CN110551637A - 一种来自黄芪根部的高效抑制番茄灰霉病菌的棘壳孢菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种来自黄芪根部的高效抑制番茄灰霉病菌的棘壳孢菌及其应用，涉及生物技术领域，该菌株分类命名为pyrenochaeta nobilis，命名为棘壳孢菌SFJ12‑R‑5，已保藏至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号CGMCC No.17766，保藏日期2019年5月31日，可用于抑制番茄灰霉病菌，为番茄灰霉病菌的防治提供了环保高效的生物防治方法。

Description

一种来自黄芪根部的高效抑制番茄灰霉病菌的棘壳孢菌及其 应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种来自黄芪根部的高效抑制番茄灰霉病菌的棘壳孢菌及其应用。

背景技术

番茄灰霉病是由灰葡萄孢Botrytis cinerea引起的一种世界性病害，是当前设施番茄生产上的重要病害之一，一般造成的产量损失在10％～20％，严重时可达60％以上。目前，由于缺乏有效的抗病品种，化学防治仍是控制该病最有效的手段之一。由于灰葡萄孢菌具有繁殖速度快，遗传变异大，适应性强等特性，病原菌对各种化学杀菌剂产生了严重的抗药性，已成为番茄设施栽培主要限制因素(李宝聚等，2003)。同时农药的残留污染环境、危害人类健康、破坏生态平衡。

目前国内外对番茄灰霉病的防治研究已取得了良好的进展，生物防治有着其他防治不可比拟的优势：不污染环境，无农药残留，减缓病菌对药物抗性的增长，符合可持续发展的要求。但其防治效果差且稳定性也不高，并且易受环境因素的限制，因此还不能得到广泛地应用。植物内生真菌是一类长期生长于健康植物内部与植物相互作用，协同进化，在演化过程中二者形成共生关系的真菌，不仅具有杀虫、抗菌、抗氧化等活性，还能促进植物生长，不会对宿主产生任何感染病症的真菌(Hyde et al.,2008；Schulz et al.,2005,2015)，并保护着植物免受多种病原菌的侵害(Smith et al.,2008；Suryanarayanan etal.,2009；Aly et al.,2011)。由于它的生存环境比暴露在恶劣环境的腐生菌和附生菌更为稳定，比其他生防因子更易发挥作用。同时，内生真菌次生代谢产物具有抑菌(傅科鹤等，2006；易晓华等，2008；Zhang et al.,2014；Xiang et al.,2016)、杀线(Farhat et al.,2019)和医学药理活性(Li et al.,2018)，己成为寻求抗植物病虫害的新资源库和开发微生物药物的热点。

但是目前的研究中，未见有对灰葡萄孢菌拮抗作用良好的菌株的相关报道。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了一种来自黄芪根部的高效抑制番茄灰霉病菌的棘壳孢菌及其应用，具体为其在抑制番茄灰霉病菌中的应用。

首先，本发明提供一种来自黄芪根部的高效抑制番茄灰霉病菌的棘壳孢菌，该菌株分类命名为pyrenochaeta nobilis，命名为棘壳孢菌SFJ12-R-5，已保藏至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号CGMCC No.17766，保藏日期2019年5月31日，保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

第二，本发明还提供了上述来自黄芪根部的高效抑制番茄灰霉病菌的棘壳孢菌在抑制番茄灰霉病菌中的应用。

有益效果

利用本发明申请提供的分离自黄芪根部的棘壳孢菌，其菌体及代谢产物均在番茄灰霉病原菌灰葡萄孢菌的菌丝生长方面具有较强的抑制作用，对照只接病原菌的平板，处理组病原菌菌落边缘菌丝生长稀疏，显微镜下观察对菌丝的致畸作用严重；将棘壳孢菌代谢产物不同浓度分别在宇蕃一号番茄叶片接种灰葡萄孢菌前、后24h以及接种病原菌的同时喷施在番茄离体叶片上，随着代谢产物浓度的提高对抑制病原菌在离体叶片上病斑大小效果越好。棘壳孢菌能够高效抑制番茄灰霉病菌，为番茄灰霉病菌的防治提供了环保高效的生物防治方法。

