CN110646624B - 一种基质素2的elisa试剂诊断盒及其使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于试剂诊断盒技术领域，具体涉及一种基质素2的ELISA试剂诊断盒，包括盒体和与所述盒体连接的盒盖，所述盒体内设有标准品、标准品稀释液、酶标试剂、样品稀释液、显色剂A液、显色剂B液、终止液和浓缩洗涤液。本发明还提供了基质素2的ELISA试剂诊断盒的使用方法。本发明利用含有特异性的基质素2抗体的ELISA试剂盒来定量检测样品中的基质素2，检测时间短，检测效率高，能够同时对多个样本进行检测，检测灵敏度高，无需使用昂贵的实验设备，检测成本低。
Description
技术领域
本发明属于免疫分析学技术领域，具体涉及一种基质素2的ELISA试剂诊断盒及其使用方法。
背景技术
在临床常见的胸部肿瘤放射治疗中，肺作为辐射中度敏感器官，肿瘤附近的肺组织因受到放射剂量超过其生物效应的阈值而产生不同程度的损伤。放射性肺损伤包括早期出现的放射性肺炎和随后的放射性肺纤维化。放射性肺炎一般发生于肺部受照射后1～3个月，轻者自行缓解，重者可导致急性低氧血症，从而发展至呼吸衰竭。而放射性肺纤维化一般发生于放射治疗后6～24个月，严重者有慢性肺源性心脏病症状，如呼吸困难、紫绀等，从而导致肺功能进行性降低直至呼吸衰竭。目前临床中，常使用一些更为精准的放射技术来避免过多正常组织受到照射，从而允许更高剂量的放射治疗得到更大获益。然而，放射性肺损伤依然时有发生。
基质素2是基质素家族中的成员之一，基质素家族包括四名成员，分别是基质素1、基质素2、基质素3和基质素4，他们含有相似的结构域，均含有两个血管假性血友病因子A结构域、数量不等的表皮生长因子结构域和C-末端α-螺旋结构域。基质素2广泛分布在多种组织中。
放射性肺损伤的发生是一个由多种细胞及其因子参与并相互作用的复杂过程，此过程造成大量母纤维细胞聚集、增生以及分化，从而导致细胞外基质过度沉积，从而造成肺纤维化。通过ELISA试剂诊断盒可以检测肺脏损伤患者的基质素2的表达水平，从而可以诊断肺损伤程度、肺纤维化程度等。
因此，开发一种基质素2的ELISA试剂诊断盒及其使用方法，不但具有迫切的研究价值，也具有良好的经济效益和工业应用潜力，这正是本发明得以完成的动力所在和基础。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基质素2的ELISA试剂诊断盒及其使用方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
为达到上述技术目的，本发明的技术方案：
第一方面，本发明提供了一种基质素2的ELISA试剂诊断盒，包括盒体和与所述盒体连接的盒盖，所述盒体内设有标准品、标准品稀释液、酶标试剂、样品稀释液、显色剂A液、显色剂B液、终止液和浓缩洗涤液。
本发明中，作为一种优选的技术方案，所述试剂诊断盒还包括ELISA酶标板和封板膜。所述ELISA酶标板为市售，优选德国greiner公司的ELISA酶标板(96孔单条可拆酶标板#650180)。
本发明中，作为一种优选的技术方案，所述标准品包括缓冲液20～300mM、基质素2抗原、稳定剂10～30g/L、防腐剂4～8g/L、抗氧化剂0.1～2g/L。
本发明中，作为一种优选的技术方案，所述标准品稀释液和样品稀释液均包括缓冲液200～400mM，表面活性剂10～30g/L，稳定剂2～6g/L，电解质10～30g/L，高分子促进剂10～40g/L，防腐剂1～3g/L，pH为6～9。
本发明中，作为一种优选的技术方案，所述酶标试剂包括缓冲液20～300mM，基质素2多肽抗体10～300ng/L，稳定剂10～30g/L，电解质10～30g/L，防腐剂4～8g/L，pH为6～9。
基质素2多肽抗体采用以氨基酸序列作为抗原选择部分，采用抗体制备标准方法合成、分离纯化得到的IgG抗体，该氨基酸序列如下：ALEDSGGRQDSAAWDLPQQAHQPTEPEPVTIKIKDLLSCSNFAVQHRFLF EEDNLSRST QKLFHSTKSSGNPLEE。其制备方法为：以细胞外非胶原基质网络蛋白基质素2的独特功能域C-末端部分的氨基酸序列为基础进行多肽合成；再以合成的多肽的C-末端部分的氨基酸序列作为抗原选择部分，采用抗体制备标准方法合成、分离纯化IgG抗体。
本发明中，作为一种优选的技术方案，所述显色剂A液包括醋酸钠2.72wt％、柠檬酸0.32wt％、双氧水0.02wt％，余量为蒸馏水。
本发明中，作为一种优选的技术方案，所述显色剂B液包括乙二胺四乙酸二钠0.04wt％、柠檬酸0.19wt％、甘油9wt％、TMB 0.03wt％，余量为蒸馏水。
本发明中，作为一种优选的技术方案，所述终止液为2mol/l硫酸溶液。
本发明中，作为一种优选的技术方案，所述浓缩洗涤液为含0.01M-0.05M PBS、1wt‰-5wt‰的Tween-20的水溶液。
其中，所述缓冲液为醋酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、TRIS缓冲液、甘氨酸缓冲液、CAPSO、MOPS、Hepes缓冲液中的一种；所述表面活性剂选自Triton系列、Tween系列、月桂醚中的一种；所述稳定剂选自亚氨基二乙酸、脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸钠、乙二胺四乙酸二钠、甘露糖、葡萄糖、壳聚糖中的一种；所述电解质选自氯化钠、氯化钾中的一种；所述高分子促进剂选自聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素、羟甲基纤维素钠中的一种；所述防腐剂选自对羟基苯甲酸、对羟基苯甲酸乙酯中的一种；所述抗氧化剂选自没食子酸丙酯、二丁基羟基甲苯、甘草抗氧化物、维生素系列中的一种。
第二方面，本发明提供了一种基质素2的ELISA试剂诊断盒的使用方法，包括如下步骤：
对待检测样本进行处理；
将标准品依照浓度梯度加入到酶标板的标准品孔内；
将标准品依照浓度梯度加入到酶标板的空白对照孔内；
将待检测样本依照浓度梯度加入到酶标板的待测样品孔内；
利用封板膜封板后温育；
配制洗涤液洗涤；
