CN102226808A - 胰蛋白酶原-2化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种胰蛋白酶原-2化学发光免疫检测试剂盒，其包括：1)胰蛋白酶原-2校准品；2)胰蛋白酶原-2抗体或链霉亲和素包被的微孔板；3)当2)中为胰蛋白酶原-2抗体包被的微孔板时，为酶标记的胰蛋白酶原-2抗体，当2)中为链霉亲和素包被的微孔板时，为酶标记的胰蛋白酶原-2抗体和生物素标记的胰蛋白酶原-2抗体；4)化学发光底物液；以及5)浓缩洗涤液。本发明还提供制备上述试剂盒的方法。本发明的试剂盒具有操作简便、灵敏度高、反应快速等优点。

Description

胰蛋白酶原-2化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法

技术领域

本发明涉及免疫分析医学领域，具体涉及一种胰蛋白酶原-2检测试剂盒及其制备方法。

背景技术

急性胰腺炎(AP)为腹部外科常见病，且近年来重型胰腺炎发病率逐渐增多。急性胰腺炎对生理扰乱大，而且对各重要脏器损害明显故死亡率甚高，有时可引起骤然死亡，重型胰腺炎死亡率为20％，有并发症者可高达50％。所以，临床上需要及早和准确的诊断，以免延误病情。

对急性胰腺炎的诊断，传统为采用生化方法测定淀粉酶。但人的淀粉酶有两类同功酶，即胰腺淀粉酶和唾液淀粉酶，前者是由胰腺细胞特异分泌的，而后者可来源于唾液腺、肝细胞、乳腺、肺和女性生殖器官，并且后者的含量大于前者。传统的生化方法不能区分这两类淀粉酶，测定中造成干扰，导致误诊。急性胰腺炎一般来势凶险，诊断延误极易造成死亡。

胰蛋白酶(Trypsin)是由胰腺外分泌细胞产生的蛋白水解酶，是胰液的主要成分，其前体为胰蛋白酶原。胰蛋白酶原(Trypsinogen)是一种分子量为25Kd的胰腺蛋白水解酶，由肠激酶激活。它分为两种主要同功酶，即阳离子的胰蛋白酶原-1和阴离子的胰蛋白酶原-2，两者在胰液中含量很高，正常时仅有极少量进入循环系统，但病理情况下可大量进入血液。健康人中胰蛋白酶原-1与胰蛋白酶原-2的比值为4∶1，但在急性胰腺炎时，血中胰蛋白酶原-2急剧增高，又由于它在肾小管吸收少，因此血和尿中胰蛋白酶原-2水平皆明显升高。血清胰蛋白酶原-2测定对胰腺炎的诊断具有高度的特异性，能够准确无误的做出判断，使急性胰腺炎得到及时和恰当的治疗，它同时又是病情严重程度的指标。英国利物浦皇家医学院外科最近在Lancet报导：他们比较了血中C-反应蛋白、尿中胰蛋白酶原激活肽等几种临床化学指标对急性胰腺炎的诊断、预后的意义，认为尿中胰蛋白酶原的检测对急性胰腺炎较佳，可作为临床常规应用。

所以，对急性胰腺炎的诊断，测定胰蛋白酶原-2的特异性远远高于传统的生化方法测定淀粉酶。

2000年，Clin Cancer Res中报导日本科学家认为60％晚期胃癌患者血中胰蛋白酶原十分高，这些患者常伴有淋巴结、肝转移，而且往往是分化差的腺癌。另外应用胰蛋白酶原对胆管癌、梗阻性黄疸的鉴别诊断近期也有相关报道。

胰蛋白酶原-2的检测，现有的胶体金的方法虽然操作比较简单，但需要手工操作，仅适合少量样本的检查，不适合进行大规模使用，不适合上机进行全自动的操作，容易造成误差，而且胶体金的方法对胰蛋白酶原-2的检查是定性的，无法实现定量。

