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KR20230088292A - MR1 제한적 Panck T 세포 및 이의 제조방법 - Google Patents

MR1 제한적 Panck T 세포 및 이의 제조방법 Download PDF

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KR20230088292A
KR20230088292A KR1020220171906A KR20220171906A KR20230088292A KR 20230088292 A KR20230088292 A KR 20230088292A KR 1020220171906 A KR1020220171906 A KR 1020220171906A KR 20220171906 A KR20220171906 A KR 20220171906A KR 20230088292 A KR20230088292 A KR 20230088292A
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South Korea
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cells
cancer
cell
panck
restricted
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Pending
Application number
KR1020220171906A
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Inventor
권병세
황선희
이정윤
Original Assignee
주식회사 유틸렉스
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
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Abstract

본 발명은 MR1-restricted pan cancer killing CD8+ T lymphocytes 인 MR1 제한적 Panck T 세포 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 생산방법에 따르면, MR1에 제한적인 특이성을 갖는 MR1 수용체를 발현하는 새로운 T 세포를 대량으로 생산할 수 있으며, 이러한 특성을 갖는 T 세포를 다양한 암종에 대한 범용성 항암제로 활용할 수 있다.

Description

MR1 제한적 Panck T 세포 및 이의 제조방법 {MR1-restricted Panck T cell and preparing method thereof}
본 발명은 MR1-restricted pan cancer killing CD8+ T lymphocytes 인 MR1 제한적 Panck T 세포 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
MAIT 세포(Mucosal associated invariant T cells)는, 각종 사이토카인을 발생하여 각종 면역 반응을 제어하는, 자연 면역 T 림프구의 일종이다. MAIT 세포는 인간에서 풍부하게 존재하나, 마우스에서는 풍부하게 존재하지 않는 것으로 알려져 있다. MAIT 세포는 특히 T 세포 수용체(T cell receptor: TCR)가 다양성을 나타내지 않는 것으로 특징 때문에 최근 주목받고 있다. TCR 은 T 세포에서 특이적으로 발현하는 수용체로 주요 조직 적합 유전자 복합체(Major Histocompatibility Complex: MHC) 분자에 결합한 펩티드 단편을 항원으로서 인식한다. T 세포 중에서도 TCR이 다양성을 나타내지 않는 단일한 세포로 자연 살해 T 세포(Natural killer T cells: NKT 세포)와 MAIT 세포의 2 종류만 알려져 있으며, 인간의 경우, MAIT 세포의 TCRα쇄는 Vα7.2-Jα33의 조합, NKT 세포의 경우, Vα24-Jα18 조합만이 알려져 있다. 또한, 마우스의 경우, MAIT 세포의 TCRα쇄는 Vα19-Jα33의 조합 뿐이며, NKT 세포의 경우, 그 조합은 Vα14-Jα18이다. 양 세포의 TCR은 결합할 수 있는 항원 제시 분자(구속성)도 상이하며, MAIT 세포의 TCR은, 일반적인 T 세포에서의 항원 제시 분자인 MHC와 유사한, 다양성이 없는 MR1(MHC-related molecule-1)을 인식 및 결합하지만, NKT의 경우, MHC와 유사한 CD1d(cluster of differentiation-1d)를 항원 제시 분자로 한다. MAIT 세포 특이적인 TCR 과 MR1은 진화적으로 매우 잘 보존되어 있다.
MAIT 세포는 다양한 질환에 관여하는 것으로 최근 보고되고 연구되어 있으나 아직까지 이의 명확한 기전에 대한 연구는 많이 보고되어 있지 않다. MAIT 세포를 이용한 연구가 제한적인 이유는 MAIT 자체가 희귀한 마우스로부터 MAIT 를 수득하기 어려우며, 인간의 경우 MAIT 세포가 마우스보다는 풍부하게 존재하나, 마찬가지로 생체 시료로부터 해당 세포를 대량으로 수득하는 것에는 한계가 있기 때문이다.
따라서, 다양성이 없는 MRI를 제한적으로 인식하여 결합할 수 있는 MAIT 세포와 유사한 특성을 갖는 세포주를 개발하고 이를 대량 생산함으로써, 이를 기초로 다양한 질병의 기전 및 치료방법을 도출하는 방법에 대한 필요성이 있으나, 아직까지 이와 같은 특성의 세포주 제공 및 이의 활용에 대한 연구는 널리 이루어지지 않았다.
본 발명자들은 MR1에 제한적으로 결합하고, 다양한 암에 광범위하게 적용할 수 있는 새로운 T 세포 치료제에 대하여 연구를 수행하던 중, MR1에 제한적으로 결합하는 새로운 Panck T 세포의 대량 생산 방법을 구축하였으며 제조된 Panck T 세포의 범용성 항암 효과를 확인하고 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 MR1 제한적 T 세포 (MR1-restricted T cell) 의 생산 방법 및 이러한 생산방법으로 만들어진 MR1 제한적 T 세포, 및 이를 포함하는 항암용 조성물을 제공하는 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 1) B2M (β2-microglobulin) 을 넉아웃시킨 암세포를 제조하는 단계; 2) 상기 1) 단계의 암세포에 B2M-linked MR1 의 과발현을 유도하는 단계; 3) 상기 2) 단계의 암세포에 방사선을 조사하는 단계; 4) 상기 3) 단계를 통해 제조된 암세포와 T 세포를 공동 배양하는 단계; 5) 상기 4) 단계 배양 후 T 세포를 IL-2, IL-7 및 IL-15로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 사이토카인이 포함된 배지에서 배양하는 단계; 및 6) 상기 3) 단계를 통해 제조된 암세포와 상기 5) 단계의 배양된 T 세포를 공동 배양하는 단계; 를 포함하는 MR1 제한적 T 세포 (MR1-restricted T cell) 의 생산 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 방법으로 생산되는 MR1 제한적 T 세포 (MR1-restricted T cell) 를 제공한다.
또한 본 발명은 i) CD8+T 및 4-1BB+; ii) TCRva7.2-; 및 iii) CD69high, CD45RO+, CD161-, PD-1low 또는 CD57low 마커 발현 특성을 갖는, MR1 제한적 T 세포를 제공한다.
또한 본 발명은 상기 MR1 제한적 T 세포를 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 MR1 제한적 T 세포를 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 암 치료 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 MR1 제한적 T 세포의 암 치료를 위한 용도를 제공한다.
또한 본 발명은 상기 MR1 제한적 T 세포의 암 치료제 제조에 있어서의 용도를 제공한다.
본 발명의 생산방법에 따르면, MR1에 제한적인 특이성을 갖는 MR1 수용체를 발현하는 새로운 T 세포를 대량으로 생산할 수 있으며, 이러한 특성을 갖는 T 세포를 다양한 암종에 대한 범용성 항암제로 활용할 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 MR1 제한적 T 세포 (이하, 'Panck T 세포') 를 생산 및 확장 증식하는 공정을 나타낸 모식도이다.
도 2는 SW480 에서의 MR1 및 B2M 발현을 확인한 결과 및 SW480, SK-OV3, A375, A549, THP-1, K562 암세포에서 B2M 단백질의 넉아웃을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 B2M 단백질을 넉아웃시킨 SW480, SK-OV3, A375, A549 세포에서 B2M-linked MR1 의 과발현을 유도한 후 MR1 및 B2M 의 발현을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 4의 a는 SW480 B2M KO/MR1 OV 및 B2M KO 되지 않은 SK-OV3 /MR1 OV 세포주에서 항-HLA-ABC (MHC 1) 항체와의 결합을 통해 MHC I 발현을 확인하고, MR1 제한적 발현을 제시하는 암세포 제조 여부를 확인한 결과를 나타낸 도이다. 또한 도 4의 b는 SK-OV3-B2m-ko/MR1, SK-OV3-B2m-ko, wtSK-OV3에서의 MHC 1 발현을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 난소암 환자의 복수 유래 세포에서 MR1 의 발현 및 면역 T 세포를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 본 발명의 방법을 통해 제조된 Panck T 세포의 CD8+, 4-1BB+, TCRva7.2(-) 발현 특성 확인 및 이들의 순도를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 7은 본 발명의 생산 과정에서 다양한 사이토카인 처리에 따른 총 T 세포 생산 및 Panck T 세포 생산능을 비교한 결과를 나타낸 도이다.
