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CN110352198A - Cd133结合剂及其用途 - Google Patents

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CN110352198A CN201780078237.3A CN201780078237A CN110352198A CN 110352198 A CN110352198 A CN 110352198A CN 201780078237 A CN201780078237 A CN 201780078237A CN 110352198 A CN110352198 A CN 110352198A
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Abstract

本公开涉及新型的CD133结合剂。本公开还涉及新型的CD133结合剂用于检测表达CD133的细胞和/或定量细胞CD133表达的水平、用于靶向表达CD133的细胞、用于降低表达CD133的细胞中CD133的水平以及用于治疗或预防癌症的用途。

Description

CD133结合剂及其用途
相关申请的交叉引用
本申请要求2016年10月19日提交的美国临时申请号62/410,162和2017年3月16日提交的美国临时申请号62/472,209的优先权权益，所述临时申请两者的内容以引用的方式整体并入本文。
技术领域
本公开总体上涉及CD133结合剂，以及这些结合剂的方法和用途。
背景技术
CD133已被鉴定为黑素瘤、脑肿瘤和多种癌的标志物，所述多种癌包括乳腺癌、结肠癌、胃癌、前列腺癌、肝癌、胰腺癌、肺癌和头颈部鳞状细胞癌(Boman等人,2008；Ferrandina等人,2009)。CD133表达通常与较差的存活率、耐药性和转移相关。在肝细胞癌中已经报道了CD133过表达、组织病理学因素与不良患者结果之间的相关性(Zhong等人，2015)。CD133是膜结合的五次跨膜(pentaspan)糖蛋白，其确切的生理作用仍不清楚。它被认为参与原始细胞分化和表皮-间充质相互作用(Bauer等人,2008；Ulasov等人,2011；Evangelista等人,2006)，并且与WNT信号传导途径和相关的细胞增殖相关(Rappa等人，2008；Mak等人，2012a；Takenobu等人，2011)。已显示转移性黑素瘤细胞系中CD133的下调导致异种移植物的转移能力降低(Rappa等人，2008)。
成胶质细胞瘤(GBM)是一律致命的原发性脑肿瘤，其特征在于多种细胞表型和遗传异质性。尽管使用包括手术切除、放射疗法和化学疗法的侵袭性细胞多模式治疗，但GBM患者的结果未能显著改善。大量研究已经涉及CD133+脑肿瘤起始细胞(BTIC)作为GBM中化学和放射抗性的驱动因素。最近还证明，CD133驱动的基因标记可预测较差的总体存活率(Venugopal等人，2015)，并且靶向CD133+治疗难治性细胞可能是阻断GBM复发的有效策略。为CD133+的成神经管细胞瘤细胞也一直与增加的多能性和富集的脑癌干细胞活性相关(Singh等人，2004)。
已提出基于抗CD133抗体的药物用于治疗癌症(在Schmohl和Vallera，2016中综述)。在人患者中已经报道了抗IL13α嵌合抗原受体T细胞疗法后复发性成胶质细胞瘤的显著但暂时的消退(Brown等人，2016)。仍然需要以高亲和力和特异性结合CD133的新型剂。
发明内容
本发明人已经描述了能够特异性地结合细胞表面表达的以及变性的人CD133的新型抗体可变区RW01和RW03，并且展示了通过包含这些CD133结合可变区的结合剂(例如抗体、Fab、scFv、基于Fab的双特异性抗体/双特异性T细胞衔接器(bispecific T cellengager,BiTE)和/或基于scFab的双特异性抗体/BiTE)的特异性CD133结合。已显示具有本发明公开的可变区的抗体特异性地结合细胞表面表达的/天然的人CD133的解离常数(KD)在亚纳摩尔/纳摩尔范围内。已显示此类CD133结合抗体可用于特异性地检测在细胞,如癌细胞(例如胰腺癌细胞、结肠直肠癌细胞)表面上表达的CD133；特异性地结合并检测例如在细胞溶解产物中的变性的CD133；特异性地结合细胞CD133、经由免疫荧光分析检测和亚细胞定位细胞CD133；并且显著降低CD133阳性(CD133+)癌细胞中CD133蛋白的水平。进一步显示，包含抗体可变区RW01的Fab和包含抗体可变区RW03的Fab不分别与IgG RW03和IgG RW01竞争结合至CD133。
本发明人还表明，CD133特异性CAR-T细胞在体内特异性地诱导CD133阳性成胶质细胞瘤(GBM)细胞死亡并诱导GBM肿瘤消退。本发明人还表明，CD133特异性BiTE将T细胞募集至CD133+人GBM细胞并引起细胞死亡。此外，用CD133特异性BiTE颅内处理的小鼠脑中形成的肿瘤的攻击性和侵袭性较低。
因此，本公开提供了一种CD133结合剂，所述CD133结合剂特异性地结合细胞表面表达的/天然的CD133并且特异性地结合变性的CD133。
在一个实施方案中，所述CD133结合剂特异性地结合由如下抗体结合的CD133表位，所述抗体包含：(a)具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的轻链和具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的重链；和/或(b)具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的轻链和具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的重链。
在另一个实施方案中，所述CD133结合剂特异性地结合细胞表面表达的CD133的CD133表位，所述细胞表面表达的CD133的CD133表位由包含具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的轻链和具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的重链的抗体结合和/或由包含具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的轻链和具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的重链的抗体结合。
在另一实施方案中，所述CD133结合剂特异性地结合变性的CD133的CD133表位，所述变性的CD133的CD133表位由包含具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的轻链和具有SEQ IDNO:3的氨基酸序列的重链的抗体和/或由包含具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的轻链和具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的重链的抗体结合。
在一个实施方案中，所述CD133结合剂包含抗体轻链可变结构域和抗体重链可变结构域，所述抗体轻链可变结构域和抗体重链可变结构域形成特异性地结合人CD133的抗原结合位点。
在另一个实施方案中，所述抗体轻链可变结构域包含含有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的轻链互补决定区(CDR)1、含有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的轻链CDR2和含有SEQ IDNO:8的氨基酸序列的轻链CDR3；并且所述抗体重链可变结构域包含含有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的重链CDR1、含有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的重链CDR2和含有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的重链CDR3，其中所述轻链可变结构域和所述重链可变结构域形成结合人CD133的抗原结合位点。任选地，所述重链可变结构域还包含位置39处的Met残基、位置55处的Ser残基和位置66处的Tyr残基。
在另一实施方案中，所述抗体轻链可变结构域包含由SEQ ID NO:6的氨基酸序列组成的轻链互补决定区(CDR)1、由SEQ ID NO:7的氨基酸序列组成的轻链CDR2和由SEQ IDNO:8的氨基酸序列组成的轻链CDR3；并且所述抗体重链可变结构域包含由SEQ ID NO:9的氨基酸序列组成的重链CDR1、由SEQ ID NO:10的氨基酸序列组成的重链CDR2和由SEQ IDNO:11的氨基酸序列组成的重链CDR3，其中所述轻链可变结构域和所述重链可变结构域形成结合人CD133的抗原结合位点。任选地，所述重链可变结构域还包含位置39处的Met残基、位置55处的Ser残基和位置66处的Tyr残基。
在另一个实施方案中，所述抗体轻链包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列或与SEQ IDNO:2的框架区具有至少70％序列同一性的氨基酸序列。
在另一个实施方案中，所述抗体轻链由SEQ ID NO:2的氨基酸序列组成。
在另一个实施方案中，所述重链包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列或与SEQ ID NO:3的框架区具有至少70％序列同一性的氨基酸序列。
在另一个实施方案中，所述抗体重链由SEQ ID NO:3的氨基酸序列组成。
在另一个实施方案中，所述轻链包含(i)SEQ ID NO:2的氨基酸序列或与SEQ IDNO:2的框架区具有至少70％序列同一性的氨基酸序列，并且(ii)所述重链包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列或与SEQ ID NO:3的框架区具有至少70％序列同一性的氨基酸序列。
在另一个实施方案中，所述轻链由SEQ ID NO:2的氨基酸序列组成，并且所述重链由SEQ ID NO:3的氨基酸序列组成。
在另一个实施方案中，所述抗体轻链可变结构域包含含有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的轻链互补决定区(CDR)1、含有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的轻链CDR2和含有SEQ IDNO:14的氨基酸序列的轻链CDR3；并且所述抗体重链可变结构域包含含有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的重链CDR1、含有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的重链CDR2和含有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的重链CDR3，其中所述轻链可变结构域和所述重链可变结构域形成结合人CD133的抗原结合位点。任选地，所述重链可变结构域还包含位置39处的Ile残基、位置55处的Tyr残基和位置66处的Tyr残基。
在一个实施方案中，所述抗体轻链可变结构域包含由SEQ ID NO:12的氨基酸序列组成的轻链互补决定区(CDR)1、由SEQ ID NO:13的氨基酸序列组成的轻链CDR2和由SEQ IDNO:14的氨基酸序列组成的轻链CDR3；并且所述抗体重链可变结构域包含由SEQ ID NO:15的氨基酸序列组成的重链CDR1、由SEQ ID NO:16的氨基酸序列组成的重链CDR2和由SEQ IDNO:17的氨基酸序列组成的重链CDR3，其中所述轻链可变结构域和所述重链可变结构域形成结合人CD133的抗原结合位点。任选地，所述重链可变结构域还包含位置39处的Ile残基、位置55处的Tyr残基和位置66处的Tyr残基。
在另一个实施方案中，所述抗体轻链包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列或与SEQ IDNO:4的框架区具有至少70％序列同一性的氨基酸序列。
在另一个实施方案中，所述抗体轻链由SEQ ID NO:4的氨基酸序列组成。
在另一个实施方案中，所述抗体重链包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列或与SEQ IDNO:5的框架区具有至少70％序列同一性的氨基酸序列。
在另一个实施方案中，所述抗体重链由SEQ ID NO:5的氨基酸序列组成。
在另一个实施方案中，所述轻链包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列或与SEQ ID NO:4的框架区具有至少70％序列同一性的氨基酸序列，并且所述重链包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列或与SEQ ID NO:5的框架区具有至少70％序列同一性的氨基酸序列。
在另一个实施方案中，所述轻链由SEQ ID NO:4的氨基酸序列组成，并且所述重链由SEQ ID NO:5的氨基酸序列组成。
在另一个实施方案中，所述CD133结合剂选自由以下组成的组：抗体、抗体片段、单链Fv(scFv)、双特异性抗体、噬菌体-Fab(其中Fab结合CD133)以及噬菌体-scFv(其中scFv结合CD133)。
在另一个实施方案中，所述CD133结合剂包含结合人CD133的抗体。
在另一个实施方案中，所述CD133结合剂包含结合人CD133的抗体片段。
在另一个实施方案中，所述CD133结合剂包含结合人CD133的单链Fv(scFv)。
在另一个实施方案中，所述CD133结合剂包含结合人CD133的双特异性抗体。
在另一个实施方案中，所述CD133结合剂包含噬菌体-Fab，其中所述Fab结合人CD133。
在另一个实施方案中，所述CD133结合剂包含结合人CD133的噬菌体-scFv，其中所述scFv结合人CD133。
在又一个实施方案中，所述抗体片段是抗原结合片段(Fab)。
在另一个实施方案中，所述CD133结合剂是(a)包含结合CD133的单链Fab和结合非CD133的scFv的双特异性抗体，(b)包含结合CD133的Fab和结合非CD133的scFv的双特异性抗体，或(c)结合CD133和结合CD3的双特异性抗体。
在另一个实施方案中，所述CD133结合剂是(a)包含结合CD133的单链Fab和结合CD3的scFv的双特异性抗体，或(b)包含结合CD133的Fab和结合CD3的scFv的双特异性抗体。
在另一个实施方案中，所述CD133结合剂是嵌合抗原受体(CAR)，所述嵌合抗原受体包含(i)结合CD133的抗体可变区和(ii)包含一个或多个免疫细胞受体信号传导结构域的CAR信号传导结构域。
在一个实施方案中，所述CD133结合剂包含人抗体恒定区。
在另一个实施方案中，所述CD133结合剂是IgG分子。
在另一实施方案中，所述IgG分子是IgG1分子。
在另一个实施方案中，所述CD133结合剂用检测剂标记。
本公开还提供免疫缀合物，其包含(1)上述结合剂，所述结合剂连接至(2)效应剂。任选地，所述效应剂是抗肿瘤剂或毒素。
本公开还提供了一种药物组合物，其包含上述CD133结合剂或免疫缀合物和载体。
本公开还提供了上述CD133结合剂、免疫缀合物或药物组合物用于靶向表达CD133的细胞的用途。
本公开还提供了上述CD133结合剂、免疫缀合物或药物组合物用于结合表达CD133的细胞的用途。
本公开还提供了上述CD133结合剂、免疫缀合物或药物组合物用于检测表达CD133的细胞和/或定量细胞CD133表达水平的用途。
本公开另外提供了本文所述的CD133结合剂或药物组合物用于降低表达CD133的细胞中的CD133蛋白水平的用途。
在一个实施方案中，所述CD133结合剂的用途是用于检测和/或定量细胞中细胞表面表达的CD133的水平。在另一个实施方案中，所述CD133结合剂的用途是用于检测和/或定量细胞中CD133的总水平。
任选地，检测表达CD133的细胞和/或定量细胞CD133表达的水平通过蛋白质印迹、酶联免疫吸附测定(ELISA)、免疫荧光、免疫组织化学或流式细胞术进行。
在另一个实施方案中，所述细胞是癌细胞，任选地表达CD133的癌细胞或可检测地表达CD133的癌细胞。
在另一个实施方案中，所述癌细胞是黑素瘤癌细胞、胰腺癌细胞、脑癌细胞或结肠直肠癌细胞。在另一个实施方案中，所述癌细胞是成胶质细胞瘤细胞。在另一个实施方案中，所述癌细胞是成神经管细胞瘤细胞。
本公开另外提供了本文所述的CD133结合剂、免疫缀合物或药物组合物用于治疗或预防癌症的用途。
在一个实施方案中，所述癌症是表达CD133的癌症或可检测地表达CD133的癌症。在另一个实施方案中，所述癌症是转移性黑素瘤、脑癌、前列腺癌、胰腺癌或结肠癌。
在另一个实施方案中，所述脑癌是成胶质细胞瘤，任选地表达CD133的成胶质细胞瘤或可检测地表达CD133的成胶质细胞瘤。在另一个实施方案中，所述脑癌是成神经管细胞瘤，任选地表达CD133的成神经管细胞瘤或可检测地表达CD133的成神经管细胞瘤。
本公开还提供了CD133结合剂用于治疗成胶质细胞瘤，任选地表达CD133的成胶质细胞瘤或可检测地表达CD133的成胶质细胞瘤的用途，所述CD133结合剂包含(a)结合CD133的单链Fab和结合非CD133的scFv，(b)包含结合CD133的Fab和结合非CD133的scFv的双特异性抗体或(c)结合CD133和结合CD3的双特异性抗体。
本公开还提供了CD133结合剂用于治疗成胶质细胞瘤，任选地表达CD133的成胶质细胞瘤或可检测地表达CD133的成胶质细胞瘤的用途，所述CD133结合剂包含(a)结合CD133的单链Fab和结合CD3的scFv或(b)包含结合CD133的Fab和结合CD3的scFv的双特异性抗体。
本公开还提供了CD133结合剂用于治疗成神经管细胞瘤，任选地表达CD133的成神经管细胞瘤或可检测地表达CD133的成神经管细胞瘤的用途，所述CD133结合剂包含(a)结合CD133的单链Fab和结合非CD133的scFv，(b)包含结合CD133的Fab和结合非CD133的scFv的双特异性抗体或(c)结合CD133和结合CD3的双特异性抗体。
本公开还提供了CD133结合剂用于治疗成神经管细胞瘤，任选地表达CD133的成神经管细胞瘤或可检测地表达CD133的成神经管细胞瘤的用途，所述CD133结合剂包含(a)结合CD133的单链Fab和结合CD3的scFv或(b)包含结合CD133的Fab和结合CD3的scFv的双特异性抗体。
在一个实施方案中，所述双特异性抗体包含如下氨基酸序列，所述氨基酸序列包含：
(a)SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:23，
(b)SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25，
(c)SEQ ID NO:26，
(d)SEQ ID NO:27，或其功能变体。
本公开还提供了本文所述的表达嵌合抗原受体(CAR)的T细胞用于治疗成胶质细胞瘤，任选地表达CD133的成胶质细胞瘤或可检测地表达CD133的成胶质细胞瘤的用途。
本公开还提供了本文所述的表达嵌合抗原受体(CAR)的T细胞用于治疗成神经管细胞瘤，任选地表达CD133的成神经管细胞瘤或可检测地表达CD133的成神经管细胞瘤的用途。
根据以下详细描述，本公开的其它特征和优点将变得显而易见。然而，应理解的是，虽然详细描述和具体实施例示出本公开的实施方案，但它们仅通过说明的方式给出，因为从此详细描述中，本公开的精神和范围内的各种改变和修改对于本领域技术人员而言将变得显而易见。
附图说明
下文结合附图描述了实施方案，其中：
图1A是描绘使用Cellectseq方法分别选自文库F或文库G的噬菌体-Fab克隆和噬菌体-scFv克隆结合至细胞表面CD133的用于CD133结合的基于细胞的ELISA的结果的表。在细胞选择后，将每个文库的第四轮输出噬菌体接种以获得单个菌落。使这些菌落在过夜培养物中生长，并通过基于细胞的ELISA测试与细胞的结合。读取板且检测并记录OD450nm。所述测定测量了克隆与过表达CD133的HEK293-CD133细胞(在“CD133”栏标题下)对比亲本HEK293细胞(在“HEK293”栏标题下)的结合。
图1B是描绘用于三种克隆(噬菌体-Fab RW03、噬菌体-Fab C12和噬菌体-Fab F5)的CD133结合的基于细胞的ELISA的直方图，所述三种克隆使用Cellectseq方法选自文库F以用于结合至细胞表面CD133并且在DNA测序后发现代表存在于被发现对比HEK293细胞优先结合至HEK293-CD133细胞至少1.5倍的77个克隆中的三个独特抗体可变区。
图2是一系列荧光显微照片，其描绘噬菌体-Fab克隆RW03特异性地结合至过表达CD133的细胞。通过基于细胞的ELISA从文库F获得的具有独特序列的三个克隆用作免疫荧光测定中的探针。噬菌体-Fab克隆C12和F5显示非特异性地结合至HEK293细胞，而RW03克隆特异性地结合至HEK293-CD133细胞，几乎没有与HEK293细胞的背景结合。
图3A和图3B分别是直方图和一组荧光显微照片，其描绘纯化的Fab RW03特异性地结合至HEK293-CD133，这与HEK293细胞相反。通过基于细胞的ELISA(图3A)和免疫荧光(IF)测定(图3B)测试表达的和纯化的Fab RW03的结合。
图4A和图4B是描绘IgG RW01和IgG RW03分别与HEK293-CD133细胞的结合的结合曲线的线图，用于估计结合亲和力(EC50)。将细胞与IgG RW01或IgG RW03的逐步稀释液一起孵育，以确定抗体的半数最大结合曲线。使用SigmaPlot绘图软件，IgG RW01的EC50被计算为2.5nM(图4A)，并且IgG RW03的EC50被计算为0.5nM(图4B)。
图5是一组荧光直方图，其描绘IgG RW01和IgG RW03可用于特异性地结合并检测胰腺癌细胞和结肠直肠癌细胞中的细胞表面CD133，如经由流式细胞术分析所示。
图6是一组荧光显微照片，其描绘IgG RW01和IgG RW03可用于特异性地结合、检测和亚细胞定位细胞CD133，如经由免疫荧光分析所示。测试所述抗体与HEK293-CD133和HEK293细胞的结合。
图7是蛋白质印迹分析的一组照片，其描绘IgG RW01和IgG RW03可用于检测结肠直肠癌细胞中的变性CD133/细胞CD133，如经由蛋白质印迹分析所示。用IgG RW01和IgGRW03探测HEK293、HEK293-CD133和Caco-2细胞的全细胞溶解产物，并且用抗人HRP缀合的第二抗体检测结合。β-肌动蛋白用作负载对照。
图8示出包含抗体可变区RW01的Fab和包含抗体可变区RW03的Fab不分别与IgGRW03和IgG RW01竞争结合至CD133。在竞争性流式细胞术实验中测试RW01和RW03与CD133的结合。在(a)中，在Fab RW03(正方形)存在下，将细胞与IgG RW01的逐步稀释液(圆圈)或IgGRW01一起孵育。类似地，在(b)中，在Fab RW01(正方形)存在下，将细胞与IgG RW03的逐步稀释液(圆圈)或IgG RW03一起孵育。
图9是蛋白质印迹分析的一组照片，其描绘用IgG RW01或IgG RW03处理显著降低Caco-2结肠直肠癌细胞中CD133蛋白的总细胞水平。将Caco-2细胞与指定的抗体一起在37℃下孵育24小时，制备全细胞溶解产物并用AC133抗CD133抗体探测。抗人IgG(H+L)抗体用作阴性抗体对照，并且GAPDH用作负载对照。
图10A是描绘BiTE#1、BiTE#2、BiTE#3和BiTE#4的构型的一组示意图。
图10B是蛋白质印迹分析的照片，其描绘BiTE#1、BiTE#2、BiTE#3和BiTE#4可各自通过瞬时转染方案从HEK293细胞表达和纯化。
图11A和图11B是荧光直方图的组，其描绘BiTE#1(图10A)、BiTE#2(图10A)、BiTE#3(图10B)和BiTE#4(图10B)各自比结合至亲本HEK293细胞显著更多地结合至HEK293-CD133细胞(即使在低至0.073-0.11微克/ml的浓度下)，如通过流式细胞术所测定。对每个直方图指示所使用的BiTE浓度。在每个直方图中，最右边的峰代表与HEK293-CD133细胞的结合，并且最左边的峰代表与亲本HEK293细胞的结合。
图12是ELISA结果的直方图，其描绘BiTE#1、BiTE#2、BiTE#3和BiTE#4各自结合至呈CD3ε/γ和CD3ε/δ形式的CD3。抗CD3抗体UCHT1和OKT3用作阳性抗体对照，并且BSA用作无抗体对照。
图13描绘用于产生CD133特异性嵌合抗原受体(CAR)的构建体。
图14示出CAR-T细胞的表征。
图15示出CD133特异性CAR-T细胞的验证。
图16示出CD133特异性CAR-T细胞在CD133+人GBM细胞存在下被活化。
图17示出活化的CD133特异性CAR-T细胞具有增强的增殖能力并且特异性地诱导CD133阳性GBM细胞死亡和CD133阳性成神经管细胞瘤细胞死亡。将CAR-T细胞与CD133高和CD133低GBM细胞以及CD133高成神经管细胞瘤细胞共培养。流式细胞术是基于用IR染料的存活-死亡染色。
图18A-18C示出CD133特异性T细胞在体内诱导GBM肿瘤消退。以100万X 2个剂量(2周)的剂量颅内递送治疗。
图19A和19B示出CD133xCD3BiTE的发展。
图20A和20B示出CD133xCD3BiTE结合至CD133+GBM肿瘤细胞和CD3+T淋巴细胞。
图21示出CD133特异性BiTE活化T细胞。
图22A-22C示出CD133特异性BiTE将T细胞募集至CD133+人GBM细胞并导致细胞死亡。
图23A-23D示出CD133xCD3BiTE介导的抗肿瘤应答。
具体实施方式
