CN105954246B - 一种在人的生物液体样本中检测游离的稀有肿瘤细胞的方法和试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种在人的生物液体样本中检测游离的稀有肿瘤细胞的方法和试剂盒。具体地，本发明提供了一种通过检测来自于肿瘤患者的生物液体样本中有核细胞的葡萄糖摄取能力及白细胞标志物CD45的表达从而鉴定其中具有活性的肿瘤细胞的方法。本发明操作简单快速，且无需对于样本中肿瘤细胞进行预先富集，一方面极少损失肿瘤细胞，另一方面基于代谢功能的鉴定方法对于液体样本中游离肿瘤细胞的鉴定较常用的免疫荧光染色的方法更为准确。

Description

一种在人的生物液体样本中检测游离的稀有肿瘤细胞的方法 和试剂盒

技术领域

本发明涉及生物与医学检测领域。更具体地，本发明涉及人外周血或胸水样本中游离的稀有肿瘤细胞的检测方法和试剂盒。本发明提供了一种快速从人生物液体样本(如血液、胸水、心包积液，优选为肿瘤患者外周血或胸水样本)中检测具有活性的稀有肿瘤细胞方法和试剂盒。

背景技术

人外周血中的循环肿瘤细胞(Circulating Tumor Cell,CTC)是指从肿瘤病灶脱落并进入外周血循环的肿瘤细胞，它代表了肿瘤病灶的分子特征，并在一定条件下可发展为肿瘤转移性病灶，因此对血液中的CTC进行计数、分子检测以及体外培养越来越引起人们的重视。但是，CTC在血液中极其稀少，一毫升血液中含有50亿个红细胞，近一千万个白细胞，可却只有几个至几十个CTC，因此给检测带来了巨大的技术挑战。

目前对CTC检测的基本策略是先富集再鉴定，以目前唯一获得美国FDA批准用于检测转移性乳腺癌、前列腺癌及结直肠癌患者外周血中CTC的CellSearch系统为例，它首先运用标记有针对EpCAM(上皮细胞标志物)抗体的磁性颗粒对癌症患者7.5毫升血液中CTC进行富集，然后通过免疫荧光染色的方法鉴定富集后的细胞中哪些是CTC，哪些是非特异性混入的白细胞，其标准为将DAPI(细胞核染料)阳性/CK(细胞角蛋白，上皮细胞标志物)阳性/CD45(白细胞标志物)阴性且符合一定形态学标准的细胞鉴定为CTC。其他针对CTC的检测方法基本沿用了类似的策略，即第一步对血液中的CTC先进行富集，其具体富集的原理与方法可能各不相同，有通过针对CTC表面抗原(如EpCAM)的特异性抗体进行正选富集的，其中抗体可负载于磁球或微流控芯片上捕获样本中的CTC，也有根据细胞大小进行正选富集，将一般尺寸较大的CTC从样本中分离出来，还有通过去除白细胞负选的方法进行富集的。为了获得较高的CTC捕获率以及纯度，这些方法往往繁琐复杂，而且富集之后与CTC一同被分选出来的往往还有几千至几十万个白细胞，因此需要进一步的鉴定才能准确的检测到CTC。所以，富集之后第二步一般通过免疫染色来区分CTC与白细胞，所使用的标志物主要包括上皮标志物细胞角蛋白CK、白细胞标志物CD45与细胞核染料DAPI，将表达上皮标志物CK、不表达白细胞标志物CD45且有核的细胞鉴定为CTC并计数。

但是，以CellSearch系统为代表的这一CTC检测方法存在若干缺陷。第一，CellSearch系统的富集方法灵敏度不高，检出率较低，在富集过程中损失了相当部分的CTC。事实上对于CTC的富集不仅操作繁琐复杂，而且在富集过程中会不可避免的损失数量不等的CTC。第二，基于EpCAM+/DAPI+/CK+/CD45-的肿瘤细胞鉴定方法严格来说并不准确，它并没有使用任何肿瘤特异性标志物，实际上鉴定的是上皮来源细胞而非肿瘤细胞。最新的研究表明在良性疾病患者，甚至健康人血液中也能检测到上皮来源的细胞，因此这种鉴定方法存在假阳性的可能。同时，研究发现肿瘤细胞在转移过程中发生的上皮间质转化(EMT)将导致CTC不表达或低表达上皮标志物，因此有可能被漏检。第三，由于上述的基于免疫荧光染色的CTC鉴定方法中使用了固定与细胞核染色，因此被免疫荧光染色后的CTC难以被进一步用于测序分析与体外培养，而测序是目前最重要针对肿瘤的分子检测手段。针对CTC的单细胞测序通过对驱动基因的测序能够进一步明确其肿瘤细胞属性以及发现可供靶向药物治疗的分子靶点，而固定与细胞核染色将干扰单细胞的基因组扩增，因而影响后续的测序。因此，应尽量保持细胞的活性以及鉴定CTC的步骤不包括固定等影响单细胞基因组扩增的步骤。第四，研究发现CTC具有很大的功能异质性，相当一部分CTC处于凋亡或坏死状态，只有一部分CTC具能够实现转移，而临床上需要真正关注的正是那一部分具有高度活力与转移潜能的CTC而不是全部的CTC。包括CellSearch在内的技术都无法从功能上鉴定CTC的恶性程度以及转移潜能。