도 8은 Panck T 세포의 표현형을 FACS 분석을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 9는 Panck T 세포의 암세포 사멸 효과 및 이의 기전을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 10은 다양한 암세포주에 Panck T 세포를 처리한 후 사이토카인 IFN-g와 TNF의 변화를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 11 및 도 12 는 Panck T 세포를 LCL 종양 모델에 투여한 후, LCL 종양 제거 효능을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 13은 PBS 대조군 (Control), 정상인에서 분리 및 생산된 Panck T 세포 (Panck T 50M-2) 및 난소암 환자에서 분리 및 생산된 Panck T 세포 (Panck T 50M-1) 실험군에서의 종양 성장 억제능을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 14는 PBS 대조군 (Control), 난소암 환자에서 분리 및 생산된 Panck T 세포 (Panck-1_#14) 실험군에서의 종양 성장 억제능 및 CD8+T 세포의 비율을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 15는 Panck T 세포의 TCR (T cell receptor) 다양성을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 16은 Panck T 세포로부터 TCR 클론의 선별 과정을 나타낸 도이며, 도 17은 TCR 클론의 선별에서 양성 TCR 신호 활성을 나타낸 클론들의 결과를 나타낸 도이다.
도 18은 SW480, A375, SK-OV3 암 세포에 여러 donor로부터 제조된 Panck T 세포를 처리한 후, 암세포 사멸 활성을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
이하, 본 발명에 대하여 상세히 설명한다.
본 발명은 MR1 제한적 T 세포 (MR1-restricted T cell) 의 생산 방법에 관한 것으로, 본 발명에서 'Panck T 세포'로 명명된 MR1-restricted pan cancer killing CD8+ T lymphocytes 를 대량으로 생산할 수 있다. 본 발명의 Panck T 세포는 다양한 암종에서 발현하는 MR1 (MHC Class related Protein)에 범용성으로 결합할 수 있으므로, 암종 및 HLA (Huma Leukocyte Antigen) 에 따라 맞춤형으로만 기능하는 항암 면역 T 치료제와 달리 HLA 유형과 무관하게 다양한 암종에 대한 치료제로 활용될 수 있다.
보다 구체적으로 1) B2M (β2-microglobulin) 을 넉아웃시킨 암세포를 제조하는 단계; 2) 상기 1) 단계의 암세포에 B2M-linked MR1 의 과발현을 유도하는 단계; 3) 상기 2) 단계의 암세포에 방사선을 조사하는 단계; 4) 상기 3) 단계를 통해 제조된 암세포와 T 세포를 공동 배양하는 단계; 5) 상기 4) 단계 배양 후 T 세포를 IL-2, IL-7 및 IL-15로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 사이토카인이 포함된 배지에서 배양하는 단계; 및 6) 상기 3) 단계를 통해 제조된 암세포와 상기 5) 단계의 배양된 T 세포를 공동 배양하는 단계; 를 포함하는 MR1 제한적 T 세포 (MR1-restricted T cell) 의 생산 방법을 제공한다.
상기 1) 단계는 B2M (β2-microglobulin) 을 넉아웃시킨 암세포를 제조하는 단계이다. 상기 방법에 사용되는 암세포는 Panck T 세포를 제조하기 위한 자극원으로 사용되는 암세포로 종류에 제한없이 사용할 수 있으며, 고형암 및 혈액암을 모두 포함할 수 있다. 예컨대 본 발명에서 사용되는 암세포는 급성 림프구암, 급성 골수성 백혈병, 포상 횡문근육종, 골암, 뇌암, 유방암, 항문암, 직장암, 눈암, 두경부암, 구강암, 만성 림프구성 백혈병, 만성 골수암, 식도암, 결장암, 자궁경부암, 신경아교종, 호지킨 림프종, 인두암, 신장암, 후두암, 건암, 폐암, 흑색종, 췌장암, 복막암, 전립선암, 직장암, 신장암, 피부암, 위암, 고환암, 갑상선암, 자궁경부암, 요관암, 방광암, 대장암 및 난소암으로 이루어진 군에서 선택한 1종의 암 세포일 수 있다. 본 발명에 있어, 바람직하게는 MR1 이 낮은 수준으로 발현되는 흑색종, 대장암, 난소암 또는 폐암 세포주를 사용할 수 있다.
상기 1) 단계를 통해 B2M를 넉아웃시킴으로써, MHC I 리간드를 제한하여 MHC I 에 의한 HLA-T 세포의 유도를 저해할 수 있으며, MHC class I 과 내생적 MR1 의 형성을 억제시킨 암 세포가 제조된다. B2M 넉아웃은 당 분야에 알려진 유전자 조작 방법을 제한없이 사용할 수 있고, 본 발명에서는 CRISPR/CAS9 을 이용하여 B2M 유전자를 넉아웃시켰다.
상기 2) 단계는 상기 1) 단계의 암세포에 B2M-linked MR1 의 과발현을 유도하는 단계로 내생적 B2M 이 모두 제거된 상태의 암세포에 MR1을 다시 과발현시켜, MHC I에 의한 영향은 배제하고 MR1 제한적인 발현을 제시하는 암세포를 제조한다. 이와 같이 제조된 암세포는 B2M을 넉아웃시키지 않고 MR1 만을 과발현시킨 암세포에서 MHC I 발현이 강하게 발현되는 것과 달리, MHC I 의 발현은 현저하게 저해되고 MR1 만을 강하게 발현하는 세포인 것을 특징으로 한다.
상기 B2M-linked MR1 의 과발현 유도는 당 분야에 공지된 방법을 제한없이 사용할 수 있으며, 본 발명의 바람직한 일 구현예에서는 B2M-linked MR1 유전자를 포함하는 플라스미드를 세포에 형질감염시켜 과발현을 유도하였다.
본 발명에 있어, 3) 단계는 2) 단계의 암세포에 방사선을 조사하는 단계로 암세포로 T 세포를 자극하기 1 내지 2일 전, 70 내지 130Gy 감마선, 더욱 바람직하게는 80 내지 110Gy 감마선을 조사할 수 있고, 본 발명의 일 구현예에서는 100Gy 감마선을 조사하여 T 세포 자극용 암세포를 제조하였다. 상기 T 세포 자극용 암세포는 MHC I 의 발현은 현저하게 저해되고 MR1 만을 강하게 발현하는 암세포이며, 방사선에 의하여 자극된 암세포이다.
본 발명에 있어, Panck T 세포를 제조하기 위한 유도 단계의 첫번째 단계로, 4) 상기와 같은 방법으로 제조된 암세포를 T 세포와 공동 배양하는 단계를 포함한다. 공동 배양은 상기 암세포와 T 세포를 1:1 내지 1:5 세포 비율로 배양하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 보다 바람직하게는 1:3 내지 1:4 세포 비율로 배양하여 암세포에 의한 T 세포 자극을 유도할 수 있다.
이 후, 5) 상기 4) 단계 배양 후 T 세포를 IL-2, IL-7 및 IL-15로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 사이토카인이 포함된 배지에서 배양하는 단계; 를 포함할 수 있다. 상기 사이토카인의 첨가는 시간 차를 두고 반복적으로 수행될 수 있으며, 예컨대 암세포와 T 세포의 공동 배양 2일 차 및 5일차에 첨가될 수 있다. 상기 첨가되는 사이토카인은 IL-2, IL-7 또는 IL-15 중 하나, 이들 중 둘, 이들 모두의 조합을 포함할 수 있고, 본 발명에서는 바람직한 일 예로 사이토카인으로 IL-2 단독; IL-7 및 IL-15; 또는 IL2, IL-7 및 IL-15를 배지에 첨가하여 T 세포 자극을 유도하였다. 상기 사이토카인 중 IL-2은 20 내지 80IU, IL-7 및 IL-15 는 1 내지 10ng/ml 로 배지에 첨가될 수 있고, 본 발명의 일 구현예에서는 rIL-2 50IU, rIL-7 5ng/ml 및 rIL-15 5ng/ml 을 배지에 첨가하여 자극을 유도하였다.
상기와 같이 사이토카인 자극을 목적에 따라 적절하게 선택하여 처리할 수 있으며, 수득되는 활성화된 총 T 세포 수 증가를 위해서는 바람직하게는 IL-2, IL-7 및 IL-15 로 이루어진 군에서 선태된 2종 이상의 조합, 이들 모두를 포함하는 배지를 이용할 수 있고, 수득되는 총 T 세포 중 CD8+/CD62L+ memory T 세포를 높은 비율로 수득하고자 하는 경우, IL-2 를 단독으로 포함하는 배지를 이용할 수 있다.