化学发光免疫分析(Chemiluminescence Immunoassay，CLIA)于1977年问世，上世纪九十年代，化学发光免疫分析试剂盒的研制和自动化测量仪的生产取得了突破性进展，从而进入高速发展阶段。化学发光免疫分析是继荧光、放射性同位素和酶免疫分析之后发展起来的一项新的免疫分析技术，根据大量的实验结果及临床应用资料，从实用性、稳定性、准确性及发展前景来看，在非放射性标记分析技术中化学发光免疫分析处于领先地位，代表了当今世界发展的方向和潮流，它不仅具有免疫反应的特异性，而且具有化学发光反应的高灵敏性(检测限度可达10^-15～10^-18mol/L)。化学发光免疫分析技术具有灵敏度高、快速、准确、重复性好、效期长并安全无毒无污染等优点，成为取代放射免疫分析和酶免疫分析技术的首选。

化学发光免疫分析作为一种新兴的分析技术，目前尚未应用于胰蛋白酶原-2的检测。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供了一种胰蛋白酶原-2化学发光免疫检测试剂盒。

本发明的另一目的是提供所述试剂盒的临床适用范围。

本发明的试剂盒可以用于急性胰腺炎的临床诊断；本发明试剂盒还可以用于监测胰腺癌、胆囊癌、胃癌、淋巴瘤、胚胎性恶性肿瘤的发展过程。

本发明的再一目的是提供制备上述试剂盒的方法。

本发明的胰蛋白酶原-2化学发光免疫检测试剂盒包括：1)胰蛋白酶原-2抗原校准品；2)胰蛋白酶原-2抗体或链霉亲和素包被的微孔板；3)当2)中为胰蛋白酶原-2抗体包被的微孔板时，为酶标记的胰蛋白酶原-2抗体，当2)中为链霉亲和素包被的微孔板时，为酶标记的胰蛋白酶原-2抗体和生物素标记的胰蛋白酶原-2抗体；4)化学发光底物液；以及5)浓缩洗涤液。

本发明还提供了制备上述试剂盒的方法，其包括以下步骤：1)配制胰蛋白酶原-2抗原校准品；2)以胰蛋白酶原-2抗体或链霉亲和素包被微孔板；3)当2)中采用胰蛋白酶原-2抗体包被微孔板时，采用酶标记胰蛋白酶原-2抗体，当2)中采用链霉亲和素包被微孔板时，采用酶标记胰蛋白酶原-2抗体并采用生物素标记胰蛋白酶原-2抗体；4)配制化学发光底物液；以及5)浓缩洗涤液；6)分装上述胰蛋白酶原-2抗原校准品、酶或生物素标记的胰蛋白酶原-2抗体、化学发光底物液和浓缩洗涤液；以及7)组装为成品。

具体实施方式

急性胰腺炎时，尿或血液中胰蛋白酶原-2水平急剧升高，测定尿或血液中胰蛋白酶原-2的含量可以作为急性胰腺炎早期诊断的依据。同时本发明的发明人发现在胃癌、淋巴瘤、胚胎性恶性肿瘤患者血液中胰蛋白酶原-2水平也明显升高，可见胰蛋白酶原-2也是一种有价值的肿瘤标志物。胰蛋白酶原-2化学发光免疫检测试剂盒将在急性胰腺炎诊断和癌症发展监测方面起到重大的作用。

为了解决现有技术中存在的问题，本发明将化学发光技术与胰蛋白酶原-2的免疫分析学有效地结合，同时使用了发光信号强、持续时间长、更高信噪比的自制化学发光底物液，提供了一种能够更加简便、快速、灵敏、稳定地检测胰蛋白酶原-2的试剂盒。同时，本发明的试剂盒采用的方法比目前其它分析法灵敏度高，反应高度特异性，因此使本试剂盒更适于在产业上有效地进行推广和应用。

根据本发明的胰蛋白酶原-2化学发光免疫检测试剂盒包括：1)胰蛋白酶原-2抗原校准品；2)胰蛋白酶原-2抗体或链霉亲和素包被的微孔板；3)当2)中为胰蛋白酶原-2抗体包被的微孔板时，为酶标记的胰蛋白酶原-2抗体，当2)中为链霉亲和素包被的微孔板时，为酶标记的胰蛋白酶原-2抗体和生物素标记的胰蛋白酶原-2抗体；4)化学发光底物液；以及5)浓缩洗涤液。

其中，所述胰蛋白酶原-2抗体可以是多克隆抗体或单克隆抗体，优选为单克隆抗体，例如芬兰Medix Biochemica公司的Anti-Trypsinogen-2单克隆抗体。