目前几乎所有的CTC检测方法都具有与CellSearch系统类似的缺陷，富集步骤繁琐复杂且损失CTC，而基于免疫荧光染色的CTC鉴定方法无法准确鉴定肿瘤细胞，且限制了后续基因测序分析与体外培养的进行。因此，目前缺乏快速、准确的鉴定血液或其他体液如胸水、心包积液样本中游离的稀有肿瘤细胞的方法，且该方法不影响后续对CTC的测序与体外培养。

因此，本领域迫切需要开发能够在肿瘤患者外周血或胸水样本中快速、准确鉴定具有高度活性与恶性程度的肿瘤细胞的技术，且这一技术不影响后续对所鉴定的肿瘤细胞进行测序或体外培养。

发明内容

本发明的目的就是提供一种快速、准确地检测肿瘤患者血液或胸水样本中游离的肿瘤细胞的方法和装置。

根据以上的需要，本发明的创新点主要包括以下几项：第一、不使用富集步骤从而大大减少CTC的损失，这里的富集是指针对有核细胞的富集，对于血小板、无核的红细胞这些不会与CTC发生混淆的血液成分仍可去除；第二、通过简单、有效的方法快速在所有的有核细胞中鉴定肿瘤细胞，而正因为鉴定方法的简单快速才能确保可对大量细胞进行检测，使得不富集直接检测成为可能；第三、肿瘤细胞的检测方法不影响后续的测序与体外培养；第四、所有细胞均可寻址，因此能够方便准确的取出单个的肿瘤细胞进行测序。

而本发明所采用的肿瘤细胞鉴定方法，即高葡萄糖摄取且细胞表面不表达白细胞共同抗原CD45是肿瘤细胞所具有的普遍特征，不依赖于肿瘤细胞的尺寸、表面抗原表达情况等，因此是一种简单可靠的肿瘤细胞鉴定方法。因其简单快速，所以配合高速荧光成像系统能够对大量细胞进行快速检测，从而使得不对样本中的有核细胞进行富集成为可能。同时对葡萄糖摄取与CD45的检测不影响细胞活性，能够用于后续的单细胞基因组测序及体外培养等用途。细胞采用可寻址的方式排列能够方便的找到肿瘤细胞并取出。

本发明的第一方面，提供了一种非诊断性地检测人生物液体样本中游离的稀有肿瘤细胞的方法，所述方法包括步骤：

(a)提供一外周血或胸水生物样本，所述的生物样本为通过选择性裂解除去红细胞的样本；

(b)将步骤(a)中的样本与针对白细胞表面抗原CD45的荧光修饰抗体共孵育，从而使样本中的白细胞表面标记针对白细胞表面抗原CD45的荧光修饰抗体；

(c)将步骤(b)中获得的标记有白细胞表面抗原CD45的荧光修饰抗体的细胞样本分散于所述的微孔阵列芯片中，所述的芯片包括多个用于容纳细胞，且可以被寻址的微孔，且所述的微孔数与样本中的细胞数的比例为1:0.2-5，优选为1:1-3；

(d)用带有荧光标记的葡萄糖类似物与所述的分布于微孔阵列中的细胞进行共培养；

(e)检测各个微孔中细胞的荧光标记的葡萄糖类似物摄取量以及CD45表达的荧光信号；和

(f)将高摄取葡萄糖且不表达CD45的细胞鉴定为具有活性的肿瘤细胞，并记录该细胞所在微孔的坐标位置；

且所述的步骤(a)中，所述的外周血或胸水生物样本为未经过有核细胞富集的样本。

在另一优选例中，所述的人生物液体样本选自下组：血液、胸水、心包积液，更优选为肿瘤患者的外周血或胸水样本。在另一优选例中，所述的肿瘤细胞为循环肿瘤细胞(CTC，Circulating Tumor Cell)，优选地为选自下组的肿瘤细胞：肝癌、肺癌、胃癌、结肠癌、乳腺癌、卵巢癌。

