CN110541026A - 一种检测溃疡性结肠炎的生物标志物及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了溃疡性结肠炎的生物标志物，同时提供了溃疡性结肠炎的生物标志物用于检测溃疡性结肠炎中的用途。本发明从UC患者中还鉴别出如下新的菌群，菌群为首次在UC患者肠道中分离得到，为以后研究UC的致病机制提供了新的靶点。通过本发明提供的生物标志物可以运用于检测溃疡性结肠炎的试剂、试剂盒或检测系统的开发，还可作为靶点用于筛选治疗或者预防炎症性肠病的药物中以及作为靶点用于监控溃疡性结肠炎患者的治疗效果。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种检测溃疡性结肠炎的生物标志物及应用。
背景技术
炎症性肠病(inflammatory bowel disease，IBD)是一种发病机制未明的慢性非特异性肠道粘膜炎症性疾病，包括溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)和克罗恩病(Crohn’s disease，CD)。IBD是北美和欧洲的常见病，Siew Ng等进行了21世纪全球炎症性肠病发病率及患病率的系统性综述，总共纳入1990年至2016年147项研究，Siew等敏锐的捕捉到在高收入国家过去2-3世代，在发展中及新兴工业国家仅1世代的时间，IBD都均持续增加。在香港IBD的发生率从1985年的1/106增加至2014年的30/10。在中国近20年来IBD也以惊人的步伐成为消化系统的常见病。发病率的升高可能与工业化和城市化的推动、卫生条件、营养状况等相关。
IBD中又以UC发病率较高，病变主要限于大肠粘膜与粘膜下层，呈连续性弥漫性炎症，多数在直肠乙状结肠，可蔓延至全结肠。临床表现为腹泻、粘液脓血便、腹痛、里急后重和不同程度的全身症状。本病青壮年居多、诊治困难、终身治疗，现有药物治疗有限、花费巨大、累积并发症发生率高。IBD患者药物依从性的调查结果显示，纳入研究的UC患者中，86.2％的患者治疗依从性差，39％的患者年收入少于1万元，50％的患者治疗费用超过年收入的一半，93.5％的患者觉得治疗费用是巨大的经济负担，经济压力是导致依从性差最主要的原因之一。患者因病致贫、致残、致癌、致死时有发生，降低患者生活质量，造成沉重的经济负担。
目前认为UC是遗传易感个体免疫系统对肠道微生物或组分启动异常反应，造成持久、过激、不可逆的免疫性损伤。全基因组关联分析(Genome-wide association study,GWAS)鉴定出了超过200个与IBD相关的风险基因座，Jostins等在发现的163个与IBD易感性相关的多态性位点中，仅能解释约7％-40％的IBD发病机制，Frank等发现IBD微生物的改变与疾病分型和基因型相关。Balish等将白细胞介素-10(Interleukin-10，IL-10)基因敲除小鼠放置于无菌环境中培养，其不会发生UC；将小鼠给予粪肠球菌灌肠后可诱发UC。国内外文献大量报道肠道菌群失调在UC的易感个体中，触发异常免疫反应。动物实验中CX3CR1+骨髓细胞过表达IL23可诱发UC，更换小鼠饲料可引起菌群的快速变化，包括变形菌门丰度改变、拟杆菌门降低、疣微菌门增多，菌群变化作用于CD4+T细胞，诱导结肠炎发生。Leber等发现肠道上皮细胞缺失具有抗炎活性的NLRX1小鼠，在DSS诱导的肠炎小鼠中敏感性增加，肠道菌群韦荣球菌属、梭菌目丰度增加，代谢组学上皮细胞增殖、氨基酸代谢、紧密连接蛋白表达发生显著变化。上述研究提示我们肠道微生物是IBD发病的关键因素。
尽管国内外大量研究都提供了UC患者肠道生态失调的证据，但结果差异大，未能获得一致结论，UC的微生物群落状态至今不明，与肠菌相关的作用过程和致病机理并不明确，探究原因，可能与缺乏标准化流程，混杂因素的干扰导致实验室之间的差异相关。首先，各类研究始终无法排除饮食、生活习惯、居住环境、种族等混杂因素的干扰；其次，缺乏与UC粘膜病变相关的样本研究；最后，测序方式之间的差异导致研究结果的差异。
一方面，国内外多位学者研究发现，膳食结构及地理环境的差异导致肠道菌群的差异。肠道菌群细胞数量是人体的10倍，基因数量是人体自身的150倍被称为人体的“第二基因组”及“隐藏的器官”。Yatsunenko等对非洲马拉维人、印度人、委内瑞拉人、美国人531例健康粪便样本测序发现美国人粪便微生物多样性降低。Rehman等对德国、立陶宛、印度IBD和健康人粘膜样本测序发现，IBD中存在病态的群落模式，该模式受居住地、人口特性影响。农村居民的螺旋体属、普氏菌属、变形菌门等丰度更高，而城市居民的拟杆菌属、厚壁菌门及双歧杆菌属丰度更高。Clayton等提取捕获、半捕获和野生环境生活的两种灵长类物种大便样本进行DNA测序，发现被捕获的灵长类与野生个体微生物显著不同，前者表现出与现代人类类似的消化道微生物组成。上述研究证实Baas-Becking提出“Everything iseverywhere，but the environment selects”的“微生物无处不在，但环境是选择”的假说。