其中，所述3)中的酶标记物优选为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶或生物素；试剂盒优选同时可以引入生物素-链霉亲和素系统，采用链霉亲和素包被微孔板，以生物素标记的一株单克隆抗体和酶标记的另一株单克隆抗体形成新的免疫分析模式。

其中，所述4)中的化学发光底物优选可以是1，2-二氧乙烷类衍生物，例如3-(2-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3-磷氧酰)-苯基-1，2-二氧环乙烷(AMPPD)；鲁米诺或其衍生物，或异鲁米诺或其衍生物；氨基苯二酰肼类，等。

其中，所述4)采用的是化学发光底物液。该化学法光底物液可以按照本领域常规的方法自制，也可以购买得到，例如美国THERMO公司的PIERCE试剂。

所述4)中，所述浓缩洗涤液优选为PBST(即磷酸盐吐温缓冲液)或含Tween20的Tris-HCl缓冲液。

根据本发明的试剂盒，其中，所述胰蛋白酶原-2抗体的来源可以是大鼠、小鼠、兔、山羊、绵羊、豚鼠、牛、驴、马、鸡或猴子。

本发明的用于制备所述试剂盒的方法包括以下步骤：1)配制胰蛋白酶原-2抗原校准品；2)以胰蛋白酶原-2抗体或链霉亲和素包被微孔板；3)当2)中采用胰蛋白酶原-2抗体包被微孔板时，采用酶标记胰蛋白酶原-2抗体，当2)中采用链霉亲和素包被微孔板时，采用酶标记胰蛋白酶原-2抗体并采用生物素标记胰蛋白酶原-2抗体；4)配制化学发光底物液；以及5)配制浓缩洗涤液；6)分装上述胰蛋白酶原-2抗原校准品、酶或生物素标记的胰蛋白酶原-2抗体、化学发光底物液和浓缩洗涤液；以及7)组装为成品。

所述步骤1)中，所述胰蛋白酶原-2抗原校准品为人工合成多肽，纯度优选不得低于90％。

所述步骤2)优选包括以下步骤：

I)胰蛋白酶原-2抗体的准备

所述胰蛋白酶原-2抗体可以是多克隆抗体或单克隆抗体，优选为单克隆抗体，例如芬兰Medix Biochemica公司的Anti-Trypsinogen-2单克隆抗体。所述胰蛋白酶原-2抗体可以购买得到或者按照本领域常规的制备方法获得。制备方法可以是：

①制备多克隆抗体

人工合成胰蛋白酶原-2多肽，用合成的多肽交联BSA后免疫兔子，制备兔抗人胰蛋白酶原-2抗体；或者

②制备单克隆抗体

用基因重组的胰蛋白酶原-2免疫小鼠，通过杂交瘤技术制备单克隆抗体细胞株。

II)包被

用0.01～5mol/L(优选为0.01～0.1mol/L，更优选为0.05mol/L)pH值为7～11(优选为7～10，更优选为9.6)的碳酸盐缓冲液与1～20μg/mL的胰蛋白酶原-2抗体配制成包被液，或者

配制基于1000mL包含10～90g Na₂HPO₄·12H₂O、1～50g柠檬酸的溶液，所述溶液的pH值为3～10，然后将链霉亲和素以1～20μg/mL的浓度溶解到所述溶液中，配制成包被液；

将上述包被液负载于微孔板上，包被的微孔板为48或96孔的微孔板条。

III)用生理盐水洗涤上述微孔板。

IV)封闭

配制封闭液，基于1000mL所述封闭液包含0.01～5g(优选为0.01～2.0g，更优选为0.2g)NaH₂PO₄·2H₂O、0.01～10g(优选为0.01～5g，更优选为0.5～5g最优选为2.9g)Na₂HPO₄·12H₂O、1～40g(优选为1～20g，更优选为10g)牛血清白蛋白和0.1～10mL(优选为1mL)生物防腐剂(例如庆大霉素、乳酸链球菌素和那他霉素、Proclin300等)，所述封闭液的pH值为7.0～10(优选为7.0～7.6)，然后将所得封闭液加到微孔板上，每孔200～300微升，2～40℃放置4～24小时后将液体吸出，用0.9％生理盐水冲洗一遍后晾干备用。