在另一优选例中，在步骤(a)中，所述的外周血样品是未经去除白细胞处理的外周血样品。

在另一优选例中，在步骤(a)中，所述的样本是通过以下步骤预处理过的样本：用负载CD45抗体的免疫磁球对于白细胞进行负选，从而得到除去大部分白细胞的样本。

在另一优选例中，步骤(c)中还包括：加入牛血清白蛋白对微孔芯片进行封闭，消除对荧光标记的葡萄糖类似物的非特异性吸附。

在另一优选例中，所述的饥饿处理是将所述微孔中的细胞置于低葡萄糖浓度或无葡萄糖的培养条件下，培养一段时间。

在另一优选例中，该饥饿处理的培养时间为1-30分钟，较佳地为5-20分钟，更佳地为10分钟。

在另一优选例中，在步骤(d)中，所述荧光标记的葡萄糖类似物与肿瘤细胞共培养的时间为5-30分钟，更佳地为10-20分钟。

在另一优选例中，在步骤(e)中，先清洗去多余的所述荧光标记的葡萄糖类似物，然后检测各个微孔中细胞的荧光标记葡萄糖类似物的摄取量。

在另一优选例中，所述的带有荧光标记的葡萄糖类似物为2-NBDG。

在另一优选例中，在步骤(e)中，还包括：与参考值进行比较，从而确定所述微孔中细胞的葡萄糖摄取水平。

在另一优选例中，在步骤(f)之后还包括：通过手动或自动化的显微操作设备将确认为有活性的肿瘤细胞根据记录的位置将其取出，从而用于进一步基因测序分析或体外培养。

在另一优选例中，所述的芯片上微孔的数目为5万至50万个，优选为15-25万个。

在另一优选例中，所述的微孔的直径为15-30微米，优选为18-25微米。

在另一优选例中，所述的方法还包括：通过鉴定得到的具有活性肿瘤细胞数目，计算样本中所包含的具有活性的肿瘤细胞的数目。

在另一优选例中，在步骤(a)和(b)之间，还包括步骤：通过标记CD45抗体的免疫磁球除去白细胞以减少细胞数目。

在另一优选例中，所述方法还包括：在步骤(d)中，同时加入死细胞染料以标记已经坏死的细胞；优选地，所述的死细胞染料为EthD-1。

在另一优选例中，在步骤(f)之后，还包括步骤：通过手动或自动化的显微操作设备根据确认为有活性的肿瘤细胞的位置将其取出，并用于进一步分析或培养。

在另一优选例中，所述的荧光标记的葡萄糖类似物为2-NBDG。

在另一优选例中，所述的针对白细胞表面抗原CD45的荧光修饰抗体为Allophycocyanin，即APC标记的CD45抗体。在另一优选例中，白细胞标志物CD45抗体所带荧光与荧光标记的葡萄糖类似物2-NBDG以及死细胞染料EthD-1所带荧光互不干扰。

在另一优选例中，所述的方法还包括：将2-NBDG强阳性CD45阴性且EthD-1阴性的细胞鉴定为疑似肿瘤细胞。

本发明的第二方面，提供了一种用于检测人生物液体样本中游离的稀有肿瘤细胞的试剂盒，所述装置包括：

(a)微孔阵列芯片，所述的芯片包括多个用于容纳细胞且可以被寻址的微孔；

(b)白细胞表面抗原CD45的荧光修饰抗体，所述的白细胞表面抗原CD45的荧光修饰抗体用于标记样本中的白细胞；

(c)带有可检测标记物的葡萄糖类似物(优选为荧光标记的葡萄糖类似物)，所述带有可检测标记物的葡萄糖类似物用于检测样本中细胞的葡萄糖摄取能力；

和任选的(d)死细胞染料，用于标记样本中的坏死细胞。

在另一优选例中，所述的微孔的直径为15-30微米，优选为18-25微米。

在另一优选例中，所述的芯片上微孔的数目为5万至50万个，优选为15-25万个。

在另一优选例中，所述带有可检测标记物的葡萄糖类似物为2-NBDG；荧光修饰的CD45抗体为APC标记CD45抗体，和/或所述的死细胞染料为EthD-1。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了本发明一个实例中，微孔阵列芯片某一部分的明场显微镜视野图。微孔阵列芯片的每个微孔直径20微米，深30微米，每500个微孔形成一个小区域，并用数字标记。一个典型的微孔阵列芯片由400个这样的数字标记的小区域构成，共有20万个微孔。

图2显示了将包含肺癌细胞系H1650细胞的悬液加在微孔阵列芯片上后细胞在微孔中分布的明场显微镜视野图，以及细胞摄取2-NBDG后的荧光显微镜视野图。由图中可见，当细胞浓度适当的情况下，大部分微孔中都有细胞且每个微孔只有至多一个肿瘤细胞，同时细胞位于微孔的中心处。由于每个微孔的坐标固定，因此微孔中的细胞均可寻址，可通过手动或自动化的显微操作设备取出微孔中的细胞。荧光标记葡萄糖类似物2-NBDG的激发与发射波长为465纳米与540纳米，被摄取进入细胞后所发出的荧光为绿色，可使用针对FITC的滤光片来进行观察。

图3显示了本发明的一个实例中，肺癌患者的胸水样本经红细胞裂解后将剩余细胞离心重悬后加入微孔阵列芯片，细胞基本均在孔内，但由于部分白细胞尺寸较小，部分微孔中有多于一个的细胞。

图4显示了采用高速荧光成像设备扫描微孔阵列芯片的荧光视野图，显示了微孔阵列芯片的一部分，其中微孔中的细胞经过DAPI对细胞核的染色。

图5显示了本发明的一个实例中，一肺癌患者的胸水样本经红细胞裂解后将剩余细胞经过CD45-Allophycocyanin(APC)抗体、2-NBDG、EthD-1共同标记后的荧光显微镜视野图，其中左边为CD45-APC(红色)与2-NBDG(绿色)的重合图，右边为2-NBDG(绿色)与EthD-1(黄色)的重合图，被标记为红色的细胞为CD45阳性细胞，即白细胞，被标记为绿色的细胞为摄取2-NBDG的细胞，被标记为黄色的细胞为已经坏死的细胞。本图中清晰的显示了一个CD45阴性(不表达白细胞标志物)、2-NBDG强阳性(高摄取葡萄糖)且EthD-1阴性(活细胞)，同时尺寸明显大于周围白细胞的细胞，因此该细胞有较大可能为游离于胸水中的肿瘤细胞。

图6显示了一个包含500个微孔的小区域中所有细胞的2-NBDG摄取量的统计。其中下方的图为所有EthD-1阴性，即坏死细胞摄取2-NBDG的荧光信号分布，中间的图为所有CD45阳性且EthD-1阴性，即活的白细胞摄取2-NBDG的荧光信号分布。而上方的图为所有CD45阴性且EthD-1阴性的细胞摄取2-NBDG的荧光信号分布，其中存在两个2-NBDG强阳性，即葡萄糖高摄取的细胞，其中一个为图5所示细胞。

