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CN110709516A - 识别来自mage-a4的肽的抗原结合性蛋白 - Google Patents

识别来自mage-a4的肽的抗原结合性蛋白 Download PDF

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CN110709516A CN201880037404.4A CN201880037404A CN110709516A CN 110709516 A CN110709516 A CN 110709516A CN 201880037404 A CN201880037404 A CN 201880037404A CN 110709516 A CN110709516 A CN 110709516A
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Abstract

本发明所要解决的技术问题在于：提供一种能够用于使用癌症特异性细胞内抗原的CAR输注疗法的CAR‑T细胞。解决技术问题的技术方案为：通过如下的癌症治疗用CAR‑T细胞来解决，该癌症治疗用CAR‑T细胞具有识别来自MAGE‑A4的肽和HLA‑A2复合体的抗体，上述抗体具有序列号36的VH的氨基酸序列和序列号38的VL的氨基酸序列。此时，上述抗体优选具有序列号32的氨基酸序列。

Description

识别来自MAGE-A4的肽的抗原结合性蛋白
技术领域
本发明涉及识别来自MAGE-A4的肽的抗原结合性蛋白等。
背景技术
目前，恶性肿瘤超过了死亡原因的30％，成为发达国家中第一位的死因。由于医疗的进步，也存在完全治愈的癌症，但也存在大量难以治疗的癌症。开发癌症的新型治疗方法是当务之急。作为癌症的治疗方法，手术、化学疗法、放射线疗法是三大治疗方法，主要是组合这些方法进行治疗。
近年来，被称为免疫疗法的第四种癌症治疗方法得到发展，其非侵入性和高效性备受关注。免疫疗法主要分为疫苗疗法、抗体疗法、细胞输注疗法这3种。细胞输注疗法包括：将来自癌症特异性反应的细胞毒性T细胞的T细胞受体(T cell receptor：TCR)的基因在体外导入患者的淋巴细胞后进行输注的T细胞受体基因导入淋巴细胞输注疗法；和将使作为抗原识别部位的scFv和作为细胞内信号传导分子的CD3ζ结合而得到的嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor：CAR)导入患者外周血淋巴细胞进行输注的治疗方法。这些治疗方法通过将具有抗原特异性的淋巴细胞导入受体基因这样的方法能够以短时间进行大量地制备，因此能够对多种癌症患者进行特异性T细胞治疗。
TCR基因输注疗法是识别肽MHC复合体(peptide-MHC complex：pMHC)来杀死癌症的系统，是一种安全且有效的治疗方法，世界上正在进行着开发。但是，存在分离能够用于其的杀伤T细胞克隆极其困难这样的问题。
另一方面，作为CAR输注疗法的优点可以列举以下的3点。(1)导入了包含单链抗体(scFv)和T细胞受体(TCR)或副刺激分子的信号传导结构域的CAR的T细胞与原本的T细胞不同，能够MHC非依赖性地识别癌症抗原进行破坏，因此具有能够适用于广大范围的患者的优点；(2)不仅能够对CD8阳性T细胞起作用，还能够对CD4阳性T细胞和非T细胞起作用；(3)因为继承了抗体的反应性，所以与TCR相比，亲和性高。实际上，关于CAR治疗方法，报道了作为使用了抗CD19抗体的CAR治疗方法，对白血病和淋巴瘤的患者具有极高的临床效果(非专利文献1：关于文献，记载在最后。)。CD19分子也能够在B细胞中表达，但B细胞的消失可以通过补充免疫球蛋白等来解决。一般而言，使用只在癌症细胞中表达的抗原是比较理想的。但是，存在在现有技术中还没有发现那样的细胞表面抗原的技术问题。
另一方面，关于存在于细胞内的分子，报道有癌症睾丸抗原、肿瘤新生抗原(neoantigen)等的癌症特异性分子。但是，关于使用癌症特异性细胞内抗原的CAR输注疗法还是未知的。
基于这样的状況，本发明的发明人考虑了分离识别MHC和来自细胞内抗原的肽的复合体的抗体，使用该抗体，应用于CAR免疫疗法的方法。特异性识别肽MHC复合体的抗体只报道了有限数量的成功例子(非专利文献2)。如果能够获取特异性识别肽MHC复合体的抗体，并制备特异性杀伤癌症细胞的CAR-T细胞，则将成为开创性的治疗方法。关于识别肽MHC复合体的CAR，通过在体内输注CAR-T细胞的同时给药CAR-T细胞特异性识别的肽，能够期待抗原提呈细胞产生的CAR-T细胞的增殖。
发明内容
发明所要解决的技术问题
本发明是鉴于上述的技术问题所完成的发明，其目的在于：提供特异性识别来自MAGE-A4的肽/HLA-A2复合体的抗原结合性蛋白。
用于解决技术问题的技术方案
作为MHC所提呈的抗原，使用了MAGE-A4分子。MAGE-A4在包括恶性黑色素瘤的实体癌症中表达(非专利文献3)，与NY-ESO-1同样为CTA(肿瘤睾丸抗原：cancer testisantigen)。这些分子在睾丸和胎盘以外的正常组织中没有观察到蛋白表达。MAGA-A4在细胞内表达之后，在蛋白酶体中进行分解。其一部分成为10个氨基酸的MAGE-A4肽，利用内质网与HLA-A*0201、β-2微球蛋白(beta-2microglobulin)缔合，作为癌症特异性抗原提呈于细胞表面。作为提呈于HLA-A*0201上的肽，选择了p230-239(GVYDGREHTV：序列号1)(非专利文献4)。
确立了：将特异性识别A2-MAGE-A4的CAR基因导入人淋巴细胞，制备对靶标癌症表现特异性反应的CAR-T细胞，将其应用于人的细胞输注疗法的方法。即，(1)分离识别来自MAGE-A4的肽和HLA-A2复合体的亲和性高的多个抗体，(2)研究所分离得到的抗体的特异性，(3)筛选特异性高的抗体，(4)制备使用了该抗体的CAR-T细胞，确认了该CAR-T细胞由于靶标癌症细胞特异性被活化，引起细胞杀伤活性。在利用输注了CAR-T细胞的人肿瘤移植小鼠的体内(in vivo)癌症治疗模型中，在小鼠体内，CAR-T细胞特异性地增殖，能够观察到对肿瘤的浸润。这样，基本上完成了本发明。
本发明所涉及的抗原结合性蛋白包含以下的(A)或(B)的多肽，该抗原结合性蛋白将HLA-A2-MAGE-A4复合体识别为抗原，即，(A)包含序列号36的VH(重链可变区)的氨基酸序列和序列号38的VL(轻链可变区)的氨基酸序列的多肽；(B)包含与序列号36的VH(重链可变区)的氨基酸序列具有90％以上的同源性的氨基酸序列和与序列号38的VL(轻链可变区)的氨基酸序列具有90％以上的同源性的氨基酸序列的多肽。此时，优选在VH与VL之间包含以下的(C)或(D)的多肽，即，(C)包含序列号37的sc(单链)的氨基酸序列的多肽；(D)包含与序列号37的sc(单链)的氨基酸序列具有90％以上的同源性的基酸序列的多肽。另外，优选为包含序列号32的氨基酸序列、或与序列号32的氨基酸序列具有90％以上的同源性的氨基酸序列的多肽。上述抗原结合性蛋白优选为Fab、Fab'、F(ab')2、Fv或单链Fv(scFv)。其中，在本说明书中，抗原结合性蛋白包括抗体本身或抗体衍生物等。
在本发明中，同源性是指通过比较2个(或3个以上)的氨基酸序列或碱基序列而确定的关系。同源性是指通过氨基酸序列或碱基序列之间的比对而得到的相关性的程度或者一系列的部分序列间的相关性的程度。具体而言，通过序列的同一性和保持性(维持序列中的特定氨基酸或序列中的理化特性的置换)而确定。确定同源性的方法优选为能够在对比的序列间进行最长的比对的方法。为了确定同源性，可以使用能够通过互联网进行利用的程序、例如BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)＜https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi＞而求得。优选为与序列号32、36、37、38的氨基酸序列显示90％以上(更优选为95％以上，进一步优选为98％以上)的同源性，并且将HLA-A2-MAGE-A4复合体识别为抗原的多肽。
另外，另一个发明所涉及的核酸编码第一发明记载的抗原结合性蛋白。
另一个发明所涉及的载体包含上述核酸。这里，核酸包括DNA或RNA。另外，核酸可以是单链或双链中的任意种。载体包括质粒载体、病毒载体等。
另一个发明所涉及的嵌合抗原受体包含上述抗原结合性蛋白和信号传导蛋白的胞内结构域。此时，信号传导蛋白优选为CD3zeta(CD3ζ)链或共刺激分子CD(GITR)中的任意种。另外，优选还包含CD28的胞内结构域或GITR的胞内结构域中的任意种。
另外，另一个发明所涉及的核酸编码上述嵌合抗原受体。另一个发明所涉及的载体包含该核酸。
另一个发明所涉及的细胞是表达上述嵌合抗原受体的细胞。另外，另一个发明所涉及的医药组合物含有该细胞作为有效成分。
发明效果
根据本发明，能够提供特异性识别来自MAGE-A4的肽/HLA-A2复合体的抗原结合性蛋白、编码抗原结合性蛋白的核酸、包含该核酸的载体、包含抗原结合性蛋白的嵌合抗原受体、编码嵌合抗原受体的核酸、包含该核酸的载体、表达嵌合抗原受体的细胞和包含该细胞的医药组合物。特异性识别来自MAGE-A4的肽/HLA-A2复合体的抗原结合性蛋白能够在细胞医疗、基因治疗的领域中使用。另外，对表达来自MAGE-A4的肽/HLA-A2复合体的肿瘤细胞的检测、肿瘤的治疗及其研究、试验是极其有用的。另外，本发明的CAR-T细胞的副作用非常少，因此能够提供非常有效的癌症治疗方法。
附图说明
图1为表示MAGE#17scFV的序列图像的图。
图2为表示用于说明CAR的构建方法的基因序列图像的图。
图3的(A)、(B)都为表示针对挑选的克隆使用ELISA确认对多个抗原的反应性而得到的结果的棒状图。
图4为表示针对MAGE#17测定KD值而得到的结果的图表。(A)表示测定检测敏感度相对于时间经过的动态变化的图表，(B)表示基于从图表中读取的数据计算KD值而得到的结果的表。