所述步骤3)中，胰蛋白酶原-2抗体酶标记物优选为偶联碱性磷酸酶或是辣根过氧化物酶。采用辣根过氧化物酶时，优选采用过碘酸钠法进行标记，采用碱性磷酸酶时，优选采用戊二醛交联法进行标记。试剂盒优选同时可以引入生物素-链霉亲和素系统，采用链霉亲和素包被微孔板，以生物素标记的一株单克隆抗体和酶标记的另一株单克隆抗体形成新的免疫分析模式。

所述步骤3)中，采用生物素标记胰蛋白酶原-2抗体的步骤优选为：①将胰蛋白酶原-2抗体在0.01～2.00mol/L的pH 5～10的硼酸缓冲液中透析4～24小时，透析完毕后取出抗体装入玻璃瓶中；②称生物素10μg～1000μg溶于有机溶剂中，所述有机溶剂优选为非质子极性溶剂，例如DMF、DMSO等；③将步骤①中所得到的溶液与步骤②中所得到的溶液混合，室温反应1～24小时，加入100μl的0.5～5mol/L的氯化铵溶液。

所述步骤4)中，所述化学发光底物液中的有效发光物质优选为鲁米诺或AMPPD。该化学法光底物液可以按照本领域常规的方法自制，也可以购买得到，例如美国THERMO公司PIERCE试剂。

所述步骤5)中，浓缩洗涤液优选为PBST或含Tween20的Tris-HCl缓冲液。

步骤6)和7)可按照本领域常规的操作。例如步骤6)即将生产的所述组分等体积存放在小瓶中，步骤7)即将这些小瓶排放到试剂盒的里面。

在本发明的研究过程中，首先对所用的原材料进行了筛选试验和质量鉴定，以保证试验的精确性，然后对包被方法进行了研究，选择出最适合的包被缓冲液和封闭液，找到最佳的浓度条件，并且配制出了能够使酶标记物长期保持活性的稀释液。

本发明胰蛋白酶原-2化学发光免疫检测试剂盒可以检测尿或血液中胰蛋白酶原-2的水平，可以作为急性胰腺炎诊断指标之一，从而可以用于急性胰腺炎的临床诊断。同时使用该试剂盒测定尿或血液中胰蛋白酶原-2的水平还可用于监测癌症(例如胰腺癌、胆囊癌、胃癌、淋巴瘤和胚胎性恶性肿瘤)的发展过程。本发明的试剂盒具有无创、简便、快速、灵敏、稳定等优点。同时该胰蛋白酶原-2化学发光免疫检测试剂盒的各项指标均已达到技术要求。

根据本发明的试剂盒，酶标记的胰蛋白酶原-2抗体与固相载体上包被的胰蛋白酶原-2抗体同被测样品中的胰蛋白酶原-2抗原形成“包被抗体-抗原-抗体-酶”的夹心复合物结构，因此本发明采用的“双抗体夹心法”反应模式，既有效地利用抗原-抗体反应的高特异性，又结合了化学发光免疫分析技术的高灵敏度，可为临床诊断提供更为特异、快速、可靠的依据。

实施例

下面通过实施例对本发明进行进一步地说明，但不应理解为对本发明的限制。

实施例1应用辣根过氧化物酶系统制备本发明的胰蛋白酶原-2化学发光免疫检测试剂盒

一、辣根过氧化物酶标记的胰蛋白酶原-2抗体的制备

溶解5mg辣根过氧化物酶于0.5mL蒸馏水中，加入0.5mL过碘酸钠(50mmol/L)室温搅拌30min，经10mM pH值为4.4醋酸钠缓冲液，透析后加入5mg胰蛋白酶原-2抗体(芬兰Medix Biochemica公司的Anti-Trypsinogen-28603)，搅拌2h，最后用200mM NaBH₄进行还原，经0.02M PBS缓冲液透析后，加等体积甘油，-20℃以下保存。

二、酶标抗体稀释液

三、酶标抗体浓度选定

酶标抗体的工作浓度范围为1∶500以上。

四、胰蛋白酶原-2抗原校准品的制备

将人工合成的胰蛋白酶原-2多肽抗原用校准品稀释液稀释成含量分别为0、3、10、30、100、300ng/mL系列浓度，建立定量校准品。

五、胰蛋白酶原-2抗体包被的固相载体的制备

(1)包被

采用0.05mol/L pH值为9.6的碳酸盐缓冲液与20μg/mL的胰蛋白酶原-2抗体(芬兰Medix Biochemica公司的Anti-Trypsinogen-28607)混合制成包被液，并将其负载于微孔板上；