附图说明

图1菌株形态特征；

图2菌株菌悬液及发酵滤液对番茄灰霉病菌菌丝生长抑制作用；

图3菌株滤液对植病菌菌丝生长的致畸作用；

图4菌株代谢产物对灰葡萄孢菌在离体叶片上的抑制作用。

具体实施方式

实施例1一种来自黄芪根部的高效抑制番茄灰霉病菌的棘壳孢菌SFJ12-R-5的筛选及鉴定

供试植物：野生植物黄芩Scutellaria baicalensis采自内蒙古自治区呼伦贝尔市阿荣旗三岔镇新胜村。

供试培养基：PDA培养基(去皮土豆200g，葡萄糖20g，琼脂18g，蒸馏水1000mL。)

PD培养液(去皮土豆200g，葡萄糖20g，蒸馏水1000mL。)

方法

1.内生真菌的分离

采用组织分离法：植物样品的根、茎、叶反复用自来水冲洗泥污，滤纸上晾干。取健康组织根5-7mm长、茎5-7mm长，叶3mm×3mm见方面积。各组织经70％酒精浸5s，根、茎经0.1％升汞浸1.5-2min，叶经0.1％升汞浸30-45s，无菌水漂洗3次，灭菌滤纸吸干表面水分，接入已倒好的加有硫酸链霉素(浓度50μg/mL)的PDA平板培养基上，每板4块组织，于25℃培养箱中培养，每天观察，待有菌丝长出。

对消毒效果进行验证：将涂布有最后1次无菌水冲洗液的PDA平板置于25℃培养箱中避光培养3-5d，观察有无菌落产生，若平板表面无真菌生长，则表明组织表面灭菌彻底，所分离获得的是内生真菌而不是表面附生菌，否则不能使用。

2.内生真菌的纯化

平板培养2-3d后，待培养组织边缘有菌丝长出时，采用尖端菌丝挑取法，挑取形态不同的菌落转移到新的培养基上继续培养，直至产生单一菌落。经过2-3次纯化，得到纯化菌株，对已纯化的菌株编号，转至PDA斜面培养基上，于25℃培养箱中培养5-7d，放入4℃冰箱内保藏备用，分别作为待测菌株。

3.拮抗菌株的初筛

在PDA培养基平板中央接种7mm×7mm面积的植物病原菌菌碟，在菌碟四周按“十”字方向距培养皿边缘1cm处放置7mm×7mm面积待测菌株菌碟，每皿测定4株，每处理重复3次。设只接种病原菌平板为对照。置25℃黑暗培养，待对照植物病原菌长满平皿，检查待测菌株是否有拮抗性。

4.菌株鉴定

将有拮抗作用的待测菌株接种至PDA平皿中央，置于25℃培养箱黑暗培养7-10d，观察菌落形态，显微镜下观察菌丝及孢子形态。另收集培养7-10d的菌体，采用通用引物ITS1和ITS4、引物LR0R和LR7进行分子鉴定。

5.拮抗菌株的复筛

双重对峙培养法。用直径5mm的打孔器分别在植物病原菌边缘、待测菌株平板上打取菌碟，在半径3.5cm的PDA培养基平板圆周上，沿培养皿(直径90mm)直径接种病原菌和待测菌株菌碟各一块，每处理重复3次。设只接种病原菌的平板为对照。置25℃黑暗培养，待对照菌落长满培养皿，直尺测量抑菌带宽和处理组病原菌菌落半径，计算菌丝生长抑制率(IMG)。

IMG＝(对照菌落半径﹣病原菌菌落半径)/对照菌落半径×100％。

平板扩散培养法。在PDA培养基平板中央接种植物病原菌菌碟，在菌碟周围，按等边三角形等距离放置牛津杯，每孔接入待测菌株发酵滤液250μL，每处理重复3次。以每孔接入无菌PD培养液为对照。置25℃培养箱黑暗培养，待对照菌落长满培养皿，测量抑菌圈直径。

含药平板法。用直径7mm打孔器在拮抗菌株的菌落边缘打取菌碟，接种到150mLPD培养液中，每瓶3个菌碟，于25℃、180r·min^-1条件下振荡培养7d。将发酵液在5000r·min^-1下离心15min，收集上清液，上清液用0.22μm细菌过滤器过滤，获得无菌发酵滤液，待用。

将灭菌的PDA温度降至40℃左右与拮抗菌株的发酵滤液1:1体积比混合均匀后倒平板，将直径7mm的拮抗菌菌碟接种至平板中央，置25℃培养箱黑暗培养，待对照菌落长满培养皿，十字交叉法测量菌落直径。