图7显示了对图6中所示的疑似肿瘤细胞通过显微操作设备取出该单个细胞，经过细胞裂解、DNA提取与单细胞基因组扩增、针对癌基因KRAS第二外显子的PCR以及测序，证实这两个细胞在KRAS的第二外显子中均存在G12C突变，图中*号位置为突变位置，由G变成了T，这一突变与患者组织中的突变一致，从而能够确认这两个细胞均为肿瘤细胞。

图8显示了本发明的一个实例中，一肺癌患者的全血样本经红细胞裂解后将剩余细胞经过CD45-APC、2-NBDG、EthD-1共同标记后的荧光显微镜视野图，其中左边为CD45-APC(红色)与2-NBDG(绿色)的重合图，右边为2-NBDG(绿色)与EthD-1(黄色)的重合图，被标记为红色的细胞为CD45阳性细胞，即白细胞，被标记为绿色的细胞为摄取2-NBDG的细胞，被标记为黄色的细胞为已经坏死的细胞。本图中清晰的显示了一个CD45阴性(不表达白细胞标志物)、2-NBDG强阳性(高摄取葡萄糖)且EthD-1阴性(活细胞)的细胞，该细胞有较大可能为循环肿瘤细胞。

图9显示了图7样本的部分统计结果，其中上方的图为所有CD45阳性细胞摄取2-NBDG的荧光信号分布，中间的图为所有CD45阴性且EthD-1阴性细胞摄取2-NBDG的荧光信号分布，而下方的图为所有EthD-1阴性，即坏死细胞摄取2-NBDG的荧光信号分布。其中有四个细胞为CD45阴性、EthD-1阴性且2-NBDG强阳性，取出后测序发现其基因突变特征EGFRL858R与该患者肿瘤组织的突变特征一致，确定为肿瘤细胞。

图10显示了两种代表性的人外周血中CTC捕获技术的捕获效率，其中一种是表面修饰抗体的交错式鱼骨型芯片，另一种是基于滤膜ISET技术的法国Rarecells系统。捕获效率是通过在一毫升健康人的血液中准确加入事先经过荧光标记的50个不同细胞系的肿瘤细胞富集分选后计数得到的。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，首次发明了一种能够有效、快速地检测肿瘤患者血液或胸水样本中极稀有的肿瘤细胞的方法和装置，即通过细胞的葡萄糖摄取能力以及白细胞标志物CD45的表达来鉴定血液或胸水样本中有活性的肿瘤细胞，且所述的方法不需要对于肿瘤细胞进行富集，因此可以取得极高的准确度。在此基础上，发明人完成了本发明。

术语

如本文所用，术语“2-NBDG”指(2-(N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)amino)-2-deoxyglucose)，即(2-(N-(7-硝基苯并-2-噁-1,3-二唑-4-基)氨基)-2-脱氧葡萄糖)，它是一种带有荧光标记的葡萄糖类似物。

如本文所用，术语“EthD-1"指Ethidium homodimer-1，即溴乙非啶二聚体-1，它是一种标记坏死细胞的染料。

循环肿瘤细胞CTC

循环肿瘤细胞(CTC，Circulating Tumor Cell)是指因自发或诊疗操作从实体肿瘤病灶(原发灶、转移灶)脱落并进入外周血循环的肿瘤细胞，大部分CTC在进入外周血后发生凋亡或被吞噬，少数能够逃逸并锚着发展成为转移灶，增加恶性肿瘤患者死亡风险。

在本发明中，适用于本发明方法的CTC细胞没有特别限制，可以是源自各种不同实体瘤的肿瘤细胞。代表性的例子包括(但并不限于)：肝癌、肺癌、胃癌、结肠癌、乳腺癌、卵巢癌等。

肿瘤细胞的能量代谢途径主要是糖酵解，通过大量摄取葡萄糖快速产生ATP以及生物合成所需的物质，确保肿瘤细胞能够快速分裂与增殖。

检测方法和检测机理

本发明提供了一种检测血液或胸水样本中稀有肿瘤细胞的方法。典型地，它包含如下步骤：

a.将外周血或胸水样本通过选择性裂解除去红细胞；

b.将上一步骤获得的剩余细胞与荧光标记的CD45抗体共孵育已使白细胞表面标记CD45荧光抗体；

c.对上一步骤处理后的细胞置于微孔阵列芯片中，其中每个微孔均可寻址且容纳至多一个细胞，因此该芯片上的每个细胞都具有唯一的坐标位置；

d.用荧光标记的葡萄糖类似物处理微孔阵列中的细胞；

e.通过高速荧光成像系统检测微孔中所有细胞的葡萄糖摄取量以及CD45表达的荧光信号；和

f.将高摄取葡萄糖且不表达CD45的细胞鉴定为有活性的肿瘤细胞并记录该细胞的坐标位置。

为了更好地理解本发明，本发明人提供以下机理供参考。然而，应理解，本发明的权利要求所限定的保护范围并不受该机理的限定。

研究表明肿瘤细胞代谢的特点是用高水平的有氧糖酵解替代正常组织细胞的氧化磷酸化。由于糖酵解的效率较低，因此肿瘤细胞需要摄取大量葡萄糖。在本发明中，根据肿瘤细胞摄取葡萄糖的能力大大高于正常细胞的生物学原理来鉴定血液或胸水样本中的稀有肿瘤细胞。为了提高鉴定的特异性，本发明中进一步使用了白细胞表面标志物CD45与坏死细胞染料EthD-1来排除白细胞与已经坏死的细胞。由于基于葡萄糖摄取的检测非常简单，在高速荧光成像设备的帮助下可以在短时间内鉴定非常大数目的细胞，因此本发明不需要像已经报道的方法那样先对血液或胸水样本中的稀有肿瘤细胞进行复杂的富集。对于胸水样本，由于其总的细胞数目较少，可以无需富集肿瘤细胞直接进行检测。而对于血液样本，可以在裂解除去红细胞后通过简单的标记CD45抗体的磁球负选以减少细胞的数目，然后再进行检测。如果血液样本较少或CTC数目较多，可以无需负选直接检测。

