CN110664807B

CN110664807B - 一种具有协同抗黑色素瘤功效的药物组合物及其应用

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Publication number: CN110664807B
Application number: CN201910700578.0A
Authority: CN
Inventors: 白钢; 张伟怡; 高洁; 侯媛媛; 姜民
Original assignee: Nankai University
Current assignee: Nankai University
Priority date: 2019-07-31
Filing date: 2019-07-31
Publication date: 2021-07-20
Anticipated expiration: 2039-07-31
Also published as: CN110664807A

Abstract

本发明公开了一种具有协同抗黑色素瘤功效的药物组合物及其应用，该药物组合物，是包括桂皮醛和达卡巴嗪。本发明的组合物具有较好的抗黑色素瘤效果，在开展肿瘤发病机理的研究中结合使用相关小鼠移植瘤模型的病理实验发现，将桂皮醛和达卡巴嗪联合使用具有较强的抑制实体瘤生长的作用，桂皮醛和达卡巴嗪具有协同作用，因此，可减少达卡巴嗪的用药量，从而减少了由化疗药物引起的副作用的风险，应用于治疗黑色素瘤。

Description

一种具有协同抗黑色素瘤功效的药物组合物及其应用

技术领域

本发明属于医药技术领域，涉及一种具有协同抗黑色素瘤功效的药物组合物及其应用。

背景技术

目前，黑色素瘤是皮肤癌中常见且病死率最高的一种恶性肿瘤，病死率约占80％，治疗手段除了传统的手术治疗、放化疗外，还包括靶向治疗和免疫治疗。2011年之前， FDA批准的转移性黑色素瘤的治疗药物是达卡巴嗪、重组人白细胞介素(IL)-2和高剂量或聚乙二醇化干扰素(IFN)-α，但是这些治疗药物仅在约20％的患者中产生抗肿瘤反应。而靶向治疗、免疫治疗对黑色素瘤虽然有着明显的治疗效果，但是这些方法在实施的过程中受到限制。如靶向治疗的患者很快出现耐药，免疫治疗仅对部分患者有效【M.Batus, S.Waheed,C.Ruby,etal,Optimal management of meta-static melanoma:current strategies andfuture directions,Am J Clin Dermatol,201314(3)：179-194】。因此，新的药物开发，以及新的药物组合的应用，对于黑色素瘤的治疗进展的突破具有重要意义。

桂皮醛(Cinnamaldehyde，CA)，结构式I所示，是从肉桂树中提取的烯醛类有机化合物，是其挥发油中主要成分。药理研究表明，其具有抗炎、解热镇痛、抗肿瘤等多种药理活性。中国专利也公开了桂皮醛在解热【CN201811042361】、镇痛【CN201810315891】、治疗皮肤及黏膜疾病【CN201810821967、CN201810019853】、抗癌【CN201810973728】等领域中的应用。

达卡巴嗪(Dacarbazine，DTIC)，结构式II所示，是一种嘌呤前体类新型抗肿瘤药，能干扰嘌呤的生物合成，同时兼有烷化剂的作用，由于其口服吸收不完全，个体差异较大，故均用静注。因不能透过血脑屏障，故在对原发瘤有效时仍可出现脑转移。主要用于治疗黑色素瘤，有效率约20-30％，亦能软组织肿瘤、恶性淋巴瘤等【D.Grossman,D.C.Altieri,Drug resistance in melanoma:mechanisms,apoptosis,and new potentialtherapeutic targets, Cancer metastasis reviews,20(2001)3-11】。中国专利也公开了达卡巴嗪能够协同其他药物产生抗肿瘤作用【申请号CN201610015530；CN201810754315；CN201810485125】。但目前仍存在治疗效果不确定，有效率低的问题。

目前，尚未有使用桂皮醛和达卡巴嗪组成组合物治疗黑色素瘤的报道。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术存在的不足，提供一种具有协同抗黑色素瘤功效的药物组合物。

