CN110819729A - 一种检测野油菜黄单胞菌野油菜致病变种的pcr引物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了检测野油菜黄单胞菌野油菜致病变种的PCR引物，属于植物细菌性病害检测领域，包括SEQ ID NO.1～2所示的核苷酸序列。本发明还公开了利用上述PCR引物检测甘蓝黑腐病的方法。本发明具有灵敏性高、操作简便等特点。

Description

一种检测野油菜黄单胞菌野油菜致病变种的PCR引物及其 应用

技术领域

本发明属于涉及植物细菌性病害检测领域，具体涉及一种检测野油菜黄单胞菌野油菜致病变种的PCR引物及其应用。

背景技术

十字花科蔬菜黑腐病是由野油菜黄单胞菌野油菜致病变种[Xanthomonascampestris pv.campestris(Pam.)Dowson]引起的。其最早在1973年美国各地大规模发生,在生产上造成了严重损失。在20世纪90年代，非洲大部分国家的十字花科蔬菜上发生了该病害，成为该地区十字花科蔬菜的主要病害。野油菜黄单胞菌野油菜致病变种为革兰氏阴性短杆菌，单极生鞭毛，菌体单生或链生，有荚膜，无芽孢。在PDA培养基上为黄色粘稠近圆形菌落，初呈淡黄色，后变为腊黄色，老龄菌落边缘呈放线状。最适生长温度25～30℃，致死温度51℃，最适湿度为80～100％，最适pH6.4。Xcc还能产生一种独特的不溶于水的黄色素，能产生胞外多糖又称黄原胶(Xanthangum)，还能分泌淀粉酶、纤维素酶、蛋白酶、果胶酶、磷脂酶等。黑腐病病菌生长发育的最适温度为23～30℃，最高39℃，最低5℃，致死温度51℃。病菌进入水孔后，与环境的温度关系不大，在适合的温度范围内湿度越高发病越快。十字花科蔬菜在重茬地、地势低洼、排水不良、播种早、发生虫害地块发病重，在高温多雨、高湿多露的条件下有利于病害的流行。十字花科蔬菜黑腐病主要危害蔬菜叶片、叶球和球茎，病原菌从叶缘的水孔侵入，形成三角形的褪绿黄斑，并在叶缘产生黄褐色的坏死斑，随后再沿叶脉进行蔓延，逐渐扩大成“V”字形或长条形黄褐色病斑，同时在病斑周边伴有黄色的褪绿晕带，在该部的叶脉坏死变黑。病原菌沿着叶脉、叶柄发展，蔓延到茎部和根部，致使茎部、根部的维管束变黑，整个植株枯死，常伴有软腐病的发生。不同十字花科蔬菜黑腐病的病征不同。我国的黑腐病最早发生在20世纪50年代末的华北地区，到70年代中期时，这一病害在十字花科蔬菜的生产上造成了严重威胁，在北京、山东，山西等地发生的较为严重；至80年代，该病在全国各地普遍流行，从黑龙江、到海南岛均有发生，对十字花科蔬菜的产量造成严重的损失，而且使蔬菜的品质也受到很大影响。

结球甘蓝(Brassica oleracea L.var.capitata)是世界各地广泛栽培的十字花科芸薹属蔬菜作物，起源于欧洲地中海至北海沿岸，自16世纪开始传入我国，现为我国重要的蔬菜作物。甘蓝黑腐病是由野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(Xanthommonas campestris pv.Campestris，以下简写为Xcc)引起的一种毁灭性细菌性病害。甘蓝黑腐病的发生已蔓延至全国各地，甚至可使甘蓝减产70％，对甘蓝及其他十字花科蔬菜的品质和产量造成严重损失。鉴于黑腐病发病过程漫长，一旦发病将会给生产造成严重损失，而作物感染黑腐病前期难以肉眼判断，因此有必要利用分子手段进行先期检测，以便及早发现黑腐病病情，并提早采取措施加以控制。

发明内容

发明目的：本发明要解决的技术问题是提供一种野油菜黄单胞菌野油菜致病变种所用PCR引物。

本发明还要解决的技术问题是提供上述引物在检测野油菜黄单胞菌野油菜致病变种中的应用。

为解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：

检测油菜黄单胞菌野油菜致病变种的PCR引物，其特征在于，包括如下引物：

上游引物Xcc-JC-F(SEQ IN NO.1)：5’-GTGCGTAGGTGGTGGTTT-3’；

下游引物Xcc-JC-R(SEQ IN NO.2)：5’-GTGCCTCAGTGTCAGTGTTG-3’。

检测油菜黄单胞菌野油菜致病变种的方法，包括如下步骤：

(1)提取待检测甘蓝样品的总RNA，冰上备用；利用天根公司植物总RNA提取试剂盒(DP432)提取甘蓝总RNA，根据eppendorf紫外/可见光分光光度计测定OD260/280的值，检测总RNA的纯度和浓度，并使用琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性。甘蓝总RNA的提取具体步骤如下：