除非另外定义，否则结合本公开使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。此外，除非上下文另有要求，否则单数术语应包括复数，并且复数术语应包括单数。例如，术语“细胞”包括单个细胞以及多个细胞或细胞群体。一般来说，与本文所述的细胞和组织培养、分子生物学以及蛋白质和寡核苷酸或多核苷酸化学和杂交结合使用的命名法及其技术是本领域中众所周知并且常用的那些(参见例如Green和Sambrook，2012)。
如本文所用的程度术语诸如“约”、“基本上”和“大约”意指所修饰的术语的合理偏差量，以使得最终结果并不显著改变。如果这种偏差并不否定它所修饰的词语的含义，这些程度术语应理解为包括至少±5％的偏差。
物质的组合物：
本发明人提供了新型的合成抗体可变区，所述合成抗体可变区能够特异性地结合表面表达的/天然的人CD133以及还有变性的人CD133并且特异性地结合人CD133，解离常数(KD)在亚纳摩尔/纳摩尔范围内(参见下文的实施例3和6)。
本发明人特别提供了结合CD133的噬菌体-scFv克隆RW01，其中所述scFv包含结合CD133的抗体可变区RW01；和结合CD133的噬菌体-Fab克隆RW03，其中所述Fab包含结合CD133的抗体可变区RW03。这些克隆选自噬菌体展示文库，因为它们能够特异性地结合表达CD133的细胞，如最初经由酶联免疫吸附测定(ELISA；参见实施例1和2，下文)所证实的。本发明人进一步特别提供了结合CD133的抗体可变区RW01包含对应于SEQ ID NO:2的Asp1至Lys106区段的抗体轻链可变结构域，其中其轻链CDR1、轻链CDR2和轻链CDR3的氨基酸序列分别对应于SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8(参见实施例2，下文)。本发明人另外提供了抗体可变区RW01包含对应于SEQ ID NO:3的Glu1至Thr120区段的抗体重链可变结构域，其中其重链CDR1、重链CDR2和重链CDR3的氨基酸序列分别对应于SEQ ID NO:9、SEQ IDNO:10和SEQ ID NO:11，并且其中位置39、55和66处的(框架区)残基是Met、Ser和Tyr残基(参见实施例2，下文)。
本发明人进一步提供了结合CD133的抗体可变区RW03包含对应于SEQ ID NO:4的Asp1至Lys109区段的抗体轻链可变结构域，其中其轻链CDR1、轻链CDR2和轻链CDR3的氨基酸序列分别对应于SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14(参见实施例2，下文)。本发明人进一步提供了抗体可变区RW03包含对应于SEQ ID NO:5的Glu1至Ser118区段的抗体重链可变结构域，其中其重链CDR1、重链CDR2和重链CDR3的氨基酸序列分别对应于SEQ IDNO:15、SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:17，并且其中位置39、55和66处的(框架区)残基分别是Ile、Tyr和Tyr残基(参见实施例2，下文)。
本发明人进一步特别提供了IgG1抗体“IgG RW01”和“IgG RW03”(其分别包含结合CD133的抗体可变区RW01和结合CD133的抗体可变区RW03)可用于：(i)特异性地结合和检测胰腺癌细胞系和结肠直肠癌细胞系中的细胞表面CD133，如经由流式细胞术分析所示(参见实施例4，下文)；(ii)特异性地结合、检测和亚细胞定位表达CD133的细胞中的细胞CD133，如经由免疫荧光分析所示(参见实施例5，下文)；(iii)检测结肠直肠癌细胞的全细胞溶解产物中的变性的CD133，如经由蛋白质印迹分析所示(参见实施例6，下文)；以及(iv)显著降低结肠直肠癌细胞系中的总细胞CD133蛋白水平(参见实施例8，下文)。本发明人公开了抗体IgG RW01包含具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的轻链和具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的重链，并且抗体IgG RW03包含具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的轻链和具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的重链(实施例2)。本发明人仍然进一步公开了包含抗体可变区RW01的Fab和包含抗体可变区RW03的Fab不分别与IgG RW03和IgG RW01竞争结合至CD133(实施例7，下文)。
本发明人还描述了特异性地靶向CD133+GBM细胞的基于嵌合抗原受体(CAR)T细胞的策略。CD133特异性表达CAR的T细胞在CD133高GBM细胞存在下被活化，并显示活化标志物CD69和CD25的表面表达增加。CD4+和CD8+CD133特异性CAR-T细胞两者均显示活化标志物的表面表达水平的上调。本发明人进一步证明了CAR-T细胞诱导的针对治疗抗性和回避性CD133+GBM BTIC的细胞毒性(实施例10，下文)。
本发明人进一步特别公开了多种构型的双特异性抗体/双特异性T细胞衔接器(BiTE)(包含结合T细胞共受体CD3的scFv并且还包含并入结合CD133的抗体可变区RW03的Fab或单链Fab(scFab))可特异性地结合CD133阳性细胞和CD3两者(参见实施例9，下文)。本发明人还表明，重组CD133xCD3双特异性T细胞衔接器(BiTE)将人多克隆T细胞重定向至CD133+GBM细胞，从而诱导有效的抗肿瘤应答(参见实施例11，下文)。
CD133分子是具有细胞外N-末端区域、具有分别交替的短和长细胞内和细胞外结构域的五个跨膜结构域以及细胞内C-末端区域的跨膜蛋白。如本文所用，CD133可来自任何物种或来源并且包括这种CD133蛋白的同种型、类似物、变体或功能衍生物。在一个实施方案中，CD133是人CD133。人CD133基因或蛋白质可具有CD133的任何已知的公开序列，其可从诸如GenBank的公共来源获得。这种蛋白质序列的实例包括但不限于如SEQ ID NO:1所示的序列。人CD133在本领域中替代地称为凸素(Prominin)-1。
CD133结合剂
因此，本公开提供了一种CD133结合剂，所述CD133结合剂特异性地结合细胞表面表达的/天然的CD133并且特异性地结合变性的CD133。
如本文所用，“特异性地结合细胞表面表达的/天然的CD133”的CD133结合剂是结合表达CD133的细胞的剂。表达CD133的细胞可如此鉴定，例如经由流式细胞术分析，例如如实施例4中所描述。或者，“特异性地结合细胞表面表达的/天然的CD133”的CD133结合剂是以不可检测的水平，例如以低于如流式细胞术分析的测定的检测限的水平结合表达CD133的表达CD133的细胞的剂。如本文所用，“特异性地结合变性的CD133”的CD133结合剂是与样品中的其他多肽相反，结合表达CD133的细胞的变性全细胞蛋白样品中的CD133的剂(如例如经由蛋白质印迹分析所确定，例如如实施例6中所描述)。术语“与CD133免疫反应”或“针对CD133”或被表征为“抗CD133”在本文中也出于相同的目的使用。
在一个实施方案中，所述CD133结合剂特异性地结合由抗体结合的CD133表位，所述抗体包含具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的轻链和具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的重链(即抗体IgG RW01)；和/或特异性地结合由抗体结合的CD133表位，所述抗体包含具有SEQID NO:4的氨基酸序列的轻链和具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的重链(即抗体IgG RW03)。在一个实施方案中，所述CD133表位是人CD133表位。
如本文所用，术语“表位”是指抗原上由抗体IgG RW01和/或抗体IgG RW03结合的特定位点或位点/氨基酸的特定组合，例如，人CD133的未修饰的或修饰的(例如，翻译后修饰的，例如糖基化的)的氨基酸残基、人CD133的包含这些氨基酸残基的最小多肽片段或人CD133的包含这些氨基酸残基的多肽片段的任何组合。表位决定簇通常由诸如氨基酸或糖侧链的分子组成，并且通常具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。
除非另有说明，否则如本文所用，抗体或二价抗体片段(例如F(ab’)2)被称为包含“一条”特异性轻链，或者单数形式的“一条”特异性重链是指抗体或二价抗体片段，其中两条轻链或两条重链分别相同。
CD133结合剂的实施方案包括任何类型的CD133结合分子、大分子、物质、化合物、材料、组合物或复合物，但不限于此。
在一个实施方案中，所述CD133结合剂是多肽。在其他实施方案中，所述CD133结合剂是非多肽剂，如结合CD133的核酸或结合CD133的有机化合物。所述CD133结合剂可以是单体或多聚体。所述CD133结合剂可以是聚合的或非聚合的。或者，所述CD133结合剂可以是工程改造的多肽(例如，被工程改造为具有修饰的氨基酸序列的天然存在的多肽；或被工程改造为包含两个或更多个天然存在的氨基酸序列的嵌合多肽；或选自具有随机化氨基酸序列的工程改造的多肽的文库的工程改造的多肽)，或化学修饰的多肽。
在一个实施方案中，所述CD133结合剂包含结合CD133的抗体可变区。
如本文所用，结合CD133的抗体可变区是抗体重链可变结构域和抗体轻链可变结构域的组合，其中所述抗体重链可变结构域和抗体轻链可变结构域形成特异性地结合CD133的抗原结合位点。
CD133结合剂任选地是抗体、抗体的抗原结合片段或包含结合CD133的抗体可变区的剂。
如本文所用，并且除非另有说明，否则术语“抗体”是指免疫球蛋白(Ig)分子。已知基础抗体结构单元包含四聚体。每个四聚体由两对相同的多肽链组成，每对具有一条轻链(“L”)(约25kDa)和一条重链(“H”)(约50-70kDa)。每条链的氨基端部分包含主要负责抗原识别并且在下文更详细地描述的具有约100至110个或更多个氨基酸的可变区。每条链的羧基末端部分限定主要负责效应功能的恒定区。术语“抗原结合位点”或“结合部分”是指参与抗原结合的结合蛋白的部分。在抗体中，抗原结合位点由重链和轻链的N-末端可变(“V”)区的氨基酸残基形成。重链和轻链的V区内的三个高度趋异性区段(称为“高变区”)间插在称为“框架区”或“FR”的更保守的侧接区段之间。因此，术语“FR”是指天然存在于免疫球蛋白中的高变区之间并与其相邻的氨基酸序列。在抗体分子中，轻链的三个高变区和重链的三个高变区是相对于彼此安置于三维空间中以形成抗原结合表面。抗原结合表面与结合抗原的三维表面互补，并且重链和轻链中的每个的三个高变区被称为“互补决定区”或“CDR”。本文公开的所有CDR和框架区(FR)、本文公开的CDR和FR的氨基酸序列和本文公开的编码CDR或编码FR的核酸序列意图根据IMGT编号来定义(Lefranc等人，2003)。在本领域中替代使用的用于此类定义的另一种系统是Kabat编号的系统(Kabat等人，1991)。
所述CD133结合剂可以是抗体，如含有工程改造的可变区(例如含有选自展示工程改造的抗体可变区的噬菌体展示文库，例如噬菌体-Fab文库或噬菌体-scFv文库的可变区，例如，如实施例1中所描述)的人抗体，或包含人恒定区和非人哺乳动物的抗体可变区的嵌合抗体。所述CD133结合剂可以是人源化抗体，例如包含人恒定区、人可变区框架区和在非人哺乳动物中产生的结合CD133的CDR的抗体。非人哺乳动物可以是啮齿动物，如小鼠、大鼠、兔、豚鼠或仓鼠。或者，非人哺乳动物可以是有蹄类动物，如骆驼科动物或牛科动物。所述CD133结合剂可以是包含属于任何类型的类别或亚类的重链恒定区的抗体。CD133结合剂可包含任何类型的轻链。
在一个实施方案中，所述CD133结合剂是人抗体，如IgG1抗体，其中重链恒定区是γ1重链恒定区。在其他实施方案中，所述CD133结合剂是人抗体，如IgA1、IgA2、IgD、IgG2、IgG3、IgG4、IgE或IgM抗体，其中重链恒定区分别是α1、α2、δ、γ2、γ3、γ4、ε或μ重链恒定区。
在又一个实施方案中，所述CD133结合剂是其中轻链包含人κ轻链恒定结构域或其中轻链是人κ轻链的抗体。或者，所述CD133结合剂是其中轻链包含人λ轻链恒定结构域或其中轻链是人λ轻链的抗体。
在又一个实施方案中，所述CD133结合剂是包含人γ1重链恒定区和人κ轻链的抗体。
本公开的CD133结合剂的实施方案还包括但不限于抗原结合片段(Fab)、单链Fv(scFv)、单链Fab(scFab)、Fab'、Fv、化学连接的F(ab')2、dsFv、dsFv'、sc(Fv)2、ds-scFv、(dsFv)2、scFv-Fc、基于scFv的嵌合抗原受体(CAR)、基于Fab的CAR、基于scFab的CAR、单链免疫球蛋白(例如scIgG)、单结构域抗体(sdAb，纳米抗体)、scFv-Fc、微型抗体(scFv-CH3)、双抗体、三抗体、四抗体、多聚体抗体(例如scFv二聚体、二价双抗体)、多特异性抗体(例如双特异性抗体、三特异性抗体、di-scFv、tri-scFv、双特异性Fab2、三特异性Fab2、三特异性三抗体、三特异性Fab3)、多聚体/多特异性抗体(例如scFv二聚体、双特异性双抗体、dsFv-dsFv')、重链抗体、Fab3、二价VHH、五价VHH(五抗体)、(scFv-SA)4和[sc(Fv)2]2。
在另一个实施方案中，所述CD133结合剂是展示包含结合CD133的抗体可变区的多肽的噬菌体，如噬菌体-Fab或噬菌体-scFv(参见实施例1和2，下文)。
本公开的CD133结合剂的实施方案还进一步包括结合CD133的核酸适体(例如RNA适体或DNA适体；参见例如Lipi等人，2016)、肽适体(参见例如Parashar，2016)和化学合成的剂(例如合成抗体模拟物；参见例如McEnaney等人，2014)。
在另一个实施方案中，所述CD133结合剂是肽类似物。肽类似物通常在制药工业中用作非肽药物，性质类似于模板肽。这些类型的非肽化合物被称为“肽模拟物(peptidemimetics)”或“模拟肽(peptidomimetics)”(参见例如Fauchere，1986)；Veber和Freidinger，1985；和Evans等人，1987)。通常在计算机化分子模型化的辅助下开发此类化合物。在结构上类似于生物学上有用的肽的肽模拟物可用于产生等效的生物学作用。通常，模拟肽在结构上类似于范式多肽(即具有生物化学性质或药理学活性的多肽)，诸如人抗体，但具有一个或多个肽键联，所述一个或多个肽键联任选地通过本领域中熟知的方法被选自由以下组成的组的键联取代：–CH2NH–、–CH2S–、–CH2-CH2–、–CH＝CH–(顺式和反式)、–COCH2–、CH(OH)CH2–和–CH2SO–。可使用用相同类型的D-氨基酸系统取代共有序列的一个或多个氨基酸(例如D-赖氨酸代替L-赖氨酸)来产生更稳定的肽。此外，可通过本领域中已知的方法(参见例如Rizo和Gierasch，1992)，例如通过添加能够形成使肽环化的分子内二硫桥的内部半胱氨酸残基来产生包含共有序列或基本上相同的共有序列变化的限制性肽。
在一个实施方案中，所述CD133结合剂包含抗体可变区RW01，所述抗体可变区RW01包含(a)对应于SEQ ID NO:2的Asp1至Lys106区段的抗体轻链可变结构域(SEQ ID NO:28)，其中其轻链CDR1、轻链CDR2和轻链CD3的氨基酸序列分别对应于SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8(参见实施例2，下文)，和(b)对应于SEQ ID NO:3的Glu1至Thr120区段的抗体重链可变结构域(SEQ ID NO:29)，其中其重链CDR1、重链CDR2和重链CDR3的氨基酸序列分别对应于SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11，并且其中位置39、55和66处的(框架区)残基是Met、Ser和Tyr残基(参见实施例2，下文)。
在另一实施方案中，所述CD133结合剂包含抗体可变区RW03，所述抗体可变区RW03包含(a)对应于SEQ ID NO:4的Asp1至Lys109区段的抗体轻链可变结构域(SEQ ID NO:30)，其中其轻链CDR1、轻链CDR2和轻链CD3的氨基酸序列分别对应于SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14(参见实施例2，下文)，和(b)对应于SEQ ID NO:5的Glu1至Ser118区段的抗体重链可变结构域(SEQ ID NO:31)，其中其重链CDR1、重链CDR2和重链CD3的氨基酸序列分别对应于SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:17，并且其中位置39、55和66处的(框架区)残基分别是Ile、Tyr和Tyr残基(参见实施例2，下文)。
本文还特别公开了一种CD133结合剂IgG RW01，其包含如SEQ ID NO:2中所示的轻链氨基酸序列和如SEQ ID NO:3中所示的重链氨基酸序列(参见实施例2，下文)。
本文进一步特别公开的了一种CD133结合剂IgG RW03，其包含如SEQ ID NO:4中所示的轻链氨基酸序列和如SEQ ID NO:5中所示的重链氨基酸序列(参见实施例2，下文)。
因此，本公开还提供了一种CD133结合剂，其包含：
(i)抗体轻链可变结构域，所述抗体轻链可变结构域包含含有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的轻链CDR1、含有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的轻链CDR2和/或含有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的轻链CDR3；和/或
(ii)抗体重链可变结构域，所述抗体重链可变结构域包含位置39处的Met残基和包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的重链CDR1；位置55处的Ser残基、位置66处的Tyr残基和包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的重链CDR2；和/或包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的重链CDR3，其中所述抗体轻链可变结构域和抗体重链可变结构域形成结合人CD133的抗原结合位点。
在一个实施方案中，所述抗体轻链可变结构域包含分别包含SEQ ID NO:6、SEQ IDNO:7和SEQ ID NO:8的氨基酸序列的轻链CDR1、轻链CDR2和轻链CDR3；并且所述抗体重链可变结构域包含分别包含SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11的氨基酸序列的重链CDR1、重链CDR2和重链CDR3；并且所述抗体重链可变结构域分别包含位置39、55和66处的Met、Ser和Tyr残基。
在另一个实施方案中，所述抗体轻链可变结构域包含分别由SEQ ID NO:6、SEQ IDNO:7和SEQ ID NO:8的氨基酸序列组成的轻链CDR1、轻链CDR2和轻链CDR3；并且所述抗体重链可变结构域包含由重链CDR1和位置39处侧接所述重链CDR1的Met残基构成的氨基酸序列(SEQ ID NO:32)，所述重链CDR1由SEQ ID NO:9的氨基酸序列组成；由重链CDR2、位置55处的侧接所述重链CDR2的Ser残基和位置66处的侧接所述重链CDR2的Tyr残基构成的氨基酸序列(SEQ ID NO:33)，所述重链CDR2由SEQ ID NO:10的氨基酸序列组成；和由SEQ ID NO:11的氨基酸序列组成的重链CDR3。
在另一实施方案中，所述轻链包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列或与SEQ ID NO:2的框架区具有至少70％序列同一性的氨基酸序列，和/或所述重链包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列或与SEQ ID NO:3的框架区具有至少70％序列同一性的氨基酸序列。
在另一实施方案中，所述轻链由SEQ ID NO:2的氨基酸序列组成，和/或所述重链由SEQ ID NO:3的氨基酸序列组成。
因此，本公开还提供了一种CD133结合剂，其包含：
(i)抗体轻链可变结构域，所述抗体轻链可变结构域包含含有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的轻链CDR1、含有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的轻链CDR2和/或含有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的轻链CDR3；和/或
(ii)抗体重链可变结构域，所述抗体重链可变结构域包含位置39处的Ile残基和包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的重链CDR1；位置55和66处的Tyr残基和包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的重链CDR2；和/或包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的重链CDR3，其中所述抗体轻链可变结构域和抗体重链可变结构域形成结合人CD133的抗原结合位点。
在一个实施方案中，所述抗体轻链可变结构域包含分别包含SEQ ID NO:12、SEQID NO:13和SEQ ID NO:14的氨基酸序列的轻链CDR1、轻链CDR2和轻链CDR3；并且所述抗体重链可变结构域包含分别包含SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:17的氨基酸序列的重链CDR1、重链CDR2和重链CDR3；并且所述抗体重链可变结构域分别包含位置39、55和66处的Ile、Tyr和Tyr残基。
在另一个实施方案中，所述抗体轻链可变结构域包含分别由SEQ ID NO:12、SEQID NO:13和SEQ ID NO:14的氨基酸序列组成的轻链CDR1、轻链CDR2和轻链CDR3；并且所述抗体重链可变结构域包含由重链CDR1和位置39处侧接所述重链CDR1的Ile残基构成的氨基酸序列(SEQ ID NO:34)，所述重链CDR1由SEQ ID NO:15的氨基酸序列组成；由重链CDR2、位置55处的侧接所述重链CDR2的Tyr残基和位置66处的侧接所述重链CDR2的Tyr残基构成的氨基酸序列(SEQ ID NO:35)，所述重链CDR2由SEQ ID NO:16的氨基酸序列组成；和由SEQID NO:17的氨基酸序列组成的重链CDR3。
在另一实施方案中，所述抗体轻链包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列或与SEQ IDNO:4的框架区具有至少70％序列同一性的氨基酸序列，和/或所述抗体重链包含SEQ IDNO:5的氨基酸序列或与SEQID NO:5的框架区具有至少70％序列同一性的氨基酸序列。
在另一实施方案中，所述轻链由SEQ ID NO:4的氨基酸序列组成，并且所述重链由SEQ ID NO:5的氨基酸序列组成。
可以使用熟知的技术获得并适当地制备本公开的任何CD133结合剂。
本公开的多肽CD133结合剂可通过本领域熟知和常规实施的重组技术来合成。本公开的多肽CD133结合剂可在重组来源，如重组细胞系或转基因动物中产生。技术可适用于产生对CD133具有特异性的单链抗体，如scFv(参见例如美国专利号4,946,778)。
或者，本公开的多肽CD133结合剂(如本公开的CD133结合抗体)可通过用CD133或含有合适CD133表位的多肽免疫动物以在所述动物的血清中产生所述抗体而获得。
本公开的CD133结合IgG抗体可经由诸如使用蛋白A或蛋白G的亲和色谱的技术从生物样品(如血清)纯化(参见例如Wilkinson，2000)。另外或可替代地，可将CD133或包含其表位的多肽(其由CD133结合剂特异性地结合)固定在柱上，以通过免疫亲和色谱法从样品中纯化CD133结合剂。
可使用常规技术从抗体获得本公开的CD133结合抗体片段。例如，可通过用胃蛋白酶处理抗体产生F(ab')2片段。可处理所得的F(ab')2片段以还原二硫桥来产生Fab'片段。
产生本公开的多肽CD133结合剂的方法在下文进一步详细描述。
如上所述，在一个实施方案中，所述CD133结合剂可以是双特异性抗体。
如本文所用，双特异性抗体是包含两个不同的抗体可变区的结合剂，所述两个不同的抗体可变区赋予对至少两种不同的抗原或同一抗原的两种不同表位结合特异性。
本发明公开的双特异性抗体特异性地结合CD133和另一种抗原或特异性地结合CD133的不同表位。任选地，所述双特异性抗体结合CD133和细胞表面蛋白、受体或受体亚基。
在一个实施方案中，所述双特异性抗体包含结合CD133的单链Fab和结合非CD133的scFv。或者，所述双特异性抗体包含结合CD133的Fab和结合非CD133的scFv。
在另一个实施方案中，所述CD133结合剂是双特异性抗体，其靶向、结合和/或接合免疫细胞，如T细胞、巨噬细胞或NK细胞。根据此实施方案，所述CD133结合剂是双特异性抗体，其中结合特异性之一是针对CD133，而另一种结合特异性是针对在T细胞、巨噬细胞或NK细胞表面上表达的抗原。例如，所述双特异性抗体可结合CD133和免疫细胞受体，如T细胞的受体，其在结合时活化或抑制免疫细胞的活性。
已描述直接自重组细胞培养物制备和分离双特异性抗体的各种技术。例如，已经使用亮氨酸拉链(参见例如Kostelny等人，1992)、使用“双抗体”技术(参见例如Hollinger等人，1993)和使用单链Fv(scFv)二聚体(参见例如Gruber等人，1994)产生了双特异性抗体。