另一方面，研究发现居住在相同饮食及地理环境下的配偶体内菌群趋于一致。2016年《纽约杂志》发表了Shannon等在美国老年学学会上的研究报告：入组1568对美国夫妻，分成结婚20年、结婚50年的两组，研究揭示，长期共同的生活，配偶双方的肾脏功能、脂质代谢等生化学指标及握力测试的结果都出现惊人地一致性。进一步研究发现，配偶双方患有相同疾病的可能性很大。Hippisley等研究发现配偶一方患病，另一方的患病率会显著提高。研究显示健康宿主肠道菌种相对稳定，约60％菌种可在肠道内恒定存在数十年，同时IBD无论缓解或活动，亦存在相应的核心菌种，基于核心菌种可很好的区分UC、CD和健康对照。这其中，饮食及环境变化是宿主肠道微生态最重要且可修饰的决定因素，其变化可快速改变肠道菌群结构、核心菌株基因组编码序列及KEGG通路丰度，但其“肠型”在饮食干预中却基本保持一致。
宿主遗传显著影响肠道菌群。HMP与美国肠道计划两个项目中纳入4个种族1673个健康个体，发现宿主基因遗传背景与肠道菌群存在关联，12个科或属水平的细菌丰度受种族影响。种族间的差异显著影响肠道菌群的结构及多样性，而同种族间发现成员共享更多的菌群类群。一项关于婴儿肠道菌群与种族的研究中发现：南亚人富含双歧杆菌、乳酸菌等产乳酸细菌；而白种高加索人富含更多梭状芽胞杆菌、毛螺旋菌科等细菌。荷兰阿姆斯特丹分析了居住于同一城市、不同族裔6个族群、2084名捐赠粪便样本的受试者,发现摩洛哥人、土耳其人和加纳人集中存在普氏菌属，非洲和南亚苏里南人集中存在拟杆菌属，荷兰人集中存在梭菌目。既往研究表明，不同国家地域，不同种族，不同民族人群UC患者肠道菌群构成存在较大差异。
尽管上述研究都没有明确提出UC肠道微生态失调的具体机制，但是目前的线索提出了一个临床研究者应该注意的问题：相同的环境、膳食、种族、相似的生活习惯，促使夫妻间原本有差异的肠道微生态系统逐渐趋同、菌群趋于相似，导致配偶之间在性格、生理越来越相似，有些夫妻甚至出现“夫妻相”，配偶双方患有相同疾病的可能性很大。因此，选择UC患者及其健康配偶，能够深入发现之间核心微生物群落的异同点，挖掘致病菌群、筛选出与溃疡性结肠炎相关性高的生物标志物、明确精准靶向生物学诊断指标。
传统研究微生物的分子生物学技术包括：分离培养、生物芯片、温度梯度凝胶电泳(Temperature gradient gel electrophoresis，TGGE)、变性梯度凝胶电泳(Denaturinggradient gel electrophoresis，DGGE)、末端限制性片段长度多态性(Terminal-restriction fragment length polymorphism，T-RFLP)、印记杂交、定量PCR、基因芯片等，它们是迄今为止使用最为广泛的微生物鉴别技术。但却面对诸多缺点：耗时长、有偏倚、低精度、只能验证已知，无法探索未知。
在溃疡性结肠炎的实际诊断中，医疗人员往往需要采用多种检测手段、数据,以及专业经验,才能较好的确定病因,耗时长、对医务人员和检测设备资源的占用较多。虽然,部分医务人员或学者提出了一些设想,或进行了一些有益的探索,但是截至到目前,依然尚未有一种较为准确、高效的方法,能够实现快速识别、诊断进而有效地治疗溃疡性结肠炎的目的。
发明内容
针对上述问题，本发明通过对溃疡性结肠炎患者及其配偶的肠道粪便及肠粘膜菌群进行研究，基于二代高通量测序，筛选出与溃疡性结肠炎相关的生物标志物，利用该生物标志物准确的判断溃疡性结肠炎，包括以下技术方案：
溃疡性结肠炎的生物标志物至少包含如下的微生物菌群任意一种或几种的组合:Acidaminococcaceae、Odoribacteraceae、Phascolarctobacterium、红椿菌目(Coriobacteriales)、交替单胞菌目(Alteromonauodales)、拜叶林克氏菌科(Beijerinckiaceae)、肉杆菌属(Carnobacterium)、不年柄菌属(Asticcacaulis)、Eggerthellaceae、普雷沃氏菌属(Prevotella)、放线菌科(Actinomycetaceae)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、Pseudomonadales→Moraxellaceae→Acinetobacter→Acinetobacter_baumannii、Acinetobacter_junii、Acinetobacter_indicus_CIP_110367。