具体地，所述0.05mol/L碳酸盐缓冲液的配方为：

无水碳酸钠              1.59g

碳酸氢钠                2.93g

去离子水                1000mL

溶解混匀后，调整pH值至9.6，加入5.0mg的Anti-Trypsinogen-28607，混匀，

按100μL/孔的量加入微孔板中，4℃过夜。

(2)洗涤：用生理盐水洗涤上述包被好的微孔板。

(3)封闭

将上述试剂称量好放入洁净容器中，加双蒸水定容，溶解混匀，调整pH值为7.0～7.6。

按200μL/孔的量加入微孔板中，室温放置2～4小时。甩掉封闭液，在吸水纸上拍干。室温除湿干燥24小时后立即进行真空封袋。封袋后放置15分钟检查是否漏气，如有漏气则需重新封袋，如无漏气现象贴签后置2～8℃保存，备用。

六、化学发光底物

A液：在100ml双蒸水中加入1.21g Tris和295μL浓HCl配成0.1M pH8.5的Tris-HCl缓冲液。在此缓冲液中加入0.5g的鲁米诺、20μL的Tween20以及0.1g对碘苯酚，混合均匀。

B液：在100ml双蒸水中加入柠檬酸三钠0.73g和柠檬酸0.44g，配制成0.1M pH 5.0的柠檬酸缓冲液，在此溶液中加入0.1g过氧化脲。

使用方法：使用前将A液与B液按1∶1比例混合后使用

七、浓缩洗涤液

八、半成品及成品组成

上述步骤所得产品分装即为半成品，组装成胰蛋白酶原-2化学发光免疫分析定量测定试剂盒。

实施例2应用碱性磷酸酶系统制备本发明的胃蛋白酶化学发光免疫检测试剂盒

一、碱性磷酸酶标记的胰蛋白酶原-2抗体的制备

由于本试剂盒采用的是碱性磷酸酶，因此采用戊二醛交联法来制备酶标记物。

溶解5mg碱性磷酸酶于0.5mL蒸馏水中，加入0.5mL戊二醛室温震荡120min，经10mM pH值为4.4醋酸钠缓冲液，透析后加入5mg胰蛋白酶原-2抗体(Anti-Trypsinogen-28607)，室温震荡120min，最后用聚丙烯酰胺-琼脂糖凝胶过滤除去未标记的抗体，最后加等体积甘油，-20℃以下保存。

酶标抗体稀释液

酶标抗体浓度选定：

酶标抗体的工作浓度范围为1∶500以上。

二、化学发光底物

本发明所使用的碱性磷酸酶的化学发光底物液的配制方法：

调整pH值至7.4。

四、胰蛋白酶原-2抗体包被的固相载体的制备

本步骤中，除将Anti-Trypsinogen-28607换成Anti-Trypsinogen-28603外，其他均与实施例1相同。

其他试剂与组分的配制方法与辣根过氧化物酶系统制备胰蛋白酶原-2化学发光免疫检测试剂盒的方法一致。

实施例3应用辣根过氧化物酶和生物素-链霉亲和素系统制备本发明的胰蛋白酶原-2化学发光免疫检测试剂盒

一、生物素标记胰蛋白酶原-2抗体的制备

(1)将胰蛋白酶原-2抗体(Anti-Trypsinogen-28607)在1.5mol/L pH 8.0的硼酸缓冲液中透析12小时，透析完毕后取出抗体装入玻璃瓶中；