本发明所描述的方法与临床上已经使用的通过一种放射性葡萄糖类似物(¹⁸F-FDG，2-Fluorine-18-Fluoro-2-deeoxy-D-glucose，2-氟-18-氟-2-脱氧-D-葡萄糖)探测组织对葡萄糖摄取的肿瘤影像学检测方法有类似之处。¹⁸F-FDG通过葡萄糖转运蛋白输运进入细胞，在己糖激酶(hexokinase)作用下磷酸化，生成6-PO₄-¹⁸F-FDG并积累在细胞中可被正电子发射成像(PET，Positron Emission computed Tomography)所检测。因此，基于放射性葡萄糖类似物¹⁸F-FDG的PET成像可用于显示肿瘤的部位、形态、大小、数量及肿瘤内的放射性分布，临床上主要用于恶性肿瘤的诊断及良、恶性的鉴别诊断、临床分期、评价疗效及监测复发等。绝大多数良性病灶不摄取或轻度摄取¹⁸F-FDG。临床上使用SUV(standard uptakevalue，标准摄取值)这一半定量治疗来衡量病灶摄取¹⁸F-FDG的量并鉴定组织的良恶性，一般SUV>2.5考虑为恶性肿瘤，SUV<2.0可以考虑为良性病变。

就肿瘤细胞而言，其具有各种不同的表型、基因特征和代谢行为。在本发明中，所检测的是血液或胸水中游离的肿瘤细胞的葡萄糖摄取能力。本发明人研究表明，这些游离肿瘤细胞的葡萄糖摄取能力虽然是其代谢活动的一种，但是却与其活性与恶性程度密切相关，相比其他分子特征，可以更简单、合理地反映肿瘤细胞的活力和恶性程度。

在本发明方法中，为了确保肿瘤细胞的活性以检测到较准确的葡萄糖摄取行为，需取新鲜的血液或胸水样本进行检测，且在可能的情况下只做红细胞裂解，不进行进一步的富集，然后直接进行葡萄糖摄取与细胞表面CD45表达量的检测。如果由于细胞数目过多必须进行富集，可以使用标记CD45抗体的磁球进行负选，一般可以除去90～99％的白细胞，从而将细胞数目减少10倍至100倍。通过上述的白细胞负选方法去除白细胞后，肿瘤细胞的回收率通常为97-99％，但在本申请中，优选不进行富集。

检测试剂盒

本发明还提供了一种用于检测血液或胸水样本中检测稀有肿瘤细胞的试剂盒。

典型地，本发明试剂盒包括：

(a)微孔阵列芯片，其中每个用于容纳细胞的微孔均可寻址；

(b)荧光标记的CD45抗体，用于标记样本中的白细胞；

(c)荧光标记的葡萄糖类似物2-NBDG，用于检测样本中细胞的葡萄糖摄取能力；

(d)死细胞染料EthD-1，用于标记样本中的坏死细胞。

其中，优选的微孔阵列芯片的微孔尺寸为15-30微米，优选为18-25微米，从而使得一个微孔只能容纳一个肿瘤细胞。细胞的数目(有核细胞，包括白细胞与肿瘤细胞)一般是微孔数目的1-3倍，例如，常用的微孔阵列芯片具有5万至50万孔，优选为15-25万孔。

本发明的主要优点包括：

(a)本发明方法可以低成本、快速、准确地在大量细胞中鉴定有活性肿瘤细胞的方法。由于鉴定方法简单且可与高速荧光成像系统相结合，因而能够快速筛查大量细胞，使得在复杂样本中不富集直接鉴定稀有肿瘤细胞成为可能。传统的稀有肿瘤细胞富集方法操作复杂且损失较多肿瘤细胞，而本发明方法中摒弃了传统的对血液或胸水中稀有肿瘤细胞先富集后检测的方法，通过大量可寻址的微孔容纳所有细胞，并通过快速简单的荧光标记方法和高速荧光成像从而从非常大数目的细胞中快速鉴定稀有肿瘤细胞，整个操作简单快速，且由于不富集因此极少损失肿瘤细胞。此外，本发明方法直接鉴定具有高度活性与恶性的肿瘤细胞，为后续进一步的分子检测如测序提供了良好的基础。

(b)本发明通过检测肿瘤细胞的代谢活性，即葡萄糖摄取能力，从而快速有效的鉴定具有活性的肿瘤细胞，是一种基于功能的从血液或胸水中鉴定肿瘤细胞的方法，而鉴定得到的具有活性的肿瘤细胞对后续进一步的分子分析及体外培养非常有利。肿瘤细胞具有高葡萄糖摄取能力同时不表达CD45是肿瘤细胞所具有的普遍特征，不依赖于肿瘤细胞的尺寸、表面抗原表达情况等，因此是一种简单可靠的肿瘤细胞鉴定方法。本发明方法通过微孔阵列芯片使所有细胞处于可寻址的位置，而一旦被鉴定为肿瘤细胞，就可以根据该细胞的坐标位置通过手动或自动化的显微操作设备将其取出做进一步分析。