本发明提供了溃疡性结肠炎的生物标志物在制备用于检测溃疡性结肠炎的试剂盒中的用途，试剂盒包含能够结合或基因测序识别样本中所述生物标志的配体。
溃疡性结肠炎的生物标志物作为靶点用于筛选治疗或者预防炎症性肠病的药物中的用途，通过测定患者粪便及黏膜标本中生物标志物的水平并与参考水平比较，以判断药物的药效。
溃疡性结肠炎的生物标志物作为靶点用于监控溃疡性结肠炎患者的治疗效果的用途，通过测定患者粪便及黏膜标本中生物标志物的水平并与参考水平比较，以监控患者的治疗效果。
优选地，溃疡性结肠炎的生物标志物用于检测溃疡性结肠炎中的用途，所述检测步骤包括如下步骤：
(a)获取被检测对象的粪便及肠黏膜的样本中的一种或多种菌群生物标志物水平；
(b)将所述一种或多种菌群生物标志物水平与参考水平进行比较；
(c)将粪便样本中的一种或多种菌群生物标志物水平与肠黏膜样本中的一种或多种菌群生物标志物水平进行比较；
(c)基于比较结果判断检测样本是否足以导致提供者患有溃疡性结肠炎。
优选地，所述粪便及肠黏膜中的Acidaminococcaceae、Odoribacteraceae、与Phascolarctobacterium菌群生物标志物水平均低于参考Acidaminococcaceae、Odoribacteraceae、与Phascolarctobacterium菌群水平，即可判断检测样本足以导致提供者患有溃疡性结肠炎。
优选地，所述粪便及肠黏膜中的红椿菌目(Coriobacteriales)、交替单胞菌目(Alteromonauodales)、拜叶林克氏菌科(Beijerinckiaceae)、肉杆菌属(Carnobacterium)、不年柄菌属(Asticcacaulis)及Eggerthellaceae菌群生物标志物水平均高于参考红椿菌目(Coriobacteriales)、交替单胞菌目(Alteromonauodales)、拜叶林克氏菌科(Beijerinckiaceae)、肉杆菌属(Carnobacterium)、不年柄菌属(Asticcacaulis)及Eggerthellaceae菌群水平，即可判断检测样本足以导致提供者患有溃疡性结肠炎。
优选地，所述粪便中的普雷沃氏菌科(Prevotellaceae)→普雷沃氏菌属(Prevotella)，放线菌目(Actinomycetales)→放线菌科(Actinomycetaceae)水平高于黏膜中的水平，即可判断检测样本足以导致提供者患有溃疡性结肠炎。
优选地，所述检测黏膜样本中的棒状杆菌属(Corynebacterium)、Pseudomonadales→Moraxellaceae→Acinetobacter→Acinetobacter_baumannii、Acinetobacter_junii、Acinetobacter_indicus_CIP_110367水平高于相应检测粪便中的水平，即可判断检测样本足以导致提供者患有溃疡性结肠炎。
优选地，所述生物标志物的水平是通过从被检测对象中分离出的肠道菌群核酸样本进行基因测序所获得的相对丰度值，所述参考水平指健康人群的肠道菌群核酸样本进行基因测序所获得的平均相对丰度值。
优选地，溃疡性结肠炎的生物标志物的用途，还可以通过生物标志物菌群的改变研究其致病机制。通过KEGG、eggNOG、MetaCyc代谢通路挖掘生物标记菌群关键的功能，推测出其可能的致病机制。
本发明的有益效果为：本发明对数对相同种族、膳食结构、居住环境、生活方式的UC患者及其健康配偶的肠道菌群进行研究,能够深入发现之间核心微生物群落的异同点，挖掘致病菌群、筛选出与溃疡性结肠炎相关性高的生物标志物、明确精准靶向生物学诊断指标。通过高通量基因测序及OUT丰度检测，筛选出与溃疡性结肠炎相关性高的菌群生物标志物，提供了利用菌群标志物准确高效地检测溃疡性结肠炎的方法，该检测方法相对于传统的检测、判断方法,速度、效率、准确性均有大幅度的提升，对医生经验的依赖性大幅下降。本发明从UC患者中还鉴别出如下新的菌群：Eggerthellaceae、Carnobacterium、Asticcacaulis、Sphingomonadacea、Serratia、Corynebacterium、Acinetobacter_baumannii、Acinetobacter_junii、Acinetobacter_indicus_CIP_110367，上述菌群为首次在UC患者肠道中分离得到，为以后研究UC的致病机制提供了新的靶点。通过本发明提供的生物标志物可以运用于检测溃疡性结肠炎的试剂、试剂盒或检测系统的开发，还可作为靶点用于筛选治疗或者预防炎症性肠病的药物中以及作为靶点用于监控溃疡性结肠炎患者的治疗效果。