标准品孔、待测样品孔内加入酶标试剂；
利用封板膜封板后温育；
配制洗涤液洗涤；
每孔先参加显色剂A液，再加显色剂B液，显色；
加停止液，停止反应；
测定结果。
本发明中，作为一种优选的技术方案，待检测样本处理方法包括：
血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右(2000-3000转/分)，仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心；
血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右(2000-3000转/分)，仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心；
尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右(2000-3000转/分)，仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心；
细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集，离心20分钟左右(2000-3000转/分)，仔细收集上清。检测细胞内的成份时，用PBS(PH7.2-7.4)稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右，通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份，离心20分钟左右(2000-3000转/分)，仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心；
组织标本：切割标本后，称取重量，加入一定量的PBS，PH7.4，用液氮迅速冷冻保存备用，标本融化后仍然保持2-8℃的温度，加入一定量的PBS(PH7.4)，用手工或匀浆器将标本匀浆充分，离心20分钟左右(2000-3000转/分)，仔细收集上清，分装后一份待检测，其余冷冻备用。
本发明中，作为一种优选的技术方案，试剂盒的使用步骤为：ELISA试剂盒在酶标板上设标准品孔10孔，在榜首、第二孔平分别加标准品100μl，然后在榜首、第二孔中加标准品稀释液50μl，混匀；然后从榜首孔、第二孔中各取100μl分别加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分别加标准品稀释液50μl，ELISA试剂盒混匀；然后在第三孔和第四孔中先各取50μl弃掉，再各取50μl分别加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔平分别加标准品稀释液50ul，混匀；混匀后从第五、第六孔中各取50μl分别加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔平分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第七、第八孔平分别取50μl加到第九、第十孔中，再在第九、第十孔分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第九、第十孔中各取50μl弃掉。(稀释后各孔加样量都为50μl，浓度分别为30ng/L，20ng/L，10ng/L，5ng/L，2.5ng/L)；
加样：分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂，其他各步操作一样)、待测样品孔，在酶标板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl，ELISA试剂盒然后再加待测样品10μl(样品终究稀释度为5倍)，加样时将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀；
温育：ELISA试剂盒用封板膜封板后置37℃温育30分钟；
配液：将20倍浓缩洗刷液用蒸馏水20倍稀释后备用；
洗刷：当心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗刷液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干；
加酶：每孔参加酶标试剂50μl，空白孔除外；
温育：ELISA试剂盒用封板膜封板后置37℃温育30分钟；
洗刷：当心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗刷液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干；
显色：每孔先参加显色剂A液50μl，再参加显色剂B液50μl，轻轻震动混匀，37℃避光显色15分钟；
停止：每孔加停止液50μl，停止反响(此刻蓝色立转黄色)；
ELISA试剂盒测定：以空白孔调零，450nm波长依序丈量各孔的吸光度(OD值)，测定应在加停止液后15分钟以内进行。
由于采用上述技术方案，本发明的有益效果：
本发明所用的抗体采用目前唯一通过克隆重组检测分析的基质素2抗体。本发明提出的多肽抗体与抗原的抗原决定簇位于特异的独特功能域，该功能域结构特殊，和目前已知蛋白质没有交叉反应，与基质素家族的其它成员(如基质素1、基质素3和基质素4)均没有交叉反应；特异性结合强度非常高。
发明人经过大量反复的试验，筛选了最为合理的组分，与基质素2抗体相协同作用，使得试剂盒不仅具有较高的检测灵敏度，而且具有较好的检测特异性，开发及应用前景良好。检测发现，在健康人以及肺损伤、肺纤维化患者的外周血清中存在基质素2。与健康人相比，肺损伤、肺纤维化患者的外周血中基质素2的表达水平显著升高；与稳定期肺损伤、肺纤维化患者相比，活动期肺损伤、肺纤维化患者体内基质素2的表达水平也显著升高；经治疗，同一发作期肺损伤、肺纤维化炎患者的外周血中基质素2的表达水平降低。因此，该试剂盒在肺损伤、肺纤维化的诊断和疗效判断中具有一定的应用价值。
