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BR112019025667A2 - proteína de ligação ao antígeno que reconhece o peptídeo derivado de mage-a4 - Google Patents

proteína de ligação ao antígeno que reconhece o peptídeo derivado de mage-a4 Download PDF

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BR112019025667A2
BR112019025667A2 BR112019025667-9A BR112019025667A BR112019025667A2 BR 112019025667 A2 BR112019025667 A2 BR 112019025667A2 BR 112019025667 A BR112019025667 A BR 112019025667A BR 112019025667 A2 BR112019025667 A2 BR 112019025667A2
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BR
Brazil
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cells
car
mage
antigen
seq
Prior art date
Application number
BR112019025667-9A
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Inventor
Hiroshi Shiku
Yasushi Akahori
Yuya Kato
Yoshihiro Miyahara
Original Assignee
Mie University
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Filing date
Publication date
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Abstract

  A presente invenção refere-se a células CAR-T que podem ser usadas na terapia de infusão de CAR, em que é utilizado um antígeno intracelular específico para o câncer. O problema é resolvido pelas células CAR-T para terapia de câncer fornecidas com um anticorpo que reconhece o complexo peptídeo derivado de MAGE-A4/HLA-A2, em que o anticorpo possui a sequência de aminoácidos da VH da SEQ ID NO: 36 e a sequência de aminoácidos da VL da SEQ ID NO: 38. Neste caso, o anticorpo é, de preferência, fornecido com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 32.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "PROTEÍNA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO QUE RECONHECE O PEPTÍDEO DERIVADO DE MAGE-A4". Campo Técnico
[001] A presente invenção refere-se à proteína de ligação ao antígeno que reconhece o peptídeo derivado de MAGE-A4 e similares. Antecedentes da Invenção
[002] Atualmente, os tumores malignos representam mais de 30% das mortes e são a principal causa de morte nos países desenvolvidos. Alguns tipos de câncer podem ser curados com assistência médica avançada, mas outros são difíceis de tratar. É uma tarefa urgente desenvolver novos tratamentos para o câncer. Para o tratamento de câncer, cirurgia, quimioterapia e radioterapia são três principais terapias. A combinação das três terapias é usada no tratamento do câncer.
[003] Recentemente, a quarta terapia de câncer chamada imunoterapia foi aprimorada, com foco na não invasividade e alta eficácia da imunoterapia. A imunoterapia é mais ou menos classificada em três tipos: vacinação, terapia com anticorpos e terapia com transfusão de células. Na terapia de transfusão de células, são conhecidos dois tipos de terapias. Uma é a terapia de transfusão de linfócitos transferidos pelo gene do receptor de células T, em que o gene do receptor de células T (TCR), que reage especificamente ao câncer, é induzido nos linfócitos do paciente in vitro e infundidos no paciente. A outra é a terapia de transfusão de células T específicas, em que um receptor de antígeno quimérico (CAR) que contém scFv como sítio de reconhecimento de antígeno e CD3ζ como molécula de transdução de sinal intracelular é transfundido para os linfócitos do paciente e os linfócitos são infundidos no paciente. Nestes tratamentos, uma vez que uma grande quantidade de linfócitos compreendendo a especificidade de um antígeno do câncer é produzida por transdução de genes em pouco tempo, terapias específicas de células T podem ser aplicadas a vários tipos de pacientes com câncer.
[004] A terapia de infusão do gene do TCR, em que o complexo peptídeo MHC (pMHC) é reconhecido pelas células T e as células cancerígenas são mortas, é segura e eficaz, e foi desenvolvida no mundo. No entanto, há um problema em que os clones de células T assassinas são extremamente difíceis de isolar.
[005] Por outro lado, existem três vantagens na terapia de infusão de CAR. (1) Vários pacientes podem receber a terapia, uma vez que células T transfectadas com CAR compreendendo o anticorpo de cadeia única (scFv), e o receptor de células T (TCR) e o domínio de sinalização de moléculas coestimulatórias podem reconhecer o antígeno cancerígeno MHC independentemente e atacar células cancerígenas, diferentes das células T originais, (2) células T CD4 positivas, bem como células T CD8 positivas e células não T podem ser afetadas para atuar, (3) maior afinidade é mantida em comparação com o TCR, para herdar a reatividade de um anticorpo. De fato, a terapia com CAR usando anticorpo anti-CD19 foi relatada com alta eficácia clínica para pacientes com leucemia e linfoma (Documento de não patente 1: documentos são resumidos no final). A molécula de CD19 também é expressa em células B, o desaparecimento de células B pode ser coberto pelo suplemento de imunoglobulina. Em geral, é ideal usar antígenos expressos apenas em células cancerígenas. No entanto, há um problema em que tais antígenos da superfície celular não foram observados atualmente.
[006] Por outro lado, são relatados antígenos específicos de câncer em moléculas intracelulares, incluindo antígeno e neoantígeno de câncer de testículo. No entanto, a terapia de infusão de CAR com antígenos intracelulares específicos para o câncer não é conhecida.
[007] Em vista de tais circunstâncias, os inventores isolaram anticorpos que reconhecem o complexo MHC e peptídeos derivados de antígenos intracelulares e construíram a imunoterapia com CAR utilizando o anticorpo. Apenas alguns anticorpos que reconhecem especificamente o complexo peptídeo/MHC foram relatados (documento de não patente 2). Se um anticorpo que reconhece especificamente o complexo peptídeo/MHC e as células CAR-T que matam especificamente células cancerígenas puder ser produzido, ele se tornaria uma terapia inovadora. O CAR que reconhece o complexo peptídeo/MHC pode ser utilizado para infusão de células CAR-T, e quando o peptídeo reconhecido especificamente pelas células CAR-T é infundido simultaneamente, a proliferação de células CAR-T pode ser esperada pela apresentação do antígeno.
SUMÁRIO Problemas a serem resolvidos pela invenção
[008] A invenção foi feita tendo em vista os problemas descritos acima, e seu objetivo é fornecer uma proteína de ligação ao antígeno que reconheça especificamente o complexo peptídeo derivado de MAGE-A4/HLA-A2. Meios para resolução dos problemas
[009] Foi utilizada a molécula MAGE-A4 como antígeno a ser apresentado ao MHC. MAGE-A4 é expresso em cânceres sólidos, incluindo melanoma maligno (Documento de não patente 3), e é CTA (antígeno de câncer de testículo) como NY-ESO-1. Essas moléculas são expressas apenas no testículo e na placenta, não observadas em outros tecidos normais. Depois que MAGE-A4 é expresso nas células, ele sofre degradação no proteassoma. Após a degradação, os peptídeos MAGE-A4 contendo 10 aminoácidos são produzidos, associados à HLA-A* 0201, beta-2 microglobulina no retículo endoplasmático e apresentados na superfície celular como um antígeno específico do câncer. Como o peptídeo apresentado no HLA- A* 0201, p230-239 (GVYDGREHTV: SEQ ID NO: 1) foi selecionado (documento de não patente 4).
[0010] Foram estabelecidos métodos para produzir uma célula CAR-T exibindo resposta específica para o câncer-alvo por transfecção de CAR que reconhece especificamente A2-MAGE-A4 em linfócitos humanos e para aplicar a célula à terapia de infusão de células para seres humanos. (1) Anticorpos que reconhecem o peptídeo derivado de MAGE-A4 e o complexo HLA-A2 com alta afinidade foram isolados, (2) a especificidade dos anticorpos foi examinada, (3) os anticorpos com alta especificidade foram rastreados, (4) as células CAR-T foram preparadas usando o anticorpo, foram ativadas especificamente pela célula cancerígena- alvo e a citotoxicidade causada foi confirmada. No modelo de terapia do câncer com camundongos transplantados com tumores humanos infundidos com células CAR-T in vivo, observou-se que as células CAR-T foram especificamente proliferadas no corpo do camundongo e infiltradas no tumor. Dessa forma, a invenção foi concluída basicamente.
[0011] Uma proteína de ligação ao antígeno na invenção é caracterizada compreendendo o seguinte polipeptídeo de (A) ou (B) e reconhecendo o complexo HLA-A2-MAGE-A4: (A) o polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos de VH (região variável da cadeia pesada) da SEQ ID NO: 36 e a sequência de aminoácidos de VL (região variável da cadeia leve) da SEQ ID NO: 38; (B) o polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos com pelo menos 90% de homologia de VH (região variável da cadeia pesada) da SEQ ID NO: 36 e a sequência de aminoácidos com pelo menos 90% de homologia de VL (região variável da cadeia leve) da SEQ ID
NO: 38. Neste momento, é preferencial que a proteína de ligação ao antígeno compreenda o seguinte polipeptídeo (C) ou (D) entre VH e VL: (C) o polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos de sc (cadeia única) da SEQ ID NO: 37; (D) o polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 90% de sc (cadeia única) da SEQ ID NO: 37. Além disso, é preferencial que a proteína de ligação ao antígeno compreenda o polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 32, ou o polipeptídeo com pelo menos 90% de homologia da SEQ ID NO: 32. É preferencial que a proteína de ligação ao antígeno seja Fab, Fab’, F(ab’)2, Fv ou Fv de cadeia única (scFv). No relatório descritivo, a proteína de ligação ao antígeno contém um anticorpo próprio ou um derivado de anticorpo.
[0012] Na invenção, homologia significa a relação entre duas (ou três ou mais) sequências de aminoácidos ou sequências nucleotídicas determinadas por comparação. Homologia significa o grau de correlação pelo alinhamento entre sequências de aminoácidos ou sequências nucleotídicas ou entre uma série de sequências parciais. Especificamente, é determinada pela identidade e retenção da sequência (substituição para manter as propriedades físico-químicas de um aminoácido ou sequência particular na sequência). O método para determinar a homologia é preferencialmente aquele que contrasta com o alinhamento mais longo entre as sequências. Para determinar a homologia, programas via internet, por exemplo, BLAST (Ferramenta Básica de Busca por Alinhamento Local) <https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi> são usados. O polipeptídeo com pelo menos 90% de homologia (de preferência, pelo menos 95%, com mais preferência, pelo menos 98%) da SEQ ID NO: 32, 36, 37, 38 e o reconhecimento do complexo HLA-A2-MAGE-A4 é preferencial.
[0013] Em outra invenção, um ácido nucleico codifica a proteína de ligação ao antígeno de acordo com a primeira invenção.
[0014] Em outra invenção, um vetor compreende o ácido nucleico. Em que o ácido nucleico inclui DNA ou RNA. O ácido nucleico pode ser de fita simples ou dupla. Os vetores incluem um vetor de plasmídeo e um vetor de vírus como similares.
[0015] Em outra invenção, um receptor de antígeno quimérico inclui a proteína de ligação ao antígeno e um domínio intracelular de uma proteína de transdução de sinal. Neste momento, a proteína de transdução de sinal é, de preferência, qualquer uma das cadeias CD3zeta (CD3ζ) e moléculas coestimuladoras CD (GITR). É preferencial compreender ainda qualquer um dos domínios intracelulares de CD28 e GITR.
[0016] Em outra invenção, um ácido nucleico codifica o receptor de antígeno quimérico. Em outra invenção, um vetor inclui o ácido nucleico.
[0017] Em outra invenção, uma célula expressa o receptor de antígeno quimérico. Em outra invenção, uma composição farmacêutica compreende a célula como um ingrediente ativo. Efeitos da invenção
[0018] De acordo com a invenção, uma proteína de ligação ao antígeno que reconhece especificamente o complexo peptídeo derivado de MAGE-A4/HLA-A2, ácidos nucleicos que codificam a proteína de ligação ao antígeno, vetores contendo os ácidos nucleicos, receptores quiméricos de antígeno que ligam a proteína de ligação ao antígeno, ácidos nucleicos que codificam são fornecidos o receptor de antígeno quimérico, vetores contendo os ácidos nucleicos, células que expressam o receptor de antígeno quimérico e composições farmacêuticas compreendendo as células são fornecidos. A proteína de ligação ao antígeno que reconhece especificamente o complexo peptídeo derivado de MAGE-A4/HLA-A2 pode ser usada em terapia celular e no campo da terapia genética. E a proteína é extremamente útil para a detecção de células tumorais que expressam o complexo peptídeo derivado de MAGE-A4/HLA-A2, para o tratamento, pesquisa e teste do tumor. Além disso, as células CAR-T da invenção podem ser utilizadas para uma terapia eficaz contra o câncer, uma vez que seus efeitos colaterais são pequenos.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[0019] A Figura 1 mostra a imagem da sequência de MAGE # 17 scFV.
[0020] A Figura 2 mostra a imagem da sequência genética para explicar o método de construção de CAR.
[0021] As Figuras 3 (A) e (B) mostram os gráficos de barras que ilustram os resultados da reatividade dos clones capturados por múltiplos antígenos avaliados por ELISA.
[0022] A Figura 4 mostra o gráfico de medição dos valores de KD de MAGE # 17. (A) mostra o gráfico de mudanças dinâmicas na sensibilidade da detecção ao longo do tempo, (B) mostra a tabela que mostra os resultados do cálculo dos valores de KD com base nos dados lidos no gráfico, respectivamente.