硼酸缓冲液：

(2)称生物素800μg溶于DMF；

(3)将步骤(1)中所得的溶液与步骤(2)中所得的溶液混合，室温反应12小时，加入100μl 2.5mol/L的氯化铵溶液。

二、辣根过氧化物酶标记的胰蛋白酶原-2抗体的制备

采用Anti-Trypsinogen-28603，按照实施例1或2的方法制备。

三、链霉亲和素包被的固相载体的制备

(1)包被

配制溶液，所述溶液的pH值为9，然后将链霉亲和素以15μg/mL的浓度溶解到所述溶液中。

具体地，所述溶液的配方为：

Na₂HPO₄·12H₂O、                  8g

柠檬酸                            4g

去离子水                          100mL

溶解混匀后，调整pH值至9，加入1.5mg链霉亲和素混匀，

按100μL/孔的量加入微孔板中，4℃过夜。

(2)洗涤：用生理盐水洗涤上述包被好的微孔板。

(3)封闭

将上述试剂称量好放入洁净容器中，加双蒸水定容，溶解混匀，调整pH值为7.5。

按200μL/孔的量加入微孔板中，室温放置2～4小时。甩掉封闭液，在吸水纸上拍干。室温除湿干燥24小时后立即进行真空封袋。封袋后放置15分钟检查是否漏气，如有漏气则需重新封袋，如无漏气现象贴签后置2～8℃保存，备用。

其他试剂与组分的配制方法与实施例1中辣根过氧化物酶系统制备胰蛋白酶原-2化学发光免疫检测试剂盒的方法一致。

实施例4本发明的试剂盒的使用方法

一、样品的准备

血液标本：静脉采血至采血管中，静置30分钟后离心，取上清液使用。

尿液标本：留取随机尿液标本进行检测。

二、检测方法

1、使用按照实施例1或2的方法制备的试剂盒进行实验的具体操作步骤如下：

1)将实验需要的微孔板(微孔板已包被好抗体，96孔)放置在板架上；

2)反应孔中分别加入待测样品50μl，再加各浓度校准品0、3、10、30、100、300ng/mL，每孔各加50μL；

3)室温振荡30分钟；

4)取出反应板，弃去孔中溶液，用稀释好的洗液在自动洗板机上或者手工洗板5次，在吸水纸上拍干；

5)每孔加含鲁米诺的发光底物液A 50μL，再加含过氧化脲的发光底物液B 50μL；或者先将鲁米诺化学发光底物液的A液和B液按1∶1混合，每孔各加100μL；

6)轻轻振荡混匀；

7)在化学发光测量仪上依序测量各孔的发光强度(RLU)；

8)分别读取校准品浓度值和其相对应的RLU值，在建立的双对数曲线上建立标准曲线，以各待测血清RLU值在标准曲线上查出该样品中胰蛋白酶原-2的浓度，计算检测结果；

9)打印检测结果报告；

2、使用按照实施例3的方法制备的试剂盒进行实验的具体操作步骤如下：

1)将实验需要的微孔板(微孔板已包被好链霉亲和素，96孔)放置在板架上；

2)反应孔中分别加入待测样品50μl，再加各浓度校准品0、3、10、30、100、300ng/mL，每孔各加50μL；

3)每孔各加生物素标记的抗体100μL然后室温振荡2小时；

4)取出反应板，弃去孔中溶液，用稀释好的洗液在自动洗板机上或者手工洗板5次，在吸水纸上拍干；

5)每孔各加辣根过氧化物酶标记的抗体100μL然后室温振荡1小时；

6)取出反应板，弃去孔中溶液，用稀释好的洗液在自动洗板机上或者手工洗板5次，在吸水纸上拍干；

7)每孔加含鲁米诺的发光底物液A 50μL，再加含过氧化脲的发光底物液B 50μL；或者先将鲁米诺化学发光底物液的A液和B液按1∶1混合，每孔各加100μL；

8)轻轻振荡混匀；

9)在化学发光测量仪上依序测量各孔的发光强度(RLU)；

10)分别读取校准品浓度值和其相对应的RLU值，在建立的双对数曲线上建立标准曲线，以各待测血清RLU值在标准曲线上查出该样品中胰蛋白酶原-2的浓度，计算检测结果；

11)打印检测结果报告；

实施例5本发明的试剂盒在方法学上的鉴定

本发明的试剂盒在用于胰蛋白酶原-2浓度水平测定时，方法学指标如下：

1)检测范围：3～300ng/mL；

2)最低检出量：平行测定20孔零值校准品血清，计算零值校准品RLU平均值(X)及标准差(S)，以X+2S为定值代入标准曲线方程中，求出其对应的浓度值，所对应的浓度值即为最低检出量为0.8ng/mL；

3)精密度：测定胰蛋白酶原-2抗原质控品的浓度，重复检测3次，每次重复10孔，进行精密度测定，计算批内精密度为8.1％，小于15％，批间精密度(高、低二个质控品)为9.2％，小于15％；