综上所述，本发明利用含有特异性的基质素2抗体的ELISA试剂盒来定量检测样品中的基质素2，检测时间短，检测效率高，能够同时对多个样本进行检测，检测灵敏度高，无需使用昂贵的实验设备，检测成本低。
附图说明
图1为本发明实施例ELISA试剂盒抗体特异性识别Unique功能域同时发现酶切示意图；
图2为本发明实施例ELISA试剂盒剪接在与基质素1和3共同存在时有不同的酶切能力示意图；
图3为本发明实施例ELISA试剂盒在预防TNF-α诱导的软骨细胞死亡时的示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明作进一步的说明。其中，附图仅用于示例性说明，表示的仅是示意图，而非实物图，不能理解为对本专利的限制；为了更好地说明本发明的实施例，附图某些部件会有省略、放大或缩小，并不代表实际产品的尺寸；对本领域技术人员来说，附图中某些公知结构及其说明可能省略是可以理解的。
实施例1
基质素2的ELISA试剂诊断盒诊断方法，以如下的ELISA试剂诊断盒为手段，基质素2的ELISA试剂诊断盒，包括盒体和与所述盒体连接的盒盖，所述盒体内设有标准品、标准品稀释液、酶标试剂、样品稀释液、显色剂A液、显色剂B液、终止液和浓缩洗涤液。还包括ELISA酶标板和封板膜。所述ELISA酶标板为市售，优选德国greiner公司的ELISA酶标板(96孔单条可拆酶标板#650180)。其中，所述标准品包括缓冲液20mM、基质素2抗原、稳定剂10g/L、防腐剂4g/L、抗氧化剂0.1g/L。所述标准品稀释液和样品稀释液均包括缓冲液200mM，表面活性剂10g/L，稳定剂2g/L，电解质10g/L，高分子促进剂10g/L，防腐剂1g/L，pH为6。所述酶标试剂包括缓冲液20mM，基质素2多肽抗体10ng/L，稳定剂10g/L，电解质10g/L，防腐剂4g/L，pH为6。所述缓冲液为醋酸盐缓冲液；所述表面活性剂选自Triton系列；所述稳定剂选自亚氨基二乙酸；所述电解质选自氯化钠；所述高分子促进剂选自聚乙烯吡咯烷酮；所述防腐剂选自对羟基苯甲酸；所述抗氧化剂选自没食子酸丙酯。基质素2多肽抗体采用以氨基酸序列作为抗原选择部分，采用抗体制备标准方法合成、分离纯化得到的IgG抗体，该氨基酸序列如下：ALEDSGGRQDSAAWDLPQQAHQPTEPEPVTIKIKDLLSCSNFAVQHRFLFEEDNLSRSTQKLFHSTKSSGNPLEE。其制备方法为：以细胞外非胶原基质网络蛋白基质素2的独特功能域C-末端部分的氨基酸序列为基础进行多肽合成；再以合成的多肽的C-末端部分的氨基酸序列作为抗原选择部分，采用抗体制备标准方法合成、分离纯化IgG抗体(具体的获取方式参见CN201610217452.4)。所述显色剂A液包括醋酸钠2.72wt％、柠檬酸0.32wt％、双氧水0.02wt％，余量为蒸馏水。所述显色剂B液包括乙二胺四乙酸二钠0.04wt％、柠檬酸0.19wt％、甘油9wt％、TMB 0.03wt％，余量为蒸馏水。所述终止液为2mol/l硫酸溶液。所述浓缩洗涤液为含0.01M PBS、1wt‰的Tween-20的水溶液；其中，图1为ELISA试剂盒抗体特异性识别Unique功能域同时发现酶切示意图；图2为ELISA试剂盒剪接在与基质素1和3共同存在时有不同的酶切能力示意图；图3为ELISA试剂盒在预防TNF-α诱导的软骨细胞死亡时的示意图。
以血清为待测样本，采用包括如下步骤的方法进行检测：
待检测样本处理：
血清：室温血液自然凝固10-分钟，离心20分钟左右(2000转/分)，仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心；
ELISA试剂盒在酶标板上设标准品孔10孔，在榜首、第二孔平分别加标准品100μl，然后在榜首、第二孔中加标准品稀释液50μl，混匀；然后从榜首孔、第二孔中各取100μl分别加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分别加标准品稀释液50μl，ELISA试剂盒混匀；然后在第三孔和第四孔中先各取50μl弃掉，再各取50μl分别加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔平分别加标准品稀释液50ul，混匀；混匀后从第五、第六孔中各取50μl分别加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔平分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第七、第八孔平分别取50μl加到第九、第十孔中，再在第九、第十孔分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第九、第十孔中各取50μl弃掉。(稀释后各孔加样量都为50μl，浓度分别为30ng/L，20ng/L，10ng/L，5ng/L，2.5ng/L)；
加样：分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂，其他各步操作一样)、待测样品孔，在酶标板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl，ELISA试剂盒然后再加待测样品10μl(样品终究稀释度为5倍)，加样时将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀；
温育：ELISA试剂盒用封板膜封板后置37℃温育30分钟；
配液：将20倍浓缩洗刷液用蒸馏水20倍稀释后备用；
洗刷：当心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗刷液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干；
加酶：每孔参加酶标试剂50μl，空白孔除外；
温育：ELISA试剂盒用封板膜封板后置37℃温育30分钟；
洗刷：当心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗刷液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干；