1)取100mg甘蓝病叶叶片放入研钵，倒入液氮迅速研磨成粉末，加入450μl RL(使用前加入2‰的β-巯基乙醇)，用药勺转移至1.5mL RNase-Free离心管中，涡旋震荡混匀；56℃孵育1-3min；

2)将离心管中溶液转移到过滤柱CS上(过滤柱CS放在收集管中),12000rpm离心2min，吸取上清液转移到RNase-Free的离心管中；

3)缓慢加入1/2上清体积的无水乙醇，上下颠倒混匀，将离心管内样品转移到吸附柱CR3中，12000rpm离心30s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中；

4)加入RW1去蛋白液350μl，12000rpm离心1min，倒掉废液；

5)DNasel工作液的配制：取10μl DNasel(-20℃存放，现用现配)储存液放入新的RNase-Free离心管中，加入70μl RDD溶液，混匀；

6)向吸附柱CR3中央的膜加入80μl的DNaseI工作液(竖直悬空，勿碰到管壁)，室温放置15min；

7)加入350μl去蛋白液RW1，12000rpm离心30s，倒掉废液；

8)加入500μl漂洗液RW(使用前加入乙醇)，室温静置2min，12000rpm离心60S，倒掉收集管中的废液；

9)重复步骤8；

10)12000rpm离心2min，倒掉废液；超净工作台放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液；

11)将CR3放入一个新的RNase-Free离心管中，向吸附膜中央悬空滴加40μlRNase-Free ddH₂O，室温放置2min，12000rpm离心2min，得到RNA溶液。RNA样品放在-80℃冰箱中备用；

12)1.5％非变性琼脂糖凝胶电泳检测总RNA浓度，根据检测浓度，调整浓度一致后，按照PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit(TaKaRa)的说明，取2μlRNA进行反转录反应；获得的cDNA产物稀释后用于qRT-PCR或-20℃贮藏备用。

(2)依据TIANgel Midi Purification Kit(天根生化科技(北京)有限公司)cDNA第一条链合成试剂盒进行反转录；以该cDNA为模板进行PCR扩增；

cDNA第一条链合成：

参照Takara公司的Primescript TM RT reagent Kit with gDNA Eraser第一链合成试剂盒合成cDNA第一链，具体操作步骤如下：

1)去除基因组DNA，按如下成分在冰上配制反应混合液：2.0μl 5×gDNA EraserBuffer；1.0μlgDNA Eraser；2.0μl Total RNA；5.0μlRNase Free ddH₂O；

2)PCR仪上42℃加热2min，4℃保温，拿出后迅速在冰上冷却2min。瞬时离心收集反应液后加入以下各组分：

10.0μl步骤1的反应液；1.0μl PrimeScript RT Enzyme Mix I；1.0μl RT PrimerMix*4；4.0μl 5×PrimeScript Buffer 2(for Real Time)；4.0μl RNase Free dH₂O；

3)37℃温浴15min，85℃加热5s，4℃保温，取出后瞬时离心，于-20℃保存备用。

PCR体系设计如下：

使用上述模板进行PCR扩增，其PCR反应体系为20μl，在微量PCR管中依次加入其中含基因组DNA 1μl，上下游引物各1μl，2xEasyTaq PCR SuperMix 10μl。其PCR反应条件为：94℃预变性3min；94℃变性50S，56℃50S，72℃延伸60S，35个循环；72℃延伸10min，然后于4℃保存；

(3)对(2)中的PCR产物进行1.2％琼脂糖凝胶电泳检测，得到阳性条带，目的条带大小

预计约为188bp，经测序后Blast比对，表明样品中含有野油菜黄单胞菌致病菌；

(4)为进一步确定该样品中是否含有野油菜黄单胞菌，继续如下实验；将(3)中阳性PCR产物样品进行切胶回收，回收产物直接与PMD18-T载体进行连接，转化到DH-5α菌株中进行培养，挑取阳性单菌落进行菌液复苏，经菌液PCR鉴定为阳性的样品进行进一步测序，依据测序结果进行比对以确定样品是否被野油菜黄单胞菌侵染。

