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CN117344054B - 一种扩增小麦抗白粉病基因pmXQ-0508的分子标记引物及其应用 - Google Patents

一种扩增小麦抗白粉病基因pmXQ-0508的分子标记引物及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种扩增小麦抗白粉病基因pmXQ‑0508的分子标记引物，该分子标记引物包括上游引物69‑2B‑025‑F和下游引物69‑2B‑025‑R；所述上游引物69‑2B‑025‑F的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述下游引物69‑2B‑025‑R的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。本发明还公开了该分子标记引物在基因pmXQ‑0508的检测、鉴定及辅助鉴定小麦抗白粉病性状以及分子标记辅助育种中的应用。本发明提供的引物及其应用不受环境影响，选择目标明确，不仅检测快速、精准，而且节约成本，大大提高了抗白粉病小麦品种的选育效率。

Description

一种扩增小麦抗白粉病基因pmXQ-0508的分子标记引物及其 应用
技术领域
本发明涉及农业生物技术领域，具体涉及一种扩增小麦抗白粉病基因PmXQ-0508的分子标记引物及其应用。
背景技术
小麦是重要的粮食作物之一，其高产和稳产对粮食安全尤为重要。由布氏白粉病菌侵染引起的小麦白粉病造成小麦减产，严重威胁小麦的安全生产。防治小麦白粉病的措施主要有化学药剂防治和抗病品种的选育和推广。相比传统的化学药剂防治，挖掘抗病基因进行高效的育种选择，在生产上广泛推广使用抗病品种，最为经济、有效和环保。
近年来，已有超过100个小麦抗白粉病基因或其等位基因被鉴定和分子定位，包括64个正式命名的基因。但这些抗病基因绝大多数都是小种专化抗性，容易随着生产上的大规模使用以及病原菌的进化而丧失抗性。因此，有必要不断寻找并定位新的白粉病抗性基因，并应用于小麦抗白粉病育种，以丰富小麦白粉病抗原。
发明内容
本发明的目的是提供一种扩增小麦抗白粉病基因pmXQ-0508的分子标记引物及其应用，以利用引物扩增分子标记对小麦抗白粉病基因pmXQ-0508进行定位和检测，在小麦选育中对其亲本进行有目的地选择，为选育抗白粉病类型的小麦新品种提供指导依据。
本发明是通过以下方法实现的：一种扩增小麦抗白粉病基因pmXQ-0508的分子标记引物，该分子标记引物包括上游引物69-2B-025-F和下游引物69-2B-025-R；所述上游引物69-2B-025-F的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述下游引物69-2B-025-R的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
本发明提供的扩增小麦抗白粉病基因pmXQ-0508的分子标记引物在基因pmXQ- 0508的检测、鉴定及辅助鉴定小麦抗白粉病性状以及分子标记辅助育种中的应用。
本发明还提供了一种检测小麦品种中是否携带小麦抗白粉病基因pmXQ-0508的方法，包括以下步骤：
（1）提取待测小麦样品的基因组DNA；
（2）利用分子标记引物对待测小麦样品的基因组DNA进行PCR扩增，获得扩增产物；所述分子标记引物包括上游引物69-2B-025-F和下游引物69-2B-025-R；所述上游引物69-2B-025-F的核苷酸序列为5'-AACATAAATGCGTTCGACAC-3'（ SEQ ID NO:1），所述下游引物69-2B-025-R的核苷酸序列为5'-TTAAAGCATTGCACCAAAGG-3'（SEQ ID NO:2）；
（3）对所述扩增产物进行电泳、检测，若能扩增出156 bp的特异条带，说明待测小麦样品中携带抗白粉病基因pmXQ-0508；否则，待测小麦样品中不携带抗白粉病基因pmXQ- 0508。
本发明提供的方法中所述PCR扩增的体系为10 μL，包括：50 ng/μL小麦基因组DNA1.0 μL，PCR MasterMix 4 μL ，5 μM上游引物0.5 μL，5 μM下游引物0.5 μL，无菌去离子水4 μL。
本发明提供的方法中所述PCR扩增的程序为：94℃预变性3 min；94℃变性15 s，55℃退火15 s，延伸40 s，30个循环；72℃延伸10 min；4℃保存。
