CN110904195A - 一种cd55基因表达检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种CD55基因表达检测试剂盒，其包括针对CD55基因mRNA的茎环状捕获探针以及信号放大系统；所述信号放大系统包括有扩增探针和末端修饰有树状荧光基团的标记探针；其中，所述茎环状捕获探针从5’端到3’端的碱基组成依次为：茎部结构序列，能与目标mRNA结合的特异性P1序列、间隔臂序列、P2序列；所述扩增探针从5’端到3’端的碱基组成依次为：能与茎环状捕获探针的P2序列互补配对的P3序列、间隔臂序列、P4序列；所述标记探针具有与扩增探针P4序列互补配对的P5序列，且末端修饰有树状荧光基团。上述试剂盒具有灵敏度高、特异性强、准确率高等优点，可用于检测生物样本中CD55基因的表达水平。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种CD55基因表达检测试剂盒。
背景技术
CD55又称为衰变加速因子(DAF)，最早由Hofmann于1969年从人红细胞表面分离出来；自此，CD55被认为是一种糖基磷脂酰肌醇膜蛋白，广泛存在于血液、基质、上皮和内皮细胞中。其基因定位于人类染色体1q32.2，包含15个外显子；其主要功能是作为补体调节蛋白同C2竞争与C4b结合，抑制C3转化酶形成以及促进其分解，同时抑制补体C3的沉积和激活，因此能抑制补体经典途径和旁路途径(Dho S H et al.,Immune network,2018,18,e11)。
近年来，研究表明，CD55基因表达水平的变化与多种疾病有关，包括癌症，CD55在癌症预后和治疗方面具有重要的临床意义。因此，有必要开发一种CD55基因表达检测试剂盒，该试剂盒将有助于进一步深入研究CD55基因表达在各种肿瘤发生发展、预后及治疗方面的临床意义，并将为肿瘤的诊断、预后和治疗提供有用的临床辅助信息。
目前文献报道的用于临床样本CD55表达检测的方法主要是免疫组化的方法。该方法是利用手术或穿刺后取得的肿瘤组织进行切片染色，检测的是肿瘤组织中CD55蛋白的表达情况，具有检测成本低、操作简单、耗时短，可实现自动化检测和染色后切片便于存档等优点。但是，免疫组化的一些不足成为临床上CD55表达检测所面临的新问题，主要有：①免疫组化法容易受到受检组织固定时间、固定液的选择、抗体试剂盒的选择和染色结果判读的主观性等诸多因素影响；②肿瘤异质性导致免疫组化法无法避免出现假阴性的结果；③检测所需组织样本要通过手术获取，取材繁琐且对患者影响较大；④部分患者无法提供组织样本或组织样本无法满足检测的基本要求。此外，定量RT-PCR主要用于CD55 mRNA表达水平的检测，具有灵敏度高、序列特异性强等优点；但是，定量RT-PCR过程对环境和操作的要求高，稍有不慎，就可能造成污染，导致假阳性结果的产生。
基于此，有必要开发出一种灵敏度高、特异性强、准确率高的CD55基因检测试剂盒。
发明内容
基于此，本发明的目的在于提供一种灵敏度高、特异性强、准确率高的CD55基因表达检测试剂盒，可用于检测生物样本中CD55基因的表达水平，提供临床相关辅助信息。
具体技术方案如下：
一种CD55基因表达检测试剂盒，包括针对CD55基因mRNA的茎环状捕获探针以及信号放大系统；所述信号放大系统包括扩增探针和末端修饰有树状荧光基团的标记探针；其中，
(1)茎环状捕获探针：所述捕获探针为茎环状，用于连接CD55基因mRNA与扩增探针，每条捕获探针从5’端到3’端的碱基组成依次为：茎部结构序列，能与CD55基因mRNA结合的特异性P1序列、间隔臂序列、P2序列；所述茎部结构序列可与P2序列3’端的碱基互补形成茎环结构；所述P2序列为不存在发夹结构，探针内部和探针间不形成二聚体、不存在错配，与P1、P4和CD55基因mRNA之间均不存在特异性结合的序列；所述针对CD55基因mRNA的茎环状捕获探针中，特异性P1序列选自SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.10中的5条或5条以上，茎部结构序列为SEQ ID NO.21，P2序列为SEQ ID NO.23；
(2)扩增探针：所述扩增探针连接捕获探针与标记探针，每条扩增探针从5’端到3’端的碱基组成依次为：能与茎环状捕获探针的P2序列互补配对的P3序列、间隔臂序列、P4序列；所述P4序列为不存在发夹结构，探针内部和探针间不形成二聚体、不存在错配，与P1、P2、P3和CD55基因mRNA之间均不存在特异性结合的序列；所述针对CD55基因mRNA的扩增探针中，P3序列为SEQ ID NO.25，P4序列为SEQ ID NO.27；
(3)标记探针：所述标记探针连接扩增探针与树状荧光基团，每条标记探针具有与扩增探针P4序列互补配对的P5序列，且末端修饰有树状荧光基团。
在其中一些实施例中，所述针对CD55基因mRNA的标记探针中，P5序列为SEQ IDNO.29。
在其中一些实施例中，所述试剂盒还包括有针对内参基因mRNA的茎环状捕获探针以及信号放大系统；针对内参基因mRNA的茎环状捕获探针以及信号放大系统与针对CD55基因mRNA的捕获探针以及信号放大系统的结构相同，但标记探针的末端修饰的树状荧光基团互不相同。使用内参基因，有助于进一步保证检测结果的可靠性。
在其中一些实施例中，优选所述内参基因为ACTB基因。
在其中一些实施例中，所述针对ACTB基因mRNA的茎环状捕获探针中，特异性P1序列选自SEQ ID NO.11～SEQ ID NO.20中的5条或5条以上，茎部结构序列为SEQ ID NO.22，P2序列为SEQ ID NO.24；针对ACTB基因mRNA的扩增探针中，P3序列为SEQ ID NO.26，P4序列为SEQ ID NO.28；针对ACTB基因mRNA的标记探针中，P5序列为SEQ ID NO.30。
在其中一些实施例中，所述间隔臂序列的长度为5～10个碱基。
在其中一些实施例中，优选所述间隔臂序列为5～10个T。