有益效果：

本发明所提供的PCR引物对黑腐病菌的检出具有特异性，可检测出甘蓝样品中的野油菜黄单胞菌野油菜致病菌(Xanthommonas campestris pv.Campestris)，并得到特异性条带。利用RT-PCR法进行检测，具有灵敏性高、操作简便等特点。实验表明，利用本发明检测甘蓝上的黑腐病菌侵染，有较高的特异性。

附图说明

图1为RT-PCR法检测甘蓝中Xcc的凝胶电泳图。(Matker：DL2000，1～10为杭州病样，10～20为盐城病样，21～22为未发病植物)；

图2为待检甘蓝样品检测出Xcc在NCBI Blast比对结果。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行详细说明。

下面结合实例对本发明做进一步解释说明，在介绍实例之前，首先对本发明中所涉及到的部分物料进行如下简介。

生物材料样品：

待检测样品为疑是被黑腐病侵染的带有明显被病毒侵染症状的甘蓝样品，该样品采自浙江杭州、江苏盐城，其生理症状表现为：从湿度较大的下部叶片开始发病，细菌从叶缘水孔侵入后，先形成三角形褪绿黄斑，叶缘产生黄褐色坏死斑，再沿叶脉蔓延，逐渐扩大成“V”字形或长条形黄褐斑，边周伴有黄色褪绿晕带，该部叶脉坏死变黑；大肠杆菌DH-5α菌株，TIANGEN(天根生化科技(北京)有限公司)；PMD18-T载体，TaKaRa(宝生物工程(大连)有限公司)；上下游引物合成，思普金(盐城)生物科技有限公司。

实验仪器及试剂：

凝胶电泳仪(北京君意东方仪器厂)；PCR仪(德国)；RNA提取试剂盒(TIANGEN)；TaqDNA聚合酶(TIANGEN)；Marker DL2000(TaKaRa)；反转录试剂盒(TIANGEN)。

实例1：本实例中的甘蓝黑腐病菌的检测方法，具体包括如下步骤：

(1)提取待检测甘蓝样品的总RNA，冰上备用；利用天根公司植物总RNA提取试剂盒(DP432)提取甘蓝总RNA，根据eppendorf

紫外/可见光分光光度计测定OD260/280的值，检测总RNA的纯度和浓度，并使用琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性。甘蓝总RNA的提取具体步骤如下：

1)取100mg甘蓝病叶叶片放入研钵，倒入液氮迅速研磨成粉末，加入450μl RL(使用前加入2‰的β-巯基乙醇)，用药勺转移至1.5mL RNase-Free离心管中，涡旋震荡混匀；56℃孵育1-3min；

2)将离心管中溶液转移到过滤柱CS上(过滤柱CS放在收集管中),12000rpm离心2min，吸取上清液转移到RNase-Free的离心管中；

3)缓慢加入1/2上清体积的无水乙醇，上下颠倒混匀，将离心管内样品转移到吸附柱CR3中，12000rpm离心30s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中；

4)加入RW1去蛋白液350μl，12000rpm离心1min，倒掉废液；

5)DNasel工作液的配制：取10μl DNasel(-20℃存放，现用现配)储存液放入新的RNase-Free离心管中，加入70μl RDD溶液，混匀；

6)向吸附柱CR3中央的膜加入80μl的DNaseI工作液(竖直悬空，勿碰到管壁)，室温放置15min；

7)加入350μl去蛋白液RW1，12000rpm离心30s，倒掉废液；

8)加入500μl漂洗液RW(使用前加入乙醇)，室温静置2min，12000rpm离心60S，倒掉收集管中的废液；

9)重复步骤8；

10)12000rpm离心2min，倒掉废液；超净工作台放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液；

11)将CR3放入一个新的RNase-Free离心管中，向吸附膜中央悬空滴加40μlRNase-Free ddH₂O，室温放置2min，12000rpm离心2min，得到RNA溶液。RNA样品放在-80℃冰箱中备用；

12)1.5％非变性琼脂糖凝胶电泳检测总RNA浓度，根据检测浓度，调整浓度一致后，按照PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit(TaKaRa)的说明，取2μlRNA进行反转录反应；获得的cDNA产物稀释后用于qRT-PCR或-20℃贮藏备用。

(2)cDNA第一条链合成：参照Takara公司的Primescript TM RT reagent Kitwith gDNA Eraser第一链合成试剂盒合成cDNA第一链，具体操作步骤如下：

1)去除基因组DNA，按如下成分在冰上配制反应混合液：2.0μl 5×gDNA EraserBuffer；1.0μlgDNA Eraser；2.0μl Total RNA；5.0μlRNase Free ddH₂O；