具体实施方式
本文中，UC指溃疡性结肠炎，MH指健康对照粪便样本组，FU指UC患者粪便样本组，MH指健康对照肠道粘膜样本组，MU指UC患者肠道粘膜样本组，
实施例1
本发明提供的溃疡性结肠炎生物标志物的筛选方法为：
(1)选择28对相同饮食结构及居住环境的UC患者及配偶，对其进行粪便及肠道黏膜标本采集及处理；
(2)对处理后的粪便及肠道黏膜标本分别进行DNA提取及纯化；
(3)对提取纯化后的DNA进行16s rRNA分析。
本发明粪便标本采集与处理的方法为：
未行肠道清洁准备前，将粪便排入干净的卫生纸上，使用粪便采样套装，由患者用压舌板挑取1管(1g)粪便至粪便保存管(内含3ml粪便保存剂)，于24小时内放置负80摄氏度的冰箱保存，后期进行DNA的提取，转运可在常温下进行。
本发明肠道粘膜标本采集与处理的方法为：
UC患者及其健康配偶统一行肠镜检查，取直肠粘膜组织，受试者均不限制饮食。用一次性活检钳于直肠病变最重处取粘膜活检组织6块，其中4块分别放入不同冻存管中并用1mlPBS缓冲液反复洗涤3次，再次分别置入新的冻存管中，然后迅速转移至液氮保存备用，后期进行DNA的提取，用于16s rRNA和宏基因组学研究。另外2块放入4％福尔马林液中保存，制作蜡块，用于组织学及免疫组织化学检查。
本发明DNA提取方法为：
(1)向装有粪便的离心管中加入1ml的ddH2O,涡旋仪最大震速混匀一分钟。备溶菌酶,放入冰盒，CTAB放入65℃水浴锅；
(2)离心机10000g离心1min；
(3)倾倒液体，留沉淀(必要时重复1-3步骤)；
(4)加入800ul SM缓冲液；
(5)涡旋仪震荡10min；
(6)2000g离心10min；
(7)过滤：准备新的1.5ml离心管，2.5ml针筒抽取上清，过一个0.22um的滤头，若上清过于浑浊，可先过一个0.45um的滤头，过滤后体积在400ul左右；
(8)加入100mg/ml的溶菌酶(lysozyme),量为过滤后液体体积的1/100，金属浴37℃至少30min；
(9)取出后短暂离心，加入液体总体积1/5的氯仿，摇匀至乳白色，室温静置10min，准备DNase于冰盒中，reaction buffer从4度冰箱中取出置于室温)；
(10)2500g离心5分钟，分层，上层为清亮水层，中间白色蛋白质层，下层为氯仿有机层，取上层水层至新的2ml离心管中；
(11)加入液体总体积的1/10体积的reaction buffer，再加入1ul的DNase；
(12)轻震荡混匀37℃金属浴温育15min(备stop buffer从4度冰箱中取出置于室温)；
(13)取出，短暂离心，加入总体积的1/10体积的stop buffer，65℃，10min；
(14)加入3.8％体积的SDS,(每100ul体积加入3.8ul SDS,如400ul，加入15.2ul的SDS)；
(15)加入蛋白酶K，每100ul体积加入0.5ul proteinase K(如400ul，加入2ul)；
(16)混匀，56℃40min；
(17)加入CTAB，每100ul加入14ul CTAB，吹打至乳白色，65℃，10min；
(18)取出短暂离心，加入等体积氯仿，轻轻颠倒混匀，8000g离心5min,取上清至新的离心管；
(19)加入等体积PCI，轻轻颠倒混匀，8000g离心5min,取上清至新的离心管。
DNA的纯化方法为
(1)准备好纯化柱加套管，标记号码；
(2结合缓冲液:样品体积＝2:1，加入结合缓冲液进离心管中，吹打混匀后加入纯化柱；
(3)10000g离心30s,去滤液；
(4)洗涤缓冲液200ul加入纯化柱，10000g离心30s,去滤液；
(5)重复第4步，再洗一次，去滤液；
(6)将纯化柱套到新的标记好的离心管中，ddH2O 10ul加到纯化柱膜正中央，10000g离心30s；
(7)离心管中10ul，取1ul进行核算定量，≤30ng/ml合格。
本发明PCR+PCR产物纯化的方法为：
(1)一个PCR管中：样品缓冲液4.5ul+template DNA 1uL，每个样品准备三个PCR管，标记，PCR仪中95℃3min,4℃∞，设置液体体积为10ul体系；
(2)取出置于冰盒上，按照PCR管数，混匀Master Mix＝4.5ul reaction buffer+0.5ul酶；
(3)调节PCR仪程序，设置液体体积为10ul体系；
30℃ 3h,
65℃ 10min
4℃ ∞
(4)准备好纯化柱加套管，标记；
(5)扩增完取出置于冰上，将每3个PCR管中的液体汇合成一管，加入5倍体积结合缓冲液，混匀，加入纯化柱；
(6)10000g离心30s,去滤液；
(7)洗涤缓冲液200ul加入纯化柱，10000g离心30s,去滤液，洗2次；