[0023] A Figura 5 (A) mostra o gráfico dos resultados da análise das quantidades de deslocamento obtidas pela reação dos anticorpos MAGE # 17, # 86, # 209, # 345 e # 672 às células T2 pulsadas com MAGE-A4p230, CMV e DMSO (B) mostra os gráficos de barra dos resultados.
[0024] A Figura 6 mostra o gráfico dos resultados da análise das quantidades de HLA na superfície das células T2 pulsadas com peptídeos substituídos por alanina, medidos por FACS.
[0025] A Figura 7 mostra o gráfico dos resultados da análise do aminoácido relacionado ao reconhecimento de anticorpos pela reação de MAGE # 17 a células T2 pulsadas com peptídeos substituídos por alanina.
[0026] A Figura 8 mostra o gráfico dos resultados da análise das quantidades de HLA da superfície das células T2 pulsadas com peptídeos de risco medidos por FACS.
[0027] A Figura 9 mostra o gráfico dos resultados da análise da reatividade com os peptídeos de risco por reação de MAGE # 17 a células T2 pulsadas com os peptídeos de risco.
[0028] A Figura 10 mostra os resultados da análise se o CAR (mRNA) introduzido nas PBMCs foi expresso ou não, por marcação com tetrâmero.
[0029] A Figura 11 mostra os gráficos dos resultados que as células CAR-T transfectadas com mRNA reconhecem especificamente as células-alvo e aumentam a produção de IFNy.
[0030] A Figura 12 mostra os resultados da análise se o gene de CAR (retrovírus) introduzido nas PBMCs foi examinado ou não, por marcação com tetrâmero.
[0031] A Figura 13 são gráficos que mostram que as células CAR- T transfectadas com retrovírus reconhecem especificamente as células-alvo e aumentam a produção de IFNy.
[0032] A Figura 14 é o gráfico que mostra que as células T transfectadas com MAGE # 17 CAR foram ativadas por cocultura com células T2 pulsadas com o peptídeo MAGE-A4.
[0033] A Figura 15 é o gráfico que mostra que as células T transfectadas com MAGE # 17 CAR foram ativadas por cocultura com células positivas para A2 MAGE-A4 positivo.
[0034] A Figura 16 mostra o gráfico dos resultados em que a produção de interferon por CAR-T foi aumentada quando as células apresentadoras de antígenos que incorporam peptídeos MAGE-A4 longos foram cocultivadas com CAR-T.
[0035] A Figura 17 é o gráfico que mostra que as células T2 pulsadas com o peptídeo MAGE-A4 têm a atividade citotóxica específica para MAGE-A4.
[0036] A Figura 18 é o gráfico que mostra que as células-alvo têm a atividade citotóxica específica para células positivas para MAGE positivas para A2.
[0037] A Figura 19 mostra os resultados do exame da taxa positiva de CAR de células CAR-T infundidas por marcação com tetrâmero.
[0038] A Figura 20 (A) é o gráfico que mostra os resultados dos efeitos das células CAT-T contra o tumor positivo para A2 positivo para MAGE-A4 (NW-MEL-38) e (B) é o gráfico que mostra os resultados dos efeitos das células CAR-T contra os tumores positivos para A2 negativos para MAGE-A4 (HCT116).
[0039] A Figura 21 mostra a imagem da sequência genética de CAR zG.
[0040] A Figura 22 são gráficos que mostram os resultados dos efeitos das células CAR-T com diferentes domínios intracelulares (CDI) contra tumores positivos para A2 positivos para MAGE-A4 (NW- MEL-38). (A) mostra o tamanho do tumor, (B) mostra os pesos corporais, respectivamente. As setas à esquerda nos gráficos mostram o dia do tratamento da irradiação corporal (TCE) (dia 3), as setas à direita mostram a data de administração dos linfócitos (dia 4), respectivamente.
[0041] A Figura 23 são figuras que mostram os resultados da análise das taxas positivas para CAR de células T positivas para CD8 sem CAR introduzido (NGMC: controle), células T positivas para CD8 com CAR tipo zG introduzido (zG) e células T positivas para CD8 com CAR tipo 28z introduzido (28z) por marcação com tetrâmero.
[0042] A Figura 24 é o gráfico que mostra os resultados da análise se as células CAR-T reconhecem especificamente as células-alvo e aumentam a produção de IFNy.
[0043] A Figura 25 é o gráfico que mostra os resultados da análise se as células CAR-T reconhecem especificamente as células-alvo e aumentam a produção de IFNγ.
DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO
[0044] A seguir, as modalidades da invenção serão descritas com referência a figuras e tabelas. O escopo técnico da invenção não é limitado por essas modalidades e pode ser implementado de várias formas sem alterar o resumo da invenção.
[0045] No relatório descritivo, o termo "anticorpo", "fragmento de ligação ao antígeno" refere-se à proteína de ligação ao antígeno no sistema imunológico. Um anticorpo que possui a região de ligação ao antígeno é uma glicoproteína compreendendo duas cadeias pesadas (cadeias H) e duas cadeias leves (cadeias L) ligadas entre si por ligações dissulfeto. Cada cadeia pesada inclui a região variável da cadeia pesada (VH) e a região constante da cadeia pesada (CH). A região constante da cadeia pesada é composta por três domínios, CH1, CH2 e CH3. Cada cadeia leve inclui a região variável da cadeia leve (VL) e a região constante da cadeia leve (CL). VL é composto pelo domínio CL. As regiões VH e VL podem ainda ser subdivididas em regiões de determinação de complementaridade (CDR) com regiões de hipervariabilidade e regiões estruturais (FR) com alguma extensão de sequência conservada. Em VH e VL, FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 e FR4, isto é, três CDRs e quatro FRs, estão dispostas do terminal amino ao terminal carboxila, respectivamente. Para a ligação ao antígeno, sabe-se que CDR3 é importante. Tanto VH quanto VL compreendem domínios de ligação que interagem com um antígeno.
[0046] Neste relatório descritivo, o termo "HLA" é o Antígeno Leucócitário Humano (antígeno de leucócitos humanos), significa o complexo principal de histocompatibilidade humana (MHC) e um complexo de genes que codificam moléculas de superfície celular necessárias para a apresentação de antígenos às células imunológicas. HLA pode ser classificado nas classes I e II. HLA de classe I é composto de cadeia α e β2-microglobulina. HLA de classe I é expresso em quase todas as células nucleadas e funciona para células T CD8 positivas na apresentação de antígenos. HLA classe I pode ser classificado em HLA-A, HLA-B e HLA-C.
[0047] Neste relatório descritivo, o termo "receptor de antígeno quimérico (CAR)" significa a proteína de fusão contendo um domínio extracelular que se liga a um antígeno, um domínio transmembrana diferente do domínio extracelular e pelo menos um de um domínio intracelular. CAR pode ser chamado de "receptor quimérico", "corpo T" ou "receptor imune quimérico (CIR)". "Domínio extracelular que se liga a um antígeno" significa qualquer oligopeptídeo ou polipeptídeo que se liga a um antígeno, "domínio intracelular" significa qualquer oligopeptídeo ou polipeptídeo que é conhecido por funcionar como um domínio para um sinal de transmissão que ativa ou inibe um processo biológico em uma célula.
[0048] Neste relatório descritivo, "proteína de ligação ao antígeno" significa uma parte do anticorpo que se liga a um antígeno ou um fragmento de anticorpo que confere especificidade ao anticorpo para o antígeno.
[0049] A seguir, a invenção será descrita especificamente. Fragmento de ligação ao antígeno e o ácido nucleico que o codifica da invenção
[0050] O anticorpo anticomplexo peptídeo derivado de MAGE- A4/HLA-A2 (HLA-A2-MAGE-A4) é o anticorpo que reconhece e se liga especificamente ao complexo de HLA-A2 e P230-239 (SEQ ID NO: 1) que é um peptídeo derivado de MAGE-A4 com restrição de HLA-A2. O anticorpo da invenção é altamente específico, não se liga ao complexo de HLA-A2 e peptídeo diferente de P230-239 e ao complexo de peptídeo P230-239 e HLA diferente de HLA-A2 (ou atividade de ligação muito baixa). Dessa forma, o fragmento de ligação ao antígeno da invenção pode detectar ou visar especificamente o complexo HLA- A2-MAGE-A4.
[0051] O fragmento de ligação ao antígeno da invenção contém (A) o polipeptídeo que possui a sequência de aminoácidos da VH (região variável da cadeia pesada) da SEQ ID NO: 36 e a sequência de aminoácidos de VL (região variável da cadeia leve) da SEQ ID NO: 38, ou (B) o polipeptídeo que possui a sequência de aminoácidos da VH (região variável da cadeia pesada) com homologia de sequência de aminoácidos de 90% ou mais da SEQ ID NO: 36, e a sequência de aminoácidos da VL (região variável da cadeia leve) com homologia da sequência de aminoácidos de 90% ou mais da SEQ ID NO: 38. O fragmento de ligação ao antígeno da invenção pode conter (C) o polipeptídeo que possui a sequência de aminoácidos sc (cadeia única) da SEQ ID NO: 37, ou (D) o polipeptídeo que possui a sequência de aminoácidos sc (cadeia única) com homologia de sequência de aminoácidos de 90% ou mais da SEQ ID NO: 37 entre VH e VL.
[0052] O fragmento de ligação ao antígeno inclui um ou mais fragmentos que se ligam especificamente a um antígeno. O fragmento de um anticorpo compreendendo uma região de ligação ao antígeno do anticorpo reconhece especificamente o antígeno similar ao anticorpo de comprimento total. Nos fragmentos de ligação ao antígeno que contêm anticorpos e seus fragmentos compreendem, Fab, Fab’, F(ab’)2, Fv e Fv de cadeia única (scFv) são exemplificados. Fab é um fragmento de anticorpo monovalente constituído pelo domínio VL, VH, CL e CH1. Fab’ é um fragmento de anticorpo monovalente constituído pelo domínio VL, VH, CL, CH1 e região de alça. F(ab’)2 é um fragmento de anticorpo divalente compreendendo dois fragmentos Fab ligados por ligações dissulfeto da região de alça. Fv é um fragmento de anticorpo monovalente constituído por VL e VH. Os domínios VL e VH do fragmento Fv são codificados por genes separados, o scFv, que é uma proteína de uma molécula, pode ser produzido por técnicas de recombinação de genes combinando dois genes com um ligante. O scFv contém um ligante (cadeia única) entre VH e VL. O sc conecta VH e VL e é um peptídeo a ser utilizado normalmente no campo técnico para estabilizar a capacidade de ligação ao antígeno do anticorpo scFv (por exemplo, Huston et al., Methods in Enzymology, 203: 46-88 (1991), Whitlow et al, Protein Eng., 6: 989 (1993)). sc contém geralmente glicina e serina, o comprimento é de 15 a 18 aminoácidos.
[0053] Um aspecto da invenção compreende uma combinação de um fragmento de ligação ao antígeno. Para tais moléculas, Fab3, Diacorpo, Triacorpo, Tetracorpo, Minicorpo, Bis-scFv, (scFv) 2-Fc, IgG intacta são exemplificados (Holliger et al., Nature Biotechnology, 23 (9), p.1126-36 (2005)).
[0054] Um ou vários aminoácidos dos fragmentos de ligação ao antígeno podem ser modificados, desde que não afetem substancialmente suas propriedades. Por exemplo, um ou vários aminoácidos na região constante ou na região FR podem ser substituídos, deletados, adicionados ou inseridos. A modificação pode ser facilmente conduzida por combinação de métodos conhecidos, incluindo mutagênese sítio-dirigida (mutação pontual introduzida e mutagênese em cassete, etc.), método de recombinação homóloga de genes, método de extensão do iniciador e método de PCR.
[0055] A invenção compreende um ácido nucleico que codifica o fragmento de ligação ao antígeno. Além disso, o ácido nucleico da invenção compreende a sequência nucleotídica mostrada na SEQ ID NO: 31 e 33 a 35 na listagem de sequências. O ácido nucleico pode ser modificado para códons (códon ótimo) adequados para células hospedeiras sem alterar a sequência de aminoácidos codificada pelo ácido nucleico. A eficiência da expressão de um polipeptídeo em uma célula hospedeira pode ser melhorada pela modificação para códons ótimos.
[0056] O fragmento de ligação ao antígeno da invenção pode ser preparado usando técnicas conhecidas de engenharia genética ou métodos de síntese química. Na técnica de engenharia genética, preparando um vetor de clonagem ou um vetor de expressão contendo o ácido nucleico da invenção, introduzindo o vetor em uma célula hospedeira, cultivando células hospedeiras que expressam o ácido nucleico e recuperando o polipeptídeo por purificação, o polipeptídeo pode ser produzido. Quando uma pluralidade de ácidos nucleicos da invenção é compreendida, uma combinação de um vetor de pluralidade contendo cada molécula de ácido nucleico em uma célula hospedeira, ou um vetor que compreende uma pluralidade de ácidos nucleicos pode ser introduzida em uma célula hospedeira. Na preparação do polipeptídeo, um marcador peptídico está ligado ao polipeptídeo, ele pode ser recuperado e purificado usando o marcador peptídico.