在其中一些实施例中，所述树状荧光基团的荧光染料选自：FAM、TET、JOE、HEX、Cy3、TAMRA、ROX、Texas、Red、LC RED640、Cy5、LC RED705、Alexa Fluor 488和Alexa Fluor750；使用树状荧光基团，有助于提高标记探针的灵敏度。
在其中一些实施例中，所述CD55基因表达检测试剂盒还包括有样本前处理组分，用于对生物样本进行前处理，实现待检测细胞的富集；所述样本前处理组分包括单个核细胞分离管和含滤膜的过滤器；其中，
所述单个核细胞分离管，包括管体和管塞，用于单个核细胞层的分离提取；所述管体内部从管底往上，按照比重由大到小，依次包括Ficoll-hyhaque分层液层、分离胶层和抗凝剂层；
所述含滤膜的过滤器用于待检测细胞的富集，所述滤膜选自聚碳酸酯滤膜、纤维滤膜、尼龙滤膜或塑料薄膜。
所述生物样本包括但不局限于以下来源：人或动物的外周循环血、胸腔积液、腹水、脐带血、羊水、骨髓或培养的人或动物细胞。
所述抗凝剂层上方空间用于容纳生物样本，血液样本分离前要先与抗凝剂混合均匀。
在其中一些实施例中，所述Ficoll-hyhaque分层液层中的Ficoll-hyhaque分层液为常规的Ficoll-hyhaque分层液，可通过购买得到。
在其中一些实施例中，所述分离胶的比重为1.050～1.080；所述分离胶层中的分离胶是通过向基体树脂中加入比重调节剂和有机凝胶剂制成，基体树脂、比重调节剂和有机凝胶剂的重量比为100:2-7:0.5-5；所述基体树脂由α-烯烃和马来酸二烷基酯两种单体在引发剂作用下聚合而成，α-烯烃、马来酸二烷基酯和引发剂的质量比为1:1-1.4:0.04-0.12；所述基体树脂的比重为1.030～1.080；所述引发剂为过氧化苯甲酸叔丁酯；所述比重调节剂为粒径为5～50nm的纳米二氧化硅；所述有机凝胶溶剂为分子量500～10000的聚氧乙烯聚丙烯醚。
在其中一些实施例中，所述抗凝剂层中抗凝剂为浓度0.10～0.15mol/L的柠檬酸钠溶液。
在其中一些实施例中，所述滤膜孔径为5～8μm。
在其中一些实施例中，所述滤膜优选为聚碳酸酯滤膜，滤膜孔径优选为8μm。
上述单个核细胞分离管用于肿瘤细胞的富集，与常规的Ficoll-hyhaque密度梯度离心法相比，操作简单、快捷，减少了操作过程中肿瘤细胞的丢失。
本发明的另一目的，在于提供一种非诊断目的的CD55基因表达检测方法。
具体技术方案为：
一种非诊断目的的CD55基因表达检测方法，包括以下步骤：
(1)得到待检测生物样本；
(2)利用上述的前处理组分富集生物样本中的待检测细胞：a)单个核细胞分离管处理生物样本，从而得到单个核细胞层；b)单个核细胞层使用含滤膜的过滤器进行过滤，将待检测细胞过滤至滤膜上，从而实现待检测细胞的富集；
(3)对待检测细胞进行前处理，使mRNA暴露；
(4)利用上述试剂盒检测CD55基因mRNA是否存在：a)茎环状捕获探针与CD55基因mRNA序列和扩增探针杂交，获得CD55基因mRNA-捕获探针-扩增探针复合体；b)标记探针与步骤a)所述复合体中扩增探针的P4序列杂交，实现信号的级联放大；c)通过荧光检测仪检测。
在其中一些实施例中，所述步骤(4)中捕获探针、扩增探针和标记探针的摩尔比为3：0.66：0.33。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1、本发明提供了一种特异性高的CD55基因mRNA原位检测探针，所述探针包括茎环状捕获探针、扩增探针和标记探针。所述捕获探针从5’端到3’端的碱基组成依次为：茎部结构序列，能与CD55基因mRNA结合的特异性P1序列、间隔臂序列、P2序列，通过茎部结构序列与P2序列3’端的碱基互补配对形成茎环状结构。在用于检测时，P1序列与目标mRNA互补结合，P2序列与P3序列互补结合，在捕获探针两侧形成张力。发明人经过大量的模拟测试和研究统计发现，本发明提供的检测探针可以形成一个良好的力学体系，当本发明提供的如SEQID NO.1～SEQ ID NO.10所示的P1序列与CD55基因mRNA互补结合，且如SEQ ID NO.23所示的P2序列与如SEQ ID NO.25所示的P3序列互补结合，形成的张力才足以打开本发明提供的捕获探针中的茎环状结构，从而使捕获探针被拉直，修饰有树状荧光基团的标记探针与CD55基因mRNA-捕获探针-扩增探针复合体结合，使目标mRNA带上荧光标记，实现检测。针对CD55基因mRNA的P1序列选择其他序列或P2序列碱基的更换均会使捕获探针两侧形成张力不足以打开本发明提供的捕获探针中的茎环状结构，从而不能实现检测。
2、本发明所提供的试剂盒信噪比高、准确率高：本发明提供的检测探针在使用时，只有当捕获探针两侧形成张力足以打开所述茎环状结构，才能使目标mRNA带上荧光标记，实现检测。此外，茎环状捕获探针分子与基质表面(如滤膜)接触面积小于线性寡核苷酸探针，在一定程度上也降低了背景荧光的产生；带有树状荧光基团的标记探针比常规荧光基团修饰的标记探针更加灵敏，并提高了目标荧光信号强度，从而增加信噪比，提高准确率。
3、本发明所设计的各种探针，能够在均一的反应条件下进行反应，且各种探针之间基本不存在非特异性结合；所设计的探针在检测中特异性好、信噪比高。同时，多种探针的组合使用使检测试剂盒和检测方法形成一个检测效果完好的系统。
4、本发明试剂盒还提供了样本前处理组分，所述样本前处理组份包括单个核细胞分离管和含滤膜的过滤器。所述单个核细胞分离管用于生物样本(主要是血液样本)中的单个核细胞的分离提取，相对于现有技术，无需将血液从含有抗凝剂的真空采集管中转移到另一容器中的操作，也无需进行将血液小心地注入到Ficoll-hyhaque分层液上方的操作，吸取外周血单个核细胞层时也无需从液体界面小心地吸取而是可以放心地从固体的分离胶界面和黄色的血浆之间吸取，从而简化了外周血单个核细胞的提取步骤、降低提取难度并提高可重复性。在使用单个核细胞分离管分离提取外周血单个核细胞后，再使用含滤膜的过滤器通过膜过滤的方法，进一步去除白细胞并富集肿瘤细胞，可提高循环肿瘤细胞纯度，方便后续对肿瘤细胞的CD55基因表达的检测。