본 발명에 있어, 1) 내지 3) 단계를 통해 제조된 암세포와 사이토카인을 첨가한 공동 배양을 통해 T 세포의 자극을 유도하는 단계는 필요에 따라 반복적으로 수행할 수 있다. 따라서 본 발명은 상기 5) 단계를 통해 암세포 및 사이토카인에 의한 자극이 완료된 이 후 다시, 5-1) 상기 3) 단계를 통해 제조된 암세포와 5) 단계 배양된 T 세포를 공동 배양하는 단계; 및 5-2) 상기 5-1) 단계 배양 후 T 세포를 IL-2, IL-7 및 IL-15로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 사이토카인이 포함된 배지에서 배양하는 단계; 를 1회 내지 5회 반복하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다. 상기 반복 단계는 이에 제한되는 것은 아니나, 1, 2, 3, 4 또는 5회 반복될 수 있고, 바람직하게는 2회 또는 3회 반복한다.
이 때 첨가되는 사이토카인은 IL-2, IL-7 또는 IL-15 중 하나, 이들 중 둘, 이들 모두의 조합을 포함할 수 있다. 상기 사이토카인 중 IL-2은 20 내지 80IU, IL-7 및 IL-15 는 1 내지 10ng/ml 로 배지에 첨가될 수 있고, 본 발명의 일 구현예에서는 rIL-2 50IU, rIL-7 5ng/ml 및 rIL-15 5ng/ml 중 하나 이상을 배지에 첨가하여 자극을 유도하였다.
상기와 같은 암세포 자극 및 사이토카인 자극에 의한 T 세포 유도 후에는 5) 단계 이후, IL-2 를 포함하는 배지에서 T 세포를 배양하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 단계에서는 사이토카인으로 IL-2 만을 단독으로 포함하는 배지를 포함하여 T 세포 자극을 추가적으로 유도하며 2일 내지 4 마다 배양 배지의 1/2을 IL-2 를 첨가한 새로운 배지로 교환하며 배양을 수행한다. 이때 IL-2 은 20 내지 80IU 로 첨가되고, 바람직하게는 40 내지 60 IU 로 배지에 첨가될 수 있다.
본 발명은 6) 상기 3) 단계를 통해 제조된 암세포와 상기 5) 단계의 배양된 T 세포를 공동 배양하는 단계를 포함한다. 본 단계는 5) 단계 배양 이후 자극 유도된 T 세포를 3) 단계에서 제조된 MHC I의 발현은 현저하게 저해되고 MR1 만을 강하게 발현하는 암세포로 다시 한번 자극하는 단계이다.
본 발명에 있어 자극 단계인 4) 내지 6) 단계는 8 내지 20일 동안 수행될 수 있으며, 바람직하게는 10 내지 15일, 더욱 바람직하게는 11일 내지 13일 동안 수행될 수 있다. 따라서, 자극 유도 단계의 마지막 단계인 6) 단계는 최초 암세포와 T 세포의 공동 배양 자극 개시 후 12일 차에 수행될 수 있고, 하룻밤동안 자극한 후 자극 단계가 종료된다.
상기와 같은 자극 단계가 본 발명의 도 1에 도시되어 있다. 자극 단계가 종료된 T 세포는 자극 유도 전 T 세포와 비교하여 4-1BB 발현이 확인된다.
상기와 같은 단계를 통해 CD8+, 4-1BB+ 특성을 나타내는 MR1-restricted pan cancer killing CD8+ T lymphocytes 인 “T 세포” 가 제조될 수 있다.
또한 본 발명은 상기 MR1 수용체를 특이적으로 발현하는 CD8+ T 세포인 Panck T 세포의 수득율을 높이기 위하여, 추가적인 확장 단계를 포함한다.
본 발명에서는 순도를 높이기 위하여, MAIT 세포의 존재를 배제하기 위한 TCRva7.2+ sort out 단계를 추가적으로 수행할 수 있고, 이를 통해 CD8(+), TCRva7.2(-)인 T 세포를 게이팅하고, CD8+ 4-1BB+ 인 T 세포만을 분리하여 본 발명의 확장 단계에 사용할 수 있다.
따라서 본 발명은 7) 상기 5) 단계에서 제조된 세포 중 CD8+, 4-1BB+ 및 TCRva7.2(-) 인 세포를 분리하는 단계; 및 8) 상기 7) 단계에서 분리된 세포를 배양하는 단계; 를 포함하는 확장 단계를 포함할 수 있고, 상기 8) 단계는 7) 단계에서 분리된 세포를 방사선 조사된 allo-PBMC, IL-2 및 항-CD3 항체를 포함하는 배지에서 배양하는 것을 특징으로 할 수 있다. 보다 구체적으로 상기 방사선은 20 내지 90Gy 의 감마 방사선일 수 있고, 바람직하게는 50 내지 70Gy 의 감마 방사선일 수 있다. 상기 allo-PBMC 는 7) 단계에서 분리된 세포의 150 내지 250 배수로 포함될 수 있고, 바람직하게는 170 내지 220 배로 포함될 수 있다. 배지에 포함되는 IL-2는 800 내지 1200IU 및 항-CD3 항체는 10 내지 50ng/ml 농도로 포함될 수 있으며, 보다 바람직하게는 IL-2은 900IU 내지 1000IU, 항 CD3 항체는 20 내지 40ng/ml 로 포함될 수 있다.
본 발명의 확장 단계는 7 내지 13일 동안 수행될 수 있고, 반제품 확장 단계까지 수행되는 경우, 약 7일, 이 후 완제품 확장단계까지 수행되는 경우 추가적으로 11일 내지 13일의 기간 동안 수행될 수 있다.
상기와 같은 MR1 제한적 T 세포 (MR1-restricted T cell) 의 생산 방법을 통해 생산된 T 세포는 CD8+T 및 4-1BB+ 세포인 것을 특징으로 할 수 있고, CD8+, 4-1BB+, 및 TCRva7.2(-) 인 것을 특징으로 할 수 있다.
따라서, 본 발명은 상기와 같은 생산 방법으로 생산된 MR1 제한적 T 세포 (MR1-restricted T cell)를 제공하며, 이들은 CD8+T 및 4-1BB+ 세포인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 MR1 제한적 T 세포는 또한 TCRva7.2-이며 CD69high, CD45RO+, CD161-, PD-1low 또는 CD57low 마커 발현 특성을 갖는 것을 특징으로 할 수 있다.
따라서 본 발명은 i) CD8+T 및 4-1BB+; ii) TCRva7.2-; 및 iii) CD69high, CD45RO+, CD161-, PD-1low 또는 CD57low 마커 발현 특성을 갖는, MR1 제한적 T 세포를 제공하며, 바람직하게는 i) CD8+T 및 4-1BB+; ii) TCRva7.2-; 및 iii) CD69high, CD45RO+, CD161-, PD-1low 및 CD57low 마커 발현 특성을 갖는 MR1 제한적 T 세포를 제공할 수 있다.
상기와 같은 마커 발현 특성을 갖는 MR1 제한적 T 세포는 기존의 T 세포와 달리 암 종 및 HLA 유형에 따른 암항원의 발현에 따라 제한적으로 사용되는 기존 맞춤형 항암 면역 T 세포 치료제와 달리 HLA 유형에 상관없이 모든 암 종에 적용 가능하므로, MR1에 결합가능한 신규 T 세포 치료제로 활용할 수 있다.
본 발명의 T 세포는 배양된 T 세포, 예컨대 일차 T 세포와 같은 모든 T 세포 또는 배양된 세포주 예컨대 Jurkat, SupT1 등으로부터 유래한 T 세포, 포유동물 유래 T 세포, 바람직하게는 인간 환자 유래 T 세포나 T 세포 전구체일 수 있다. 포유 동물 유래인 경우 혈액, 림프구, 골수, 흉선, 또는 기타 조직이나 유체로부터 수득할 수 있다. 바람직하게는 상기 T 세포는 인간 T 세포 일 수 있으며, CD4+ 양성 T 세포, CD8 양성 세포독성 T 림프구, 감마 델타 T 세포, 종양 침윤 림프구 또는 말초 혈액 단핵세포 (PBMC) 에서 분리된 T 세포일 수 있다.