[0057] Um vetor da invenção está operacionalmente ligado a sequências de controle adequadas para expressar os ácidos nucleicos em um hospedeiro adequado. Tais sequências de controle contêm um promotor para transcrever os ácidos nucleicos, uma sequência de operador para controlar a transcrição, uma sequência que codifica um sítio de ligação ao ribossomo, um intensificador, uma sequência de poliadenilação e uma sequência para controlar a terminação da transcrição e tradução e similares. Várias sequências conhecidas (por exemplo, sítio de clivagem da enzima de restrição, gene marcador como gene de resistência ao fármaco (gene de seleção), sequência sinal, sequência líder e similares) podem ser utilizadas no vetor. Várias sequências podem ser selecionadas e utilizadas apropriadamente de acordo com o tipo de polipeptídeo expresso, a célula hospedeira, as condições do meio e similares.
[0058] Um vetor que é incorporado no genoma do hospedeiro, ou não está incorporado no genoma do hospedeiro, e um vetor epissomal que existe no citoplasma para replicar autonomamente e similares pode ser utilizado na invenção. Como vetor, um vetor de retrovírus (contendo vetores de oncorretrovírus, vetores de lentivírus, vetor pseudotipado), vetor adenoviral, vetor do vírus adeno-associado (AAV), vetor de vírus símio, vetor do vírus vaccinia, vetor do vírus Sendai, vetor do vírus Epstein-Barr (EBV), vetor do HSV e similares são exemplificados. Como vetor de vírus, o vírus que não possui capacidade de replicação nas células infectadas pode ser utilizado preferencialmente. Além disso, o vetor não viral também pode ser utilizado por combinação com lipossomo e um agente de condensação, como lipídios catiônicos. Além disso, o ácido nucleico pode ser introduzido nas células por transfecção com fosfato de cálcio, DEAE-dextrana, eletroporação, bombardeio de partículas e similares.
[0059] Como células hospedeiras, células conhecidas podem ser usadas. Por exemplo, células procarióticas como E. coli, células de mamíferos como células de ovário de hamster chinês (células CHO), células humanas e células eucarióticas como células de leveduras e insetos e exemplos são exemplificadas.
[0060] O fragmento de ligação ao antígeno da invenção expresso em células hospedeiras, pode ser purificado a partir do meio de célula hospedeira, extratos e/ou lisado de células hospedeiras. O método de purificação pode ser conduzido combinando métodos conhecidos apropriados. Por exemplo, centrifugação, cromatografia em hidroxiapatita, eletroforese em gel, diálise, fracionamento em uma coluna de troca iônica, precipitação com etanol, HPLC em fase reversa, cromatografia por sílica, cromatografia por heparina-sefarose, cromatografia em resina aniônica ou catiônica (coluna de ácido poliaspártico, etc.), cromatofocagem, SDS-PAGE, precipitação com sulfato de amônio e cromatografia de afinidade podem ser utilizados adequadamente. (2) Uma composição da invenção
[0061] Na invenção, é fornecida uma composição compreendendo o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno da invenção descrito em (1), bem como uma composição compreendendo o ácido nucleico que codifica o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno.
[0062] O anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno da invenção pode ser utilizado como uma sonda para o peptídeo derivado de MAGE-A4 e o complexo HLA-A2. Sabe-se que o MAGE-A4 é expresso dentro das células cancerígenas e é apresentado pelo HLA; as células T atacam as células cancerígenas com base no reconhecimento de antígenos. Portanto, o fragmento de ligação ao antígeno da invenção pode ser utilizado como uma sonda para células cancerígenas, isto é, a composição de detecção ou diagnóstico.
[0063] Para tais métodos de detecção, podem ser exemplificados métodos de detecção conhecidos, por exemplo, ELISA, ensaio de anticorpos fluorescentes, radioimunoensaio, radioimunoprecipitação, ensaios dot blot, ensaio de inibição ou competição, ensaio em sanduíche e ensaios de aglutinação de contas de látex.
[0064] As amostras para diagnóstico e detecção contêm amostras biológicas (por exemplo, tecidos do local da doença, células, fluido corporal contendo sangue, soro, plasma, linfa e urina). Para estas amostras, após pré-purificadas, homogeneizadas, centrifugadas ou diluídas em um tampão adequado, se necessário, colocadas em contato com o fragmento de ligação ao antígeno da invenção, o complexo antígeno-anticorpo é detectado. No caso, o fragmento de ligação ao antígeno da invenção pode ser marcado ou pode ser utilizado um anticorpo secundário marcado. Para a marcação, uma enzima (como peroxidase de rábano silvestre, fosfatase alcalina, etc.), 32 35 isótopos radioativos (por exemplo, P, S, 3H, 125 I, etc.), substância fluorescente (por exemplo, rodamina, fluorescamina, cloreto de dansila, e seus derivados, etc.), e podem ser utilizados peptídeos marcadores e similares.
[0065] O fragmento de ligação ao antígeno da invenção pode ser utilizado para entregar uma composição farmacêutica a um alvo. O anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno da invenção ligado a produtos farmacêuticos reconhece especificamente o peptídeo WT1 e o complexo HLA-A24. Para a composição farmacêutica para entrega a um alvo, citocinas (IL2, TNF, IFN-γ, etc.), as proteínas receptoras delas, citotoxina (ricina, difteria, gelonina etc.), isótopos radioativos (90Y, 131 I, 225 Ac, 213Bi, 223 Ra e 227 Th, etc.), células (células T, células NK, etc.) ou composto de baixo peso molecular (caliqueamicina, doxorrubicina, etc.) são exemplificados.
[0066] Quantidades eficazes dos ingredientes ativos da composição farmacêutica da invenção são determinadas adequadamente com base na finalidade, no tipo de tumor, nas condições médicas, como local da doença e tamanho da condição do paciente, e via de administração e similares. Quando utilizado como uma composição farmacêutica, vários componentes que podem ser aceitos farmaceuticamente (por exemplo, veículo, excipiente, tampão, estabilizador, etc.) podem ser adicionados além do ingrediente ativo. A composição farmacêutica pode ser fornecida na forma de um comprimido, líquido, pó, gel, spray, uma microcápsula, sistema de distribuição coloidal (lipossomas, microemulsões, etc.) e macroemulsão como similares com base nas condições. Como via de administração da composição farmacêutica, são exemplificadas por via intravenosa, intraperitoneal, intracerebral, intratecal, intramuscular, intraocular, intra-arterial, ducto biliar e injeção intralesional, infusão, sistemas de liberação sustentada e similares. A composição farmacêutica pode ser administrada por infusão ou injeção contínua.
[0067] A composição farmacêutica da invenção pode ser usada para o tratamento de tumores hematopoiéticos, como leucemia mieloide crônica, leucemia linfocítica aguda (LLA) e leucemia mieloide aguda (LMA) e cânceres sólidos, como câncer de estômago, câncer de cólon, câncer de pulmão, câncer de mama, câncer de células germinativas, câncer hepático, câncer da pele, câncer de bexiga, câncer de próstata, câncer uterino, câncer do colo do útero, câncer de ovário, mesotelioma e similares e para o diagnóstico e detecção de tumores e cânceres sólidos. Em particular, é útil para o tratamento, diagnóstico e detecção de tumor hematopoiético positivo para MAGE- A4 ou positivo para HLA-A2 e câncer sólido. (3) Receptor de antígeno quimérico da invenção
[0068] A invenção inclui um receptor de antígeno quimérico (CAR) compreendendo o fragmento de ligação ao antígeno em (1) e o domínio intracelular da proteína de sinalização. CAR reconhece especificamente o complexo peptídico derivado de HLA-A2-MAGE-A4 e se liga a ele, pode transmitir um sinal às células que expressam CAR. CAR compreende um domínio extracelular, um domínio transmembrana e um domínio intracelular. No domínio extracelular, o fragmento de ligação ao antígeno da invenção está contido. Quando o domínio extracelular se liga especificamente ao complexo HLA-A2- MAGE-A4, um sinal é transmitido para a célula através do domínio intracelular do CAR, estimula a célula que expressa o CAR. As células estimuladas produzem citocinas e similares, exibem citotoxicidade para as células-alvo que expressam o complexo ou induzem citotoxicidade de outras células imunes.
[0069] Como um domínio intracelular de CAR, pode ser utilizado um domínio que pode transmitir um sinal para a célula, quando o domínio extracelular da molécula do CAR interage (se liga) ao complexo peptídeo derivado de MAGE-A4/HLA-A2. Como tais proteínas de sinalização, proteínas de membrana, receptores de sinal e receptores de citocina são exemplificados. Para o domínio intracelular de CAR, são exemplificados os domínios intracelulares que contêm uma sequência de transmissão de sinal citoplasmático primário derivada de (CD3ζ), FCRγ, FcRβ, CD3γ, CD3δ, CD3ε, CD5, CD22, CD79a e CD66d. Além disso, os domínios intracelulares contendo uma sequência de transmissão de sinal citoplasmático secundário (sinal coestimulatório) derivada de CD2, CD4, CD5, CD8α, CD8β, CD28, CD137 (também conhecido como "4-1BB"), CD134, ICOS, GITR e CD154 são exemplificados. Além disso, são exemplificados os domínios intracelulares que contêm uma sequência de transmissão de sinal citoplasmático terciário derivada do receptor de IL-2 e do receptor de IL-21.
[0070] Como domínio transmembrana de CAR, cadeia alfa ou cadeia beta do receptor de células T, o domínio transmembrana da cadeia zeta CD3, CD28, CD3ε, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 (também conhecido como "4-1BB"), ICOS, CD154 e GITR e similares podem ser utilizados. Uma sequência artificialmente projetada pode ser utilizada.
[0071] A invenção compreende um ácido nucleico que codifica um CAR. O ácido nucleico que codifica um CAR pode ser conectado com outro ácido nucleico a ser expresso sob o controle de um promotor adequado. Pode ser utilizado um promotor que seja expresso constitutivamente ou induzível por um fármaco (por exemplo,
tetraciclina ou doxorrubicina). Por exemplo, promotor derivado de mamífero contendo promotor de fosfoglicerato cinase (PGK), promotor Xist, promotor de beta-actina e promotor de RNA polimerase II, promotor derivado de vírus contendo promotor inicial de SV40, promotor de citomegalovírus, promotor de timidina quinase do vírus do herpes simplex, promotor de LTR de vários retrovírus podem ser utilizados e similares. Para obter uma transcrição eficiente do ácido nucleico, outro elemento regulador que coopera com um promotor ou um sítio de iniciação da transcrição (por exemplo, uma sequência intensificadora ou uma sequência terminadora) pode ser ligado ao ácido nucleico. Além disso, um gene marcador que pode ser utilizado para confirmação da expressão do ácido nucleico (por exemplo, gene de resistência a fármacos, um gene que codifica uma enzima repórter ou um gene que codifica uma proteína fluorescente, etc.) pode ser incorporado.
[0072] O ácido nucleico que codifica CAR pode ser introduzido nas células pelo vetor. Além disso, o ácido nucleico que codifica CAR pode ser utilizado como ingrediente ativo de uma composição farmacêutica. A composição farmacêutica compreendendo o ácido nucleico que codifica CAR pode ser preparada e utilizada com base na descrição de (2).
[0073] Em outro aspecto da invenção, uma célula que expressa CAR é incluída. As células podem ser preparadas pelo processo de introdução do CAR da invenção em uma célula. Quando as células que expressam CAR se ligam ao complexo HLA-A2-MAGE-A4 via CAR, um sinal é transmitido para a célula e ativado. A ativação das células pode ser confirmada pela liberação de citocinas, aumento da taxa de proliferação, alteração das moléculas da superfície celular e similares, dependendo do tipo de célula hospedeira e do domínio intracelular. Por exemplo, a liberação de citocinas citotóxicas (fator de necrose tumoral, linfotoxina etc.) de células ativadas resulta na destruição de células tumorais que expressam o complexo. Além disso, a liberação de citocinas e a alteração das moléculas da superfície celular estimulam outras células imunes, por exemplo, células B, células dendríticas, células NK, macrófagos e similares. Dessa forma, as células que expressam CAR são úteis para imunoterapia adotiva, especialmente contra tumores ou câncer positivos para MAGE-A4, positivos para HLA-A2.