显色：每孔先参加显色剂A液50μl，再参加显色剂B液50μl，轻轻震动混匀，37℃避光显色15分钟；
停止：每孔加停止液50μl，停止反响(此刻蓝色立转黄色)；
ELISA试剂盒测定：以空白空调零，450nm波长依序丈量各孔的吸光度(OD值)，测定应在加停止液后15分钟以内进行。
读取吸光度OD；根据吸光度自动计算出基质素2的浓度。
实施例2
基质素2的ELISA试剂诊断盒诊断方法，以如下的ELISA试剂诊断盒为手段，基质素2的ELISA试剂诊断盒，包括盒体和与所述盒体连接的盒盖，所述盒体内设有标准品、标准品稀释液、酶标试剂、样品稀释液、显色剂A液、显色剂B液、终止液和浓缩洗涤液。还包括ELISA酶标板和封板膜。所述ELISA酶标板为市售，优选德国greiner公司的ELISA酶标板(96孔单条可拆酶标板#650180)。其中，所述标准品包括缓冲液300mM、基质素2抗原、稳定剂30g/L、防腐剂8g/L、抗氧化剂2g/L。所述标准品稀释液和样品稀释液均包括缓冲液400mM，表面活性剂30g/L，稳定剂6g/L，电解质30g/L，高分子促进剂40g/L，防腐剂3g/L，pH为9。所述酶标试剂包括缓冲液300mM，基质素2多肽抗体300ng/L，稳定剂30g/L，电解质30g/L，防腐剂8g/L，pH为9。所述缓冲液为磷酸盐缓冲液；所述表面活性剂选自Tween系列；所述稳定剂选自脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸钠；所述电解质选自氯化钾；所述高分子促进剂选自羟丙基甲基纤维素；所述防腐剂选自对羟基苯甲酸乙酯；所述抗氧化剂选自二丁基羟基甲苯。基质素2多肽抗体采用以氨基酸序列作为抗原选择部分，采用抗体制备标准方法合成、分离纯化得到的IgG抗体，该氨基酸序列如下：ALEDSGGRQDSAAWDLPQQAHQPTEPEPVTIKIKDLLSCSNFAVQHRFLFEEDNLSRST QKLFHSTKSSGNPLEE。其制备方法为：以细胞外非胶原基质网络蛋白基质素2的独特功能域C-末端部分的氨基酸序列为基础进行多肽合成；再以合成的多肽的C-末端部分的氨基酸序列作为抗原选择部分，采用抗体制备标准方法合成、分离纯化IgG抗体(具体的获取方式参见CN201610217452.4)。所述显色剂A液包括醋酸钠2.72wt％、柠檬酸0.32wt％、双氧水0.02wt％，余量为蒸馏水。所述显色剂B液包括乙二胺四乙酸二钠0.04wt％、柠檬酸0.19wt％、甘油9wt％、TMB 0.03wt％，余量为蒸馏水。所述终止液为2mol/l硫酸溶液。所述浓缩洗涤液为含0.05M PBS、5wt‰的Tween-20的水溶液；
以血浆为待测样本，采用包括如下步骤的方法进行检测：
待检测样本：应根据标本的要求选择EDTA作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右(3000转/分)，仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心；
ELISA试剂盒在酶标板上设标准品孔10孔，在榜首、第二孔平分别加标准品100μl，然后在榜首、第二孔中加标准品稀释液50μl，混匀；然后从榜首孔、第二孔中各取100μl分别加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分别加标准品稀释液50μl，ELISA试剂盒混匀；然后在第三孔和第四孔中先各取50μl弃掉，再各取50μl分别加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔平分别加标准品稀释液50ul，混匀；混匀后从第五、第六孔中各取50μl分别加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第七、第八孔中分别取50μl加到第九、第十孔中，再在第九、第十孔分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第九、第十孔中各取50μl弃掉。(稀释后各孔加样量都为50μl，浓度分别为30ng/L，20ng/L，10ng/L，5ng/L，2.5ng/L)；
加样：分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂，其他各步操作一样)、待测样品孔，在酶标板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl，ELISA试剂盒然后再加待测样品10μl(样品终究稀释度为5倍)，加样时将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀；
温育：ELISA试剂盒用封板膜封板后置37℃温育30分钟；
配液：将20倍浓缩洗刷液用蒸馏水20倍稀释后备用；
洗刷：当心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗刷液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干；
加酶：每孔参加酶标试剂50μl，空白孔除外；
温育：ELISA试剂盒用封板膜封板后置37℃温育30分钟；
洗刷：当心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗刷液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干；
显色：每孔先参加显色剂A液50μl，再参加显色剂B液50μl，轻轻震动混匀，37℃避光显色15分钟；
停止：每孔加停止液50μl，停止反响(此刻蓝色立转黄色)；
ELISA试剂盒测定：以空白空调零，450nm波长依序丈量各孔的吸光度(OD值)，测定应在加停止液后15分钟以内进行。
读取吸光度OD；根据吸光度自动计算出基质素2的浓度。
实施例3