5、本发明设计的标记探针上修饰的荧光基团采用树状荧光基团，树状荧光基团的使用可使掺入标记探针内的荧光染料的量不受限制，可使荧光信号比它们相应的单独个体更加明亮，使得标记探针更加灵敏，从而进一步提高检测的灵敏度。
附图说明
图1为本发明试剂盒对CD55基因表达的阴性和阳性检测结果示意图，其中A为CD55阴性细胞图，图中细胞带有红色荧光信号点(只表达ACTB)；B为CD55阳性细胞图，图中细胞带有红色和绿色荧光信号点(同时表达CD55和ACTB)。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将参照实施例对本发明进行更全面的描述，以下给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。应理解，下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用试剂，均为市售产品。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
实施例1CD55基因表达检测试剂盒
本实施例所述的CD55基因表达检测试剂盒，主要包括有：
1.茎环状捕获探针
茎环状捕获探针由四部分碱基序列组成，从5’端到3’端依次是茎部结构序列、能与待检测目标mRNA结合的特异性P1序列、间隔臂序列、能与扩增探针P3序列结合的P2序列，同一目标mRNA的茎环状捕获探针中的P2序列相同。所述间隔臂为用于将捕获探针P2序列与目标mRNA间隔开来，通过在探针内部设置适当长度的间隔臂序列，可减少空间位阻，提高杂交反应的效率以及杂交反应的特异性。本发明捕获探针的间隔臂优选为5～10个T，本实施例优选为5个T。针对每个mRNA分别设计10条茎环状捕获探针，在保证整个检测系统的稳定性的基础上，再提高检测的特异性(具体使用时，针对每个目标基因，选择≥5条捕获探针即可完成检测，特异性和稳定性都很好，可参考实施例5)，本实施例优选为使用10条捕获探针，以使特异性达到最好。针对相应的目标mRNA的茎环状捕获探针的特异性P1序列见表1，不同类型的目标mRNA的捕获探针的茎部结构序列见表2，P2序列见表3。
表1目标mRNA捕获探针的P1序列
表2捕获探针的茎部结构序列
| mRNA | 捕获探针茎部结构序列(5’-3’) | SEQ ID NO. |
| CD55 | GTTACTAG | 21 |
| ACTB | AGTGTCAC | 22 |
表3捕获探针的P2序列
| mRNA | 捕获探针P2序列(5’-3’) | SEQ ID NO. |
| CD55 | ATGTAATAGAAGATTACTAGTAAC | 23 |
| ACTB | GAACTGTAGCTAGCACGTGACACT | 24 |
2.扩增探针
扩增探针是连接捕获探针与信号检测组分之间的序列，扩增探针由三部分碱基序列组成，从5’端到3’端依次是能与捕获探针P2序列互补配对的P3序列、5个寡聚核苷酸T的间隔臂序列(本发明的扩增探针间隔臂优选为5～10个T，本实施例优选为5个T)、能与标记探针互补配对的P4序列。所述目标mRNA的扩增探针的P4序列内部不存在发夹结构，探针内部和探针间不形成二聚体、不存在错配，与P1、P2、P3和总mRNA之间均不存在特异性结合的序列。针对相应的目标mRNA的扩增探针的P3序列见表4，P4序列见表5。
表4扩增探针的P3序列
表5扩增探针的P4序列
| mRNA | 扩增探针P4序列(5’-3’) | SEQ ID NO. |
| CD55 | GTTTAGTATTGATTGAGATTTAAG | 27 |
| ACTB | TGCTACACTGCATTGCAAGCATC | 28 |
3.标记探针
标记探针由两部分组成，其5’端是能与扩增探针P4序列互补配对的P5序列，3’端带有树状荧光基团标记，通过与扩增探针P4序列的结合实现目标mRNA信号的级联放大。标记探针的树状荧光基团的荧光染料选自：FAM、TET、JOE、HEX、Cy3、TAMRA、ROX、Texas、Red、LCRED640、Cy5、LC RED705、Alexa Fluor 488和Alexa Fluor 750，不同类型目标mRNA的标记探针的树状荧光基团选择的荧光染料互不相同，且所选择的荧光染料的颜色互不相同或发射波长互不相同，以便区分不同类型的目标mRNA。
表6标记探针的P5序列
| mRNA | 标记探针P5序列(5’-3’) | SEQ ID NO. | 树状荧光基团的荧光染料 |
| CD55 | CTTAAATCTCAATCAATACTAAAC | 29 | Alexa Fluor 488(绿色荧光信号) |
| ACTB | GATGCTTGCAATGCAGTGTAGCA | 30 | Cy3(红色荧光信号) |
本实施例所述的CD55基因表达检测试剂盒，还包括有样本前处理组分，用于对生物样本进行前处理，实现肿瘤细胞的富集；所述样本前处理组份包括单个核细胞分离管和含滤膜的过滤器。
4.单个核细胞分离管
单个核细胞分离管用于生物样本单个核细胞层的分离提取，单个核细胞分离管，包括管体和管塞，所述管体内部从管底部往上，按照比重由大到小，依次为Ficoll-hyhaque分层液层、分离胶层和抗凝剂层；所述管体中，分离胶层的上方空间用于容纳生物样本；所述Ficoll-hyhaque分层液层中的Ficoll-hyhaque分层液为常规的Ficoll-hyhaque分层液，可通过购买得到；抗凝剂层中的抗凝剂为浓度为0.10～0.15mol/L的柠檬酸钠溶液；分离胶层中的分离胶比重为1.050～1.080，是通过向基体树脂中加入比重调节剂和有机凝胶剂制成，基体树脂、比重调节剂和有机凝胶剂的重量比为100:2-7:0.5-5；所述基体树脂由α-烯烃和马来酸二烷基酯两种单体在引发剂作用下聚合而成，α-烯烃、马来酸二烷基酯和引发剂的质量比为1:1-1.4:0.04-0.12；所述基体树脂的比重为1.030～1.080；所述引发剂为过氧化苯甲酸叔丁酯；所述比重调节剂为粒径为5～50nm的纳米二氧化硅；所述有机凝胶溶剂为分子量500～10000的聚氧乙烯聚丙烯醚。