[0074] O processo de introdução do ácido nucleico que codifica CAR nas células é realizado in vitro (ex vivo) ou in vivo. Para células introduzidas por ácidos nucleicos, podem ser utilizadas células de mamíferos, como células derivadas de seres humanos, e células derivadas de mamíferos não humanos como macaco, camundongo, rato, porco, vaca e cachorro, etc. Para tipos de células, por exemplo, podem ser usadas células do fluido corporal, como sangue (sangue periférico, sangue do cordão umbilical, etc.), medula óssea, tecido ou órgão, coletadas, isoladas, purificadas e induzidas. Podem ser usadas PBMCs, células imunes (células dendríticas, células B, células-tronco hematopoiéticas, macrófagos, monócitos ou células NK, células sanguíneas (neutrófilos, basófilos, monócitos), células-tronco hematopoiéticas, células mononucleares do cordão umbilical, fibroblastos, pré-adipócitos, hepatócitos e células sanguíneas, queratinócitos da pele, células-tronco mesenquimais, células-tronco hematopoiéticas, células-tronco adiposas, células-tronco pluripotentes, várias linhagens de células cancerígenas ou células-tronco neurais. Na invenção, particularmente células T, precursores de células T (células- tronco hematopoiéticas, células progenitoras linfoides, etc.), células- tronco pluripotentes ou populações de células que os contêm são preferencialmente utilizados. As células T contêm células T positivas para CD8, células T positivas para CD4, células T reguladoras, células
T citotóxicas, linfócitos infiltrantes de tumores. A população de células contendo células T e células progenitoras de células T inclui PBMCs. As células utilizadas na invenção podem ser qualquer uma das células amostradas do corpo vivo, aquelas expandidas por cultura e linhagens celulares. Quando as células transfectadas com um ácido nucleico ou células diferenciadas podem esperar ser transplantadas para um corpo vivo, preferencialmente são transplantadas células coletadas do corpo vivo ou do mesmo tipo de corpo vivo.
[0075] Para células que expressam o CAR da invenção, pode ser realizada cultura e/ou estimulação com o meio de cultura apropriado e/ou moléculas estimuladoras antes da administração a um indivíduo. As moléculas estimuladoras contêm citocinas, proteínas apropriadas e outros componentes. Como citocinas, por exemplo, IL-2, IL-7, IL-12, IL-15 e IFN-γ e similares são exemplificadas, de preferência IL-2 é exemplificada. A concentração de IL-2 no meio não é particularmente limitada, por exemplo, é 0,01 a 1 x 105 U/ml, de preferência 1 a 1×104 U/mL. Além disso, para proteínas adequadas, são exemplificados o ligante CD3, o ligante CD28 e o anticorpo anti-IL-4. Além disso, podem ser adicionados estimuladores de linfócitos, como lectinas. Além disso, soro ou plasma podem ser adicionados ao meio de cultura. A quantidade de aditivos para o meio não é particularmente limitada, 0 a 20% em volume é exemplificado, a quantidade de soro ou plasma pode ser alterada de acordo com o estágio de cultura. A concentração de soro ou plasma pode ser diminuída gradualmente. A origem do soro ou plasma pode ser a mesma do próprio corpo (a mesma origem das células cultivadas) ou não (diferente da origem das células da cultura), preferencialmente as próprias são usadas com segurança.
[0076] O equipamento de cultura de células a ser utilizado para a cultura de células não é particularmente limitado, por exemplo, uma placa de Petri, um balão, uma bolsa, um banho de cultura grande, um biorreator e similares. Como bolsa, pode ser utilizado saco permeável ao CO2 gasoso de cultura de células. Quando a massa de populações de células é produzida industrialmente, um banho de cultura grande pode ser utilizado. Além disso, a cultura pode ser conduzida em sistema aberto ou sistema fechado, o sistema fechado é preferencialmente utilizado para segurança da população celular resultante.
[0077] A invenção inclui uma composição farmacêutica contendo células que expressam o CAR como ingrediente ativo. A composição farmacêutica da invenção é administrada parenteralmente. Para administração parenteral, como administração intravenosa, intra- arterial, intramuscular, intraperitoneal e subcutânea e similares, estão contidas. Para aumentar o efeito antitumoral, a administração ao meningioma ou tecido próximo, por exemplo, a administração subcutânea pode ser usada. A dose de administração é adequadamente selecionada dependendo da condição do indivíduo, peso, idade e similares. Normalmente, como número de células, são administradas 107 a 109 células por 60 kg de peso corporal por administração, de preferência cerca de 5 x 107 a 5 x 108 células. A composição farmacêutica pode ser administrada uma vez ou mais vezes. A composição farmacêutica pode estar em uma forma adequada para administração parenteral, por exemplo, uma injeção ou infusão. A composição farmacêutica pode opcionalmente compreender um excipiente farmaceuticamente aceitável. A composição farmacêutica pode compreender solução salina, solução salina tamponada com fosfato (PBS), meio ou similar, a fim de manter as células de forma estável. O meio não é particularmente limitado, como RPMI, AIM-V, X-Vivo 10 e similares são geralmente exemplificados. Método de teste
[0078] 1. Rastreamento de anticorpos com a biblioteca de fagos de anticorpos humanos Preparação de contas de pMHC
[0079] 20 µg de A2-MAGE-A4 como pMHC e 200 mg de esferas magnéticas ligadas à estreptavidina foram misturados e reagidos a 4°C em solução de Tween/PBS (-) 0,05%. 3 µL de biotina/PBS (-) 2 mM foram adicionados e reagidos por 1 hora. A solução foi lavada duas vezes com Tween/PBS (-) 0,05% e suspensa em 400 µL de de Tween/PBS (-) 0,05%. A suspensão foi utilizada conforme as contas de antígeno. (2) Biblioteca de anticorpos humanos
[0080] VH e VL foram amplificadas por PCR a partir de amígdalas, sangue do cordão umbilical, sangue periférico e medula óssea de dezenas de indivíduos saudáveis. Os produtos de PCR foram recombinados com o vetor fagemídeo pUC119, para produzir scFv com repertório de 3,4 x 1012. scFv foi exibido no cp3 do fago M13. O produto foi utilizado como biblioteca de anticorpos humanos. (3) Rastreamento utilizando biblioteca de anticorpos humanos, isolamento de anticorpos, preparação do sobrenadante da cultura de cp3
[0081] A mistura de reação contendo 3,4 × 1012 ufc de solução de biblioteca de anticorpos humanos, 100 µg de estreptavidina (Pierce), 30 µg de tetrâmero A2-CMV, 30 µg de tetrâmero A2-Foxp69, 30 µg de tetrâmero A2-IDOp41, 30 µg de tetrâmero A2-IDOp195, 20 µg de proteção Gamma, 100 µL de solução BSA 2%, 65 µL de TritonX100 10%, 1000 µL de TritonX100/PBS 1% foram preparados e misturados e rotacionados por 1 hora à temperatura ambiente e 100 µl de solução de contas magnéticas que estavam ligadas ao tetrâmero A2-MAGE-A4 foi adicionados e misturados e rotacionados durante 1 hora. Em seguida, as contas magnéticas foram fixadas com Magnet Trapper (Toyobo), enquanto foram lavadas 5 vezes com TritonX100/PBS 1%.
As contas magnéticas foram adicionadas ao XL1-blue cultivado, infectadas por 1 hora a 37 °C, centrifugadas e susp ensas em 600 µL de meio 2×YTAG (200 µg/mL de ampicilina, glicose/2×YT 1%). A suspensão foi semeada em placa de ágar YTAG (ampicilina 200 µg/mL, glicose/ágar com nutrientes 2% (Nissui)) e cultivada por 15 horas a 37 °C. As colônias foram coletadas com 30 m L de meio 2 × YTAG, 200 µL da solução coletada foram adicionados a 20 mL de 2 × YTAG e 30 µL de fago auxiliar VCSM. A mistura foi incubada por 30 minutos a 37 °C para infecção e incubada por 90 min utos a 37 °C. 80mL de meio 2x YTAG, 60 µL de 50 µg/mL de canamicina e 50 µL de 1M IPTG foram adicionados à mistura cultivada e incubados por 20 horas a 28 °C. Após a mistura incubada ter sido cen trifugada, o sobrenadante foi misturado com 25 mL de solução de PEG (20% de PEG # 600, NaCl 2,5M). O precipitado foi coletado por centrifugação, foi suspenso em 1 mL de PBS e esterilizado em filtro. A operação foi repetida duas vezes. E. coli recuperada foi plaqueada em meio de ágar YTAG. Após incubadas a 30°C, as colônias foram coletadas e cultivadas em meio LB a 30 °C durante a noite. O DN A foi extraído com Miniprep DNA Kit (QIAGEN) utilizando uma porção do meio LB cultivado e sequenciado. 50 µL da cultura foram misturados com 1,5 ml de 2×YTAI (2×YT contendo 0,5mM de IPTG) e cultivados a 30 °C durante a noite. O sobrenadante foi separado por centrifugação. O sobrenadante foi utilizado como sobrenadante de cp3. ELISA foi conduzido usando o sobrenadante de cp3.
2. Ensaio de imunoadsorção ligado à enzima (ELISA) Complexo MHC-peptídeo (monômero)
[0082] O complexo que HLA-A*0201 ligou a MAGE-A4 p230, MAGE-A4 P286, MAGE-A3 P195, CMV, MelanA, GP3, HTLV-1, NY- ESO-1 p157, NY-ESO-1 p159, Foxp3 p69, Foxp3 p127, Foxp3 p390, IDO p41, IDO p41, IDO p195 e IDO p199 foi utilizado como complexo
MHC-peptídeo. (2) Imobilização de pMHC
[0083] 500 ng de neutravidina (PIERCE Co.) em 50 µL de PBS foram suspensos em Maxisorp livre (Nunc) e agitados a 4 °C durante a noite. Após descartar a solução, 200 µL de BSA/PBS 2% foram adicionados e a solução foi colocada e bloqueada durante a noite. Após descartar a solução, 300 ng de monômero HLA-A2-MAGE-A4 em 50 µL de PBS foram adicionados e agitados a 4 °C durant e a noite. A solução foi lavada com PBS.
[0084] A imobilização do HLA-A2-CMV como controle negativo foi conduzida da mesma maneira. (3) Medição da reação ELISA
[0085] 100 µL de sobrenadante da cultura de cp3 foram vertidos no poço da placa de antígeno imobilizado, após agitação por 1 hora à temperatura ambiente, o poço da placa foi lavado com PBS, 100 µl de anticorpo anti-cp3 de coelho diluído 2000 vezes com Tween 20/PBS 0,05% foram vertidos no poço e a placa foi agitada por 1 hora em temperatura ambiente. Após o poço ter sido lavado com PBS, 100 µl de IgG anti-coelho marcado com HRP (MBL Co., Ltd.) diluída 4000 vezes em Tween 20/PBS 0,05% foram vertidos no poço e a placa foi agitada por 1 hora à temperatura ambiente. Após o poço ser lavado com PBS, OPD (WAKO Co., Ltd.) suspenso em H2O2 0,01%, Na2PO4 0,1 M, ácido cítrico 0,1 M (pH 5,1) foi vertido e deixado reagir, após a confirmação por desenvolvimento de cor, H2SO4 2 N foi adicionado para parar a reação. A absorvância foi medida no comprimento de onda de 490 nm no SpectraMaxM2 (Molecular Devices).
3. Purificação de anticorpos Transfecção para o vetor para purificação
[0086] O gene do anticorpo foi transferido para o vetor de expressão His/FLAG para mudar para a forma de scFv-FLAG / His. Foi utilizado o marcador FLAG para detecção por FACS, o marcador His foi utilizado para purificação por coluna, respectivamente. (2) Transformação
[0087] Após o DNA clonado do anticorpo isolado ser reagido por SalI (Takara Bio Inc.), o fragmento de DNA foi reagido com o vetor através da DNA ligase T4. As células competentes DH5α (TOYOBO Co. Ltd.) foram transformadas pelo DNA e foram plaqueadas em placa LBGA. Após incubadas a 30 °C durante a noite, as co lônias foram cultivadas em 2 × YTAG e parte da solução de cultura foi cultivada em 2 × YTAI, o sobrenadante foi preparado por centrifugação. (3) Confirmação da expressão de scFv-FLAG / His
[0088] Após 100 µl de sobrenadante da cultura terem sido vertidos em um poço da placa do antígeno, agitando por 1 hora à temperatura ambiente e o poço foi lavado com PBS. Para confirmação da expressão do marcador His, anti-His marcado com HRP (MBL Co., Ltd.) diluído 4000 vezes em Tween 20/PBS 0,05% foi vertido e agitado durante 1 hora à temperatura ambiente. Para confirmação da expressão do marcador FLAG, o anticorpo anti-FLAG (DDDK) e o anticorpo marcado com HRP foram reagidos em ordem.