基质素2的ELISA试剂诊断盒诊断方法，以如下的ELISA试剂诊断盒为手段，基质素2的ELISA试剂诊断盒，包括盒体和与所述盒体连接的盒盖，所述盒体内设有标准品、标准品稀释液、酶标试剂、样品稀释液、显色剂A液、显色剂B液、终止液和浓缩洗涤液。还包括ELISA酶标板和封板膜。所述ELISA酶标板为市售，优选德国greiner公司的ELISA酶标板(96孔单条可拆酶标板#650180)。其中，所述标准品包括缓冲液100mM、基质素2抗原、稳定剂20g/L、防腐剂6g/L、抗氧化剂1g/L。所述标准品稀释液和样品稀释液均包括缓冲液300mM，表面活性剂20g/L，稳定剂4g/L，电解质20g/L，高分子促进剂25g/L，防腐剂2g/L，pH为7。所述酶标试剂包括缓冲液100mM，基质素2多肽抗体200ng/L，稳定剂20g/L，电解质10～30g/L，防腐剂6g/L，pH为7。所述缓冲液为TRIS缓冲液；所述表面活性剂选自Tween系列；所述稳定剂选自乙二胺四乙酸二钠；所述电解质选自氯化钠；所述高分子促进剂选自羟甲基纤维素钠；所述防腐剂选自对羟基苯甲酸乙酯；所述抗氧化剂选自甘草抗氧化物。基质素2多肽抗体采用以氨基酸序列作为抗原选择部分，采用抗体制备标准方法合成、分离纯化得到的IgG抗体，该氨基酸序列如下：ALEDSGGRQDSAAWDLPQQAHQPTEPEPVTIKIKDLLSCSNFAVQHRFLFEEDNLSRSTQKLFHSTKSSGNPLEE。其制备方法为：以细胞外非胶原基质网络蛋白基质素2的独特功能域C-末端部分的氨基酸序列为基础进行多肽合成；再以合成的多肽的C-末端部分的氨基酸序列作为抗原选择部分，采用抗体制备标准方法合成、分离纯化IgG抗体(具体的获取方式参见CN201610217452.4)。所述显色剂A液包括醋酸钠2.72wt％、柠檬酸0.32wt％、双氧水0.02wt％，余量为蒸馏水。所述显色剂B液包括乙二胺四乙酸二钠0.04wt％、柠檬酸0.19wt％、甘油9wt％、TMB 0.03wt％，余量为蒸馏水。所述终止液为2mol/l硫酸溶液。所述浓缩洗涤液为含0.03M PBS、3wt‰的Tween-20的水溶液；
以尿液为待测样本，采用包括如下步骤的方法进行检测：
待检测样本处理：用无菌管收集，离心20分钟左右(2500转/分)，仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心；
ELISA试剂盒在酶标板上设标准品孔10孔，在榜首、第二孔平分别加标准品100μl，然后在榜首、第二孔中加标准品稀释液50μl，混匀；然后从榜首孔、第二孔中各取100μl分别加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分别加标准品稀释液50μl，ELISA试剂盒混匀；然后在第三孔和第四孔中先各取50μl弃掉，再各取50μl分别加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔平分别加标准品稀释液50ul，混匀；混匀后从第五、第六孔中各取50μl分别加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第七、第八孔中分别取50μl加到第九、第十孔中，再在第九、第十孔分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第九、第十孔中各取50μl弃掉。(稀释后各孔加样量都为50μl，浓度分别为30ng/L，20ng/L，10ng/L，5ng/L，2.5ng/L)；
加样：分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂，其他各步操作一样)、待测样品孔，在酶标板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl，ELISA试剂盒然后再加待测样品10μl(样品终究稀释度为5倍)，加样时将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀；
温育：ELISA试剂盒用封板膜封板后置37℃温育30分钟；
配液：将20倍浓缩洗刷液用蒸馏水20倍稀释后备用；
洗刷：当心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗刷液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干；
加酶：每孔参加酶标试剂50μl，空白孔除外；
温育：ELISA试剂盒用封板膜封板后置37℃温育30分钟；
洗刷：当心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗刷液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干；
显色：每孔先参加显色剂A液50μl，再参加显色剂B液50μl，轻轻震动混匀，37℃避光显色15分钟；
停止：每孔加停止液50μl，停止反响(此刻蓝色立转黄色)；
ELISA试剂盒测定：以空白空调零，450nm波长依序丈量各孔的吸光度(OD值)，测定应在加停止液后15分钟以内进行。
读取吸光度OD；根据吸光度自动计算出基质素2的浓度。
实施例4
基质素2的ELISA试剂诊断盒诊断方法，以如下的ELISA试剂诊断盒为手段，基质素2的ELISA试剂诊断盒，包括盒体和与所述盒体连接的盒盖，所述盒体内设有标准品、标准品稀释液、酶标试剂、样品稀释液、显色剂A液、显色剂B液、终止液和浓缩洗涤液。还包括ELISA酶标板和封板膜。所述ELISA酶标板为市售，优选德国greiner公司的ELISA酶标板(96孔单条可拆酶标板#650180)。其中，所述标准品包括缓冲液100mM、基质素2抗原、稳定剂15g/L、防腐剂5g/L、抗氧化剂0.5g/L。所述标准品稀释液和样品稀释液均包括缓冲液250mM，表面活性剂15g/L，稳定剂3g/L，电解质15g/L，高分子促进剂15g/L，防腐剂1.5g/L，pH为8。所述酶标试剂包括缓冲液100mM，基质素2多肽抗体100ng/L，稳定剂15g/L，电解质15g/L，防腐剂5g/L，pH为8。所述缓冲液为CAPSO缓冲液；所述表面活性剂选自月桂醚；所述稳定剂选自壳聚糖；所述电解质选自氯化钠；所述高分子促进剂选自羟甲基纤维素钠；所述防腐剂选自对羟基苯甲酸乙酯；所述抗氧化剂选自甘草抗氧化物。