通过多年多点大田鉴定，小麦XQ-0508对白粉病抗性表现良好，是优异的小麦抗白粉病种质资源。苗期白粉病抗性遗传分析及分子标记检测表明，小麦XQ-0508苗期对白粉病流行菌株E09的抗性由单个隐性基因控制，命名为pmXQ-0508。利用全基因组均匀分布的118对分子标记对XQ-0508、感病小麦品种SH3566及利用XQ-0508×SH3566的F2:3群体中20个纯合抗病和20个纯合感病家系组成的抗病池和感病池进行多态性检测，9对标记在抗感亲本和抗感池中展现出一致的多态性，随后利用这些标记对138个XQ-0508×SH3566的F2:3家系进行基因型分型，将基因pmXQ-0508初步定位于小麦2BS染色体26.35-29.59 Mb的区间内。进一步根据中国春小麦参考基因组在该区间内的序列，利用primer5.0软件设计并筛选获得与基因pmXQ-0508紧密连锁的Indel标记69-2B-025。本发明提供的小麦抗白粉病基因pmXQ-0508的分子标记69-2B-025经过遗传分离群体检测，与基因pmXQ-0508共分离，可以高效、准确地检测基因pmXQ-0508的遗传作图大群体，应用于基因pmXQ-0508的检测，鉴定及辅助鉴定小麦抗白粉病性状以及分子标记辅助选择育种。扩增小麦抗白粉病基因pmXQ-0508的分子标记引物应用于抗白粉病小麦育种中，不仅检测快速、精准，不受环境影响，选择目标明确，而且节约成本，大大提高了抗白粉病小麦品种或品系的选育效率。
附图说明
图1：标记69-2B-025引物在XQ-0508×SH3566的部分F2:3家系中的扩增结果。
图中M：pUC18/MspI；1：XQ-0508（抗病亲本）；2：SH3566（感病亲本）；3-17：XQ-0508×SH3566的F2:3家系，其中，3-7：纯合抗病家系，8-12：抗感分离家系，13-17：纯合感病家系；箭头为扩增基因pmXQ-0508的特异条带。
图2：标记69-2B-025在部分感病小麦品种中的扩增结果。
图中M：pUC18/MspI；1：XQ-0508（抗病亲本）；2：SH3566（感病亲本）；3-17：山农1538、邯麦13、周麦27、烟1212、中育1311、泰农1014、济麦229、济麦21、济麦20、岱麦2173、中麦1751、中麦9398、良星619、青麦6和郑麦0856；箭头为pmXQ-0508的特异条带。
具体实施方式
以下实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。实施例中所用的试验材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1 小麦抗白粉病基因pmXQ-0508分子标记69-2B-025的开发
材料
小麦XQ-0508由烟台大学小麦育种团队提供，高抗小麦白粉病。SH3566从国家作物种质库获得。XQ-0508和SH3566杂交，所得F1自交，获得F2群体及对应的F2:3家系。
2、小麦基因组DNA的提取
小麦基因组DNA提取CTAB法，流程如下：
1）取小麦材料的幼嫩叶片，在液氮中速冻后研磨成粉末状，装入2 mL EP管；
2）加入600-800 μL CTAB提取液，于65°C水浴1 h，期间多次颠倒混匀；
3）加入等体积的氯仿，置于摇床上混匀15 min；
4）12000 rpm室温离心10 min，取400 μL上清液至1.5 mL的EP管中，加入3倍体积提前预冷的无水乙醇，混匀，-20°C沉降2 h；
5）12000 rpm室温离心10 min，弃上清，加入800 μL的70 %乙醇洗涤3次；
6）风干沉淀，加入50 μL的1×TE或者ddH2O溶解。
7）将DNA储存液用无菌去离子水稀释成50 ng/μL作为工作液备用。
3、小麦苗期白粉病抗性鉴定及抗性遗传分析
小麦苗期白粉病抗性鉴定在智能化温室中完成。将抗病亲本XQ-0508、感病亲本SH3566、F1杂交种、F2群体和F2:3家系种植于128穴的穴盘（3.2×3.2×4.2 cm）中，亲本及F1均鉴定至少20粒种子，每个F2:3家系均鉴定至少25粒种子，感病对照铭贤169随机播种并插标签区分。将温室条件控制在18-20°C，相对湿度80%，光周期为14 h光照/10 h黑暗。于一叶期用扫拂法接种白粉病菌株E09。10-14天后，当感病对照铭贤169充分发病时调查表型。反应型（Infection type，IT）按0-4级标准记载。抗病等级划分：0-2级为抗病类型，3-4级为感病类型。