[0089] Após a placa do antígeno ser lavada com PBS, OPD (WAKO Co., Ltd.) suspenso em H2O2 0,01%, Na2PO4 0,1 M, ácido cítrico 0,1 M (pH 5,1) foi vertido e deixado reagir, após a confirmação por desenvolvimento de cor, H2SO4 2 N foi adicionado para parar a reação. A absorvância foi medida no comprimento de onda de 490 nm no SpectraMaxM2 (dispositivos moleculares). (4) Purificação bruta do anticorpo
[0090] 2 mL de solução bacteriana pré-cultivada foram colocados em 100 mL de 2 × YTAI e cultivados a 30 °C durante a noite. A solução foi centrifugada (8000 rpm, 10 min, 4 ℃ ), o sobrenadante foi coletado, 100 ml de ácido sulfúrico saturado foram adicionados ao sobrenadante e agitado. A solução foi centrifugada (8000 rpm, 20 min, 4 ℃ ) e o precipitado foi suspenso em 10,5 mL de PBS completo. Após o PBS completo ser centrifugado (12000 rpm, 1 h, 4 ºC), 1 ml de Ni Sefarose excel (GE Healthcare) equilibrada com PBS foi adicionado ao sobrenadante e incubado a 4 °C durante a noite. Uma coluna foi preenchida com a amostra, lavada com NaCl PBS 0,5 M contendo NaCl PBS 0,5 M e imidazol 20 mM e eluída com NaCl PBS 0,5 M contendo imidazol 250 mM. O eluente foi dialisado contra PBS, após a diálise, foi concentrado com Amicon Ultra 10K (Millipore). A SDS- PAGE foi realizada com uma parte da amostra, para confirmar a banda por marcação com CBB, para determinar a concentração de proteína do anticorpo purificado em bruto. (5) Purificação da proteína marcadora His utilizando AKTA Prime plus
[0091] O anticorpo bruto foi ainda purificado utilizando a coluna HisTRAP por AKTA Prime plus (GE Healthcare). O procedimento foi realizado de acordo com o protocolo de purificação de marcação His anexado. As frações de pico recuperadas foram detectadas por SDS- PAGE.
4. Medição da constante de dissociação (valor de KD)
[0092] Os valores de KD dos anticorpos purificados foram medidos por BiacoreX100 (GE Healthcare). A imobilização de ligantes foi realizada com o kit de captura Biotion (GE Healthcare). Imobilização do ligante
[0093] HLA-A2-MAGE-A4 p230 foi imobilizado no chip sensor CAP. A concentração foi ajustada para 200 nM com tampão HBS, e o ligante foi imobilizado como UR adequada (unidade de ressonância). (2) Preparação da solução de analito
[0094] O anticorpo purificado foi ajustado para 12,5 nM, 25 nM, 50 nM, 100 nM e 200 nM com tampão HBS EP +.
(3) Medição dos valores de KD
[0095] A reação de ligação foi medida por 180 segundos enquanto a solução de analito estava fluindo através da célula de fluxo do chip sensor. Após a medição, a solução do analito foi trocada para o tampão HBS e a reação de dissociação foi medida por 300 segundos. A medição foi realizada usando um método de ciclo único do programa para escoar continuamente o analito de baixa concentração para alta concentração.
[0096] Depois que as reações terminaram com todas as concentrações, a constante de ligação foi calculada usando o programa de ajuste de curvas.
5. Análise por citometria de fluxo (FACS) Equipamentos
[0097] Foram utilizados FACS Calibur/FACS Cant/FACS CantII (BD) para medir o citômetro de fluxo. (2) Anticorpo marcado com fluorescência
[0098] Os anticorpos marcados com fluorescência foram utilizados como descrito na Tabela 1.
Tabela 1 (3) Tetrâmero de PE
[0099] Tetrâmero de PE significa a estreptavidina-PE à qual estão ligados quatro monômeros biotinilados. O tetrâmero PE foi utilizado para a detecção de células T específicas para o antígeno. Os tetrâmeros utilizados no relatório descritivo foram o tetrâmero A2- MAGE-A4 p230 e o tetrâmero A2-NY-ESO-1 p157.
6. Ensaio de estabilidade de HLA e ensaio de ligação ao scFv Célula T2 (linhagem de célula linfoblastoide híbrida BT humana HLA-A*02+)
[00100] A célula T2 é um tipo de linhagem celular que não possui Transportador Associado ao Processamento de Antígeno (TAP), tem uma especificidade em que a proteína intracelular não é apresentada ao HLA. (2) Pulso de peptídeo para células T2
[00101] O peptídeo foi adicionado a uma concentração final de 10 µM a células T2 em RPMI1640 humano, deixado por 15 minutos à temperatura ambiente, RPMI1640 com FCS humano 20% foi adicionado a uma concentração final de FCS 10%. As células foram incubadas em incubadora de CO2 por 45 minutos, a 37 °C. Após duas lavagens, as células foram usadas para teste. (3) Ensaio de estabilidade de HLA
[00102] Anti-HLA-A2 Alexa Fluor 488 foi reagido com células T2 pulsadas por peptídeo por 1 hora, a quantidade de HLA estabilizado na superfície da célula T foi determinada por detecção com FACS. (4) Ensaio de ligação ao scFv
[00103] As células T2 pulsadas com peptídeo reagiram com anticorpos adquiridos por 1 hora, com anticorpo anti-FLAG por 1 hora, com anticorpo anti-FITC de camundongo por 1 hora e foram detectadas com FACS. (5) Peptídeos substituídos com um aminoácido e peptídeo de risco
[00104] Como mostrado na Tabela 2, um peptídeo substituído por aminoácido em que um dos 10 aminoácidos de MAGE-A4p230-239 foi substituído por alanina (A), metionina (M), fenilalanina (F) e triptofano (W) foram sintetizados e a IC50 examinada de cada peptídeo. Cada peptídeo foi ajustado para uma concentração final de 10 mM em DMSO.
[00105] IC50 de MHC é o valor teórico calculado pelo IEDB (http://tools.immuneepitope.org/processing/) e, quando o valor é menor, é indicado que a ligação entre HLA-A* 0201 e o peptídeo é mais forte.
[00106] A Tabela 2 mostra a sequência de aminoácidos de peptídeos substituídos com um aminoácido e IC50. Tabela 2
[00107] Sequência de aminoácidos Sequência de aminoácidos
[00108] A Tabela 3 mostra a sequência de aminoácidos dos peptídeos de risco e os valores de IC50 que foram extraídos do peptídeo da família MAGE e do aminoácido que reconhece o anticorpo MAGE # 17 por pesquisa BLAST.
Tabela 3 Peptídeo de Risco Sequência de aminoácidos Calcifosina
7. Construção do construto do CAR e do vetor MAGE#17 28z CAR
[00109] A Figura 1 mostra a imagem em sequência da construção do CAR. O construto contém as cadeias líder, VH, VL, CL, CD28TM, CD28ICD (domínio intracelular de CD28) e CD3zeta (CD3ζ) da extremidade 5’. VH e VL são MAGE#17 scFv nessas cadeias. (2) Construção do CAR
[00110] A Figura 2 mostra as etapas de construção do CAR esquematicamente. Cada etapa pode ser explicada como a seguir.
[00111] Primeiro, a reação de PCR foi conduzida usando scFv-cp3 como modelo, em que foram adicionados líder com sítio de reconhecimento EcoRI na extremidade 5’ de VH-VL e CL com sítio de reconhecimento AscI na extremidade 3’, respectivamente. Em seguida, o fragmento do produto de PCR tratado com EcoRI e AscI e o fragmento do vetor 28z CAR tratado com EcoRI e AscI foram reagidos por ligase para obter CAR 28z.
8. Preparação de linfócitos humanos
[00112] Os linfócitos humanos foram preparados a partir de sangue de doador saudável usando Ficoll-PaqueTM PLUS (17-1440-03, GE Healthcare). Foram obtidos através da separação de PBMCs (células mononucleares do sangue periférico). A coleta de amostras contendo sangue periférico humano utilizado no estudo e a análise foram realizadas de acordo com a Declaração de Helsinque, de acordo com o protocolo aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Escola de Medicina da Universidade Mie com o consentimento por escrito dos indivíduos.
[00113] As amostras coletadas foram armazenadas em um refrigerador ou tanque de nitrogênio líquido que havia sido criptografado para não identificar os indivíduos e tratamento antifurto. As informações pessoais dos indivíduos eram anônimas, e muita atenção foi dada à privacidade pessoal e aos resultados da análise dos genes, para não vazar para o exterior.
9. Introdução do mRNA nas células por eletroporação Preparação de mRNA
[00114] O DNA do CAR foi cortado em fita simples para produzir um modelo linear de DNA. O DNA foi purificado usando Wizard SV Gel e o PCR Clean-UP System (Promega). O mRNA foi preparado a partir do DNA purificado usando o mMESSAGEmMACHINE T7 Ultra Kit (Life Technologies). (2) Verificação pelo Bioanalyzer
[00115] A adição de Poli A ao mRNA foi confirmada pelo Bioanalyzer (Agilent Technologies). (3) Preparação da placa de cultura de PBMC
[00116] O anticorpo anti-CD3 (OKT-3 eBioscience) foi diluído com solução ACD-A (TERUMO) a uma concentração final de 5 µg/mL, RetroNectin (Takara Bio) foi diluído com solução ACD-A com uma concentração final de 25 µg/mL, Foram vertidos 400 µL de duas soluções em cada poço da placa de 12 poços (Nunc) e incubados por 5 a 10 horas a 37 °C na incubadora com CO 2. (4) Preparação de CM (meio de cultura)
[00117] Foi preparada uma cultura de PBMC contendo 50 mL de meio de linfócito GT-T503, 50 µL de IL-2 humana (600 UI), 400 µL de Albuminar (HSA 25% ) e 300 µL de plasma do doador de linfócitos. (5) Isolamento e cultura de PBMCs
[00118] As células mononucleares do sangue periférico foram separadas do sangue humano saudável (células mononucleares do sangue periférico, PBMCs) por Ficoll, e foram suspensas a 2 x 105 células/mL por CM, 2,5 mL da suspensão foram vertidos em placa e cultivadas por 4 dias a 37 °C na incubadora com CO 2. (6) Eletroporação
[00119] O mRNA produzido foi introduzido em PBMCs após 10 dias da separação por eletroporação. PBMCs introduzidas foram utilizadas no ensaio dentro de 24 horas.
[00120] 10. Transferência de genes para as células por retrovírus (experimento de infecção) Preparação de retrovírus por empacotamento da célula Plat-A
[00121] O gene de CAR foi introduzido na célula de empacotamento plat-A usando FuGENE (Promega). Após incubado por dois dias, o sobrenadante foi recuperado e utilizado como solução viral. (2) Isolamento e cultura de PBMCs
[00122] O isolamento e a cultura de PBMCs foram realizados de acordo com o item 9 acima. (3)-(5). (3) Produção de placa para infecção por retrovírus
[00123] RetroNectin foi diluído com solução ACD-A na concentração final de 20 µg/mL. Foram vertidos 500 µL da solução em cada poço da placa de 24 poços e armazenados a 4 °C durante a noite. Antes de verter a solução do vírus, a placa foi lavada duas vezes com ACD-A. (4) Preparação da placa de retrovírus para infecção, infecção nas células
[00124] A solução de vírus preparada em 10.(1) acima foi vertida na placa de infecção por retrovírus por 1 mL, a placa foi centrifugada a 2000×g por 2 horas a 32 °C para revestir a placa co m vírus. A placa foi lavada duas vezes com 1,5% de Albuminar/PBS. (5) Infecção por retrovírus em PBMCs, preparação de células CAR-T
[00125] As PBMCs cultivadas em 10.(2) acima foram recuperadas, após diluídas por CM a 4×105, 950 µL da suspensão foram semeados na placa para infecção por retrovírus, após a placa ter sido centrifugada 1000×g por 10 minutos a 32 °C e incuba da a 37 °C na incubadora com CO2.
[00126] A célula CAR-T preparada foi utilizada no ensaio após 12 a 14 dias a partir da separação das PBMCs. (6) Preparação da célula de controle
[00127] Parte das células cultivadas do item 10.(2) acima foram usadas como células de controle (nenhuma operação de transfecção de genes).
11. Características das linhagens celulares tumorais utilizadas em experimentos in vitro
[00128] As características das linhagens celulares utilizadas em experimentos in vitro foram mostradas na Tabela 4. Tabela 4
[00129] Linhagem celular
Linhagem celular
12. Ensaio de liberação de IF-γ
[00130] A concentração de IF-γ na cultura foi determinada usando o kit eBioscience por ELISA.
[00131] O tampão de revestimento 10 × foi diluído 10 vezes com água purificada para preparar o tampão de revestimento. 48 µL do anticorpo primário foram adicionados a 12 mL de tampão de revestimento. O tampão foi adicionado à placa de 96 poços de fundo plano por 100 µL por poço. Depois de a placa ter sido armazenada a 4°C durante a noite, foi lavada cinco vezes com PBS -T 0,05%. Os diluentes 5 × do ensaio foram diluídos 5 vezes com água purificada para preparar os diluentes do ensaio. Os diluentes do ensaio foram adicionados a 200 µL por poço. Após 1 hora à temperatura ambiente para bloqueio, a placa foi lavada 5 vezes com PBS-T 0,05%. IFN-γ foi preparado a 1000 pg/mL com o máximo, foi diluído com 7 etapas por duas vezes para preparar os padrões. As amostras e os padrões foram adicionados à placa e reagiram por 2 horas à temperatura ambiente, e a placa foi lavada 5 vezes com PBS-T 0,05%. 48 µL do anticorpo secundário foram adicionados a 12 mL de diluentes de ensaio, os diluentes foram adicionados por 100 µL por poço. Após a placa ter sido armazenada durante 1 hora à temperatura ambiente, foi lavada cinco vezes com PBS-T 0,05%. Foram adicionados 48 µL de estreptavidina-HRP a 12 mL de diluentes de ensaio, a solução foi adicionada por 100 µL por poço. A placa foi reagida no escuro por 30 minutos à temperatura ambiente e lavada sete vezes com PBS-T 0,05%. Solução de substrato TMB foi adicionada por 100 uL, reagindo em escuro durante 15 minutos à temperatura ambiente, 50 µL de H2SO4 0,18 M foi adicionado para parar a reação. Imediatamente, a placa foi medida no comprimento de onda de 450 nm com Microplate Reader Model 680 (Bio-Rad).