接合T细胞的双特异性抗体可称为双特异性T细胞衔接器(BiTE)。在本公开的一个实施方案中，所述双特异性抗体/BiTE特异性地结合CD133和T细胞共受体CD3两者(在本文中也称为结合CD133/结合CD3的双特异性抗体)。因此，本文提供了双特异性抗体/BiTE，其包含本公开的结合CD133的抗体可变区和结合CD3的抗体可变区。此类双特异性抗体/BiTE允许将T细胞靶向表达表面CD133的细胞，如癌细胞。本文考虑了双特异性抗体/BiTE的各种构型。例如，在一个实施方案中，所述双特异性抗体/BiTE包含抗CD133Fab和抗CD3scFv。任选地，所述抗CD133Fab的轻链或重链连接至抗CD3scFv的重链。在另一个实施方案中，所述双特异性抗体/BiTE包含抗CD133单链Fab(scFab)和抗CD3ScFv。任选地，所述抗CD133Fab或抗CD133scFab的轻链或重链连接至抗CD3scFv的重链。在一个实施方案中，所述抗CD3scFv结合CD3ε/γ。在一个实施方案中，所述BiTE/双特异性抗体结合CD3ε/δ。参见，例如图10A。表6中提供了BiTE的各种实施方案的构型和氨基酸序列的实例。因此，本公开还提供了包含选自(a)SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:23、(b)SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25、(c)SEQ ID NO:26和(d)SEQ ID NO:27或其功能变体的一个或多个氨基酸序列的BiTE。在一个实施方案中，所述BiTE包含与SEQ ID No:22-27中的任一个具有至少50％、或至少60％、或至少70％、或至少80％、或至少90％、或至少95％序列同一性的氨基酸序列。
在另一实施方案中，所述双特异性抗体结合CD133和NK细胞表面受体CD16。
在本公开的另一个实施方案中，所述CD133结合剂是包含抗体可变区RW01和抗体可变区RW03的双特异性抗体。
如上所述，所述CD133结合剂可具有任何数量的化合价和/或特异性。例如，可制备三特异性和/或三价CD133结合剂(参见，例如Tutt等人，1991)。
如上所述，CD133结合剂的实施方案还包括结合CD133的嵌合抗原受体(CAR)。
因此，本文提供了嵌合抗原受体，其包含(i)本公开的CD133结合剂和(ii)包含一个或多个免疫细胞受体信号传导结构域的CAR信号传导结构域。嵌合抗原受体是工程改造的受体，其中包含本公开的结合CD133的可变区的多肽(例如结合CD133的scFv)例如经由铰链结构域和跨膜结构域融合至包含一种或多种免疫细胞受体的一个或多个细胞内信号传导结构域的CAR信号传导结构域。CAR可以是单体多肽(例如基于抗CD133scFv的)或多聚体多肽(例如基于抗CD133Fab的)。这种CAR在免疫效应细胞中的表达允许将免疫细胞靶向表达表面CD133的细胞，其中所述CAR与细胞表面表达的CD133的结合活化免疫效应细胞的效应功能。
在一个实施方案中，所述CAR信号传导结构域包含T细胞共受体CD3的信号传导结构域(例如CD3ζ或CD3γ)。在另一个实施方案中，所述CAR包含与一种或多种T细胞共刺激分子(例如CD28、4-1BB、CD137、OX40、ICOS和/或CD27)的信号传导结构域融合的T细胞共受体CD3的信号传导结构域。在另一个实施方案中，所述CAR信号传导结构域包含CD3ζ，以及CD8和CD28的部分。在另一个实施方案中，所述CAR信号传导结构域包含人CD8前导序列和CD8a跨膜结构域。在一个实施方案中，所述CAR包含CD28信号传导结构域和末端CD3ζ信号传导结构域。在另一实施方案中，所述CAR信号传导结构域包含CD3ζ信号传导结构域、4-1BB信号传导结构域和CD28信号传导结构域。考虑了CAR中包含的scFv的不同构型，包括VL-接头-VH和VH-接头-VL。合适的CAR的构建及其用于靶向表达抗原的细胞的用途(在本领域通常称为“CAR T细胞疗法”)是本领域熟知的(参见例如Maus和June，2016；Abate-Daga和Davila，2016；Resetca等人，2016；以及Wang和Rivière，2016)。
在另外的实施方案中，所述CD133结合剂是噬菌体-Fab或噬菌体-scFv，其中所述Fab或scFv特异性地结合CD133。本公开还提供了表达如本文所述的CAR的T细胞。
可能希望关于效应功能修饰本文公开的结合剂，以增强其结合/靶向表达CD133的细胞的有效性和/或降低表达CD133的细胞中CD133的水平。例如，当所述结合剂包含抗体Fc区(如抗体)时，可将一个或多个半胱氨酸残基引入Fc区的COOH末端，从而允许在该区域中的抗体单体之间形成链间二硫键。由此产生的同二聚体抗体可具有改善的内化能力和/或增加的补体介导的细胞杀伤和抗体依赖性细胞毒性(ADCC)(参见例如Caron等人，1992；和Shopes，1992)。或者，可工程改造具有双Fc区的抗体，并且因此可具有增强的补体溶解和ADCC能力(参见例如Stevenson等人，1989)。本公开还涵盖本文所述的CD133结合剂的功能变体。如本文所用的术语“功能变体”包括以基本相同的方式执行与本文公开的多肽或核酸分子基本相同的功能的本文公开的氨基酸和核酸序列的修饰或化学等效物。例如，本文公开的多肽的功能变体包括但不限于保守氨基酸取代。
如本文所用的“保守氨基酸取代”是其中一个氨基酸残基被另一个氨基酸残基置换的取代，其是将氨基酸改变为具有相似生物化学性质(例如电荷、疏水性和大小)的不同氨基酸。多肽的变体还包括对本文公开的多肽序列的添加和缺失。另外，变体核苷酸序列包括其类似物和衍生物。本文公开的结合剂的变体包括与结合剂结合至相同抗原或表位的剂。
在一个实施方案中，本公开包括本文公开的氨基酸序列的功能变体。特别地，本公开提供了IgG RW01的轻链和重链的氨基酸序列(分别SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3)的功能变体、抗体可变区RW01的CDR的氨基酸序列(SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQID NO:9、SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11)的功能变体以及对应于抗体可变区RW01的重链的SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:33的氨基酸序列的功能变体。本公开进一步特别地提供了IgGRW03的轻链和重链的氨基酸序列(分别SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5)的功能变体、抗体可变区RW03的CDR的氨基酸序列(SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:17)的功能变体以及对应于抗体可变区RW03的重链的SEQ IDNO:34和SEQ ID NO:35的氨基酸序列的功能变体。
在另一个实施方案中，本公开包括编码本文公开的氨基酸序列的核酸序列的功能变体。特别提供了编码IgG RW01的轻链和重链的核苷酸序列(分别SEQ ID NO:18和SEQ IDNO:19)的功能变体、编码抗体可变区RW01的轻链和重链可变结构域的核苷酸序列(分别SEQID NO:52和SEQ ID NO:53)的功能变体、编码抗体可变区RW01的CDR的氨基酸序列的核苷酸序列(SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40和SEQ IDNO:41)的功能变体以及编码对应于抗体可变区RW01的重链的SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:33的氨基酸序列的核苷酸序列(分别SEQ ID NO:42和SEQ ID NO:43)的功能变体。
本公开进一步特别提供了编码IgG RW03的轻链和重链的核苷酸序列(分别SEQ IDNO:20和SEQ ID NO:21)的功能变体、编码抗体可变区RW03的轻链和重链可变结构域的核苷酸序列(分别SEQ ID NO:54和SEQ ID NO:55)的功能变体、编码抗体可变区RW03的CDR的氨基酸序列的核苷酸序列(SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQID NO:48和SEQ ID NO:49)的功能变体以及编码对应于抗体可变区RW03的重链的SEQ IDNO:34和SEQ ID NO:35的氨基酸序列的核苷酸序列(分别SEQ ID NO:50和SEQ ID NO:51)的功能变体。
此外，功能变体包括在至少适度严格的杂交条件下与编码本公开的氨基酸序列的核酸或其互补序列杂交的核苷酸序列。此类功能变体包括在至少适度严格的杂交条件下与SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ IDNO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ IDNO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54或SEQID NO:55或其互补序列杂交的核苷酸序列。
所谓“至少适度严格的杂交条件”其意味着选择促进在溶液中的两种互补核酸分子之间的选择性杂交的条件。杂交可发生于核酸序列分子的全部或一部分中。所述杂交部分通常是至少15(例如20、25、30、40或50)个核苷酸的长度。本领域的技术人员将认识到核酸双链体或杂合体的稳定性由Tm决定，在含钠缓冲液中稳定性是钠离子浓度和温度的函数(Tm＝81.5℃–16.6(Log10[Na+])+0.41(％(G+C)–600/l)，或类似的方程)。因此，在洗涤条件中确定杂合体稳定性的参数是钠离子浓度和温度。为了鉴定与已知核酸分子类似但不相同的分子，1％错配可被认为导致Tm下降约1℃，例如如果寻求具有>95％同一性的核酸分子，则最终洗涤温度将下降约5℃。基于这些考虑，本领域的技术人员将能够容易地选择适当的杂交条件。在一些实施方案中，选择严格的杂交条件。举例来说，可采用以下条件来实现严格杂交：基于以上方程，在Tm-5℃下在5x氯化钠/柠檬酸钠(SSC)/5x Denhardt’s溶液/1.0％SDS下杂交，然后在60℃下0.2x SSC/0.1％SDS洗涤。适度严格的杂交条件包括在42℃下在3x SSC中的洗涤步骤。然而，应理解，可使用替代的缓冲剂、盐和温度实现等效严格性。有关杂交条件的额外指导可参见：Current Protocols in Molecular Biology,JohnWiley&Sons,N.Y.,2002以及：Sambrook等人,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,2001。
在一个实施方案中，本文公开的氨基酸序列的变体氨基酸序列包含与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34或SEQ ID NO:35具有至少50％、或至少60％、或至少70％、或至少80％、或至少90％、或至少95％序列同一性的序列。
在另一个实施方案中，本文公开的氨基酸序列的变体氨基酸序列包含与SEQ IDNO:2、3、4或5的框架区具有至少50％、或至少60％、或至少70％、或至少80％、或至少90％、或至少95％序列同一性的序列。在另一个实施方案中，编码本文公开的所述氨基酸序列的变体核苷酸序列包含与SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQID NO:54或SEQ ID NO:55具有至少50％、或至少60％、或至少70％、或至少80％、或至少90％、或至少95％序列同一性的序列。
在另一个实施方案中，编码包含本文公开的重链和轻链可变结构域的氨基酸序列的变体核苷酸序列包含与编码此类氨基酸序列的核苷酸序列(包括SEQ ID NO:18、SEQ IDNO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54和SEQID NO:55)具有至少50％、或至少60％、或至少70％、或至少80％、或至少至少90％或至少95％序列同一性的序列。
如本文所用的术语“序列同一性”是指两个氨基酸序列或两个核酸序列之间的序列同一性的百分比。为确定两个氨基酸序列或两个核酸序列的同一性百分比，为了最佳比较目的将所述序列进行比对(例如，可在第一氨基酸或核酸序列中引入空位，以与第二氨基酸或核酸序列最佳比对)。然后比较在相应氨基酸位置或核苷酸位置的氨基酸残基或核苷酸。当第一序列中的位置被第二序列中相应位置的相同氨基酸残基或核苷酸占据时，则分子在该位置相同。两个序列之间的同一性百分比是序列共有的相同位置数量的函数(即，同一性％＝相同重叠位置/位置总数×100％)。在一个实施方案中，两个序列是相同长度。两个序列之间的同一性百分比的确定还可使用数学算法完成。用于比较两个序列的数学算法的一个非限制性实例是Karlin和Altschul，1990的算法，如在Karlin和Altschul，1993中进行修改。这种算法被结合到Altschul等人，1990的NBLAST和XBLAST程序中。可采用NBLAST核苷酸程序参数设定例如分数＝100，字长＝12执行BLAST核苷酸搜索，以便获得与本公开的核酸分子同源的核苷酸序列。可采用XBLAST程序参数设定例如分数-50，字长＝3执行BLAST蛋白质搜索，以便获得与本发明的蛋白质分子同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的空位比对，可如Altschul等人，1997中所述，利用空位BLAST。或者，可使用PSI-BLAST来执行迭代搜索，其检测分子之间的远缘关系。当利用BLAST程序、空位BLAST程序以及PSI-Blast程序时，可使用对应程序(例如，XBLAST和NBLAST)的默认参数(参见例如NCBI网站)。用于比较序列的数学算法的另一个非限制性实例是Myers和Miller，1988的算法。将此类算法并入ALIGN程序(2.0版)中，所述程序是GCG序列比对软件包的一部分。当利用ALIGN程序比较氨基酸序列时，可使用PAM120权重残基表、12的空位长度罚分和4的空位罚分。可使用与上述技术相似的技术，允许或不允许空位，测定两个序列之间的百分比同一性。在计算同一性百分比中，通常仅对精确匹配计数。
核酸和载体
还提供了编码本文所述的抗体可变区的核酸和编码包含这些抗体可变区的多肽的核酸。如本文所用，术语“核酸”包括分离的核酸。
特别地，本公开提供了如SEQ ID NO:36-41中列出的编码抗体可变区RW01的CDR区的核酸及其功能变体；以及如SEQ ID NO:42和43中列出的编码RW01的重链可变结构域的氨基酸序列的核酸及其功能变体。还提供了如SEQ ID NO:44-49中列出的编码RW03的CDR区的核酸及其功能变体；以及如SEQ ID NO:50和51中列出的编码RW03的重链可变结构域的氨基酸序列的核酸及其功能变体。
还提供了编码抗体可变区RW01的轻链可变结构域的核酸(SEQ ID NO:52)及其功能变体。在一个实施方案中，所述核酸编码(a)SEQ ID NO:28的氨基酸序列或(b)与SEQ IDNO:28的框架区具有至少70％序列同一性的氨基酸序列。还提供了编码IgG RW01的重链的核酸(SEQ ID NO:53)。在一个实施方案中，所述核酸编码(a)SEQ ID NO:29的氨基酸序列或(b)与SEQ ID NO:29的框架区具有至少70％序列同一性的氨基酸序列。
还提供了编码抗体可变区RW03的轻链可变结构域的核酸(SEQ ID NO:54)及其功能变体。在一个实施方案中，所述核酸编码(a)SEQ ID NO:30的氨基酸序列或与SEQ ID NO:30的框架区具有至少70％序列同一性的氨基酸序列。还提供了编码抗体可变区RW03的重链可变结构域的核酸(SEQ ID NO:55)。在一个实施方案中，所述核酸编码(a)SEQ ID NO:31的氨基酸序列或与SEQ ID NO:31的框架区具有至少70％序列同一性的氨基酸序列。
本公开还提供了编码如SEQ ID No:18、19、20和21中列出的IgG RW01和IgG RW03的轻链和重链的核酸及其功能变体。
本公开还提供了如SEQ ID No:52、53、54和55中列出的编码抗体可变区RW01和抗体可变区RW03的轻链和重链的可变结构域的核酸及其功能变体。
本文公开的多肽结合剂可通过含有编码目标多肽的核酸的载体使用本领域熟知和常规实施的方法来表达。因此，本公开还提供了表达本文所述的任何核酸的载体。
多肽结合剂可通过构建编码多肽结合剂的核酸、将构建体插入表达载体且然后在适当的宿主细胞中表达它来制备。用于表达本文公开的多肽结合剂的载体是本领域熟知的。在一个实施方案中，所述载体包含在具有功能性启动子的可操作阅读相(operablereading phase)中的合适翻译起始和终止信号，并且可包含一种或多种表型选择性标记和复制起点以确保载体的维持并且如果需要在宿主内提供扩增。除载体外，本公开的核酸可经由本领域已知的任何其他方法递送至细胞或受试者，所述方法包括但不限于脂质体、裸DNA、佐剂辅助的DNA、基因枪、导管等。
单克隆多肽/单克隆抗体
如上所述，所述CD133结合剂可以是包含结合CD133的抗体可变区的多肽，如具体地包含抗体可变区RW01或抗体可变区RW03的抗体。因此，本公开还提供了本公开的单克隆多肽CD133结合剂，如本公开的单克隆CD133结合抗体。
如本文所用，本公开的“单克隆”多肽CD133结合剂是指相同的多肽CD133结合剂分子的群体。例如，在本公开的包含结合CD133的抗体可变区的单克隆多肽CD133结合剂的情况下，如本公开的单克隆CD133结合抗体，CDR在所述群体的所有分子中是相同的。本领域已知的各种方法可用于产生单克隆多肽，如本公开的单克隆抗体(参见，例如，Greenfield，2013)。通常使用缩写“mAb”或“MAb”来指代单克隆抗体。
单克隆抗体还可通过重组DNA方法，如美国专利号4,816,567中描述的那些方法来制备。编码单克隆抗体及其抗原结合片段的DNA可容易地分离并且使用常规程序(例如，通过使用能够特异性结合至编码鼠科抗体的重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)来测序。杂交瘤细胞充当这种DNA的优选来源。一旦分离，DNA可安置于表达载体中，然后将表达载体转染至否则不产生免疫球蛋白的宿主细胞如猿COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞中，以获得单克隆抗体在重组宿主细胞中的合成。
还可产生单克隆抗体，例如通过用CD133，例如像鼠、大鼠或人CD133或其免疫原性片段、衍生物或变体免疫动物。或者，用含有编码CD133的核酸分子的载体转染的细胞免疫动物，所述CD133表达并与转染细胞的表面缔合。或者，通过针对结合至CD133筛选含有抗体或抗原结合结构域序列的文库来获得抗体。此文库例如在噬菌体中作为蛋白质或与噬菌体外壳蛋白的肽融合物而制备，所述噬菌体外壳蛋白在组装的噬菌体颗粒的表面和包含在噬菌体颗粒内的编码DNA序列上表达(即“噬菌体展示文库”)。然后筛选由骨髓瘤/B细胞融合物产生的杂交瘤对CD133的反应性。
可例如使用杂交瘤方法制备单克隆抗体(参见，例如，Kohler和Milstein，1975)。在杂交瘤方法中，小鼠、仓鼠或其他适当宿主动物通常用免疫剂来免疫以引发淋巴细胞，所述淋巴细胞产生或能够产生将特异性地结合至免疫剂的抗体。或者，淋巴细胞可在体外免疫接种。
亲和力
免疫球蛋白分子与免疫球蛋白对其具有特异性的抗原之间发生非共价相互作用。免疫结合相互作用的强度或亲和力可用相互作用的解离常数(KD)来表示，其中较小的KD代表较大的亲和力。可使用本领域中熟知的方法来定量特异性多肽的免疫结合性质。一种此类方法需要测量抗原结合位点/抗原复合物形成和解离的速率，其中这些速率取决于复合配偶体的浓度、相互作用的亲和力以及在两个方向上同等地影响速率的几何参数。因此，可通过计算浓度以及缔合和解离的实际速率来确定“缔合速率常数”(K缔合)与“解离速率常数”(K解离)(参见，例如Malmqvist，1993)。K解离/K缔合的比率能够取消与亲和力无关的所有参数，并且等于解离常数KD(参见，例如Davies等人，1990)。
本文公开的二价CD133结合剂，如包含两个CD133结合抗体可变区(例如抗体或F(ab’)2)的CD133结合剂在结合的解离常数(KD)≤1微摩尔时被认为特异性地结合CD133。本文公开的单价CD133结合剂(即具有单个CD133结合位点，如单个结合CD133的抗体可变区，例如scFv或Fab)在呈二价形式的CD133结合剂的结合解离常数(KD)≤1微摩尔时被称为特异性地结合CD133。用于连接本公开的单价结合剂以产生其合适的二价形式的方法是本领域熟知的(例如其中单价剂包含单个抗体可变区，产生包含抗体可变区的两个拷贝的二价抗体/F(ab’)2；或者例如使用合适的接头，如多肽接头、核酸接头或化学合成的接头)。
在各种实施方案中，所述CD133结合剂结合CD133的解离常数(KD)≤1微摩尔、≤900nM、≤800nM、≤700nM、≤600nM、≤500nM、≤400nM、≤300nM、≤200nM、≤100nM、≤90nM、≤80nM、≤70nM、≤60nM、≤50nM、≤40nM、≤30nM、≤20nM、≤10nM、≤9nM、≤8nM、≤7nM、≤6nM、≤5nM、≤4nM、≤2nM、≤1nM、≤0.9nM、≤0.8nM、≤0.7nM、≤0.6nM、≤0.5nM、≤0.4nM至0.3nM、≤0.2nM或≤100pM至约1pM。
在其他各种实施方案中，所述CD133结合剂结合CD133的解离常数(KD)≤1微摩尔至100nM、≤100nM至10nM、≤10nM至1nM、≤1nM至0.1nM或≤0.1nM至10pM。
在另外的各种实施方案中，所述CD133结合剂结合CD133的解离常数(KD)≤3nM至2nM、≤2.6nM至2.4nM、≤2.5nM、约2.5nM、≤2nM至1nM、≤0.6nM至0.4nM、≤0.5nM或约0.5nM。
如本文所公开的，二价CD133结合剂(如本公开的结合CD133的抗体或呈二价形式的单价CD133结合剂)的结合的解离常数KD被认为大致上对应于如经由流式细胞术测定的与过表达CD133的细胞群体(如HEK293-CD133细胞)的饱和结合所需的CD133结合剂的半数最大浓度(“EC50”)(参见实施例3，下文)。这种方法可用于测定结合剂对不能适当纯化的细胞表面分子的亲和力，这通常是跨膜蛋白如CD133的情况。确定CD133结合剂与细胞表面表达的CD133的结合的解离常数(KD)的替代方法包括放射性配体结合测定，以及本领域技术人员已知的类似测定。或者，当由本公开的CD133结合剂结合的CD133或其一部分以纯化形式可获得时，解离常数(KD)可通过诸如表面等离子共振(SPR；Biacore)测定和本领域已知的其他合适测定的测定来测量。
如上所述，本公开提供了CD133结合剂，所述CD133结合剂特异性地结合由抗体IgGRW01结合的CD133表位和/或由抗体IgG RW03结合的CD133表位。
可使用本领域已知的各种方法中的任一种来鉴定CD133结合剂，所述CD133结合剂特异性地结合由抗体IgG RW01结合的CD133表位和/或由抗体IgG RW03结合的CD133表位。本领域技术人员将理解，结合测定如竞争结合测定可用于此目的。本领域技术人员将认识到，有可能在没有过度实验的情况下通过确定结合剂是否阻止抗体IgG RW01和/或抗体IgGRW03结合至人CD133来确定所述结合剂是否特异性地结合由抗体IgG RW01结合的CD133表位和/或由抗体IgG RW03结合的CD133表位。如果所测试的结合剂与抗体IgG RW01和/或抗体IgG RW03竞争，如通过抗体IgG RW01和/或抗体IgG RW03与人CD133的结合减少所示，则所述结合剂与抗体IgG RW01和/或抗体IgG RW03结合至相同的表位。用于测试结合剂的特异性的方法包括但不限于酶联免疫吸附测定(ELISA)和本领域已知的其他免疫介导的技术。
在一个实施方案中，特异性地结合由抗体IgG RW01结合的CD133表位和/或由抗体IgG RW03结合的CD133表位的CD133结合剂是与抗体IgG RW01和/或抗体IgG RW03竞争结合至表达CD133的细胞的表面的CD133结合剂。在一个实施方案中，所述CD133表位是人CD133表位。例如，特异性地结合由抗体IgG RW01结合的CD133表位和/或由抗体IgG RW03结合的CD133表位的CD133结合剂将部分或完全抑制抗体IgG RW01和/或抗体IgG RW03与同饱和浓度的这种结合剂一起预孵育的表达CD133的细胞的结合，如类似于实施例7中公开的实验经由流式细胞术所测定的。或者，特异性地结合由抗体IgG RW01结合的CD133表位和/或由抗体IgG RW03结合的CD133表位的CD133结合剂将部分或完全抑制抗体IgG RW01和/或抗体IgG RW03与变性CD133的结合，所述变性CD133是例如在全细胞溶解产物的变性蛋白质的还原条件下电泳分离后电印迹到膜(例如硝酸纤维素或PVDF)上的变性CD133(参见例如实施例6)，其中所述膜已经与饱和浓度的这种结合剂一起预孵育。
在另一个实施方案中，特异性地结合由抗体IgG RW01结合的CD133表位和/或由抗体IgG RW03结合的CD133表位的CD133结合剂是与包含抗体可变区RW01的Fab和/或包含抗体可变区RW03的Fab竞争结合至表达CD133的细胞的表面的单价CD133结合剂(例如Fab或scFv)。在一个实施方案中，所述CD133表位是人CD133表位。例如，特异性地结合由抗体IgGRW01结合的CD133表位和/或由抗体IgG RW03结合的CD133表位的单价CD133结合剂将部分或完全抑制包含抗体可变区RW01的Fab和/或包含抗体可变区RW03的Fab与同饱和浓度的这种结合剂一起预孵育的表达CD133的细胞的结合，如类似于实施例7中公开的实验经由流式细胞术所测定。或者，所述单价剂将部分或完全抑制包含抗体可变区RW01的Fab和/或包含抗体可变区RW03的Fab与变性CD133的结合，所述变性CD133是例如在全细胞溶解产物的变性蛋白质的还原条件下电泳分离后电印迹到膜(例如硝酸纤维素或PVDF)上的变性CD133(参见例如实施例6)，其中在电印迹后将所述膜与饱和浓度的这种结合剂一起预孵育。在一个实施方案中，所述CD133是人CD133。