本发明的第二个目的是提供一种具有协同抗黑色素瘤功效的药物组合物在制备抗黑色素瘤药物的应用。

本发明的技术方案概述如下：

一种具有协同抗黑色素瘤功效的药物组合物，包括桂皮醛和达卡巴嗪。

优选地，桂皮醛和达卡巴嗪的摩尔比为10:(6.25-25)

上述组合物在制备抗黑色素瘤药物的应用。

本发明的优点：

将桂皮醛和达卡巴嗪联合使用，其药效大于单独使用的药效，对黑色素瘤的发展具有明显的抑制作用。

经测定，本发明提供的组合物可明显抑制黑色素瘤细胞生长，且具有较强的抗肿瘤功效，本发明的组合物中，使用量少于单独药量。

本发明对药物剂型不作限定，凡是药物领域接受的剂型均在本发明的保护范围之内。

本发明的组合物具有较好的抗黑色素瘤效果，我们在开展肿瘤发病机理的研究中结合使用相关小鼠移植瘤模型的病理实验发现，将桂皮醛和达卡巴嗪联合使用具有较强的抑制实体瘤生长的作用。桂皮醛和达卡巴嗪具有协同作用，因此，可减少达卡巴嗪的用药量，从而减少了由化疗药物引起的副作用的风险，应用于治疗黑色素瘤。

附图说明

图1示通过MTT实验检测两种药物联合作用后对A375细胞的抑制作用和IC₅₀的影响，并通过CompuSyn软件计算两种药物联合作用后的协同指数(Combi-nation index，CI)。图1a为给药后抑制率的变化；图1b为给药后IC₅₀的变化；图1c为给药后CI值的变化。

图2示通过MTT实验检测两种药物联合作用后对A875细胞的抑制作用和IC₅₀的影响，并通过CompuSyn软件计算两种药物联合作用后的协同指数(CI值)。图2a为给药后抑制率的变化；图2b为给药后IC₅₀的变化；图2c为给药后CI值的变化。

图3示通过MTT实验检测两种药物联合作用后对C918细胞的抑制作用和IC₅₀的影响，并通过CompuSyn软件计算两种药物联合作用后的协同指数(CI值)。图3a为给药后抑制率的变化；图3b为给药后IC₅₀的变化；图3c为给药后CI值的变化。

图4示通过MTT实验检测两种药物联合作用后对SK-MEL-1细胞的抑制作用和IC₅₀的影响，并通过CompuSyn软件计算两种药物联合作用后的协同指数(CI值)。图4a为给药后抑制率的变化；图4b为给药后IC₅₀的变化；图4c为给药后CI值的变化。

图5示两药联合与相应单药相比，对A375移植瘤在实验动物体内成瘤的抑制作用；图5a为从各组实验裸鼠中剥离的肿瘤；图5b为各组实验裸鼠的平均体重变化；图5c各组实验裸鼠的平均肿瘤质量变化。

具体实施方式

本发明实验中使用桂皮醛(购自上海阿拉丁，货号C110084)，达卡巴嗪(购自上海迈瑞尔，货号F21540)。

本发明的组合物是将桂皮醛和达卡巴嗪按摩尔比为10:(6.25-25)，混合得到。

在本发明的具体实施方案中，所述黑色素瘤细胞分别为：人恶性黑色素瘤细胞A375、人黑色素瘤细胞A875、人眼脉络黑色素瘤细胞C918和人皮肤黑色素瘤细胞SK-MEL-1细胞，购自Procell(武汉，货号依次为CL-0014、CL-0255、CL-0264、CL-0440)。