基质素2多肽抗体采用以氨基酸序列作为抗原选择部分，采用抗体制备标准方法合成、分离纯化得到的IgG抗体，该氨基酸序列如下：ALEDSGGRQDSAAWDLPQQAHQPTEPEPVTIKIKDLLSCSNFAVQHRFLFEEDNLSRSTQKLFHSTKSSGNPLEE。其制备方法为：以细胞外非胶原基质网络蛋白基质素2的独特功能域C-末端部分的氨基酸序列为基础进行多肽合成；再以合成的多肽的C-末端部分的氨基酸序列作为抗原选择部分，采用抗体制备标准方法合成、分离纯化IgG抗体(具体的获取方式参见CN201610217452.4)。所述显色剂A液包括醋酸钠2.72wt％、柠檬酸0.32wt％、双氧水0.02wt％，余量为蒸馏水。所述显色剂B液包括乙二胺四乙酸二钠0.04wt％、柠檬酸0.19wt％、甘油9wt％、TMB 0.03wt％，余量为蒸馏水。所述终止液为2mol/l硫酸溶液。所述浓缩洗涤液为含0.02M PBS、2wt‰的Tween-20的水溶液。
以细胞培养上清为待测样本，采用包括如下步骤的方法进行检测：
待检测样本处理：细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集，离心20分钟左右(2000转/分)，仔细收集上清。检测细胞内的成份时，用PBS(PH7.2-7.4)稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右，通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份，离心20分钟左右(2000-3000转/分)，仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心；
ELISA试剂盒在酶标板上设标准品孔10孔，在榜首、第二孔平分别加标准品100μl，然后在榜首、第二孔中加标准品稀释液50μl，混匀；然后从榜首孔、第二孔中各取100μl分别加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分别加标准品稀释液50μl，ELISA试剂盒混匀；然后在第三孔和第四孔中先各取50μl弃掉，再各取50μl分别加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔平分别加标准品稀释液50ul，混匀；混匀后从第五、第六孔中各取50μl分别加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔平分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第七、第八孔平分别取50μl加到第九、第十孔中，再在第九、第十孔分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第九、第十孔中各取50μl弃掉。(稀释后各孔加样量都为50μl，浓度分别为30ng/L，20ng/L，10ng/L，5ng/L，2.5ng/L)；
加样：分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂，其他各步操作一样)、待测样品孔，在酶标板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl，ELISA试剂盒然后再加待测样品10μl(样品终究稀释度为5倍)，加样时将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀；
温育：ELISA试剂盒用封板膜封板后置37℃温育30分钟；
配液：将20倍浓缩洗刷液用蒸馏水20倍稀释后备用；
洗刷：当心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗刷液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干；
加酶：每孔参加酶标试剂50μl，空白孔除外；
温育：ELISA试剂盒用封板膜封板后置37℃温育30分钟；
洗刷：当心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗刷液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干；
显色：每孔先参加显色剂A液50μl，再参加显色剂B液50μl，轻轻震动混匀，37℃避光显色15分钟；
停止：每孔加停止液50μl，停止反响(此刻蓝色立转黄色)；
ELISA试剂盒测定：以空白空调零，450nm波长依序丈量各孔的吸光度(OD值)，测定应在加停止液后15分钟以内进行。
读取吸光度OD；根据吸光度自动计算出基质素2的浓度。
实施例5
基质素2的ELISA试剂诊断盒诊断方法，以如下的ELISA试剂诊断盒为手段，基质素2的ELISA试剂诊断盒，包括盒体和与所述盒体连接的盒盖，所述盒体内设有标准品、标准品稀释液、酶标试剂、样品稀释液、显色剂A液、显色剂B液、终止液和浓缩洗涤液。还包括ELISA酶标板和封板膜。所述ELISA酶标板为市售，优选德国greiner公司的ELISA酶标板(96孔单条可拆酶标板#650180)。其中，所述标准品包括缓冲液250mM、基质素2抗原、稳定剂25g/L、防腐剂7g/L、抗氧化剂1.5g/L。所述标准品稀释液和样品稀释液均包括缓冲液350mM，表面活性剂25g/L，稳定剂5g/L，电解质25g/L，高分子促进剂35g/L，防腐剂2g/L，pH为8。所述酶标试剂包括缓冲液250mM，基质素2多肽抗体250ng/L，稳定剂25g/L，电解质26g/L，防腐剂7g/L，pH为8。所述缓冲液为磷酸盐缓冲液；所述表面活性剂选自Tween系列；所述稳定剂选自脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸钠；所述电解质选自氯化钾；所述高分子促进剂选自羟丙基甲基纤维素；所述防腐剂选自对羟基苯甲酸乙酯；所述抗氧化剂选自二丁基羟基甲苯。基质素2多肽抗体采用以氨基酸序列作为抗原选择部分，采用抗体制备标准方法合成、分离纯化得到的IgG抗体，该氨基酸序列如下：ALEDSGGRQDSAAWDLPQQAHQPTEPEPVTIKIKDLLSCSNFAVQHRFLFEEDNLSRST QKLFHSTKSSGNPLEE。其制备方法为：以细胞外非胶原基质网络蛋白基质素2的独特功能域C-末端部分的氨基酸序列为基础进行多肽合成；再以合成的多肽的C-末端部分的氨基酸序列作为抗原选择部分，采用抗体制备标准方法合成、分离纯化IgG抗体(具体的获取方式参见CN201610217452.4)。所述显色剂A液包括醋酸钠2.72wt％、柠檬酸0.32wt％、双氧水0.02wt％，余量为蒸馏水。所述显色剂B液包括乙二胺四乙酸二钠0.04wt％、柠檬酸0.19wt％、甘油9wt％、TMB 0.03wt％，余量为蒸馏水。所述终止液为2mol/l硫酸溶液。所述浓缩洗涤液为含0.04M PBS、4wt‰的Tween-20的水溶液；