图5为表示利用FACS研究使抗体MAGE#17、#86、#209、#345和#672与脉冲了MAGE-A4p230、CMV、DMSO的T2细胞反应时的偏移量而得到的结果的图表(A)和棒状图(B)。
图6为表示利用FACS测定脉冲了经丙氨酸置换的肽时的T2细胞表面上的HLA量而得到的结果的图表。
图7为表示将经丙氨酸置换的肽脉冲到T2细胞中，使MAGE#17反应，调查与抗体识别相关的氨基酸而得到的结果的图表。
图8为表示将危险型肽(risk peptide)脉冲到T2细胞中，利用FACS测定T2细胞表面上的HLA量而得到的结果的图表。
图9为表示将危险型肽脉冲到T2细胞中，使MAGE#17反应，研究与危险型肽的反应性而得到的结果的图表。
图10为表示利用四聚体染色研究导入PBMC中的CAR(mRNA)是否表达而得到的结果的图。
图11为表示导入了mRNA的CAR-T细胞特异性识别靶细胞，使IFNγ产生增加的图表。
图12为表示利用四聚体染色研究导入PBMC中的CAR基因(逆转录病毒)是否表达而得到的结果的图。
图13为表示导入了逆转录病毒的CAR-T细胞特异性识别靶细胞，使IFNγ产生增加的图表。
图14为表示导入了MAGE#17CAR的T细胞通过与脉冲了MAGE-A4肽的T2细胞的共培养而活化的图表。
图15为表示导入了MAGE#17CAR的T细胞通过与A2阳性MAGE-A4阳性细胞的共培养而活化的图表。
图16为通过将摄取了MAGE-A4长肽的抗原提呈细胞与CAR-T共培养，增加CAR-T的干扰素产生的图表。
图17为表示脉冲了MAGE-A4肽的T2细胞具有MAGE-A4特异性的细胞杀伤活性的图表。
图18为表示靶细胞对A2阳性MAGE阳性细胞具有特异性的细胞杀伤活性的图表。
图19为表示利用四聚体染色研究输注的CAR-T细胞的CAR阳性率而得到的结果的图。
图20的(A)为表示确认CAR-T细胞对A2阳性MAGE-A4阳性肿瘤(NW-MEL-38)的效果而得到的结果的图表，或者(B)为表示确认了CAR-T细胞对A2阳性MAGE-A4阴性肿瘤(HCT116)的效果而得到的结果的图表。
图21为表示CAR zG的基因序列图的图。
图22为表示确认对A2阳性MAGE-A4阳性肿瘤(NW-MEL-38)给药胞内结构域(ICD)不同的CAR-T细胞时的效果而得到的结果的图表。(A)表示肿瘤径，(B)表示体重。关于图表中的箭头，左侧表示放射线全身照射(TBI)的治疗日(第3天)，右侧表示淋巴细胞给药日(第4天)。
图23为表示利用四聚体染色研究CAR非导入CD8阳性T细胞(NGMC：对照)、zG型CAR导入CD8阳性T细胞(zG)和28z型CAR导入CD8阳性T细胞(28z)的CAR阳性率而得到的结果的图。
图24为表示研究是否CAR-T细胞特异性识别靶细胞，使IFNγ产生增多而得到的结果的图表。
图25为表示研究是否CAR-T细胞特异性识别靶细胞，使IFNγ产生增多而得到的结果的图表。
具体实施方式
接着，对本发明的实施方式，参照图表进行说明。本发明的技术范围并不限定于这些实施方式，可以在不改变发明的主旨的条件下实施各种方式。
在本说明书中，“抗体”、“抗原结合性片段”是指免疫系统中的抗原结合性蛋白。具有抗原结合性区域的抗体为包含通过二硫键相互连接的2个重链(H链)和2个轻链(L链)的糖蛋白。各重链包含重链可变区(VH)和重链恒定区(CH)。重链恒定区由CH1、CH2和CH3的3个结构域构成。各轻链包含轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)。VL由CL结构域构成。VH和VL区域可以进一步细分为互补性决定区域(CDR)这样的具有超可变性的区域和骨架区域(framework，FR)这样的某种程度保守的区域。VH和VL中，从氨基末端到羧基末端，以FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4的顺序排列有3个CDR和4个FR。已知在与抗原的结合中，CDR3是重要的。VH和VL包含与抗原相互作用的结合结构域。
在本说明书中，“HLA”为Human Leukocyte Antigen(人白血球型抗原)，是指人主要组织相容性基因复合体(MHC)，是指编码对免疫细胞的抗原提呈所需的细胞表面分子的基因的复合体。HLA可以分类为I类和II类。I类HLA由α链和β2-微球蛋白构成。I类HLA几乎在所有的有核细胞中表达，在对CD8阳性T细胞的抗原提呈中发挥作用。I类HLA还可以分类为HLA-A、HLA-B和HLA-C。
在本说明书中，“嵌合抗原受体(CAR)”是指包含结合抗原的胞外结构域、与胞外结构域不同的来自多肽的跨膜结构域和至少1个胞内结构域的融合蛋白。CAR有时也被称为“嵌合受体”、“T-body”、“嵌合免疫受体(CIR)”。“结合抗原的胞外结构域”是指结合某抗原的任意寡肽或多肽，“胞内结构域”是指已知在细胞内作为传递将生物学过程活化或抑制的信号的结构域发挥作用的任意寡肽或多肽。
在本说明书中，“抗原结合性蛋白”是指结合抗原、将对抗体赋予对抗原的特异性的抗体的一部分或全部的蛋白质片段。
接着，具体地对本发明进行说明。
(1)本发明的抗原结合性片段和编码这些的核酸
抗来自MAGE-A4的肽/HLA-A2(HLA-A2-MAGE-A4)复合体抗体是特异性识别和结合P230-239(序列号1)与HLA-A2的复合体的抗体，P230-239为HLA-A2限制性的来自MAGE-A4的肽。本发明的抗体的特异性，不与HLA-A2以外的肽和HLA-A2的复合体以及P230-239肽和HLA-A2以外的HLA的复合体结合(或结合活性极低)。因此，本发明的抗原结合性片段能够特异性检测HLA-A2-MAGE-A4复合体或以HLA-A2-MAGE-A4复合体为靶标。
本发明的抗原结合性片段包含：(A)包含序列号36的VH(重链可变区)的氨基酸序列和序列号38的VL(轻链可变区)的氨基酸序列的多肽、或(B)包含与序列号36的VH(重链可变区)的氨基酸序列具有90％以上的同源性的氨基酸序列和与序列号38的VL(轻链可变区)的氨基酸序列具有90％以上的同源性的氨基酸序列的多肽。另外，在VH与VL之间包含：(C)包含序列号37的sc(单链)的氨基酸序列的多肽、或(D)包含与序列号37的sc(单链)的氨基酸序列具有90％以上的同源性的氨基酸序列的多肽。
抗原结合性片段包括特异性结合抗原的1个或2个以上的片段。包含抗体的抗原结合区域的抗体片段与全长抗体同样特异性识别抗原。作为抗原结合性片段所包含的抗体或其片段的例子，可以例示Fab、Fab'、F(ab')2、Fv或单链Fv(scFv)。Fab为由VL、VH、CL和CH1结构域构成的单价抗体片段。Fab'为由VL、VH、CL、CH1结构域和铰链区构成的单价抗体片段。F(ab')2为包含通过铰链区的二硫键结合的2个Fab片段的双价抗体片段。Fv为由抗体的单臂的VL和VH构成的单价抗体片段。作为Fv片段的2个结构域的VL和VH由各自的基因编码，能够通过基因重组技术利用接头(linker)连结这些结构域来制造作为1分子的蛋白质的scFv。scFv在VH和VL之间包含接头(单链(single chain)：sc)。该sc是为了连结VH和VL，使scFv抗体的抗原结合能稳定化而在本领域中通常使用的肽(例如，Huston et al.,Methods inEnzymology,203:46-88(1991),Whitlow et al.,Protein Eng.,6:989(1993))。sc一般包含甘氨酸和丝氨酸，其长度为15～18个氨基酸。
作为本发明的一个方式，包含抗原结合性片段的组合。这样的分子可以例示Fab3、Diabody(双链抗体)、Triabody(三链抗体)、Tetrabody(四链抗体)、Minibody(微型抗体)、Bis-scFv、(scFv)2-Fc、intact-IgG(Holliger et al.,Nature Biotechnology,23(9),p.1126-36(2005))。
抗原结合性片段只要对其特性不产生实质的影响，可以改变1个或几个氨基酸。例如，在恒定区和FR区域中，氨基酸能够被置换、缺失、添加或插入。该改变能够组合部位特异性突变导入法(点突变导入和盒式突变导入等)、基因同源重组法、引物延伸法和PCR法等公知方法而容易地实施。
本发明包含编码上述抗原结合性片段的核酸。另外，本发明的核酸包含序列表的序列号31、33～35所示的碱基序列。这些核酸能够不使编码的氨基酸序列变更而改变为适应宿主细胞的密码子(最佳密码子)。通过改变为最佳密码子，能够提高宿主细胞内的多肽的表达效率。
本发明的抗原结合性片段能够使用公知的基因工程方法或化学合成等的方法来制造。作为基因工程方法，能够制备含有本发明的核酸的克隆载体或表达载体，将该载体导入宿主细胞，培养宿主细胞，使核酸表达，回收和纯化所得到的多肽，由此来制造。在本发明的核酸由多个核酸分子构成的情况下，可以将包含各核酸分子的多个载体的组合导入宿主细胞，或者将包含多个核酸的1个载体导入宿主细胞。在制造多肽时，可以连结肽标签，使用该肽标签，进行回收和纯化。
本发明的载体与适当的控制序列功能性连结，以使在适当的宿主内表达核酸。作为这样的控制序列，包含转录核酸的启动子、控制转录的操纵子序列、编码核糖体结合部位的序列、增强子、聚腺苷酸化序列以及控制转录和翻译结束的序列等。载体可以使用公知的各种序列(例如，限制性酶切位点、耐药基因等的标记基因(选择基因)、信号序列、前导序列等)。各种序列可以根据所表达的多肽的种类、宿主细胞、培养基等的条件适当选择使用。
作为载体，能够使用整合入宿主基因组的载体和没有整合入的载体、存在于细胞质中进行自主复制的附加型载体等。作为这样的载体，例如，可以例示逆转录病毒载体(包含致癌逆转录病毒载体、慢病毒载体、假型载体)、腺病毒载体、腺伴随病毒(AAV)载体、猿猴病毒载体、牛痘病毒载体、仙台病毒载体、爱泼斯坦巴尔病毒(EBV)载体、HSV载体等病毒载体。作为病毒载体，优选使用以在转染的细胞中病毒不能自主复制的方式缺损了复制能力的载体。另外，通过与脂质体和阳离子脂质等缩合剂的并用，也能够使用非病毒载体。进一步而言，可以通过磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖、电穿孔、粒子轰击向细胞中导入核酸。