(8)将纯化柱套到新的标记好的离心管中，洗脱缓冲液30ul加到纯化柱膜正中央，10000g离心30s；
(9)离心管中30ul，取1ul进行核算定量，2-3ug/ul合格。
本发明中16s rRNA分析包括以下步骤:
a.数据统计与测序
(1)设置30bp窗口长度，截除read末端序列，移除最终read长度低于原始read长度75％的reads；
(2)去除接头污染reads；
(3)去除含N的reads
(4)去除低复杂度reads(默认reads中某个碱基连续出现的长度≥10，设置10bp),样品通过barcode合并建库，得到Clean Data后，利用barcode序列与测序reads比对。通过Illumina平台(25,000tags，MiSeq平台)进行测序，完成112个人源样品(粪便56个，肠黏膜56个)V3-V4区扩增子信息采集，下机数据经过去除低质量reads。测序策略(PE101/PE150/PE250/PE300)：PE300；
正向引物为：5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’；
反向引物为：5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’。
b.序列拼接
使用FLASH(Fast Length Adjustment of Short reads，FLASH)利用重叠关系将双末端测序获得的Paired-reads组装成序列，获得高变区Tags。
(1)最小匹配长度15bp；
(2)重叠区域允许错配率0.1，去除没有overlap关系的reads。
c.OTU及其丰度分析
(1)处理后的Clean Tags进行操作分类单元(Operational Taxonomic Units，OTU)聚类、注释完成物种分类；
(2)利用UPARSE在97％相似度下进行聚类，获得OTU的代表序列；
(3)使用usearch global方法将所有Tags比对回OTU代表序列，获得每个样品在每个OTU的丰度统计；
(4)使用RDP classifer(V 2.2)软件将OTU代表序列与数据库(Greengene)比对进行物种注释；
(5)OTU Venn图：在97％的相似度下，获得每个样品OTU个数，利用Venn图展示多样品共有和各自OTU数目，展示重叠情况，结合OTU所代表的物种，分别找出健康人—UC患者粪便及粘膜的核心微生物组；
(6)OTU PCA分析
PCA分析(Principal Component Analysis)，即主成分分析，通过保留低阶主成分，忽略高阶主成分，能够减少数据集的维数、保持数据集中对方差贡献最大的特征。依据每个样品OTU计算相对丰度，进行PCA分析。PCA运用方差分解，将多组数据的差异反映在二维坐标图上，如果两个样品距离越近，则表示两个样品组成越相似。
d.物种分类和丰度分析
(1)profiling面积图和柱状图：与数据库比对，对OTU进行物种分类并分别在门、纲、目、科、属、种几个分类等级对个样品做物种profiling面积图和柱状图。
(2)系统进化分析：系统进化树是表示物种间发育关系的树状图，枝长长短表示进化距离差异。系统关系越近、进化树种距离越近。我们选取属水平丰度最高的一条作为代表序列，构建物种系统进化树。
e.多样性分析
(1)Alpha多样性(Alpha diversity)，包括observed specices指数、chao指数、ace指数、shannon指数以及simpson指数，前面4个指数越大、最后一个指数越小，说明样品中物种越丰富。
(2)Beta多样性(Beta diversity)分析样品在物种多样性方面存在的差异大小。
(3)PCoA主坐标分析(Principal coordinates analysis,PCoA)分析样品间差异大小，距离越近，物种组成越相似。
f.物种组成聚类分析
通过QIIME软件进行，聚类方法为UPGMA(Unweighted Pair Group Method withArithmetic mean)。
g.微生物物种显著性差异分析及线性判别分析效应大小(Linear DiscriminateAnalysis Effect Size，LEfSe)分析
LEfSe分析结果：
1.不同菌群在人群的粪便中的富集情况，见表1
表1 UC相关的粪便菌群
2.不同菌群在人群的肠道黏膜上的富集情况，见表2
表2 UC相关的肠粘膜菌群
注：#采用Wilcoxon signed-rank test，*采用Benjamini-Hochberg Method
3.不同菌群在UC人群的肠粘膜与粪便中的富集情况，见表3
表3 UC患者肠粘膜与粪便相关菌群
表3 UC患者肠粘膜与粪便相关菌群
表3 UC患者肠粘膜与粪便相关菌群