본 발명에서는 본 발명의 생산방법으로 제조된 MR1 제한적 T 세포 또는 i) CD8+T 및 4-1BB+; ii) TCRva7.2-; 및 iii) CD69high, CD45RO+, CD161-, PD-1low 또는 CD57low 마커 발현 특성을 갖는, MR1 제한적 T 세포를 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다. 또한 본 발명의 약학적 조성물은 MR1 제한적 T 세포는 바람직하게는 i) CD8+T 및 4-1BB+; ii) TCRva7.2-; 및 iii) CD69high, CD45RO+, CD161-, PD-1low 및 CD57low 마커 발현 특성을 갖는, MR1 제한적 T 세포를 포함할 수 있다.
본 발명에 있어, “조성물”은 활성 성분으로서 본 발명에 따른 MR1 제한적 T 세포와 함께 천연 또는 인공의 담체, 라벨 또는 탐지제와 같은 불활성 성분 또는 애주번트, 희석제, 결합제, 안정화제, 완충제, 염, 친지방성 용매, 보존제와 같은 활성 성분과의 조합을 의미하며, 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함한다. 담체는 또한 약학적 부형제 및 부가적인 단백질, 펩티드, 아미노산, 지질, 및 탄수화물 (예를 들어, 단당류; 이당류; 삼당류; 사당류; 올리고당류; 알디톨, 알돈산, 에스테르화된 설탕과 같은 설탕의 유도체, 폴리사카라이드, 또는 당 중합체 등)을 단독으로 또는 조합하여 포함할 수 있으며, 1 내지 99.99 중량% 또는 부피%로 포함할 수 있다. 단백질 부형제는, 예를 들어, 인간 혈청 알부민, 재조합 인간 알부민, 젤라틴, 카제인 등을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 완충 역할을 할 수 있는 대표적인 아미노산 성분은, 예를 들어, 알라닌, 알기닌, 글리신, 베타인, 히스티딘, 글루탐산, 아스파르트산, 시스테인, 라이신, 루신, 아이소루신, 발린, 메티오닌, 페닐알라닌, 아스파탐 등을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 탄수화물 부형제는 또한, 예를 들어, 프룩토스, 말토스, 갈락토스, 글루코스, D-만노스, 솔보스와 같은 단당류; 락토스, 수크로스, 트레할로스, 셀로비오스와 같은 이당류, 라피노스, 말토덱스트린, 텍스트란, 전분과 같은 다당류, 및 만니톨, 자일리톨, 말티톨, 락티톨, 소르비톨, 및 마이오이노시톨과 같은 알디톨을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 약학 조성물은 당업자에 의해 공지의 방법으로 제제화하는 것이 가능하다. 예를 들면, 필요에 따라서 물 또는 그 외의 약학적으로 허용되는 액과의 무균성 용액, 또는 현탁액제의 주사제의 형태로 비경구적으로 사용할 수 있다. 예를 들면, 약학적으로 허용되는 담체 또는 매체, 구체적으로는, 멸균수나 생리 식염수, 식물유, 유화제, 현탁제, 계면활성제, 안정제, 부형제, 비히클(vehicle), 방부제, 결합제 등과 적당 조합하여, 일반적으로 인정된 제약 실시에 요구되는 단위 용량 형태로 혼화함으로써 제제화할 수 있다. 상기 제제에 있어서 유효 성분량은 지시받은 범위의 적당한 용량을 얻을 수 있도록 하는 것이다.
본 발명에 있어, 상기 암은 고형암 및 혈액암을 모두 포함할 수 있다. 예컨대 본 발명의 암은 급성 림프구암, 급성 골수성 백혈병, 포상 횡문근육종, 골암, 뇌암, 유방암, 항문암, 직장암, 눈암, 두경부암, 구강암, 만성 림프구성 백혈병, 만성 골수암, 식도암, 결장암, 자궁경부암, 신경아교종, 호지킨 림프종, 인두암, 신장암, 후두암, 건암, 폐암, 흑색종, 췌장암, 복막암, 전립선암, 직장암, 신장암, 피부암, 위암, 고환암, 갑상선암, 자궁경부암, 요관암, 방광암, 대장암 및 난소암으로 이루어진 군에서 선택한 1종의 암일 수 있다. 본 발명에 있어, 상기 암은 바람직하게는 흑색종, 대장암, 난소암 또는 폐암일 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 경구투여, 주입, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 복강내 투여, 직장내 투여, 국소 투여 및 비내 투여 등으로 투여될 수 있고, 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중 및 환자의 중증도 및 여러 인자에 따라 적절하게 조절될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 종양 또는 암 증상을 예방, 개선 또는 치료하기 위한 목적으로 다른 공지의 항암제와 병용 투여될 수 있다.
또한 본 발명은 상기 MR1 제한적 T 세포를 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 암 치료 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 MR1 제한적 T 세포의 암 치료를 위한 용도 및 암 치료제 제조에 있어서의 용도를 제공한다.
상기 이를 필요로 하는 개체는 암에 걸린 개체 또는 암에 걸린 가능성이 있거나, 암에 걸린 것으로 의심되는 개체를 의미하며, 인간을 포함한 포유류를 제한없이 포함할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. Panck T 세포의 제조
암세포 사멸을 유도할 수 있는 새로운 T 세포를 프라이밍하여 제조하고 이를 대량 생산하기 위한 본 발명의 공정을 도 1과 같이 수행하였다. 본 발명의 방법은 T 세포를 암세포 및 재조합 인간 IL-2로 자극하는 자극 단계 (stimulation phase)와 자극된 T 세포를 고순도로 분리하여 대량으로 배양하는 확장 단계(Expansion phase)를 포함하고 전체 공정은 20일 내지 33일에 걸쳐 수행된다.
보다 구체적으로 하기와 같다.
1.1 T 세포 자극용 암세포의 제조
β2-microglobulin (B2M) 은 MR1 외에도 MHC I 이 리간드와 결합하여 폴딩 구조를 형성함으로써 세포 표면에 제시할 수 있도록 기능한다. 따라서, MHC I 리간드를 제한하여 MHC I 에 의한 HLA-T 세포의 유도를 저해하기 위하여 B2M 을 넉아웃시킨 암세포를 제조하였다. 암세포로는 MR1 이 낮은 수준으로 발현되는 A375 (멜라노마 세포주), SW480 (대장암 세포주), SK-OV3 (난소암 세포주), A549 (폐암 세포주), A375 (악성 흑색종 세포주), K562 (만성 골수 백혈병 세포) 및 THP-1 (인간 단핵구 백혈병 세포주) 을 이용하였다.
암세포주에서 B2M의 넉아웃을 위하여 암세포는 PCR 방법에 의한 mycoplasma test를 수행하여 마이코플라즈마 오염이 되지 않음을 확인하였다. CRISPR/CAS9 system을 이용한 B2M 넉아웃을 위하여 B2M을 타깃하는 guide RNA는 인트론을 포함한 signal peptide 부분의 유전자 서열을 CRISPR/CAS9과 EGFP를 포함하는 Guide-it CRISPR/CAS9 system plasmid (Clontech)에 클로닝하였다. 암세포는 6-well plate에 세포를 깔아서 overnight 배양한 후 B2M gRNA CRISPR/CAS9/EGFP plasmid를 암세포에 Transfection하고 72시간 동안 배양하였다. 플라스미드의 transfection은 현광 현미경으로 세포내 EGFP의 발현 정도를 관찰함으로써 확인하였다. EGFP를 발현하는 암세포는 바닥으로부터 떼어내고 FACS Pre-sort buffer (BD)에 현탁하여 APC-anti-human β(Biolegend) 항체를 처리하여 4℃에서 20분간 반응시켰다. FACS sorter를 사용하여 플라스미드의 report인 EGFP를 발현하면서 B2M 발현이 넉아웃된 EGFP(+)/B2M-APC(-)인 세포군을 분리하였다. 분리한 암세포는 세포수를 측정한 후 96-well plate에 0.5 cell/well로 seed하여 single cell cloning을 하였다. 세포 배양 동안 각 well에서 세포군 형성을 확인하고 세포수가 증가하면 각 clone을 12-well plate로 옮겨서 배양을 유지하였다. 각 clone의 일부 세포는 B2M 유전자의 mutation을 확인하기 위하여 Guide-it™Mutation Detection Kit (Clontech)을 이용하여 분석하였고 그 과정은 PCR에 의해 B2M 유전자를 증폭하고 DNA hybridization 후 효소 반응하여 전기영동으로 B2M 유전자의 잘려진 형태를 확인하는 과정을 포함한다.