作为宿主细胞，可以使用公知的细胞。例如可以列举大肠杆菌(E.coli)等原核细胞、中国仓鼠卵巣细胞(CHO细胞)、人源细胞等哺乳动物细胞、酵母、昆虫细胞等真核细胞。
在宿主细胞中表达的本发明的抗原结合性片段可以从宿主细胞的培养基、宿主细胞的提取物和/或溶解物中纯化。纯化方法可以适当组合公知的方法来进行。例如，可以适当使用离心分离、羟基磷灰石色谱、凝胶电泳、透析、离子交换柱上的分离、乙醇沉淀、反相HPLC、硅胶色谱、肝素琼脂糖色谱、阴离子或阳离子树脂色谱(聚天冬氨酸柱等)、色谱聚焦、SDS-PAGE、硫酸铵沉淀和亲和层析等。
(2)本发明的组合物
本发明提供包含上述(1)记载的本发明的抗体或抗原结合性片段的组合物、以及包含编码本发明的抗体或抗原结合性片段的核酸的组合物。
本发明的抗体或抗原结合性片段可以作为针对来自MAGE-A4的肽和HLA-A2的复合体的探针使用。可知MAGE-A4在癌症细胞的内部表达，利用HLA提呈，T细胞基于抗原识别，攻击该癌症细胞。因此，本发明的抗原结合性片段可以作为针对癌症细胞的探针、即检测用组合物或诊断用组合物使用。
作为这样的检测方法，可以例示公知的检测方法、例如ELISA、荧光抗体检测、放射性免疫检测、放射性免疫沉降法、点印迹检测、抑制或竞争检测、夹心检测、乳胶珠凝集检测等。
成为诊断和检测的对象的试样包含生物学的试样(例如，疾病部位的组织、细胞、血液、血清、血浆、淋巴液、尿等体液)。这些试样根据需要进行预纯化、均质化、离心分离或稀释之后，在适当的缓冲液中，接触本发明的抗原结合性片段，检测抗原、抗体复合体。在该情况下，可以标识本发明的抗原结合性片段，也可以使用标识二次抗体。作为标识，可以使用酶(例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等)、放射性同位素(例如32P、35S、3H、125I等)、荧光性物质(例如罗丹明、荧光胺、丹磺酰氯、它们的衍生物等)、标签肽等。
本发明的抗原结合性片段能够用于将医药递送给靶标。与医药连结的本发明的抗体或抗原结合性片段用于特异性识别WT1肽和HLA－A24的复合体，将医药组合物递送给靶标，可以例示细胞因子(IL2、TNF、IFN-γ等)、它们的受体蛋白、细胞毒素(赖氨酸、白喉毒素、白树毒素等)、放射性核种(90Y、131I、225Ac、213Bi、223Ra和227Th等)、细胞(T细胞、NK细胞等)或低分子化合物(卡奇霉素、阿霉素等)。
本发明的医药组合物的有效成分的有效量可以根据目的、肿瘤的种类、部位和大小等的给药对象的病情、患者的条件和给药途径等适当确定。在作为医药组合物使用时，除了有效成分，还可以添加公知的药学上可接受的各种成分(例如，载体、赋形剂、缓冲剂、稳定剂等)。医药组合物可以根据条件制成片剂、液剂、粉末、凝胶、喷雾剂或微胶囊、胶体分配体系(脂质体、微乳液等)和粗乳液等药剂形态。作为医药组合物的给药方法，可以列举静脉内、腹腔内、脑内、脊髄内、肌肉内、眼内、动脉内、胆管内、病变内路径的注入、注射、利用缓释型系统制剂的方法。医药组合物可以通过输液连续给药、或者通过注射给药。
本发明的医药组合物可以用于慢性骨髓性白血病、急性淋巴性白血病(ALL)、急性骨髓性白血病(AML)等造血器官肿瘤、胃癌、大肠癌、肺癌、乳腺癌、胚胎细胞癌、肝癌、皮肤癌、膀胱癌、前列腺癌、子宫癌、宫颈癌、卵巣癌、间皮瘤等实体癌的治疗、各肿瘤、实体癌的诊断和检测。特别而言，对MAGE-A4阳性、HLA-A2阳性的造血器官肿瘤、实体癌的治疗、诊断和检测有用。
(3)本发明的嵌合抗原受体
本发明包含含有上述(1)记载的抗原结合性片段和信号传导蛋白的胞内结构域的嵌合抗原受体(CAR)。CAR特异性识别和结合来自HLA-A2-MAGE-A4的肽复合体，可以信号传导给表达CAR的细胞。CAR包含胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域。胞外结构域包含本发明的抗原结合性片段。胞外结构域与HLA-A2-MAGE-A4复合体特异性结合时，经由CAR的胞内结构域，将信号传递到细胞内，刺激表达CAR的细胞。接受刺激的细胞产生细胞因子等，能够对表达复合体的靶标细胞发挥细胞毒性，或者能够诱导其他的免疫细胞的细胞毒性。
作为CAR的胞内结构域，可以使用存在于同一分子内的胞外结构域与来自MAGE-A4的肽/HLA-A2复合体相互作用(结合)时，能够信号传导给细胞内的胞内结构域。作为那样的信号传导蛋白，可以例示选自膜蛋白、信号受体、细胞因子受体的蛋白质。CAR的胞内结构域可以例示包含来自CD3zeta(CD3ζ)、FCRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b和CD66d的一次细胞质信号传导序列的胞内结构域。另外，可以例示包含来自CD2、CD4、CD5、CD8α、CD8β、CD28、CD137(也称为“4-1BB”)、CD134、ICOS、GITR和CD154的二次细胞质信号(共刺激信号)传导序列的胞内结构域。进一步而言，可以例示包含来自IL-2受体、IL-21受体的三次细胞质信号传导序列的胞内结构域。
CAR的跨膜结构域例如可以使用T细胞受体的α链、β链、CD3ζ链、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137(也称为“4-1BB”)、ICOS、CD154、GITR的跨膜结构域。另外，也可以是人工设计的序列。
本发明包含编码CAR的核酸。编码CAR的核酸能够以在适当的启动子的控制下进行表达的方式与其他核酸连结。作为启动子，也可以使用结构上促进表达的启动子、通过药剂等(例如四环素或阿霉素)进行诱导的启动子等中的任意种。例如可以使用磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子、Xist启动子、β-肌动蛋白启动子、RNA聚合酶II启动子等来自哺乳类的启动子、SV40初期启动子、巨细胞病毒启动子、单纯疱疹病毒的胸苷激酶启动子、各种逆转录病毒的LTR启动子等来自病毒的启动子。为了实现高效的核酸转录，也可以连结包含与启动子或转录开始部位协同的其他调节要素(例如增强子序列或终止子序列)的核酸。另外，可以进一步整合入能够成为用于确认核酸的表达的标记的基因(例如耐药性基因、编码报告酶的基因、或编码荧光蛋白的基因等)。
编码CAR的核酸可以使用上述载体来导入细胞。进一步而言，编码CAR的核酸可以作为医药用组合物的有效成分来使用。包含编码CAR的核酸的医药用组合物基于上述(2)的记载，能够制造和使用。
在本发明的其他方式中，包含表达CAR的细胞。该细胞可以通过将编码本发明的CAR的核酸导入细胞的工序来制造。表达CAR的细胞可以通过经由CAR与HLA-A2-MAGE-A4复合体结合，向细胞内传递信号，被活化。细胞的活化根据宿主细胞的种类和胞内结构域而不同，可以将细胞因子的释放、细胞增殖率的提高、细胞表面分子的变化等作为指标来进行确认。例如，从被活化的细胞释放细胞毒性的细胞因子(肿瘤坏死因子、淋巴毒素等)会将表达复合体的肿瘤细胞破坏。另外，由于细胞因子的释放或细胞表面分子的变化，刺激其他的免疫细胞、例如B细胞、树突状细胞、NK细胞、巨噬细胞等。因此，CAR表达细胞在过继免疫疗法、特别是对MAGE-A4阳性、HLA-A2阳性的肿瘤或癌的过继免疫疗法中有用。
将编码CAR的核酸导入细胞的工序可以在生物体外(ex vivo)或生物体内(invivo)实施。导入核酸的细胞可以使用来自哺乳动物的细胞、例如来自人的细胞或来自猴子、小鼠、大鼠、猪、牛、狗等非人哺乳动物的细胞。作为细胞的种类，例如可以使用由血液(外周血、脐带血等)、骨髓等体液、组织或器官收集、分离、纯化、诱导而得到的细胞。优选使用PBMC、免疫细胞[树突状细胞、B细胞、造血干细胞、巨噬细胞、单核细胞或NK细胞、血球系细胞(中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、单核细胞)]、造血干细胞、脐带血单核细胞、成纤维细胞、前脂肪细胞、肝细胞、血球细胞、皮肤角化细胞、间充质干细胞、造血干细胞、脂肪干细胞、多能性干细胞、各种癌细胞株或神经干细胞。在本发明中，特别优选T细胞、T细胞的前体细胞(造血干细胞、淋巴细胞前体细胞等)、多能性干细胞或含有这些的细胞集团。T细胞包括CD8阳性T细胞、或CD4阳性T细胞、调节性T细胞、细胞毒性T细胞、肿瘤浸润淋巴细胞。含有T细胞和T细胞的前体细胞的细胞集团包含PBMC。在本发明使用的细胞可以是由生物体收集的细胞、将其扩大培养而得到的细胞或作为细胞系而确立的细胞中的任意种。在希望将导入了核酸的细胞或由该细胞分化得到的细胞移植到生物体时，优选向由其生物体本身或同种的生物体收集的细胞导入核酸。
表达本发明的CAR的细胞在向对象给药之前，可以使用适当的培养基和/或刺激分子进行培养和/或刺激。刺激分子包含细胞因子类、适当的蛋白质、其他的成分。作为细胞因子类，例如可以例示IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IFN-γ等，优选例示IL-2。作为IL-2的培养基中的浓度，没有特别限定，例如为0.01～1×105U/mL，更优选为1～1×104U/mL。另外，作为适当的蛋白质，例如可以例示CD3配体、CD28配体、抗IL-4抗体。另外，除此以外，还可以添加凝集素等淋巴细胞刺激因子。另外，可以在培养基中添加血清或血浆。这些向培养基中的添加量没有特别限定，可以例示0～20容量％，可以根据培养阶段变更所使用的血清或血浆的量。可以阶段地减少血清或血浆浓度来使用。作为血清或血浆的来源，可以是自身(是指来源与培养的细胞相同)或非自身(是指来源与培养的细胞不同)的任意种，从安全性的观点考虑，优选使用来源自身的血清或血浆。
作为用于细胞的培养的细胞培养用器材，没有特别限定，例如可以使用培养皿、烧瓶、培养袋、大型培养槽、生物反应器等。另外，作为培养袋，可以使用细胞培养用CO2气体透过性培养袋。另外，在工业上制造大量的细胞集团时，可以使用大型培养槽。另外，培养可以是在开放体统、封闭系统中的任意系统中实施，适当的是，从得到的细胞集团的安全性的观点考虑，优选在封闭系统中进行培养。
