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CN110512025B - 一种与小麦抗白粉病基因PmJM23紧密连锁的分子标记及其应用 - Google Patents

一种与小麦抗白粉病基因PmJM23紧密连锁的分子标记及其应用 Download PDF

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CN110512025B
CN110512025B CN201910929715.8A CN201910929715A CN110512025B CN 110512025 B CN110512025 B CN 110512025B CN 201910929715 A CN201910929715 A CN 201910929715A CN 110512025 B CN110512025 B CN 110512025B
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Abstract

本发明公开了一种与小麦抗白粉病基因PmJM23紧密连锁的分子标记，该分子标记为YTU1011；所述分子标记YTU1011的上游引物为YTU1011‑F，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述分子标记YTU1011的下游引物为YTU1011‑R，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；以所述分子标记YTU1011的标记引物对小麦基因组DNA进行PCR扩增，将扩增产物电泳分离，获得对应的扩增产物分子量为290bp，即为与小麦抗白粉病基因PmJM23紧密连锁的分子标记。本发明开发的与PmJM23紧密连锁的分子标记YTU1011，可高效、准确地检测育种大群体，大大提高转移抗病基因PmJM23基因的效率和精度，加快PmJM23基因不同遗传背景抗白粉病小麦新品种的培育，不仅能够缩短育种年限，而且能够消除连锁累赘，实现目标基因的有效转移和聚合，有效提高小麦育种的效率。

Description

一种与小麦抗白粉病基因PmJM23紧密连锁的分子标记及其 应用
技术领域
本发明涉及小麦分子生物技术与育种应用领域，具体地说是一种与小麦抗白粉病基因PmJM23紧密连锁的分子标记及其应用。
背景技术
小麦白粉病是一种由布氏白粉菌引起的叶部病害。小麦感染白粉病后一般可造成10-15%的产量损失，严重时减产可达50%（Ma et al. Characterization of a powderymildew resistance gene in wheat breeding line 10V-2 and its application inmarker-assisted selection. Plant Disease. 2018, 102:925–931.），严重威胁国家粮食安全。在众多小麦白粉病防治措施中，抗病品种的推广是最为经济有效的策略（Petersenet al. Mapping of powdery mildew resistance gene Pm53 introgressed fromAegilops speltoides into soft red winter wheat. Theoretical and AppliedGenetics. 2015, 128:303-312.）。当前小麦白粉病抗性基因多为小种特异性抗性，较易随着病原菌群的演化而丧失抗性，目前我国主要审定品种中具有广谱抗性的比例仅3.4%（李洪杰等，中国小麦品种对白粉病的抗性反应与抗病基因检测. 作物学报. 2011, 37:943-954.），亟需发掘更多抗白粉病基因应用于抗病育种。
迄今，已在53个位点发现了70多个正式命名的小麦抗白粉病基因（McIntosh etal. Catalogue of gene symbols for wheat: 2017 supplement. http://www.shigen.nig.ac.jp/wheat/komugi/genes/symbolClassList.jsp. 2017）。但是，很多抗病基因由于品种-菌群的互作逐渐丧失了对白粉病的抗性，目前一些有抗性的基因也并非都可以直接利用，很多抗病基因由于存在不利的一因多效、遗传连锁累赘和竞争滞后等因素，大大影响了在生产上的利用（Summers & Brown. Constraints on breeding fordisease resistance in 6