각 clone의 분석에서 효소 반응에 의해 잘려진 형태를 가지는 clone은 탈락시키고 잘려지지 않은 형태를 가지는 clone의 DNA는 agarose gel로부터 분리하여 유전자 서열 분석을 하였다. 유전자 서열은 DNA 서열뿐만 아니라 아미노산으로 번역하여 B2M 서열에서 mutation을 가지는, 특히 아미노산 서열에서 stop codon을 가지는 clone을 선별하였다. 선별된 clone의 세포 배양을 유지하면서 1.5-2x106 cells은 RIPA lysis buffer로 lysis하여 단백질을 추출하여 50ug의 단백질을 전기영동하고 Nitrocellulose membrane에 transfer 한 후 anti-B2M antibody (Abcam)로 Western blot하여 SW480 (ATCC, CCL-228)에 더하여 SK-OV3 (ATCC, HTB-79), A375 (KCLB, KCLB80003), A549 (ATCC, CCL185), THP-1 (ATCC, TIB-202) 및 K562 (KCLB, KCLB10243) 에서 B2M 단백질의 넉아웃을 확인하였고 그 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2에 나타낸 바와 같이, 각 세포주에서는 B2M 단백질의 넉아웃이 효과적으로 달성되고, MHC class I 과 내생적 MR1의 형성을 억제시킨 암 세포주가 제조됨을 확인하였다.
B2M 넉아웃 암세포는 3~5x106 세포를 6-well plate에 seed하여 배양하고 다음날 B2M을 연결한 MR1 유전자와 G418 selection marker를 포함하는 플라스미드를 세포에 transfection하여 과발현을 유도하였다. MR1을 과발현하는 세포는 G418 항생제의 농도를 점차적으로 증가하면서 1차 선별하였고 충분한 세포수를 확립하였을 때 anti-MR1-APC (Biolegend) 항체를 사용하여 MR1이 강하게 발현되는 세포군을 1~2회 FACS sorting함으로써 2차 분리하였다. MR1의 과발현은 SW480-B2M ko-5 세포주에 더하여 SK-OV3-B2M ko-11, A375-B2M ko-4, 그리고 A549-B2M ko-28 세포주에서 확립하였다.
상기 암세포주에 B2M-linked MR1의 과발현을 유도한 후, B2M 을 넉아웃한 이후 MR1 이 다시 과발현된 암세포가 제조되었음을 확인한 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3에 나타낸 바와 같이, MR1 과발현 유도에 의하여, 다시 MR1 및 B2M 발현이 증가된 것을 확인하였다.
B2M을 넉아웃하고 MR1을 과발현 시켜 제조된 SW480 B2M KO/MR1 OV 및 B2M을 넉아웃하지 않고 MR1 만을 과발현시킨 SK-OV3 세포주인 SK-OV3/MR1 OV 에서 MHC I 발현을 확인하여, MHC I 이 효과적으로 억제되었는지 항-HLA-ABC 항체와의 결합을 확인하였다. 또한 SK-OV3-B2M KO/MR1 세포주와 야생형 SK-OV3 (WtSK-OV3), MRI 과발현 유도 없이 B2M만 넉아웃된 SK-OV3-B2M-ko 세포에서 MHC I 발현을 확인하였다.
도 4a에 나타낸 바와 같이, 본 발명에서 제조한 B2M 넉아웃 후 MR1을 과발현시킨 세포주 SW480 B2M KO/MR1 OV 에서는 항-HLA-ABC 항체에 대한 결합이 매우 낮게 나타나 MHC I 의 발현이 약 9.89% 정도인 것으로 확인되었다. 또한 도 4b에 나타낸 바와 같이 B2M 을 넉아웃시키고 MR1을 과발현시켜 제조된 SK-OV3 B2M KO/MR1 세포주에서도 MHC I 발현이 사라지는 것을 확인하였다. 이러한 결과는 B2M 을 넉아웃 시키지 않고 MR1 만 과발현 시켜 제조된 SK-OV3/MR1 OV 세포의 MHC I 발현이 99% 이상으로 강하게 발현되는 것과 대조적인 결과이다. 또한 본 발명을 통해 MR1 제한적인 발현을 제시하는 암세포가 제조되었음을 확인하였다. 이러한 결과는 MR1에 제한된 T 세포 활성을 유도하기 위해서는 B2M 넉아웃에 의하여 MHC I 의 강한 발현을 제거하는 것이 효과적임을 나타내는 결과이다.
상기 제조된 B2M-넉아웃/MR1 과발현 암 세포는 하기 자극 단계에 사용하기 하루 전에 100Gy 감마 방사능을 조사하여 준비하였다.
실제 암환자의 세포에서 MR1 의 발현 패턴을 확인하기 위하여, 암 환자의 복수로부터 분리된 세포에서 면역 T 세포를 분석하였다. 먼저 IRB 에 의해 제공받은 5명 난소암 환자의 복수로부터 세포를 분리하였다. 분리된 일부 세포는 MR1 항체 (Biolegend) 로 염색하였고, 복수 유래 세포에서 면역 T 세포의 존재를 확인하기 위하여 CD4 항체 (BD) 및 CD8 (Biolegend) 항체로 염색을 수행하였다. 복수 유래 세포에서의 MR1 의 발현을 확인한 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5에 나타낸 바와 같이, 복수 유래 세포 ascites 6, ascites 13에서는 MR1 이 강하게 발현하였고, ascites 5, ascites 10은 중간 정도, ascites 9 는 약한 발현을 나타내는 것을 확인하였다. 그러나 MR1 발현은 정상 세포나 암세포주에서의 약한 발현과 비교하여 암환자 유래의 세포에서는 비교적 발현이 증가되어 있는 것을 확인하였다. 또한 CD4 및 CD8 항체에 대한 결합 확인 결과, 암 환자 복수 유래 세포에는 면역 T 세포도 일정 비율 존재하고 있음을 확인하였다. 이러한 면역 T 세포는 MR1 에 대한 자극 유도가 더 좋을 것으로 예상되었다.
1.2 자극 단계
자극 단계는 암세포에 의해 T 세포를 자극시키고, 적절한 조합의 사이토카인을 처리하여 MR1 수용체를 발현하는 T 세포로 유도하는 단계이다.
상기 1.1 에서 제조된 SW480 B2M KO/MR1 OV 세포주 또는 SK-OV3/MR1 OV 세포주로 T 세포를 자극하면 MR1에 제한적인 특이성을 갖는 MR1 수용체를 발현하는 T 세포 (Panck T 세포)의 증식을 유도할 수 있다.
MRI 제한적 T 세포를 제조하기 위한 첫번째 단계로 먼저 건강한 기증자 또는 난소암 환자의 혈액을 Ficoll-paque (Cytiva)을 이용한 밀도 구배에 의하여 PBMC를 분리 또는 pan T 세포를 분리 (Pan T cell isolation Kit, Miltenyi Biotec)하였다. 상기 실시예 1.1 과 같이 하루 전에 100Gy 감마 방사능을 조사한 B2M-넉아웃/MR1 과발현 암 세포는 5x105/well 세포를 12-well plate에 부착 배양하여 준비한다. 부착된 방사선 조사된 B2M-넉아웃/MR1 과발현 암 세포와 분리한 PBMC 유래 T 세포를 암세포의 3~4배의 T 세포 비율로 공동 배양하여 T 세포의 자극을 유도하였다 (Day 1).
이 후 CTL 배지 (웰진)에 3% auto-plasma를 첨가한 배지를 사용하여 배양 2일과 5일에 2번만 인간 rIL-2 (50IU)을 첨가하였다.
Day 7에 새롭게 부착한 100Gy 감마 방사능 조사된 B2M-넉아웃/MR1 과발현 암세포와 이전 단계에서 자극된 T 세포를 공동 배양하여 2차 자극을 가했다. Day 9 및 Day 11 차에는 rhIL-2 (50IU)를 첨가한 새로운 CTL+3% auto-plasma 배지로 교환하여 주었다. Day 11에는 새롭게 부착한 100Gy 감마 방사능 조사된 B2M-넉아웃/MR1 과발현 암세포를 준비하였다. 이후 Day 12에 새롭게 부착한 100Gy 감마 방사능 조사된 B2M-넉아웃/MR1 과발현 암세포와 앞서 자극된 T 세포를 공동 배양하여 overnight 동안 다시 자극한 후 자극 단계를 종료하였다.