13. Marcação intracelular de citocinas (ICS)
[00132] As células-alvo foram ajustadas para 1 x 105 células/mL, as células efetoras foram ajustadas para 1 x 105 células/mL. Foram adicionados 0,5 µL de APC Anti-CD107a humano por amostra, células-alvo e células efetoras foram adicionadas na proporção de 1:1 na placa de 96 poços (U), cocultivadas por 1 hora a 37 °C. Em seguida, 0,7 µL de Golgistop (Inibidor de Transporte de Proteínas) foram adicionados a cada poço e incubados por 4 horas a 37 °C. As células em cada poço foram transferidas para uma placa de 96 poços tipo V, depois de centrifugadas a 1200 rpm por 5 minutos a 4 °C, e depois lavadas duas vezes com BSA/PBS 0,5%. 0,5 µL de APC-cy7 anti-CD4 humano e 0,5 µL de FITC anti-CD8 humano foram adicionados a cada poço, e permaneceram em gelo por 20 minutos no escuro, e a placa foi lavada duas vezes com BSA/PBS 0,5%. 100 µL de solução de fixação celular (Cytofix / Cytoperm: BD) foram adicionados, deixados no gelo por 20 minutos no escuro, 100 µL de perm/lavagem (BD) foram adicionados e centrifugados. Em seguida, a placa foi lavada duas vezes com solução perm/lavagem. 0,5 µL de V450 IFN-γ e 0,5 µL de PE-Cy7 TNF-α foram adicionados a cada poço. Sob condições no escuro, a placa foi mantida em gelo por 30 minutos, lavada duas vezes com BSA/PBS 0,5%. Posteriormente, a placa foi medida pelo citômetro de fluxo FACSCanto II (BD) e os dados foram analisados pelo FACS Diva Software (BD).
14. Captação longa de peptídeos por APC, Apresentação Cruzada peptídeo longo MAGE-A4
[00133] A sequência de aminoácidos do peptídeo longo MAGE-A4 foi NYKRCFPVIF GKASEGVYDG REHTVYGEPR KAETSYVKVL EHVVRVNARV RI (SEQ ID NO: 28), o peso molecular do peptídeo foi de 6006,811. O peptídeo longo foi projetado conectando o epítopo A24 MAGE-A4 143-151 (NYKRCFPVI: SEQ ID NO: 29), o epítopo A2 MAGE-A4 230-239 (GVYDGREHTV: SEQ ID NO: 1) e um epítopo auxiliar (AETSYVKVLE HVVRVNARVR I: SEQ ID NO: 30). (2) Peptídeos longos CHP
[00134] Peptídeo longo CHP significa um objeto que o peptídeo MAGE-A4 longo foi envolvido em nanogel de CHP como um sistema de administração de fármacos. A indução de imunidade celular pode ser esperada usando o objeto (Documento de não patente 5). (3) Seleção de contas negativas CD3
[00135] 1 x 107 células de linfócitos humanos foram suspensas em 80 µL de FCS/PBS 2%. À suspensão, 20 µL de CD3 Micro Beads (Miltenyi Biotec) foram adicionados e bem misturados. Após 15 minutos a 4 °C em revestimento leve, a suspensão fo i lavada com 10 volumes de de FCS/PBS 2%. As células foram suspensas em 3 mL de FCS/PBS 2% para serem utilizadas como suspensão celular. A suspensão de células foi aplicada ao MACS Separator equipado com uma coluna MACS. As frações que foram passadas através da coluna foram frações CD3 negativas, usadas como APC.
15. Citotoxicidade do Ensaio Ensaio de liberação de Cr
[00136] Após as células-alvo serem recolhidas por centrifugação, foram suspensas em 100% de FCS a uma concentração final de 1 x 106 células/50 µL. A esta mistura, 50 µCi (3,7 x 106 Bq) de 51 Cr foram adicionados, e incubada durante 1 hora a 37 °C na i ncubadora com CO2. A concentração de células efetoras foi ajustada de acordo com a proporção E/T em FCS-RPMI1640 10% e foi semeada em placa de 96 poços em formato de U. Após a cultura, as células foram lavadas três vezes com FCS-RPMI1640 10%. As células foram suspensas em FCS-RPMI 1640 10% a uma concentração final de 1 x 105 células/mL, foram semeadas a 1 x 104 células/100 µL/poço em placa de 96 poços em formato de U e foram cultivadas por 8 horas em incubadora com CO2 a 37 °C. Após a cultura, a placa foi centrifugada a 1200 rpm por 5 minutos a 4 °C, 30 µL de sobrenadante foram transferidos para a placa para leitura e secos por secagem ao ar durante a noite. A quantidade 51 de Cr foi determinada pelo contador de cintilação MicroBeta2 (Perkin Elmer). O cálculo da atividade citotóxica foi determinado pela seguinte equação. O valor máximo de liberação foi o valor medido quando 100 µL de NP-40 1% foram adicionados.
[00137] Atividade citotóxica (%) = 100 × (valor medido (cpm) - valor de liberação espontânea (cpm)) / (valor máximo de liberação (cpm) - valor de liberação espontânea (cpm)).
16. Experiência in vivo de modelo de tratamento do câncer usando o camundongo NOG Camundongos utilizados
[00138] Camundongos NOG (NOD/Shi-scid, IL-2RγKO Jic) foram adquiridos junto à CLEA Japan, Inc. As fêmeas dos camundongos foram utilizadas na experiência de 7 a 8 semanas de idade. A terapia de infusão de células T com animais de laboratório e o estudo da imunoterapia gênica foram aprovados pelo comitê de experimentos de DNA recombinante da Universidade Mie, pelo Comitê de Ética em
Pesquisa da Escola de Medicina da Universidade Mie e pelo comitê de pesquisa com animais. Os ratos foram criados no Centro de Ciências da Vida da Universidade Mie para Pesquisa e Suporte do Centro de Pesquisa em Animais. (2) Implantação de tumor humano e irradiação corporal total (TCE)
[00139] Como pré-tratamento, a irradiação corporal total (TBI) com 2,5 Gy para camundongos NOG foi realizada no dia anterior à infusão celular. O número de linfócitos no receptor foi reduzido pelo pré- tratamento, para que os linfócitos doados transfundidos fossem enxertados facilmente. As células CAR-T e linfócitos humanos para infusão foram 1 × 107 células/animal. As células foram transfundidas a partir da veia da cauda de camundongos NOG. O peso corporal foi medido a cada 2 ou 3 dias.
[00140] O transplante do tumor em camundongos NOG foi realizado em 7 dias antes da infusão das células CAR-T, NW-MEL-38 (positivas para A2 positivas para MAGE-A4) por 2,5 x 106 células/camundongo foram injetadas no lado direito do camundongo, HCT116 (positivas para A2 negativas para MAGE-A4) por 2,5 células x 106 células/camundongo foram injetadas subcutaneamente no lado esquerdo do camundongo. Os diâmetros do tumor foram medidos a cada 2 ou 3 dias. (3) Preparação de células para infusão
[00141] As células CAR-T para infusão foram preparadas de acordo com o método acima "10. Transferência de genes para células por retrovírus". (4) isolamento de PBMCs no sangue periférico de camundongos por amostragem de sangue orbital
[00142] O sangue periférico foi coletado do orbital do camundongo, PBMCs foram separadas usando Ficoll. Elas foram marcadas com o tetrâmero A2-MAGE-A4, anticorpo fluorescente CD4CD8 humano, as células infundidas foram confirmadas por FACS. (5) Confirmação de TIL (linfócitos infiltrantes de tumores)
[00143] O tumor retirado do camundongo foi triturado, marcado com anticorpo fluorescente CD4CD8 humano do tetrâmero A2-MAGE-A4 e as células transfundidas foram confirmadas por FACS. (6) Imunomarcação
[00144] O tumor excisado do camundongo foi congelado em nitrogênio líquido, as seções congeladas foram preparadas por criostato. Essas seções foram marcadas por DAPI, CD4-FITC humana e CD8-FITC humana e observadas com um microscópio de fluorescência.
17. Experimentos in vitro com células T positivas para CD8 introduzidas em CAR tipo zG e células T positivas para CD8 introduzidas em CAR tipo 4-1BBz
[00145] Os efeitos das células CAR-T devido a diferenças na região do CDI foram confirmados. Especificamente, CD137 CAR tipo GITR (zG) e tipo (4-1BBz) foram produzidas a partir de CAR tipo CD28 (28z), cujos efeitos foram confirmados. Como mostrado na Figura 21, GITR (receptor do fator de necrose tumoral induzido por glicocorticoide) foi utilizado em vez de CD28 como CDI em CAR zG. Da mesma forma, CD137 (4-1BBz) foi utilizado em vez de CD28
[00146] Como controle, foram utilizadas células T positivas para CD8 não transfectadas com CAR (NGMC). Resultados Isolamento e avaliação do anticorpo que reconhece HLA-A2- MAGE-A4
[00147] É conhecido que MAGE-A4 (HLA-A2-MAGE-A4) é altamente expresso em melanoma. Portanto, uma pluralidade de anticorpos que reconhecem MAGE-A4 foram isolados por rastreamento utilizando bibliotecas de anticorpos humanos. O método de exibição de fagos foi utilizado para isolamento de anticorpos. No método, scFv é apresentado como parte de uma proteína cp3 de revestimento de fago, e os clones que se ligam ao antígeno com alta afinidade podem ser selecionados por ELISA. Depois de coletados cerca de 1500 clones, ELISA foi realizado no estado de scFv-CP3. Os clones que responderam a HLA-A2-MAGE-A4 como alvo positivo e não responderam a A2-CMV como alvo negativo foram selecionados. Para examinar a especificidade de ligação dos anticorpos selecionados, o ELISA foi conduzido usando os vários complexos peptídeos-MHC (pMHC). Cada monômero de pMHC, contendo HLA- A2-MAGE-A4 p230, MAGE-A4 p286, MAGE-A3 p195, CMV, MelanA, GP3, HTLV-1 p11, NY-ESO-1 p157, NY-ESO-1 p159, Foxp3 p69, Foxp3 p127, Foxp3 p390, IDO p41, IDO p41, IDO p195 e IDO p199 foram imobilizados, ELISA foi realizado utilizando anticorpos selecionados. Alguns resultados do ELISA são mostrados na Figura 3.
[00148] Foram obtidos quinze clones mostrando uma reação específica a HLA-A2-MAGE-A4 depois de comparada a sequência dos clones mostrando forte ligação a HLA-A2-MAGE-A4. Entre eles, 5 clones mostrando forte ligação, isto é, MAGE#17, #86, #209, #345 e #672, foram selecionados como clones candidatos e prosseguiram as análises.
[00149] Em seguida, o valor de KD do anticorpo MAGE #17 foi medido com BiacoreX100. A determinação do valor de KD por Biacore foi determinada medindo as mudanças dinâmicas na sensibilidade de detecção (ressonância, refletindo a mudança de massa no chip) ao longo do tempo. A constante da taxa de dissociação (Kd) e a constante da taxa de ligação (Ka) foram determinadas pela curva de mudança dinâmica, a constante de ligação foi determinada a partir da razão das duas constantes. Como resultado da medição, a constante de ligação de MAGE # 17 foi de 22 nM (Figura 4).
2. Estudo da especificidade do reconhecimento do complexo A2- MAGE-A4 e antígeno de risco dos anticorpos obtidos
[00150] A célula T2 não possui o Transportador Associado ao Processamento de Antígenos (TAP), não apresenta a proteína intracelular para o HLA. Quando o peptídeo foi pulsado para a célula T2, como HLA foi estabilizado em T2, o nível de expressão de HLA foi confirmado usando o anticorpo anti-HLA fluorescente, é possível reconhecer qual a extensão do peptídeo que se liga ao HLA.
[00151] Anticorpos selecionados, ou seja, anti-MAGE #17, #86, #209, #345 e #672 foram reagidos com células T2 pulsadas com MAGE-A4p230, CMV e DMSO, a quantidade de mudança foi determinada por FACS. Somente na célula T2 pulsada com MAGE-A4 p230, os clones de anticorpos selecionados, MAGE #17, #86, #209, #345 e #672 mostraram a alteração na quantidade de deslocamento (Figura 5).