检测剂
本文所述的结合剂任选地用检测剂标记。如本文所用，术语“检测剂”是指允许检测和/或定量结合剂的存在的任何剂。检测剂的实例包括但不限于肽标签、酶(例如，HRP或碱性磷酸酶)、蛋白质(例如藻红蛋白或生物素/链霉抗生物素蛋白)、磁性颗粒、发色团、荧光分子、化学发光分子、放射性标记和染料。可以用检测剂直接或间接标记结合剂。
人源化抗体
编码本文公开的非人(例如鼠)CD133结合剂的核苷酸序列可例如通过取代人重链和轻链恒定结构域的编码序列代替同源非人(例如鼠)序列(参见例如美国专利号4,816,567；和Morrison，1994)或通过将非免疫球蛋白多肽的编码序列的全部或一部分共价连接至免疫球蛋白编码序列来进行修饰。这种非免疫球蛋白多肽可取代为本文公开的抗体的恒定结构域，或者可取代为本文公开的抗体的一个抗原结合位点的可变结构域以产生嵌合二价抗体。
本文所述的包含Fc区的非人结合剂(例如非人抗体)可以是人源化的，以使其更好地耐受用于人。例如，框架区中的氨基酸残基可通过用氨基酸残基和人框架区置换它们而人源化，只要所述置换不损害结合剂结合至CD133的能力即可(参见例如Vincke等人，2008)。
应理解，可使用本领域熟知的技术将鼠抗体或来自其他物种的抗体人源化或灵长类化(参见例如Winter和Harris，1993；和Wright等人，1992)。可通过重组DNA技术工程改造抗体以用相应的人序列取代CH1、CH2、CH3、铰链结构域和/或框架结构域(参见例如WO92102190和美国专利号5,530,101；5,585,089；5,693,761；5,693,792；5,714,350；以及5,777,085)。此外，Ig cDNA用于构建嵌合免疫球蛋白基因的用途是本领域已知的(参见例如Liu等人，1987a；和Liu等人，1987b)。从产生抗体的杂交瘤或其他细胞中分离mRNA并用于产生cDNA。目标cDNA可使用特定引物通过聚合酶链反应进行扩增(美国专利号4,683,195和4,683,202)。或者，制备文库并进行筛选以分离目标序列。接着使编码抗体的可变区的DNA序列与人恒定区序列融合。人C区基因可容易地从已知克隆获得。同种型的选择将由所需的效应功能来指导，所述效应功能如补体固定或抗体依赖性细胞毒性中的活性。可使用人轻链恒定区κ或λ中的任一者。接着可通过常规方法表达嵌合、人源化抗体。
如上所述，所述CD133结合剂可以是人抗体。完全人抗体是抗体分子，其中轻链和重链两者的完整序列(包括CDR)来自人基因。此类抗体在本文中称为“人抗体”或“完全人抗体”。可通过使用三源杂交瘤技术；人B细胞杂交瘤技术(参见例如Kozbor等人，1983)和用于产生人单克隆抗体的EBV杂交瘤技术(参见例如Cole等人，1985)来制备人单克隆抗体。可使用人单克隆抗体，并且人单克隆抗体可通过使用人杂交瘤(参见例如Cote等人，1983)或通过在体外用埃-巴二氏病毒(Epstein Barr Virus)转化人B细胞来产生(参见例如Cole等人，1985)。
包含结合CD133的抗体可变区的结合CD133的多肽(如结合CD133的scFv或结合CD133的Fab)可例如使用仅含有人序列的抗体的噬菌体展示方法来开发。此类方法在本领域中是熟知的(参见例如WO92/01047和美国专利号6,521,404，其以引用的方式特此并入)。在这种方法中，使用CD133或其片段的天然或重组来源筛选携带轻链和重链的随机对的噬菌体的组合文库。在另一种方法中，抗体或片段可通过一种方法产生，其中该方法的至少一个步骤包括用CD133蛋白免疫转基因的非人动物。在这种方法中，这种异种/非人动物的一些内源性重链和/或κ轻链基因座已经失效，并且不能产生响应于抗原产生编码免疫球蛋白的基因所需的重排。此外，至少一个人重链基因座和至少一个人轻链基因座已稳定地转染到动物体内。因此，响应于施用的抗原，人基因座重排以提供对抗原具有免疫特异性的编码人可变区的基因。因此，在免疫后，动物产生分泌完全人免疫球蛋白的B细胞。
本领域熟知多种技术用于产生异种/非人动物(参见例如美国专利号6,075,181和6,150,584，其以引用的方式特此并入；Green等人，1994，其以引用的方式特此整体并入；美国专利号6,162,963、6,150,584、6,114,598、6,075,181和5,939,598；日本专利号3 068180 B2、3 068 506 B2和3 068 507 B2；欧洲专利号EP 0 463 151 B1；以及国际专利申请号WO 94/02602、WO 96/34096、WO 98/24893和WO 00/76310)。
或者，可使用“微基因座”方法，其中通过包含来自Ig基因座的碎片(单独基因)来模拟外源性Ig基因座(参见例如美国专利号5,545,806、5,545,807、5,591,669、5,612,205、5,625,825、5,625,126、5,633,425、5,643,763、5,661,016、5,721,367、5,770,429、5,789,215、5,789,650、5,814,318、5,877,397、5,874,299、6,023,010和6,255,458；欧洲专利号0546 073 B1；以及国际专利申请号WO 92/03918、WO 92/22645、WO 92/22647、WO 92/22670、WO 93/12227、WO 94/00569、WO 94/25585、WO 96/14436、WO 97/13852和WO 98/24884)。因此，一种或多种VH基因、一种或多种DH基因、一种或多种JH基因、mu恒定区以及第二恒定区(优选地是γ恒定区)形成在用于插入动物中的构建体。
已经证明了从小鼠中产生人抗体，其中通过微细胞融合，已经引入大片染色体或整个染色体(参见例如欧洲专利申请号773 288和843961)。
免疫缀合物
本公开还包括免疫缀合物，其包含(1)CD133结合剂，任选地是抗体或抗体抗原结合片段，所述CD133结合剂已连接至(2)效应剂。如本文所用，术语“免疫缀合物”涵盖本公开的不包含抗体可变区的CD133结合剂，并且进一步涵盖本文公开的包含抗体可变区的CD133结合剂。
在一个实施方案中，效应剂是标记，其可直接或间接地产生可检测的信号。标记的实例包括放射性同位素(即放射性缀合物)。
在另一个实施方案中，所述效应剂是治疗剂。治疗剂包括但不限于癌症治疗剂/抗肿瘤剂。在另一个实施方案中，治疗剂是毒素。
术语“癌症治疗剂”或“抗肿瘤剂”在本文中用于指具有降低癌细胞中的CD133水平的功能性质的剂，所述癌细胞如胰腺癌细胞、结肠直肠癌细胞、乳腺癌细胞、结肠癌细胞、胃癌细胞、前列腺癌细胞、肝癌细胞、肺癌细胞、黑素瘤细胞、脑癌细胞(任选地成胶质细胞瘤或成神经管细胞瘤细胞)和头颈部鳞状细胞癌细胞。
毒素可以是细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素或其片段。可使用的毒素及其片段包括白喉A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌)、蓖麻毒素A链、相思豆毒素A链、蒴莲根毒素A链、α-八叠球菌、油桐蛋白、石竹素蛋白、美洲商陆蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜抑制剂、麻风树毒蛋白、巴豆毒素、肥皂草抑制剂、白树毒素、丝裂吉菌素(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)、伊诺霉素(enomycin)和单端孢霉烯(tricothecene)。
本公开的放射性缀合的CD133结合剂(如本公开的抗体)可用于将放射性核素结合至表达CD133的细胞，例如以使细胞可视化或作为细胞的细胞毒性处理。多种放射性核素可用于产生放射缀合的抗体。实例包括212Bi、131I、131In、90Y和186Re。
本领域普通技术人员将认识到，多种可能的部分可与本公开的多肽CD133结合剂偶联，如包含抗体可变区的那些部分(例如包含结合CD133的抗体可变区的抗体或抗体片段)(参见，例如，Cruse和Lewis，1989，其全部内容以引用的方式并入本文)。偶联可通过将某一部分和本公开的CD133结合剂结合的任何化学反应来完成，只要这些保留它们用于其预期用途的各自的活性/特征即可。这种键联可包括许多化学机制，例如共价结合、亲和结合、嵌入、配位结合和络合。
例如，本公开的多肽CD133结合剂的缀合物(如抗体与效应剂)可使用多种双官能蛋白偶联剂来制备，所述双官能蛋白偶联剂诸如N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫醇)丙酸酯(SPDP)、亚氨基硫烷(IT)、亚氨酸酯的双官能衍生物(诸如二亚胺代己二酸二甲酯HCL)、活性酯(诸如辛二酸二琥珀酰亚胺基酯)、醛(诸如戊二醛)、双-叠氮基化合物(诸如双(对叠氮基苯甲酰基)己二胺)、双-重氮衍生物(诸如双-(对重氮苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(诸如甲苯2,6-二异氰酸酯)和双-活性氟化合物(诸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。例如，可如Vitetta等人,Science 238:1098(1987)中所述的那样制备蓖麻毒素免疫毒素。
碳14标记的1-异硫氰基苄基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于使放射性核素与抗体缀合的示例性螯合剂(参见例如W094/11026)。
药物组合物
本公开还提供药物组合物，其包含本文所述的CD133结合剂或免疫缀合物或放射性缀合物作为活性成分和药学上可接受的载体。
在一些实施方案中，术语“药学上可接受的载体”意图包括与药物施用相容的任何和所有的溶剂、分散介质、包衣、等渗剂以及吸收延迟剂等。本领域中的标准参考文本Remington’s Pharmaceutical Sciences的最新版本中描述了合适的载体，该文献以引用的方式并入本文中。此类载体或稀释剂的任选实例包括但不限于水、盐水、林格氏溶液、右旋糖溶液以及5％人血清白蛋白。
配制药物组合物以与其预定施用路径相容。施用途径的实例包括胃肠外，例如静脉内、真皮内、皮下、经口(例如，吸入)、经皮(局部)、经粘膜和经直肠施用。
在一个实施方案中，所述活性成分是用将保护所述活性成分免于从身体迅速消除的载体制备，如持续/控制释放制剂，包括植入物和微囊化递送系统。可使用可生物降解、生物相容的聚合物，诸如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯以及聚乳酸。用于制备这种制剂的方法将为本领域技术人员显而易见的。
在一个实施方案中，口服和胃肠外组合物以剂量单位形式配制以便于施用和剂量均匀性。如本文使用的剂量单位形式是指适合作为用于待治疗的受试者的单一剂量的物理上离散单位；各单位含有经计算在与所需药物载体缔合的情况下可产生所需治疗作用的预定量的活性成分。剂量单位形式的规格由如下决定并且直接依赖于：活性成分的独特特征和待实现的具体治疗效果，和本领域中制备用于治疗个体的这种活性成分的固有局限性。
所述制剂还可含有多于一种如为所治疗的具体适应症所必需的活性成分，任选地为具有不会不利地影响彼此的互补活性的那些。或者/此外，所述药物组合物可包含增强其功能的剂，例如像细胞毒剂、细胞因子、化学治疗剂或生长抑制剂。此类分子以对于预期目的有效的量适当地联合存在。
方法和用途
本公开还提供了与本文所述的CD133结合剂有关的用途和方法。
检测表达CD133的细胞
本公开的CD133结合剂、免疫缀合物和药物组合物可用于检测表达CD133的细胞。因此，本公开提供了本文所述的CD133结合剂用于靶向、结合和/或检测表达CD133的细胞的用途。任选地，所述细胞是癌细胞，包括但不限于胰腺癌细胞、结肠直肠癌细胞、乳腺癌细胞、结肠癌细胞、胃癌细胞、前列腺癌细胞、肝癌细胞、肺癌细胞、黑素瘤细胞、脑癌细胞以及头颈部鳞状细胞癌细胞。
在一个实施方案中，本文所述的CD133结合剂、免疫缀合物和药物组合物可用于靶向、结合和/或检测表达CD133的细胞的细胞表面表达。
在另一个实施方案中，本文所述的CD133结合剂、免疫缀合物和药物组合物可用于靶向、结合、检测和/或定位细胞内CD133。
在另一个实施方案中，本文所述的CD133结合剂、免疫缀合物和药物组合物可用于靶向、结合和/或检测细胞溶解产物中的CD133。
在另一个实施方案中，本文所述的CD133结合剂、免疫缀合物和药物组合物可用于检测和/或定量样品中(任选地表达CD133的细胞中)CD133的表达水平。在一个实施方案中，CD133结合剂、免疫缀合物和药物组合物用于检测和/或定量细胞CD133水平。在另一个实施方案中，所述CD133结合剂、免疫缀合物和药物组合物可用于检测和/或定量细胞表面CD133水平。
本公开的CD133结合剂可用于检测/定量天然/细胞表面表达的以及变性的CD133。CD133的过表达通常与癌性表型相关。例如，使用本公开的CD133结合剂的变性全细胞溶解产物中CD133蛋白水平的蛋白质印迹检测可用于表征/证实治疗降低表达CD133的癌细胞的转移能力的能力，因为降低的总体细胞CD133蛋白水平已经显示与细胞的转移能力降低相关(参见例如Rappa等人，2008)。
通常，使用结合剂检测分析物，如细胞内、总细胞或表面表达的CD133蛋白是本领域熟知的，并且可通过应用多种方法来实现。这些方法通常是基于标记或标记物，如放射性、荧光、生物和酶标签的检测。方法的实例包括但不限于蛋白质印迹、酶联免疫吸附测定(ELISA)、免疫荧光、免疫组织化学和流式细胞术。
本公开的CD133结合剂、免疫缀合物和药物组合物还可用于降低和/或消除细胞中CD133蛋白的水平或量。任选地，所述细胞是CD133阳性癌细胞，包括但不限于胰腺癌细胞、结肠直肠癌细胞、乳腺癌细胞、结肠癌细胞、胃癌细胞、前列腺癌细胞、肝癌细胞、胰腺癌细胞、肺癌细胞、黑素瘤细胞、脑癌细胞(任选的成胶质细胞瘤或成神经管细胞瘤细胞)以及头颈部鳞状细胞癌细胞。癌细胞中总细胞CD133蛋白水平的降低可用于降低其转移能力(参见例如Rappa等人，2008)。其水平降低的CD133蛋白任选地是细胞表面表达的和/或细胞内CD133。表达CD133的细胞中的CD133蛋白任选地被减少至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％；或100％。
使表达CD133的细胞靶向免疫细胞
此外，本公开的CD133结合剂、免疫缀合物和药物组合物可用于接合、靶向和/或结合免疫系统的细胞。
例如，在上述一个实施方案中，CD133结合剂是双特异性抗体，其中结合特异性之一是针对CD133，并且另一种结合特异性是针对在免疫细胞如T细胞、巨噬细胞或NK细胞上表达的抗原。如上所述，靶向T细胞的双特异性抗体的一个实例是双特异性T细胞衔接器(BiTE)。
在上述另一个实施方案中，CD133结合剂是CD133结合嵌合抗原受体(CAR)，其包含本公开的CD133结合剂，如结合CD133的scFv作为其抗原结合/靶向结构域。
合适的CAR的构建及其用于靶向表达抗原的细胞的用途(在本领域通常称为“CART细胞疗法”)是本领域熟知的(参见例如Maus和June，2016；Abate-Daga和Davila，2016；Resetca等人，2016；以及Wang和Rivière，2016)。因此，本文所述的双特异性抗体和嵌合抗原受体可用于使免疫效应细胞靶向表达CD133的细胞(CD133+细胞)。
还提供了用于靶向CD133+细胞的方法，所述方法包括将CD133+细胞暴露于表达本公开的CAR的免疫效应细胞，或暴露于本公开的双特异性抗体和由双特异性抗体特异性地结合的免疫效应细胞的组合。
通过这些方法使免疫效应细胞靶向CD133+细胞可用于消除CD133+癌细胞的表型和/或将CD133+癌细胞的表型从癌性表型转向较低癌性或非癌性表型。另外，使免疫效应细胞靶向CD133+细胞可用于治疗表达或过表达CD133的疾病，如癌症。
诊断方法
本文公开的CD133结合剂可用于检测/定量患者样品或健康个体的对照样品中的CD133，并且因此可以是有用的诊断剂。例如，本公开的结合剂可用于检测/定量CD133和/或细胞表面表达的CD133的总细胞表达。如本文所用，术语“诊断”包括筛选、分层、监测等。
在一个实施方案中，所述CD133结合剂用于检测表达CD133的细胞，任选地是癌细胞，如胰腺癌细胞、结肠直肠癌细胞、乳腺癌细胞、结肠癌细胞、胃癌细胞、前列腺癌细胞、肝癌细胞、肺癌细胞、黑素瘤细胞、脑癌细胞和头颈部鳞状细胞癌细胞。
在另一个实施方案中，所述CD133结合剂用于检测/定量CD133的细胞表面表达。在另一个实施方案中，所述CD133结合剂用于检测/定量CD133的细胞内表达。在另一个实施方案中，本文所述的CD133结合剂可用于检测/定量样品中CD133的表达。
例如，本公开的CD133结合剂(如本公开的抗体和抗体片段)可用于实施各种测定中的任一种，例如免疫荧光、流式细胞术或ELISA，以检测/定量样品中的CD133水平。
在一个实施方案中，所述样品是患者样品，如来自癌症患者的癌症样品。或者，样品可以是来自健康个体的对照样品。样品的实施方案包括但不限于培养的细胞、培养的细胞上清液、细胞溶解产物、血清、血浆、生物流体或生物组织的样品。在其他实施方案中，所述样品获自癌症。在某些实施方案中，所述样品是活检样品。
癌症的治疗
已证明CD133在各种癌症中发挥重要作用。例如，CD133已被鉴定为脑肿瘤中癌症干细胞(CSC)的标志物(Singh等人，2003)，并且已经证明来自脑肿瘤级分的少至100个CD133+细胞足以在NOD/SCID小鼠中产生肿瘤(Singh等人，2004)。另外，与CD133阴性(CD133-)细胞相比，已显示CD133+神经胶质瘤细胞以DNA检查点依赖性方式具有增加的对辐射的抗性(Bao等人，2006)。已经使用抗CD133抗体分离了胰腺CSC，并且已经证明这些细胞是致瘤性的并且对标准化学疗法具有高度抗性(Hermann等人，2007)。类似地，还显示胰腺癌细胞中CD133表达的增加与更具攻击性的性质相关，包括迁移和侵袭增加以及肿瘤攻击性增强(Moriyama等人，2010)。已经鉴定了来自前列腺癌组织的干细胞样细胞(Collins，2005)，并且已经证明从前列腺癌组织和永生化前列腺癌细胞系中分离的CD133+细胞表现出干细胞特征(Miki等人，2007；Wei等人，2007)，然而，其他研究未能证实这一点(Missol-Kolka等人，2010)，并且没有报告其他归属于像DU145细胞系的胰腺癌细胞系的干细胞特征(Pfeiffer和Schalken，2010)。CD133用作CSC标志物的另一种癌症类型是结肠直肠癌。单独的团体已经将CD133鉴定为结肠癌中CSC的标志物(O'Brien等人，2006；Ricci-Vitiani等人，2006)。已经证明，CD133+细胞容易在SCID小鼠中重演肿瘤(Ricci-Vitiani等人，2006)，并且与未分级的肿瘤细胞相比，存在结肠癌起始细胞纯化的CD133+细胞的富集(O'Brien等人，2006)。已经证明来自结肠转移的CD133+和CD133-阴性细胞能够在NOD/SCID小鼠中形成结肠球并重演肿瘤(Shmelkov，2004)。此外，一些团体得出结论，CD133与较差的临床预后、疾病进展和转移相关，并且CD133蛋白可用作结直肠癌患者的独立预后标志物(Horst等人，2009)。然而，其他团体未能在结肠癌患者中发现CD133与疾病进展或存活之间的关系，而是发现蛋白质表达与肿瘤分期之间的关系(Lugli等人，2010)。
已经证实，转移性黑素瘤细胞系FEMX-I中CD133的下调导致细胞生长减慢、细胞运动性降低、干细胞生长条件下形成球的能力降低以及肿瘤异种移植物的转移能力降低(Rappa等人，2008)。已经显示，与单甲基澳瑞他汀F缀合的抗CD133抗体AC133在体外抑制肝癌细胞和胃癌细胞的生长(Smith等人，2008)，进一步证明了在AC133存在下与皂草素缀合的第二抗体对FEMX-I细胞有毒性，但不控制人成纤维细胞(Rappa等人，2008)。另外，已显示直接与皂草素缀合的AC133对于FEMX-I细胞比对CD133表达被敲低的FEMX-I细胞更有效(Rappa等人，2008)。观察到在CD133被敲低的细胞中，变得上调的基因编码wnt抑制剂(Mak等人，2012b)。
此外，许多研究涉及CD133+脑肿瘤起始细胞(BTIC)作为成胶质细胞瘤(GBM)中化学和放射抗性的驱动因素。最近还证明，CD133驱动的基因标记可预测较差的总体存活率(Venugopal等人，2015)，并且靶向CD133+治疗难治性细胞可能是阻断GBM复发的有效策略。
因此，这些结果为靶向CD133作为有效的治疗策略和有效的诊断策略提供了支持。此外，本发明人已经描述了基于CAR T细胞的策略，其中CD133+GBM细胞被特异性地靶向并杀死。本发明人还表明，将人多克隆T细胞重定向至CD133+GBM细胞的BiTE抗体诱导有效的抗肿瘤应答。
因此，本公开的CD133结合剂和药物组合物可用于治疗或预防癌症，如转移性黑素瘤、脑癌、前列腺癌、胰腺癌和/或结肠癌/结肠直肠癌。在一个实施方案中，所述癌症是成胶质细胞瘤。在另一个实施方案中，所述癌症是成神经管细胞瘤。
在另一个实施方案中，所述癌症是CD133阳性癌症(也称为表达CD133的癌症)。在一个实施方案中，CD133阳性癌被定义为具有大于80％、85％、90％、95％或99％CD133阳性细胞(即，表达CD133的细胞)的癌症。表达CD133的细胞的百分比可例如在肿瘤细胞培养物中测定。因此，在特定实施方案中，所述癌症是CD133阳性成胶质细胞瘤或CD133阳性成神经管细胞瘤。在另一个实施方案中，所述癌症是可检测地表达CD133的成胶质细胞瘤或可检测地表达CD133的成神经管细胞瘤。
在一个实施方案中，本文所述的CD133结合剂和药物组合物在用于治疗或预防癌症的方法中使用，所述方法包括向有需要的动物或细胞施用有效量的本文公开的CD133结合剂或药物组合物，任选地，其中所述癌症是转移性黑素瘤、脑癌、前列腺癌、胰腺癌和/或结肠癌。在一个实施方案中，所述癌症是成胶质细胞瘤或成神经管细胞瘤。
在另一个实施方案中，有效量的本文公开的CD133结合剂或药物组合物用于治疗或预防癌症，任选地其中所述癌症是转移性黑素瘤、脑癌、前列腺癌、胰腺癌和/或结肠癌。在另一个实施方案中，本文公开的CD133结合剂或药物组合物用于制备用于治疗或预防癌症的药物，任选地其中所述癌症是转移性黑素瘤、脑癌、前列腺癌、胰腺癌和/或结肠癌。在一个实施方案中，所述癌症是成胶质细胞瘤或成神经管细胞瘤。
在另一个实施方案中，有效量的本文公开的CD133结合剂或药物组合物用于治疗或预防癌症，任选地其中所述癌症是转移性黑素瘤、脑癌、前列腺癌、胰腺癌和/或结肠癌。在一个实施方案中，所述癌症是成胶质细胞瘤或成神经管细胞瘤。
如上所述，本公开提供免疫缀合物，其包含(1)CD133结合剂和(2)效应剂，其中所述效应剂任选地是毒素或抗肿瘤剂。
因此，本公开提供了使用本文公开的免疫缀合物治疗或预防癌症的方法，所述方法包括向有需要的动物或细胞施用有效量的本文公开的免疫缀合物，任选地其中所述癌症是转移性黑素瘤、脑癌、前列腺癌、胰腺癌和/或结肠癌。在一个实施方案中，所述癌症是成胶质细胞瘤或成神经管细胞瘤。
在一个实施方案中，有效量的本文公开的免疫缀合物用于治疗或预防癌症，任选地其中所述癌症是转移性黑素瘤、脑癌、前列腺癌、胰腺癌和/或结肠癌。在另一个实施方案中，本文公开的免疫缀合物用于制备用于治疗或预防癌症的药物，任选地其中所述癌症是转移性黑素瘤、脑癌、前列腺癌、胰腺癌和/或结肠癌。在一个实施方案中，所述癌症是成胶质细胞瘤或成神经管细胞瘤。
本公开还提供了靶向表达CD133的细胞的CAR和表达所述CAR的T细胞。因此，在另一个实施方案中，本公开提供了使用本文公开的表达CAR的T细胞治疗或预防癌症的方法，所述方法包括向有需要的动物或细胞施用有效量的本文公开的表达CAR的T细胞，任选地其中所述癌症是转移性黑素瘤、脑癌、前列腺癌、胰腺癌和/或结肠癌。在一个实施方案中，所述癌症是成胶质细胞瘤或成神经管细胞瘤。
在一个实施方案中，有效量的本文公开的表达CAR的T细胞用于治疗或预防癌症，任选地其中所述癌症是转移性黑素瘤、脑癌、前列腺癌、胰腺癌和/或结肠癌。在另一个实施方案中，本文公开的表达CAR的T细胞用于制备用于治疗或预防癌症的药物，任选地其中所述癌症是转移性黑素瘤、脑癌、前列腺癌、胰腺癌和/或结肠癌。在一个实施方案中，所述癌症是成胶质细胞瘤或成神经管细胞瘤。
如本文所用，术语“受试者”和“动物”包括动物界的所有成员，在一个实施方案中，受试者是哺乳动物。在另一实施方案中，受试者是人类。在一个实施方案中，受试者是患有与表达CD133的细胞相关的疾病(如癌症)的患者。
术语“细胞”包括单个细胞以及多个细胞或细胞群体。
本公开的CD133结合剂、免疫缀合物或药物组合物的有效量通常涉及实现治疗目标所需的量。如上所述，这可以是CD133结合剂与CD133之间的结合相互作用，其在某些情况下干扰CD133的功能。
需要施用的量还将取决于CD133结合剂对CD133的结合亲和力，并且还将取决于施用的CD133结合剂从向其施用的受试者的自由体积中消减的速率。本发公开的CD133结合剂、免疫缀合物或药物组合物的治疗有效剂量的共同范围可以是，作为非限制性实例，约0.1mg kg体重至约50mg/kg体重。常见的给药频率可在例如每天两次至每周一次的范围内。
与用于诊断或治疗特定癌症的任何已知方法相关联地确定治疗的有效性。减轻癌症的一种或多种症状表明所述抗体赋予临床益处。