(c)本发明提供了一种血液或胸水样本中肿瘤细胞的功能表征手段。研究表明，血液或胸水中的游离肿瘤细胞是从肿瘤组织上脱落的，存在着较大的功能异质性，其中相当部分肿瘤细胞处于凋亡状态，很小一部分具有高度活性与转移潜能的肿瘤细胞最终能够形成转移灶。直接对游离肿瘤细胞进行功能表征有助于评估肿瘤细胞的转移潜能，同时，有活性的肿瘤细胞能够进行比较均匀的单细胞基因组扩增。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

材料

在实施例中，所有细胞系、细胞培养液、荧光标记葡萄糖类似物、荧光标记抗体、免疫磁珠、荧光染料等均为市售购得。

实施例1

肿瘤细胞的葡萄糖类似物摄取检测

提供一微孔阵列PDMS芯片，其结构如图1所示，其中每个微孔直径20微米，深30微米，每500个微孔形成一个小区域并用数字标记以实现每个微孔的可寻址。一个典型的微孔芯片由400个如图1所示的数字编码的小区域构成，共有20万个微孔。

将肺癌细胞H1650的细胞悬液加在微孔阵列芯片上，静置后用不含葡萄糖的细胞培养液RPMI-1640清洗，如图2所示大部分微孔中都有细胞且每个微孔只有至多一个细胞，同时细胞位于微孔的中心处。

使用不含葡萄糖的细胞培养液RPMI-1640孵育细胞10分钟，对微孔中的肿瘤细胞进行饥饿处理。然后，加入含2-NBDG(浓度为0.3mM)的细胞培养液RPMI-1640继续孵育细胞20分钟。孵育结束后，在冰上用4℃的PBS充分、反复清洗细胞，最后在显微镜下对芯片上的细胞荧光成像，如图2所示。荧光标记葡萄糖类似物2-NBDG的激发与发射波长为465纳米与540纳米，被摄取进入细胞后所发出的荧光为绿色，可使用针对FITC的滤光片来进行观察。

实施例2

肺癌患者胸水样本中肿瘤细胞的检测

本实施例中，方法包括以下步骤：

(1)将40毫升肺癌患者胸水用150目纱布过滤后，离心(500g，5分钟)分离出细胞，加5毫升红细胞裂解液(BD公司)避光裂解5分钟，再次离心(500g，5分钟)，弃去上清液后用Hank平衡盐溶液(HBSS)重悬并洗涤细胞，离心(500g，5分钟)，弃去上清液，加入2毫升HBSS重悬细胞；

(2)细胞计数后取500微升细胞悬液(约100万个细胞)，加入2微升APC标记的CD45抗体在翻转仪上翻转孵育1小时；

(3)离心，弃去上清液后用HBSS稀释细胞，并将细胞悬液滴加在2块微孔阵列芯片上(每块芯片包含20万个微孔)静置10分钟；

(4)吸去芯片表面溶液，每块芯片上加入100微升不含葡萄糖的DMEM细胞培养液，饥饿细胞10分钟，芯片的显微镜明场图片如图3所示，细胞基本均在微孔内，但由于部分白细胞尺寸较小，部分微孔内有多于一个的细胞；

(5)吸去芯片表面溶液，每块芯片上加入荧光标记的葡萄糖类似物2-NBDG(400μM)以及细胞坏死荧光染料EthD-1(4μM)，37度培养箱静置20min；

(6)孵育结束后，用冰PBS清洗芯片8遍，并用高速荧光成像设备成像。

图4显示了采用高速荧光成像设备扫描微孔阵列芯片的荧光视野图，显示了微孔阵列芯片的一部分，其中微孔中的细胞经过DAPI对细胞核的染色。高速荧光成像设备可以快速对芯片上的细胞进行2-NBDG(绿色)、CD45(红色)与EthD-1(黄色)三个荧光视野的成像，并通过程序筛选2-NBDG强阳性、CD45阴性、EthD-1阴性的细胞鉴定为疑似肿瘤细胞，同时记录其坐标位置。

结果如图5所示，左边为CD45-APC(红色)与2-NBDG(绿色)的重合图，右边为2-NBDG(绿色)与EthD-1(黄色)的重合图，被标记为红色的细胞为CD45阳性细胞，即白细胞，被标记为绿色的细胞为摄取2-NBDG的细胞，被标记为黄色的细胞为已经坏死的细胞。本图中清晰的显示了一个CD45阴性(不表达白细胞标志物)、2-NBDG强阳性(高摄取葡萄糖)且EthD-1阴性(活细胞)，同时尺寸明显大于周围白细胞的细胞，因此该细胞有较大可能为游离于胸水中的肿瘤细胞。

图6显示了一个包含500个微孔的小区域中所有细胞的2-NBDG摄取量的统计。其中下方的图为所有EthD-1阴性，即坏死细胞摄取2-NBDG的荧光信号分布，中间的图为所有CD45阳性且EthD-1阴性，即活的白细胞摄取2-NBDG的荧光信号分布。而上方的图为所有CD45阴性且EthD-1阴性的细胞摄取2-NBDG的荧光信号分布，其中存在两个2-NBDG强阳性，即葡萄糖高摄取的细胞，其中一个为图5所示细胞。