방사선 조사된 B2M-넉아웃/MR1 과발현 암 세포로 자극하기 전의 CD8+ T 세포에서는 4-1BB의 발현이 확인되지 않았으나, 상기 자극 방법을 거친 CD8+T 세포에서는 4-1BB 의 발현이 확인되었다.
1.3 확장 단계
확장 단계는 1.2에서 자극 유도하여 제조된 MR1 수용체를 특이적으로 발현하는 CD8+T 세포를 대량 증식하기 위한 단계이다. 상기 유도 단계를 거친 CD8+ T 세포는 4-1BB 가 발현되는 것을 확인하였으므로, 이를 이용하여 MR1 수용체를 발현하는 T 세포를 분리하였다. 또한 MAIT 세포의 존재를 배제하기 위하여, TCRva7.2+세포를 sort out 하였다.
즉 목적하는 세포를 얻기 위하여 유도한 T 세포는 FACS Pre-sort buffer (BD)에 단일 세포 현탁액으로 모으고 anti-hCD8-V450 (Biolegend), anti-h4-BB-PeCy7 (BD), 그리고 anti-TCRva7.2-APC (Biolegend) 항체를 처리하여 4℃에서 20분간 반응한 후 FACs 소팅을 이용하여 CD8(+), TCRva7.2(-)인 T 세포를 gating한 후 CD8+ 4-1BB+ 인 T 세포만을 분리하였다. 분리된 세포를 분석한 결과를 도 6에 나타내었다.
도 6에 나타낸 바와 같이, CD8+, 4-1BB+ 세포의 순도는 97.1% 로 확인되었고, CD8+TCRva7.2+세포는 0.05%로 나타나, 본 발명에서 제조된 T 세포가 높은 순도의 CD8+, 4-1BB+, TCRva7.2(-) 세포로 제조되었음을 확인하였다.
이 후 분리된 상기 T 세포를 ALys505N serum free medium (CSTI), 3% allo-plasma, 60Gy 감마 방사선이 조사된 allo-PBMC (분리된 Panck T 세포수의 200배 이상), rhIL-2 (1000IU), 및 항-hCD3 항체 (BD, 30ng/ml)를 포함하는 최적화된 배지에서 배양을 시작하고 이 후에는 2~3일 간격으로 rhIL-2 (1000IU)와 3% allo-plasma를 첨가한 ALys505N (CSTI), 배지를 첨가해 주면서 7일 동안 배양한 후 반제품으로 세포를 얼리거나 또는 11~13일 동안 배양을 진행하여 암세포 사멸 효능을 가지는 Panck T 세포를 대량 수득하였다.
얼려진 반제품 Panck T 세포는 다시 확장 배양을 위하여 녹여서 ALys505N serum free medium (CSTI), 3% allo-plasma, 60Gy 감마 방사선이 조사된 allo-PBMC (분리된 Panck T 세포수의 200배 이상), rhIL-2 (1000IU), 및 항-hCD3 항체 (BD, 30ng/ml)를 포함하는 최적화된 배지에서 11~13일 동안 배양을 진행하여 완제품 Panck T 세포를 제조할 수 있다.
이와 같이 제조된 세포는 MR1 수용체를 특이적으로 발현하는 T 세포로 MRI 제한적 T 세포(MR1-restricted T cell)로 정의될 수 있고, 본 발명의 자극 및 증식단계를 통해 제조된 MRI 제한적 T 세포를 'Panck T 세포'로 정의하였다.
실시예 2. 사이토카인 첨가에 의한 Panck T 세포 회수 효과 비교
본 발명의 Panck T 세포 제조 공정 중 자극 단계에서 수행되는 rIL-2, rIL-7 및 rIL-15 첨가에 의한 Panck T 세포 제조 효율을 비교하기 위하여, 도 1의 Day 2, 5 자극 단계에서 첨가되는 사이토카인을 i) IL-2 단독 처리, ii) IL-7 및 IL-15 처리, iii) IL-2, IL-7 및 IL-15 처리 실험군으로 나누어 그 효과를 비교하였다.
실험군 농도
IL-2 단독 i) IL-2; 50IU
IL-7 및 IL-15 i) IL-7; 5ng/mlii) IL-15; 5ng/ml
IL-2, IL-7 및 IL-15 i) IL-2; 50IUii) IL-7; 5ng/ml
iii) IL-15; 5ng/ml
확장에 의한 효과를 배제하기 위하여, 배양 12일 차 마지막 자극 단계의 방사선 조사된 B2M-넉아웃/MR1 과발현 암 세포로 자극 후 다음 날 수득되는 전체 T 세포의 수를 비교하였으며, 그 결과를 도 7에 나타내었다.
도 7에 나타낸 바와 같이, IL-2 단독 처리와 비교하여, SW480 B2M KO/MR1 OV 세포주, SK-OV3/MR1 OV 세포주 모두에서 IL-7 및 IL-15, IL-2, IL-7 및 IL-15 처리군에서 수득되는 활성화된 전체 T 세포의 수가 증가하는 것을 확인하였다.
그러나 실제적인 Panck T 세포 분리에서 수득되는 CD8+/4-1BB+ Panck T 세포 비율은 3개의 처리군에서 현저한 차이가 없었으며, 또한 CD8+/CD62L+ memory T 세포의 비율(박스 표시)은 오히려 IL-2 단독 처리에서 높은 것을 확인하였다.
즉, 유도 단계에서 수득되는 전체 T 세포수는 IL-2 단독 처리보다 IL-2, IL-7 및 IL-15 처리군에서 증가되었지만, 실질적으로 목적하는 분리된 CD8+/4-1BB+ Panck T 세포 비율은 IL-2 단독 처리와 미약한 차이를 보였으므로 필요에 따라, 자극 단계에서 세포수 수득율을 높이기 위해서는 IL-2를 단독 처리하거나 IL-7 및 IL-15 를 병용 처리 하더라도 유사한 효과를 구현할 수 있음을 확인하였다. 이후 실시예에서는, CD8+4-1BB+ Panck T 세포의 제조에 IL-2 단독 처리하는 것을 우선적으로 사용하였다.
실시예 3. Panck T 세포 분리 및 표현형 분석
실시예 1의 방법으로 제조되고 증식된 Panck T 세포의 표현형을 확인하기 위하여 다양한 T 세포 마커를 분석하였다. 구체적으로 Panck T 세포는 각 다양한 T 세포 마커로써 anti-hCD8-V450 (Biolegend), anti-hCD69-PeCy7 (Biolegend), anti-hCD161-BV605 (Biolegend), 5-OP-RU tetrmer-APC (Creative Biolabs), anti-TCRva7.2-APC (Biolegend), anti-hCD62L-BV510 (BD), anti-hCD45RO (BD), anti-hCD57-FITC (BD), anti-hPD-1-FITC (BD)의 항체를 처리하고 4℃에서 20분간 반응한 후 flow cytometry로 CD69 (T 세포 활성화 관여), CD161, 테트라머, TCRva7.2 (MAIT 세포 마커), CD62L (메모리 T 세포 마커), CD45RO (T 세포 활성화/증식 관여), CD57(T 세포 노화 마커), PD-1(T 세포 고갈 마커) 의 발현 정도를 분석하였다. 세포 마커 확인 결과를 도 8에 나타내었다.
도 8에 나타낸 바와 같이, Panck T 세포는 MAIT 세포 마커인 테트라머와 TCRva7.2를 발현하지 않았으며, CD69high, CD45RO+, CD161-, PD-1low, CD57low 의 표현형으로 발현하는 것을 확인하였다. 상기 결과를 통해 본 발명의 Pank T 세포는 효과기 메모리 T 세포의 성질을 나타내는 것을 확인하였다.
실시예 4. In vitro 에서 Panck T 세포의 효능 확인
본 발명의 방법에 의해 제조된 Panck T 세포의 암세포 사멸능력을 확인하기 위하여, in vitro 실험을 수행하였다. 표적 암 세포로 A375 (KCLB, KCLB80003), SW480 (ATCC, CCL-228) 및 SW480으로부터 MR1을 넉아웃 시켜서 확립된 MR1 ko-10-40-5를 준비하였으며, Panck T 세포는 건강한 사람의 혈액으로부터 제조된 S0006-T 세포와 난소암 환자로부터 제조된 #11-210518-T 세포, #12-210526-T 세포를 사용하였다 (공여자의 혈액은 IRB에 의해 제공되었다).