上述单个核细胞分离管的制备方法如下：
步骤1：按重量比称取α-烯烃、马来酸二烷基酯和过氧化苯甲酸叔丁酯；将α-烯烃和马来酸二烷基酯混合均匀并加热至140～160℃后，以滴加方式加入过氧化苯甲酸叔丁酯，滴加时间为3～4小时；滴加完毕后，于140～160℃保温2～3小时，得到基体树脂；
步骤2：按重量比称取和混匀基体树脂、比重调节剂和有机凝胶剂后，于真空条件下分散调和1～2小时得到分离胶；
步骤3：向分离管的管体中先加入1.5～2.5ml的Ficoll-hyhaque分层液，再加入1～3g的分离胶，于1500g离心力下离心5分钟后，加入0.8～1.2ml浓度为0.10～0.15mol/L的抗凝剂，然后真空压塞制得单个核细胞分离管。
在上述制备过程中，所用试剂盒、分离管的管体和管塞均经过灭菌处理。
5.含滤膜的过滤器
含滤膜的过滤器用于富集单个核细胞层中的待检测细胞；所述滤膜选自聚碳酸酯滤膜、纤维滤膜、尼龙滤膜或塑料薄膜，滤膜孔径为5～8μm；本实施例滤膜优选为聚碳酸酯滤膜，滤膜孔径优选为8μm。
实施例2运用实施例1中试剂盒对样本进行检测
所述各种溶液的配方如表7：
本实施例优选肿瘤患者血液样本，对样本中循环肿瘤细胞(CTCs)CD55基因表达水平进行检测，其中捕获探针混合液、扩增探针混合液、显色探针混合液均使用实施例1的CD55基因表达检测试剂盒相应列表中的全部探针。
1、样本前处理，待检测细胞过滤至滤膜上
(1)将血液样本5ml注入本发明的单个核细胞分离管中，轻轻颠倒8～10次使血液和分离管中抗凝剂充分混匀；(2)于1500rpm离心力下离心20分钟使血液分层，每层中的组分自下而上依次为红细胞、粒细胞、Ficoll-hypaque分层液层、分离胶层、单个核细胞层、血浆，吸取分离胶上方与黄色血浆之间的单个核细胞层，收集得到单个核细胞层；(3)向上述获得的单个核细胞层中加入4ml PBS和1ml固定剂，涡旋混匀，室温静置8分钟；(4)样本过滤：将步骤(3)所述的液体转移至过滤器中，打开真空抽滤泵抽尽液体；再加入4ml PBS，洗涤管壁后抽滤液体；(5)将滤膜转移至24孔板中，加入400μl的4％甲醛溶液，室温固定1小时；(6)去除液体，每孔加入1ml PBS洗涤3次，每次浸泡2分钟。
2、透化处理
(1)在新的24孔板中每孔加入50μl透化剂，将滤膜从PBS中取出，滤膜片边缘接触吸水纸，去除多余液体，将滤膜倒扣在透化剂上，即滤膜铁圈刻有编码的一面向下贴近液体。室温孵育5min；(2)去除液体，每孔加入1ml PBS洗涤2次，每次浸泡2分钟。将滤膜保持在PBS中至下一步实验操作。
3、消化细胞，暴露mRNA，使其便于与探针杂交
(1)配制相应浓度的消化酶工作液：对于每个样本，消化酶工作液组成如下：48.75μl的PBS、1.25μl的消化酶，总体积50μl；(2)按实验需要配制一定体积的消化酶工作液，涡旋混匀，分装至24孔板中，每孔50μl；(3)将滤膜取出，倒扣至24孔板中消化酶工作液上，保证滤膜向下一面与液体充分接触，不能有气泡存在，室温静置1小时；(4)去除液体，每孔加入1ml PBS洗涤3次，每次浸泡2分钟。将滤膜保持在PBS中至下一步实验操作。
4、探针杂交，形成目标mRNA序列-捕获探针-扩增探针复合体
(1)捕获缓冲液、扩增缓冲液使用前需40℃水浴预热20分钟；(2)配制捕获工作液：对于每个样本，捕获探针工作液组成如下：8μl捕获混合液、42μl捕获缓冲液(40℃预热)，总体积50μl。按实验需要配制一定体积的捕获工作液，涡旋混匀，分装至24孔板中，每孔50μl；(3)配制扩增工作液：对于每个样本，扩增工作液组成如下：2μl扩增混合液、48μl扩增缓冲液(40℃预热)，总体积50μl。按实验需要配制一定体积的扩增工作液，涡旋混匀，分装至已含有捕获工作液的24孔板中，每孔50μl；(4)将滤膜取出，倒扣至24孔板中探针工作液上(同时包含捕获探针和扩增探针)，保证滤膜向下一面与液体充分接触，不能有气泡存在；(5)盖上24孔板盖，40±1℃孵育3小时；(6)去除液体，每孔加入1ml PBS洗涤3次，每次浸泡2分钟。将滤膜保持在PBS中至下一步实验操作。
5、显色，荧光标记目标信号
(1)显色缓冲液使用前需40℃水浴预热20分钟；整个显色操作过程需避光操作；(2)配制显色工作液：对于每个样本，显色工作液组成如下：2μl显色混合液、48μl显色缓冲液(40℃预热)，总体积50μl。按实验需要配制一定体积的显色工作液，避光涡旋混匀。分装至24孔板中，每孔50μl；(3)将滤膜取出，倒扣至24孔板中显色工作液上，保证滤膜向下一面与液体充分接触，不能有气泡存在；(4)盖上24孔板盖，40±1℃避光孵育30分钟；(5)去除液体，每孔加入1ml PBS洗涤3次，每次浸泡2分钟。将滤膜保持在PBS中至下一步实验操作。
6、荧光显微镜观察CD55基因的表达
本发明的对照品使用DAPI作为细胞核荧光基团，其发射蓝色荧光信号。
(1)将滤膜细胞面朝上置于载玻片上，沿铁圈内环将滤膜割下，加10μl含DAPI的抗淬灭剂，盖上18mm×18mm的盖玻片，直接镜检或置于-20℃保存；(2)通过20倍物镜计数筛查细胞异性核数量；(3)根据10倍物镜定位异性核位置，滴油，用油镜观察实验结果，并拍照记录结果；(4)然后再根据10倍物镜定位下一个异性核位置，滴油，用油镜观察实验结果，并拍照记录结果；(5)重复操作至拍完所有的异性核，数量与20倍物镜计数结果一致。
显微镜使用通道如下：
表8荧光基团的激发波长和发射波长
| 荧光基团 | 激发波长(Excitation filter) | 发射波长(Emission filter) |
| DAPI | 330～385nm | 420nm |