使用本发明的组合物，所述桂皮醛的药物浓度为10μM-40μM；所述达卡巴嗪的药物浓度为1.56μM-200μM。

在A375细胞中，优选条件范围为：桂皮醛20-40μM，达卡巴嗪12.5-200μM；

在C918细胞中，优选条件范围为：桂皮醛20μM，达卡巴嗪6.25-100μM；

在SK-MEL-1细胞中，优选条件范围为：桂皮醛10μM，达卡巴嗪1.56-25μM。

在A875细胞中，优选条件为：桂皮醛20μM，达卡巴嗪200μM。

综上，本发明的药物组合物中桂皮醛和达卡巴嗪的摩尔比范围为10:(6.25-25)。

为了验证细胞实验得到的结果，我们在此范围内选取两个不同比例配比的药物联合应用，在动物水平进行实验。在小鼠A375移植瘤模型中进行联合给药时，给药方式为腹腔注射。所述桂皮醛用量为30mg(0.2mmol)/kg/day；所述达卡巴嗪的用量分别为25mg(0.15mmol)mg/kg/day和50mg(0.3mmol)mg/kg/day。

本领域技术人员可以借鉴本文内容适当改进。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，都属于本发明的保护范围。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1

通过MTT实验，考察桂皮醛和达卡巴嗪联用(本发明的组合物，具体配比见表1)对黑色素瘤细胞A375的增殖抑制作用

取对数生长期的细胞，以4000个/孔种于96孔板内，每孔80μL体积，置于37℃、5％CO₂条件的培养箱中培养过夜。待细胞贴壁后，空白组加入双蒸水，对照组加入等倍稀释的溶剂DMSO，均为20μL/孔。联合用药组浓度设定中，桂皮醛的浓度依据单独作用时对不同黑色素瘤细胞的IC₅₀值设定，给药后作用于37℃、5％CO₂条件的培养箱中72h，每种药为10μL/孔；每孔加入20μL MTT溶液(5mg/mL)，置于37℃作用4h，吸除上清后加入150μL DMSO于37℃孵育10min。震荡溶解Formazan结晶后，用酶标仪于570nm 处测定OD值。每组设3个复孔，实验重复3次，取平均值为最终结果。

结果评定：按下列公式分别计算不同化合物对多种细胞生长抑制率：

细胞增殖抑制率(Fa)＝(OD_{溶剂对照组}－OD_给药组)/OD_{溶剂对照组}应用CompuSyn software 软件分析CI值，<1代表具有协同作用,＝1为相加作用,>1为拮抗作用。

结果表明，不同浓度的桂皮醛和达卡巴嗪联合作用后，抑制作用强于单独药效，IC₅₀值明显减小，且可以在部分浓度下表现出对黑色素瘤细胞A375的协同抑制作用，*代表P＜0.05，**代表P＜0.01，差异具有统计学意义(图1，表1)。

表1 A375细胞中CA+DTIC联合作用(组合物)后的CI值

实施例2

通过MTT实验，考察桂皮醛和达卡巴嗪联用(本发明的组合物，具体配比见表2)对黑色素瘤细胞A875的增殖抑制作用.

细胞种板、给药浓度设定、作用时间以及细胞活力测定方法均依据实施例1中，每组设3个复孔，实验重复3次，取平均值为最终结果。应用CompuSyn software软件分析 CI值，<1代表具有协同作用,＝1为相加作用,>1为拮抗作用。

结果表明，不同浓度的桂皮醛和达卡巴嗪联合作用后，抑制作用强于单独药效，IC₅₀值明显减小，且可以在部分浓度下表现出对黑色素瘤细胞A875的协同抑制作用，*代表P＜0.05，**代表P＜0.01，差异具有统计学意义(图2，表2)。

表2 A875细胞中CA+DTIC联合作用后的CI值

实施例3

通过MTT实验，考察桂皮醛和达卡巴嗪联用(本发明的组合物，具体配比见表3)对黑色素瘤细胞C918的增殖抑制作用.