commercially competitive wheat cultivars. Plant Pathology. 2013, 62(Suppl. 1):115-121. ）。因此，一个抗病基因，不但抗性要强，抗谱要宽，载体品种还必须满足产量、品质和农艺性状方面的要求，才能够被育种家接受。当前推广品种/育种品系是优良基因的集合，勿需进行先期改良即可直接利用。因此，利用育成品种中的广谱抗白粉病基因更具实践意义。
小麦传统育种在过去几十年中，取得了瞩目成就。然而，传统育种往往具有一定的盲目性，无法保持稳定的增长。利用分子育种则可以在较少的回交代数中去除不利基因，加速育种进程（Chhetri et al. Development of robust molecular markers for marker-assisted selection of leaf rust resistance gene Lr23 in common and durumwheat breeding programs. Molecular Breeding. 2017, 37: 21）。尤其近年来，随着高通量、自动化测序技术的发展，小麦高通量SNP（Single nucleotide polymorphism）芯片、SLAF-seq（Specific-locus amplified fragment sequencing）和BSR-Seq（Bulkedsegregant RNA-seq）等开始应用于小麦饱和遗传图谱的构建，大大促进了抗病分子育种的进程（Semagn et al. Single nucleotide polymorphism genotyping usingkompetitive allele specific PCR (KASP): overview of the technology and itsapplication in crop improvement. Molecular Breeding. 2016, 33:1–14.）。
小麦品种济麦23是由山东省农科院作物所与中国农科院作科所联合选育的高产、优质、抗病小麦新品种。经实验室苗期抗白粉病遗传分析及分子标记检测表明，济麦23苗期对不同毒性小麦白粉菌的抗性由一对显性基因控制，因此，开发与该基因紧密连锁的分子标记，进而应用于高效、准确的检测和追踪抗白粉病基因，对实现其育种具有非常重要的价值和意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种与小麦抗白粉病基因PmJM23紧密连锁的分子标记，为高效、准确地检测小麦抗白粉病基因PmJM23及其图位克隆提供便利工具，在小麦选育中对其亲本进行有目的地选择，进而选育出在抗白粉病方面表现优异的小麦品种或品系，有效应用于抗白粉病分子标记辅助选择育种。
本发明是通过以下方法实现的：一种与小麦抗白粉病基因PmJM23紧密连锁的分子标记，其特征在于，该分子标记为是共显性SSR标记YTU1011；
所述分子标记YTU1011的上游引物为YTU1011-F，其核苷酸序列如下所示：
YTU1011-F：5' - 3'：GCTTCATCCTCAGCTTCGTC；
所述分子标记YTU1011的下游引物为YTU1011-R，其核苷酸序列如下所示；
YTU1011-R：5' - 3'：GGAGGAAACAAAGGCACAGA；
以所述分子标记YTU1011的标记引物对小麦基因组DNA进行PCR扩增，将扩增产物电泳分离，获得对应的扩增产物分子量为290bp，即为与小麦抗白粉病基因PmJM23紧密连锁的分子标记。
所述PCR扩增的体系为10μL，包含30-50 ng/μL小麦基因组DNA 1.0 μL，10×PCRbuffer 1.0μL，10 mM dNTP 0.2μL，10 mM MgCl2 1.0μL，5U Taq聚合酶0.2μL，5μM 上游引物0.4μL，5μM 下游引物0.4μL，无菌去离子水5.8μL。
所述PCR扩增的程序为：94℃预变性5分钟；94℃变性30秒，55℃退火30秒，延伸40秒，36个循环；72℃延伸5min；4℃保存。
扩增产物电泳分离是指在8%变性聚丙烯酰胺凝胶上300 V恒压下电泳2.5-3h。
本发明提供的与小麦抗白粉病基因PmJM23紧密连锁的分子标记在小麦抗白粉病基因PmJM23定位、检测或图位克隆中的应用。