2)PCR仪上42℃加热2min，4℃保温，拿出后迅速在冰上冷却2min。瞬时离心收集反应液后加入以下各组分：

10.0μl步骤1的反应液；1.0μl PrimeScript RT Enzyme Mix I；1.0μl RT PrimerMix*4；4.0μl 5×PrimeScript Buffer 2(for Real Time)；4.0μl RNase Free dH₂O；

3)37℃温浴15min，85℃加热5s，4℃保温，取出后瞬时离心，于-20℃保存备用。

PCR引物设计如下：(该引物特异扩增Xcc序列片段，大小约为188bp)

上游引物Xcc-JC-F(SEQ IN NO.1)：5’-GTGCGTAGGTGGTGGTTT-3’；

下游引物下游引物Xcc-JC-R(SEQ IN NO.2)：5’-GTGCCTCAGTGTCAGTGTTG-3’；

(3)RT-PCR法扩增：

使用(2)中cDNA进行PCR扩增，使用上述模板进行PCR扩增，其PCR反应体系为20μl，在微量PCR管中依次加入其中含基因组DNA 1μl，上下游引物各1μl，2xEasyTaq PCRSuperMix 10μl。其PCR反应条件为：94℃预变性3min；94℃变性50S，56℃50S，72℃延伸60S，35个循环；72℃延伸10min，然后于4℃保存；取PCR产物于1.2％琼脂糖凝胶电泳检测，PCR产物经电泳后，利用凝胶成像仪成像，若样品呈阳性且条带大小为188bp左右，表明样品中含有黑腐病病菌。

检测结果如图1所示，结果显示，1～10号采杭州市的甘蓝病叶样品呈现大小为188bp的阳性条带，11～20号采自江苏盐城的黑腐病病叶样品呈现大小为188bp的阳性条带，表明1～20号样品中受到Xcc的侵染。将(4)中待检测PCR产物样品进行回收，回收产物直接与PMD18-T载体连接，16℃温育3h，再转化到DH-5α菌株中培养，挑取单菌落进行菌液复苏，进行菌液PCR初步筛选，选取阳性样品送出测序，依据测序结果进行比对，测序结果如SEQ INNO.3所示，与Xcc序列进行同源性比对，核苷酸序列同源性>95％(图2)，可确定侵染甘蓝叶片的病原菌为Xcc。

从哈尔滨、广州、重庆、北京、天津、武汉、南京、郑州采集甘蓝病叶样品，利用本发明的PCR引物进行检测，通过田间观测黑腐病发病情况进行验证。

表1其他城市甘蓝病叶样品样品检测结果

总体而言，本发明中使用该种特异性引物并利用RT-PCR技术，即可快速即可快速对植物样品是否受到黑腐病菌的侵染做出判断，该种方法适用于快速、大量样品的鉴定，若产物浓度低，还可通过连接转化，将其克隆到PMD18-T载体上，进行扩繁，在进行测序，进而判断黑腐病菌是否存在于被检测样品中。该种方法鉴定操作简单，准确性良好，为黑腐病菌的鉴定及基因的多样性分析提供良好的理论基础。

序列表

<110> 江苏省农业科学院

<120> 一种检测野油菜黄单胞菌野油菜致病变种的PCR引物及其应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gtgcgtaggt ggtggttt 18

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gtgcctcagt gtcagtgtt 19

<210> 3

<211> 188

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gtgcgtaggt ggtggtttaa gtctgttgtg aaagccctgg gctcaacctg ggaattgcag 60

tggatactgg gtcactagag tgtggtagag ggtagcggaa ttcccggtgt agcagtgaaa 120

tgcgtagaga tcgggaggaa catccgtggc gaaggcggct acctggacca acactgacac 180

tgaggcac 188

Claims (3)

1.检测甘蓝野油菜黄单胞菌野油菜致病变种的PCR引物，其特征在于，包括SEQ IDNO.1～2所示的核苷酸序列。

2.检测野油菜黄单胞菌野油菜致病变种的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)提取待检测甘蓝样品的总RNA；

(2)将RNA反转录成cDNA；

(3)以步骤(2)得到的cDNA为模板，SEQ ID NO.1～2所示的核苷酸为引物进行PCR扩增；

(4)利用琼脂糖凝胶电泳检测，若得到大小为188bp的目的条带，则该甘蓝样品感染甘蓝黑腐病。

3.根据权利要求2所述检测野油菜黄单胞菌野油菜致病变种的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述PCR扩增的反应条件为：94℃预变性3min；94℃变性50S，56℃50S，72℃延伸60S，35个循环；72℃延伸10min。

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