本发明包含含有表达CAR的细胞作为有效成分的医药组合物。本发明的医药用组合物进行非口服给药。作为非口服的给药方法，包括静脉内、动脉内、肌肉内、腹腔内和皮下给药等方法。为了提高抗肿瘤作用，可以向脑膜瘤或近旁组织、例如皮下进行给药。给药量可以根据对象的状态、体重、年龄等适当选择。通常，作为细胞数量，相对于体重60kg，每1次给药107～109个细胞左右、优选5×107～5×108个细胞。医药组合物可以1次或分多次进行给药。医药组合物可以制成适于非口服给药的形态、例如注射或注入剂。医药组合物可以适当含有药理上可接受的赋形剂。为了稳定维持细胞，医药组合物可以含有生理盐水、磷酸缓冲生理盐水(PBS)、培养基等。作为培养基，没有特别限定，一般可以列举RPMI、AIM-V、X-VIVO10等培养基。
＜试验方法＞
1.使用人抗体噬菌体库的抗体筛选
(1)pMHC微珠的制备
混合作为pMHC的A2-MAGE-A4 20μg和结合了链霉亲和素(Streptavidin)的磁性微珠200mg，在0.05％Tween/PBS(-)溶液中，以4℃反应过夜。向其中加入3μL的2mM生物素/PBS(-)，使其反应1小时。利用0.05％Tween/PBS(-)溶液将其进行2次清洗后，悬浮于0.05％Tween/PBS(-)溶液400μL中。将其制成抗原微珠。
(2)人抗体库
将来自几十人的健康人的扁桃腺、脐带血、外周血、骨髓作为基础，利用PCR扩增VH和VL，将其整合到噬菌粒(phagemid)载体pUC119上，制备成3.4×1012的全套抗体(Repertoire)的scFv，提呈在M13噬菌体(phage)的cp3上，将其作为人抗体库。
(3)使用人抗体库的筛选、抗体的分离、cp3-培养上清液的调整
作为反应液，制备3.4×1012cfu的人抗体库溶液、链霉亲和素(Streptavidin)(Pierce)100μg、A2-CMV四聚体(tetramer)30μg、A2-Foxp69四聚体(tetramer)30μg、A2-IDOp41四聚体(tetramer)30μg、A2-IDOp195四聚体(tetramer)30μg、Gamma guard 20μg、2％BSA溶液(solution)100μL、10％TritonX100 65μL、1％TritonX100/PBS1000μL，在室温下旋转混合1小时后，混合结合了A2-MAGE-A4四聚体(tetramer)的磁性微珠液100μl，进行旋转混合1小时。之后，一边利用磁体捕获器(东洋纺)捕获磁性微珠，一边利用1％TritonX100/PBS清洗5次，之后利用PBS清洗1次。将其加入培养的XL1-blue，在37℃转染1小时后，进行离心，利用600μL的2×YTAG培养基(200μg/mL氨苄青霉素、1％葡萄糖/2×YT)进行悬浮，铺在YTAG琼脂培养基(200μg/mL氨苄青霉素、2％葡萄糖/普通琼脂培养基(日水))上，在37℃培养15小时。在30mL的2×YTAG培养基中回收菌落，之后将200μL加入20mL的2×YTAG培养基中，加入30μL的辅助噬菌体(helper phage)VCSM。在37℃转染30分钟后，在37℃培养90分钟。在培养液中加入80mL的2×YTAG培养基、50μg/mL卡那霉素60μL、1MIPTG 50μL，在28℃培养20小时。将其离心，在得到的上清液中加入25mL的PEG溶液(20％PEG#600、2.5MNaCl)进行混合，离心，回收沉淀，将其利用1mL PBS悬浮之后，进行过滤器灭菌。将以上的操作重复2次，第2次结束后，将所回收的大肠杆菌铺在YTAG琼脂培养基。在30℃培养，将得到的菌落利用LB培养基在30℃培养过夜，使用一部分，利用小量提取DNA试剂盒(miniprepDNAkit)(QIAGEN)提取DNA，进行序列确定。另外，将培养物50μL与1.5mL的2×YTAI(加入了0.5mM的IPTG的2×YT培养基)混合，在30℃培养过夜之后，离心，取上清液。将其作为cp3上清液。使用其进行ELISA。
2.酶联免疫吸附测定(Enzyme-linked immunosorbent assay)(ELISA)
(1)使用的MHC-肽复合体(单体)
使用MAGE-A4 p230、MAGE-A4 p286、MAGE-A3 p195、CMV、MelanA、GP3、HTLV-1、NY-ESO-1p157、NY-ESO-1p159、Foxp3 p69、Foxp3 p127、Foxp3 p390、IDO p41、IDO p41、IDOp195和IDOp199的各肽与HLA-A*0201结合而得到的物质。
(2)pMHC的固相化
将悬浮于PBS 50μL的500ng中性亲和素(neutraavidin)(PIERCE公司制造)加入Maxisop loose(Nunc)中，在4℃振荡过夜。弃去溶液后，加入200μL的2％BSA/PBS，静置过夜，进行密封。弃去溶液后，加入HLA-A2-MAGE-A4单体300ng/50μl PBS，在4℃振荡过夜。之后，利用PBS进行清洗。
也同样进行作为阴性对照的HLA-A2-CMV的固相化。
(3)ELISA反应测定
向固相化后的抗原培养板加入100μl的cp3培养上清液，在室温振荡1小时后，利用PBS清洗培养板，加入利用0.05％Tween20/PBS稀释2000倍后的抗cp3兔抗体100μl，在室温下振荡1小时。利用PBS清洗后，加入利用0.05％Tween20/PBS稀释4000倍后的HRP标识抗兔IgG(MBL公司制造)100μl，在室温下振荡1小时。利用PBS清洗后，使悬浮于0.01％H2O2、0.1MNa2PO4、0.1M柠檬酸(pH5.1)的OPD(WAKO公司制造)反应，确认显色后，添加2N H2SO4，使反应停止，利用SpectraMaxM2(Molecular Devices公司制造)在490nm的波长下测定吸光度。
3.抗体的纯化
(1)向纯化用载体的转移
为了制成scFv-FLAG/His的形态，向His/FLAG表达载体转移。FLAG tag用于利用FACS的检测用，His-tag用于利用柱的纯化用。
(2)转化
利用SalI(Takara Bio公司制造)消化所分离的抗体克隆DNA后，利用T4 DNA连接酶(ligase)进行连结反应，之后利用感受态细胞DH5α(TOYOBO公司制造)进行转化，将其铺在LBGA培养板上。在30℃进行培养过夜，将得到的菌落利用2×YTAG培养后，将一部分利用2×YTAI进行培养，离心，制备上清液。
(3)scFv-FLAG/His表达的确认
在抗原培养板上加入培养上清液100μl，在室温下振荡1小时后，利用PBS进行清洗。在进行His-tag的表达确认时，使利用0.05％Tween20/PBS稀释4000倍后的anti-HisHRP标识抗体反应，在室温下振荡1小时。在进行FLAG-tag的表达确认时，以Anti-FLAG(DDDK)抗体、HRP标识抗体的顺序使其反应。
利用PBS清洗抗原培养板后，使悬浮于0.01％H2O2、0.1MNa2HPO4、0.1M柠檬酸(pH5.1)的OPD(WAKO公司制造)反应，确认显色后，添加2NH2SO4，使反应停止，利用SpectraMaxM2(Molecular Devices公司制造)在490nm的波长下测定吸光度。
(4)抗体的粗纯化
将之前培养的菌液2mL加入到100mL的2×YTAI中，在30℃培养过夜。将其离心(8000rpm、10min、4℃)，回收上清液，加入饱和硫酸100mL，进行搅拌。将其离心(8000rpm、20min、4℃)，将所得到的沉淀悬浮于PBScomplete 10.5mL。将其离心(12000rpm、1h、4℃)后，在上清液中加入利用PBS平衡化的Ni Sepharose excel(GE Healthcare)1mL，在4℃培养过夜。将试样填充到柱中，利用0.5MNaCl PBS、20mM咪唑·0.5MNaCl PBS进行清洗，利用250mM咪唑·0.5MNaCl PBS进行洗脱。利用PBS进行透析，透析结束后，利用Amicon Ultra10K(Millipore公司制造)进行浓缩。使用试样的一部分，进行SDS-PAGE，进行CBB染色，确认条带，判定粗纯化后的抗体的蛋白浓度。
(5)使用AKTA Prime plus的His-tag蛋白的纯化
将粗纯化后的抗体，通过AKTA Prime plus(GE Healthcare)，使用HisTRAP柱进一步进行纯化。步骤按照附带的His-tag纯化操作手册(protocol)进行。回收出现峰的组分(Fraction)，利用SDS-PAGE进行确认。
4.解离常数(KD值)的测定
纯化的抗体的KD值使用BiacoreX100(GE Healthcare)进行测定。配体的固相化使用生物素捕获试剂盒(Biotion capture kit)(GE Healthcare)。
(1)配体的固相化
在传感芯片CAP上将HLA-A2-MAGE-A4 p230固相化。利用HBS缓冲液调整为200nM，以成为适当的RU(共振单位：resonance unit)的方式进行固相化。
(2)分析物溶液的调整
将纯化的抗体利用HBS EP+缓冲液调成为12.5nM、25nM、50nM、100nM、200nM的浓度。
(3)KD值的测定
在传感芯片的流通槽(Flow cell)中流通分析物溶液，测定180秒的结合反应。接着切换为HBS缓冲液，测定300秒的解离反应。测定采用将分析物从低的浓度连续流通的单循环法的程序进行。
关于全部的浓度，反应结束后，使用曲线拟合的程序计算结合常数。
5.利用流式细胞仪的解析(FACS)
(1)使用设备
在流式细胞仪的测定中使用FACS Calibur/FACS Cant/FACS CantII(BD)。
(2)使用的荧光标识抗体
作为荧光标识抗体，使用表1所示的抗体。
[表1]
荧光标识 抗原 克隆 制造商名称
FITC CD8 HIT8a BD bioscience
APC CD4 RPA-T4 Biolegend
APC CD8 RPA-T8 Biolegend
APC 107a H4A3 Biolegend
APC-Cy7 CD4 RPA-T4 Biolegend