具体地，检测小麦抗白粉病基因PmJM23的方法包括以下步骤：
（1）从待测样品的幼嫩叶片提取小麦基因组DNA；
（2）利用分子标记YTU1011的引物对所述基因组DNA进行PCR扩增，获得扩增产物；所述分子标记YTU1011的引物包括上游引物YTU1011-F和下游引物YTU1011-R；所述上游引物YTU1011-F的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述下游引物YTU1011-R的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；
（3）PCR扩增产物检测：在8%变性聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳，将所述扩增产物和5μL上样缓冲液混合后，取2μL混合物点样，300 V恒压下电泳2.5-3h，硝酸银染色后拍照,若能扩增出290 bp的特异条带，说明待测小麦种质中存在抗白粉病基因PmJM23，否则，待测小麦种质中不存在小麦抗白粉病基因PmJM23。
该检测方法中所述PCR扩增的体系为10μL，包含30-50 ng/μL小麦基因组DNA 1.0μL，10×PCR buffer 1.0μL，10 mM dNTP 0.2μL，10 mM MgCl2 1.0μL，5U Taq聚合酶0.2μL，5μM 上游引物0.4μL，5μM 下游引物0.4μL，无菌去离子水5.8μL；所述PCR扩增的程序为：94℃预变性5分钟；94℃变性30秒，55℃退火30秒，延伸40秒，36个循环；72℃延伸5min；4℃保存。
本发明中与小麦抗白粉病基因PmJM23紧密连锁的分子标记在小麦分子标记辅助选择育种中的应用。
本发明通过实验室苗期抗白粉病遗传分析及分子标记检测表明，济麦23苗期对不同毒性小麦白粉菌的抗性由单个显性基因控制，命名为PmJM23，再利用Bulked segregantRNA-Seq（BSR-seq）对济麦23、泰农18以及利用济麦23×泰农18 F2:3群体中50个纯合抗病和50个纯合感病家系组成的抗病池和感病池进行BSR-Seq测序，通过全基因组范围内差异SNP分析，发现只在5D染色体40-43Mb物理区间内存在明显富集峰，进一步根据该区间抗感亲本及抗池间均存在的差异序列，利用primer5.0软件设计成Simple Sequence Repeat（SSR）标记YTU1011。本发明提供的小麦抗白粉病基因PmJM23的分子标记YTU1011经过遗传分离群体检测，与PmJM23的遗传距离仅为1.0cM，与PmJM23紧密连锁，不仅可以高效、准确地检测检测PmJM23的遗传作图大群体，应用于PmJM23的精细定位和图位克隆，还可利用该标记进行PmJM23的分子标记辅助选择育种，尤其PmJM23的载体品种济麦23为生产上的主栽品种，无连锁累赘，减少回交代数，使得利用该分子标记对PmJM23进行的高效分子育种更具实践意义。
附图说明
图1为分子标记YTU1011检测济麦23和泰农18及其杂交后代分离群体的结果。
图1中：M：DNA marker pUC19 Msp I；1：济麦23（抗白粉病品种，携带PmJM23）；2：泰农18（感白粉病品种）；3-17：济麦23与泰农18杂交形成的F2:3家系，其中，3-7：纯合抗病的F2:3家系，8-12：抗感分离的F2:3家系，13-17：纯合感病的F2:3家系；黑色箭头为能追踪PmJM23的特异性条带。
图2为分子标记YTU1011通过PCR扩增检测部分感病主栽品种育种可用性的结果。
图2中：M：DNA marker pUC19 Msp I；1：济麦23（抗白粉病品种，携带PmJM23）；2：泰农18（感白粉病品种）；3：辉县红；4：邯麦13；5：淮麦0226；6：西农979；7：鲁辰185；8：冀麦268；9：泰农1014；10：济南17；11：良星619；12：石麦15；13：济麦21；14：济麦20；15：石新633；黑色箭头为能追踪PmJM23的特异性条带。
具体实施方式
下面实施例用于进一步详细说明本发明，但不以任何形式限制本发明。
实施例1 小麦抗白粉病基因PmJM23的分子标记YTU1011的开发
1、 材料
抗病亲本济麦23和感病亲本泰农18分别为2017年和2008年山东省审定品种，对小麦白粉病分别表现为抗病和感病，济麦23和泰农18杂交，所得F1自交，获得F2群体及对应的F2:3家系。
2、小麦基因组DNA的提取