表3 UC患者肠粘膜与粪便相关菌群
注：#采用Wilcoxon signed-rank test，*采用Benjamini-Hochberg Method
试验结果：
本发明从UC患者中鉴别出如下新的菌群：Eggerthellaceae、Carnobacterium、Asticcacaulis、Sphingomonadacea、Serratia、Corynebacterium、Acinetobacter_baumannii、Acinetobacter_junii、Acinetobacter_indicus_CIP_110367，上述菌群为首次在UC患者肠道中分离得到。
结果分析：
在不同的生物分类层面，通过统计学的方法检验FH与FU两组样品间微生物群落相对丰度(Related Abundance)的差异，并使用FDR(false discovery rate)评估差异的显著性，如表1所示：
在目水平上FU中的紫红球菌目(Puniceicoccales)含量少于健康配偶粪便样本(FH)(P<0.01)，而气单胞菌目(Aeromonadales)、交替单胞菌目(Alteromonadales)、蛭弧菌目(Bdellovibrionales)和红椿菌目(Coriobacteriales)则多于FH(P<0.05)。在科水平上，FU中的氨基酸球菌科(Acidaminococcaceae)、Odoribacteraceae显著低于FH(P<0.05)，而拜叶林克氏菌科(Beijerinckiaceae)、Eggerthellaceae明显增加(P<0.05)。在属水平上，相对FH而言，FU的考拉杆菌属(Phascolarctobacterium)、Odoribacter均显著减少(P<0.05)，而肉杆菌属(Carnobacterium)和不年柄菌属(Asticcacaulis)明显增加(P<0.05)。
不同的生物分类层面对肠粘膜中的菌群进行比较发现，如表2所示，与健康对照相比，MU在目水平上，氨基酸球菌目(Acidaminococcales)和拟杆菌目(Bacteroidales)显著减少，芽孢杆菌目(Bacillales)、肠杆菌目(Enterobacteriales，EB)和鞘脂单孢菌目(Sphingomonadales)显著增加；科水平上，UC患者肠粘膜菌群氨基酸球菌科(Acidaminococcaceae)和Odoribacteraceae显著减少，而鞘脂单孢菌科(Sphingomonadaceae)明显增加；属水平上，UC患者肠粘膜消化链球菌属(Peptostreptococcus)明显增加，Odoribacter和考拉杆菌属(Phascolarctobacterium)显著减少；种水平上UC患者肠粘膜Acinetobacter baumannii，Acinetobacter junii明显增加，P值均小于0.05。
将粪便和肠粘膜差异菌群联合分析发现，与健康配偶对照组相比，鉴定出UC患者独特的潜在菌群标志物，Acidaminococcaceae、Odoribacteraceae、Phascolarctobacterium联合减少。
综上所述，得出结论：本发明将与健康人群和溃疡性结肠炎人群中存在相对丰度有显著差异的菌群作为是溃疡性结肠炎的生物标志物，包括以下菌群Acidaminococcaceae、Odoribacteraceae、Phascolarctobacterium、红椿菌目(Coriobacteriales)、交替单胞菌目(Alteromonauodales)、拜叶林克氏菌科(Beijerinckiaceae)、肉杆菌属(Carnobacterium)、不年柄菌属(Asticcacaulis)、Eggerthellaceae、普雷沃氏菌属(Prevotella)、放线菌科(Actinomycetaceae)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、Pseudomonadales→Moraxellaceae→Acinetobacter→Acinetobacter_baumannii、Acinetobacter_junii、Acinetobacter_indicus_CIP_110367。
实施例2
溃疡性结肠炎的生物标志物用于检测溃疡性结肠炎中的检测步骤包括如下步骤：
(a)获取被检测对象的粪便及肠黏膜的样本中的一种或多种菌群生物标志物水平，生物标志物水平即该菌群生物标志物的相对丰度；参考水平即该菌群生物标志物在健康人群中相对丰度的平均值。
对被检测对象的粪便及肠道粘膜微生物16S rRNA的V3-V4区进行分析，测定样品中一种或多种生物标志物的OUT及相对丰度。
(b)将所述一种或多种菌群生物标志物水平与参考水平进行比较；