| Alexa Fluor 488 | 460～495nm | 510～550nm |
| Cy3 | 545～580nm | 610nm |
7、检测结果判断及分析
(1)CD55基因表达判定标准
在滤膜上，富集有待检测细胞，本试剂盒阳性表达判定标准(参见图1)：
a)样本中有≥1个细胞表达CD55基因mRNA，在本试剂盒中表现为样本中有1个或1个以上细胞在Alexa Fluor 488通道下能够显示绿色荧光信号点；b)样本中所有细胞均表达内参基因mRNA，在本试剂盒中表现为样本中所有细胞在Cy3通道下均显示红色荧光信号点。
本试剂盒采用针对目标mRNA的多重捕获探针，分别针对CD55基因mRNA和内参基因mRNA，通过荧光信号的表达，判断检测的细胞是否为表达CD55。
(2)使用上述检测方法，对15例肿瘤患者外周血样本(编号1～15)进行检测，同时选用CD55阳性肺癌细胞株NCl-H1975和CD55阴性细胞株NK-92自然杀伤细胞作为阴阳性对照，本领域技术人员只要知道细胞株的名称即可通过购买得到。分别各取约1000个NCl-H1975和NK-92细胞(通过细胞计数器确定)，混合均匀后将样本各均分为5份编号16～20和21～25，读取每个细胞株样本中有DAPI蓝色荧光信号的50个细胞，统计其表达绿色/红色荧光的细胞数量，其中，样本中的细胞数通过荧光显微镜自动扫描来选取。每个标本重复检测三次。具体结果如表9所示：
表9样本检测结果
检测发现，每个标本的每次检测结果相同，且由上述检测结果可知，本发明CD55基因表达检测试剂盒具有很好的特异性和灵敏度，能有效实现生物样本的检测。本发明试剂盒与临床检测结果具有100％的吻合率，说明本发明试剂盒设计的探针组成的检测体系能对患者循环肿瘤细胞中CD55的表达进行精准检测，具有很高的准确率。
实施例3捕获探针结构对试剂盒检测效果的影响
1、试剂盒制备的设计(捕获探针结构设计)
为了评估不同结构捕获探针组成的试剂盒的检测效果，设计实验组1-2，其中实验组1选用本发明试剂盒中的茎环状捕获探针，实验组2选用线性捕获探针，两个实验组除了捕获探针不同之外，其它组分均相同。所述线性捕获探针的组成结构从5’端到3’端依次为：能与待检测目标mRNA结合的特异性P1序列、间隔臂序列、P2序列，其中P1序列、间隔臂序列、P2序列与实验组1中的茎环状捕获探针完全相同，具体设计如表10所示。
表10试剂盒捕获探针结构的选择
| 实验组 | 捕获探针类型 | 捕获探针组成(5’-3’) |
| 实验组1 | 茎环状捕获探针 | 茎部结构序列-P1序列-间隔臂序列-P2序列 |
| 实验组2 | 线性捕获探针 | P1序列-间隔臂序列-P2序列 |
2、样本检测
采用上述设计制备的试剂盒，按实施例2所述检测过程和方法对10例肿瘤患者血液样本(依次编号为1～10)进行检测，读取每个样本中有DAPI蓝色荧光信号的细胞，统计其表达绿色/红色荧光的细胞数量，同时表达两种荧光的细胞分别在绿色阳性、红色阳性细胞数量中列出，其中，样本中的细胞数通过荧光显微镜自动扫描来选取。具体结果如下：
表11试剂盒选用不同捕获探针的检测结果比较
从以上检测结果可知，与常规的线性捕获探针(本实施例实验组2)相比，本发明设计的茎环状捕获探针(本实施例实验组1)具有更高的特异性和准确度，检测结果与临床检测结果100％吻合。线性捕获探针由于不能区分两端几个碱基的差异，故存在一些非特异性杂交；同时线性探针分子与滤膜表面接触面积大于茎环状探针，在探针杂交过程中难以避免探针分子与滤膜本身的结合造成的非特异性荧光背景，因此线性捕获探针的非特异性荧光信号高于茎环状捕获探针，导致一些假阳性结果的产生(3号和8号样本)，故本发明设计的茎环状捕获探针具有更高的特异性和准确率。
实施例4捕获探针的特异性
1、试剂盒制备的设计
本发明试剂盒提供一种茎环状的捕获探针，只有如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.10所示的P1序列与CD55基因mRNA互补结合，且如SEQ ID NO.23所示的P2序列与如SEQ IDNO.25所示的P3序列互补结合，形成的张力才足以打开本发明提供的捕获探针中的茎环状结构，从而使捕获探针被拉直，修饰有树状荧光基团的标记探针与CD55基因mRNA-捕获探针-扩增探针复合体结合，使目标mRNA带上荧光标记，实现检测。针对CD55基因mRNA的P1序列碱基的更换、P1序列选择其他序列或P2序列碱基的更换均会使捕获探针两侧形成张力不足以打开本发明提供的捕获探针中的茎环状结构，从而不能实现检测。
以针对CD55基因mRNA捕获探针的P1序列为例，设计三组实验，依次记为实验组1-3，其中实验组1采用实施例1试剂盒相应列表中的全部探针，实验组2采用SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.10所示P1序列具有1-5个替换碱基的捕获探针，实验组3使用5条可与CD55基因mRNA完全互补结合的不同于本发明的P1序列。其它检测组分均与实验组1完全一致，具体设计如表12所示。
表12捕获探针P1序列
2、样本检测
本实施例选用细胞株NCl-H1975和NK-92进行实验，本领域技术人员只要知道细胞株的名称即可通过购买得到。分别各取约2000个NCl-H1975和NK-92细胞(通过细胞计数器确定)，混合均匀后将样本各均分为15份，依次编号1～15和16～30。采用上述设计制备的试剂盒，按实施例2所述检测过程和方法对样本1～30进行检测，每个实验组的试剂盒每种细胞株的样本各检5份，读取每个样本中有DAPI蓝色荧光信号的50个细胞，统计其表达绿色荧光的细胞数量以及平均荧光点数，其中，样本中的细胞数通过荧光显微镜自动扫描来选取。
具体结果如下：
表13使用不同P1序列的捕获探针的检测结果比较