小麦基因组DNA提取采用酚/氯仿法，流程如下：
(1) 取新鲜小麦叶片置于研钵中，加入液氮研磨粉碎，取约0.2g置于2mL离心管中。
(2) 加入600 μL DNA提取液 (100 mM Tris, 50mM EDTA, 500 mM NaCl, 1.8%SDS, pH = 8.0)，65℃水浴60 min，期间每隔10 min上下混匀一次。
(3) 加入600 μL氯仿-异戊醇 (24:1, v/v)，置于摇床上轻摇15 min。
(4) 12000 rpm 离心15 min，取上清于另一2 mL离心管中，加入3倍体积的预冷无水乙醇，置于-20 ºC冰箱中沉淀60 min。
(5) 挑出絮状DNA沉淀，用75%预冷乙醇洗涤2遍。
(6) 将DNA沉淀挑出，置于1.5 mL离心管中，室内自然风干。
(7) 加入60 μL TE缓冲液 (100 mM Tris-Hcl，10 mM的EDTA，pH = 8.0) 溶解DNA沉淀制成DNA储存液。
(8) 将DNA储存液用超纯水稀释成10-30 ng/μL作为工作液备用。
3、苗期白粉病抗性鉴定及遗传分析
小麦材料的白粉病抗性鉴定于条件可控的玻璃温室中完成。将F1杂交种、F2群体和F2:3家系种植于72穴的穴盘(3×3cm)中，每个穴播种5粒种子，每个家系播种4个穴，感病对照铭贤169随机分布。发苗期间条件控制为光照14h/黑暗10h，温度18-22℃，相对湿度30-40%。待长至一叶期，利用扫拂法接种白粉病菌株E09，接种后头24h条件控制为：黑暗，温度18-22℃，相对湿度80-90%，之后条件控制为光照14h/黑暗10h，温度18-22℃，相对湿度80-90%。10-14天后，当感病对照铭贤169第一片叶子充分发病后调查表型。反应型按0-4级标准记载，抗病等级为0-2级，感病等级为3-4级。接种白粉病菌株E09后，10株F1均表现0-1级抗病，说明济麦23中的白粉病抗性受显性基因控制，所鉴定的F2群体抗感分离比为3810:1249，卡方检验符合单显性基因的分离比例3:1（χ2=0.26, P=0.61），进一步将该群体移栽至大田，获得对应的F2:3家系，E09鉴定后，发现纯合抗病家系、抗感分离家系和纯合感病家系数分别为1218、2497和1230，卡方检验符合单显性基因的分离比例1:2:1（χ2=0.54, P=0.76），进一步证实济麦23的白粉病抗性由单个显性基因控制，命名为PmJM23。此外，根据抗谱分析表明，苗期对23个具有不同毒性小麦白粉病菌株中的20个表现抗性，具有广谱抗性。因此，PmJM23对小麦抗白粉病遗传育种具有重要意义。PmJM23导入到主栽品种后，如何高效、准确的检测和追踪抗白粉病基因PmJM23对实现其育种价值极为重要。
4、BSR-Seq测序分析
根据上述抗性鉴定结果，分别选取50株纯合高抗和50个纯合抗病家系和50个纯合感病家系构建抗病池和感病池。对抗病亲本济麦23、感病泰农18以及抗病池和感病池共4个样品进行BSR-Seq测序。
5、与PmJM23紧密连锁分子标记的开发
对BSR-Seq数据差异区段及SNP进行分析，发现全基因组只有在5D染色体上40-43Mb物理区间存在明显的富集。进一步根据该区间抗感亲本及抗池间均存在的差异序列，利用primer5.0软件设计成Simple Sequence Repeat（SSR）标记YTU1011，通过检测济麦23×泰农18的F2:3家系的连锁分析发现，该标记与PmJM23紧密连锁，遗传距离仅为1.0cM。
其分子标记YTU1011的引物包括一条上游引物和一条下游引物：
上游引物序列：YTU1011-F：GCTTCATCCTCAGCTTCGTC ；
下游引物序列：YTU1011-R：GGAGGAAACAAAGGCACAGA。
PCR反应体系为10μL，包含30-50 ng/μL待测小麦基因组DNA 1.0μL，10×PCRbuffer 1.0μL，10mM dNTP 0.2μL，10 mM MgCl2 1.0μL，5U Taq聚合酶0.2μL，5μM上游引物0.4μL，5μM下游引物0.4μL，无菌去离子水5.8μL；
PCR扩增程序为：94℃预变性5分钟；94℃变性30秒，55℃退火30秒，延伸40秒，36个循环；72℃延伸5min；4℃保存备用。
PCR扩增产物检测程序为：在8%变性聚丙烯酰胺凝胶（acrylamide/bisacrylamide = 25/1）上进行电泳，将上述PCR产物和5μL上样缓冲液混合后，取2μL混合物点样，300 V恒压下电泳2.5-3h，硝酸银染色后拍照，扩增产物分子量为290 bp和490 bp片段分别为与抗病和感病表型连锁的特异片段；扩增产物分子量为290bp为与小麦抗白粉病基因PmJM23紧密连锁的分子标记。