APC-Cy7 CD8 RPA-T8 Biolegend
perCP-Cy5.5 CD8 RPA-T8 Biolegend
PE-Cy7 TNF-α MAb11 eBioscience
V450 IFN-Y 4S.B3 eBioscience
(3)四聚体PE
四聚体PE(Tetramer-PE)是指在链霉亲和素-PE上结合4个生物素化的单体而得到的物质，用于抗原特异性T细胞的检测。使用的四聚体为A2-MAGE-A4 p230四聚体和A2-NY-ESO-1 p157四聚体。
6.HLA稳定性检测(stability assay)和scFv结合性检测(binding assay)
(1)T2细胞(HLA-A*02+人B-T杂交淋巴母细胞株)
T2细胞为抗原加工相关转运体(Transporter Associated with AntigenProcessing)(TAP)缺陷株，具有细胞内蛋白没有提呈于HLA的特征。
(2)向T2细胞的肽脉冲(peptide pulse)
在人RPMI1640中，加入最终浓度10μM的肽，在室温下放置15分钟，加入20％FCS人RPMI1640，使FCS成为10％。利用CO2培养箱在37℃培养45min后，进行2次清洗后，用于测定。
(3)HLA稳定性检测(stability assay)
在进行了肽脉冲的T2细胞中使抗HLA-A2 Alexa Fluor488反应1小时，利用FACS进行检测，由此测定在T细胞表面上稳定化的HLA的量。
(4)scFv结合性检测(binding assay)
在进行了肽脉冲的T2细胞中使获得的抗体反应1小时，使抗FLAG抗体反应1小时，使抗小鼠FITC抗体反应1小时，利用FACS进行检测。
(5)1个氨基酸置换肽和危险型肽
如表2所示，在MAGE-A4p230-239的10个氨基酸序列中，将1处的氨基酸利用丙氨酸(A)、蛋氨酸(M)、苯丙氨酸(F)或色氨酸(W)进行置换，合成1个氨基酸置换肽，研究各肽的IC50。各肽利用DMSO进行调整，使得最终浓度为10mM。
MHC IC50为通过IEDB(http://tools.immuneepitope.org/processing/)计算的理论值，数字越低表示HLA-A*0201与肽的结合越强。
表2中表示1个氨基酸置换肽的氨基酸序列和IC50。
[表2]
表3表示利用BLAST搜索从与MAGE家族(family)肽和MAGE#17抗体的识别相关的氨基酸中选出的危险型肽的氨基酸序列和IC50值。
[表3]
Figure BDA0002304147470000221
7.CAR的构建和载体的构建
(1)MAGE#17 28z CAR
图1表示CAR的构建的序列图像。在该构建中，从5'侧连接前导序列(Leader)、VH、VL、CL、CD28TM、CD28ICD(CD28的胞内结构域)和CD3zeta(CD3ζ)链。其中，VH、VL为MAGE#17scFv。
(2)CAR的构建
图2示意地表示CAR的构建步骤。如下所述，说明各步骤。
首先，将scFv-cp3作为模板，通过PCR反应在VH-VL的5'侧加接具有EcoRI识别部位的前导序列(Leader)，在3'侧加接具有AscI识别部位的CL。接着，将该PCR产物利用EcoRI和AscI进行处理而得到的片段和将28z CAR载体利用EcoRI和AscI进行处理而得到的片段利用连接酶进行反应，得到CAR 28z。
8.人淋巴细胞制备
关于人淋巴细胞，从由健康的捐助者提供的血液，使用Ficoll-PaqueTM PLUS(17-1440-03、GE Healthcare)，分离PBMC(外周血单核细胞，Peripheral Blood Mononuclearcells)而得到。用于本研究的人外周血等检测体的采集、解析按照赫尔辛基宣言而进行，全部按照三重大学医学部研究伦理委员会所承认的协议书，并得到了被检验者本人的书面同意书而实施。
将采集的检验体保存在标以无法特定本人的密码且实施了防盗处理的冰箱、液氮罐中。关于被检验者个人信息是匿名的，并采取严格、谨慎的处理措施，以防止将个人隐私、基因解析的结果泄露到外部。
9.利用电穿孔法向细胞导入mRNA
(1)mRNA的制备
将制备的CAR的DNA切断成单链，制备线性DNA模板。使用Wizard SV Gel and PCRClean-UP System(Promega)的试剂盒进行DNA的纯化。对于纯化得到的试样，使用mMESSAGEmMACHINE T7 Ultra试剂盒(Life technologies)进行mRNA的制备。
(2)利用生物分析仪进行确认
使用生物分析仪(Agilent Technologies)，确认mRNA的polyA加接。
(3)PBMC培养板的制备
利用ACD-A液(TERUMO)进行稀释，使Anti-CD3抗体(OKT-3 eBioscience)的最终浓度为5μg/mL，使RetroNectin(Takara Bio)的最终浓度为25μg/mL，之后向12孔板(Nunc)的各孔中加入400μL，利用CO2培养箱在37℃静置5-10小时。
(4)CM(培养基：caluture medium)的制备
向淋巴细胞用培养基GT-T503 50mL中加入人(human)IL-2(600IU)50μL、人血白蛋白(Albuminar)(25％HAS)400μL、淋巴细胞供体的血浆(plasma)300μL，将得到的物质作为PBMC培养的培养基。
(5)PBMC的分离和培养
将由健康人血液使用Ficoll分离得到的外周血单核细胞(peripheral bloodmononuclear cells、PBMC)以成为2×105个/mL的方式利用CM悬浮，将2.5mL加入培养板，利用CO2培养箱在37℃培养4天。
(6)电穿孔
在分离10天后的PBMC中利用电穿孔导入制备的mRNA。导入后，在24小时以内用于测定。
10.利用逆转录病毒向细胞导入基因(转染实验)
(1)利用包装(Packaging)细胞plat-A进行的逆转录病毒的制备
使用FuGENE(promega)向包装(Packaging)细胞plat-A导入CAR的基因，培养两天后，回收上清液，制成病毒液。
(2)PBMC的分离和培养
按照与上述9.(3)～(5)相同的步骤进行。
(3)逆转录病毒转染用培养板(plate)的制备
利用ACD-A液稀释RetroNectin，调整成最终浓度20μg/mL。将其向24孔板的各孔中加入500μL，在4℃以O/N进行静置。在加入病毒液之前，利用ACD-A进行2次清洗。
(4)转染用逆转录病毒培养板(plate)制备、向细胞的转染
将上述10.(1)制备的病毒液1mL放置于逆转录病毒转染用培养板(plate)，以2000×g、32℃离心2小时，将病毒涂布于培养板。接着，将其利用1.5％人血白蛋白/PBS进行2次清洗。
(5)PBMC的逆转录病毒转染CAR-T细胞的制备
回收上述10.(2)中培养的PBMC，利用CM稀释成4×105个/mL后，将950μl铺在逆转录病毒转染用培养板(plate)上，以1000×g、32℃离心10分钟后，在CO2培养箱中以37℃进行培养。
制备的CAR-T细胞从PBMC的分离开始数第12～14天用于测定。
(6)对照细胞的制备
将上述10.(2)中培养的细胞的一部分作为对照细胞(没有进行基因导入操作的细胞)使用。
11.用于体外(in vitro)实验的肿瘤细胞系(tumor cell line)的特征
在本实施方式中，将用于体外(in vitro)实验的细胞系的特征表示在表4中。
[表4]
细胞系 A2 A24 MAGE-A4
NW-MEL-38 + - 6.01E+03(+)
LB-23 + + 1.95E+03(+)
LC-1/sq - + 1.61E+03(+)
MEL72 + + 4.00E-01(-)
HCT116 + - -
T2 + - -
SK-MEL-37 + - +
12.IF-γ释放测定(release assay)
使用eBioscience的试剂盒，利用ELISA对培养液中含有的IFN-γ的量进行测定。
利用精制水将10×涂布缓冲液(Coating buffer)稀释10倍，制备涂布缓冲液。向涂布缓冲液12mL中添加一次抗体48μL，在96孔平底板上添加100μL/孔。将其在4℃静置一晚后，利用0.05％PBS-T清洗5次。利用精制水将5×检测稀释液(Assay diluents)稀释5倍，制备检测稀释液。加入检测稀释液200μL/孔。在室温下密封1小时后，利用0.05％PBS-T清洗5次。对于IFN-γ，将最高浓度调整为1000pg/mL，将其每2倍以7阶段稀释，制成标椎样。将试样和标准样放置于培养板上，在室温下反应2小时后，利用0.05％PBS-T清洗5次。向检测稀释液12mL中添加二次抗体48μL，每孔加入100μL。在室温下反应1小时后，利用0.05％PBS-T清洗5次。向检测稀释液12mL中添加链霉亲和素(Streptavidin)-HRP48μL，添加100μL/孔。在暗处、在室温下反应30分钟后，利用0.05％PBS-T清洗7次。每100μL加入TMB底物溶液(substrate solution)，在暗处、在室温下反应15分钟后，每50μL加入0.18M H2SO4，终止反应。立即利用酶标仪型号(microplate reader Model)680(Bio-Rad)以波长450nm进行计测。
13.细胞内细胞因子染色(intracellular cytokine staining)(ICS)
将靶细胞调整为1×105个/mL，将效应(effector)细胞调整为1×105个/mL。将APC抗人(Anti human)CD107a对每1试样添加0.5μL，以靶细胞:效应细胞＝1:1在96孔板(U)以37℃进行1小时共培养。之后，向各孔分别加入0.7μL golgistop(Protein TransportInhibitor)，在37℃培养4小时。将各孔的细胞移到V型96孔板，以1200rpm、4℃离心5分钟后，利用0.5％BSA/PBS清洗2次。对各孔分别加入0.5μL APC-cy7抗人(Anti-Human)CD4和FITC抗人(Anti-Human)CD8，遮光下在冰上静置20分钟，利用0.5％BSA/PBS清洗2次。添加细胞固定液(cytofixl cytoperm：BD)100μL，在遮光条件下在冰上静置20分钟后，添加perm/wash(BD)100μL进行离心。之后，利用perm/wash液，进行2次清洗。对各孔分别添加0.5μL的V450 IFN-γ、PE-Cy7 TNF-α。在遮光条件下，在冰上静置30分钟后，利用0.5％BSA/PBS进行2次清洗。之后，利用FACSCanto II流式细胞仪(BD)进行测定，利用FACS Diva Software(BD)进行解析。