如本文所用，“治疗癌症”包括但不限于逆转、减轻或抑制癌症的进展或与癌症相关的症状或病状。“预防癌症”包括预防癌症的发生或复发。“治疗癌症”还包括延长受试者的存活。存活任选地在不用如本文所述的CD133结合剂、免疫缀合物或药物组合物治疗的情况下在将预期的存活期内被延长至少1个月、2个月、3个月、6个月或12个月，或至少2、3、4、5或10年。“治疗癌症”还包括减少肿瘤质量和/或减少肿瘤负荷(例如，脑肿瘤质量和/或脑肿瘤负荷)。任选地，在用如本文所述的CD133结合剂、免疫缀合物或药物组合物治疗后，肿瘤质量和/或肿瘤负荷被降低至少5％、10％、25％、50％、75％或100％。在其他实施方案中，“治疗癌症”包括降低肿瘤的攻击性、分级和/或侵袭性。肿瘤任选地是新形成的肿瘤或在治疗时已经存在的肿瘤。
在一个实施方案中，活性成分可与至少一种另外的治疗剂组合使用。因此，本申请提供了使用本文公开的CD133结合剂、免疫缀合物或药物组合物与至少一种另外的治疗剂组合来预防或治疗癌症的方法。可在施用活性成分之前、与施用活性成分重叠、同时和/或之后施用另外的治疗剂。当同时施用时，CD133结合剂、免疫缀合物或药物组合物和另外的治疗剂可以单一制剂或分开的制剂施用，并且如果分开施用，则任选地通过不同的施用模式施用。一种或多种CD133结合剂、免疫缀合物或药物组合物与一种或多种其他治疗剂的组合可协同作用以对抗癌症。
另外的治疗剂的实施方案包括另外的CD133结合剂、另外的CD133结合免疫缀合物、另外的CD133结合药物组合物、细胞因子、生长因子抑制剂、免疫抑制剂、抗炎剂、代谢抑制剂、酶抑制剂、抗肿瘤剂、细胞毒性剂和/或细胞抑制剂。此类组合疗法可有利地利用较低剂量的所施用活性成分，由此避免与单一疗法相关的可能毒性或并发症。
筛选测定
本公开还提供了用于鉴定调节剂的方法(在本文中也称为“筛选测定法”)，所述调节剂即调节或以其他方式干扰本文公开的蛋白质与CD133的结合的测试剂(例如肽、肽模拟物、小分子或其他药物)。
所述测试剂可使用本领域中已知的组合文库方法中的多种方法中的任一种来获得，包括：生物文库、空间可寻址平行固相或液相文库、需要去卷积的合成文库方法、“一珠一化合物(one-bead one-compound)”文库方法以及使用亲合色谱法选择的合成文库方法(参见，例如Lam，1997)。
以上公开内容总体上描述了本申请。通过参考以下具体实施例可获得更完整的理解。这些实施例仅出于说明的目的描述，并且不意图限制本公开的范围。考虑形式的变化和等效物的取代，因为情况可能暗示或使得有利。尽管本文已采用特定术语，但此类术语意图处于描述性意义而非出于限制的目的。
以下非限制性实施例说明本公开：
实施例
实施例1：细胞选择和测序
为了尝试发现能够特异性结合CD133的新型抗体，使用“Cellectseq”方法筛选了两个噬菌体展示文库，文库F和文库G的细胞表面CD133结合物(已经在例如美国专利申请13/629,520中描述了Cellectseq方法、文库F和文库G)。简言之，文库F是在轻链互补决定区(CDR)3和所有三个重链CDR中具有多样性的Fab文库，并且文库G是在所有六个CDR中具有多样性的scFv文库。用于选择的细胞是HEK293细胞，所述细胞被工程改造以过表达CD133(GenBank登录号O43490)用于阳性选择，并且亲本HEK293细胞用于阴性选择。在四轮阳性和阴性选择后，对每个文库进行四轮输出噬菌体(10E-1至10E-3)的连续稀释，并用于感染XL1-蓝细胞。将感染的细胞接种以分离单个菌落，以用于基于克隆细胞的ELISA来用于分离CD133特异性结合物。与HEK293-CD133细胞结合并产生比与HEK293细胞的背景结合高至少1.5倍的ELISA信号的克隆被分类为CD133特异性结合物。通过用M13标记的测序引物从克隆DNA扩增抗体可变(VL和VH)结构域进行测序，并通过Illumina测序对扩增的序列进行测序。在HEK293-CD133细胞中表达的人CD133的全长氨基酸序列示于表1中。CD133的三个细胞外结构域的氨基酸序列坐标如下：Gly20-Gly108、Ala179-Tyr433和Gly508-Asn792。跨越所有三个细胞外结构域的区段的氨基酸序列坐标是Gly20-Asn792。对应于全长序列的Met1-Ser19的信号序列不存在于成熟的细胞表面表达的CD133蛋白中。
表1.人CD133的氨基酸序列(GenBank登录O43490)。
实施例2：能够特异性地结合人CD133的新型抗体可变区RW01和RW03的发现和表征
细胞选择和测序数据：
使用如实施例1中描述的Cellectseq方法进行CD133结合噬菌体-Fab或噬菌体-scFv的基于细胞的选择。在从文库F输出中选择并进行ELISA以确定其CD133结合特异性的94个噬菌体-Fab克隆中，发现77个克隆与HEK293-CD133细胞结合的水平比与对照HEK293细胞高至少1.5倍(图1A)。相比之下，选自文库G输出的克隆中没有一个表现出这种CD133结合特异性。通过使用M13标记的测序引物扩增编码Fab可变区(VL和VH区)的DNA，对选自文库F的94个克隆进行测序。经由Illumina测序对文库F和文库G第3轮和第4轮阳性和阴性输出进行测序，以鉴定富含阳性选择输出集合的结合物。测序结果表明，94个克隆中的91个由各自具有3个独特的抗体可变区之一的克隆组成，如由克隆“噬菌体-Fab RW03”、“噬菌体-FabC12”和“噬菌体-Fab F5”所示。具体地，在94个克隆中，89个克隆共享相同的可变区序列，2个克隆具有独特的可变区序列，并且未获得3个克隆的序列。
图1B示出通过包含“抗体可变区RW03”的噬菌体-Fab RW03、噬菌体-Fab C12和噬菌体-Fab F5与HEK293-CD133和HEK293细胞结合的代表性的基于细胞的ELISA结果。仅噬菌体-Fab RW03显示与HEK293-CD133细胞对比HEK293细胞的优先结合至少1.5倍。将噬菌体-Fab RW03、噬菌体-Fab C12和噬菌体-Fab F5的Fab编码DNA序列各自克隆到用于蛋白质表达的IPTG诱导型载体中，并且将表达的Fab(分别“Fab RW03”、“Fab C12”和“Fab F5”中)进行纯化以用于经由免疫荧光(IF)测定进行测试，其结果显示在图2中。IF测定显示FabRW03展示与HEK293-CD133细胞的高度特异性结合，与HEK293细胞的背景结合非常少，而发现FabC12和Fab F5非特异性地结合至HEK293-CD133细胞和HEK293细胞两者。通过基于细胞的ELISA还证实了Fab RW03与HEK293-CD133细胞的特异性结合(图3A)。此外，还发现Fab RW03与Caco-2细胞结合，Caco-2细胞是已知表达CD133的结肠直肠癌细胞系(图3B)。这些结果与Illumina测序结果一致，其中噬菌体-Fab克隆C12和噬菌体-Fab克隆F5的可变区DNA序列出现在阳性以及阴性选择输出集合中，而噬菌体-Fab RW03的可变区DNA序列仅出现在阳性选择集合中(数据未示出)。此外，噬菌体Fab RW03DNA序列是第3轮和第4轮输出集合两者中最丰富的序列，这也与基于细胞的ELISA的结果一致，其中94％的噬菌体-Fab结合物的DNA序列是噬菌体-Fab RW03的那些序列。
除了确定编码来自文库F的结合CD133的噬菌体-Fab的DNA序列之外，还分析了来自文库G选择输出集合的Illumina测序数据以鉴定富集的结合物(数据未示出)。经由PCR扩增拯救编码12个选定的噬菌体-scFv克隆的可变区的DNA，并用于产生表达12种IgG的表达载体，所述12种IgG具有对应于12种选择的噬菌体-scFv克隆的可变区的可变区。在这12种IgG中，含有源自噬菌体-scFv克隆RW01的“抗体可变区RW01”的“IgG RW01”通过流式细胞术分析验证了与CD133+细胞的特异性结合。类似地，产生了具有对应于Fab RW03的抗体可变区的“抗体可变区RW03”的“IgG RW03”，并且进一步平行测试了IgG RW01和IgG RW03。
表2中示出IgG RW01和IgG RW03的轻链(hK)和重链以及抗体可变区RW01和RW03的重链可变结构域和轻链可变结构域的氨基酸序列，并且在表3中示出在IgG RW01中包含的抗体可变区RW01和在IgG RW03中包含的抗体可变区RW03的互补决定区(CDR)以及位置39、55和66位处的重链可变结构域残基的氨基酸序列。在表4中示出编码在IgG RW01中包含的抗体可变区RW01和包含在IgG RW03中的抗体可变区RW03的CDR以及位置39、55和66处的重链可变结构域残基的核苷酸序列。IgG RW01的轻链可变结构域的氨基酸序列对应于SEQ IDNO:2的Asp1至Lys106区段的氨基酸序列；IgG RW01的重链可变结构域的氨基酸序列对应于SEQ ID NO:3的Glu1至Thr120区段的氨基酸序列；IgG RW03的轻链可变结构域的氨基酸序列对应于SEQ ID NO:4的Asp1至Lys109区段的氨基酸序列；并且IgG RW03的重链可变结构域的氨基酸序列对应于SEQ ID NO:5的Glu1至Ser118区段的氨基酸序列。
表2.IgG RW01和IgG RW03的轻链(hK)和重链以及抗体可变区RW01和RW03的重链可变结构域和轻链可变结构域的氨基酸序列。
表3.抗体可变区RW01和抗体可变区RW03的CDR和重链可变结构域位置39、55和66处的FR残基的氨基酸序列。
表4.编码抗体可变区RW01和抗体可变区RW03的互补决定区(CDR)以及重链可变结构域位置39、55和66处的FR残基的核苷酸序列。
在表5中示出编码IgG RW01和IgG RW03的轻链(hK)和重链的DNA的核苷酸序列，以及抗体可变区RW01和RW03的重链和轻链可变结构域。
表5.编码IgG RW01和IgG RW03的轻链(hK)和重链的DNA的核苷酸序列，以及抗体可变区RW01和RW03的重链可变结构域和轻链可变结构域。
实施例3：IgG RW01和IgG RW03结合在细胞表面表达的CD133，分别具有大约个位数的纳摩尔和亚纳摩尔亲和力。
经由流式细胞术测试IgG RW01和IgG RW03抗体结合HEK293-CD133细胞的能力，之后估计每种抗体对细胞的半数最大结合浓度。具体地，将HEK293-CD133细胞与每种抗体的连续稀释液一起孵育，用抗人Fab'2第二抗体检测结合，并使用Sigma Plot绘图程序将数据拟合至最佳拟合线。图4示出IgG RW01的EC50曲线，其具有2.5nM的计算的EC 50；和IgGRW03的曲线，其具有0.5nM的计算的EC 50。
实施例4：IgG RW01和IgG RW03可用于特异性地结合并检测胰腺癌细胞和结肠直肠癌细胞中的细胞表面CD133，如经由流式细胞术分析所示。
经由流式细胞术评估IgG RW01和IgG RW03抗体与以下癌细胞系的结合：Caco-2，一种已知表达CD133的结肠癌细胞系；胰腺癌细胞系HPAC、PL45、RWP-1和SU8686；以及卵巢癌细胞系Ovcar-8。HEK293和HEK293-CD133细胞分别用作阴性对照和阳性对照。如图5所示，5μg/ml的两种抗体均结合在HEK293-CD133对照细胞表面、在Caco-2结直肠癌细胞表面和在HPAC、PL45和RWP-1胰腺癌细胞表面的CD133。在HPAC和PL45细胞中观察到双峰染色峰，并且更宽的峰，如对于工程改造的细胞系HEK293-CD133观察到的那些峰最可能是异质表达细胞群体的结果，与指示更均匀表达细胞群体的在RWP-1细胞情况下观察到的窄峰形成对比。
实施例5：IgG RW01和IgG RW03可用于特异性结合、检测和亚细胞定位细胞CD133，如经由免疫荧光分析所示
在免疫荧光测定中测试IgG RW01和IgG RW03抗体与细胞表达的CD133的结合(图6)。所述测定显示IgG RW01和IgG RW03结合至HEK293-CD133细胞(从而表明CD133的细胞亚定位)，但不结合至HEK293细胞。
实施例6：IgG RW01和IgG RW03各自可用于检测结肠直肠癌细胞的全细胞溶解产物中的变性CD133，如经由蛋白质印迹分析所示
制备Caco-2结肠直肠癌细胞的全细胞溶解产物，并经由蛋白质印迹测定分析IgGRW01和IgG RW03检测所述溶解产物中的变性CD133的能力。HEK293-CD133细胞和HEK293细胞分别用作阳性对照和阴性对照。图7示出IgG RW01和IgG RW03各自检测Caco-2细胞和HEK293-CD133细胞的溶解产物中的变性CD133(其均为CD133阳性)，但不检测HEK293细胞的溶解产物中的变性CD133。
实施例7：表位-Fab RW01和Fab RW03不分别与IgG RW03和IgG RW01竞争结合至CD133
进行实验以确定抗体可变区RW01和抗体可变区RW03是否彼此竞争结合至细胞表达的CD133。首先将细胞与25nM浓度的Fab RW01或Fab RW03一起孵育，并且分别添加IgGRW03或IgG RW01的系列稀释液，并使用针对人Fc的第二抗体检测IgG结合。每种抗体的结果可在图8(a)和(b)中观察到，并且表明IgG RW01可在饱和RW03Fab存在下结合细胞，并且IgGRW03可在RW01Fab存在下结合。
实施例8：用IgG RW01或IgG RW03处理可用于显著降低Caco-2结肠直肠癌细胞中的总细胞CD133蛋白水平
为了研究IgG RW01和IgG RW03对癌细胞中CD133蛋白水平的影响，将Caco-2结肠直肠癌细胞与IgG RW01或IgG RW03一起在37℃下孵育24小时，并使用AC133抗CD133抗体(Miltenyi Biotec)作为探针和抗人IgG(H+L)抗体(Jackson ImmunoResearch)作为阴性抗体对照通过蛋白质印迹分析全细胞溶解产物。如图9所示，与未处理和抗人IgG对照处理相比，用RW01IgG或RW03IgG处理显著降低了CD133蛋白水平。为了评估观察到的CD133蛋白水平降低对细胞中Wnt信号传导的影响，还分析了β-连环蛋白水平，然而在对照抗体处理的样品与IgG RW01或IgG RW03处理的样品之间未观察到β-连环蛋白蛋白质稳定性的差异。
实施例9：单链Fab RW03可用于使双特异性T细胞衔接器(BiTE)靶向CD133阳性细胞
构建载体用于表达四种新型抗CD133x抗CD3双特异性T细胞衔接器(BiTE；图10A)。四种BiTE中的每一种都并入抗CD3scFv，并且进一步并入抗CD133Fab RW03(基于Fab的BiTE)或并入Fab RW03的可变区的抗CD133单链Fab(scFab)(“scFab RW03”；基于scFab的BiTE)。在4种BiTE中的每一种中，Fab或scFab与scFv的VH结构域连接。4种BiTE包括两种基于Fab的变体，其中scFv与Fab的轻链(“BiTE#1”)或重链来源的部分(“BiTE#2”)连接。另外两种BiTE是基于scFab的变体，其中scFv类似地与scFab的重链来源的区段(“BiTE#3”)或轻链区段(“BiTE#4”)连接。
BiTE#1、BiTE#2、BiTE#3和BiTE#4的氨基酸序列示于表6中。
表6.BiTE#1、BiTE#2、BiTE#3和BiTE#4多肽的构型和氨基酸序列。
用BiTE表达载体瞬时转染的HEK293细胞能够容易地表达从转染子的还原和未还原的全细胞溶解产物表达和纯化的BiTE#1、BiTE#2、BiTE#3和BiTE#4，如经由蛋白质印迹分析所示(图10B)。
BiTE#1、BiTE#2、BiTE#3和BiTE#4具有结合至细胞表面CD133和CD3的能力
使用用BiTE染色HEK293-CD133细胞对比HEK293细胞的流式细胞术分析确定纯化的BiTE特异性地结合细胞表面CD133的能力。如图11A和图11B所示，BiTE#1、BiTE#2、BiTE#3和BiTE#4各自结合至HEK293-CD133细胞显著多于结合至HEK293细胞，即使浓度低至0.073-0.11微克/ml。在ELISA中进一步测试纯化的BiTE，以确定它们结合呈CD3ε/γ和CD3ε/δ形式的CD3的能力。如图12所示，纯化的BiTE结合至CD3以及阳性对照抗体(UCHT1、OKT3)。这些BiTE可结合至CD133和CD3两者。
实施例10：人CD133特异性嵌合抗原受体(CAR)修饰的T细胞靶向患者来源的成胶质细胞瘤脑肿瘤
单链可变片段(scFv)源自RW03(如上所述)，并产生第二代CAR。将具有myc标签的抗CD133scFv与人CD8前导序列、CD8a跨膜结构域、CD28和hCD3ζ(人CD3ζ)信号传导尾部一起以两种不同取向框内克隆到慢病毒构建体pCCL-ΔNGFR载体中：轻链-接头-重链(CD133CAR-LH)和重链-接头-轻链(CD133CAR-HL)。
在慢病毒制备后，用CD133CAR-LH和CD133CAR-VH构建体转导从PBMC分离的T细胞。在成功的T细胞工程改造后，使用流式细胞术分析ΔNGFR和myc标签的表达，以分别确认转导效率和抗CD133的表面表达。虽然在所有CAR T细胞(包括对照)中观察到ΔNGFR的表达，但发现在CAR、CD133CAR-HL和CD133CAR-LH的两种变型中c-myc标签的表达。此外，基于Presto Blue的杀伤测定用于测试CD133CAR选择性地结合和杀死CD133+GBM脑肿瘤起始细胞系(BTIC)的能力。CD133特异性CAR-T细胞对CD133+GBM具有细胞毒性。与GBM一起共培养CD133CAR-T细胞引发T细胞活化和增殖，从而验证了这种过继性T细胞治疗策略。
表达CD133特异性CAR的人T细胞通过克隆scFv进行工程改造，所述scFv包含抗体可变区RW03的重链可变结构域和轻链可变结构域(上文公开)、c-myc的短标记表位、来自鼠CD8的铰链区以及小鼠CD28和CD3ζ的跨膜和细胞质部分(图13)。将人CD133-CAR克隆到慢病毒转移载体pCCL-ΔNGFR中并包装为慢病毒。细胞外结构域中的c-myc标签用于验证CAR表达。ΔNGFR用作细胞表面标志物以用于跟踪和分选转导的细胞。
转导的T细胞由CD4阳性和CD8阳性细胞组成，两个亚群均表达CD133特异性CAR(图14)。在成功转导后，在所有CAR T细胞(包括对照)中观察到ΔNGFR(CD271)的表达，然而仅在CD133CAR-HL和CD133CAR-LH细胞中发现c-myc标签的表达增加(图15)。
将CD133特异性CAR-T细胞与GBM BT459一起孵育、染色并在18小时后分析T细胞活化标志物CD69和CD25的表面表达(图16)。CD4+(T辅助细胞)和CD84+(T细胞毒性)细胞两者均显示活化标志物的表面表达水平的上调。仅在存在CD133特异性CAR而非CAR-T对照的情况下检测到升高的表达。
CD133特异性CAR T细胞在与CD133高GBM细胞共培养后显示出增强的增殖能力(图17，顶行)。CD133特异性CAR T细胞特异性地识别并杀死CD133高GBM和成神经管细胞瘤(对照)中的肿瘤细胞，而对CD133低GBM细胞没有影响(图17，底行)。CD133高和CD133低GBM是基于肿瘤细胞培养物中存在的CD133阳性细胞的百分比来定义。具有>90％CD133+细胞的GBM培养物被定义为CD133高GBM，并且具有<5％CD133+细胞的培养物被定义为CD133低GBM。
对肿瘤移植的小鼠以效应物与靶标比例(E:T)＝2:1注射，即CAR-CON(对照)T细胞(图18A)和CAR-CD133T细胞(图18B)。与对照相比，用CAR-CD133T细胞颅内处理的小鼠脑中形成的肿瘤具有显著较低攻击性和侵袭性(如通过人细胞的COX IV染色所评估)(n＝4)。在CAR-CD133T细胞处理后产生的小鼠异种移植物具有显著较低的肿瘤质量(图18C)。
用CD133特异性CAR-T细胞处理携带GBM肿瘤的小鼠在小鼠中产生了延长的存活以及脑肿瘤负荷的显著降低。
实施例11.新型CD133/CD3双特异性T细胞衔接器(BiTE)抗体靶向患者来源的成胶质细胞瘤细胞的临床前验证
已针对多种肿瘤相关抗原评估了BiTE形式，所述肿瘤相关抗原包括CD19、CD20、EpCAM、EGFR、MUC-1、CEA、CD133、EphA2和HER2/neu(在Baeuerle等人2009中综述)。研究BiTE的临床试验包括用于白血病患者的博纳吐单抗(NCT00274742)、用于肺癌/结肠直肠癌/乳腺癌/卵巢癌患者的AMG110/MT110(NCT00635596)、用于胃肠腺癌患者的AMG211/MEDI565(NCT01284231)和用于前列腺癌患者的AMG212/BAY2010112(NCT0173475)。对两种GBM肿瘤细胞表面抗原CD133(Prasad等人，2015)和EGFRvIII(Choi等人，2013)表现出特异性的BiTE也已显示在异种移植肿瘤模型中诱导抗肿瘤发生活性。重要的是，静脉内递送的EGFRvIII特异性BiTE的临床前评估显示具有良好确立的表达EGFRvIII的GBM的小鼠中的肿瘤减小/收缩、延长的存活。
如实施例9中所述，构建了由两个臂组成的CD133特异性BiTE或RW03xCD3；一个臂识别肿瘤抗原(CD133)，而第二臂对CD3抗原具有特异性。BiTE以四种不同构象构建，并且使用流式细胞术确认双重结合特异性。使用CD133高和CD133低原代GBM细胞系，验证了BiTE与CD133+细胞的结合。进一步分析显示BiTE与已知在健康供体外周血单核细胞群体中表达CD3的人T细胞的结合。观察到BiTE重定向T细胞以杀死GBM，在CD133高GBM中观察到更高的效率，从而验证BiTE靶标特异性。
具体地，使用CellectSeq(一种组合使用噬菌体展示的合成抗体文库和高通量DNA测序技术的新方法)，开发了CD133特异性单克隆抗体‘RW03’(图19A)。在验证CD133RW03抗体后，构建具有两个臂的CD133特异性BiTE或RW03xCD3；一个臂识别肿瘤抗原(CD133)，而第二臂对CD3抗原具有特异性。BiTE以四种不同的构象构建(图19B)。
流式细胞术用于证实CD133xCD3BiTE针对表达适当抗原的细胞的双重特异性。当与结合至可商购CD133(Miltenyi)单克隆抗体相比时，CD133xCD3BiTE以相似的能力结合至表达CD133的GBM肿瘤(图20A)。分析揭示CD133xCD3BiTE与已知在健康供体外周血单核细胞(PBMC)群体内表达CD3的人T细胞的结合(图20B)。
对与BiTE和CD133高GBM BT459一起孵育的T细胞进行染色并分析活化标志物CD69和CD25的表面表达(图21)。CD4+(T辅助细胞)和CD84+(T细胞毒性)细胞两者均显示活化标志物的表面表达水平的上调。仅在共培养物中存在CD133BiTE时检测到升高的表达。
当单独接种(图22A(a)或用T细胞接种(图22A(b))时，GBM细胞形成单层；然而，添加BiTE(图22A，c和d)将T细胞募集至GBM细胞，从而形成球形簇。如通过alamar蓝细胞毒性测定所确定的，向与T细胞共培养的GBM细胞中添加BiTE导致GBM细胞的显著细胞死亡(图22B)。通过基于流式细胞术的存活-死亡染色(用IR染料)定量肿瘤细胞溶解(图22C)。在24小时后在CD133BiTE存在和不存在下肿瘤细胞(CFSE标记的)和T细胞(E:T比例，1:2)显示BiTE介导的GBM细胞死亡。
对NSG(NOD scidγ)小鼠颅内植入CD133高GBM细胞并且在成功植入后，用含有或不含BiTE的未刺激的PBMC(2周内总计4个剂量)处理(图23)。与对照相比，用CD133BiTE颅内处理的小鼠脑中形成的肿瘤具有显著较低攻击性和侵袭性(如通过人细胞的COX IV染色所评估)(n＝4)(图23，A和B))。在BiTE处理后产生的小鼠异种移植物具有较小的肿瘤负荷(图23C)并且相对于对照小鼠(n＝7)维持显著存活优势(图23D)。
用于实施例10和11的方法
流式细胞术表征：解离患者来源的GBM细胞系，病将单细胞重悬于PBS+2mM EDTA中。用抗CD133、抗CD69、抗CD25、抗CD8、抗CD4或匹配的同种型对照(Miltenyi/BDBiosciences)对细胞悬浮液染色。样品在MoFlo XDP细胞分选仪(Beckman Coulter)上运行。使用存活力染料7AAD来排除死亡细胞。(1:10；Beckman Coulter)。使用小鼠IgGCompBead(BD)进行补偿。基于使用同种型对照建立的分析区域，将表面标志物表达定义为阳性或阴性。
细胞增殖测定：将单个细胞以每孔1,000个细胞/200μL的密度接种在96孔板中，一式四份并孵育4天。在读出时间点之前大约2小时向每个孔中添加20μL的Presto Blue(Invitrogen)。使用FLUOstar Omega荧光556微孔板读数器(BMG LABTECH)分别在535nm和600nm的激发和发射波长下测量荧光。使用Omega分析软件分析读数。
定量细胞毒性测定：进行不同效应物/靶标(E:T)比率的Prestoblue杀伤和LDH细胞毒性测定以确定BiTE重定向T细胞和杀死表达CD133的GBM BTIC的效率。
异种移植肿瘤的体内GBM颅内注射和H&E染色：涉及动物的所有实验程序均由McMaster大学动物研究伦理委员会(AREB)审查和批准。NOD-SCID小鼠用于所有实验。使用气体麻醉(异氟醚：5％诱导，2.5％维持)对小鼠进行麻醉，在微创手术后使用耳切口进行鉴定，并监测恢复情况。颅内注射如先前所描述的(1)来执行。简言之，将10μL细胞悬浮液注射到8-10周龄小鼠的右额叶中。每周监测小鼠的疾病迹象，并且在达到终点时，收获脑和肺(用于IT和ICa注射)，切片，并且石蜡包埋用于苏木精和曙红(H&E)。使用Aperio SlideScanner扫描图像，并通过ImageScope v11.1.2.760软件(Aperio)分析。
虽然本申请已参考实施例进行了描述，但是应理解权利要求书的范围应受实施例中列出的实施方案的限制，但是应总体上给出与描述一致的最广泛解释。
所有公布、专利和专利申请都以引用的方式整体并入本文，其程度就如同具体地和个别地指示将每一个别公布、专利或专利申请以引用的方式整体并入本文一般。
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<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 864
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 1