[00152] Em seguida, para pesquisar os aminoácidos que correlacionavam o reconhecimento de anticorpos, peptídeos com uma substituição de aminoácido por outro aminoácido (principalmente alanina) de MAGE-A4 p230 (GVYDGREHTV: SEQ ID NO: 1) foram preparados, a força de ligação entre HLA-A*0201 e o peptídeo foi examinada usando IEDB (Base de Dados de Epítopo Imune) e determinada a IC50 de MHC (Tabela 2). IC50 de MHC é o valor teórico calculado pelo IEDB, quando o valor é menor, a ligação com HLA- A*0201 e o peptídeo é mais forte. Os peptídeos substituídos com alanina foram pulsados para a célula T2, a quantidade de HLA na superfície da célula T2 foi determinada por FACS (Figura 6). Mais fortemente, um peptídeo se liga ao HLA, a estrutura do peptídeo-HLA foi estabilizada, uma vez que a quantidade de deslocamento de FACS foi aumentada, o valor da MFI foi um indicador da força de ligação do peptídeo e do HLA. Exceto alguns dos peptídeos, o valor de MFI e o valor da IC50 de MHC correspondiam um ao outro.
[00153] Em seguida, o peptídeo substituído por alanina foi pulsado para a célula T2 e reagido com MAGE #17, o aminoácido envolvido no reconhecimento do anticorpo foi examinado (Figura 7). Como o valor da IMF caiu com 1A, 2A, 3A, 4A, 5A, 6A e 8A, os sete aminoácidos foram determinados como envolvidos no reconhecimento. A sequência de aminoácidos de GVYDGRxHxx foi conduzida por pesquisa BLAST, o peptídeo de risco foi extraído (Tabela 3). Após a célula T2 ser pulsada pelo peptídeo de risco, a quantidade de HLA na superfície da célula T2 foi determinada por FACS. Similar aos resultados mostrados na Figura 6, o valor da MFI e o valor da IC50 de MHC de MFI correspondiam entre si (Figura 8).
[00154] Então, a célula T2 foi pulsada pelo peptídeo de risco, reagida com MAGE # 17 e confirmou que a célula T2 não reconhece o peptídeo de risco (Figura 9). Ensaios similares foram praticados usando outros clones # 86, # 209, # 345 e # 672, nos resultados, o clone # 17 teve a maioria dos aminoácidos envolvidos no reconhecimento do antígeno. Por esse motivo, o MAGE # 17 foi feito como candidato final.
[00155] A sequência nucleotídica (SEQ ID NO: 31) e a sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 32) de MAGE # 17 foram mostradas.
[00156] Sequência de nucleotídeos de MAGE #17 (SEQ ID NO: 31):
CAGGTCCAGC TGGTACAGTC TGGGGCTGAG GTGAAGAAGC CTGGGTCCTC GGTGAAGGTC TCCTGCAAGG CTTCTGGAGG CACCTTCAGC AGCTATGCTA TCAGCTGGGT GCGACAGGCC CCTGGACAAG GGCTTGAGTG GATGGGAGGG ATCATCCCTA TCTTTGGTAC AGCAAACTAC GCACAGAAGT TCCAGGGCAG AGTCACGATT ACCGCGGACA AATCCACGAG CACAGCCTAC ATGGAGCTGA GCAGCCTGAG ATCTGAGGAC ACGGCCGTGT ATTACTGTGC GAGATCCCCC CGGCGGGCAT ATCATGATGC TTTTGATATC TGGGGCCAAG GGACAATGGT CACCGTCTCT TCAGGTGGAG GCGGTTCAGG CGGAGGTGGC AGCGGCGGTG GCGGGAGTTC CTATGAGCTG ACTCAGCCAC CCTCGATGTC AGTGGCCCCA GGAAAGACGG CCAGCATTAC CTGTGGCGGA GACCATATTG GAAGTAAAAG TGTTCACTGG TACCAGCAGA AGCCAGGCCA GGCCCCTGTA CTGGTCGTCT ATGATGATAG CGACCGGCCC TCAGGGATCC CTGAGCGATT CTCTGGCTCC AACTCTGGGA ACACAGCCAC TCTGACCATC AGCGGGACCC AGGCTATGGA TGAGGCTGAC TATTACTGTC TGGCGTGGGA CAGCAGCACT GCGATCTTCG GCGGAGGGAC CAAGCTGACC GTCCTC.
[00157] A sequência de aminoácidos de MAGE #17 (SEQ ID NO: 32): QVQLVQSGAE VKKPGSSVKV SCKASGGTFS SYAISWVRQA
PGQGLEWMGG IIPIFGTANY AQKFQGRVTI TADKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCARSP RRAYHDAFDI WGQGTMVTVS SGGGGSGGGG SGGGGSSYEL TQPPSMSVAP GKTASITCGG DHIGSKSVHW YQQKPGQAPV LVVYDDSDRP SGIPERFSGS NSGNTATLTI SGTQAMDEAD YYCLAWDSST AIFGGGTKLT VL.
[00158] As sequências acima mostram a sequência nucleotídica que contém VH (SEQ ID NO: 33), sc (SEQ ID NO: 34) e VL (SEQ ID NO: 35), e a sequência de aminoácidos que contém VH (SEQ ID NO: 36), sc (SEQ ID NO: 37) e VL (SEQ ID NO: 38), como mostrado a seguir.
[00159] A sequência nucleotídica de VH (SEQ ID NO 33):
CAGGTCCAGC TGGTACAGTC TGGGGCTGAG GTGAAGAAGC CTGGGTCCTC GGTGAAGGTC TCCTGCAAGG CTTCTGGAGG CACCTTCAGC AGCTATGCTA TCAGCTGGGT GCGACAGGCC CCTGGACAAG GGCTTGAGTG GATGGGAGGG ATCATCCCTA TCTTTGGTAC AGCAAACTAC GCACAGAAGT TCCAGGGCAG AGTCACGATT ACCGCGGACA AATCCACGAG CACAGCCTAC ATGGAGCTGA GCAGCCTGAG ATCTGAGGAC ACGGCCGTGT ATTACTGTGC GAGATCCCCC CGGCGGGCAT ATCATGATGC TTTTGATATC TGGGGCCAAG GGACAATGGT CACCGTCTCT TCA.
[00160] A sequência nucleotídica da região sc (SEQ ID NO 34):
GGTGGAGGCG GTTCAGGCGG AGGTGGCAGC GGCGGTGGCG GGAGTTCCTA T.
[00161] A sequência nucleotídica da região VL (SEQ ID NO 35):
GAGCTGACTC AGCCACCCTC GATGTCAGTG GCCCCAGGAA AGACGGCCAG CATTACCTGT GGCGGAGACC ATATTGGAAG TAAAAGTGTT CACTGGTACC AGCAGAAGCC AGGCCAGGCC CCTGTACTGG TCGTCTATGA TGATAGCGAC CGGCCCTCAG GGATCCCTGA GCGATTCTCT GGCTCCAACT CTGGGAACAC AGCCACTCTG ACCATCAGCG GGACCCAGGC TATGGATGAG GCTGACTATT ACTGTCTGGC GTGGGACAGC AGCACTGCGA TCTTCGGCGG AGGGACCAAG CTGACCGTCC TC.
[00162] A sequência de aminoácidos da região VH (SEQ ID NO 36):
QVQLVQSGAE VKKPGSSVKV SCKASGGTFS SYAISWVRQA PGQGLEWMGG IIPIFGTANY AQKFQGRVTI TADKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCARSP RRAYHDAFDI WGQGTMVTVS S.
[00163] A sequência de aminoácidos da região sc (SEQ ID NO: 37): GGGGSGGGGS GGGGSSY.
[00164] A sequência de aminoácidos da região VL (SEQ ID NO: 38): ELTQPPSMSV APGKTASITC GGDHIGSKSV HWYQQKPGQA
PVLVVYDDSD RPSGIPERFS GSNSGNTATL TISGTQAMDE ADYYCLAWDS STAIFGGGTK LTVL.
3. CAR MAGE # 17 reconhece especificamente a célula cancerígena-alvo e a produção de IFN-γ aumentou.
[00165] Uma vez que a especificidade do clone de anticorpo MAGE # 17 foi confirmada, MAGE # 17 foi substituído pelo vetor de CAR. Então, após a preparação do mRNA, foi confirmado pelo bioanalisador, o gene CAR foi introduzido nos linfócitos do sangue periférico humano (PBMCs) pelo método de eletroporação. A confirmação ou não de CAR normalmente expresso foi confirmada por marcação com tetrâmero. Consequentemente, a taxa positiva de CAR das células CAR-T foi de 98,8% por CD8 e de 98,5% por CD4 (Figura 10). A célula CAR-T e a célula T2 pulsada com peptídeo foram cocultivadas por 24 horas e o IFN-γ no sobrenadante da cultura foi medido, a produção de IFN-γ na célula T2 pulsada com MAGE-A4 foi especificamente aumentada. Ensaio similar foi realizado utilizando células de controle (células sem transfecção de genes). Além disso, foi observada produção específica para tumor de IFN-γ em células-alvo NW-MEL-38 e LB-23 positivas para A2 positivas para MAGE-A4, em comparação com células não alvo de LC-1/sq e MEL72 (Figura 11).
[00166] Uma vez que a expressão de CAR por mRNA foi transitória, foi realizada a transfecção de genes por retrovírus para expressão permanente de CAR. Após o vetor de retrovírus ser construído para a introdução do CAR, o retrovírus foi preparado pelo empacotamento das células plat-A, a célula CAR-T foi produzida por infecção do retrovírus em PBMCs. A transferência de genes foi realizada de acordo com o método acima "10. Transferência de genes para células por retrovírus". A expressão de CAR foi confirmada por marcação com tetrâmero. Consequentemente, a taxa positiva de CAR das células CAR-T foi de 59,3% por CD8 e de 49,5% por CD4 (Figura 12).
[00167] As células CAR-T transferidas com genes por retrovírus e células T2 pulsadas com peptídeo foram cocultivadas por 24 horas, foi medido o IFN-γ no sobrenadante da cultura, a produção de IFN-γ na célula T2 pulsada com MAGE-A4 foi especificamente aumentada. Ensaio similar foi realizado utilizando células de controle (células sem transfecção de genes). Além disso, foi observada produção específica para tumor de IFN-γ em células-alvo NW-MEL-38 e LB-23 positivas para A2 positivas para MAGE-A4, em comparação com células não alvo de LC-1/sq e MEL72 (Figura 13). Foi confirmado que o CAR foi expresso pela introdução do mRNA e introdução do gene de CAR por vetores de retrovírus, a célula reconheceu especificamente o tumor e produziu IFN-γ.
[00168] 4. A célula CAR-T introduzida com o gene CAR MAGE #17 reconheceu especificamente células cancerígenas-alvo e mostrou atividade citotóxica.
[00169] Esperava-se que as células CAR-T reconhecessem A2- MAGE-A4 expresso como antígeno nas células cancerígenas, fossem ativadas e exibissem atividade citotóxica. IFN-γ, TNF-α e CD107a são conhecidos como indicadores da ativação das células T, são expressos cada vez mais de acordo com a ativação da célula T. Portanto, a marcação intracelular de citocina (marcação intracelular de citocina: ICS) da célula T2 pulsada por peptídeo e MAGE # 17 CAR cocultivada com célula-alvo foi conduzida.
[00170] Como resultado, a proporção de células CAR-T marcadas com IFN-γ, TNF-α e CD107a foi aumentada em cocultura com células T2 pulsadas com MAGE-A4p230 (Figura 14). Além disso, a proporção de células CAR-T marcadas com IFN-γ, TNF-α e CD107a foi aumentada em cocultura com células-alvo quando cocultivadas com NW-MEL-38 e LB-23 positivas para A2-positivas para MAGE-A4 (Figura 15).
[00171] 5. A produção de IFN-γ em células CAR-T foi aumentada pela apresentação do antígeno da célula apresentadora de antígeno (APC) que utilizou o antígeno de peptídeo longo MAGE-A4.
[00172] As PBMCs foram separadas do sangue periférico humano saudável, a seleção negativa foi realizada por contas magnéticas de CD3, as frações de CD3 foram usadas como células apresentadoras de antígeno (APC). A2-APC como APC no qual MAGE-A4p230 foi apresentado e A24-APC como APC para controle negativo foram utilizados. O peptídeo longo MAGE-A4 e o peptídeo longo CHP- MAGE-A4 foram adicionados a uma concentração final de 10 µM, cultivados durante a noite e cocultivados com células CAR-T por 24 horas. A transfecção gênica para células CAR-T foi conduzida de acordo com o método acima "10. Transferência de genes para células por retrovírus". Como resultado, a concentração de IFN-γ no sobrenadante da cultura foi aumentada em cocultura com A2-APC pulsado com peptídeo longo MAGE-A4 (Figura 16).
[00173] Os peptídeos longos MAGE-A4 foram incorporados na APC, o MAGE-A4p230 foi apresentado com produção de MHC classe I, IFN-γ de células CAR-T que reconheciam o complexo MAGE- A4p230-MHC classe I aumentou especificamente. Por outro lado, a produção específica de IFN-γ não foi observada em peptídeos longos de CHP-MAGEA4 envolvidos em CHP Nanogel como um sistema de administração de fármacos.