6.拮抗菌株对植物病原菌菌丝生长的影响

用直径7mm的打孔器在植物病原菌边缘打取菌碟，接种到150mLPD培养液中，每瓶3个菌碟，于25℃、180r·min^-1条件下振荡培养5d。无菌条件下，75mL植物病原菌发酵液与75mL拮抗菌发酵滤液混合，于25℃、180r·min^-1条件下振荡培养。单一150mL植物病原菌发酵液为对照，7d后镜检植物病原菌菌丝形态。

结果

初筛结果显示，菌株SFJ12-R-5对番茄灰霉病菌具有较强的拮抗作用。

供试植物病原菌：大豆根腐病菌尖镰孢Fusarium oxysporum、水稻稻瘟病菌Pyricularia grisea、水稻纹枯病菌Rhizoctonia solani、玉米大斑病菌Setosphaeriaturcica、玉米茎基腐病菌Fusarium graminearum、番茄灰霉病菌Botrytis cinerea、马铃薯早疫病菌Alternaria solani，以上病原菌菌株由黑龙江省农业科学院植物保护研究所免疫室提供。FZZ菌株发酵滤液对番茄灰霉病菌Botrytis cinerea有较强抑菌活性，抑菌带宽直径达2.93cm。(公开于《植物保护》2018,44(5)：199-205一株平沙绿僵菌的鉴定及生防应用潜力评价——杨帆等)。

1.菌株对病原菌菌丝的抑制作用

双重对峙培养法菌株菌悬液处理的灰葡萄孢菌，边缘菌丝稀少疏松，菌悬液对菌丝生长抑制率为66.67±3.15％(图2-A)。平板扩散培养法发酵滤液处理的灰葡萄孢菌，牛津杯周边几乎不长菌丝，偶见稀少菌丝，发酵滤液抑菌直径为20.83±3.78mm(图2-B)。含药平板法含50％滤液处理灰葡萄孢菌，平板中病原菌几乎不生长，直径为14.63mm±1.41mm，抑制率达90.92±1.02％(图2-C)。

2.拮抗菌株对植物病原菌菌丝生长的影响

经菌株发酵滤液处理的病原菌，生长受到严重的抑制，菌丝顶端膨大，菌丝出现抑缩或是消融，对病原菌菌丝生长有致畸作用(见图3)。

3.菌株鉴定

菌株在PDA上培养10d，形态如图1所示，菌丝墨绿色，絮状，随菌落逐渐扩大。在奥林巴斯光学显微镜下观察，未见有孢子产生，菌丝没隔，内有包含物。

通过Blast进行序列比对，与棘壳孢菌Pyrenochaeta nobilis相似性为100％。

上述菌株SFJ12-R-5命名为棘壳孢菌SFJ12-R-5，分类命名为pyrenochaetanobilis，已保藏至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号CGMCC No.17766，保藏日期2019年5月31日，保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

实施例2棘壳孢菌SFJ12-R-5在抑制番茄灰霉病菌中的应用

取长势健壮且均一的番茄叶片，经2％NaClO表面消毒5min后无菌水冲洗三次，自然风干。番茄叶片分三组处理：生防菌代谢产物较灰葡萄孢菌提前24h接种为处理1；生防菌代谢产物与灰葡萄孢菌同时接种为处理2；生防菌代谢产物较灰葡萄孢菌推迟24h接种为处理3。设置代谢产物浓度分别为A-E：1％、3％、7％、11％和15％。上述番茄叶片置于无菌托盘里无菌棉保湿，22℃培养箱(L:D＝12:12)培养，分别设喷施无菌水和只接病原菌为对照CK1和CK2，每组处理重复三次。每片番茄叶片喷施处理液1mL。培养3d后十字交叉测量病斑大小，并计算病斑面积(图4)。

抑制率＝[(CK病斑面积-处理病斑面积)/CK病斑面积]×100％

表1菌株代谢产物对灰葡萄孢菌在离体叶片上的抑制率

从以上数据可以看出，利用本发明申请提供的棘壳孢菌SFJ12-R-5，对番茄灰霉病菌灰葡萄孢菌平板对峙以及离体叶片抑制率都有明显效果，为番茄灰霉病菌的防治提供了环保高效的生物防治方法。

Claims (2)

1.一种来自黄芪根部的高效抑制番茄灰霉病菌的棘壳孢菌，其特征在于：该菌株分类命名为pyrenochaeta nobilis，命名为棘壳孢菌SFJ12-R-5，已保藏至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号CGMCC No.17766，保藏日期2019年5月31日。

2.一种权利要求1所述的来自黄芪根部的高效抑制番茄灰霉病菌的棘壳孢菌在抑制番茄灰霉病菌中的应用。