실험군은 배양액만 처리한 군, 타깃 암세포주에 lysis buffer 처리하여 100% 사멸시킨 SW480 only, MR1 ko-10-40-5 only의 양성 대조군, 그리고 각 Panck T 세포만 처리한 Panck T only의 음성 대조군과 비교하여 암세포주의 Panck T 세포 처리군에서 암세포 사멸 효능을 분석하였다.
96U-well plate에 타깃 암세포주를 각 well에 1x104개의 세포를 넣고 Effector Panck T 세포는 암세포주의 1:1 비율에서는 1x104개의 T 세포를 첨가하고 1:5 비율에서는 5x104개의 T 세포를 첨가한 후 16 시간 동안 배양하였다. 암세포 사멸 효능을 LDH (CytoTox96 Non-radioactive Cytotoxicity assay, Promega) 분석 방법을 통해 분석하였다. 암 세포 사멸 효과가 Panck T 세포의 MR1 특이적 수용체에 의한 MR1 결합 독성인지 여부를 비교하기 위하여, 타깃 암세포주로 SW480 및 A375을 사용하였고, 그 대조군으로 MR1 발현이 넉다운된 SW480-MR1 KO 10-40-5 세포를 음성 대조군으로 비교하고 또한 항-MHC I 항체 (BD)를 이용한 암세포주의 MHC I 단백질을 차단하여 Panck T 세포의 암 세포 사멸 효과에 영향을 미치는지 확인하였다. 암 세포에 대한 세포 독성을 확인한 결과를 도 9에 나타내었다.
도 9에 나타낸 바와 같이, 3종류의 Panck T 세포 처리군 모두에서 암 세포 사멸 효능이 확인되었다. 특히 모든 실험군에서 MR1 발현이 넉다운된 KO 10-40-5 세포에서는 세포 사멸 효과가 현저히 감소함과 동시에 항-MHC I 항체 차단 실험군에서는 세포 사멸 효과에 영향을 크게 받지 않았다는 점에서 본 발명의 Panck T 세포의 암세포 사멸 효과가 MR1 제한적 암세포 사멸 효과임을 확인하였다.
추가적으로 실시예 4에서 Panck T 세포에 의한 암세포 사멸 실험과정에서 분비되는 Panck T 세포의 사이토카인 생성량을 CBA 분석 (BD, Cytometric Bead Array) 방법으로 분석하였다. 실험군은 배양액만 처리한 군, 타깃 암세포주에 lysis buffer 처리하여 100% 사멸시킨 SW480 only, MR1 ko-10-40-5 only의 양성 대조군, 그리고 각 Panck T 세포만 처리한 Panck T only의 음성 대조군과 비교하여 암세포주의 Panck T 세포 처리군에서 암세포 사멸 효능에서 생성되는 사이토카인을 분석하였다.
각 실험군의 배양액을 각 IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, TNF, IFN-g, IL-17의 사이토카인 capture bead mix에 처리하고 실온에서 3시간 반응시킨 후 각 사이토카인 Beads의 배양액에 포함한 사이토카인 결합 강도를 flow cytometry의 Mean value값으로 확인하였고, 유의한 변화가 관찰된 IFN-g와 TNF의 그 결과를 도 10에 나타내었다.
도 10에 나타낸 바와 같이, Panck T 세포를 처리한 실험군에서 IFN-g 및 TNF 사이토카인이 증가하였으나, MR1 발현이 넉다운된 KO 10-40-5 세포에서는 이러한 사이토카인의 증가가 확인되지 않았다. 또한 항-MHC I 항체 차단에 의한 영향없이 사이토카인이 증가하였으므로, Panck T 세포가 MR1 제한적 T 세포임을 확인하였다.
Panck T 세포의 암세포 사멸 효능은 모든 실험군의 T 세포에서 IFN-g 생성이 현저하게 증가되는 것을 통해 확인할 수 있으며, 반면에 TNF의 생성은 암세포주 사멸에서는 유의한 증가를 보였으나 anti-MHC I 차단은 일관성있는 효과가 관찰되지 않았다.
실시예 5. In vivo Panck T 항암 활성 분석
본 발명 Panck T 세포의 in vivo 항암 활성을 확인하기 위하여, 혈액 종양 모델을 이용하였다. 면역 결핍 NSG 마우스에 4x106 cells의 LCL(자체 제작, human lymphoblastoid cell line) 세포를 피하 투여하여 종양을 만들고 종양 크기를 측정하였다. Panck T 세포 투여 전, 전체 마우스 종양의 평균 크기를 기준으로 그룹을 나누고 각 개체 마우스의 꼬리표를 숫자로 표기하였다. 첫번째 실험은, 10x106 cells/mouse의 Panck T 세포 수를 투여하였고, 두번째 실험은 첫번째 실험에서 사용한 세포 수보다 낮춰서 6.6x106 cells/mouse과 3.3x106 cells/mouse의 두 그룹으로 Panck T 세포를 투여하였다. 음성 대조군으로 1xDPBS를 사용하였고, 정상 T 세포로 분리된 CD8+/4-1BB- T 세포 (Normal T)를 이용하였다. 실험은 2회 반복 실험하였으며, LCL 종양 제거 효능을 확인한 결과를 도 11 및 도 12에 나타내었다.
도 11에 나타낸 바와 같이, Panck T 세포를 1회, 10x106 cells/mouse 투여한 모든 실험군에서 종양 부피가 감소함을 그룹별 평균 종양 성장(왼쪽)과 개체별 종양 성장(오른쪽)으로 확인하였다.
또한 도 12에 나타낸 바와 같이, Panck T 세포를 10x106 cells/mouse 세포수보다 낮은 6.6x106 cells/mouse과 3.3x106 cells/mouse의 세포수 투여 실험군에서도 LCL 종양의 성장이 현저하게 억제되는 것을 그룹별 평균 종양 성장(왼쪽)과 개체별 종양 성장(오른쪽)으로 확인하였다. 반면 정상 T 세포인 CD8+/4-1BB- T 세포를 이용한 실험군(Neg 그룹)에서는 초기 암 세포의 성장이 급격히 증가하여, Panck T 세포 투여군과 차이를 나타냈다. 상기와 같은 결과는 정상 T 세포와 달리 본 발명의 방법에 의해 제조된 Panck T 세포가 종양 성장을 더 낮은 농도에서도 더 빠르고 효과적으로 억제할 수 있음을 보여주는 결과이다.
실시예 6. SW480 고형암에서의 In vivo Panck T 항암 활성 분석
고형암종인 SW480 종양 모델에서의 항암 효과를 확인하기 위하여, 난소암 환자로부터 분리하여 실시예 1의 방법으로 제조된 Panck T 세포 (1 그룹), 건강한 정상 공여자로부터 분리하여 실시예 1의 방법으로 제조된 Panck T 세포 (2 그룹) 를 5x107 cells/mouse 투여량으로 고형암종인 SW480 종양 모델에 투여하였다. 이 후 각 실험군에서 종양 크기의 변화를 확인하였으며, 그 결과를 도 13에 나타내었다.
추가하여 고형암종인 SW480 종양 모델에서의 항암 효과를 확인하기 위하여, 또 다른 난소암 환자로부터 분리하여 실시예 1의 방법으로 제조된 Panck T 세포를 5x107 cells/mouse 투여량으로 고형암종인 SW480 종양 모델에 투여(Panck-1_#14)하였다. 이 후 각 실험군에서 종양 크기의 변화를 확인하였다. 그리고 혈액으로부터 PBMC를 분리한 후 anti-hCD45-PE/Cy7(BD), anti-hCD8-V450(Biolegend) 항체로 염색하여 인간 hCD8+ 세포의 비율과 세포수를 분석하였다. 대조군으로는 PBS 투여군을 이용하였으며, 각 실험군에서 종양 성장 확인 및 CD8+ T 세포의 비율 및 세포수 결과를 도 14에 나타내었다.
도 13에 나타낸 바와 같이, 정상인으로부터 분리된 Panck T 세포 2군 대비, 난소암 환자에서 분리된 Panck T 세포 1군이 더욱 강한 항암 효능을 보이는 것을 확인하였다.