以组织标本为待测样本，采用包括如下步骤的方法进行检测：
待检测样本：切割标本后，称取重量，加入一定量的PBS，PH7.4，用液氮迅速冷冻保存备用，标本融化后仍然保持2-8℃的温度，加入一定量的PBS(PH7.4)，用手工或匀浆器将标本匀浆充分，离心20分钟左右(2000-3000转/分)，仔细收集上清，分装后一份待检测，其余冷冻备用；
ELISA试剂盒在酶标板上设标准品孔10孔，在榜首、第二孔平分别加标准品100μl，然后在榜首、第二孔中加标准品稀释液50μl，混匀；然后从榜首孔、第二孔中各取100μl分别加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分别加标准品稀释液50μl，ELISA试剂盒混匀；然后在第三孔和第四孔中先各取50μl弃掉，再各取50μl分别加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔平分别加标准品稀释液50ul，混匀；混匀后从第五、第六孔中各取50μl分别加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔平分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第七、第八孔平分别取50μl加到第九、第十孔中，再在第九、第十孔分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第九、第十孔中各取50μl弃掉。(稀释后各孔加样量都为50μl，浓度分别为30ng/L，20ng/L，10ng/L，5ng/L，2.5ng/L)；
加样：分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂，其他各步操作一样)、待测样品孔，在酶标板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl，ELISA试剂盒然后再加待测样品10μl(样品终究稀释度为5倍)，加样时将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀；
温育：ELISA试剂盒用封板膜封板后置37℃温育30分钟；
配液：将20倍浓缩洗刷液用蒸馏水20倍稀释后备用；
洗刷：当心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗刷液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干；
加酶：每孔参加酶标试剂50μl，空白孔除外；
温育：ELISA试剂盒用封板膜封板后置37℃温育30分钟；
洗刷：当心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗刷液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干；
显色：每孔先参加显色剂A液50μl，再参加显色剂B液50μl，轻轻震动混匀，37℃避光显色15分钟；
停止：每孔加停止液50μl，停止反响(此刻蓝色立转黄色)；
ELISA试剂盒测定：以空白空调零，450nm波长依序丈量各孔的吸光度(OD值)，测定应在加停止液后15分钟以内进行。
读取吸光度OD；根据吸光度自动计算出基质素2的浓度。
本发明试剂与市售的SBJ-H0156基质裂解素2(ST-2)ELISA KIT对照测定100例临床标本，测定结果如表1所示。本发明试剂盒测定方法同实施例3，对比试剂按照说明书设定相关参数，使用日立7080全自动生化分析仪对样本进行分析。
表1
线性回归得到的回归方程为Y＝0.98273X+0.75836，相关系数R2＝0.9957。数据表明，本发明试剂与对比试剂相关性很好，说明本发明试剂对检测基质素2具有很好的特异性和准确度。
以上所述本发明的具体实施方式，并不构成对本发明保护范围的限定。任何根据本发明的技术构思所做出的各种其他相应的改变与变形，均应包含在本发明权利要求的保护范围内。
Claims (4)
1.一种基质素2的ELISA试剂诊断盒，包括盒体和与所述盒体连接的盒盖，其特征在于，所述盒体内设有标准品、标准品稀释液、酶标试剂、样品稀释液、显色剂A液、显色剂B液、终止液和浓缩洗涤液；
所述试剂诊断盒还包括ELISA酶标板和封板膜；
所述标准品包括缓冲液20~300mM、基质素2抗原、稳定剂10~30g/L、防腐剂4~8g/L、抗氧化剂0.1~2g/L；
所述酶标试剂包括缓冲液20~300mM，基质素2多肽抗体10~300ng/L，稳定剂10~30g/L，电解质10~30g/L，防腐剂4~8g/L，pH为6~9；
基质素2多肽抗体采用以氨基酸序列作为抗原选择部分，采用抗体制备标准方法合成、分离纯化得到的IgG抗体，该氨基酸序列如下：ALEDSGGRQDSAAWDLPQQAHQPTEPEPVTIKIKDLLSCSNFAVQHRFLFEEDNLSRST QKLFHSTKSSGNPLEE；
所述显色剂A液包括醋酸钠2.72wt％、柠檬酸0.32wt％、双氧水0.02wt％，余量为蒸馏水；
所述显色剂B液包括乙二胺四乙酸二钠0.04wt％、柠檬酸0.19wt％、甘油9wt％、TMB0.03wt％，余量为蒸馏水；