从以上结果可知，当捕获探针特异性P1序列中有1-5个替换为其他碱基时，其与CD55基因mRNA不能完全互补配对，在CD55阳性细胞株NCl-H1975中基本检测不到荧光信号，不能实现检测(本实施例实验组2)；当捕获探针特异性P1序列使用其他可与CD55基因mRNA完全互补配对的序列时，在捕获探针两侧形成的张力也不能完全打开茎环结构，导致在CD55阳性细胞株NCl-H1975中基本检测不到荧光信号，不能实现有效检测(本实施例实验组3)。本发明提供的茎环状探针具有很高的特异性，只有如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.10所示的P1序列与CD55基因mRNA互补结合，且如SEQ ID NO.23所示的P2序列与如SEQ ID NO.25所示的P3序列互补结合，形成的张力才足以打开本发明提供的捕获探针中的茎环状结构，从而使捕获探针被拉直，修饰有树状荧光基团的标记探针与CD55基因mRNA-捕获探针-扩增探针复合体结合，使目标mRNA带上荧光标记，实现检测，保证了检测结果的准确性。
实施例5捕获探针的数量选择
1、试剂盒制备的设计(捕获探针数量的选择)
本发明CD55基因表达检测试剂盒，针对不同的目标mRNA分别设计了10条捕获探针，且同一目标mRNA捕获探针中的P2序列相同。在实际使用时，可以针对每种目标mRNA，选择对应的至少5条捕获探针即可完成检测，特异性和稳定性都能达到需求。
为考察捕获探针数量的选择对试剂盒检测效果的影响，以CD55基因mRNA的捕获探针数量选择为例，设计三组实验组，依次记为实验组1-3，分别选取2条、5条及10条的捕获探针，对比其检测效果，试剂盒具体设计参见表14。
表14CD55基因mRNA捕获探针的选择
| 实验组 | 捕获探针数量 | 捕获探针中P1序列 |
| 实验组1 | 2条 | SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2 |
| 实验组2 | 5条 | SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.5 |
| 实验组3 | 10条 | SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.10 |
2、样本检测
本实施例选用市场上销售的细胞株NCl-H1975和NK-92进行实验。分别各取约3000个NCl-H1975和NK-92细胞(通过细胞计数器确定)，混合均匀后将样本各均分为15份，依次编号1～15和16～30。按实施例2所述检测过程和方法对样本1～30进行检测，每个实验组每种细胞株各检5份，读取每个样本中有DAPI蓝色荧光信号的50个细胞，统计其表达绿色荧光的细胞数量以及平均荧光点数，其中，样本中的细胞数通过荧光显微镜自动扫描来选取。
具体结果如下：
表15CD55基因使用不同数量捕获探针的检测结果比较
通过三组实验对比可知，针对CD55基因表达的检测，使用2条、5条和10条的捕获探针均可完成检测，但当捕获探针使用5条或以上时，其特异性和稳定性才都很好。其中，当使用全部10条的捕获探针时，检测到的荧光信号点数更多，信号更强更稳定，检测效果最佳。
针对ACTB基因mRNA捕获探针的数量的选择实验结果与上述结果一致，具体数据省略。
实施例6内参基因的运用
1、试剂盒制备的设计(目标检测mRNA的选择)
本发明试剂盒目标检测mRNA包括CD55和ACTB基因的mRNA，为了考察内参基因的使用对检测效果的影响，设计两组实验组，依次记为实验组1-2，其中实验组1只检测CD55基因mRNA，实验组2同时检测CD55和ACTB基因的mRNA。每组相应目标mRNA的所述捕获探针、扩增探针和标记探针的组成和数量、检测方法等如实施例1和实施例2所述。具体设计如表16所示。
表16目标检测mRNA的选择
| 实验组 | 目标检测mRNA |
| 实验组1 | CD55基因 |
| 实验组2 | CD55基因、ACTB基因 |
2、样本检测
本实施例选用市场上销售的细胞株NCl-H1975和NK-92进行实验。分别各取约2000个NCl-H1975和NK-92细胞(通过细胞计数器确定)，混合均匀后将样本各均分为10份，依次编号1～10和11～20。按实施例2所述检测过程和方法对样本1～20进行检测，每个实验组每种细胞株各检5份，读取每个样本中有DAPI蓝色荧光信号的50个细胞，统计其表达绿色/红色荧光的细胞数量，同时表达两种荧光的细胞分别在绿色阳性、红色阳性细胞数量中列出，其中，样本中的细胞数通过荧光显微镜自动扫描来选取。具体结果如下：
表17试剂盒选用不同检测目标mRNA的检测结果比较
从上述检测结果可知，本发明试剂盒提供的CD55基因mRNA检测体系，既可以单独使用，也可与内参基因ACTB一起联合使用，均能实现CD55基因表达的精准检测，说明本发明提供的检测探针具有很好的特异性，相互之间不产生干扰。使用内参基因，可进一步提高检测结果的可靠性(本实施例实验组2)，但不使用内参基因也可完成检测(本实施例实验组1)，实现CD55基因表达的检测，且两者检测结果没有显著差异。
实施例7间隔臂序列碱基数目的选择
1、试剂盒制备的设计(间隔臂序列碱基数目的选择)
为了考察间隔臂长度对试剂盒检测效果的影响，设计五组实验组，记为实验组1-5，捕获探针和扩增探针的间隔臂序列组成依次为3、5、8、10和15个T，对比其检测效果，具体设计参见表18，试剂盒其它探针序列和组分与实施例1完全一致。
表18间隔臂序列组成的选择
2、样本检测
本实施例选用市场上销售的细胞株NCl-H1975和NK-92进行实验。分别各取约3000个NCl-H1975和NK-92细胞(通过细胞计数器确定)，混合均匀后将样本各均分为15份，依次编号1～15和16～30。按实施例2所述检测过程和方法对样本1～30进行检测，每个实验组每种细胞株各检3份，读取每个样本中有DAPI蓝色荧光信号的50个细胞，统计其表达绿色/红色荧光的细胞数量，同时表达两种荧光的细胞分别在绿色阳性、红色阳性细胞数量中列出，其中，样本中的细胞数通过荧光显微镜自动扫描来选取。具体结果如下：
表19试剂盒选用不同间隔臂的检测结果比较