结果显示：XQ-0508对白粉病菌株E09表现高抗（IT=0），SH3566表现高感（IT=4），F1植株均表现感病（IT为3-4），表明XQ-0508携带隐性抗病基因；对该组合的F2群体进行抗性鉴定，结果表明其抗感分离比为32:106，卡方检验符合单隐性基因的分离比例1:3（χ2=0.24,P=0.62），进一步的F2:3家系鉴定结果显示纯合抗病家系：抗感分离家系：纯合感病家系的分离比为32:73:33，卡方检验符合单隐性基因的分离比例1:2:1（χ2=0.49,P=0.79）。综上所述，XQ-0508对白粉病菌株E09的抗性由单个隐性基因控制，将该抗白粉病基因命名为pmXQ-0508。
4、pmXQ-0508的分子标记初定位
根据表型鉴定结果，分别选取20个纯合抗病家系和20个纯合感病家系构建抗病池和感病池。利用全基因组均匀分布的118对分子标记对XQ-0508、SH3566及抗病池和感病池进行多态性检测，9对标记在抗感亲本和抗感池中展现出一致的多态性，随后利用这些标记对138个XQ-0508×SH3566的F2:3家系进行基因型分型，将pmXQ-0508初步定位于小麦2BS染色体26.35-29.59 Mb的区间内。
5、与pmXQ-0508紧密连锁分子标记的开发
根据中国春小麦参考基因组在该候选区间26.35-29.59 Mb内的序列信息，利用primer5.0软件设计成Indel标记的引物，对XQ-0508×SH3566的F2:3家系进行基因型分型，最终获得了与基因pmXQ-0508共分离的Indel标记69-2B-025。
分子标记69-2B-025的引物包括一条上游引物和一条下游引物：
上游引物69-2B-025-F的核苷酸序列：5'-AACATAAATGCGTTCGACAC-3'；
下游引物69-2B-025-R的核苷酸序列：5'-TTAAAGCATTGCACCAAAGG-3'。
所述PCR扩增的体系为10 μL，包括：50 ng/μL小麦基因组DNA 1.0 μL，4 μL PCRMasterMix，5 μM上游引物0.5 μL，5 μM下游引物0.5 μL，无菌去离子水4 μL。
所述PCR扩增的程序为：94℃预变性3 min；94℃变性15 s，54℃退火15 s，延伸40s，30个循环；72℃延伸10 min；4℃保存。
所述扩增产物电泳分离程序为：在质量体积百分比浓度为8%非变性聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳，将所述扩增产物和2 μL 6×上样缓冲液混合后，取2 μL混合物点样，180 V恒压下电泳2.5-3h，硝酸银染色后拍照。若能扩增出156 bp的特异条带，说明待测小麦样品中携带抗白粉病基因pmXQ-0508，否则，待测小麦样品中不携带小麦抗白粉病基因pmXQ- 0508。
分子标记69-2B-025在XQ-0508×SH3566的部分F2:3家系中的分型结果见图1。其中：M：pUC18/MspI；1：XQ-0508（抗病亲本）；2：SH3566（感病亲本）；3-17：XQ-0508×SH3566的F2:3家系，其中，3-7：纯合抗病家系，8-12：抗感分离家系，13-17：纯合感病家系；箭头为基因pmXQ-0508的特异条带。扩增结果显示标记69-2B-025在抗病亲本XQ-0508和抗病家系中扩增出了156 bp的特异条带，在感病亲本SH3566和感病家系中没有扩增出该目的条带。
实施例2 小麦抗白粉病基因pmXQ-0508分子标记引物的应用
待测样品包括抗病亲本XQ-0508、感病亲本SH3566、138个XQ-0508×SH3566衍生的F2:3家系及35份不携带抗病基因pmXQ-0508的感病小麦品种（山农1538、邯麦13、周麦27、烟1212、中育1311、泰农1014、济麦229、济麦21、济麦20、岱麦2173、中麦1751、中麦9398、良星619、青麦6、郑麦0856、兰德677、武农16、泰麦1918、辉县红、僕麦28、中信麦77、烟农15、烟农17、烟农23、烟农24、烟农161、烟农191、烟农301、烟农390、烟农572、烟农745、烟农836、烟农5158、烟农215和烟农199），待测小麦DNA提取方法同实施例1。
以上述材料的基因组DNA作为PCR扩增模板，利用本发明开发的分子标记69-2B-025的引物进行扩增：
上游引物69-2B-025-F的核苷酸序列：5'-AACATAAATGCGTTCGACAC-3'；
下游引物69-2B-025-R的核苷酸序列：5'-TTAAAGCATTGCACCAAAGG-3'。