Met Ala Leu Val Leu Gly Ser Leu Leu Leu Leu Gly Leu Cys Gly Asn
1 5 10 15
Ser Phe Ser Gly Gly Gln Pro Ser Ser Thr Asp Ala Pro Lys Ala Trp
20 25 30
Asn Tyr Glu Leu Pro Ala Thr Asn Tyr Glu Thr Gln Asp Ser His Lys
35 40 45
Ala Gly Pro Ile Gly Ile Leu Phe Glu Leu Val His Ile Phe Leu Tyr
50 55 60
Val Val Gln Pro Arg Asp Phe Pro Glu Asp Thr Leu Arg Lys Phe Leu
65 70 75 80
Gln Lys Ala Tyr Glu Ser Lys Ile Asp Tyr Asp Lys Pro Glu Thr Val
85 90 95
Ile Leu Gly Leu Lys Ile Val Tyr Tyr Glu Ala Gly Ile Ile Leu Cys
100 105 110
Cys Val Leu Gly Leu Leu Phe Ile Ile Leu Met Pro Leu Val Gly Tyr
115 120 125
Phe Phe Cys Met Cys Arg Cys Cys Asn Lys Cys Gly Gly Glu Met His
130 135 140
Gln Arg Gln Lys Glu Asn Gly Pro Phe Leu Arg Lys Cys Phe Ala Ile
145 150 155 160
Ser Leu Leu Val Ile Cys Ile Ile Ile Ser Ile Gly Ile Phe Tyr Gly
165 170 175
Phe Val Ala Asn His Gln Val Arg Thr Arg Ile Lys Arg Ser Arg Lys
180 185 190
Leu Ala Asp Ser Asn Phe Lys Asp Leu Arg Thr Leu Leu Asn Glu Thr
195 200 205
Pro Glu Gln Ile Lys Tyr Ile Leu Ala Gln Tyr Asn Thr Thr Lys Asp
210 215 220
Lys Ala Phe Thr Asp Leu Asn Ser Ile Asn Ser Val Leu Gly Gly Gly
225 230 235 240
Ile Leu Asp Arg Leu Arg Pro Asn Ile Ile Pro Val Leu Asp Glu Ile
245 250 255
Lys Ser Met Ala Thr Ala Ile Lys Glu Thr Lys Glu Ala Leu Glu Asn
260 265 270
Met Asn Ser Thr Leu Lys Ser Leu His Gln Gln Ser Thr Gln Leu Ser
275 280 285
Ser Ser Leu Thr Ser Val Lys Thr Ser Leu Arg Ser Ser Leu Asn Asp
290 295 300
Pro Leu Cys Leu Val His Pro Ser Ser Glu Thr Cys Asn Ser Ile Arg
305 310 315 320
Leu Ser Leu Ser Gln Leu Asn Ser Asn Pro Glu Leu Arg Gln Leu Pro
325 330 335
Pro Val Asp Ala Glu Leu Asp Asn Val Asn Asn Val Leu Arg Thr Asp
340 345 350
Leu Asp Gly Leu Val Gln Gln Gly Tyr Gln Ser Leu Asn Asp Ile Pro
355 360 365
Asp Arg Val Gln Arg Gln Thr Thr Thr Val Val Ala Gly Ile Lys Arg
370 375 380
Val Leu Asn Ser Ile Gly Ser Asp Ile Asp Asn Val Thr Gln Arg Leu
385 390 395 400
Pro Ile Gln Asp Ile Leu Ser Ala Phe Ser Val Tyr Val Asn Asn Thr
405 410 415
Glu Ser Tyr Ile His Arg Asn Leu Pro Thr Leu Glu Glu Tyr Asp Ser
420 425 430
Tyr Trp Trp Leu Gly Gly Leu Val Ile Cys Ser Leu Leu Thr Leu Ile
435 440 445
Val Ile Phe Tyr Tyr Leu Gly Leu Leu Cys Gly Val Cys Gly Tyr Asp
450 455 460
Arg His Ala Thr Pro Thr Thr Arg Gly Cys Val Ser Asn Thr Gly Gly
465 470 475 480
Val Phe Leu Met Val Gly Val Gly Leu Ser Phe Leu Phe Cys Trp Ile
485 490 495
Leu Met Ile Ile Val Val Leu Thr Phe Val Phe Gly Ala Asn Val Glu
500 505 510
Lys Leu Ile Cys Glu Pro Tyr Thr Ser Lys Glu Leu Phe Arg Val Leu
515 520 525
Asp Thr Pro Tyr Leu Leu Asn Glu Asp Trp Glu Tyr Tyr Leu Ser Gly
530 535 540
Lys Leu Phe Asn Lys Ser Lys Met Lys Leu Thr Phe Glu Gln Val Tyr
545 550 555 560
Ser Asp Cys Lys Lys Asn Arg Gly Thr Tyr Gly Thr Leu His Leu Gln
565 570 575
Asn Ser Phe Asn Ile Ser Glu His Leu Asn Ile Asn Glu His Thr Gly
580 585 590
Ser Ile Ser Ser Glu Leu Glu Ser Leu Lys Val Asn Leu Asn Ile Phe
595 600 605
Leu Leu Gly Ala Ala Gly Arg Lys Asn Leu Gln Asp Phe Ala Ala Cys
610 615 620
Gly Ile Asp Arg Met Asn Tyr Asp Ser Tyr Leu Ala Gln Thr Gly Lys
625 630 635 640
Ser Pro Ala Gly Val Asn Leu Leu Ser Phe Ala Tyr Asp Leu Glu Ala
645 650 655
Lys Ala Asn Ser Leu Pro Pro Gly Asn Leu Arg Asn Ser Leu Lys Arg
660 665 670
Asp Ala Gln Thr Ile Lys Thr Ile His Gln Gln Arg Val Leu Pro Ile
675 680 685
Glu Gln Ser Leu Ser Thr Leu Tyr Gln Ser Val Lys Ile Leu Gln Arg
690 695 700
Thr Gly Asn Gly Leu Leu Glu Arg Val Thr Arg Ile Leu Ser Leu Asp
705 710 715 720
Phe Ala Gln Asn Phe Ile Thr Asn Asn Thr Ser Ser Val Ile Ile Glu
725 730 735
Glu Thr Lys Lys Tyr Gly Arg Thr Ile Ile Gly Tyr Phe Glu His Tyr
740 745 750
Leu Gln Trp Ile Glu Phe Ser Ile Ser Glu Lys Val Ala Ser Cys Lys
755 760 765
Pro Val Ala Thr Ala Leu Asp Thr Ala Val Asp Val Phe Leu Cys Ser
770 775 780
Tyr Ile Ile Asp Pro Leu Asn Leu Phe Trp Phe Gly Ile Gly Lys Ala
785 790 795 800
Thr Val Phe Leu Leu Pro Ala Leu Ile Phe Ala Val Lys Leu Ala Lys
805 810 815
Tyr Tyr Arg Arg Met Asp Ser Glu Asp Val Tyr Asp Asp Val Glu Thr
820 825 830
Ile Pro Met Lys Asn Met Glu Asn Gly Asn Asn Gly Tyr His Lys Asp
835 840 845
His Val Tyr Gly Ile His Asn Pro Val Met Thr Ser Pro Ser Gln His
850 855 860
<210> 2
<211> 213
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 2
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ser Ser Tyr Val
20 25 30
Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
Ser Ala Ser Tyr Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Val Trp Ser Leu Ile Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro
100 105 110
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr
115 120 125
Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys
130 135 140
Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu
145 150 155 160
Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser
165 170 175
Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala
180 185 190
Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe
195 200 205
Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 3
<211> 456
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 3
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Tyr Tyr Tyr
20 25 30
Gly Ser Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Val Ala Ser Ile Ser Pro Tyr Tyr Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser
50 55 60
Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala
65 70 75 80
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg His Ala Ser Ser Gly Tyr Gly His Tyr Ala Val Tyr Gly
100 105 110
Ile Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser
115 120 125
Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr
130 135 140
Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro
145 150 155 160
Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val
165 170 175
His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser
180 185 190
Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile
195 200 205
Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val
210 215 220
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
225 230 235 240
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
245 250 255
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
260 265 270
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
275 280 285
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
290 295 300
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
305 310 315 320
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
325 330 335
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
340 345 350
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr
355 360 365
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
370 375 380
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
385 390 395 400
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
405 410 415
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
420 425 430
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
435 440 445
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
450 455
<210> 4
<211> 216
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 4
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Ser Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser His Ala Gly His
85 90 95
Leu Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val
100 105 110
Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys
115 120 125
Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg
130 135 140
Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn
145 150 155 160
Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser
165 170 175
Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys
180 185 190
Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr
195 200 205
Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 5
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 5
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Leu Ser Ser Ser
20 25 30
Ser Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Tyr Ile Tyr Pro Tyr Tyr Ser Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Phe Gly Ser Val Ala Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210 215 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 6
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 6
Gln Gly Ser Ser Tyr
1 5
<210> 7
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 7
Ser Ala Ser
1
<210> 8
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 8
Gln Gln Gly Val Trp Ser Leu Ile Thr
1 5
<210> 9
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 9
Gly Phe Asn Ile Tyr Tyr Tyr Gly Ser
1 5
<210> 10
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 10
Ile Ser Pro Tyr Tyr Gly Ser Thr
1 5
<210> 11
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 11
Ala Arg His Ala Ser Ser Gly Tyr Gly His Tyr Ala Val Tyr Gly Ile
1 5 10 15
Asp Tyr
<210> 12
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 12
Gln Ser Val Ser Ser Ala
1 5
<210> 13
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 13
Ser Ala Ser
1
<210> 14
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 14
Gln Gln Tyr Ser His Ala Gly His Leu Phe Thr
1 5 10
<210> 15
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 15
Gly Phe Asn Leu Ser Ser Ser Ser
1 5
<210> 16
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 16
Ile Tyr Pro Tyr Tyr Ser Tyr Thr
1 5
<210> 17
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 17
Ala Arg Phe Gly Ser Val Ala Gly Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 18
<211> 644
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 18
gatatccaga tgacccagtc cccgagctcc ctgtccgcct ctgtgggcga tagggtcacc 60
atcacctgcc gtgccagtca gggttcttct tacgtagcct ggtatcaaca gaaaccagga 120
aaagctccga agcttctgat ttactctgca tcctacctct actctactct ggagtccctt 180
ctcgcttctc tggtagccgt tccgggacgg atttcactct gaccatcagc agtctgcagc 240
cggaagactt cgcaacttat tactgtcagc aaggtgtttg gtctctgatc acgttcggac 300
agggtaccaa ggtggagatc aaacgtacgg tggctgcacc atctgtcttc atcttcccgc 360
catctgatga gcagttgaaa tctggaactg cctctgttgt gtgcctgctg aataacttct 420
atcccagaga ggccaaagta cagtggaagg tggataacgc cctccaatcg ggtaactccc 480
aggagagtgt cacagagcag gacagcaagg acagcaccta cagcctcagc agcaccctga 540
cgctgagcaa agcagactac gagaaacaca aagtctacgc ctgcgaagtc acccatcagg 600
gcctgagctc gcccgtcaca aagagcttca acaggggaga gtgt 644
<210> 19
<211> 1368
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 19
gaggttcagc tggtggagtc tggcggtggc ctggtgcagc cagggggctc actccgtttg 60
tcctgtgcag cttctggctt caacatctac tactacggtt ctatgcactg ggtgcgtcag 120
gccccgggta agggcctgga atgggttgca tctatttctc cttactacgg ctctacttac 180
tatgccgata gcgtcaaggg ccgtttcact ataagcgcag acacatccaa aaacacagcc 240
tacctacaaa tgaacagctt aagagctgag gacactgccg tctattattg tgctcgccat 300
gcttcttctg gttacggtca ttacgctgtt tacggtattg actactgggg tcaaggaacc 360
ctggtcaccg tctcctcggc tagcaccaag ggcccatcgg tcttccccct ggcaccctcc 420
tccaagagca cctctggggg cacagcggcc ctgggctgcc tggtcaagga ctacttcccc 480
gaaccggtga cggtgtcgtg gaactcaggc gccctgacca gcggcgtgca caccttcccg 540
gctgtcctac agtcctcagg actctactcc ctcagcagcg tggtgaccgt gccctccagc 600
agcttgggca cccagaccta catctgcaac gtgaatcaca agcccagcaa caccaaggtg 660
gacaagaaag ttgagcccaa atcttgtgac aaaactcaca catgcccacc gtgcccagca 720
cctgaactcc tggggggacc gtcagtcttc ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc 780
atgatctccc ggacccctga ggtcacatgc gtggtggtgg acgtgagcca cgaagaccct 840
gaggtcaagt tcaactggta cgtggacggc gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg 900