또한 도 14에 나타낸 바와 같이, 다른 난소암 환자로부터 분리된 Panck T 세포도 강한 항암 효능을 보이는 것을 반복적으로 확인하였으며, 인간 CD8+ T 세포의 비율과 세포수가 대조군 (PBS)과 비교하여 증가되어 있는 것을 확인하였다.
실시예 7. Panck T 세포의 TCR 다양성 확인
정상인 및 난소암 환자로부터 분리하고 실시예 1의 방법으로 제조된 각각의 공여자에 대한 Panck T 세포에서 발현하는 T 세포 수용체 (TCR, T cell receptor)를 분석하였다. 각 Panck T 세포는 단일 세포 수준에서 single cell RNA sequencing을 하였고 각 샘플당 1만개 정도의 단일 세포에서 발현하는 TCR alpa/beta의 clonotypes 비율을 분석하여 그 결과를 도 15에 나타내었다.
각 5명의 난소암 환자(#9, 10, 11, 12, 13)와 1명의 정상인(S0006)으로부터 제조된 Panck T 세포의 TCR clonotype을 분석하였고, 각 개체마다 그리고 각 공여자마다 다양한 TCR clonotype을 나타냈다. 이는 stimulator인 암세포주와 공여자간의 HLA-A type이 mis-match이거나 half-match와는 상관없이 암세포주로부터 유도된 활성화된 T 세포 수용체의 다양성을 나타내었다.
도 15에 나타낸 바와 같이, 제조된 Panck T 세포는 HLA 타입에 제한적이지 않고, 다양한 T 세포 수용체 서열을 갖는 것을 확인하였으며, 각 공여자 혈액으로부터 제조된 Panck T 세포에서 대표적으로 Top 10 clonotype TCR을 비교하였을 때 TCR 다양성을 나타냄을 확인하였다.
Panck T 세포로부터 분석된 각각의 TCR 서열은 렌티바이러스 벡터에 클로닝한 후 바이러스로 생산하였다. endogenous TCR 발현이 넉아웃 되고 새로 주입한 외부 TCR 신호 자극에 의하여 전사인자인 NFAT가 활성화되면서 luciferase가 발현될 수 있는 Jurkat 세포 (BPS, TCR KO Jurkat-NFAT-luciferase)에 생산한 바이러스를 도입하고 TCR signal activity 를 분석해서 positive TCR 클론들을 선별하였다. TCR signal activity 분석을 위한 방법 공정을 도 16에 나타내었고, TCR 클론의 선별에서 양성 TCR 신호 활성을 나타낸 클론들의 분석 결과를 도 17에 나타내었다.
도 17에 나타낸 바와 같이, 각 혈액 공여자에 따른 개별 개체 분석 결과, 각 Panck T 세포의 제조시 사용한 암세포주 (stimulator)와 TCR signal activity 분석에서 선별된 클론(clone)뿐만 아니라, 선별된 클론과 동일한 clonotype을 가지지만 CDR3 서열이 다른 클론(PC-like)들도 선별하였다. 선별된 대부분의 TCR 클론은 In vivo 항암 활성을 분석하였을 때 강력한 항암 효능을 보였던 Panck T 세포로부터 분석된 TCR 서열에서 선별되었다.
실시예 8. 난소암 환자 유래 Panck T 세포의 항암 효과 확인
여러 명의 난소암 환자로부터 실시예 1의 방법을 통해 Panck T 세포를 제조하고 다양한 암세포에 대한 사멸활성을 확인하였다. 암 세포로 SW480, A375, SK-OV3 를 사용하였으며, 암세포 사멸활성을 확인한 결과를 도 18에 나타내었다.
도 18에 나타낸 바와 같이, SW480에서 약 83%, A375에서 약 74%, SK-OV3에서 약 77%의 암 세포 사멸 활성을 나타내었으며, 이러한 결과는 Panck T 세포 유도를 위하여 사용된 자극 세포주 종류와 상관없이 Panck T 세포가 다양한 종류의 암세포를 범용적으로 사멸할 수 있음을 보여주는 결과이다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였으나, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 균등물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (21)

1) B2M (β2-microglobulin) 을 넉아웃시킨 암세포를 제조하는 단계;
2) 상기 1) 단계의 암세포에 B2M-linked MR1 의 과발현을 유도하는 단계;
3) 상기 2) 단계의 암세포에 방사선을 조사하는 단계;
4) 상기 3) 단계를 통해 제조된 암세포와 T 세포를 공동 배양하는 단계;
5) 상기 4) 단계 배양 후 T 세포를 IL-2, IL-7 및 IL-15로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 사이토카인이 포함된 배지에서 배양하는 단계; 및
6) 상기 3) 단계를 통해 제조된 암세포와 상기 5) 단계의 배양된 T 세포를 공동 배양하는 단계; 를 포함하는 MR1 제한적 T 세포 (MR1-restricted T cell) 의 생산 방법.
제1항에 있어서, 상기 3) 단계의 방사선은 70 내지 130Gy 의 감마선인, 방법.
제1항에 있어서, 상기 4) 단계의 공동 배양은 암세포와 T 세포를 1:1 내지 1:5 세포 비율로 배양하는 것인, 방법.
제1항에 있어서, 상기 5) 단계 이후
5-1) 상기 3) 단계를 통해 제조된 암세포와 5) 단계 배양된 T 세포를 공동 배양하는 단계; 및
5-2) 상기 5-1) 단계 배양 후 T 세포를 IL-2, IL-7 및 IL-15로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 사이토카인이 포함된 배지에서 배양하는 단계; 를 1회 내지 5회 반복하는 단계; 를 포함하는, 방법.
제1항에 있어서, 상기 5) 단계의 사이토카인은 IL-2 단독; IL-7 및 IL-15; 또는 IL2, IL-7 및 IL-15 인 것을 특징으로 하는, 방법.
제5항에 있어서, 상기 IL-2은 20 내지 80IU, IL-7 및 IL-15는 1 내지 10ng/ml 농도로 포함되는 것인, 방법.
제1항에 있어서, 상기 5) 단계 이후, IL-2 를 포함하는 배지에서 T 세포를 배양하는 단계를 더 포함하는, 방법.
제1항에 있어서, 상기 4) 내지 6) 단계는 8 내지 20 일 동안 수행되는 것인, 방법.
제1항에 있어서,
7) 상기 5) 단계에서 제조된 세포 중 CD8+, 4-1BB+ 및 TCRva7.2(-) 인 세포를 분리하는 단계; 및
8) 상기 7) 단계에서 분리된 세포를 배양하는 단계; 를 포함하는 확장 단계를 포함하는 방법.
제9항에 있어서, 상기 8) 단계는
상기 7) 단계에서 분리된 세포를 방사선 조사된 allo-PBMC, IL-2 및 항-CD3 항체를 포함하는 배지에서 배양하는 것인, 방법.
제10항에 있어서, 상기 방사선은 20 내지 90Gy 감마 방사선인, 방법.
제10항에 있어서, 상기 allo-PBMC 는 상기 7) 단계에서 분리된 세포의 150 내지 250 배수로 포함되는 것인, 방법.
제10항에 있어서, 상기 IL-2 는 800 내지 1200IU 및 항-CD3 항체는 10 내지 50ng/ml 로 포함되는 것인, 방법.
제9항에 있어서, 상기 확장 단계는 7 내지 13일 동안 수행하는 것인, 방법.
제1항에 있어서, 상기 MR1 제한적 T 세포는 CD8+T 및 4-1BB+ 세포인, 방법.
제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 방법으로 생산된 MR1 제한적 T 세포 (MR1-restricted T cell).
제16항에 있어서, CD8+T 및 4-1BB+인 것을 특징으로 하는, MR1 제한적 T 세포.
제16항에 있어서, 상기 세포는 TCRva7.2-이며 CD69high, CD45RO+, CD161-, PD-1low 또는 CD57low 마커 발현 특성을 갖는 것인, MR1 제한적 T 세포.
i) CD8+T 및 4-1BB+;
ii) TCRva7.2-; 및
iii) CD69high, CD45RO+, CD161-, PD-1low 또는 CD57low 마커 발현 특성을 갖는, MR1 제한적 T 세포.
제16항의 MR1 제한적 T 세포를 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제19항의 MR1 제한적 T 세포를 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.

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