图7显示了对图6中所示的疑似肿瘤细胞通过显微操作设备取出单个细胞，经过细胞裂解、DNA提取与单细胞基因组扩增、针对癌基因KRAS第二外显子的PCR以及测序，证实这两个细胞在KRAS的第二外显子中均存在G12C突变，图中*号位置为突变位置，由G变成了T，这一突变与患者组织中的突变一致，从而能够确认这两个细胞均为肿瘤细胞，说明基于葡萄糖摄取与CD45表达的快速鉴定方法有效。这一样本中一共取出四个疑似肿瘤细胞(包括图6、图7所示的两个)，经测序均为肿瘤细胞，说明这一方法鉴定肿瘤细胞准确可靠。

此外，除了上述被显微操作设备取出进行单细胞测序的4个肿瘤细胞外，对于同一样本中其他6个在微孔中的肿瘤细胞经过固定、透膜、CK/DAPI免疫荧光染色(注:CD45已经染上)，结果显示6个肿瘤细胞只有3个为CK阳性，其余3个为CK阴性，说明基于CK/CD45/DAPI的免疫荧光染色方法鉴定CTC并不可靠。

实施例3

肺癌患者外周血样本中肿瘤细胞的葡萄糖类似物摄取检测

本实施例中，方法包括以下步骤：

(1)将1毫升肺癌患者外周血样本，首先低速离心(200g，5分钟)除去上层的富血小板血浆，剩余细胞用HBSS重悬，加入红细胞裂解液(BD公司)避光裂解5分钟，再次离心(500g，5分钟)，弃去上清液后用Hank平衡盐溶液(HBSS)重悬并洗涤细胞，离心(500g，5分钟)，弃去上清液，加入2毫升HBSS重悬细胞；

(2)细胞计数后按照细胞数目1：20加入CD45抗体标记的磁球(Stemcell公司)，翻转仪上翻转孵育，15分钟后加入4微升APC标记的CD45抗体继续翻转孵育45分钟；

(3)将细胞悬液转入离心管中，插入磁极(Stemcell公司)静置10分钟，表面结合了CD45抗体磁球的白细胞被吸附在离心管壁上，将管中液体移入1.5毫升的EP管中，其中包含了表面未结合CD45抗体磁球的细胞，这一步负选将能够除去90-99％的白细胞；

(4)离心，弃去上清液后用HBSS稀释细胞，并将细胞悬液滴加在1块微孔阵列芯片上(每块芯片包含20万个微孔)静置10分钟；

(5)吸去芯片表面溶液，每块芯片上加入100微升不含葡萄糖的DMEM细胞培养液，饥饿细胞10分钟，芯片的显微镜明场图片如图3所示，细胞基本均在微孔内，但由于部分白细胞尺寸较小，部分微孔内有多于一个的细胞；

(6)吸去芯片表面溶液，每块芯片上加入荧光标记的葡萄糖类似物2-NBDG(400μM)以及细胞坏死荧光染料EthD-1(4μM)，37度培养箱静置20min；

(7)孵育结束后，用冰PBS清洗芯片8遍，并用高速荧光成像设备成像。

图8显示了一个包含500个微孔的小区域，左边为CD45-APC(红色)与2-NBDG(绿色)的重合图，右边为2-NBDG(绿色)与EthD-1(黄色)的重合图，被标记为红色的细胞为CD45阳性细胞，即白细胞，被标记为绿色的细胞为摄取2-NBDG的细胞，被标记为黄色的细胞为已经坏死的细胞。本图中清晰的显示了一个CD45阴性(不表达白细胞标志物)、2-NBDG强阳性(高摄取葡萄糖)且EthD-1阴性(活细胞)的细胞，该细胞有较大可能为循环肿瘤细胞。

图9显示了对图8样本的统计结果(约2000个细胞)，其中上方的图为所有CD45阳性细胞摄取2-NBDG的荧光信号分布，下方的图为所有EthD-1阴性，即坏死细胞摄取2-NBDG的荧光信号分布,中间的图为所有CD45阴性且EthD-1阴性细胞摄取2-NBDG的荧光信号分布，其中2-NBDG摄取荧光信号大于100的四个疑似肿瘤细胞经显微操作设备取出后进行单细胞基因组测序，发现即基因突变特征EGFR L858R与肿瘤组织一致，的确为肿瘤细胞，说明了基于葡萄糖摄取与CD45表达的快速鉴定方法有效。

对比例1

CTC富集方法的捕获率

我们选择了两种具有代表性的人外周血中CTC富集检测技术，其中一种是表面修饰捕获抗体的交错式鱼骨型芯片(方法见Stott SL，et al.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.2010,107,18392)，另一种是商业化的基于滤膜(孔径8微米)ISET技术的法国Rarecells系统。由于无法知道病人样本中CTC的真实数目，因此评估富集技术的捕获效率一般通过在一毫升健康人血液样本中准确加入100个肿瘤细胞系细胞，再经富集分选计数后得到。由于不同细胞的尺寸不同、表面抗原表达也不同，因此本实验使用6种不同肿瘤的细胞系进行模拟实验，从而计算不同方法的捕获效率。其中，基于抗体的捕获方法根据不同细胞系表面抗原的表达量选择了相应的特异性抗体。图10显示了两种不同技术对于5种肿瘤细胞系的富集效果的评估。毫无疑问，富集步骤均导致了CTC的损失。其中基于8微米孔径滤膜的ISET技术对于小尺寸肿瘤细胞的富集效果较差，同时这一方法一般会特异性混入数万个白细胞，且CTC被卡在微孔中难以取出。而基于抗体的微流控芯片捕获技术对于EpCAM等抗原低表达的细胞系富集效果不佳，即使采用多种抗体针对不同抗原往往也难以达到较好的效果，同样的CTC被固定在芯片中难以取出做进一步分析，且这一方法一般会特异性混入数千个白细胞。因此，目前的CTC富集检测技术在富集步骤会丢失CTC，且难以预测丢失的数目，而CTC鉴定步骤不能准确可靠的鉴定肿瘤细胞且由于固定于细胞核染色导致无法将鉴定到的CTC进一步测序以寻找靶向药物靶点，同时以上的富集方法难以准确可靠的将CTC取出用于下一步分析。