cgggaggagc agtacaacag cacgtaccgt gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag 960
gactggctga atggcaagga gtacaagtgc aaggtctcca acaaagccct cccagccccc 1020
atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg 1080
cccccatccc gggaggagat gaccaagaac caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc 1140
ttctatccca gcgacatcgc cgtggagtgg gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac 1200
aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac ggctccttct tcctctacag caagctcacc 1260
gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct 1320
ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc tccctgtctc cgggtaaa 1368
<210> 20
<211> 653
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 20
gatatccaga tgacccagtc cccgagctcc ctgtccgcct ctgtgggcga tagggtcacc 60
atcacctgcc gtgccagtca gtccgtgtcc agcgctgtag cctggtatca acagaaacca 120
ggaaaagctc cgaagcttct gatttactcg gcatccagcc tctactctac tctggagtcc 180
cttctcgctt ctctggtagc cgttccggga cggatttcac tctgaccatc agcagtctgc 240
agccggaaga cttcgcaact tattactgtc agcaatactc tcatgctggt catctgttca 300
cgttcggaca gggtaccaag gtggagatca aacgtacggt ggctgcacca tctgtcttca 360
tcttcccgcc atctgatgag cagttgaaat ctggaactgc ctctgttgtg tgcctgctga 420
ataacttcta tcccagagag gccaaagtac agtggaaggt ggataacgcc ctccaatcgg 480
gtaactccca ggagagtgtc acagagcagg acagcaagga cagcacctac agcctcagca 540
gcaccctgac gctgagcaaa gcagactacg agaaacacaa agtctacgcc tgcgaagtca 600
cccatcaggg cctgagctcg cccgtcacaa agagcttcaa caggggagag tgt 653
<210> 21
<211> 1344
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 21
gaggttcagc tggtggagtc tggcggtggc ctggtgcagc cagggggctc actccgtttg 60
tcctgtgcag cttctggctt caacctctct tcttcttcta tccactgggt gcgtcaggcc 120
ccgggtaagg gcctggaatg ggttgcatat atttatcctt attatagcta tacttattat 180
gccgatagcg tcaagggccg tttcactata agcgcagaca catccaaaaa cacagcctac 240
ctacaaatga acagcttaag agctgaggac actgccgtct attattgtgc tcgcttcggt 300
tctgttgctg gttttgacta ctggggtcaa ggaaccctgg tcaccgtctc ctcggctagc 360
accaagggcc catcggtctt ccccctggca ccctcctcca agagcacctc tgggggcaca 420
gcggccctgg gctgcctggt caaggactac ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac 480
tcaggcgccc tgaccagcgg cgtgcacacc ttcccggctg tcctacagtc ctcaggactc 540
tactccctca gcagcgtggt gaccgtgccc tccagcagct tgggcaccca gacctacatc 600
tgcaacgtga atcacaagcc cagcaacacc aaggtggaca agaaagttga gcccaaatct 660
tgtgacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc ccagcacctg aactcctggg gggaccgtca 720
gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga tctcccggac ccctgaggtc 780
acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg 840
gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta caacagcacg 900
taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg caaggagtac 960
aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc 1020
aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc catcccggga ggagatgacc 1080
aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg 1140
gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac 1200
tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag 1260
gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag 1320
agcctctccc tgtctccggg taaa 1344
<210> 22
<211> 461
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 22
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Ser Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser His Ala Gly His
85 90 95
Leu Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val
100 105 110
Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys
115 120 125
Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg
130 135 140
Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn
145 150 155 160
Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser
165 170 175
Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys
180 185 190
Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr
195 200 205
Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Lys
210 215 220
Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala Ser Val Lys
225 230 235 240
Met Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr Thr Met His
245 250 255
Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile
260 265 270
Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp Lys
275 280 285
Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu
290 295 300
Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Tyr
305 310 315 320
Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu
325 330 335
Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
340 345 350
Gly Gly Ser Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala
355 360 365
Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val
370 375 380
Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg
385 390 395 400
Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Val Ala Ser Gly Val Pro Tyr Arg Phe
405 410 415
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met
420 425 430
Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn
435 440 445
Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
450 455 460
<210> 23
<211> 226
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 23
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Leu Ser Ser Ser
20 25 30
Ser Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Tyr Ile Tyr Pro Tyr Tyr Ser Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Phe Gly Ser Val Ala Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210 215 220
His Thr
225
<210> 24
<211> 471
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 24
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Leu Ser Ser Ser
20 25 30
Ser Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Tyr Ile Tyr Pro Tyr Tyr Ser Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Phe Gly Ser Val Ala Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210 215 220
His Thr Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala
225 230 235 240
Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Thr Ser
245 250 255
Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro
260 265 270
Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr
275 280 285
Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp
290 295 300
Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu
305 310 315 320
Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys
325 330 335
Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Gly Gly
340 345 350
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln
355 360 365
Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val
370 375 380
Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr
385 390 395 400
Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser
405 410 415
Lys Val Ala Ser Gly Val Pro Tyr Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
420 425 430
Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala
435 440 445
Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr Phe Gly Ala
450 455 460
Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
465 470
<210> 25
<211> 216
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 25
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Ser Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser His Ala Gly His
85 90 95
Leu Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val
100 105 110
Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys
115 120 125
Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg
130 135 140
Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn
145 150 155 160
Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser
165 170 175
Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys
180 185 190
Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr
195 200 205
Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 26
<211> 724
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 26
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Ser Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser His Ala Gly His
85 90 95
Leu Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val
100 105 110
Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys
115 120 125
Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg
130 135 140
Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn
145 150 155 160
Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser
165 170 175
Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys
180 185 190
Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr
195 200 205
Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly Gly Ser Ser Gly Ser Gly Ser
210 215 220
Gly Ser Thr Gly Thr Ser Ser Ser Gly Thr Gly Thr Ser Ala Gly Thr
225 230 235 240
Thr Gly Thr Ser Ala Ser Thr Ser Gly Ser Gly Ser Gly Glu Val Gln
245 250 255
Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg
260 265 270
Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Leu Ser Ser Ser Ser Ile His
275 280 285
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Tyr Ile
290 295 300
Tyr Pro Tyr Tyr Ser Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg
305 310 315 320
Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met
325 330 335
Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Phe
340 345 350
Gly Ser Val Ala Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
355 360 365
Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro
370 375 380
Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val
385 390 395 400
Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala
405 410 415
Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly
420 425 430
Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly
435 440 445
Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys
450 455 460
Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Gly
465 470 475 480
Gly Gly Gly Ser Asp Ile Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala
485 490 495
Arg Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr
500 505 510
Phe Thr Arg Tyr Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly
515 520 525
Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr
530 535 540
Asn Gln Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser
545 550 555 560
Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala
565 570 575
Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr
580 585 590
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser
595 600 605
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Leu Thr Gln
610 615 620
Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr
625 630 635 640
Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys
645 650 655
Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Val Ala
660 665 670
Ser Gly Val Pro Tyr Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr
675 680 685
Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr
690 695 700
Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys
705 710 715 720
Leu Glu Leu Lys
<210> 27
<211> 724
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 27
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Leu Ser Ser Ser
20 25 30
Ser Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Tyr Ile Tyr Pro Tyr Tyr Ser Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Phe Gly Ser Val Ala Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210 215 220
His Thr Gly Gly Ser Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Thr Gly Thr Ser
225 230 235 240
Ser Ser Gly Thr Gly Thr Ser Ala Gly Thr Thr Gly Thr Ser Ala Ser
245 250 255