从上述检测结果可知，当间隔臂组成为5～10个T时(本实施例实验组2-4)，试剂盒检测效果最好，能将样本中细胞完全检出。当间隔臂组成小于5个T时(本实施例实验组1)，由于间隔臂序列过短而不能使捕获探针P2序列与目标mRNA有效间隔开来，导致空间位阻过大，降低了杂交反应效率以及荧光信号放大效果，使检测效果不稳定，大量阳性细胞不能有效被检出；当间隔臂组成大于10个T时(本实施例实验组5)，造成了过大空间位阻，导致当目标mRNA和扩增探针结合到捕获探针两侧时，形成的张力不足以打开茎环结构，从而无法使目标mRNA带上荧光信号，导致检测失败。因此，当捕获探针的间隔臂序列为5～10个T时，试剂盒检测效果达到最好，小于5个T或大于10个T均会大大降低试剂盒检测性能，甚至导致无法检测。
实施例8标记探针的荧光基团对试剂盒检测效果的影响
1、试剂盒制备的设计(标记探针的荧光基团设计)
为了评估带有不同结构荧光基团的标记探针组成的试剂盒的检测效果，设计实验组1-2，其中实验组1选用本发明试剂盒中的树状荧光基团修饰的标记探针，实验组2选用常规荧光基团修饰的标记探针，两个实验组除了荧光基团结构不同之外，相应荧光染料及其它组分均相同。具体设计如表20所示。
表20标记探针的荧光基团的选择
| 实验组 | 荧光基团结构 | 荧光染料 |
| 实验组1 | 树状荧光基团 | CD55：Alexa Fluor 488；ACTB：Cy3 |
| 实验组2 | 常规荧光基团 | CD55：Alexa Fluor 488；ACTB：Cy3 |
2、样本检测
本实施例选用市场上销售的细胞株NCl-H1975和NK-92进行实验。分别各取约2000个NCl-H1975和NK-92细胞(通过细胞计数器确定)，混合均匀后将样本各均分为10份，依次编号1～10和11～20。按实施例2所述检测过程和方法对样本1～20进行检测，每个实验组每种细胞株各检5份，读取每个样本中有DAPI蓝色荧光信号的50个细胞，统计其表达绿色/红色荧光的细胞数量以及平均荧光点数，其中，样本中的细胞数通过荧光显微镜自动扫描来选取。具体结果如下：
表21不同结构荧光基团修饰的标记探针的检测结果比较
从上述检测结果可知，当使用本发明设计的树状荧光基团修饰的标记探针(本实施例实验组1)时，所有阳性细胞都能被检出，而当使用常规荧光基团修饰的标记探针(本实施例实验组2)时，存在个别阳性细胞未能被检出的现象；与常规荧光基团修饰的标记探针(本实施例实验组2)相比，本发明设计的树状荧光基团修饰的标记探针(本实施例实验组1)检测到的荧光信号点数更多，信号更强更稳定，检测效果更佳；说明本发明设计的树状荧光基团修饰的标记探针具有更高的灵敏度、稳定性和准确率。
实施例9单个核细胞分离管的运用
1、试剂盒制备的设计(单个核细胞分离管的运用)
本发明的CD55基因表达检测试剂盒还包括样本前处理组分单个核细胞分离管，其包括管体和管塞，管体内部从管底部往上，依次包括Ficoll-hyhaque分层液层、分离胶层和抗凝剂层。在使用本试剂盒进行检测时，单个核细胞分离管用于分离提取生物样本中的单个核细胞层。为了考察单个核细胞分离管的分离提取效果及其对后续CD55基因表达检测的影响，设计两组实验组，记为实验组1-2，其中实验组1使用本发明的单个核细胞分离管进行单个核细胞层分离提取，实验组2使用常规的Ficoll-hyhaque密度梯度离心法进行单个核细胞层分离提取；两组其它试剂盒组份相同。具体设计如表22所示。
表22单个核细胞层分离方法及试剂
| 实验组 | 方法 | 试剂 |
| 实验组1 | 单个核细胞分离管 | 单个核细胞分离管 |
| 实验组2 | 常规的Ficoll-hyhaque密度梯度离心法 | 抗凝真空采血管、Ficoll-hyhaque分层液 |
2、样本检测
本实施例选用市场上销售的细胞株NCl-H1975和NK-92进行实验。分别各取约50个NCl-H1975和NK-92细胞(通过细胞计数器确定)各10份，每份加入等量健康者血液样本混合均匀作为模拟临床样本，依次编号1～10和11～20。实验组1按实施例2所述检测过程和方法对样本1～5和和11～15进行检测，实验组2则按照常规的Ficoll-hyhaque密度梯度离心法进行单个核细胞层的分离提取后再按照实施例2所述检测过程和方法对样本6～10和16～20进行后续操作，读取每个样本中有DAPI蓝色荧光信号的细胞，统计其表达绿色/红色荧光的细胞数量，同时表达两种荧光的细胞分别在绿色阳性、红色阳性细胞数量中列出，其中，样本中的细胞数通过荧光显微镜自动扫描来选取。
实验组2所采用的常规Ficoll-hyhaque密度梯度离心法分离提取单个核细胞层的操作过程包括以下步骤：
(1)取混合有50个NCl-H1975或NK-92细胞的模拟临床样本加至抗凝真空采血管中，轻轻颠倒混匀8-10次，使抗凝剂与血液完全混合均匀，；
(2)使用移液器将抗凝血转移到锥形管中，并向锥形管中加入一定体积的缓冲液稀释；
(3)取装有Ficoll-hyhaque分层液的锥形管，使用移液器把稀释血液小心加入Ficoll-hyhaque分层液的上方，注意不要使Ficoll-hyhaque分层液和稀释血液混合；
(4)离心使得抗凝血分层，从下到上每层的成分依次是红细胞、粒细胞、Ficoll-hyhaque分层液、单个核细胞层和血浆，从Ficoll-hyhaque层和血浆层中间小心吸取单个核细胞层，收集得到单个核细胞层。
具体实验结果如下：
表23单个核细胞分离管与常规Ficoll-hyhaque密度梯度离心法的检测结果比较
从上述检测结果可知，与常规的Ficoll-hyhaque密度梯度离心法(本实施例实验组2)相比，本发明的单个核细胞分离管(本实施例实验组1)检测到的细胞数更多，且重复性更好，说明本发明的单个核细胞分离管的回收率明显更好，提高了检测的重复性，检测结果更准确。此外，比较本发明的单个核细胞分离管与常规的Ficoll-hyhaque密度梯度离心法的操作过程可知，本发明的单个核细胞分离管的使用简化了外周血单个核细胞的提取步骤、减少了实验用具、降低了提取难度。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对以上实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 益善生物技术股份有限公司