[00174] 6. Células CAR-T em que o gene CAR MAGE #17 foi transferido lisaram especificamente as células cancerígenas-alvo.
[00175] Foi confirmado se a atividade citotóxica específica de CAR 51 MAGE #17 foi observada ou não por ensaio de liberação de Cr. Quando a proporção entre células CAR-T e células-alvo do câncer era a proporção E/T (proporção efetor/alvo), as células cancerígenas que utilizaram Cr, e as células CAR-T eram cocultivadas por 8 horas com a proporção ET era de 10:1, 3 :1, 1:1, a taxa de citotoxicidade (% de lise) 51 foi determinada a partir da radioatividade de Cr no sobrenadante. A transferência de genes para células CAR-T foi realizada de acordo com o método acima "10. Transferência de genes para células por retrovírus".
[00176] Como resultado, foi observada citotoxicidade específica para MAGE-A4 em células T2 pulsadas com o peptídeo p230 MAGE- A4 (Figura 17). Além disso, nas células-alvo, foi confirmada citotoxicidade específica para células NW-MEL-38 que eram células positivas para A2-positivas para MAGE-A4 (Figura 18).
[00177] 7. Modelo de terapia para câncer de camundongo Modelo usando NW-MEL-38 e HCT116
[00178] Uma vez que o camundongo NOG carece de receptor γ comum, as células NK não existem no camundongo. Portanto, o enxerto de células e tecidos humanos é significativamente mais alto no camundongo NOG do que o camundongo NOD-SCID, o câncer e o tecido humano podem ser facilmente enxertados no NOG. Além disso, uma vez que é observada diferenciação de células T humanas após o transplante de células-tronco hematopoiéticas humanas, era esperado um modelo de camundongo NOG para o modelo do sistema imunológico humano. Camundongos NOG têm as características que contêm deleção de células T e células B, deleção de células assassinas naturais (NK), redução das funções das células dendríticas, diminuição das funções dos macrófagos, perda de atividade do complemento, falta de vazamento de células B e células T associadas ao envelhecimento (vazamento).
[00179] Para camundongos NOG, NW-MEL-38 (positivo para A2- MAGE positivo para A4) por 2,5 x 106 células/camundongo foram injetadas no lado direito do camundongo, HCT116 (positivo para A2 negativo para MAGE-A4) por 2,5 × 106 células/camundongo foram injetadas subcutaneamente no lado esquerdo do camundongo. Como pré-tratamento, a irradiação corporal total (TBI) com camundongos 2,5 Gy para NOG foi realizada nos 6 dias após o transplante do tumor. À medida que o TBI reduzia os linfócitos nos receptores, os linfócitos doados transplantados seriam enxertados facilmente. No dia 7, células CAR-T MAGE # 17 e linfócitos humanos foram infundidos a partir da veia da cauda por 1 x 107 células/animal. A transferência de genes para células CAR-T foi realizada de acordo com o método acima "10. Transferência de genes para células por retrovírus". A taxa positiva de CAR foi de 36,3% em CD8 e de 38,5% em CD4 (Figura 19).
[00180] Os experimentos foram realizados contendo o grupo infundido de células CAR-T (n = 2), grupo de infusão de linfócitos humanos (CAR não transferido (n = 2)) e grupo PBS (n = 2), medindo- se o tamanho do tumor e o peso corporal a cada 2 ou 3 dias. As medições foram realizadas até 42 dias após a implantação do tumor.
[00181] Como resultado, no grupo infundido com células CAR-T, foi observada inibição do crescimento de NW-MEL-38 (positivo para A2 positivo para MAGE-A4) no camundongo #1 e camundongo #2. Por outro lado, não foi observada inibição do crescimento de HCT116 (negativo para MAGE-A4 positivo para A2). O camundongo nº 1 morreu após 34 dias da implantação do tumor. A causa da morte não foi a morte por tumor, mas seria uma infecção (Figura 20). (2) Experimentos dos efeitos das diferenças do domínio intracelular (ICD)
[00182] A seguir, foram confirmados os efeitos das células CAR-T devido a diferenças na porção de ICD. A Figura 21 mostra a imagem da sequência genética de CAR zG. Em CAR zG, foi utilizado ICD de GITR em vez de CD28. GITR é um receptor do fator de necrose tumoral induzível por glicocorticóides, CAR usando o ICR é conhecido como o nível de expressão de citocinas por aquele do CAR era maior (WO2013051718). No CAR zG, o ICD de CD28 no CAR 28z na Figura 2 foi alterado no ICD do GITR, e a ordem dos domínios CD3ζ e CID no CAR 28z foi alterada. Outras partes foram usadas com sequências idênticas de CAR 28z.
[00183] NW-MEL-38 (positivo para A2 positivo para MAGE-A4), 2,5 x 106 células/camundongo foram injetadas por via subcutânea a camundongos NOG. Três dias após a implantação do tumor, a irradiação corporal total (TCE) com 2,0Gy foi realizada como pré- tratamento. No dia 4, células ou PBS e linfócitos humanos, 4 x 106 células/camundongo para cada grupo A a C (n = 4) mostrado a seguir foi infundido através da veia da cauda. A transferência de genes para células CAR-T foi realizada de acordo com o método acima "10. Transferência de genes para células por retrovírus". Foi infundido PBS no grupo A, células CAR-T MAGE # 17 no grupo B (28z) e células CAR-T (zG) no grupo C.
[00184] O diâmetro dos tumores e o peso corporal foram medidos a cada 2 ou 3 dias para o grupo A a C. As medições foram realizadas até 24 dias após a implantação do tumor.
[00185] Como resultado, foi observada a inibição do crescimento de NW-MEL-38 (positivo para A2 positivo para MAGE-A4), quando células CAR-T com 28z de ICT ou zG de ICT foram infundidas (Figura 22). Na modalidade, foi verificado que o mesmo efeito foi obtido ao alterar o domínio intracelular.
[00186] 8. Experimentos sobre os efeitos das células T positivas para CD8 introduzidas com CAR tipo zG e células T positivas para CD8 introduzidas com CAR tipo 4-1BBz
[00187] (1) A construção do vetor de retrovírus introduzido com CAR tipo zG e CAR tipo 28z, após a preparação do retrovírus com as células de empacotamento plat-A, as células CAR-T foram produzidas pela infecção do retrovírus nas PBMCs. A transferência de genes foi realizada de acordo com o método acima "10. Transferência de genes para células por retrovírus". A expressão de CAR foi confirmada por marcação com tetrâmero. Consequentemente, a taxa de positivo para CAR de células CAR-T tipo zG foi de 99,1% por CD8, e a de células CAR-T tipo 28z foi de 99,8% por CD8 (Figura 23).
[00188] (2) Células CAR-T transfectadas com genes por retrovírus
(4 x 104 células) e células T2 pulsadas com peptídeo, NW-MEL-38, SK-MEL-37, e HCT116 (respectivamente, 2 x 105 células) foram cocultivadas durante 18 horas, e INF-y foi medido no sobrenadante da cultura. Como mostrado na Figura 24, a produção de IFN-γ foi aumentada especificamente em células CAR-T transfectadas com CAR tipo zG e CAR tipo 28z, em células T2 pulsadas com MAGE-A4 e células NW-MEL-38 e células SK-MEL-37.
[00189] Ensaio similar foi realizado utilizando células de controle (células sem transfecção de genes). Não foi observada produção de IFN-γ em HCT116 MAGE-A4 positiva para A2 como célula-alvo. A produção de IFN-γ não foi observada apenas nos efetores (somente Efetor) e somente no alvo (somente Alvo).
[00190] Dessa forma, células T positivas para CD8 introduzidas com CAR tipo zG induziu a produção de INF-γ in vitro. Os dados podem explicar com sucesso os resultados obtidos in vivo.
[00191] (3) Em seguida, ensaios similares aos de (1) e (2) foram realizados usando células T CD8 positivas para 4-1BBz introduzidas com CAR para obter os caracteres das células. Como mostrado na Figura 25, em células CAR-T transfectadas com CAR tipo 4-1BBz, a produção de IFN-γ foi aumentada especificamente para células T2 pulsadas com MAGE-A4.
[00192] Nas células T2 pulsadas com peptídeo controle, não foi observada produção de IFN-γ. Somente em efetores (somente Efetor) e somente alvo (somente Alvo), a produção de IFN-γ não foi observada.
[00193] Dessa forma, mesmo quando o ICD foi alterado para o tipo 4-1BBz, o mesmo efeito foi observado. Os dados in vitro podem explicar facilmente os resultados obtidos in vivo.
[00194] Dessa maneira, mesmo quando o ICD foi alterado, o mesmo efeito do tipo zG foi observado.
[00195] Dessa forma, de acordo com essas modalidades, uma proteína de ligação ao antígeno que reconhece especificamente o complexo peptídeo derivado de MAGE-A4/HLA-A2, ácidos nucleicos que codificam a proteína de ligação ao antígeno, um vetor contendo os ácidos nucleicos, um receptor de antígeno quimérico incluindo a proteína de ligação ao antígeno, ácidos nucleicos que codificam o receptor de antígeno quimérico, um vetor contendo os ácidos nucleicos, uma célula que expressa o receptor de antígeno quimérico e uma composição farmacêutica contendo as células foram fornecidos.
[00196] A proteína de ligação ao antígeno que reconhece especificamente o complexo peptídeo derivado de MAGE-A4/HLA-A2, pode ser utilizada em terapia celular e no campo da terapia genética. A invenção é extremamente útil para a detecção de células tumorais que expressam o complexo peptídeo derivado de MAGE-A4/HLA-A2, curaa para tumores, pesquisas e experimentos de tumores. As células CAR- T da invenção podem fornecer terapia de câncer muito eficaz, uma vez que os efeitos colaterais são muito pequenos. Técnica anterior Documento de não patente Documento de não patente 1: Brentjens RJ, et al: Safety and persistence of adoptively transferred autologous CD19-targeted T cells in patients with relapsed or chemotherapy refractory B- leukemias. Blood 2011,118:4817-4828. Documento de não patente 2: Dao T, Yan S, Veomett N, Pankov D, Zhou L, Korontsvit T, et al: Targeting the intracellular WT1 oncogene product with a therapeutic human antibody. Sci Transl Med 2013; 5 : 176ra133. Documento de não patente 3: Van Der Bruggen P, Zhang Y, Chaux P, Stroobant V, Panichelli C, Schultz ES, Chapiro J, Van Den Eynde BJ, Brasseur F, Boon T. Tumor-specific shared antigenic peptides recognized by human T cells.
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Claims (13)

REIVINDICAÇÕES
1. Proteína de ligação ao antígeno, caracterizada pelo fato de que compreende o seguinte polipeptídeo (A) ou (B) e reconhece o complexo HLA-A2-MAGE-A4: (A) o polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos de VH (região variável da cadeia pesada) da SEQ ID NO: 36 e a sequência de aminoácidos de VL (região variável da cadeia leve) da SEQ ID NO: 38; (B) o polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos com pelo menos 90% de homologia de VH (região variável da cadeia pesada) da SEQ ID NO: 36 e a sequência de aminoácidos com pelo menos 90% de homologia de VL (região variável da cadeia leve) da SEQ ID NO: 38.
2. Proteína de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que compreende o seguinte polipeptídeo (C) ou (D) entre VH e VL: (C) o polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos de sc (cadeia única) da SEQ ID NO: 37; (D) o polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 90% de sc (cadeia única) da SEQ ID NO: 37.
3. Proteína de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que compreende o polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 32, ou o polipeptídeo com pelo menos 90% de homologia da SEQ ID NO: 32.
4. Proteína de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que a proteína de ligação ao antígeno é Fab, Fab’, F(ab’)2 , Fv ou Fv de cadeia única (scFv).
5. Ácido nucleico caracterizado pelo fato de que codifica a proteína de ligação ao antígeno, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 4.
6. Vetor caracterizado pelo fato de que compreende o ácido nucleico como definido na reivindicação 5.
7. Receptor de antígeno quimérico caracterizado pelo fato de que compreende as proteínas de ligação ao antígeno como definidas em qualquer uma das reivindicações 1 a 4 e um domínio intracelular de uma proteína de transdução de sinal.
8. Receptor de antígeno quimérico, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a proteína de transdução de sinal é qualquer uma de CD3zeta (CD3ζ) e moléculas coestimuladoras CD (GITR).
9. Receptor de antígeno quimérico, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que compreende ainda qualquer um dos domínios intracelulares de CD28 e GITR.
10. Ácido nucleico caracterizado pelo fato de que codifica o receptor de antígeno quimérico como definido em qualquer uma das reivindicações 7 a 9.
11. Vetor caracterizado pelo fato de que compreende o ácido nucleico como definido na reivindicação 10.
12. Célula caracterizada pelo fato de que expressa o receptor de antígeno quimérico como definido em qualquer uma das reivindicações 7 a 9.
13. Composição farmacêutica caracterizada pelo fato de que compreende a célula como definida na reivindicação 12 como um ingrediente ativo.
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