Thr Ser Gly Ser Gly Ser Gly Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser
260 265 270
Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala
275 280 285
Ser Gln Ser Val Ser Ser Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly
290 295 300
Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Ser Leu Tyr Ser Gly
305 310 315 320
Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu
325 330 335
Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln
340 345 350
Gln Tyr Ser His Ala Gly His Leu Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys
355 360 365
Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro
370 375 380
Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu
385 390 395 400
Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp
405 410 415
Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp
420 425 430
Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys
435 440 445
Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln
450 455 460
Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly
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Gly Gly Gly Ser Asp Ile Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala
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Arg Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr
500 505 510
Phe Thr Arg Tyr Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly
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Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr
530 535 540
Asn Gln Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser
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Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala
565 570 575
Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr
580 585 590
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser
595 600 605
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Leu Thr Gln
610 615 620
Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr
625 630 635 640
Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys
645 650 655
Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Val Ala
660 665 670
Ser Gly Val Pro Tyr Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr
675 680 685
Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr
690 695 700
Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys
705 710 715 720
Leu Glu Leu Lys
<210> 28
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 28
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ser Ser Tyr Val
20 25 30
Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
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Ser Ala Ser Tyr Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Val Trp Ser Leu Ile Thr
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Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 29
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 29
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Tyr Tyr Tyr
20 25 30
Gly Ser Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 30
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
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100 105
<210> 31
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 31
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Leu Ser Ser Ser
20 25 30
Ser Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
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115
<210> 32
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 32
Gly Ser Met Ile Tyr Tyr Tyr Gly Ser
1 5
<210> 33
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 33
Ser Ile Ser Pro Tyr Tyr Gly Ser Thr Tyr
1 5 10
<210> 34
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 34
Gly Phe Asn Leu Ser Ser Ser Ser Ile
1 5
<210> 35
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 35
Tyr Ile Tyr Pro Tyr Tyr Ser Tyr Thr Tyr
1 5 10
<210> 36
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 36
cagggttctt cttac 15
<210> 37
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 37
tctgcatcc 9
<210> 38
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 38
cagcaaggtg tttggtctct gatcacg 27
<210> 39
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 39
ggcttcaaca tctactacta cggttct 27
<210> 40
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 40
atttctcctt actacggctc tact 24
<210> 41
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 41
gctcgccatg cttcttctgg ttacggtcat tacgctgttt acggtattga ctac 54
<210> 42
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 42
ggcttcaaca tctactacta cggttctatg 30
<210> 43
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 43
tctatttctc cttactacgg ctctacttac 30
<210> 44
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 44
cagtccgtgt ccagcgct 18
<210> 45
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 45
tcggcatcc 9
<210> 46
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 46
cagcaatact ctcatgctgg tcatctgttc acg 33
<210> 47
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 47
ggcttcaacc tctcttcttc ttct 24
<210> 48
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 48
atttatcctt attatagcta tact 24
<210> 49
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 49
gctcgcttcg gttctgttgc tggttttgac tac 33
<210> 50
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 50
ggcttcaacc tctcttcttc ttctatc 27
<210> 51
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 51
tatatttatc cttattatag ctatacttat 30
<210> 52
<211> 323
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 52
gatatccaga tgacccagtc cccgagctcc ctgtccgcct ctgtgggcga tagggtcacc 60
atcacctgcc gtgccagtca gggttcttct tacgtagcct ggtatcaaca gaaaccagga 120
aaagctccga agcttctgat ttactctgca tcctacctct actctactct ggagtccctt 180
ctcgcttctc tggtagccgt tccgggacgg atttcactct gaccatcagc agtctgcagc 240
cggaagactt cgcaacttat tactgtcagc aaggtgtttg gtctctgatc acgttcggac 300
agggtaccaa ggtggagatc aaa 323
<210> 53
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 53
gaggttcagc tggtggagtc tggcggtggc ctggtgcagc cagggggctc actccgtttg 60
tcctgtgcag cttctggctt caacctctct tcttcttcta tccactgggt gcgtcaggcc 120
ccgggtaagg gcctggaatg ggttgcatat atttatcctt attatagcta tacttattat 180
gccgatagcg tcaagggccg tttcactata agcgcagaca catccaaaaa cacagcctac 240
ctacaaatga acagcttaag agctgaggac actgccgtct attattgtgc tcgcttcggt 300
tctgttgctg gttttgacta ctggggtcaa ggaaccctgg tcaccgtctc ctcg 354
<210> 54
<211> 332
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 54
gatatccaga tgacccagtc cccgagctcc ctgtccgcct ctgtgggcga tagggtcacc 60
atcacctgcc gtgccagtca gtccgtgtcc agcgctgtag cctggtatca acagaaacca 120
ggaaaagctc cgaagcttct gatttactcg gcatccagcc tctactctac tctggagtcc 180
cttctcgctt ctctggtagc cgttccggga cggatttcac tctgaccatc agcagtctgc 240
agccggaaga cttcgcaact tattactgtc agcaatactc tcatgctggt catctgttca 300
cgttcggaca gggtaccaag gtggagatca aa 332
<210> 55
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 55
gaggttcagc tggtggagtc tggcggtggc ctggtgcagc cagggggctc actccgtttg 60
tcctgtgcag cttctggctt caacctctct tcttcttcta tccactgggt gcgtcaggcc 120
ccgggtaagg gcctggaatg ggttgcatat atttatcctt attatagcta tacttattat 180
gccgatagcg tcaagggccg tttcactata agcgcagaca catccaaaaa cacagcctac 240
ctacaaatga acagcttaag agctgaggac actgccgtct attattgtgc tcgcttcggt 300
tctgttgctg gttttgacta ctggggtcaa ggaaccctgg tcaccgtctc ctcg 354

Claims (35)

1.一种CD133结合剂，其特异性地结合(a)由包含具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的轻链和具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的重链的抗体结合的CD133表位；和/或(b)由包含具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的轻链和具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的重链的抗体结合的CD133表位。
2.一种CD133结合剂，其特异性地结合细胞表面表达的CD133并且特异性地结合变性的CD133。
3.如权利要求1或2所述的CD133结合剂，其包含抗体轻链可变结构域和抗体重链可变结构域，所述抗体轻链可变结构域和所述抗体重链可变结构域形成特异性地结合人CD133的抗原结合位点。
4.如权利要求3所述的CD133结合剂，其中：
(a)(i)所述抗体轻链可变结构域包含含有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的轻链互补决定区(CDR)1、含有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的轻链CDR2和含有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的轻链CDR3；并且(ii)所述抗体重链可变结构域包含含有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的重链CDR1、含有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的重链CDR2和含有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的重链CDR3、位置39处的Met残基、位置55处的Ser残基和位置66处的Tyr残基；或
(b)(i)所述抗体轻链可变结构域包含含有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的轻链互补决定区(CDR)1、含有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的轻链CDR2和含有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的轻链CDR3；并且(ii)所述抗体重链可变结构域包含含有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的重链CDR1、含有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的重链CDR2和含有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的重链CDR3、位置39处的Ile残基、位置55处的Tyr残基和位置66处的Tyr残基。
5.如权利要求3或4所述的CD133结合剂，其中所述轻链包含(a)SEQ ID NO:2的氨基酸序列或与SEQ ID NO:2的框架区具有至少70％序列同一性的氨基酸序列；或(b)SEQ ID NO:4的氨基酸序列或与SEQ ID NO:4的框架区具有至少70％序列同一性的氨基酸序列。
6.如权利要求3或4所述的CD133结合剂，其中所述重链包含(a)SEQ ID NO:3的氨基酸序列或与SEQ ID NO:3的框架区具有至少70％序列同一性的氨基酸序列；或(b)SEQ ID NO:5的氨基酸序列或与SEQ ID NO:5的框架区具有至少70％序列同一性的氨基酸序列。
7.如权利要求4所述的CD133结合剂，其中：(a)所述轻链包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列或与SEQ ID NO:2的所述框架区具有至少70％序列同一性的氨基酸序列，并且所述重链包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列或与SEQ ID NO:3的所述框架区具有至少70％序列同一性的氨基酸序列；或(b)所述轻链包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列或与SEQ ID NO:4的所述框架区具有至少70％序列同一性的氨基酸序列，并且所述重链包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列或与SEQ ID NO:5的所述框架区具有至少70％序列同一性的氨基酸序列。
8.如权利要求1-7中任一项所述的CD133结合剂，其中所述结合剂选自由以下组成的组：抗体、抗体片段、单链Fv(scFv)、双特异性抗体、噬菌体-Fab和噬菌体-scFv。
9.如权利要求1-8中任一项所述的CD133结合剂，其中所述结合剂是抗原结合片段(Fab)。
10.如权利要求1-8中任一项所述的CD133结合剂，其中所述结合剂是(a)包含结合CD133的单链Fab和结合非CD133的scFv的双特异性抗体，(b)包含结合CD133的Fab和结合非CD133的scFv的双特异性抗体，或(c)结合CD133和结合CD3的双特异性抗体。
11.如权利要求1-8和10中任一项所述的CD133结合剂，其中所述结合剂是(a)包含结合CD133的单链Fab和结合CD3的scFv的双特异性抗体，或(b)包含结合CD133的Fab和结合CD3的scFv的双特异性抗体。
12.如权利要求1-8中任一项所述的CD133结合剂，其中所述结合剂是嵌合抗原受体(CAR)，所述嵌合抗原受体包含(i)结合CD133的抗体可变区和(ii)包含一个或多个免疫细胞受体信号传导结构域的CAR信号传导结构域。
13.如权利要求8-12中任一项所述的CD133结合剂，其中所述CD133结合剂包含人抗体恒定区。
14.如权利要求1-8中任一项所述的CD133结合剂，其中所述CD133结合剂是IgG分子。
15.如权利要求1-14中任一项所述的CD133结合剂，其中所述结合剂用检测剂标记。
16.一种免疫缀合物，其包含(1)如权利要求1至14中任一项所述的结合剂，所述结合剂连接至(2)效应剂。
17.如权利要求16所述的免疫缀合物，其中所述效应剂是抗肿瘤剂。
18.如权利要求16所述的免疫缀合物，其中所述效应剂是毒素。
19.一种药物组合物，其包含如权利要求1-15中任一项所述的CD133结合剂或如权利要求16-18中任一项所述的免疫缀合物和载体。
20.如权利要求1-15中任一项所述的CD133结合剂、如权利要求16-18中任一项所述的免疫缀合物或如权利要求19所述的药物组合物用于靶向表达CD133的细胞的用途。
21.如权利要求1-15中任一项所述的CD133结合剂、如权利要求16-18中任一项所述的免疫缀合物或如权利要求19所述的药物组合物用于结合表达CD133的细胞的用途。
22.如权利要求1-15中任一项所述的CD133结合剂、如权利要求16-18中任一项所述的免疫缀合物或如权利要求19所述的药物组合物用于检测表达CD133的细胞和/或用于定量细胞CD133表达水平的用途。
23.如权利要求1-15中任一项所述的CD133结合剂或如权利要求19所述的药物组合物用于降低表达CD133的细胞中CD133蛋白的水平的用途。
24.如权利要求20-23中任一项所述的用途，其中所述表达CD133的细胞是癌细胞。
25.如权利要求1-15中任一项所述的CD133结合剂、如权利要求16-18中任一项所述的免疫缀合物或如权利要求19所述的药物组合物用于治疗或预防癌症的用途。
26.如权利要求25所述的用途，其中所述癌症是转移性黑素瘤、脑癌、前列腺癌、胰腺癌或结肠癌。
27.如权利要求26所述的用途，其中所述脑症是成胶质细胞瘤。
28.如权利要求27所述的用途，其中所述成胶质细胞瘤是可检测地表达CD133的成胶质细胞瘤。
29.如权利要求10或11所述的CD133结合剂用于治疗成胶质细胞瘤，任选地可检测地表达CD133的成胶质细胞瘤的用途。
30.如权利要求26所述的用途，其中所述脑癌是成神经管细胞瘤。
31.如权利要求30所述的用途，其中所述成神经管细胞瘤是可检测地表达CD133的成神经管细胞瘤。
32.如权利要求10或11所述的CD133结合剂用于治疗成神经管细胞瘤，任选地可检测地表达CD133的成神经管细胞瘤的用途。
33.如权利要求29或32所述的用途，其中所述双特异性抗体包含如下氨基酸序列，所述氨基酸序列包含：
(a)SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:23，
(b)SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25，
(c)SEQ ID NO:26，
(d)SEQ ID NO:27，
或其功能变体。
34.如权利要求12所述的表达所述嵌合抗原受体(CAR)的T细胞用于治疗成胶质细胞瘤，任选地可检测地表达CD133的成胶质细胞瘤的用途。
35.如权利要求12所述的表达所述嵌合抗原受体(CAR)的T细胞用于治疗成神经管细胞瘤，任选地可检测地表达CD133的成神经管细胞瘤的用途。
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