讨论

本发明针对肿瘤患者外周血或胸水样本进行葡萄糖摄取与白细胞标志物CD45的联合检测，从而快速鉴定其中游离的数目极为稀少的肿瘤细胞，其原理是有活性的肿瘤细胞能够快速摄取荧光标记的葡萄糖类似物，而该葡萄糖类似物与正常葡萄糖有类似的代谢途径(尤其是在摄取环节非常相似)。同时，肿瘤细胞不表达白细胞标志物CD45。这一方法是肿瘤细胞所具有的普遍特征，不依赖于肿瘤细胞的尺寸、表面抗原表达情况等，因此是一种简单可靠的肿瘤细胞鉴定方法。

本发明中采用的荧光标记葡萄糖类似物为2-NBDG，它具有与D型葡萄糖相似的代谢途径，通过葡萄糖转运蛋白(GLUT)进入细胞内，然后其C-6位置被己糖激酶磷酸化。研究已显示，相比于良性细胞，2-NBDG可被恶性肿瘤细胞快速摄取，因此是一种检测恶性肿瘤细胞的光学标志物。在对稀有肿瘤细胞进行短暂的葡萄糖“饥饿”后，将其与2-NBDG共孵育一段时间后，用冰PBS清洗后通过荧光显微镜检测细胞摄取2-NBDG后发出的荧光信号。

本发明主要针对了目前CTC检测领域的若干技术挑战：(1)缺乏快速准确鉴定CTC的方法，强生公司的商业化系统CellSearch采用的标准是EpCAM阳性CK阳性CD45阴性DAPI阳性，但这实际上只能鉴定细胞为上皮细胞而不能鉴定其为肿瘤细胞，往往需要更为复杂的如测序、FISH等方法才能进一步鉴定做分离到细胞良恶性，缺乏简单快速的方法；(2)由于血液或胸水样本中血细胞数目巨大而CTC非常稀少，传统检测CTC的方法一般都是先富集后检测，但是富集过程往往操作复杂且容易损失CTC，从而降低了CTC的检出率；(3)CTC的测序对指导用药非常重要，因此需要能够在鉴定出CTC后可靠的取出CTC以进行后续分析。

对于技术挑战1，本发明采用代谢活性检测的方法来鉴定肿瘤细胞，即利用肿瘤细胞对葡萄糖摄取大大高于普通正常细胞的原理，并进一步结合了白细胞标志物CD45表达的检测以提高鉴定的准确性。这一方法检测简单、成本低，能够快速对大量细胞进行筛查。

对于技术挑战2，由于葡萄糖摄取的检测方法简单快速，结合高速荧光成像系统能够在短时间内检测大量细胞，因此有可能对样本不进行富集或只进行简单富集即可检测。比如对于胸水样本由于本身细胞较少一般可以不进行富集直接进行所有细胞的葡萄糖摄取检测以鉴定其中的肿瘤细胞，对于血液样本一般在裂解红细胞后通过标记CD45抗体的磁球进行简单的负选以减少细胞数目后，对剩余的所有细胞进行葡萄糖摄取检测以鉴定CTC。

对于技术挑战3，本发明设计了微孔阵列芯片使细胞均进入孔中进行检测。由于每个微孔都是可寻址的，因此微孔中细胞的坐标也就固定了。一旦被鉴定为肿瘤细胞，就可以根据其坐标找到该细胞，并通过手动或自动化的显微操作摄取将该细胞从微孔中取出。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (7)

1.一种用于检测人生物液体样本中游离的稀有肿瘤细胞的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒由以下部件组成：

(a) 微孔阵列芯片，所述的芯片包括多个用于容纳细胞且可以被寻址的微孔；

(b) 白细胞表面抗原CD45的荧光修饰抗体，所述的白细胞表面抗原CD45的荧光修饰抗体用于标记样本中的白细胞；

(c) 带有可检测标记物的葡萄糖类似物，所述带有可检测标记物的葡萄糖类似物用于检测样本中细胞的葡萄糖摄取能力；

且所述的带有可检测标记物的葡萄糖类似物为荧光标记的葡萄糖类似物。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还包括：(d) 死细胞染料，用于标记样本中的坏死细胞。

3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的微孔的直径为15-30微米。

4.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的微孔的直径为18-25微米。

5.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的芯片上微孔的数目为5万至50万个。

6.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的芯片上微孔的数目为15-25万个。

7.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述带有可检测标记物的葡萄糖类似物为2-NBDG；荧光修饰的CD45抗体为APC标记CD45抗体，和/或所述的死细胞染料为EthD-1。

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