4)特异性：浓度为30μg/mL的胰蛋白酶-1在本试剂盒上的测定结果不高于3.0ng/mL；

5)稳定性：各试剂组分别在2～8℃条件下自生产之日起保存至第13个月后进行检测，实验发现各组分仍稳定。

实施例6采用本发明的试剂盒对样品进行测定

采用实施例3的试剂盒，并按照实施例4的使用方法，对正常人血清、胃癌患者血清、贲门癌患者血清及正常人尿液、肝癌患者尿液进行测定，实验结果参见表1和表2。分别采用实施例3的试剂盒和芬兰Medix Biochemica公司试剂盒，对已确诊的急性胰腺炎(acute pancreatitis，AP)患者51例、非AP急腹症68例样品进行检测，其中采用实施例3的试剂盒进行操作时，选取浓度＞24ng/mL时，检测结果认为是阳性，采用芬兰Medix Biochemica公司试剂盒时，按照Medix Biochemica公司试剂盒中说明书操作并选取浓度＞50μg/L时，检测结果为阳性。实验结果参见表5。

表1正常人血清、正常人尿液、肝癌患者尿液、胃癌患者血液、贲门癌患者血液中测定的胰蛋白酶原-2浓度的结果

注：测定批次表示每种样品测定的例数，例如正常人血清为30例，正常人尿样为14例，胃癌患者血液为25例，等。在同一个测定批次中，正常人血清和正常人尿样可能为取自不同人的样品。

表2胰头癌等恶性肿瘤患者尿液中测定的胰蛋白酶原-2浓度的结果

序号	恶性肿瘤类型	胰蛋白酶原-2浓度(ng/mL)
			1	胰头癌	480
2	胰头癌	423
			3	胰头癌	218
4	结肠癌	22
			5	甲状腺癌	22.3
6	肝母细胞癌	54.3
			7	肺癌	16.9
8	食管癌	51.6
			9	肾癌(肾动脉栓塞后)	40.9
10	乳腺癌	38.6
			11	肝癌	19
12	睾丸胚胎癌	36.3
			13	甲状腺癌	125.7
14	恶性淋巴瘤	587.9
			15	平均值	152.6071
16	标准差	189.728

根据表1和表2，分别对尿液测定结果和血液测定结果进行比较，分别参见表3和表4。

表3尿液测定结果比较

序号	类别	平均值±2SD(ng/mL)
			1	正常人	2.87±2.72
2	肝癌患者	7.13±12.94
			3	胰头癌等恶性肿瘤患者	152.61±379.44

表4血液测定结果比较

序号	类别	平均值±2SD(ng/mL)
			1	正常人	5.21±12.36
2	胃癌	46.98±101.98
			3	贲门癌	23.30±38.38

由以上测定结果可知，胃癌、贲门癌患者血清胰蛋白酶原-2含量明显高于正常组(P＜0.001；肝癌患者尿液胰蛋白酶原-2水平明显高于正常组(P＜0.01)，胰头癌等恶性肿瘤患者尿液胰蛋白酶原-2含量也明显高于正常组(P＜0.001)。通过监测血清或尿液中胰蛋白酶原-2的含量的变化有助于早期发现或监测恶性肿瘤。

表5血清胰蛋白酶原-2在AP和非AP急腹症的检测结果

由以上测定结果可知，测定血清胰蛋白酶原-2水平可以作为急性胰腺炎的诊断指标，其诊断的灵敏度是100％，特异性是97％，适合医院检验科、体检中心对急诊病例的快速测定，使急性胰腺炎得到及时和恰当的治疗。

本发明的试剂盒所用样品量少，所需样品来源简单方便，体外检测对测试对象没有任何毒副作用。同时本发明采用的化学发光免疫分析方法，不产生放射性污染。利用本发明方法进行检测，灵敏度高，特异性强，检测范围宽，操作简单，无放射性污染，试剂盒成本低，临床适用性强，更适用于我国临床检测筛查实验室。因此本发明为临床检测胰蛋白酶原-2，辅助诊断急性胰腺炎提供了一种更准确，特异，方便，快捷的方法，同时初步研究也发现胰、胆管、胃癌和淋巴瘤、胚胎性恶性肿瘤患者血液或尿液中胰蛋白酶原-2也明显升高，因此测定胰蛋白酶原-2水平也对上述肿瘤的监测及早期发现有一定价值。