实施例2 小麦抗白粉病基因PmJM23的分子标记YTU1011的应用
利用小麦抗白粉病基因PmJM23的分子标记YTU1011检测济麦23、泰农18以及济麦23与泰农18杂交形成的F2:3家系中的材料。
待测样品：济麦23、泰农18以及济麦23与泰农18杂交形成的F2:3家系中15个材料。
提取上述材料的DNA为模板，利用本发明开发的分子标记YTU1011的引物进行扩增：
上游引物序列：
YTU1011-F：GCTTCATCCTCAGCTTCGTC；
下游引物序列：
YTU1011-R：GGAGGAAACAAAGGCACAGA。
PCR反应体系为10μL，包含30-50 ng/μL待测小麦基因组DNA 1.0μL，10×PCRbuffer 1.0μL，10mM dNTP 0.2μL，10 mM MgCl2 1.0μL，5U Taq聚合酶0.2μL，2μM引物0.8μL，无菌去离子水5.8μL。
PCR扩增程序为：94预变性5分钟；94℃变性30秒，55℃退火30秒，延伸40秒，36个循环；72℃延伸5min；4℃保存备用。
PCR扩增产物检测程序为：在8%变性聚丙烯酰胺凝胶（acrylamide/bisacrylamide = 25/1）上进行电泳，将上述PCR产物和5μL上样缓冲液混合后，取2μL混合物点样，300 V恒压下电泳2.5-3h，硝酸银染色后拍照。
分子标记检测结果见图1。图中显示济麦23中可以扩增出与抗病表型连锁的290bp的特异条带，泰农18可以扩增出与感病表型连锁的490 bp的特异条带，济麦23与泰农18杂交形成的F2:3家系15个材料中材料3-7可以扩增出与抗病表型连锁的290 bp的特异条带，3-7材料为纯合抗病的F2:3家系；8-12可以同时扩增出与抗病表型连锁的290 bp的特异条带和与感病表型连锁的490 bp的特异条带，所以8-7材料为抗感分离的F2:3家系；13-17可以扩增出与感病表型连锁的490 bp的特异条带，13-17材料为纯合感病的F2:3家系。图中M为DNAmarker pUC19 Msp I，黑色箭头为能追踪PmJM23的特异性条带。
实施例3 小麦抗白粉病基因PmJM23的分子标记YTU1011的应用
利用小麦抗白粉病基因PmJM23的分子标记YTU1011检测现有品种中是否含有抗白粉病基因PmJM23。
待测样品包括济麦23、泰农18以及13个小麦材料。13个小麦材料分别为：辉县红、邯麦13、淮麦0226、西农979、鲁辰185、冀麦268、泰农1014、济南17、良星619、石麦15、济麦21、济麦20和石新633。经本实验室前期抗白粉病鉴定结果表明：这13个小麦材料均对小麦白粉病菌株E09表现感病。
提取上述材料的DNA为模板，利用本发明开发的分子标记YTU1011的引物进行扩增：
上游引物序列：
YTU1011-F：GCTTCATCCTCAGCTTCGTC；
下游引物序列：
YTU1011-R：GGAGGAAACAAAGGCACAGA。
PCR反应体系为10μL，包含30-50 ng/μL待测小麦基因组DNA 1.0μL，10×PCRbuffer 1.0μL，10mM dNTP 0.2μL，10 mM MgCl2 1.0μL，5U Taq聚合酶0.2μL，5μM 上游引物0.4μL，5μM 下游引物0.4μL，无菌去离子水5.8μL。
PCR扩增程序为：94℃预变性5分钟；94℃变性30秒，55℃退火30秒，延伸40秒，36个循环；72℃延伸5min；4℃保存备用。
PCR扩增产物检测程序为：在8%变性聚丙烯酰胺凝胶（acrylamide/bisacrylamide = 25/1）上进行电泳，将上述PCR产物和5μL上样缓冲液混合后，取2μL混合物点样，300 V恒压下电泳2.5-3h，硝酸银染色后拍照。
分子标记检测结果显示，济麦23中可以扩增出与抗病表型连锁的290 bp的特异条带，其他材料与泰农18相同，均扩增出与感病表型连锁的490 bp的特异条带。这与经本实验室前期抗白粉病鉴定泰农18和其他13个小麦材料均对小麦白粉病菌株E09表现感病是相一致的。其扩增产物电泳后的图谱如图2所示。