结果表明，不同浓度的桂皮醛和达卡巴嗪联合作用后，抑制作用强于单独药效，IC₅₀值明显减小，且可以在部分浓度下表现出对黑色素瘤细胞C918的协同抑制作用，*代表P＜0.05，**代表P＜0.01，差异具有统计学意义(图3，表3)。

表3 C918细胞中CA+DTIC联合作用后的CI值

实施例4

通过MTT实验，考察桂皮醛和达卡巴嗪联用(本发明的组合物，具体配比见表4)对黑色素瘤细胞SK-MEL-1的增殖抑制作用。

细胞种板、给药浓度设定、作用时间以及细胞活力测定方法均依据实施例1中，每组设3个及以上复孔，实验重复3次，取平均值为最终结果。应用CompuSyn software软件分析CI值，<1代表具有协同作用,＝1为相加作用,>1为拮抗作用。

结果表明，不同浓度的桂皮醛和达卡巴嗪联合作用后，抑制作用强于单独药效，IC₅₀值明显减小，且可以在部分浓度下表现出对黑色素瘤细胞SK-MEL-1的协同抑制作用，*代表P＜0.05，**代表P＜0.01，差异具有统计学意义(图4，表4)。

表4 SK-MEL-1细胞中CA+DTIC联合作用后的CI值

通过以上细胞水平的实验证明：桂皮醛与达卡巴嗪联合(本发明的组合物)作用于四种黑色素瘤细胞后，在摩尔比范围为10:(6.25-25)时，对其中三种细胞人恶性黑色素瘤细胞A375、人眼脉络黑色素瘤细胞C918和人皮肤黑色素瘤细胞SK-MEL-1细胞抑制作用均强于单独用药时，而对人黑色素瘤细胞A875则仅在桂皮醛和达卡巴嗪摩尔比为10:100时有协同抑制作用。因此，我们接下来以A375为例进行动物体内方面的验证，以证实两药联合使用时可以提高治疗效果。

实施例5

裸鼠品种为BALB/c-nu，鼠龄在6-8周，体重为18-22g。通过使用

桂皮醛和达卡巴嗪联合给药(本发明的组合物)的方法，观察对BALB/c-nu裸鼠体内 A375移植瘤的影响。

将黑色素瘤细胞A375进行大量的扩增培养，待细胞处于对数增长期时，用胰酶消化，收集细胞，用无菌生理盐水制成1×10⁷个/mL的细胞悬液，皮下注射于雄性裸鼠左侧腋下位置处，每只0.1mL。接种成功之后，每日观测小鼠状况，待肿瘤成瘤后一周左右时，将动物随机分为6组，每组6只。分组情况为：①对照组：生理盐水(PBS)；②桂皮醛(CA) 组：30mg(0.2mmol)/kg/day；③达卡巴嗪(DTIC)组：25mg(0.15mmol)/kg/day；④DTIC 组：50mg(0.3mmol)/kg/day；⑤联合组1：CA 30mg(0.2mmol)/kg/day+DITC 25mg (0.15mmol)/kg/day；⑥联合组2：CA 30mg(0.2mmol)/kg/day+DITC 50mg (0.3mmol)/kg/day。采用腹腔给药，0.1mL/只/天，连续给药14天后，颈部脱臼处死小鼠，将肿瘤剥离、称重，对比肿瘤生长大小。

结果显示，两者联合使用((本发明的组合物))时，联合给药组显著降低A375黑色素瘤的大小，A375移植瘤的生长被更大程度地抑制，而且单独给药或联合给药对动物体重均没有显著影响，表明联合给药组抑制效果明显高于单独给药组且没有明显毒性(图5)， *代表P＜0.05，**代表P＜0.01，^ΔΔ代表P<0.01，^##代表P<0.01，差异具有统计学意义。

Claims

1.一种具有协同抗黑色素瘤功效的药物组合物在制备抗黑色素瘤药物中的应用，其特征是所述药物组合物包括桂皮醛和达卡巴嗪；所述桂皮醛和达卡巴嗪的摩尔比为10:(6.25-25)。