Claims (12)

1.一种胰蛋白酶原-2化学发光免疫分析检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：1)胰蛋白酶原-2校准品；2)胰蛋白酶原-2抗体或链霉亲和素包被的微孔板；3)当2)中为胰蛋白酶原-2抗体包被的微孔板时，为酶标记的胰蛋白酶原-2抗体，当2)中为链霉亲和素包被的微孔板时，为酶标记的胰蛋白酶原-2抗体和生物素标记的胰蛋白酶原-2抗体；4)化学发光底物液；以及5)浓缩洗涤液。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，用于标记胰蛋白酶原-2抗体的标记物为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶或生物素。

3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述化学发光底物为1，2-二氧乙烷类衍生物、鲁米诺及其衍生物、异鲁米诺及其衍生物或氨基苯二酰肼类衍生物。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述化学发光底物为AMPPD、鲁米诺或异鲁米诺或氨基苯二酰肼。

5.根据权利要求1～4中任意一项所述的试剂盒，其特征在于，所述浓缩洗涤液为PBST或含Tween20的Tris-HCl缓冲液。

6.根据权利要求1～5中任意一项所述的试剂盒，其特征在于所述胰蛋白酶原-2抗体是单克隆抗体或多克隆抗体。

7.根据权利要求1～6中任意一项所述的试剂盒，所述胰蛋白酶原-2抗体来源于大鼠、小鼠、兔、山羊、绵羊、豚鼠、牛、驴、马、鸡或猴子。

8.一种制备权利要求1～7中任意一项所述试剂盒的方法，其包括以下步骤：1)配制胰蛋白酶原-2抗原校准品；2)以胰蛋白酶原-2抗体或链霉亲和素包被微孔板；3)当2)中采用胰蛋白酶原-2抗体包被微孔板时，采用酶标记胰蛋白酶原-2抗体，当2)中采用链霉亲和素包被微孔板时，采用酶标记胰蛋白酶原-2抗体并采用生物素标记胰蛋白酶原-2抗体；4)配制化学发光底物液；5)配制浓缩洗涤液；6)分装所述胰蛋白酶原-2抗原校准品、酶和/或生物素标记的胰蛋白酶原-2抗体、化学发光底物液、浓缩洗涤液；以及7)组装为成品。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于所述步骤2)包括以下步骤：

I)胰蛋白酶原-2抗体的准备；

II)包被

用0.01～5mol/L pH值为7.0～11.0的碳酸盐缓冲液与1～20μg/mL的胰蛋白酶原-2抗体配制成包被液，或者

配制基于1000mL包含10～90g Na₂HPO₄·12H₂O、1～50g柠檬酸的溶液，所述溶液的pH值为3～10，然后将链霉亲和素以1～20μg/mL的浓度溶解到所述溶液中，配制成包被液；

将上述包被液负载于微孔板上，包被的微孔板为48或96孔的微孔板条；

III)用生理盐水洗涤上述微孔板；

IV)封闭

配制封闭液，基于1000mL所述封闭液包含0.01～5.0g NaH₂PO₄·2H₂O、0.01～10g Na₂HPO₄·12H₂O、1～40g牛血清白蛋白和0.1～10mL生物防腐剂，所述封闭液的pH值为7.0～10，然后将所得封闭液负载于上述洗涤后的微孔板上。

10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于所述步骤3)中，胰蛋白酶原-2抗体酶标记物为偶联碱性磷酸酶或是辣根过氧化物酶，采用辣根过氧化物酶时，采用过碘酸钠法进行标记，采用碱性磷酸酶时，采用戊二醛交联法进行标记。

11.根据权利要求8～10中任意一项所述的方法，其特征在于所述步骤3)中，采用生物素标记胰蛋白酶原-2抗体的步骤为：①将胰蛋白酶原-2抗体在0.01～2.00mol/L pH 5～10的硼酸缓冲液中透析4～24小时，透析完毕后取出抗体装入玻璃瓶中；②称生物素10μg～1000μg溶于有机溶剂中；③将步骤①中得到的溶液与步骤②中得到的溶液混合，室温反应1～24小时，加入100μl0.5～5mol/L的氯化铵溶液。

12.根据权利要求11所述的方法，其中，所述有机溶剂为DMF、DMSO或其组合。