14.利用APC的长肽的摄取交叉提呈
(1)MAGE-A4长肽
MAGE-A4长肽的氨基酸序列为NYKRCFPVIF GKASEGVYDG REHTVYGEPR KAETSYVKVLEHVVRVNARV RI(序列号28)，分子量为6006.811。该长肽连结A24 MAGE-A4 143-151表位(NYKRCFPVI：序列号29)、A2 MAGE-A4 230-239表位(GVYDGREHTV：序列号1)和辅助表位(AETSYVKVLE HVVRVNARVR I：序列号30)而设计。
(2)CHP-长肽
CHP-长肽是指在作为药物输送系统(Drug delivery system)的CHP纳米凝胶中包含MAGE-A4长肽而得到的长肽。通过使用该物质，能够期待细胞性免疫诱导(非专利文献5)。
(3)CD3阴性珠选择(negative beads selection)
将人淋巴细胞每1×107个悬浮于2％FCS/PBS 80μL。在其中加入CD3微珠(MicroBeads)(Miltenyi Biotec)20μL，充分混合。制成遮光状态，在4℃反应15分钟后，利用10倍量的2％FCS/PBS清洗。将细胞悬浮于2％FCS/PBS 3mL，制作细胞悬浮液。在安装有MACS柱的MACS分离器(Separator)中流通细胞悬浮液。将通过柱的组分作为CD3阴性组分，作为APC使用。
15.细胞毒性测定(Cytotoxicity assay)
(1)Cr释放测定(release assay)
利用离心收集靶标细胞，制成1×106个细胞悬浮于50μL 100％FCS的状态。向其中添加50μCi(3.7×106Bq)的51Cr，在CO2培养箱中以37℃培养1小时。效应细胞根据ETratio利用10％FCS·RPMI1640调整细胞数，接种于U字型96孔板。培养结束后，利用10％FCS·RPMI1640清洗3次。利用10％FCS·RPMI1640以成为1×105个/mL的方式使细胞悬浮，以成为1×104个/100μL/孔的方式在U字型96孔板上接种。在CO2培养箱中以37℃培养8小时。培养结束后，以1200rpm、4℃离心5分钟，在读取用板上移入上清液30μL，通过风干一晩使之干燥。利用闪烁计数器MicroBeta2(PerkinElmer)测定51Cr的量。细胞杀伤活性的计算利用下述式求得。最大释放值(maximam release)为添加100μL的1％NP-40时的测定值。
细胞杀伤活性(％)＝100×(测定值(cpm)－自发释放值(cpm))/(最大释放值(cpm)－自发释放值(cpm))
16.使用NOG小鼠的体内(in vivo)癌症治疗模型实验
(1)使用小鼠
NOG小鼠(NOD/Shi-scid、IL-2RγKO Jic)从日本Clea株式会社购入。实验使用雌小鼠，在7-8周龄时用于实验。使用实验动物的T细胞输注疗法、基因免疫疗法的研究被三重大学的重组DNA实验审查委员会、三重大学医学部研究伦理委员会、动物实验审查委员会承认。小鼠在三重大学生命科学研究支援中心动物实验设施饲养。
(2)人肿瘤的移植和放射线全身照射(TBI)
作为前治疗，在细胞输注的前日向NOG小鼠进行放射线全身照射(TBI)2.5Gy。通过该前治疗，使受体体内的淋巴细胞数减少，成为容易植入所输注的供体淋巴细胞的状态。所输注的CAR-T细胞和人淋巴细胞设为1×107个/只。各细胞由尾静脉输注给NOG小鼠。体重每隔2-3天进行测定。
向NOG小鼠的肿瘤的移植在输注CAR-T细胞的7天前进行，向小鼠右体侧以2.5×106个/只皮下注射NW-MEL-38(A2阳性MAGE-A4阳性)，向小鼠左体侧以2.5×106个/只皮下注射HCT116(A2阳性MAGE-A4阴性)。肿瘤径每隔2-3天进行测定。
(3)输注细胞的制备
输注用的CAR-T细胞按照上述“10.利用逆转录病毒向细胞导入基因”的方法进行制备。
(4)利用眼眶采血得到的小鼠外周血中的PBMC分离
由小鼠的眼眶收集外周血，使用Ficoll分离PBMC。使用A2-MAGE-A4四聚体、人CD4CD8荧光抗体进行染色，利用FACS确认输注的细胞。
(5)TIL(肿瘤浸润性淋巴细胞：tumor infiltrating lymphocytes)的确认
将从小鼠收集的肿瘤捣碎，使用A2-MAGE-A4四聚体、人CD4CD8荧光抗体进行染色，利用FACS确认输注的细胞。
(6)免疫染色
将从小鼠切除的癌利用液氮冷冻，利用低温箱制备冷冻切片。利用DAPI、人CD4-FITC、人CD8-FITC进行染色，利用荧光显微镜进行观察。
17.使用导入zG型CAR的CD8阳性T细胞和导入4-1BBz型CAR的CD8阳性T细胞的体外试验
确认由于ICD部分的不同而产生的CAR-T细胞的效果。具体而言，制备从CD28的ICD部分(28z)改变为GITR的ICD部分(zG)和CD137的ICD部分(4-1BBz)的CAR，确认其效果。CARzG如图21所示，作为ICD，代替CD28的ICD部分，使用GITR(糖皮质激素诱导肿瘤坏死因子受体)。同样地，代替CD28的ICD部分，使用CD137(4-1BBz)的ICD部分。
作为对照，使用CAR非导入CD8阳性T细胞(NGMC)。
＜试验结果＞
1.识别HLA-A2-MAGE-A4的抗体的分离和评价
已知MAGE-A4(HLA-A2-MAGE-A4)在黑色素瘤中进行高表达。因此，通过使用人抗体库的筛选，来分离识别MAGE-A4的多个抗体。抗体的分离使用噬菌体展示法。在该方法中，作为噬菌体衣壳蛋白cp3的一部分，提呈scFv，利用ELISA，能够拉取对抗原显示高结合性的克隆。挑选约1500个克隆，在scFv-CP3的状态下进行ELISA。选择与作为阳性靶标的HLA-A2-MAGE-A4反应而不与作为阴性靶标的A2-CMV反应的抗体。对于选择的抗体，进行结合特异性的研究，因此使用多个肽-MHC复合体(pMHC)进行ELISA。将HLA-A2-MAGE-A4 p230、MAGE-A4p286、MAGE-A3 p195、CMV、MelanA、GP3、HTLV-1p11、NY-ESO-1p157、NY-ESO-1p159、Foxp3p69、Foxp3 p127、Foxp3 p390、IDO p41、IDO p41、IDO p195、IDO p199的各pMHC单体固相化，利用选择的抗体进行ELISA。图3表示ELISA的结果的一例。
比较对HLA-A2-MAGE-A4显示强的结合性的克隆的序列，结果得到了对HLA-A2-MAGE-A4显示特异性反应的15个克隆。其中，将结合力高的克隆5个克隆、即MAGE#17、#86、#209、#345、#672作为候补克隆进行解析。
接着，对MAGE#17抗体，进行利用BiacoreX100的KD值的测定。利用Biacore的KD值测定通过测定检测敏感度(反映共振、芯片上的质量变化)相对于时间经过的动态变化而求得。由动态变化的曲线求出解离速度常数(Kd)和结合速度常数(Ka)，由该2个常数的比求出其结合常数。测定的结果是：MAGE#17的结合常数为22nM(图4)。
2.针对获得的抗体对A2-MAGE-A4复合体的识别特异性和危险型抗原的研究
T2细胞为抗原加工相关转运体(Transporter Associated with AntigenProcessing)(TAP)缺陷株，细胞内蛋白没有提呈于HLA。向T2细胞脉冲肽时，T2上的HLA稳定化，因此通过使用被荧光标识的抗HLA抗体，能够确认HLA表达量，可知该肽对HLA以何种程度结合。
使脉冲了MAGE-A4p230、CMV、DMSO的各肽的T2细胞与获得的抗体MAGE#17、#86、#209、#345、#672反应，利用FACS确认偏移量。只在脉冲了MAGE-A4 p230的T2细胞中，在获得的抗体克隆MAGE#17、#86、#209、#345、#672的全部中确认到偏移量的变化(图5)。
接着，为了研究与抗体的识别相关的氨基酸，制备将MAGE-A4 p230(GVYDGREHTV：序列号1)的氨基酸每1个置换成其他的氨基酸(主要为丙氨酸)而得到的肽，利用IEDB(免疫表位数据库：ImmuneEpitope Database)研究与HLA-A*0201的结合力，求得MHC IC50(表2)。MHC IC50为利用IEDB计算的理论值，数字越低表示HLA-A*0201与肽的结合越強。向T2细胞中脉冲经丙氨酸置换的肽，利用FACS测定T2细胞表面上的HLA的量(图6)。肽越强地与HLA结合，peptide-HLA的结构越稳定，FACS的偏移量越增加，因此，MFI的值为肽与HLA的结合力的指标。除了一部分的肽以外，MFI的值与MHC IC50值相互对应。
接着，向T2细胞中脉冲经丙氨酸置换的肽，使MAGE#17反应，研究与抗体的识别相关的氨基酸(图7)。在1A、2A、3A、4A、5A、6A、8A中，MFI的值降低了，因此判断该7个氨基酸与识别相关。利用GVYDGRxHxx的氨基酸序列进行BLAST搜索，提取成为危险型的肽(表3)。将危险型肽脉冲给T2细胞，利用FACS测定T2细胞表面上的HLA的量。与图6所示的结果同样，MFI的值与MHC IC50的值对应(图8)。
接着，将危险型肽脉冲给T2细胞，使MAGE#17反应，确认到没有识别危险型肽(图9)。在其他的克隆#86、#209、#345、#672中也实施同样的测定，结果，与识别相关的氨基酸的数量最多的克隆为#17。因此，将MAGE#17作为最终的候补。
表示MAGE#17的碱基序列(序列号31)和肽序列(序列号32)。
MAGE#17的碱基序列(序列号31)：
Figure BDA0002304147470000301