将PmJM23基因导入到感病小麦主栽品种中，利用本发明开发的与PmJM23紧密连锁的分子标记YTU1011，可高效、准确地检测育种大群体，大大提高转移抗病基因PmJM23基因的效率和精度，加快PmJM23基因不同遗传背景抗白粉病小麦新品种的培育，不仅能够缩短育种年限，而且能够消除连锁累赘，实现目标基因的有效转移和聚合，有效提高小麦育种的效率。
PmJM23是在我国一个优秀的推广品种济麦23中发现的广谱抗白粉病基因，目前该基因尚未见被精细定位和图位克隆的报道。通过构建遗传作图大群体、精细定位并图位克隆PmJM23基因，对PmJM23抗病机制的深入解析具有重要意义。利用本发明开发的与PmJM23紧密连锁的分子标记YTU1011，可以高效、准确地检测PmJM23的遗传作图大群体，应用于PmJM23的精细定位、图位克隆及分子标记辅助选择育种，具有理论和实践研究的双重意义。
上述实施例为本发明优化的实施方案，仅用于说明本发明而非限制本发明。本领域的技术人员在不脱离本发明实施方案的宗旨和原理的基础上所作的修改或等同替换，均属于本发明要求保护的范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 烟台大学；山东省农业科学院作物研究所；烟台吉恩生物科技有限公司
<120> 一种与小麦抗白粉病基因PmJM23紧密连锁的分子标记及其应用
<130>
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 上游引物YTU1011-F
<400> 1
gcttcatcct cagcttcgtc 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 下游引物YTU1011-R
<400> 2
ggaggaaaca aaggcacaga 20

Claims (4)

1.一种用于扩增与小麦抗白粉病基因PmJM23紧密连锁的分子标记的引物，其特征在于，所述分子标记为YTU1011；所述分子标记YTU1011的上游引物为YTU1011-F，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述分子标记YTU1011的下游引物为YTU1011-R，其核苷酸序列如SEQ ID N:2所示；以所述分子标记YTU1011的引物对小麦基因组DNA进行PCR扩增，将扩增产物电泳分离，获得对应的扩增产物分子量为290bp。
2.一种检测小麦抗白粉病基因PmJM23的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）从待测样品的幼嫩叶片提取小麦基因组DNA；
（2）利用权利要求1所述的用于扩增与小麦抗白粉病基因PmJM23紧密连锁的分子标记的引物对所述基因组DNA进行PCR扩增，获得扩增产物；
（3）PCR扩增产物检测：在8%变性聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳，将所述扩增产物和5μL上样缓冲液混合后，取2μL混合物点样，300 V恒压下电泳2.5小时~3小时，硝酸银染色后拍照，若能扩增出290bp的特异条带，说明待测小麦种质中存在抗白粉病基因PmJM23。
3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述PCR扩增的体系为10μL，包含30ng/μL~50ng/μL小麦基因组DNA 1.0μL，10×PCR buffer 1.0μL，10mM dNTP 0.2μL，10mMMgCl2 1.0μL，5U Taq聚合酶0.2μL，5μM 上游引物0.4μL，5μM 下游引物0.4μL，无菌去离子水5.8μL；所述PCR扩增的程序为：94℃预变性5分钟；94℃变性30秒，55℃退火30秒，延伸40秒，36个循环；72℃延伸5分钟；4℃保存。
4.一种权利要求1所述的用于扩增与小麦抗白粉病基因PmJM23紧密连锁的分子标记的引物在小麦分子标记辅助选择育种中的应用。
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Molecular mapping of a new powdery mildew resistance gene Pm2b in Chinese breeding line KM2939;Pengtao Ma等;《Theor Appl Genet》;20150212;第128卷(第4期);第613-622页 *

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