所述标准品稀释液和样品稀释液均包括缓冲液200~400mM，表面活性剂10~30g/L，稳定剂2~6g/L，电解质10~30g/L，高分子促进剂10~40g/L，防腐剂1~3g/L，pH为6~9；
所述缓冲液为醋酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、TRIS缓冲液、甘氨酸缓冲液、CAPSO、MOPS、Hepes缓冲液中的一种；
所述表面活性剂选自Triton系列、Tween系列、月桂醚中的一种；
所述稳定剂选自亚氨基二乙酸、脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸钠、乙二胺四乙酸二钠、甘露糖、葡萄糖、壳聚糖中的一种；
所述电解质选自氯化钠、氯化钾中的一种；
所述高分子促进剂选自聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素、羟甲基纤维素钠中的一种；
所述防腐剂选自对羟基苯甲酸、对羟基苯甲酸乙酯中的一种；
所述抗氧化剂选自没食子酸丙酯、二丁基羟基甲苯、甘草抗氧化物、维生素系列中的一种。
2.一种如权利要求1所述的基质素2的ELISA试剂诊断盒的非诊断目的的使用方法，其特征在于，包括如下步骤：
对待检测样本进行处理；
将标准品依照浓度梯度加入到酶标板的标准品孔内；
将标准品依照浓度梯度加入到酶标板的空白对照孔内；
将待检测样本依照浓度梯度加入到酶标板的待测样品孔内；
利用封板膜封板后温育；
配制洗涤液洗涤；
标准品孔、待测样品孔内加入酶标试剂；
每孔先参加显色剂A液，再加显色剂B液，显色；
加停止液，停止反应；
测定结果。
3.如权利要求2所述的一种基质素2的ELISA试剂诊断盒的非诊断目的的使用方法，其特征在于，待检测样本处理方法包括：
血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟，转速为2000-3000转/分，仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，再次离心；
血浆：根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟，转速为2000-3000转/分，仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，再次离心；
尿液：用无菌管收集，离心20分钟，转速为2000-3000转/分，仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，再次离心；
细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集，离心20分钟，转速为2000-3000转/分，仔细收集上清；检测细胞内的成份时，用PH7.2-7.4的PBS稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml，通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份，离心20分钟，转速为2000-3000转/分，仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，再次离心；
组织标本：切割标本后，称取重量，加入一定量的PBS，PH7.4，用液氮迅速冷冻保存备用，标本融化后仍然保持2-8℃的温度，加入PBS，用手工或匀浆器将标本匀浆充分，离心20分钟，转速为2000-3000转/分，仔细收集上清，分装后一份待检测，其余冷冻备用。
4.如权利要求2所述的一种基质素2的ELISA试剂诊断盒的非诊断目的的使用方法，其特征在于，试剂盒的使用步骤为：ELISA试剂盒在酶标板上设标准品孔10孔，在榜首、第二孔中分别加标准品100μl，然后在榜首、第二孔中加标准品稀释液50μl，混匀；然后从榜首孔、第二孔中各取100μl分别加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分别加标准品稀释液50μl，ELISA试剂盒混匀；然后在第三孔和第四孔中先各取50μl弃掉，再各取50μl分别加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分别加标准品稀释液50ul，混匀；混匀后从第五、第六孔中各取50μl分别加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第七、第八孔中分别取50μl加到第九、第十孔中，再在第九、第十孔分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第九、第十孔中各取50μl弃掉；稀释后各孔加样量都为50μl，浓度分别为30ng/L，20ng/L，10ng/L，5ng/L，2.5ng/L；
加样：分别设空白孔、待测样品孔，在酶标板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl，ELISA试剂盒然后再加待测样品10μl，加样时将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，晃动混匀；
温育：ELISA试剂盒用封板膜封板后置37℃温育30分钟；
配液：将20倍浓缩洗刷液用蒸馏水20倍稀释后备用；
洗刷：当心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗刷液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干；
加酶：每孔参加酶标试剂50μl，空白孔除外；
显色：每孔先参加显色剂A液50μl，再参加显色剂B液50μl，震动混匀，37℃避光显色15分钟；
停止：每孔加停止液50μl，停止反响，此刻蓝色立转黄色；
ELISA试剂盒测定：调零，450nm波长依序丈量各孔的吸光度，所述测定在加停止液后15分钟以内进行。
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