Figure BDA0002304147470000302
Figure BDA0002304147470000311
MAGE#17的氨基酸序列(序列号32)：
Figure BDA0002304147470000312
Figure BDA0002304147470000313
上述各序列如下所示，成为结合了VH(序列号33)、sc(序列号34)和VL(序列号35)的碱基序列、以及VH(序列号36)、sc(序列号37)和VL(序列号38)的氨基酸序列的序列。
VH的碱基序列(序列号33)：
Figure BDA0002304147470000314
sc部分的碱基序列(序列号34)：
Figure BDA0002304147470000316
Figure BDA0002304147470000317
VL部分的碱基序列(序列号35)：
Figure BDA0002304147470000318
Figure BDA0002304147470000319
Figure BDA0002304147470000321
VH部分的氨基酸序列(序列号36)：
Figure BDA0002304147470000322
sc部分的氨基酸序列(序列号37)：
Figure BDA0002304147470000324
VL部分的氨基酸序列(序列号38)：
Figure BDA0002304147470000326
3.MAGE#17CAR特异性识别靶癌症细胞，IFN-γ的产生增多
由于确认了抗体克隆MAGE#17的特异性，将MAGE#17替换到CAR的载体上。接着，制备mRNA，利用生物分析仪确认后，利用电穿孔法，向人外周血淋巴细胞(PBMC)导入CAR的基因。利用四聚体染色确认导入的CAR是否正常表达。其结果，CAR-T细胞的CAR阳性率在CD8中为98.8％，在CD4中为98.5％(图10)。将CAR-T细胞和进行了肽脉冲的T2细胞共培养24小时，测定培养上清液中所包含的IFN-γ，对脉冲了MAGE-A4的T2细胞特异性使IFN-γ的产生增多。使用对照细胞(没有进行基因导入的细胞)，进行同样的试验。另外，作为靶细胞的A2阳性MAGE-A4阳性的NW-MEL-38、LB-23与作为脱靶的LC-1/sq、MEL72相比，发现肿瘤特异性的IFN-γ的产生(图11)。
利用mRNA的CAR的表达是瞬时性的，因此为了进行恒定的CAR的表达，利用逆转录病毒进行基因导入。构建CAR导入的逆转录病毒载体，通过包装(packaging)细胞plat-A制备逆转录病毒，对PBMC转染，由此制备CAR-T细胞。基因导入按照上述“10.利用逆转录病毒向细胞导入基因”的方法进行。利用四聚体染色确认CAR的表达。其结果，CAR-T细胞的CAR阳性率在CD8中为59.3％，在CD4中为49.5％(图12)。
将利用逆转录病毒导入了基因的CAR-T细胞和进行了肽脉冲的T2细胞共培养24小时，测定培养上清液中所包含的IFN-γ，对脉冲了MAGE-A4的T2细胞特异性使IFN-γ的产生增多。使用对照细胞(没有进行基因导入的细胞)，进行同样的试验。另外，作为靶细胞的A2阳性MAGE-A4阳性的NW-MEL-38、LB-23与作为脱靶的LC-1/sq、MEL72相比，发现肿瘤特异性的IFN-γ的产生(图13)。利用mRNA、逆转录病毒载体导入CAR基因中，确认了两者都表达CAR，特异性识别肿瘤，产生了IFN-γ。
4.基因导入了MAGE#17CAR的CAR-T细胞特异性识别靶癌症细胞，显示了细胞杀伤性活性
CAR-T细胞将在癌症细胞上表达的A2-MAGE-A4识别为抗原而活化，发挥细胞杀伤活性，能够期待杀伤靶标细胞。作为T细胞的活化的指标已知的分子，有IFN-γ、TNF-α、CD107a等，这些伴随T细胞的活化而表达增加。因此，进行了与进行肽脉冲的T2细胞、靶细胞共培养的MAGE#17CAR的细胞内细胞因子染色(intracellular cytokine staining：ICS)。
其结果，在与脉冲了MAGE-A4p230的T2细胞的共培养中，由IFN-γ、TNF-α、CD107a染色的CAR-T细胞的比例增加(图14)。另外，在与靶细胞的共培养中，在与A2阳性MAGE-A4阳性的NW-MEL-38、LB-23的共培养中，由IFN-γ、TNF-α、CD107a染色的CAR-T细胞的比例增加(图15)。
5.由于摄入MAGE-A4长肽的抗原提呈细胞(antigen presenting cell：APC)的抗原提呈，CAR-T细胞的IFN-γ的产生增多
从健常人的外周血分离PBMC，使用CD3磁珠，进行负选，将CD3-的组分作为抗原提呈细胞(antigen presenting cell：APC)使用。作为提呈MAGE-A4p230的APC，使用A2-APC，作为负对照的APC，使用A24-APC。加入MAGE-A4长肽、CHP-MAGE-A4长肽，使最终浓度为10μM，进行一晩培养，与CAR-T共培养24小时。向CAR-T细胞导入基因按照上述“10.利用逆转录病毒向细胞导入基因”的方法进行。其结果，在与向A2-APC中脉冲了MAGE-A4长肽的细胞共培养中，培养上清液中所含有的IFN-γ的值上升了(图16)。
MAGE-A4长肽被摄入到APC中，MAGE-A4p230被交叉提呈于MHC-class I，确认到识别其的CAR-T的IFN-γ产生特异性增多。另一方面，在作为药物输送系统的CHP纳米凝胶所包含的CHP-MAGEA4长肽中，没有发现IFN-γ的特异性产生。
6.基因导入了MAGE#17CAR的CAR-T细胞特异性杀伤靶癌症细胞
通过51Cr释放测定(release assay)确认是否产生MAGE#17CAR的特异性细胞杀伤活性。将CAR-T细胞与靶癌症细胞的比率记为ET比(效应器/靶的比例)，将摄取了铬的靶癌症细胞和CAR-T细胞以ET比为10:1、3:1、1:1共培养8小时，由上清液所含有的51Cr的放射线量的值求得细胞杀伤率(％裂解，％lysis)。向CAR-T细胞导入基因按照上述“10.利用逆转录病毒向细胞导入基因”的方法进行。
其结果，在脉冲了MAGE-A4 p230肽的T2细胞中，确认到MAGE-A4特异性的细胞杀伤(图17)。另外，在靶细胞中也确认到对A2阳性MAGE-A4阳性的NW-MEL-38的特异性的细胞杀伤(图18)。
7.小鼠癌症治疗模型
(1)使用NW-MEL-38和HCT116的模型
NOG小鼠因为缺损公共γ受体，因此不存在NK细胞。因此，关于人细胞和人组织的植入性，与NOD-SCID小鼠相比显著高，能够高效地植入人的癌组织和人正常组织。另外，在移植人造血干细胞后，能够确认到人T细胞的分化，因此作为人免疫系统模型小鼠的需求提高。作为NOG小鼠的特征，可以列举T细胞和B细胞的缺失、自然杀伤(NK)细胞的缺失、树突状细胞功能的下降、巨噬细胞功能的下降、补体活性的缺失、没有发现伴随老化的T细胞和B细胞的漏出(leakiness)。
关于NOG小鼠，向右体侧以2.5×106个/只皮下注射NW-MEL-38(A2阳性MAGE-A4阳性)，向左体侧以2.5×106个/只皮下注射HCT116(A2阳性MAGE-A4阴性)。在肿瘤移植后第6天，作为前治疗，进行放射线全身照射(TBI)2.5Gy。利用TBI，使受体体内的淋巴细胞数减少，成为容易植入输注的供体淋巴细胞的状态。第7天，由尾静脉以细胞数1×107个/只输注MAGE#17CAR-T细胞和人淋巴细胞。向CAR-T细胞导入基因按照上述“10.利用逆转录病毒向细胞导入基因”的方法进行。CAR阳性率在CD8中为36.3％，在CD4中为38.5％(图19)。
利用CAR-T细胞输注组(n＝2)、人淋巴细胞(CAR非导入)输注组(n＝2)、PBS组(n＝2)进行实验，每隔2-3天测定肿瘤径和体重。测定进行到肿瘤移植后第42天。
其结果，在CAR-T细胞输注组中，在小鼠#1和小鼠#2中能够确认到NW-MEL-38(A2阳性MAGE-A4阳性)的增殖抑制。另一方面，不能确认到HCT116(A2阳性MAGE-A4阴性)的增殖抑制。小鼠#1在肿瘤移植34天后死亡。死亡原因认为不是因肿瘤而死，而感染的可能性高(图20)。
(2)由于胞内结构域(ICD)的不同而产生的效果确认试验
接着，确认了由于ICD部分的不同而产生的CAR-T细胞的效果。在图21中表示CARzG的基因序列图。在CAR zG中，作为ICD，代替CD28的ICD部分，使用GITR的ICD部分。GITR是指糖皮质激素诱导肿瘤坏死因子受体，在使用该ICR的CAR中，已知针对CAR的表达量的细胞因子产生量能够变高(WO2013051718)。关于CAR zG，在图2的CAR 28z中，是通过将CD28 ICD部分变更为作为其他的ICD的GITR ICD，改变CAR 28z中的CD3ζ和ICD结构域的顺序而得到的。其他部分使用具有与CAR 28z同样的序列的部分。
向NOG小鼠以2.5×106个/只皮下注射NW-MEL-38(A2阳性MAGE-A4阳性)。在肿瘤移植后第3天，作为前治疗，进行放射线全身照射(TBI)2.0Gy。在第4天，对下述所示的A组～C组(n＝4)分别通过尾静脉以细胞数4×106个/只输注细胞或PBS、以及人淋巴细胞。向CAR-T细胞导入基因按照上述“10.利用逆转录病毒向细胞导入基因”的方法进行。A组给药PBS，B组给药MAGE#17CAR-T细胞(28z)，C组给药CAR-T细胞(zG)。
对于A组～C组，每隔2-3天测定肿瘤径和体重。测定进行到肿瘤移植后第24天。
其结果，在输注了ICH为28z和zG的任意种的CAR-T细胞的情况下，也能够确认到NW-MEL-38(A2阳性MAGE-A4阳性)的增殖抑制(图22)。这样可知，在本实施方式中，即使在改变胞内结构域，也能够得到同样的效果。
8.导入zG型CAR的CD8阳性T细胞和导入4-1BBz型CAR的CD8阳性T细胞的效果确认试验
(1)构建导入了zG型CAR和28z型CAR的逆转录病毒载体，利用包装(packaging)细胞plat-A制备逆转录病毒，转染于PBMC，由此制备CAR-T细胞。基因导入按照上述“10.利用逆转录病毒向细胞导入基因”的方法进行。利用四聚体染色确认CAR的表达。其结果，zG型CAR-T细胞的CAR阳性率在CD8中为99.1％，28z型CAR-T细胞的CAR阳性率在CD8中为99.8％(图23)。