<120> 一种CD55基因表达检测试剂盒
<130> 2019-12-10
<160> 30
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
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Claims (10)
1.一种CD55基因表达检测试剂盒，其特征在于，包括针对CD55基因mRNA的茎环状捕获探针以及信号放大系统；所述信号放大系统包括有扩增探针和末端修饰有树状荧光基团的标记探针；其中，
(1)茎环状捕获探针：所述捕获探针为茎环状，用于连接CD55基因mRNA与扩增探针，每条捕获探针从5’端到3’端的碱基组成依次为：茎部结构序列，能与CD55基因mRNA结合的特异性P1序列、间隔臂序列、P2序列；所述茎部结构序列可与P2序列3’端的碱基互补形成茎环结构；所述P2序列为不存在发夹结构，探针内部和探针间不形成二聚体、不存在错配，与P1、P4和CD55基因mRNA之间均不存在特异性结合的序列；所述针对CD55基因mRNA的茎环状捕获探针中，特异性P1序列选自SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.10中的5条或5条以上，茎部结构序列为SEQ ID NO.21，P2序列为SEQ ID NO.23；
(2)扩增探针：所述扩增探针连接捕获探针与标记探针，每条扩增探针从5’端到3’端的碱基组成依次为：能与茎环状捕获探针的P2序列互补配对的P3序列、间隔臂序列、P4序列；所述P4序列为不存在发夹结构，探针内部和探针间不形成二聚体、不存在错配，与P1、P2、P3和CD55基因mRNA之间均不存在特异性结合的序列；所述针对CD55基因mRNA的扩增探针中，P3序列为SEQ ID NO.25，P4序列为SEQ ID NO.27；
(3)标记探针：所述标记探针连接扩增探针与树状荧光基团，每条标记探针具有与扩增探针P4序列互补配对的P5序列，且末端修饰有树状荧光基团。
2.根据权利要求1所述的CD55基因表达检测试剂盒，其特征在于，所述针对CD55基因mRNA的标记探针中，P5序列为SEQ ID NO.29。
3.根据权利要求1-2任一项所述的CD55基因表达检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括有针对内参基因mRNA的茎环状捕获探针以及信号放大系统；针对内参基因mRNA的茎环状捕获探针以及信号放大系统与针对CD55基因mRNA的茎环状捕获探针以及信号放大系统的结构相同，但标记探针的末端修饰的树状荧光基团互不相同。
4.根据权利要求3所述的CD55基因表达检测试剂盒，其特征在于，所述内参基因为ACTB基因。
5.根据权利要求4所述的CD55基因表达检测试剂盒，其特征在于，所述针对ACTB基因mRNA的茎环状捕获探针中，特异性P1序列选自SEQ ID NO.11～SEQ ID NO.20中的5条或5条以上，茎部结构序列为SEQ ID NO.22，P2序列为SEQ ID NO.24；针对ACTB基因mRNA的扩增探针中，P3序列为SEQ ID NO.26，P4序列为SEQ ID NO.28；针对ACTB基因mRNA的标记探针中，P5序列为SEQ ID NO.30。
6.根据权利要求1-5任一项所述的CD55基因表达检测试剂盒，其特征在于，所述间隔臂序列的长度为5～10个碱基；优选所述间隔臂序列为5～10个T。
7.根据权利要求1-6任一项所述的CD55基因表达检测试剂盒，其特征在于，所述树状荧光基团的荧光染料选自：FAM、TET、JOE、HEX、Cy3、TAMRA、ROX、Texas、Red、LC RED640、Cy5、LCRED705、Alexa Fluor 488和Alexa Fluor 750。
8.根据权利要求1-7任一项所述的CD55基因表达检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括有样本前处理组分，用于待检测细胞的富集；所述样本前处理组分包括单个核细胞分离管和含滤膜的过滤器；其中，
所述单个核细胞分离管包括管体和管塞，用于单个核细胞层的分离提取；所述管体内部从管底往上，依次为Ficoll-hyhaque分层液层、分离胶层和抗凝剂层；
所述含滤膜的过滤器用于待检测细胞的富集，所述滤膜选自聚碳酸酯滤膜、纤维滤膜、尼龙滤膜或塑料薄膜，且所述滤膜孔径为5～8μm。
9.一种非诊断目的的CD55基因表达检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)得到待检测生物样本；
(2)利用权利要求8所述的前处理组分富集生物样本中的待检测细胞：a)单个核细胞分离管处理生物样本，从而得到单个核细胞层；b)单个核细胞层使用含滤膜的过滤器进行过滤，将待检测细胞过滤至滤膜上，从而实现待检测细胞的富集；
(3)对待检测细胞进行前处理，使mRNA暴露；
(4)利用权利要求1-7任一项所述试剂盒检测CD55基因mRNA是否存在：a)茎环状捕获探针与CD55基因mRNA序列和扩增探针杂交，获得CD55基因mRNA-捕获探针-扩增探针复合体；b)标记探针与步骤a)所述复合体中扩增探针的P4序列杂交，实现信号的级联放大；c)通过荧光检测仪检测。
10.根据权利要求9所述的非诊断目的的CD55基因表达检测方法，其特征在于，所述步骤(4)中捕获探针、扩增探针和标记探针的摩尔比为3：0.66：0.33。
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