PCR扩增的体系为10 μL，包括：50 ng/μL小麦基因组DNA 1.0 μL，4 μL PCRMasterMix，5 μM上游引物0.5 μL，5 μM下游引物0.5 μL，无菌去离子水4 μL。
所述PCR扩增的程序为：94℃预变性3 min；94℃变性15 s，54℃退火15 s，延伸40s，30个循环；72℃延伸10 min；4℃保存。
所述扩增产物电泳分离程序为：在质量体积百分比8%非变性聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳，将所述扩增产物和2 μL 6×上样缓冲液混合后，取2 μL混合物点样，180 V恒压下电泳2.5-3h，硝酸银染色后拍照。
分子标记69-2B-025引物在部分感病小麦品种中的部分扩增结果见图2。其中：M：pUC18/MspI；1：XQ-0508（抗病亲本）；2：SH3566（感病亲本）；3-17：山农1538、邯麦13、周麦27、烟1212、中育1311、泰农1014、济麦229、济麦21、济麦20、岱麦2173、中麦1751、中麦9398、良星619、青麦6和郑麦0856。箭头为pmXQ-0508的特异条带。扩增结果显示标记69-2B-025仅在抗病亲本XQ-0508中扩增出了156 bp的特异条带，在感病亲本SH3566和感病小麦品种中均没有扩增出该目的条带。在35份感病小麦品种中都没有扩增出156 bp的特异条带，本申请仅截取了15个材料作为扩增示意图，其余20份的结果与该15份完全一致，说明SH3566和15个所述小麦品种中均不含有基因pmXQ-0508，均属于感病小麦品种。
小麦抗白粉病基因pmXQ-0508是一个新的抗白粉病基因，目前该基因尚未有被分子定位、图位克隆以及分子育种的相关报道。通过本发明提供的分子标记69-2B-025引物扩增来检测遗传作图大群体，有助于实现基因pmXQ-0508的检测、鉴定及辅助鉴定小麦抗白粉病性状以及分子标记辅助选择育种，可大大加快pmXQ-0508在生产上的育种利用，从而丰富小麦抗白粉病的遗传基础，持久、有效地防控小麦白粉病。
上述实施例为本发明优化的实施方案，仅用于说明本发明而非限制本发明。本领域技术人员在不脱离本发明实施方案宗旨和原理的基础上所作的修改或等同替换，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (3)

1.一种检测小麦品种中是否携带小麦抗白粉病基因pmXQ-0508的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)提取待测小麦样品的基因组DNA；
(2)利用分子标记引物对待测小麦样品的基因组DNA进行PCR扩增，获得扩增产物；所述分子标记引物包括上游引物69-2B-025-F和下游引物69-2B-025-R；所述上游引物69-2B-025-F的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述下游引物69-2B-025-R的核苷酸序列如SEQID NO:2所示；
(3)对所述扩增产物进行电泳检测，若能扩增出156bp的特异条带，说明待测小麦样品中携带抗白粉病基因pmXQ-0508；否则，待测小麦样品中不携带小麦抗白粉病基因pmXQ-0508。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的体系为10μL，包括：50ng/μL小麦基因组DNA 1.0μL，PCR MasterMix 4μL，5μM上游引物0.5μL，5μM下游引物0.5μL，无菌去离子水4μL。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的程序为：94℃预变性3min；94℃变性15s，55℃退火15s，延伸40s，30个循环；72℃延伸10min；4℃保存。
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小麦不同抗性品种对6种杀菌剂防治小麦白粉病效果的影响;王奥霖等;《植物保护》;第47卷(第6期);第285-290页 *

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CN117344054A (zh) 2024-01-05

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