(2)将通过逆转录病毒进行了基因导入的CAR-T细胞(4×104个)和进行了肽脉冲的T2细胞以及各种细胞系NW-MEL-38、SK-MEL-37、HCT116(分别为2×105个)共培养18小时，测定培养上清液中所含有的IFN-γ。如图24所示，在导入了zG型CAR和28z型CAR的CAR-T细胞中，对脉冲了MAGE-A4的T2细胞和NW-MEL-38细胞以及SK-MEL-37细胞特异性地使IFN-γ的产生增多。
使用对照细胞(没有进行基因导入的细胞)，进行同样的试验。在作为靶细胞的A2阳性MAGE-A4阴性的HCT116中，没有发现IFN-γ的产生。另外，在仅效应细胞(effector)(Effector-only)和仅靶标细胞(Target-only)的情况下，没有发现IFN-γ的产生。
这样，导入zG型CAR的CD8阳性T细胞在体外(in vitro)系统中诱导IFN-γ的产生。该结果能够很好地说明体内(in vivo)系统的结果。
(3)接着，进行与上述(1)和(2)同样的试验，对导入4-1BBz型CAR的CD8阳性T细胞的特性进行研究。如图25所示，在导入了4-1BBz型CAR的CAR-T细胞中，对脉冲了MAGE-A4的T2细胞特异性地使IFN-γ的产生增多。
在利用对照肽进行了刺激的T2细胞中，没有发现IFN-γ的产生。另外，在仅效应细胞(effector)(Effector-only)和仅靶标细胞(Target-only)的情况下，没有发现IFN-γ的产生。
这样，即使将ICD变更为4-1BBz型的情况下，也能够确认同样的效果。该体外(invitro)系统的数据能够容易说明体内(in vivo)系统的结果。
这样，即使在改变ICD的情况下，也能够确认到与zG型同样的效果。
这样，根据本实施方式，能够提供特异性识别来自MAGE-A4的肽/HLA-A2复合体的抗原结合性蛋白、编码抗原结合性蛋白的核酸、包含该核酸的载体、包含抗原结合性蛋白的嵌合抗原受体、编码嵌合抗原受体的核酸、包含该核酸的载体、表达嵌合抗原受体的细胞和包含该细胞的医药组合物。
特异性识别来自MAGE-A4的肽/HLA-A2复合体的抗原结合性蛋白能够用于细胞医疗、基因治疗的领域。另外，对表达来自MAGE-A4的肽/HLA-A2复合体的肿瘤细胞的检测、肿瘤的治疗及其研究、试验是极其有用的。由于本发明的CAR-T细胞的副作用非常少，因此，能够提供非常有效的癌症治疗方法。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1：Brentjens RJ,et al:Safety and persistence of adoptivelytransferred autologous CD19-targeted T cells in patients with relapsed orchemotherapy refractory B-leukemias.Blood 2011,118:4817-4828.
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序列表
<110> 国立大学法人三重大学
<120> 用于癌症治疗的CAR-T细胞
<130> JP2018001MIU
<150> JP2017-111157
<151> 2017-06-05
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tcctgcaagg cttctggagg caccttcagc agctatgcta tcagctgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggcttgagtg gatgggaggg atcatcccta tctttggtac agcaaactac 180
gcacagaagt tccagggcag agtcacgatt accgcggaca aatccacgag cacagcctac 240
atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagatccccc 300
cggcgggcat atcatgatgc ttttgatatc tggggccaag ggacaatggt caccgtctct 360
tcaggtggag gcggttcagg cggaggtggc agcggcggtg gcgggagttc ctatgagctg 420
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<223> MAGE #17的VH
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tcctgcaagg cttctggagg caccttcagc agctatgcta tcagctgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggcttgagtg gatgggaggg atcatcccta tctttggtac agcaaactac 180
gcacagaagt tccagggcag agtcacgatt accgcggaca aatccacgag cacagcctac 240
atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagatccccc 300
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tca 363
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<220>
<223> MAGE#17的VH
<400> 36
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Pro Arg Arg Ala Tyr His Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 37
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工合成
<220>
<223> MAGE#17的sc
<400> 37
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser
1 5 10 15
Tyr
<210> 38
<211> 104
<212> PRT
<213> 人工合成
<220>
<223> MAGE#17的VL
<400> 38
Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Met Ser Val Ala Pro Gly Lys Thr Ala
1 5 10 15
Ser Ile Thr Cys Gly Gly Asp His Ile Gly Ser Lys Ser Val His Trp
20 25 30
Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Val Tyr Asp Asp
35 40 45
Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser Asn Ser
50 55 60
Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met Asp Glu
65 70 75 80
Ala Asp Tyr Tyr Cys Leu Ala Trp Asp Ser Ser Thr Ala Ile Phe Gly
85 90 95
Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100

Claims (13)

1.一种抗原结合性蛋白，其特征在于：
将HLA-A2-MAGE-A4复合体识别为抗原，该抗原结合性蛋白包含以下的(A)或(B)的多肽：
(A)包含序列号36的VH(重链可变区)的氨基酸序列和序列号38的VL(轻链可变区)的氨基酸序列的多肽；
(B)包含与序列号36的VH(重链可变区)的氨基酸序列具有90％以上的同源性的氨基酸序列和与序列号38的VL(轻链可变区)的氨基酸序列具有90％以上的同源性的氨基酸序列的多肽。
2.如权利要求1所述的抗原结合性蛋白，其特征在于：
在VH与VL之间包含以下的(C)或(D)的多肽：
(C)包含序列号37的sc(单链)的氨基酸序列的多肽；
(D)包含与序列号37的sc(单链)的氨基酸序列具有90％以上的同源性的氨基酸序列的多肽。
3.如权利要求1或2所述的抗原结合性蛋白，其特征在于：
其为包含序列号32的氨基酸序列、或与序列号32的氨基酸序列具有90％以上的同源性的氨基酸序列的多肽。
4.如权利要求1～3中任一项所述的抗原结合性蛋白，其特征在于：
抗原结合性蛋白为Fab、Fab'、F(ab')2、Fv或单链Fv(scFv)。
5.一种编码权利要求1～4中任一项所述的抗原结合性蛋白的核酸。
6.一种载体，其特征在于：
包含权利要求5所述的核酸。
7.一种嵌合抗原受体，其特征在于：
包含权利要求1～4中任一项所述的抗原结合性蛋白和信号传导蛋白的胞内结构域。
8.如权利要求7所述的嵌合抗原受体，其特征在于：
信号传导蛋白为CD3zeta(CD3ζ)链或共刺激分子CD(GITR)中的任意种。
9.如权利要求8所述的嵌合抗原受体，其特征在于：
还包含CD28的胞内结构域或GITR的胞内结构域中的任意种。
10.一种编码权利要求7～9中任一项所述的嵌合抗原受体的核酸。
11.一种载体，其特征在于：
包含权利要求10所述的核酸。
12.一种表达权利要求7～9中任一项所述的嵌合抗原受体的细胞。
13.一种医药组合物，其特征在于：
含有权利要求12所述的细胞作为有效成分。
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