用部分独立人群对该模型进行验证，患病概率≥0.5预测个体具有溃疡性结肠炎风险或者患有溃疡性结肠炎。首先，按照1.3描述的方法计算训练集中每个样本中各生物标志物的相对丰度。然后按照1.4.1的方法利用随机森林模型对验证集数据进行验证。基于10种标志物组合验证集患病概率见下表2。
表2基于10种标志物组合验证集患病概率
U：溃疡性结肠患者；N：健康对照
1.4.3肠道生物标志物特异性检测
缺血性结肠炎(ischemic colitis，IC)是由于结肠血管闭塞性或非闭塞性疾病所致的、以结肠供血不足为主要症状的一组综合征，其临床症状与溃疡性结肠炎极其相似，易引起误诊。
为验证本发明肠道生物标志物对溃疡性结肠炎的检测特异性，另外选取32例缺血性结肠炎患者和41例溃疡性结肠炎患者用于验证肠道生物标志物组合的诊断效能。使用以上微生物标志物重新建模，并在验证集中验证，结果见下表3，令人惊讶的是，结果表明，当使用上述10个生物标志物建模后，该模型能够100％将溃疡性结肠炎与缺血性结肠炎区分开来，模型预测AUC值达到了100％，95％置信区间CI为1.00-1.00。从而有效实现本发明的肠道微生物标志物对于溃疡性结肠炎的特异性诊断。
表3肠道生物标志物组合特异性检测
肠道生物标志物个数 AUC 95％置信区间(CI)
5 0.88 0.81-0.95
6 0.92 0.88-0.96
7 0.95 0.92-0.98
8 0.96 0.94-0.98
9 0.98 0.97-0.99
10 1.00 1.00-1.00
以上结果表明，本发明公开的生物标志物具有较高的准确度和特异性，具有良好的开发为诊断方法的前景，从而为溃疡性结肠炎的患病风险评估、诊断、早期诊断，寻找潜在药物靶点提供依据。
因此，本发明提出以下应用：
所述的基于肠道菌群的溃疡性结肠炎生物标志物组合作为检测靶点或检测目标在制备检测试剂盒中的应用。
所述的基于肠道菌群的溃疡性结肠炎生物标志物组合作为靶点在筛选治疗和/或者预防溃疡性结肠炎的药物中的应用。
所述的生物标志物组合相对丰度的变化为确定候选药物是否有效提供依据。
应注意的是，以上实例仅用于说明本发明的技术方案而非对其进行限制。尽管参照所给出的实例对本发明进行了详细说明，但是本领域的普通技术人员可根据需要对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。

Claims (1)

1.检测肠道菌群标志物的丰度的试剂在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于诊断对象是否患有溃疡性结肠炎或者预测对象是否患有溃疡性结肠炎的风险，所述肠道菌群标志物包括Blautia、unclassified_Ruminococcaceae、Clostridium XIVa、Lachnospiracea_incertae_sedis、Roseburia、Bifidobacterium、Gemmiger、Enterococcaceae、Adlercreutzia和Clostridium IV。
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