(c)将粪便样本中的一种或多种菌群生物标志物水平与肠黏膜样本中的一种或多种菌群生物标志物水平进行比较；
比较方法为：
(1)将被检测对象粪便及肠道粘膜中的红椿菌目(Coriobacteriales)、交替单胞菌目(Alteromonauodales)、拜叶林克氏菌科(Beijerinckiaceae)、肉杆菌属(Carnobacterium)、不年柄菌属(Asticcacaulis)及Eggerthellaceae菌群生物标志物水平与参考水平对比，若被检测对象粪便及肠道粘膜中的红椿菌目(Coriobacteriales)、交替单胞菌目(Alteromonauodales)、拜叶林克氏菌科(Beijerinckiaceae)、肉杆菌属(Carnobacterium)、不年柄菌属(Asticcacaulis)及Eggerthellaceae菌群的相对丰度均显著高于参考水平10％，即可判定检测样本足以导致提供者患有溃疡性结肠炎。
(2)将被检测对象粪便中的普雷沃氏菌科(Prevotellaceae)→普雷沃氏菌属(Prevotella)，放线菌目(Actinomycetales)→放线菌科(Actinomycetaceae)菌群生物标志物水平与参考水平比较，若被检测对象粪便中的普雷沃氏菌科(Prevotellaceae)→普雷沃氏菌属(Prevotella)，若放线菌目(Actinomycetales)→放线菌科(Actinomycetaceae)菌群相对丰度显著高于黏膜中的水平10％，即可判定检测样本足以导致提供者患有溃疡性结肠炎。
(3)将被检测对象黏膜样本中的棒状杆菌属(Corynebacterium)、Pseudomonadales→Moraxellaceae→Acinetobacter→Acinetobacter_baumannii、Acinetobacter_junii、Acinetobacter_indicus_CIP_110367菌群生物标志物水平与参考水平比较，若被检测对象黏膜中棒状杆菌属(Corynebacterium)、Pseudomonadales→Moraxellaceae→Acinetobacter→Acinetobacter_baumannii、Acinetobacter_junii、Acinetobacter_indicus_CIP_110367菌群的相对丰度均高于相应检测粪便中的相对丰度10％，即可判断检测样本足以导致提供者患有溃疡性结肠炎。
(d)基于比较结果判断检测样本是否足以导致提供者患有溃疡性结肠炎。
通过上述三种情况的比较方法比较判断，均可以实现对被检测对象的检测样本是否足以导致其患有溃疡性结肠炎进行判断。通过一种比较方法对被检测对象的检测样本是否足以导致其患有溃疡性结肠炎进行判断，可以实现快速较准确的判断过程,而通过上述多种比较方法进行判断，并基于多个判断结果进行判断,能够提高判断的准确性,其准确性相对来说会更高。
Claims (9)
1.溃疡性结肠炎的生物标志物在制备用于检测溃疡性结肠炎的试剂盒的用途，其特征在于，所述溃疡性结肠炎的生物标志物至少包含如下的微生物菌群任意一种或几种的组合:Acidaminococcaceae、Odoribacteraceae、Phascolarctobacterium、红椿菌目(Coriobacteriales)、交替单胞菌目(Alteromonauodales)、拜叶林克氏菌科(Beijerinckiaceae)、肉杆菌属(Carnobacterium)、不年柄菌属(Asticcacaulis)、Eggerthellaceae、普雷沃氏菌属(Prevotella)、放线菌科(Actinomycetaceae)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、Pseudomonadales→Moraxellaceae→Acinetobacter→Acinetobacter_baumannii、Acinetobacter_junii、Acinetobacter_indicus_CIP_110367。
2.溃疡性结肠炎的生物标志物作为靶点用于筛选治疗或者预防炎症性肠病的药物中的用途,其特征在于,所述溃疡性结肠炎的生物标志物至少包含如下的微生物菌群任意一种或几种的组合:
Acidaminococcaceae、Odoribacteraceae、Phascolarctobacterium、红椿菌目(Coriobacteriales)、交替单胞菌目(Alteromonauodales)、拜叶林克氏菌科(Beijerinckiaceae)、肉杆菌属(Carnobacterium)、不年柄菌属(Asticcacaulis)、Eggerthellaceae、普雷沃氏菌属(Prevotella)、放线菌科(Actinomycetaceae)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、Pseudomonadales→Moraxellaceae→Acinetobacter→Acinetobacter_baumannii、Acinetobacter_junii、Acinetobacter_indicus_CIP_110367。
3.溃疡性结肠炎的生物标志物作为靶点用于监控溃疡性结肠炎患者的治疗效果的用途，其特征在于,所述溃疡性结肠炎的生物标志物至少包含如下的微生物菌群任意一种或几种的组合:
Acidaminococcaceae、Odoribacteraceae、Phascolarctobacterium、红椿菌目(Coriobacteriales)、交替单胞菌目(Alteromonauodales)、拜叶林克氏菌科(Beijerinckiaceae)、肉杆菌属(Carnobacterium)、不年柄菌属(Asticcacaulis)、Eggerthellaceae、普雷沃氏菌属(Prevotella)、放线菌科(Actinomycetaceae)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、Pseudomonadales→Moraxellaceae→Acinetobacter→Acinetobacter_baumannii、Acinetobacter_junii、Acinetobacter_indicus_CIP_110367。
4.根据权利要求1所述的溃疡性结肠炎的生物标志物用于检测溃疡性结肠炎中的用途，其特征在于，所述检测步骤包括如下步骤：
(a)测量被检测对象的粪便及肠黏膜的菌群样本中的任意一种或多种菌群生物标记物水平；
(b)将所述任意一种或多种菌群生物标记物水平与参考水平进行比较；
(c)将粪便中的一种或多种菌群生物标记物水平与肠黏膜一种或多种菌群生物标记物水平进行比较；
(c)根据比较结果以确定受试者是否患溃疡性结肠炎。
5.根据权利要求4所述的溃疡性结肠炎的生物标志物用于检测溃疡性结肠炎中的用途，其特征在于，所述粪便及肠黏膜中的Acidaminococcaceae、Odoribacteraceae、与Phascolarctobacterium菌群生物标记物水平均低于参考Acidaminococcaceae、Odoribacteraceae、与Phascolarctobacterium菌群水平，即可确定检测样本足以导致提供者患有溃疡性结肠炎。
6.根据权利要求4所述的溃疡性结肠炎的生物标志物用于检测溃疡性结肠炎中的用途，其特征在于，所述粪便及肠黏膜中的红椿菌目(Coriobacteriales)、交替单胞菌目(Alteromonauodales)、拜叶林克氏菌科(Beijerinckiaceae)、肉杆菌属(Carnobacterium)、不年柄菌属(Asticcacaulis)及Eggerthellaceae菌群生物标记物水平均高于参考红椿菌目(Coriobacteriales)、交替单胞菌目(Alteromonauodales)、拜叶林克氏菌科(Beijerinckiaceae)、肉杆菌属(Carnobacterium)、不年柄菌属(Asticcacaulis)及Eggerthellaceae菌群水平，即可确定检测样本足以导致提供者患有溃疡性结肠炎。
7.根据权利要求4所述的溃疡性结肠炎的生物标志物用于检测溃疡性结肠炎中的用途，其特征在于，所述粪便中的普雷沃氏菌科(Prevotellaceae)→普雷沃氏菌属(Prevotella)，放线菌目(Actinomycetales)→放线菌科(Actinomycetaceae)水平高于黏膜中的水平，即可确定检测样本足以导致提供者患有溃疡性结肠炎。
8.根据权利要求4所述的溃疡性结肠炎的生物标志物用于检测溃疡性结肠炎中的用途，其特征在于，所述黏膜中的棒状杆菌属(Corynebacterium)、Pseudomonadales→Moraxellaceae→Acinetobacter→Acinetobacter_baumannii、Acinetobacter_junii、Acinetobacter_indicus_CIP_110367水平高于粪便中的水平，即可确定检测样本足以导致提供者患有溃疡性结肠炎。
9.根据权利要求4所述的溃疡性结肠炎的生物标志物用于检测溃疡性结肠炎中的用途，其特征在于，所述生物标记物的水平是通过从测定对象中分离出的肠道菌群核酸样本进行基因测序所获得的相对丰度值。
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